CN102827221A

CN102827221A - 荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

Info

Publication number: CN102827221A
Application number: CN2012103048342A
Authority: CN
Inventors: 程翼宇; 王毅
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-08-25
Filing date: 2012-08-25
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明提供一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，通过磁珠分离和液相色谱-质谱联用分析方法从荷叶中筛选获得9个具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，经过α-葡萄糖苷酶抑制活性验证，确认获得的化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式，大大减少了化合物制备分离的盲目性。可推广应用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。获得的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。

Description

荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

技术领域

本发明属于药物筛选方法领域，涉及一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用定性从荷叶中筛选得到具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶，减少碳水化合物转化成葡萄糖，是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的发现。

亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物，如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测；或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，进行质谱检测；还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上，与配体化合物作用后，把不结合的化合物洗脱掉，然后把与酶结合的化合物洗脱出来，进行质谱检测。

发明内容

本发明的目的是提供荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，是利用磁珠分离联用液质定性的快速筛选方法获得，通过以下步骤实现：

Figure 2012103048342100002DEST_PATH_IMAGE002

将空白羧基磁珠用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液活化；在活化磁珠中，加入α-葡萄糖苷酶溶液及2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，振荡孵育一段时间后使α-葡萄糖苷酶键合于空白羧基磁珠上；

Figure 2012103048342100002DEST_PATH_IMAGE006

对酶键合磁珠进行电镜分析、磁力测试和红外分析考察键合磁珠质量；

Figure 2012103048342100002DEST_PATH_IMAGE008

在酶键合磁珠中加入荷叶提取物水溶液，振荡孵育一段时间后，移去孵育液，将α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液进行液质联用定性分析，筛选获得具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物；

Figure 2012103048342100002DEST_PATH_IMAGE010

分离制备化合物并进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证。

具体的步骤如下：

1. 制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（1）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（2）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。

（3）键合磁珠质量考察将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别分析，检查酶键合情况。采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况。采用磁强计数仪考察键合磁珠的磁力变化情况。

2. 筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（1）具潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取100 μl荷叶提取物水溶液2份，分别加到1ml 分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振荡器上混匀，孵育1 h。弃去上清液，再加入1ml醋酸铵溶液清洗2次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析。

（2）目标化合物获取及活性验证

采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置目标化合物标准品

采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

本发明提供的荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的结构通式如下：

所述化合物有L1-9：槲皮素 3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-鼠李糖基-(1→6)-葡萄糖苷(水仙苷)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和槲皮素。

本发明的另一个目的是提供从荷叶中筛选获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。

本发明利用磁珠分离联用液质定性的快速筛选技术，筛选获得了荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式，大大减少了化合物制备分离的盲目性。可推广应用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明获得的荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。

附图说明

图 1是空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、酶键合磁珠红外光谱图。

图 2是基于磁珠分离的荷叶中活性成分筛选流程图。

图 3是α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液的液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例所用仪器：液质联用仪；傅里叶变换红外光谱仪；磁强计数仪；酶标仪

实施例1 键合α-葡萄糖苷酶的磁珠制备

1. 试剂及溶液配制：

α-葡萄糖苷酶 (Saccharomyces cerevisiae，simga公司)；羧基磁珠Dynabeads&reg MyOne Carboxylic Acid，规格：10 mg/ml（invitrogen公司）；1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC,sigma公司)；2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES,sigma公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS, sigma公司)。

25 mmol/L的MES溶液配制称取MES适量，加水溶解，加1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6，制成浓度为25mmol/L的MES溶液。

50 mg/ml EDC溶液配制称取EDC适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/ml的EDC溶液。临用时新鲜配制。

50 mg/ml NHS溶液配制称取NHS适量，快速溶解在冷的 25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50 mg/ml的NHS溶液。临用时新鲜配制。

1mg/ml α-葡萄糖苷酶溶液配制称取α-葡萄糖苷酶1 mg，快速溶解在冷的25 mmol/L的MES溶液中，制成浓度为1 mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液。临用时新鲜配制。

10 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）配制称取磷酸二氢钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，另称取磷酸氢二钠适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的磷酸氢二钠溶液。量取10 mmol/L的磷酸二氢钠溶液81.5 ml与磷酸氢二钠溶液18.5 ml，混匀即得。

2、键合α-葡萄糖苷酶的磁珠的制备

磁珠活化：取300 μl磁珠于1.5 ml离心管中，加入等体积25mmol/L的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸（pH 6）溶液清洗两次，每次10 min，弃去清洗液，加入50 μl新鲜配置50 mg/ml EDC溶液和50 μl的50 mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30 min。孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液，使用300 μl的25mmol/L MES溶液清洗两次。

