JP4644834B2 - ハマナス類由来のα−アミラーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、グルコース吸収阻害剤およびその利用 - Google Patents
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また、肥満は糖尿病以外にも虚血性心疾患、高血圧、高脂血症など多くの疾患の原因となることが知られている。
現在、糖尿病の予防や肥満の予防および解消法として、デンプンやグリコーゲンなどの多糖類を分解する消化酵素α−アミラーゼの活性を阻害する方法や、ショ糖や麦芽糖などの二糖類を分解する消化酵素α−グルコシダーゼの活性を阻害する方法による食後の急激な血糖値の上昇抑制がある。また、腸管から吸収されるブドウ糖の腸管吸収を抑制させることによる摂取エネルギー量の制御などがある。
これまでに食後血糖値の上昇を抑制する代表的なα−グルコシターゼ阻害剤としてデオキシノジリマイシンやアカルボース、ボグリボースが知られている。
しかしながら、これらは微量で強い阻害活性を示すため、その投与量や使用法には医師の処方のもと厳密な取扱いが要求される。
また、これらの阻害剤は腹部膨満、放屁の増加、軟便、下痢などの副作用を引き起こすことが多く、安全性の面で問題が残されている。
したがって、これら阻害剤が抱える問題点を改善・改良した、より安全性の高い医薬品等の開発が望まれている。
しかしながら、α−アミラーゼ活性阻害作用、α−グルコシダーゼ活性阻害作用、グルコースの腸管吸収阻害作用、食後血糖値上昇抑制作用などに関する研究は遅れている。
ハマナス類の花弁は、生花、湿潤、乾燥のいずれの形態でもよく、さらに乾燥等の形態も限定されるものでないが、予め乾燥させておくことが好ましい。特に、乾燥粉末状が好適である。また、果実については、必要に応じて、予め種子の除去、細断等の処理をしておくとよい。
水については、常温の水のほか、4〜100℃程度に冷却もしくは加温したものが用いられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル等を例示できる。また、含水有機溶媒としては、これら有機溶媒の含水物を用いることができる。なお、抽出物を食品に用いる場合には、残留による危険性の問題がない有機溶媒または含水有機溶媒を選択して用いることが好ましい。
抽出時間については、目的とする有効成分が効果的に抽出されるまで行えばよく、通常は1〜48時間、好ましくは3〜24時間である。
この段階で得られた抽出物をそのまま使用することもできるが、所望により、当該抽出物についてエバポレーターなどを用いて濃縮後、真空凍結乾燥機などにより凍結乾燥を行い、粉末抽出物を得ることができる。
また、必要に応じて、植物由来の糖類を除く方法を加えて純度の高い精製物を得ることができる。例えば、上記で得られた抽出物をDIAION MCI gel CHP-20(三菱化学株式会社製)、Sephadex LH-20(アマシャムバイオサイエンス(株)製)、TOYOPEARL HW-40(東ソー株式会社製)、アンバーライトXAD(オルガノ株式会社製)などの吸着分配樹脂、ゲルろ過樹脂、合成吸着剤などに通し、得られた溶出分画について減圧濃縮装置を用いて濃縮し、凍結乾燥したものを用いることができる。
また、有効成分である抽出物を他の組成物中に添加する場合には、上記摂取量を考慮して添加量を適宜決定することができる。
このことから、前記に記載したように、血糖値上昇が気になる人、あるいは糖尿病予備軍の人に、糖尿病予防用または糖尿病患者用の食品や飲料などとして提供することができ、かつ肥満患者に、肥満予防効果を有する医薬品、医薬部外品、食品、飲料などとして提供できる。
