KR101923695B1 - 옻나무 추출물과 두충나무 추출물을 포함하는 간 기능 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
옻나무 추출물과 두충나무 추출물을 포함하는 간 기능 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 포함하는 간 기능 개선, 간 기능 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은, 간세포에서 독성 스트레스인 CCl4에 대한 유의한 보호 효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 천연물 추출물을 포함하는 간 기능 보호에 효과적인 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 포함하는 간 기능 개선, 간 기능 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간은 약 500종 이상의 화학 작용을 하며, 그 중 가장 중요한 기능은 신진대사작용, 해독작용, 소화 및 흡수작용이 있다. 간은 전분이나 당분에서 생긴 포도당을 글리코겐의 형태로 저장하였다가 근육에 에너지원으로 공급한다. 또 단백질을 아미노산으로 변화시키고, 필요 없는 단백질은 요소로 전환하여 소변으로 배출시킨다. 간에서 생성된 담즙은 담낭에 저장해 두었다가 지방분을 소화, 흡수하는데 사용된다. 또한, 장에서 흡수된 유독 물질이나 체내에서 생성된 유해물질은 모두 간에서 파괴되고, 해독처리되어 콩팥을 통하여 배설된다.
이렇게 간은 소화기계와 전신 순환계 사이에 위치함으로써 소화기계에 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 일단 생체 내에 들 어온 생체 외 물질은 간을 통과하기 때문에 간은 영양소 이외에도 많은 독성 물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아, 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다. 간은 재생 능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있는 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 손상된 경우 간 조직의 일부가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하고, 결합조직이 과다 축적되면서 간 기능이 정상적으로 회복되지 못하는 상태가 된다.
우리나라 인구의 사망 원인 구조 중 간질환 및 간암이 상위 순위를 차지하며, 일본 및 유럽에서도 사망원인 5위 이내에 들 정도로 간은 중요한 신체기관이다. 그러나 간질환은 초기에 자각증상이 없기 때문에 질환이 상당히 진행된 후에나 발견된다. 따라서 현재 많은 종류의 간질환 치료제들이 나와 있고 많은 제약업체가 개발을 진행하고 있지만 효과적인 치료제 및 진단 방법이 없는 실정이다.
본원발명은 간 기능 개선, 간 기능 손상 예방 및 치료에 효과적인 옻나무 추출물과 두충나무 추출물을 개발하여 간 기능 개선에 효과적인 식품 조성물 및 간 기능 손상 예방, 치료 효과가 뛰어난 약품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 동시에 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어, 상기 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은, 바람직하게 1:1의 부피 비율로 혼합된 것이 좋다.
본 발명의 식품 조성물에 있어, 상기 추출물은, 바람직하게 물을 용매로 하여 추출한 것이 좋다.
본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 동시에 포함하는 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물에 있어, 상기 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은, 바람직하게 1:1의 부피 비율로 혼합된 것이 좋다.
본 발명의 약학조성물에 있어, 상기 추출물은, 바람직하게 물을 용매로 하여 추출한 것이 좋다.
본 발명의 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은, 간세포에서 독성 스트레스인 CCl4에 대한 유의한 보호 효과를 발휘한다.
도 1은 농도에 따른 CCl4의 독성을 분석한 결과이다.
도 2는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성을 분석한 결과이다 (a: 농도별, b: 시간별).
도 3의 a는 20mM의 CCl4을 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존력을 분석한 결과이고, b는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 간 기능 손상 방지 효과를 확인한 결과이다 (a: 세포생존력, B; 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출, C: 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출).
도 5는 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 세포 생존력 (a), 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출 (b), 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출 (c)을 비교한 결과이다.
도 6은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 세포 생존력을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 7은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 8은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 9는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 항산화 효과를 확인한 결과이다 (a: MDA 함량, B; SOD 활성).
도 10은 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 항산화 효과를 확인한 결과이다 (a: MDA 함량, B; SOD 활성).
도 11은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 MDA 함량을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 12는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 SOD 활성을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 13은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 라디칼 소거능을 비교한 결과이다 (a: ILE-RE (1:1), b: 1:0.5, c: 1:0.33, d: 1:0.25).
도 2는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성을 분석한 결과이다 (a: 농도별, b: 시간별).