磁珠键合：在活化磁珠中，加入1 mg/ml α-葡萄糖苷酶溶液60μl，再加入25 mmol/L MES溶液40μl，震荡混合均匀，在室温孵育30 min，或4℃缓慢倾斜旋转孵育2 h，孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液。加10 mmol/L PBS溶液300μl冲洗包被的磁珠4次，加质量分数为0.1-0.5%的牛血清白蛋白PBS溶液300μl，震荡混合均匀，弃去上清液。

3、键合磁珠质量考察

电镜分析：将制备的键合磁珠分散在10 mmol/L PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况。空白磁珠表面非常粗糙，α-葡萄糖苷酶键合磁珠表面比较光滑，可见明显的蛋白积聚情况，表明α-葡萄糖苷酶已键合于磁珠表面。

磁力测试：在室温下采用磁强计数仪测定空白磁珠与键合磁珠的磁力，结果显示键合磁珠的最大饱和磁化强度为18.0 emu/g，表明键合α-葡萄糖苷酶的磁珠仍具有磁力。

酶键合情况考察：将空白磁珠、α-葡萄糖苷酶和酶键合磁珠离心浓缩至干，溴化钾压片后，使用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，表征其性状见图1。图1a、1b、1c分别为空白磁珠、α-葡萄糖苷酶以及键合α-葡萄糖苷酶磁珠的红外光谱图。由图可见，α-葡萄糖苷酶在1645cm^-1处存在酰铵键的红外吸收(图1b)，空白磁珠在1645cm^-1处无红外吸收（图1a），而图1c中在1645cm^-1处也出现了酰铵键的红外吸收。由此表明，磁珠表面已经成功键合上α-葡萄糖苷酶。

实施例2 荷叶提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物筛选

1、药品、试剂及溶液配制：

芦丁标准品（批号：100080-200707），中国药品生物制品检定所；水仙苷标准品（批号：111209）、槲皮素标准品（批号：090426）上海融禾医药科技发展有限公司；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷标准品（批号：P0141），上海纯优生物科技有限公司；对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，sigma公司。

荷叶提取物：取荷叶加70%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩液上样于D101大孔树脂，分别用水、60%乙醇、95%乙醇洗脱，弃去水洗脱液，合并60%乙醇和95%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩液上样于732型阳离子交换树脂，分别用水、50%乙醇、95%乙醇洗脱，合并水和50%乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得荷叶提取物。

10 mmol/L醋酸铵溶液配制称取醋酸铵适量，加水溶解，制成浓度为10 mmol/L的醋酸铵溶液。

α-葡萄糖苷酶键合磁珠溶液配制取上述用0.5 mg空白磁珠制备的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠，加入10 mmol/L的醋酸铵溶液1 ml，震荡混合均匀。

空白磁珠溶液配制取50 μl空白磁珠（含空白磁珠0.5 mg），活化后加入10 mmol/L的醋酸铵溶液1 ml，震荡混合均匀。

2、α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选系统由环形磁铁、键合α-葡萄糖苷酶的磁珠、液相色谱-质谱联用仪组成。