さらに、本発明に係るハマナス類の抽出物は、天然物由来であることから、安全、かつ安心した摂取が可能である上に、新規な素材として様々な飲食物や医薬品等に広く応用され、生活習慣病等の予防に対して、効果的に利用されることが期待できる。例えば、具体的な処方として、当該抽出物を主成分としたカプセル剤、錠剤などを、α−アミラーゼ阻害剤あるいはα−グルコシダーゼ阻害剤として、糖尿病患者や肥満患者などに対して、医薬品あるいは医薬部外品として提供できる。
〔ハマナス類の花弁からの抽出物の製造〕
乾燥したハマナス花弁1kgを50%エタノール(水:エタノール=1:1)水溶液20リットルに室温で24時間浸漬し、有効成分を抽出した。
このようにして得た抽出液を濾紙で濾過し、得られた濾液について、エバポレーターを用いて減圧濃縮した。その後、真空凍結乾燥機により凍結乾燥を行い、抽出物粉末約380gを得た。
〔ハマナス花弁の抽出物によるα−アミラーゼ活性に対する阻害効果〕
製造例により得たハマナス花弁の抽出物による消化酵素α−アミラーゼの活性に対する阻害作用について酵素活性測定により評価した。
すなわち、0.4gのデンプンを含む1mlのリン酸緩衝液(pH7.0)に、最終濃度が1〜1000μg/mlとなるように試料のハマナス花弁抽出物(水で希釈した抽出物)を添加し、37℃で5分間予備加温した。
その後、α−アミラーゼ(シグマ社製、米国)を300 units(活性単位)となるように添加し、撹拌後37℃で10分間の酵素反応を行った。なお、ここでいう活性単位300 unitsとは、37℃で10分間に0.4gのデンプンをすべて分解する酵素量を指す。
ハマナス花弁の抽出物のα−アミラーゼ抑制作用は、図1に示すように、1〜50μg/mlの濃度で用量に依存してα−アミラーゼ活性の阻害作用を示し、IC50(50%抑制する濃度)は12.4μg/mlであり、該抽出物がα−アミラーゼ活性を有意に抑制することが明らかとなった。
ここで、α−アミラーゼ活性の抑制率は、対照コントロール(ハマナス花弁抽出物無添加)による残存デンプン量に対する、ハマナス花弁抽出物添加による残存デンプン量の割合を算出し、α−アミラーゼのデンプン分解活性に対する阻害を百分率で示したものである。
製造例に準じて調製したハマナス果実の抽出物によるα−アミラーゼ活性に対する阻害効果について、上記と同様にして調べたところ、α−アミラーゼ抑制作用は、100μg/mlの濃度で85%の抑制を示し、ハマナス花弁部の抽出物と同程度の抑制作用を有していることが分かった。
〔ハマナス花弁の抽出物による尿中アミラーゼ活性に対する阻害効果〕
製造例により得たハマナス花弁の抽出物による尿中アミラーゼ活性に対する阻害作用について酵素活性測定により評価した。
すなわち、0.4gのデンプンを含む1mlのリン酸緩衝液(pH7.0)に、最終濃度が1〜20μg/mlとなるように試料のハマナス花弁抽出物(水で希釈した抽出物)を添加し、37℃で5分間予備加温した。
その後、ヒトの尿10μlを添加し、撹拌後37℃で10分間の酵素反応を行った。酵素反応終了後、反応液をただちに氷中に入れて反応を停止し、ヨウ素反応液(0.01N ヨウ素溶液)を添加して残存しているデンプンの量を560nmにて比色定量(Ultrospec 3300、アマシャムバイオサイエンス社製)した。
図の縦軸は、尿中のアミラーゼ活性値(活性単位)を指し、ハマナス花弁抽出物の添加時における活性単位の減少(阻害効果)を示す。
〔ハマナス花弁の抽出物によるα−グルコシダーゼ活性に対する阻害効果〕
製造例で得たハマナス花弁の抽出物による消化酵素α−グルコシダーゼ活性に対する阻害作用について酵素活性測定により評価した。
すなわち、シュクロース(最終濃度50mM)を含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)に、最終濃度が1〜1000μg/mlとなるように試料(水で希釈した抽出物)を添加し、37℃で5分間予備加温した。