도 3의 a는 20mM의 CCl4을 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존력을 분석한 결과이고, b는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 간 기능 손상 방지 효과를 확인한 결과이다 (a: 세포생존력, B; 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출, C: 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출).
도 5는 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 세포 생존력 (a), 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출 (b), 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출 (c)을 비교한 결과이다.
도 6은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 세포 생존력을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 7은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 8은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 9는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 항산화 효과를 확인한 결과이다 (a: MDA 함량, B; SOD 활성).
도 10은 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 항산화 효과를 확인한 결과이다 (a: MDA 함량, B; SOD 활성).
도 11은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 MDA 함량을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 12는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 SOD 활성을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
도 13은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 라디칼 소거능을 비교한 결과이다 (a: ILE-RE (1:1), b: 1:0.5, c: 1:0.33, d: 1:0.25).
본 발명은 간 기능 보호에 효과적인 천연 조성물을 제공하는데, 본 발명의 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은, 간세포에서 독성 스트레스인 CCl4에 대한 유의한 보호 효과가 있었다.
옻나무는 옻나무과에 속하는 낙엽교목으로 과거에 재배하던 것이 번져서 야생화 한 것이 많이 있고, 나무껍질에 상처를 냈을 때 나오는 진을 옻이라고 하며 공업용 및 약용으로 사용하는 것으로서, 주로 옻나무는 수액을 채취하여 도료용으로 사용하고, 한방에서는 옻칠(乾漆)을 약재로 사용하는데 약성은 온(溫)하고 신(辛)하며 유독하고 파어(破瘀)·소적(消積)·살균의 효능이 있다고 알려졌다.
두충은 두충나무과에 속하는 두충나무(Eucommia ulmoides Oliver)의 껍질이나 잎을 말린 약재이다. 두충껍질의 바깥 면은 회색 또는 어두운 회색이며 세포주름이 많고 작은 구멍인 피공이 있으며, 안쪽 면은 평활하고 어두운 갈색을 띤다. 두충은 맛이 달고 매우며, 잎이나 나무껍질에 실 같은 투명한 섬유질이 많아서 꺾으면 끈기 있는 가늘고 흰 섬유질의 실이 생기는 특징이 있다. 두충의 약리작용으로는 혈압강하, 항노화, 콜레스테롤강하, 항염, 진정, 진통, 면역 조절, 혈액응고, 자궁수축, 항알레르기, 항균작용 등이 보고되고 있다. 한방에서는 간신기능 부족으로 인한 요통, 무릎통, 하복냉감, 태동불안, 자궁출혈 등을 치료하는데 효과가 있다고 알려졌다.
한편, 본 발명의 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)은 바람직하게 물을 용매로 하여 추출한 것이 좋으며, 물로 추출한 추출물에서 상기와 같은 효과가 잘 나타났다. 또한, 본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 동시에 포함하는 것이 좋은데, 그 비율은 바람직하게 1:1의 부피 비율로 혼합된 것이 좋다.
특히, 두충나무 추출물은 세포 생존력, 간 효소 (AST, ALT), ROS 및 이와 관련된 산화 방지제와 같은 간 독성 관련 바이오마커보다 더욱 강력한 효과를 보였다. ROS 상승도는 암, 간 질환, 노화, 염증과 같은 다양한 병리와 관련되어 있어, ROS를 감소시킬 수 있는 항산화제는 산화적 손상과 관련된 질병을 치료하거나 예방할 수 있다. 본 발명의 두충나무 추출물은 HepG2 세포에서 SOD와 같은 항산화 효소를 보다 유의하게 활성화하였고, MDA를 감소시켰다.
한편, 본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 동시에 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 추출물은 바람직하게 간 기능 개선용 식품 조성물 대비 0.1중량%~50중량% 포함되는 것이 좋다. 0.1중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다. 본 발명의 간 기능 개선용 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract)과 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract)을 동시에 포함하는 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 추출물의 함량은, 예방 및 치료제의 사용방법, 복용자의 상태, 질환의 종류 및 질환의 중증 정도에 따라 바람직하게 조절하는 것이 좋다. 본 발명의 조성물에서 추출물의 함량은 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물 대비 0.1중량%~50중량%일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 그 함량이 0.1중량% 미만일 경우 치료 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.
