KR101097882B1 - 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과산화효소(peroxidase) 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하세는, 표면적 및 기공 부피가 큰 다공성 실리카의 기공 안에 과산화효소로서의 활성을 띄는 자성 나노 입자와 효소가 동시에 집적되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체는 다양한 질병의 마커가 되는 포도당, 갈락토스, 콜레스테롤 등의 소분자 물질, 단백질, DNA, 병원균 등을 민감하게 진단할 수 있고, 자성 나노 입자 및 효소를 다공성 실리카에 집적함으로써 단위 개체당 활성이 높아 고감도 정량 분석이 가능하며, 자성 나노입자를 이용하여 효율적인 분리와 재사용이 가능한 효과를 가진다.
자성 나노 입자, 다공성 실리카, 효소, 발색반응, 진단, 센서, CLEA

Description

과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법{Mesoporous Silica Conjugate Integrating Magnetic Nano Particles Having Peroxidase Activity and Enzymes and Method for Manufacturing the Same}
본 발명은 과산화효소(peroxidase) 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하세는, 표면적 및 기공 부피가 큰 다공성 실리카의 기공 안에 과산화효소로서의 활성을 띄는 자성 나노 입자와 효소가 동시에 집적되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사회가 고도화·현대화될수록 보다 오래, 건강하게 살고 싶은 인간의 욕구는 증가하고 있다. 특히 최근 의학기술의 비약적인 발전은 어떤 질병이라도 조기에만 발견하면 완치가 가능한 사회를 만들어가고 있기 때문에 질병 진단 기술이 더욱 중요해지고 있다. 또한 비싼 검출 기계 혹은 숙련된 기술자가 필요한 질병 진단 기술 보다, 일반인도 쉽고 간편하게 이용할 수 있는 진단방식의 기술 개발 역시 경제적 실현성 면에서 매우 중요하다. 이와 같은 필요성에 따라 질병원인이 되는 포도당, 갈락토스, 콜레스테롤 등의 소분자 물질, 단백질, DNA, 병원균 등을 보다 쉽게 고감도로 검출 및 정량하는 기술은 경제적·기술적으로 매우 중요하고, 산업적으로도 큰 파급효과를 가지며, 세계적으로 활발히 연구되고 있는 분야이다. 또한 질병진단의 또 하나의 중요한 흐름은 POCT (Point of care testing) 라고 하는 현장진단기술 분야로서, 이 기술은 숙련된 분석 수행자 없이 현장에서 즉각적이고 손쉽게 진단의 결과를 낼 수 있는 기술과 장치를 포함한다. 최근 새롭게 형성되고 있는 세계 POCT 시장은 보다 빠르고 손쉽게 질병을 진단할 수 있는 새로운 기술을 요구하고 있다.
요즘 고감도의 진단 기술을 개발하기 위한 전략으로서 많이 사용되고 있는 것은 다양한 나노 입자를 진단에 사용하는 것이며, 최근 자성 나노 입자가 과산화효소의 활성을 갖고 있음이 발표되었다.
그러나 이러한 자성 나노 입자를 보다 효율적이고 현실적인 과산화효소 대체물로서 사용하기 위해서는, 보다 효과적인 분리 및 재사용, 단위 개체 당 활성 및 민감도의 증가, 다른 효소와의 접근성 향상 등과 같은 문제점의 해결이 중요하다.
한국특허공개 제2006-61494호에는 실리카 코팅된 자성나노입자의 표면에 아민기 또는/및 클로로기를 도입하여 제조되는 기능성 실리카 자성나노입자 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제830,889호에는 자성물질로 이루어진 중심입자와 유기형광물질을 함유하는 실리카 화합물 껍질로 이루어져 있고, 표면에 세 툭시맵 항체가 도입된 나노 입자 및 이의 제조방법이 개시되어 있으나, 상기 특허들은 자성 나노 입자 자체의 과산화효소로의 활성을 이용한 것이 아니며, 핵산 분리 정제용 또는 대장암 진단용으로 나노입자의 용도가 한정되고, 입자 표면에 유기작용기 또는 항체가 부착되어 이들의 구조 변형이나 손실로 인하여 활성이 불안정한 문제점이 있다.
한국특허등록 제821,192호에는 자기물질을 포함하는 코어, 및 코어 외부에 유기형광물질을 포함하고, 표면 개질된 실리카 껍질로 싸여진 자성 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이 개시되어 있으나, 나노 입자 제조시, 다양한 화학 작용기 도입을 위하여 실리카 껍질을 표면 개질해야 하는 번거로움이 있다.
