CN1442146A - 仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法，它提供了一种制备疗效确切的具有抑制醛糖还原酶作用的天然药物或保健食品原料的方法。它以仙人掌总黄酮提取物为原料，以仙人掌总黄酮提取物为主要原料使之作为具有抗醛糖还原酶作用成分与赋形剂结合，用来制备作为角膜损伤愈合缺损、白内障、神经病、视网膜症、肾功能障碍等糖尿病并发症的预防和治疗药物或保健食品。本发明采用溶剂提取法、树脂吸附法等工艺中的一种或多种工艺，并结合常用干燥方法制备仙人掌总黄酮。

Description

仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法。

背景技术：

糖尿病已成为威胁人类健康的常见病、多发病。据在北京召开的第五届国际糖尿病联盟西太区会议透露，目前全球已诊断的II型糖尿病达1.3亿人，我国已超过4000万人；21世纪II型糖尿病将在中国、印度等发展中国家流行，到2005年，全球糖尿病患者将突破3亿，我国糖尿病患者总数接近1亿，成为世界上糖尿病患者人数仅次于印度的第二大国。我国1994年花在糖尿病和心血管病的医疗费用大约是419亿元人民币，到2000年猛增到1216亿元[黎明中国中医药报2002-09-23]。

糖尿病的慢性并发症有神经病变、视网膜病变、肾脏病变与大血管病变等。造成并发症的原因很多，根据美国DCCT研究的结果显示，糖尿病血糖控制的好坏，与并发症的产生有关(The diabetes controland complications trial research group.The effect of intensivetratment of diabetes mellitus.N Engl J Med 1993；102：685-92)，因此高血糖可能为慢性并发症的原因之一，除了糖化反应(Glycosylation)外，多醇反应途径也是相关重要机制。我们观察醛糖还原酶(AR)在体内组织分布的情形，发现AR在糖尿病慢性病变好发的神经、眼睛与肾脏等部位，均有相当程度的含量。醛酸还原酶(AR，Aldosereductase)为多醇代谢途径(Polyol pathway)的反应速率限制酶(Ratelimiting enzyme)，它催化六碳糖还原成醇类，可将葡萄糖还原成山梨醇(Sorbitol)，把半乳糖还原成半乳糖醇(Galactitol)。山梨醇接着又可被山梨醇去氢酶(SDH，Sorbitol dehydrogenase)氧化成果糖，但是SDH却不能氧化半乳糖醇。正常生理状况下，AR活性几乎无法在活体(in vivo)状态测得，组织内山梨醇含量也能忽略不计(HolcombGN.Klemm La，Dulin WE.The polyol pathway for glucosemetabolism in tissues from normal，disbetic，ketotic Chinesehamsters.Diabetologia 1974；10：549-53)。可是当葡萄糖浓度大增(如患糖尿病时)，或是细胞内AR量增加(如处于高张溶液)时，情况就大不相同。例如在糖尿病血糖控制不良时，六碳糖激酶(Hexokinase)将葡萄糖转变成磷酸6-葡萄糖(Glucose-phosphate)的代谢途径饱和，AR即被活化，增加葡萄糖代谢成山梨醇，同时又因为SDH活性并不与AR等比增加，因此细胞内山梨醇就会大量增加。这种细胞内堆积山梨醇的现象，使得细胞在面对高张溶液时，产生一种“对抗性(Offsetting)”的保护机制，这就导致多醇途径活化。除肾脏细胞具有上述现象，水晶体上皮细胞、视网膜细胞等，都有这项能力，在细胞内堆积山梨醇。同时细胞除堆积山梨醇外，它也能堆积Betaine、Glycerophosphorylcholine、若干氨基酸等或使肌纤维醇(MI，Myoinositol)缺乏。

多醇途径活化后，可导致过多的山梨醇堆积。在1959年，科学家在糖尿病老鼠的水晶体发现有过多的山梨醇堆积，并观察到AR与糖尿病并发白内障有关(Kinoshtia JH.Aldose reductase in thediabetic\eye.Am J Ophthalmol 1986；102：685-92)。最近的研究(Tomlinson DR，stevens EJ，Diemel LT.Aldose reductase unhibitorsand their potential for the treatment of diabetic complications.TrendsPharmacol Sci1994；15：293-7)发现山梨醇堆积会造成细胞内Taurine缺乏。Taurine可刺激神经细胞Na⁺-K⁺ATPaSe作用，缺乏Taurine则与疼痛及麻木感有关，使用AR抑制剂(ARI，Aldose reductaseinhibitors)，还可预防糖尿病神经缺乏Taurine。