한편, 본 발명의 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제일 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제 (PLASTERS), 과립제 (GRANULES), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제 (LEMONADES), 산제 (POWDERS), 시럽제 (SYRUPS), 액제 (LIQUIDS FORMULATIONS), 에어로솔제 (AEROSOLS), 엑스제 (EXTRACTS), 엘릭실제 (ELIXIRS), 유동엑스제 (FLUIDEXTRACTS), 유제 (EMULSIONS), 현탁제 (SUSPENSIONS), 전제 (DECOCTIONS), 침제 (INFUSIONS), 정제 (TABLETS), 좌제 (SUPPOSITORIES), 주사제 (INJECTIONS), 주정제 (SPIRITS), 카타플라스마제 (CATAPLASMA), 캅셀제 (CAPSULES), 트로키제 (TROCOES), 팅크제 (TINCTURES), 파스타제 (PASTES), 환제 (PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 간 기능 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 간 기능 손상 예방 또는 치료제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100mg/kg (체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
※ 모든 결과는 세포 n개의 평균 ±SEM으로 나타내었다. 대응 및 비대응 스튜던트 t-검정 (paired and unpaired Student's t-tests)을 검정 및 제어 조건에 적절하게 적용하였다. 모든 통계 계산에 Microcal Origin software (Northampton, MA, USA)를 이용하였다.
※ 하기에서는 다음과 같은 약어를 사용한다.
- ILF-AJ; 오리나무 (Alnus japonica) 추출물
- ILF-AK; 신선초 (Angelica keiskei) 추출물
- ILF-AT; 부추 (Allium tuberosum) 추출물
- ILF-E; 두충나무 (Eucommia ulmoides) 추출물
- ILF-PR; 갈근 (Puerariae Radix) 추출물
- ILF-R; 옻나무 (Rhus verniciflua) 추출물
- ILF-RE: 1:1 부피비율로 혼합한 ILF-R와 ILF-E의 혼합물
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실시예
1: 본 발명 추출물의 세포 독성 억제 확인>
(1) 천연물 추출
동결된 오리나무 추출물 (Alnus japonica extract, ILF-AJ), 신선초 추출물 (Angelica keiskei extract, ILF-AK), 부추 추출물 (Allium tuberosum extract, ILF-AT), 두충나무 추출물 (Eucommia ulmoides extract, ILF-E), 갈근 추출물 (Puerariae Radix extract, ILF-PR) 및 옻나무 추출물 (Rhus verniciflua extract, ILF-R)을 칭량하고, 50% 에탄올과 물로 추출하였다. 여과 후, 추출물을 농축하여 건조한 후 -4℃에서 보관하였다.
(2) 세포 배양
37℃, 5% CO2 배양기 (MCO18AIC; SANYO, Tokyo, Japan)에서 10% FBS (Gibco)와 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)이 첨가된 EMEM (Eagle's minimum essential medium) 배지 (Gibco Co., Birmingham, MI, USA)를 이용하여 HepG2 세포를 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. HepG2 세포에서 CCl4 유도 독성을 분석하기 위해 HepG2 세포를 배지에서 배양하거나 독성 물질 (5mM, 10mM 또는 20mM의 CCl4)로 6시간 동안 처리하였다.
(3) 세포 생존력 분석
세포 생존력 분석을 위하여 우선, 세포를 5% CO2에서 37℃로 유지시켰다. 배양액을 첨가하여 다수 성장기의 암세포 농도를 2×104/dish로 조정한 후, 96-웰 배양 플레이트에 홀(hole)당 50㎕를 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에 24시간 유지하였다. 이어서, 상층액을 제거한 후 MTT 용액을 첨가한 블랭크 대조군을 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거한 후 100㎕ DMSO를 블랭크 대조군에 첨가하고, 30분간 충격을 가한 후 효소 표준 기구를 사용하여 570㎚에서 검출하였다.
농도에 따른 CCl4의 독성을 분석한 결과, 농도의존적으로 세포생존력이 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 농도에 따른 CCl4의 독성을 분석한 결과이다. 가장 높은 독성을 보인 농도에서 시간에 따른 CCl4의 독성을 분석한 결과, 6시간 동안 CCl4을 처리한 후, HepG2 세포에서 세포생존력이 유의하게 감소하였다 (도 3의 a). 도 3의 a는 20mM의 CCl4을 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존력을 분석한 결과이다.