이에 상기 문제점을 해결하고자 본 발명자들이 예의 노력한 결과, 표면적과 기공 부피가 큰 다공성 실리카의 기공 내부에 먼저 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자를 집적한 다음, 남아있는 다공성 실리카의 기공에 효소를 고정화시켜 다공성 실리카 복합체를 제조하고, 이를 이용하여 효소의 대상 기질이 되는 물질을 손쉽게 고감도로 진단할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 과산화효소(peroxidase) 활성을 가지는 자성 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다공성 실리카 복합체를 이용한 바이오 분자 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자; 및 (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로써 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 다공성 실리카 안의 기공 내부에 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자를 침적시켜 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체를 제조하는 단계; 및 (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로써 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 상기 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체에 고정시키는 단계를 포함하는, 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자 및 효소를 함유하는 다공성 실리카 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다공성 실리카 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오분자 검출방법을 제공한다. 상기 검출방법은 (a) 상기 다공성 실리카 복합체, 검출하고자 하는 바이오분자가 포함된 시료 및 발색기질을 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 반응액의 흡광도를 측정하여, 바이오분자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체는 다양한 질병의 마커가 되는 포도당, 갈락토스, 콜레스테롤 등의 소분자 물질, 단백질, DNA, 병원균 등을 손쉽고 민감하게 발색 진단할 수 있고, 자성 나노 입자 및 효소를 다공성 실리카에 집적함으로써 단위 개체당 활성이 높아 고감도 정량 분석이 가능하며, 자성 나노입자를 이용하여 효율적인 분리와 재사용이 가능한 효과를 가진다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자; 및 (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로써 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체에 관한 것이다.
본 발명은 다공성 실리카의 기공 안에 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자를 고밀도로 집적한 후, 효소를 고정함으로써, 그에 따른 H2O2 검출반응을 통하여 효소의 대상 기질의 유무와 농도를 쉽게 정량할 수 있는 것이다.
본 발명에 있어서, 효소란 생체작용을 비롯한 다양한 화학반응을 촉매 작용하는 물질이며, 최근 질병진단을 위해 산업적으로 많이 사용되는데, 특히, 과산화효소(peroxidase)는 생물계에 보편적으로 존재하며, 범용적으로 사용되고 있는 산화환원효소로, 산화제로써 hydrogen peroxide 또는 alkyl peroxide를 사용한다.
본 발명에 있어서, “과산화효소가 촉매하는 반응”이란, 과산화효소가 촉매하는 모든 산화환원반응을 의미한다. 구체적으로, 도 2에 나타난 바와 같이, 일반적으로 상기 과산화효소 촉매 반응에는 산화 탈수소화반응(oxidative dehydrogenation), 산화 할로겐화반응(oxidative halogenation), 과산화수소 분해반응(H2O2 dismutation) 또는 산소-전이 반응(oxygen-transfer reaction) 등이 있다(Stefano Colonna, et al., Tibtech April 1999, vol. 17).
본 발명에서, “산화 탈수소화반응(oxidative dehydrogenation)”이란 과산화효소가 전자 전이에 의해 기질을 산화시키는 반응으로써, 다음의 반응식 1로 나 타낼 수 있다:
[반응식 1]
2SH +H2O2 → 2S· + H2O
본 발명에서, “산화 할로겐화반응(oxidative halogenation)”이란 과산화효소가 과산화수소와 할로겐화물 이온을 벤질/알릴 C-H결합을 활성화시키는 기질의 탄소원자를 할로겐화시키는 반응이며, 다음의 반응식 2로 나타낼 수 있다:
[반응식 2]
SH + H2O2 + H(+) +X(-) → SX +2H2O (X= Cl, Br, I)
본 발명에서, “과산화수소 분해반응(H2O2 dismutation)”이란, 과산화효소 촉매가 과산화수소를 물(H2O)과 산소(O2)로 분해하는 반응이며, 다음의 반응식 3으로 나타낼 수 있다:
[반응식 3]
2H2O2 → 2H2O + O2
본 발명에서, 산소-전이 반응(oxygen-transfer reaction)이란, 과산화효소에 의해 산소원자가 유기 기질로 거울이성체-선택적으로(enantioselective) 도입되는 것을 의미하며, 다음의 반응식 4로 나타낼 수 있다:
[반응식 4]
SH + H2O2 → SOH + H2O