多醇途径活化后，还可导致纤维醇(MI)缺乏现象，可能透过影响细胞内次发讯号(Second messenger)，细胞内Na⁺累积，神经组织动作电位的产生受影响，久而久之即发生神经病变。而造成糖尿病慢性并发症。这种情形也可发生于视网膜与肾丝球，从而导致相关的糖尿病并发症。这就是导致糖尿病并发症的肌纤维醇缺乏假说(Myoinositoldepletion hypothesis)(Naraynan S.Aldose reductaseand its inhibition in the control of diabetic compliations.Ann ClinLab Sci1993；23：148-58)(Hohman TC.Kwon HM.Toirestat blocksthe glucose-induced down regulation of Na+/myo-inositolcotransporter mRNA.Diabetologia1992；35(suppll)：A104(abstractNo.398))。

多醇途径活化后，不但细胞内堆积山梨醇，同时也用掉NADPH与NAD+等辅酶，进一步影响到其他需要NADPH及NAD+的化学反应，例如还原态Glutathione的产生即受影响而降低。Glutathione能保护细胞对抗氧化压力(Oxidative stress)，减少蛋白质糖化反应，一旦Glutathione减少，也有可能造成糖尿病并发症。NADPH为NO合成酶(NO synthase)反应生成NO的必须物质，有报告说糖尿病人内皮细胞NO生成量有降低的情形(Calver A，Collier J，VallanceP.Inhibition and stimulation of nitric oxide synthesis in the humanforearm arterial bed of patients with insulin dependent diabetes.JClin Invest 1992；90：2548-54)，使用ARI可以减少这个现象。这表明多醇途径影响NO生成，也可能造成慢性并发症。

大量动物和临床试验都已证实，醛糖还原酶抑制剂(ARIs)能有效地改善糖尿病患者的聚醇代谢紊乱，从而预防和延迟糖尿病并发症的发生。醛酸还原酶抑制剂(Aldose Reductase Inhibitor，ARI)依化学结构分成四大类：Carboxylic acids，Hydantoins，Flavonoids与其他类(Naraynan S.Aldose reductase and its inhibition in the control ofdiabetic compliations.Ann Clin Lab Sci1993；23：148-58)。ARI具有Carbonyl或Thiocarbonyl官能基，能接受AR上的电子对，达到抑制AR作用的效果。此外ARI的Aromatic官能基，也能帮忙ARI“粘”上AR，抑制AR作用。它们抑制AR，防止葡萄糖转变成山梨醇，避免细胞内堆积内梨醇，减少肌纤维醇的流失。但由于这样或那样的不良反应，在至今多数化学药物仍停留在临床研究阶段。