한편, 본원발명의 옻나무 추출물 (ILF-R)은 농도별 시간별 조건에서 어떠한 독성도 보이지 않았다 (도 2). 도 2는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성을 분석한 결과이다 (a: 농도별, b: 시간별). 또한, CCl4로 독성을 유발한 HepG2 세포에 ILF-R를 첨가하였을 시, 100㎍/㎖ 농도의 ILF-R에서 세포 사멸이 억제되었다 (도 3의 b). 도 3의 b는 옻나무 추출물 (ILF-R)의 독성 억제 효과를 분석한 결과이다.
<
실시예
2: 본 발명 추출물의 간
보호능
확인>
(a) 세포배양
HepG2 세포에서 오리나무 추출물 (ILF-AJ), 신선초 추출물 (ILF-AK), 부추 추출물 (ILF-AT), 두충나무 추출물 (ILF-E), 갈근 추출물 (ILF-PR) 및 옻나무 추출물 (ILF-R)의 간 보호 효과를 측정하기 위하여, 정상 대조군 세포를 0.05% (v/v)의 DMSO가 포함된 EMEM (Eagle's minimum essential medium) 배지에서 6시간 동안 배양하였다. 독성 치료를 위해, 세포를 0.05% (v/v)의 DMSO가 포함된 EMEM (Eagle's minimum essential medium)에서 6시간 동안 배양한 후, 20mM의 CCl4이 부가된 EMEM (Eagle's minimum essential medium) 배지에서 6시간 동안 처리하였다.
ILF-AJ, ILF-AK, ILF-AT, ILF-E, ILF-PR 및 ILF-R 처리는, ILF-AJ, ILF-AK, ILF-AT, ILF-E, ILF-PR 및 ILF-R가 포함된 EMEM (Eagle's minimum essential medium)에서 100㎍/㎖의 농도로 30분간 세포를 배양한 후, 20mM의 CCl4를 6시간 동안 처리하였다. ILF-E와 ILF-R 처리는, ILF-E와 ILF-R의 혼합물(ILE-RE (1:1), 1:0.5, 1:0.33)을 포함한 EMEM (Eagle's minimum essential medium)에서 10, 25, 50 또는 100㎍/㎖ 농도로 30분간 세포를 배양한 후, 20mM의 CCl4로 6시간 처리하였다.
아스파테이트 아미노전달효소 (AST, aspartILF-AT aminotransferase) 및 알라닌 아미노전달효소 (ALT, alanine aminotransferase) 검출 키트는 아산 제약 회사(서울, 한국)에서 구입하였다. 간 보호 효과를 확인하기 위한 시험관 내 분석에서는 상기와 같이, HepG2 세포에 ILF-AJ, ILF-AK, ILF-AT, ILF-E, ILF-PR, ILF-R 및/또는 20mM CCl4를 처리하였다. 웰에서 상층액을 제거한 후 바로 효소 활성을 측정하였으며, 결과는 IU/L로 나타냈다.
(b) 본 발명 추출물의 간 기능 손상 방지 효과 확인
실시예 1에서의 옻나무 추출물 (ILF-R) 결과를 기준으로, 오리나무 추출물 (ILF-AJ), 신선초 추출물 (ILF-AK), 부추 추출물 (ILF-AT), 두충나무 추출물 (ILF-E), 또는 갈근 추출물 (ILF-PR)의 간 보호 효능을 비교하기 위하여, CCl4 처리 전에 ILF-AJ, ILF-AK, ILF-AT, ILF-E 및 ILF-PR (25, 50 및 100㎍/㎖) 또는 ILF-R (100㎍/㎖)를 첨가하였다.