본 발명에 있어서, 상기 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질은 상기 반응식들에서 나타난 바와 같이, 과산화수소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소는 산화효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 산화효소란 산화반응에 작용하는 효소를 통틀어 이르는 말이며, 글루코스 산화효소, 잔틴산화효소, 시토크롬 산화효소, 아스코르브산 산화효소 등이 있으며, 정식으로는 기질 이름에 산화환원효소(oxidoreductase)를 붙여서 부르는 효소군이며, 그 관용명으로 옥시다아제라는 이름이 쓰인다. 산화효소 반응에 의하여 기질이 산화됨과 동시에 산소가 환원되는데 그때 산소가 과산화수소가 되는 것과 물로 되는 것으로 크게 나뉜다. 과산화수소가 되는 예에는 푸른곰팡이류에 존재하는 글루코스 산화효소, 생우유나 간 등에 존재하는 잔틴산화효소, 동물조직 중에 존재하는 D-아미노산산화효소 등이 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 산화효소는 포도당 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 갈락토스 산화효소, 피라노스 산화효소, 락토즈 산화효소, 헥소스 산화효소 및 글루타메이트 산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물은, 상기 반응식들에서 나타난 바와 같이, 물(H2O) 또는 산소(O2)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로써 이용하는 효소는 루시퍼라제(Luciferase)인 것을 특징으로 할 수 있는데, 루시퍼라제는 산소 와 루시페린(luciferin) 존재하에 발색 시그널을 나타내는 효소로서, 이를 이용해 자성 나노입자-루시퍼라제 다공성 실리카 복합체를 이용하여 과산화수소 검출을 발색할 수 있는 시스템을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 실리카란 직선, 육각형, 정육면체 등의 규칙적인 배열로 2-100nm 의 기공을 가지는, 메조포러스 실리카(mesoporous silica) 또는 실리케이트를 의미한다. 본 발명의 다공성 실리카는 상기 자성 나노입자와 산화효소를 고정시키기 위하여 기공이 형성된 실리카로서, MSU(Mishigan State University)계열, MCM계열, SBA계열 및 KIT계열 등이 개발되었으며, 더욱 바람직하게는, 기공(pore) 안에 효소의 집적을 위하여 기공 사이즈가 충분히 큰 MSU-F를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자는 강자성을 띠는 입자로서 일반적으로 크기는 약 10nm이고, 그 종류로는 산화철(Fe2O3, Fe3O4), Ferrite(Fe3O4에서 Fe 하나가 다른 자성관련 원자로 바뀐 형태, 예를 들어, CoFe2O4, MnFe2O4), 합금(자성원자들로 인해 나타나는 산화문제, 전도성 및 안정성을 높이기 위해 귀금속과 합금시킨 것, 예를들어, FePt, CoPt 등) 등으로 다양하며, 상기 자성 나노 입자는 습식법, 건조법 또는 진공법 등 통상적인 입자 제조 방법에 의해 형성될 수 있다.
상기 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자는 마그네타이트, 헤마타이트, 마그헤마이트 및 소프트페로마그네틱으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특 징으로 할 수 있는데, 바람직하게는 마그네타이트를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 실리카의 기공 직경은 10~30nm 인 것을 특징으로 할 수 있는데, 직경이 10nm 미만이면 효소의 크기 (6-7 nm) 와 비교할 때 일반적으로 집적에 문제가 있고, 직경이 30 nm를 초과하면 다공성 실리카에서 특징적으로 나타나는 효소의 안정성 증가가 저해되므로, 본 발명에서는 기공 직경이 10~30nm의 다공성 실리카가 바람직하다.
구체적으로, 본 발명에서는 10~30nm 직경의 기공을 지닌 다공성 실리카의 기공 안에 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노입자를 고밀도로 집적할 수 있게 하고, 남아 있는 기공 안에 다양한 효소를 고정화함으로써 유·무기 실리카 복합체를 간편하게 구현할 수 있다. 예를들어, 고정화된 효소와 자성 나노 입자의 연계반응을 통하여 효소의 대상 기질의 유무와 농도를 발색반응을 통하여 쉽게 정량할 수 있다(도 3).
본 발명에 있어서, 상기 다공성 실리카 복합체의 표면에 단백질, RNA, DNA, 바이러스, 병원체, 호르몬, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소로 표지된 물질 및 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 구성된 군에서 선택되는 물질이 추가로 부착되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 물질들은, 다공성 실리카 복합체의 표면에 직접 도입되거나, 표면에 화학적 작용기 (예컨대, -COOH, -NH2, -SH 등)의 표면개질을 통하여 결합될 수 있을 것이 다. 예컨대, 다공성 실리카의 표면에 Aminopropyl triethoxysilane (APTES)를 80℃에서 끓여 줌으로써 반응시켜, -NH2 반응기를 결합시키며, 3-mercaptopropyl trimethoxysilane 을 반응시킴으로써 -SH 반응기를 결합시킬 수 있다. -COOH 반응기는 -NH2가 결합된 다공성 실리카에 succinic anhydride 를 반응시킴으로써 결합시킬 수 있다. 상기 작용기들은 생체 물질의 표면과 화학적 공유 결합을 통해 결합시킬 수 있다. 예컨대, -NH2 와 -COOH 와의 결합은 EDC-NHS 반응으로 결합시킨다. 즉, EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride는 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 가 존재할 때, COOH와 반응해 amine-reactive intermediate 를 형성해서 NH2 와 반응해 amide 결합을 형성한다. 위와 같은 방법으로 생체 물질과 다공성 실리카를 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 종양마커는 리간드, 항원, 수용체 또는 이들을 코딩하는 핵산일 수 있다.