中医药治疗糖尿病有几千年的历史，积累了丰富的经验，形成了系统的理论体系和治疗方法。在治疗糖尿病并发症方面也积累了丰富的经验(王明霞，中医药治疗糖尿病并发症近况。北京中医药大学学报，1996，19(5)：43-44)、(蒋莉娟，李利。中药活性成分治疗糖尿病并发症机制研究进展，安徽中医学院学报，2001，20(4)：63)、(崔云竹，崔勇。中药对糖尿病慢性并发症防治作用的临床调查，山东中医药大学学报2002，26(1)：44-46)，从天然产物中寻找高效低毒的ARI也一直是近年来的研究重点。墨西哥的仙人掌属植物是传统的降糖植物药。在国内作药用的仙人掌属植物主要为仙人掌(Opuntiadillenii Haw)及云南仙人掌(Opuntia monocantha Haw)。关于仙人掌植物的研究也有很大进展，经我们系统调查专利和文献，目前国内外关于仙人掌的研究主要集中的降血糖作用、抗溃疡作用、抑菌、抗炎镇痛、抗衰老等作用(李向中、张汝华。仙人掌制剂及其制备方法申请号93110151.4公开号1076623)、(赵湘一种仙人掌颗粒制剂及其制备方法申请号98122873.9公开号1260183)、(张万贵仙人掌类植物保健饮料申请号99103253.5公开号1268324)、(张万贵仙人掌类植物保健饮料的制造方法申请号99103254.3公开号1268318)、(俞东平，李平，高东顺、虞京。仙人掌保健品及其加工方法申请号00100604.5公开号1306834)、(邱鹰昆，陈英杰。仙人掌属药用植物的研究进展，中国药物化学杂志，1999，9(3)：223-227)、(何祥久，姚新生。仙人掌属植物化学成分及药理作用研究进展。天然产物研究与开发，2000，06)、(王钊，林琳，鲍世铨。我国海南仙人掌的成分分析及开发前景。天然产物研究与开发，2001，01)、(林琳、鲍世铨，王钊。仙人掌的天然活性成分研究回顾。广西植物，2002，22(4)：375-381)、(李向中张汝华益津降糖制剂及其制备方法申请号93110152)、(陈朝银赵声兰仙人掌果汁、果脯、饮料及其制造方法申请号94116748)。关于仙人掌属植物提取物对醛糖还原酶的抑制作用的研究以及在糖尿病并发症中的治疗和保健作用的应用还未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法，它提供了仙人掌中黄酮类成分的新用途，为开发仙人掌提供了新的途径。仙人掌中的总黄酮类成分具有具有较好的抑制醛糖还原酶的活性，可用于制备治疗糖尿病并发症药物或保健食品的原料应用，可制成胶囊剂、冲剂、口服液等药用剂型，并且工艺稳定，易于实现。本发明开发了仙人掌防治糖尿病并发症的新用途。

本发明的目的是通过如下方案实现的，它以仙人掌总黄酮提取物为原料，以仙人掌总黄酮提取物为主要原料用来制备治疗糖尿病病发症的药品或保健食品。本发明的制备工艺如下：

以仙人掌干品或者新鲜采集的仙人掌(Opuntia dillenii Haw)及绿仙人掌(Opuntia monocantha Haw)的块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、聚酰胺柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成仙人掌总黄酮，以制成的总黄酮作为主要原料与适宜的赋形剂结合可制成液体、固体、半固体等剂型，在糖尿病并发症的药品或保健食品中进行应用。可作为角膜损伤愈合缺损、白内障、神经病、视网膜症、肾功能障碍等糖尿病并发症的预防和治疗药物或保健食品。

仙人掌干品和新鲜仙人掌的用量换算约为1∶5，即一份干品仙人掌约相当于5份鲜品仙人掌。

所用的溶剂提取法中，可选用水、甲醇、乙醇、正丁醇或其它低级脂肪醇中的一种作溶媒，或选用其中的任意二种或多种以任意比例混合而得到的混合溶媒，在室温浸提或超声提取，或加热下浸提或回流提取，提取次数可以是一次也可以是多次。

所用的溶剂萃取法中，可将用水或低级脂肪醇中一种或混合溶媒提取所得的提取物混悬于水中，以正丁醇或含水正丁醇直接萃取，或经低极性溶媒(如石油醚或已烷)脱脂后，再用正丁醇或含水正丁醇进行萃取。

所用的树脂吸附法中，树脂可采用D-101、HP-20、DM130t等型号的树脂或其它类型的树脂，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。

所用的聚酰胺柱层析法中，所用柱填料为聚酰胺，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。

所用的反相柱层析法中，可选用常压或加压柱层析，所用柱填料为为十八烷基键合相或八烷基键合相，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。

口服给药可以是片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，至少需要一种赋形剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等，片剂还可包衣。除此外，还可用硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠、滑石粉等作润滑剂，糊精、结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、明胶等作粘合剂，马铃薯淀粉、结晶纤维素作用崩解剂。此外，还可制成糖浆剂、乳剂、混悬剂等，对这些剂型，还可加入矫味剂、矫嗅剂或着色剂等。

制成注射剂时，一般用注射用水蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇、聚乙二醇等，必要时还可加入等张剂、助溶剂、抗氧剂、防腐剂、支持剂等。

本发明的优点是：提供了一种制备疗效确切的具有抑制醛糖还原酶作用的天然药物或保健食品原料的方法，可在用于治疗抗糖尿病并发症的药物或保健食品中应用，它可以制成多种剂型，包括胶囊剂、冲剂、口服液等，为仙人掌的应用提供了一条新的途径。所提供的生产工艺稳定，易于实现。