その後、α−グルコシダーゼ(和光純薬工業製)を最終濃度1μg/mlとなるように添加し、撹拌後37℃で20分間の酵素反応を行った。酵素反応終了後、氷中にて高濃度のデオキシノジリマイシン(α−グルコシダーゼ阻害剤、和光純薬工業製)を添加して反応を停止し、生成したグルコースの量をグルコースオキシダーゼ法に基づくグルコースCテストワコーキット(和光純薬工業製)を用いて定量した。
ハマナス花弁抽出物は、図3に示すとおり、1〜100μg/mlの濃度範囲で濃度に依存してα−グルコシダーゼ活性の阻害作用を示し、IC50(50%抑制する濃度)は35.4μg/mlであり、α−グルコシダーゼの活性を有意に抑制することが明らかとなった。
〔ハマナス花弁の抽出物による腸管からのグルコース吸収に対する阻害効果〕
製造例で得たハマナス花弁の抽出物による腸管からのグルコース吸収に対する阻害作用について反転腸管法により評価した。
供試動物はddY系雄性マウス(SPF、約30g)を使用し、エーテルによる深麻酔下、小腸をすばやく摘出し、冷却したKRB(Krebs-ringer bicarbonate solution)中で反転腸管を作製した。すなわち、トライツ靭帯から下部の小腸をKRB中にて約2cm断片とし、一方の断端を縫合糸で結紮した後、腸管を反転(粘膜側と奨膜側を反転)し、腸管内に10mM グルコースを含むKRBを満たして袋状の反転腸管を作製した。
反応終了後、反転腸管外液(粘膜側)および反転腸管内液(奨膜側)のグルコース濃度を測定(グルコースCテストワコー、和光純薬工業製)した。なお、実験中は混合ガス(95%酸素および5%二酸化炭素含有)を通気しながら行った。
これに対し、ハマナス花弁抽出物は、図4に示すとおり、50および100μg/mlの濃度範囲で濃度に依存して腸管内グルコース濃度の上昇を有意に抑制した。
図の白カラムは、反応前の腸管内グルコース濃度を示し、黒カラムは、1時間の反応後のグルコース濃度を示す。
これに対し、ハマナス花弁抽出物は、図5に示すとおり、50および100μg/mlの濃度範囲で濃度に依存して腸管内グルコース濃度の上昇を有意に抑制した。
なお、図の白カラムは、反応前の腸管内グルコース濃度を示し、黒カラムは、1時間の反応後のグルコース濃度を示す。
これに対し、ハマナス花弁抽出物は、図6に示すとおり、50および100μg/mlの濃度範囲で濃度に依存して腸管内グルコース濃度の上昇を有意に抑制した。
図の白カラムは、反応前の腸管内グルコース濃度を示し、黒カラムは、1時間の反応後のグルコース濃度を示す。
これに対し,ハマナス花弁抽出物は、図7に示すとおり、100〜500μg/mlの濃度範囲で濃度に依存して腸管内グルコース濃度の上昇を有意に抑制した。
なお、図の白カラムは、反応前の腸管内グルコース濃度を示し、黒カラムは、1時間の反応後のグルコース濃度を示す。
その結果、図7に示すとおり、能動輸送によるグルコースの吸収(グルコース濃度の上昇)が認められた。
以上の結果から、ハマナス花弁抽出物は、腸管上皮細胞に対する毒性作用を示さない濃度で、腸管からのグルコース吸収を有意に阻害することが明らかとなった。
〔ハマナス花弁抽出物による食後血糖値上昇抑制効果糖負荷試験〕
本発明に係るハマナスの花弁抽出物による食後血糖値上昇抑制効果を糖負荷試験により評価した。
その後、ハマナス花弁抽出物(50および100mg/kg)を強制経口投与し、20分後にシュクロース(1g/kg)を同様に経口投与した。
以下、投与の30、60、90、120分後に尾静脈採血を行って血糖値を測定した。なお、血糖値はメディセーフ血糖測定システム(テルモ製)を用いて測定した。
対照コントロールにおいて、シュクロースの負荷により、投与30分後をピークとする顕著な血糖値の上昇が認められた。
これに対し、ハマナス花弁抽出物を投与すると、図8に示すとおり、シュクロース負荷に対しては30分から120分後にかけての血糖値上昇を有意に抑制した。図中の*は、対照群に対する有意差検定によりp<0.05で有意差ありを、**は、p<0.01で有意差ありを、それぞれ示す(図9および10も同じ)。