종양 마커가 "리간드"인 경우에는, 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체 표면에 도입할 수 있는데, 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린 (integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴 (angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소 마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드 (vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체 표면에 도입할 수 있는데, 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산 (IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.
종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체 등이 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체 표면에 도입할 수 있는데, 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체, 바람직하게는, 항체가 적합할 것이다.
여기서, 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, 항체의 Fc 영역에 있는 리신의 -NH2, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 다공성 실리카 복합체 표면과 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다. 예컨대, 복합체 표면에 직접 도입되거나, 복합체 표면을 상기 작용기와 유기적으로 결합하는 작용기로 개질함으로써 도입될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물 (예, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다. 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체 표면에 당업계에 알려진 여러 방법을 통해 도입할 수 있다.
또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 실리카 복합체 표면과 직접적으로 또는, 상기 작용기와 유기적으로 결합하는 작용기로의 표면 개질을 통해 도입될 수 있다. 이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
즉, 본 발명에 따른 자성 나노 입자-다공성 실리카-효소 복합체의 표면에 전술한 특정 물질을 추가로 결합시킴으로써, 이들의 상보적 결합에 의한 발색에 의해 질병의 진행에 대한 특정 정보를 제공하는 물질의 분석에 사용할 수 있는 것이다.
본 발명에 따른 다공성 실리카 복합체는 추가적으로, 병원균 DNA, 단백질, 병원균의 검출 및 진단에 사용될 수 있는데, 병원균 DNA와 특징적으로 결합하는 DNA Probe를 본 복합체의 표면에 부착시키거나, 혹은 질병원인이 되는 단백질 및 병원균과 특징적으로 결합하는 항체를 본 복합체의 표면에 부착시킨 후, 미지의 샘플과의 반응을 통해 자성 나노 입자-다공성 실리카를 특정 DNA, 단백질, 병원균과 결합시킨다. 이후, 발색반응을 일으키는 기질을 추가함으로써 간단히 색의 변화로서 검출 및 진단할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 다공성 실리카의 기공 내부에 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자를 침적시켜 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체를 제조하는 단계; 및 (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로써 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 상기 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체에 고정시키는 단계를 포함하는, 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자 및 효소를 함유하는 다공성 실리카 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 실리카는 MSU 계열, SBA 계열, MCM 계열 및 KIT 계열로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 과산화효소 활성을 가지는 자성 나노 입자는 마그네타이트, 헤마타이트, 마그헤마이트 및 소프트페로마그네틱으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 고정은 CLEA(Crosslinked Enzyme Aggregate) 방법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체는 먼저, 자성 나노 입자를 다공성 실리카 안에 균일하게 침전시킴으로써 간편하게 생성된다. 이후 효소의 효율적인 고정화를 위해서 CLEA(Crosslinked Enzyme Aggregate) 형태의 포집 방식을 사용한다. CLEA 방식의 포집을 위하여, 먼저 산화효소를 물리적 흡착을 통해 실리카 기공 안에 흡착시킨 후 가교제로 glutaraldehyde를 사용하여 효소끼리 가교결합을 통하여 기공 안에 효소 분자 덩어리를 형성한다. 상기 형성된 효소 분자 덩어리는 실리카 기공 안에서 잘 빠져나가지 않아 효소 분자의 손실을 줄일 수 있으며, 효소의 3차원 구조 변형을 억제해 효소의 활성을 보다 안정적으로 유지할 수 있다(Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 96(2): 210-218, 2007).
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다공성 실리카 복합체와 검출하고자 하는 바이오분자가 포함된 시료를 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 발생된 H2O2를 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오분자 검출방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 상기 다공성 실리카 복합체, 검출하고자 하는 바이오분자가 포함된 시료, 및 발색 기질을 반응시키는 단계; 및 상기 반응액의 흡광도를 측정하여, 바이오분자를 검출하는 단계를 포함하는, 바이오 분자 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 H2O2의 검출은 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 전기화학적 반응을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이 때, 형광반응은 시료와 과산화효소 활성을 가진 자성나노입자와 반응하여 형광을 나타내는 방식에 의해 H2O2를 검출하는 방법으로, 예를 들어 Amplex-Red는 Peroxidase와 H2O2가 있을 때 Resorufin 이라는 형광기질을 발생함으로써, 과산화수소의 검출이 가능하다.