附图说明：

图1为本发明验证仙人掌提取物体外抑制醛糖还原酶的活性药效实验结果表

图2为本发明验证仙人掌提取物中所含的主要黄酮类单体外抑制醛糖还原酶的活性药效的实验结果表

具体实施方式：

实施例1：仙人掌总黄酮的制备方法实例

1、溶剂提取法/溶剂萃取法制备仙人掌总黄酮

仙人掌干品粗粒1.5公斤经80％乙醇(15L×3)在90℃下回流提取，合并提取液(浓缩可得到133克提取物)，乙醇提取物回收乙醇后的溶液，浓缩至小体积，经水饱合的等量正丁醇萃取三次，合并萃取液，减压浓缩回收正丁醇，提取液再经水饱合的等量乙酸乙酯萃取三次，减压回收溶剂至干，可得总黄酮，其收率约为0.9％。

2、溶剂提取法、聚酰胺柱层析法制备仙人掌总黄酮

仙人掌干品粗粒1.5公斤经80％乙醇(15L×3)在90℃下回流提取，合并提取液(浓缩可得到133克提取物)，乙醇提取物回收乙醇后的溶液，室温放置，滤除叶绿素等杂质。滤液在已预处理过的2.5公斤聚酰胺层析柱上，依次用水、95％的乙醇洗脱，水洗脱可除去杂质，95％的乙醇洗脱液减压回收溶剂乙醇至干，可得总黄酮，其收率约为0.8％。

3、溶剂提取法、树脂吸附法制备仙人掌总黄酮

仙人掌干品粗粒1.5公斤经80％丙酮(15L×3)在90℃下回流提取，合并提取液(浓缩可得到约130克提取物)，丙酮提取液40～60℃减压浓缩至约3L，室温放置，滤除叶绿素等杂质，滤液在已预处理过的2.5公斤D101大孔吸附树脂柱上，以60％的丙酮水溶液洗脱，洗脱液低温减压浓缩至干，可得总黄酮，其收率约为0.7％。

实施例2：发明人在研制过程中为了证明本发明的抑制醛糖还原酶的活性作用作了下述的实验研究：

1、仙人掌提取物的抑制醛糖还原酶的活性作用

(1)大鼠晶状体醛糖还原醛的制备

将Wistar大鼠处死，取出其晶状体，放入含有0.5mM氟化苯基甲基磺酰(PMSF)和10mM 2-巯基乙醇的135mM Na，K-磷酸缓冲液(PH7.0)中，匀浆，100,000×g离心30分钟，取上清液，4℃保存。

(2)仙人掌提取物抑制醛糖还原酶的活性作用实验

取上述大鼠晶状体醛糖还原酶，用180mM Na，K-磷酸缓冲液(PH7.0)稀释10～40倍，取100μl，加入135mM Na，K-磷酸缓冲液(PH7.0)225μl，100mM Li2S04 50μl，0.03mM NADPH组成培养液，以1mM DL-甘油醛100μl为底物(空白对照则加入同体积的水)，样品溶于DMSO中，稀释成不同的浓度，各取25μl加入培养液中。上述反应液在加入50μl 0.3mM NADPH于30℃水浴中培养30分钟后，加入150μl 0.5N HCI中止反应。最后加入0.5ml含有10mM咪唑的6N NaOH，并在60℃水浴中反应10min，使NADP⁺转化为荧光物质。最后再以荧光光度仪(型号：Hitachi650-10，日本)，在室温、照射波长360nm，检测波长460nm的条件下测定。

2、仙人掌中黄酮类单体化合物抑制醛糖还原酶的活性作用

按上述测定仙人掌提取物抑制醛糖还原酶的活性实验的方法对进行测定。

实施例3：本发明用于治疗糖尿病并发症药物或保健食品的制备方法实例。

1、仙人掌总黄酮10克与玉米淀粉40克混合加水制软材，过12目筛造粒，干燥，得颗粒剂。本颗粒剂中，每500mg中含总黄酮提取物100毫克。结合症状，每次0.5-1克，每日3-4次。