실험 결과, 50% 에탄올 ILF-E 추출물과 100% 물 ILF-E 추출물과 100% 물 ILF-R 추출물이 다른 추출물에 비해 CCl4 저해 세포 사멸을 보다 유의하게 보호하였다 (도 4의 a). CCl4에 대한 ILF-AJ, ILF-AK, ILF-AT, ILF-E 및 ILF-R의 간 보호 효과를 확인한 결과, 이들 추출물 중에서 50% 에탄올 ILF-E 추출물과 100% 물 ILF-E 추출물과 100% 물 ILF-R 추출물은 AST 및 ALT 농도를 유의하게 감소시켰다. 100㎍/㎖ 농도로 ILF-AK를 보충하면 CCl4에 의한 세포 손상을 유의하게 보호할 수도 있었으나, 동량의 ILF-E 및 ILF-R에 비해 매우 비효율적이었다 (도 4의 b, c). 도 4는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 간 기능 손상 방지 효과를 확인한 결과이다 (a: 세포생존력, B; 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출, C: 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출).
(c) ILF-E
와
ILF-R
의
혼합비에 따른 간 기능 손상 방지 효과 확인
상기에서 가장 우수한 간 보호 효능을 나타낸 ILF-E와 ILF-R의 혼합비를 찾기 위하여, HepG2 세포에서 1:1, 1:0.5, 1:0.33 및 1:0.25의 혼합비로 ILF-E와 ILF-R (10, 25, 50 및 100μg/mL)의 혼합 조건에서 세포 생존력 분석을 수행하였다. 실험 결과, 1:1 비율로 ILF-E와 ILF-R의 추출물을 혼합하였을 시, CCl4에 의한 세포 사멸을 유의하게 보호하였다 (도 5의 a, 도 6). 따라서, 가장 좋은 효과를 보인 1:1 비율의 혼합물을 ILF-RE로 명명하여 사용하였다.
또한, ILF-E와 ILF-R의 혼합비에 따른 AST와 ALT의 조절 차이도 확인되었다 (도 5의 b, c, 도 7, 도 8). 도 5는 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 세포 생존력 (a), 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출 (b), 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출 (c)을 비교한 결과이고, 도 6은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 세포 생존력을 비교한 결과이며 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25), 도 7은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 아스파테이트 아미노전달효소 (AST) 검출을 비교한 결과이고 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25), 도 8은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 알라닌 아미노전달효소 (ALT) 검출을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
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실시예
3: 본 발명 추출물의 항산화 효과 확인>
(a) 지질 과산화의 측정
지질 과산화의 최종 산물인 MDA의 농도는 Cayman Chemical Company의 티오바르비투르산 반응성 물질 (TBARS) 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 웰에서 배지를 제거하고, 부착 세포를 긁어 모은 후, 차가운 PBS에 현탁하고, 초음파 처리하여 얼음에 두었다. 용해된 세포로부터 얻은 상층액 또는 표준 나트륨 도데실 설페이트 (sodium dodecylsulfILF-AT) 및 발색 시약을 바이알에 첨가하였다. 바이알을 100℃에서 1시간 동안 가열한 후 즉시 얼음 조에서 냉각하고 원심분리 하였다. 바이알에 포함되어 있는 물질을 마이크로 플레이트의 웰로 옮겼다. 생성물의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기로 파장 540nm에서 측정하였다. MDA 농도를 측정하여 지질 과산화도를 정량하였다.
(b) SOD 활성 측정
SOD 활성은 포마잔 결정의 농도를 측정하는 비색 분석을 사용하는 Biovison Company (Mountain View, USA)의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 처리 후, 배지를 웰에서 제거하고 부착 세포를 긁어 내어 1 mM EGTA, 210 mM 만니톨 및 70 mM 수크로오스를 함유하는 20 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에 현탁하고, 초음파 처리하여 얼음에 두었다. SOD 활성을 측정하기 위해, 96-웰 플레이트의 웰마다 희석된 라디칼 검출기와 용해된 세포의 상층액 또는 표준 나트륨 도데실 설페이트를 첨가하고, 잔틴산화효소 (xanthine oxidase)를 첨가하였다. 웰 내의 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기에서 20분 후 460nm의 파장에서 측정되었다. 결과는 IU/mL로 나타내었다.