3、荷叶提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物筛选

基于磁珠分离的荷叶中活性成分发现流程图参见图2。称取10 mg荷叶提取物于1 ml 离心管中，加入1 ml纯水，超声15 min，10000 rpm离心5 min，吸取上清液备用。取100 μl上清液，分别加到1 ml的α-葡萄糖苷酶键合磁珠和空白磁珠溶液中，放在振荡器上混匀，孵育1 h。然后放于磁铁上，使磁珠与溶液分开，弃去溶液，在磁珠上加入10 mmol/L醋酸铵溶液1ml，重复上述操作，洗脱2次，弃去洗脱液。最后一次清洗使用含10%乙腈的醋酸铵溶液，吸取洗脱液备用，平行操作三份。洗脱液进行液质分析，液质分析条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C₁₈柱 250×4.6 mm, 5 μm，流动相为0.1%甲酸-水A和乙腈B；线性梯度洗脱程序如下：0 min，10%B；60 min, 50%B；80 min, 100%B；流速：0.5 ml/min，进样量：20 μl，柱温：30℃，检测器：二极管阵列检测器，波长扫描范围：190~400 nm；检测波长：254 nm。质谱参数：离子源：电喷雾（ESI）源，正负离子扫描模式，质量扫描范围：m/z 100–2000，碰撞气：高纯氦，雾化气：高纯氮，电喷雾电压：4.5 kV，鞘气流速：30 arb，辅助气流速：10 arb，毛细管温度：350℃；毛细管电压：15 V。α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱液的液相色谱图参见图3。酶键合磁珠的洗脱液有9个明显的色谱峰。说明荷叶提取物中这9个化合物对α-葡萄糖苷酶有潜在抑制活性。经紫外光谱和质谱鉴定推测L1和L2都为槲皮素二糖苷，这可以从它们的二级质谱m/z 595 [M−H]⁻、m/z 300 [A−2H]⁻、m/z 609 [M−H]⁻、m/z 301[A−H]⁻ 得出，根据Ablajan规则，带有二糖基的黄酮，如果两个糖基之间的连接为C1→C2，容易产生自由基型的苷元离子[A−2H]⁻，而如果两个糖基之间的连接为C1→C6，容易产生[A−H]⁻离子。因此L1和L2的二糖基的连接方式分别为C1→C2和C1→C6，推测为槲皮素 3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷和芦丁。L4和L7都有二级离子m/z 623 [M−H]⁻、m/z 315 [A−H]⁻、m/z 609 [M−H]⁻、m/z 314[A−2H]⁻，这说明它们为异鼠李素的二糖苷，根据Ablajan规则，L4和L7推测为异鼠李素-3-O-鼠李糖基-(1→6)-葡萄糖苷(水仙苷)和异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；L3、L5、L6、L8都包含[M-176-H]⁻离子，这说明它们都有葡萄糖醛酸基，而L6和L8都有[M-176-15-H]⁻离子，这是脱去一个中性的甲基得到的，L3、L5、L6、L8分别推测为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，L9与槲皮素标准品对比鉴定为槲皮素。通过与购置和分离提取获取的这9个化合物对照品比较，最终鉴定为：L1：槲皮素 3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、L2：芦丁、L3：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、L4：水仙苷、L5：山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、L6：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、L7：异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、L8：异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，L9：槲皮素，其结构通式如下所示：

4、荷叶提取物中具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的9个目标化合物获取

芦丁购于中国药品生物制品检定所；水仙苷、槲皮素标准品购于上海融禾医药科技发展有限公司；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷标准品购于上海纯优生物科技有限公司。其他目标化合物自制。

制备方法：取荷叶提取物适量，加甲醇溶解，10000 rpm离心10 min ，取上清液经制备液相色谱分离得到5个黄酮类化合物。制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱Agilent Zorbax SB-C₁₈柱 250×21.2 mm, 7 μm，流动相为水和乙腈，梯度洗脱程序如下：0 min，10%乙腈-水；40 min, 50%乙腈-水；50 min, 60%乙腈-水，流速：10 ml/min，柱温为室温，检测波长：203、254、280、320 nm。收集14.1min的色谱峰，减压回收溶剂，得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；收集14.5min的色谱峰，减压回收溶剂，得异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；收集17.5 min的色谱峰，减压回收溶剂，得异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；收集24 min的色谱峰，减压回收溶剂，得槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷；收集28 min的色谱峰，减压回收溶剂，得异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。

5、α-葡萄糖苷酶抑制活性验证

取购置和分离得到的槲皮素 3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素 3-O-鼠李糖基-(1→6)-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和槲皮素9个化合物配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 mmol/L的待测品溶液，各取20 μl加入20 μl浓度为0.1 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液，置于在96孔板中，在37℃震荡混匀孵育10 min后，加5 mmol/L 对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷20 μl，在37℃震荡混匀孵育30 min后，再加入0.2 mol/L碳酸氢钠溶液80 μL停止反应，在37℃震荡10 min，于405 nm测定吸收值，计算α-葡萄糖苷酶抑制抑制活性。

测试结果如表2所示，9个化合物均具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中槲皮素的半数抑制浓度（IC₅₀）为12.19 μmol/L，芦丁的半数抑制浓度（IC₅₀）为76.26 μmol/L。

。

Claims

1.一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（a）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（b）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30min进行包被，移去上清液，再用磷酸缓冲液清洗包被的磁珠，弃去清洗液，待用；

（c）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况，采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、α-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况，采用磁强计数仪考察键合磁珠的磁力变化情况；

（2）筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（a）具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取100 μl荷叶提取物水溶液2份，分别加到1ml 分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，分别放在振荡器上混匀，孵育1 h，弃去上清液，用醋酸铵溶液清洗，最后用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析；

（b）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

2.根据权利要求1所述的一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，其特征在于，所述化合物有槲皮素 3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-鼠李糖基-(1→6)-葡萄糖苷(水仙苷)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-木糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和槲皮素。

3.根据权利要求1或2所述的一种荷叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。