2、仙人掌总黄酮80克与乳糖110克，硬脂酸镁10克混合，经每600毫克填充胶囊，在本胶囊中，每个胶囊含仙人掌总黄酮150克。结合症状，每次2-3次，每日3-4次。

3、仙人掌总黄酮50克与微晶纤维素45克，硬脂酸镁5克混合，混合物用单冲压片机打成直径6毫米，重量300毫克的片剂。本片剂中第每片含总黄酮150毫克。结合症状，每次1-2片，每日3-4次。

4、仙人掌总黄酮30克，加水300毫升溶解，加橙皮苷4毫升，加单糖浆至1000毫升得糖浆剂。本糖浆剂每毫升含总黄酮提取物30毫克。结合症状，每次6-10毫升，每日3-4次。

5、仙人掌总黄酮50克与微晶纤维素90克，硬脂酸镁10克混合，混合物用单冲压片机打成直径6毫米的片剂，用CAP薄膜包衣，制成重量300毫克的肠溶片剂。本片剂中第每片含总黄酮100毫克。结合症状，每次1-2片，每日3-4次。

6、仙人掌总黄酮40克与乳糖100克，硬脂酸镁10克混合，经每600毫克填充肠溶胶囊，在本胶囊中，每个胶囊含仙人掌总黄酮160克。结合症状，每次2-3粒，每日3-4次。

7、仙人掌总黄酮25克，经普通注射剂制造法，用加热至60的注射用蒸馏水，1000毫升溶解，用NaCl调等张，封入2毫升安瓶。在本注射剂中，每2毫升含总黄酮50毫克。结合症状，可加入250毫升葡萄糖注射液或生理盐水中输注，每日3-4支。

Claims (9)

1、仙人掌总黄酮的新医药用途及其制备方法，它以仙人掌总黄酮提取物为原料，其特征在于：以仙人掌总黄酮提取物为主要原料使之作为具有抗醛糖还原酶作用成分与赋形剂结合，用来制备作为角膜损伤愈合缺损、白内障、神经病、视网膜症、肾功能障碍等糖尿病并发症的预防和治疗药物或保健食品。

2、根据权利要求1所述的仙人掌总黄酮的新医药用途，其特征在于：仙人掌总黄酮中含有下列成分的任意一种或多种，并以之为主要活性成分和/或定性定量的指标成分，这些从仙人掌提取中得到的成分包括：3-O-甲基槲皮素、3-O-甲基异鼠李黄素、山奈甲黄素、槲皮素、3-O-甲基槲皮素、7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、异鼠李黄素-3-O-β-D-芦丁糖苷。

3、一种如权利要求1所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：以仙人掌干品或者新鲜采集的仙人掌(Opuntia dillenii Haw)及绿仙人掌(Opuntia monocantha Haw)的块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、聚酰胺柱层析法、反相柱层析法等工艺中的一种或者多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等常用干燥方法可制备成仙人掌总黄酮，以制成的总黄酮作为主要原料与适宜的赋形剂结合可制成液体、固体、半固体、口服或非口服等多种剂型。

4、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：仙人掌干品和新鲜仙人掌的用量换算约为1∶5，即一份干品仙人掌约相当于5份鲜品仙人掌。

5、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：所用的溶剂提取法中，可选用水、甲醇、乙醇、正丁醇或其它低级脂肪醇中的一种作溶媒，或选用其中的任意二种或多种以任意比例混合而得到的混合溶媒，在室温浸提或超声提取，或加热下浸提或回流提取，提取次数可以是一次也可以是多次。

6、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：所用的溶剂萃取法中，可将用水或低级脂肪醇中一种或混合溶媒提取所得的提取物混悬于水中，以正丁醇或含水正丁醇直接萃取，或经低极性溶媒脱脂后，再用正丁醇或含水正丁醇进行萃取。

7、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：所用的树脂吸附法中，树脂可采用D-101、HP-20、DM130t等型号的树脂或其它类型的树脂，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。

8、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：所用的聚酰胺柱层析法中，所用柱填料为聚酰胺，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。

9、根据权利要求2所述的仙人掌总黄酮的制备方法，其特征在于：所用的反相柱层析法中，可选用常压或加压柱层析，所用柱填料为为十八烷基键合相或八烷基键合相，洗脱溶剂可采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时可进行一定浓度的洗脱也可进行梯度洗脱。