또한, 발광반응의 경우, luminol 이라는 발광 기질을 이용하여 간단히 luminescence를 측정함으로써 검출할 수 있다.
또한, 전기화학적 반응(electrochemistry)은 시료에 전기화학적 처리를 수행하여 과산화수소를 검출하는 방법으로, 과산화효소 활성을 가진 자성 나노 입자가 H2O2의 환원(reduction)에 의해 발생하는 전자의 흐름에 따른 전기적인 signal을 검출할 수 있다. 예컨대, 대표적인 예로, HRP(horse radish peroxidase)와 H2O2에 의한 효소반응을 통해 전자 이동에 의한 흐름을 전기적 신호로 검출하는 방법을 예로 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발색기질은 과산화효소 및 과산화수소와 같이 특정 색깔 반응을 나타내는 기질로써, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 Amplex-Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 바이오 분자는 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 전술한 바와 같이 자성 나노입자와 효소를 다공성 실리카에 간편하게 고정화시켰다. 상기 제조된 다공성 실리카 복합체의 성능 분석을 위하여, 본 발명의 실시예에서 발색 기질인, ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine) 및 Amplex-Red(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)를 이용하여 과산화수소 및 고정화한 효소의 대상 기질의 유무 및 정량분석을 수행하였다(도 4). 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 임상적으로 중요한 기질인 포도당과 콜레스테롤을 색으로 분석하는 시스템 개발을 위하여 포도당 산화효소와 콜레스테롤 산화효소를 각각 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체에 같이 고정화함으로써 대상 물질의 발색 센서를 구현하였다(도 5 및 도 6).
본 발명을 이용한 고정화를 수행하게 되면, 과산화효소를 사용하지 않고, 색을 이용한 고감도의 정량 분석이 가능하다. 종래 진단방법에서 사용된 과산화효소는 본질적으로 단백질 기반의 유기 효소이므로 시간에 따른 필연적인 단백질 구조의 변성과 활성의 감소가 있지만, 본 발명의 다공성 실리카 복합체는 과산화효소 대신 무기물인 자성 나노 입자를 사용하기 때문에 보다 안정적인 시스템이다. 또한 다공성 실리카에 자성 나노 입자를 집적함으로써 단위 개체당 활성을 높임으로써 고감도 정량 분석이 가능하며, 자력을 이용한 보다 효율적인 분리와 재사용이 가능 하다(도 7). 산화효소와의 다공성 실리카를 이용한 연계 반응을 통한 경제적·산업적으로 중요한 물질의 정량 분석이 육안을 통한 색 차이로 손쉽게 가능하기 때문에 비용적인 측면에서도 매우 우수하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체 제조
1-1 : MSU-F 다공성 실리카 제조
MSU-F 다공성 실리카는 다음과 같은 반응을 통하여 제조하였다. (Kim et al., Chem. Comm. 1661-1662, 2000) 9.8 g triblock copolymer pluronic P123, 4.4 ml 아세트산, 5.9g 1,3,5-트리메틸벤젠을 200 mL 물에 녹인 후 60℃에서 2 시간 동안 반응시켜, 원하는 나노구조를 만들 수 있는 oil-in-water 에멀젼(emulsion)이 만들었다. 위 반응물에 16 mL 실리카 나트륨(sodium silica)을 넣어 60℃에서 20 시간동안 반응시킨 후, 100℃에서 하루 동안 에이징(aging) 과정을 거쳤다. 550℃에서 하소(calcination)를 통해 block copolymer를 제거함으로써, 기공의 직경이 약 25nm 인 다공성 실리카를 제조하였다.
1-2 : 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체 제조
다공성 실리카에 자성 나노 입자의 고정화는 다음과 같은 방법을 이용하였다. 먼저, Fe(NO3)3·6H2O 6.97g와 실시예 1-1에서 제조한 다공성 실리카 2g을 80 ml 에탄올(ethanol)에 녹이고, 상기 용액을 에탄올(ethanol)이 모두 증발할 때까지 휘저어(stirring)주었다. 그 후, 남아 있는 분말(powder)을 argon(95%)/hydrogen(5%) mixture gas 상에서 400℃에서 6 시간 열처리하였고, 상기 반응에 의한 모세관 현상을 통해, 다공성 실리카의 기공 안에 자성 나노 입자인 마그네타이트가 집적된 형태의 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체의 형성을 TEM(도 1의 하단사진), XRD(도 8) 등으로 확인하였다. 하기, 표 1은 XRD 실험 샘플의 처리 조건 및 자성나노입자인 마그네타이트 크기를 나타낸 것이다.