その後、ハマナス花弁の抽出物(50および100mg/kg)を強制経口投与し、20分後にスターチ(1g/kg)を同様に経口投与した。
以下、投与の30、60、90、120分後に尾静脈採血を行って血糖値を測定した。なお、血糖値はメディセーフ血糖測定システム(テルモ製)を用いて測定した。
対照コントロールにおいて、それぞれスターチの負荷により、投与30分後をピークとする顕著な血糖値の上昇が認められた。
これに対し、ハマナス花弁抽出物を投与すると、図9に示すとおり、スターチ負荷に対しては30分から60分後の急激な血糖値上昇を有意に抑制した。
その後、ハマナス花弁の抽出物(100〜500mg/kg)を強制経口投与し、20分後にグルコース(1g/kg)を同様に経口投与した。
以下、投与の30、60、90、120分後に尾静脈採血を行って血糖値を測定した。なお、血糖値はメディセーフ血糖測定システム(テルモ製)を用いて測定した。
対照コントロールにおいて、それぞれグルコースの負荷により、投与30分後をピークとする顕著な血糖値の上昇が認められた。
グルコース負荷による血糖値上昇に対しては、高濃度のハマナス花弁抽出物が必要であるが、図10に示すとおり、投与30分後の急激な血糖値上昇を有意に抑制することが明らかとなった。
次に、製造例で得られたハマナス花弁の抽出物は、腸管からのブドウ糖(グルコース)の吸収について、実施例4に示したとおり、二糖類の麦芽糖(マルトース)、ショ糖(シュクロース)、多糖類のデンプン(スターチ)の分解と吸収をそれぞれ有意に阻害し、さらにブドウ糖(グルコース)の腸管吸収を有意に阻害した。
以上の結果から、ハマナス花弁の抽出物は、α−アミラーゼ阻害作用およびα−グルコシダーゼ阻害作用を有するとともに、二糖類あるいは多糖類からのグルコースへの分解を抑制し、さらにはグルコースの腸管吸収を阻害することによって、グルコース濃度の上昇、すなわち血糖値の上昇を抑制することが明らかとなった。
本発明に関わるハマナスの抽出物は、天然物由来であることから、安全、かつ安心して摂取することが可能である。
本発明により提供されるα−アミラーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、およびグルコースの吸収阻害剤は、様々な飲食物や医薬品等に広く応用され、生活習慣病等の予防に効果的に利用されることが期待できる。すなわち、血糖値上昇が気になる人あるいは糖尿病予備軍の人に、糖尿病予防用または糖尿病患者用の食品や飲料として提供できるものであり、かつ肥満患者や肥満予防効果を有する医薬品、医薬部外品、食品、飲料などとして提供でき、生活習慣病の予防や国民の健康の維持・増進により国民生活の向上に資することが期待できる。
Claims (3)
- ハマナス(Rosa rugosa Thunb.)の花弁部の含水エタノール抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、肥満予防の医薬用途に用いる経口投与用α−アミラーゼ阻害剤。
- ハマナス(Rosa rugosa Thunb.)の花弁部の含水エタノール抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、肥満予防の医薬用途に用いる経口投与用α−グルコシダーゼ阻害剤。
- ハマナス(Rosa rugosa Thunb.)の花弁部の含水エタノール抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、肥満予防の医薬用途に用いる経口投与用グルコースの腸管吸収阻害剤。
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