(c) 본 발명 추출물의 항산화 효과 확인
MDA 함량과 SOD 활성은 CCl4에 의한 세포 손상에서 산화 스트레스의 바이오 마커로 결정되었다. 이러한 결과는 CCl4가 대조군보다 MDA 수준을 유의하게 높이고 (도 9의 a), SOD 활성을 낮추는 것을 의미한다 (도 9의 b). ILF-E, ILF-R 및 ILF-AK는 CCl4로 처리한 HepG2 세포에서 MDA 수준과 SOD 활성을 유의하게 조절하였다. 구체적으로, ILF-E와 ILF-R는 ILF-AK보다 우수한 항산화 효과를 가지며, 이는 ILF-R에 첨가되는 추출물 중 ILF-E가 간 보호 상승에 유력한 물질임을 시사한다. 도 9는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 항산화 효과를 확인한 결과이다 (a: MDA 함량, B; SOD 활성).
(d) ILF-E
와
ILF-R
의
혼합비에 따른 항산화 효과 확인
항산화 효과 실험에 있어, HepG2 세포에서 ILF-E 및 ILF-R의 여러 비율의 제제 (ILF-RE (1:1), 1:0.5, 1:0.33 및 1:0.25)를 검증하여 가장 효과적인 혼합비를 결정하였다. MDA 분석 결과에 따르면 다른 제제보다 1:1 비율의 ILF-E와 ILF-R 추출물 혼합물, 즉 ILF-RE에서 CCl4에 의한 세포 손상이 유의하게 감소되었다 (도 10의 a, 도 11, 도 12). 또한, ILF-RE에서 SOD 수준도 유의하게 증가되었다 (도 10의 b, 도 11, 도 12). 도 10은 두충나무 추출물과 옻나무 추출물의 혼합물 (ILE-RE=ILF-R:ILF-E=1:1)의 항산화 효과를 확인한 결과이고 (a: MDA 함량, B; SOD 활성), 도 11은 ILF-E와 ILF-R의 혼합비에 따른 MDA 함량을 비교한 결과이며 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25), 도 12는 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 SOD 활성을 비교한 결과이다 ((a) 1:0.5, (b) 1:0.33, (c) 1:0.25).
<
실시예
4: 본 발명 두충나무 추출물 (ILF-E) 및 옻나무 추출물 (ILF-R)의 라디칼
소거능
확인>
뽕나무 추출물의 라디칼 소거 활성은 Blois (Re et al., 1999)에 의해 기술된 바와 같이 판단되었다. 별도의 시험관에 추출물 (0.5 ㎖)과 부틸화 히드 록시아니솔 (BHA) (2㎖)을 옮기고, 2,2-디페닐-1-피콜릴히드라질 0.1mM 에탄올 용액 2㎖를 첨가한 후 격렬하게 쉐이킹하였다. 시험관을 20℃에서 30분간 정치하였다. 대조군은 추출이나 에탄올이 없는 것만 제외하고 동일한 방식으로 제조되었다. 제조된 시료의 흡광도 변화를 517nm에서 측정하고 라디칼 소거 활성을 하기 수학식 1을 사용하여 저해율 (퍼센트)로 평가하였다.
ILF-RE (1:1), 1:0.5, 1:0.33 및 1:0.25 비의 ILF-E와 ILF-R 혼합물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가한 결과, 다른 ILF-E 및 ILF-R의 추출물 (1:0.5, 1:0.33 및 1:0.25) 제제보다 ILF-RE에서 HepG2 세포 내 활성이 용량에 따라 유의하게 증가하였다 (도 13). 도 13은 두충나무 추출물 (ILF-E)과 옻나무 추출물 (ILF-R)의 혼합비에 따른 라디칼 소거능을 비교한 결과이다 (a: ILE-RE (1:1), b: 1:0.5, c: 1:0.33, d: 1:0.25).
Claims (6)
- 옻나무 물 추출물 (Rhus verniciflua water extract)과 두충나무 물 추출물 (Eucommia ulmoides water extract)을 1:1의 부피 비율로 혼합한 혼합물을 함유하며, 사염화탄소(CCl4)에 의해 유도된 독성 간 손상 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 옻나무 물 추출물 (Rhus verniciflua water extract)과 두충나무 물 추출물 (Eucommia ulmoides water extract)을 1:1의 부피 비율로 혼합한 혼합물을 함유하며, 사염화탄소(CCl4)에 의해 유도된 독성 간 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
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| KR1020180064412A KR101923695B1 (ko) | 2018-06-04 | 2018-06-04 | 옻나무 추출물과 두충나무 추출물을 포함하는 간 기능 개선, 예방 또는 치료용 조성물 |
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