[표 1]
종류 마그네타이트 크기 (nm)
20% loading, 400℃ 처리 14
40% loading, 400℃ 처리 16
20% loading, 330℃ 처리 10.4
40% loading, 330℃ 처리 13.6
실시예 2 : 자성 나노 입자-다공성 실리카를 이용한 발색 센서
실시예 1에서 제조된 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체에 미리 제조된 ABTS, TMB 및 Amplex-Red 를 sodium acetate buffer (0.2 M, pH 4.0) 45℃ 조건에 서 투입하여 반응물 안의 H2O2 양을 발색 반응으로 측정하였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다. 즉, 20 wt% 및 40 wt% 만큼 마그네타이트가 로딩된 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체 0.2 mg/mL와 발색 기질 ABTS, TMB 를 1 mM, Amplex-Red 0.2 mM, H2O2 10 mM을 sodium acetate buffer (0.2 M, pH 4.0)에 incubation 하고, 45℃에서 30분간 반응시킴으로써 발색 변화를 관찰하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 ABTS 의 경우 녹색 (도 4(A)), TMB 의 경우 파란색 (도 4(B)), 그리고 Amplex-Red 의 경우 붉은색 (도 4(C)) 이 H2O2에 따라 발색되었고 흡광도 및 형광 스캐닝의 결과도 H2O2의 유무에 따른 특정한 흡광도를 보임으로써, 효소가 고정화된 자성나노입자가 과산화효소로 작용하는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 자성 나노 입자-다공성 실리카-효소 복합체의 제조 및 발색 센서로의 응용
3-1. 포도당 산화효소를 이용한 자성 나노 입자-다공성 실리카-산화효소 복합체의 제조 및 발색 센서로의 응용
실시예 1에서 제조된 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체에 특정한 효소를 같이 고정화함으로써 효소가 기질과 만나 발생하는 H2O2에 따른 발색 반응을 통한 특정 물질의 유무와 농도를 발색 측정하였다.
먼저, 포도당 발색 측정을 위하여, 상기 자성 나노 입자-다공성 실리카 100 mg 당 포도당 산화효소를 30wt% 만큼 CLEA(Crosslinked enzyme aggregate) 방식으로 포집하여 다음과 같이 고정화하였다. 먼저 10 mg 다공성 실리카당 5 mg/mL 포도당 산화효소를 물리적 흡착인 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 이용하여 30분간 인큐베이션 함으로써 흡착시켰고, Washing 후 가교제로서 0.1wt% glutaraldehyde를 30분간 처리하였다. 가교제 처리 후, 남아 있는 알데하이드(Aldehyde) 작용기를 없애기 위해 Tris-HCl 버퍼로 세척하여, 포도당 산화효소를 다공성 실리카의 기공 안에 CLEA 방식으로 고정화하였다.
그 결과, 발색기질로 ABTS를 가할 때 포도당이 있는 경우에만 녹색으로 색이 전환되는 것을 육안으로 확인할 수 있었고, 그에 따른 흡광도 스캐닝을 확인할 수 있었다(도 5(A)).
TMB를 발색 기질로 사용하여 포도당(glucose) 측정을 하여, 포도당이 있을 때에만 파란색으로의 색 변화를 확인하였고, 역시 그에 따른 흡광도 변화를 관찰하였으며, Lactose, arabinose, galactose, fructose 등 다른 당을 가하였을 경우는 buffer를 가하였을 때처럼 색과 흡광도가 변하지 않는 것을 확인하였다(도 5(B)).
이에 따라 자성 나노 입자-다공성 실리카에 포도당 산화효소를 고정화 할 경우, 발색을 통하여 고민감도의 포도당 측정이 가능하였다.
3-2. 콜레스테롤 산화효소를 이용한 자성 나노 입자-다공성 실리카-산화효소 복합체의 제조 및 발색 센서로의 응용
콜레스테롤 발색 측정을 위하여, 콜레스테롤 산화효소를 상기 자성 나노 입자-다공성 실리카에 다음과 같이 고정화하였다. 먼저 10 mg 다공성 실리카당 4 mg/mL 콜레스테롤 산화효소를 물리적 흡착을 이용하여 30분간 흡착시키고, 세척(Washing) 후 가교제로서 0.1 wt% glutaraldehyde 를 30분간 처리하였고, 가교제 처리 후, 남아 있는 Aldehyde 작용기를 없애기 위해 Tris-HCl 버퍼로 세척하여, u콜레스테롤 산화효소를 다공성 실리카의 기공 안에 CLEA 방식으로 고정화하였다.
ABTS를 사용하여 콜레스테롤 발색 측정을 한 결과, 콜레스테롤 있는 반응 튜브의 경우 녹색으로 발색함을 확인하였고, 그에 따라 417nm에서 흡광도 증가를 관찰하였다. 반응 튜브에 포도당이나 글리세롤이 있는 경우는 발색하지 않음을 확인하였다 (도 6).
따라서, 자성 나노 입자-다공성 실리카에 상기와 같이 효소를 고정화시킴으로써 자성 나노 입자의 과산화효소 활성과 특정 효소의 활성을 결합시켜 포도당, 갈락토스, 콜레스테롤 등의 효소의 대상 기질의 유무 및 농도를 매우 민감하게 검출하는 데 성공하였다.
또한, 상기와 같이 효소의 고정 뿐만 아니라, 효소가 고정된 복합체 표면에 다양한 질병의 정보를 제공할 수 있는 마커 물질인 단백질, DNA, 병원균 등과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 추가적으로 결합시킴으로써, 이들 생체물질의 확인에, 손쉬운 발색 검출에 응용할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 4 : 자석을 이용한 자성 나노 입자-다공성 실리카-효소 복합체의 분리 및 재사용 평가
다공성 실리카 복합체의 자성을 이용한 간단하고 효율적인 분리 및 재사용 가능성의 평가를 위하여, 도 7(B) 에 나타난 바와 같이, 자석을 사용하여 자성나노입자-다공성 실리카-포도당 산화효소 복합체가 얼마나 빨리 완벽하게 포집되는지 육안으로 관찰하였다. 그 결과, 자석이 가해진 지 20-30초 이내에 다공성 실리카 복합체가 자석 쪽으로 끌려오는 것을 확인하였다. 또, 단백질 정량 assay로 확인한 결과, 산화효소도 CLEA 형태로 다공성 실리카 복합체 안에 포집되어 있으므로 자석을 이용한 재사용 중에 손실이 없었다. 따라서 효소의 활성이 거의 유지됨을 확인할 수 있었다.
이 성질을 이용하여, 상기에서 설명했던 과정들, 즉, ABTS를 이용한 발색 반응-자석을 이용한 포집-생성물 흡광도 측정-반응물 및 생성물 제거(상청액 제거)-3번 washing-다시 ABTS 반응을 하는 Cycle을 이용하여 재사용 효율을 측정하였다. 그 결과, 도 7(A) 에 나타난 바와 같이, 다공성 실리카 질량 대비 40 wt% 자성 나노 입자가 고정화된 다공성 실리카에 CLEA 방식으로 포도당 산화효소가 고정화된 경우 30회의 자력을 이용한 재사용 동안 원래 활성의 90% 이상 유지되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 검은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1의 (a)는 본 발명의 모식도를 나타낸 것으로, 다공성 실리카의 큰 기공 부피와 표면적을 이용해 자성 나노 입자와 효소를 같이 고정화함으로써, 나노스케일 센서인 다공성 실리카 복합체를 제조한 것이고, (b)는 다공성 실리카 복합체의 TEM 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 자성 나노입자의 과산화효소 활성에 의해 촉매되는 반응들을 예시적으로 나타낸 것이다 (a: 산화성 탈수소화반응; b: 산화성 할로겐화반응; c: H2O2 분해반응; d: 산소 전이 반응).
도 3은 본 발명에 따른 자성 나노 입자가 다공성 실리카에 집적된 무기 복합체에 효소를 같이 고정화함으로써, 효소의 대상 기질의 유무 및 농도를 색변화로써 쉽게 측정 및 정량하는 반응식을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 자성 나노 입자-다공성 실리카 무기 복합체에 의한 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (A), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine) (B), 및 Amplex-Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) (C) 의 산화Red (통하여 과산화수소의 유무를 색으로 쉽게 측정한 결과 및 흡광도 스캐닝한 결과를 나타낸 것이다((A): a) Buffer with 6 mM ABTS, b) 6 mM ABTS + 다공성 실리카 복합체, c) 6 mM ABTS +10 mM H2O2, d) 6 mM ABTS + 10 mM H2O2 + 다공성 실리카 복합체; (B): a) 6 mM TMB + 다공성 실리카 복합체, b) 6 mM TMB +10 mM H2O2, c) 6 mM TMB + 10 mM H2O2 + 다공성 실리카 복합체; (C): a) 6 mM Amplex-Red + 다공성 실리카 복합체, b) 6 mM Amplex-Red +10 mM H2O2, c) 6 mM Amplex-Red + 10 mM H2O2 + 다공성 실리카 복합체).
도 5는 자성 나노 입자-다공성 실리카-포도당 산화효소 복합체를 이용한 포도당 측정의 사진 (ABTS (A), TMB (B)) 과 흡광도 스캐닝한 결과를 나타낸 것이다((A): a) 0.5 mM glucose, b) 5 mM lactose, c) 5 mM arabinose, d) 5 mM galactose e) 5 mM fructose, f) buffer; (B): a) 0.5 mM glucose, b) 5 mM lactose, c) 5 mM arabinose, d) 5 mM galactose e) 5 mM fructose, f) buffer).
도 6은 자성 나노 입자-다공성 실리카-콜레스테롤 산화효소 복합체를 이용한 콜레스테롤 측정의 사진(ABTS)과 흡광도 스캐닝한 결과를 나타낸 것이다(a) 0.5 mM cholesterol, b) buffer, c) 5 mM glycerol, d) 5 mM glucose).
도 7의 (A)는 본 발명에 따른 자성 나노 입자-다공성 실리카-포도당 산화효소 복합체의 자력을 이용한 빠른 복합체의 분리(CLEA-GOx in MPS: CLEA 방식으로 고정된 다공성 실리카 복합체, Ads-GOx in MPS: 물리적 흡착으로 고정된 다공성 실리카 복합체) 및 (B)는 이를 이용한 재사용 효율을 나타낸 그래프와 사진이다.
도 8은 실시예 1에서 제조된 자성 나노 입자-다공성 실리카 복합체의 magnetite XRD 분석과 고정화된 분석된 자성 나노 입자의 크기를 나타낸 것이다.

Claims (22)

  1. (a) 마그네타이트 나노입자; 및 (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로서 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는 다공성 실리카 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과산화효소가 촉매하는 반응은 산화 탈수소화반응(oxidative dehydrogenation), 산화 할로겐화반응(oxidative halogenation), 과산화수소 분해반응(H2O2 dismutation) 및 산소-전이 반응(oxygen-transfer reaction)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소는 산화효소인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 산화효소는 포도당 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 갈락토스 산화효소, 피라노스 산화효소, 락토즈 산화효소, 헥소스 산화효소 및 글루타메이트 산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물은 물(H2O) 또는 산소(O2)인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로서 이용하는 효소는 루시퍼라제(Luciferase)인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리카는 MSU(Mishigan state University) 계열, SBA(Santa Barbara) 계열, MCM(Mobil Composition of Matter, Mobil Co.) 계열 및 KIT(Korea Advanced Institute of Science and Technology, KAIST) 계열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 다공성 실리카는 MSU-F(Mishigan state University-F)인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리카의 기공 직경은 10~30nm 인 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리카 복합체의 표면에 단백질, RNA, DNA, 바이러스, 병원체, 호르몬, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소로 표지된 물질 및 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 구성된 군에서 선택되는 물질이 추가로 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 다공성 실리카 복합체.
  14. 다음 단계를 포함하는, 마그네타이트 나노입자와 효소가 다공성 실리카의 기공 내에 고정되어 있는, 제1항의 다공성 실리카 복합체의 제조방법:
    (a) 다공성 실리카의 기공 내부에 마그네타이트 나노입자를 침적시켜 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체를 제조하는 단계; 및
    (b) (i) 과산화효소가 촉매하는 반응의 기질을 제공하는 효소 및 (ii) 과산화효소가 촉매하는 반응의 산물을 기질로서 이용하는 효소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 상기 다공성 실리카-자성 나노 입자 복합체의 기공 내에 고정시키는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다공성 실리카는 MSU(Mishigan state University) 계열, SBA(Santa Barbara) 계열, MCM(Mobil Composition of Matter, Mobil Co.) 계열 및 KIT(Korea Advanced Institute of Science and Technology, KAIST) 계열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서, 상기 (b)단계의 고정은 CLEA (Crosslinked Enzyme Aggregate) 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항의 다공성 실리카 복합체와 검출하고자 하는 바이오분자가 포함된 시료를 반응시킨 다음, 상기 반응에 의해 발생된 H2O2를 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오 분자의 검출방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 H2O2의 검출은 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 전기화학적 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 방법은 (a) 제1항의 다공성 실리카 복합체, 검출하고자 하는 바이오분자가 포함된 시료, 및 발색기질을 반응시켜 반응물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 반응물의 흡광도를 측정하여, 바이오분자를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 또는 Amplex-Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 바이오 분자는 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균인 것을 특징으로 하는 방법.
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