CN104837556B - 包埋在大孔支架中的酶形成的介孔集合 - Google Patents

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Abstract

一种分级催化剂组合物，所述组合物包含连续的或颗粒的大孔支架，在所述支架中掺入了磁性纳米颗粒的介孔聚集物，其中酶包埋在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的介孔中。本申请还描述了合成所述分级催化剂组合物的方法。本申请还描述了使用可回收的分级催化剂组合物来解聚木质素、治理被芳香族物质污染的水、通过自由基机制将单体聚合、烯烃环氧化、苯酚的卤化、抑制溶液中的微生物生长和功能，以及将二氧化碳转化为甲醇的过程。本申请还描述了用于增加液相化学反应的空间时间收率和/或总周转数量的方法，所述液相化学反应包括磁性颗粒以促进所述化学反应，所述方法包括将所述化学反应置于具有选定的磁性强度、在所述化学反应中的相对位置和相对运动的多个磁场中。

Description

包埋在大孔支架中的酶形成的介孔集合
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年10月5日提交的美国临时申请号61/710,110和2013年2月21日提交的美国临时申请号61/767,477的优先权，两个申请的全部内容通过引用并入本申请。
关于联邦赞助研究的声明
本发明是在东北太阳经费组织(Northeast Sun Grant Initiative)的合同中规定的政府资助下在康奈尔大学进行的，该合同号为美国运输部资助#DTOS59-07-G-00052。政府拥有本发明的部分权益。
发明背景
过氧化物酶(EC 1.11.1)在生物系统中广泛存在，并且形成了氧化还原酶子亚类，所述氧化还原酶亚类将过氧化氢(H2O2)还原成水，从而氧化多种类型的芳香化合物，范围从苯酚到芳香胺。过氧化物酶的反应循环相当复杂，起始于通过H2O2活化亚铁血红素以形成两电子活化的化合物I(N.C.Veitch，Phytochemistry，2004，65，249)。通过氧化有机底物，化合物I的一个电子被还原，以形成比静息状态多一个电子的化合物II。第二次还原使酶恢复到其静息状态以开始新的循环。总体而言，每消耗一分子的过氧化氢，则生成两个芳香自由基，并且所述芳香自由基在次级反应中容易反应。
过氧化物酶对底物抑制高度敏感，通常由H2O2引起，所述抑制可以形成酶的可逆的无活性形式(化合物III)。产物抑制也可以阻止酶活性。因此，与过氧化物酶相关的复杂的动力学限制了它在很多方法和生物方法中的应用。增加这个家族和其他家族的酶的活性和其对不同工艺条件的耐受性可以改善其目前的用途，并且也为其在新用途中的应用创造条件。
发明简述
本申请发现，由与磁性纳米颗粒(MNP)自体组装的酶(特别是产生自由基(FRP)的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP))所组成的生物纳米催化剂(BNC)具有增强的酶活性。具体而言，本申请发现，跟游离酶或者不含酶的磁性纳米颗粒簇相比，酶与磁性纳米颗粒的自体组装簇通常具有更快的酶周转(turnover)和更低的酶抑制。另外，本申请还发现MNP的大小和磁性影响BNC的形成，并且最终影响其结构，所有这些都对所包封的酶的活性有很大影响。特别是由于其在各种反应条件下具有令人惊讶的顺应力，本申请所述BNC可以作为改良的酶试剂或催化试剂用于当前使用其他此类试剂的情形，并且其也可进一步用于酶尚未被考虑或尚未被发现适用的其他应用。
本申请所述应用不同于传统方法，传统方法依赖于通过复杂的生物化学将蛋白质结合在表面改良的颗粒上，通常以酶的活性和反应效率为代价。通过本方法，只有当酶与MNP紧密结合时，如作为初级(primary)MNP微晶与过氧化物酶的自体组装簇(聚集)时，酶动力学才被实质性(substantially)改变。在生物相关的底物浓度下，所得的BNC的整体活性可以优选地比游离酶或MNP的活性高出若干个数量级。
在一个方面，本发明涉及在磁性纳米颗粒或其簇中包埋(即包封)了酶的组合物。在特定实施方式中，组合物是磁性纳米颗粒和一种酶或者一组酶(例如FRP酶类)的介孔的成簇集合。介孔的成簇集合具有包埋了酶的介孔。在其他实施方式中，前述成簇组合物包含磁性纳米颗粒，在其表面上包被有贵金属例如金。
在其他实施方式中，前述磁性纳米颗粒(BNC)的介孔聚集物掺入到大孔支架中，以形成具有第一级和第二级集合的分级催化剂集合。大孔支架可以构造成微米大小的磁性颗粒的集合，或者可以是并非从颗粒构建的连续支架，或者甚至是两者组合。这样得到酶功能化的高度大孔和介孔的磁性固体的组合，这样有利于固定任何具有小的扩散性底物和产物的酶。由于至少存在BNC，所以整个分级催化剂集合是磁性的。
就连续的大孔支架而言，在第一组实施方式中，BNC掺入的连续大孔支架是磁性的。由于由磁性聚合物组合物组成和/或由于其中包埋了不属于BNC的磁性颗粒(如不与酶结合的磁性纳米颗粒或微粒)，连续的大孔支架可以是磁性的。在第二组实施方式中，BNC掺入的连续支架是非磁性的；然而，由于其中至少存在掺入的BNC，所以包含非磁性支架的整个分级催化剂集合仍然是磁性的。
本发明还涉及用于生成上述包埋酶的磁性纳米颗粒的方法。在一些实施方式中，首先制备磁性纳米颗粒或其聚集物，然后在其中吸附酶。在其他实施方式中，通过在存在酶的条件下组装单分散的磁性纳米颗粒来生成包埋酶的磁性纳米颗粒组合物，由此通过自体组装机制将酶包埋在MNP的簇中。
本发明也涉及用于生成上述分级催化剂集合的方法，在所述分级催化剂集合中，磁性纳米颗粒(BNC)的介孔聚集物被掺入到连续的或颗粒状的大孔支架中。在所述方法中，BNC在溶液中与大孔支架接触，从而将BNC基本上(substantially)包埋进入大孔支架的大孔中。在连续大孔支架的特定情况中，连续的大孔支架可以通过模板法来生成，所述模板法包括(i)生产复合物(composite)，所述复合物包含在其中包埋了牺牲模板剂的支架前体材料，和(ii)选择性除去牺牲模板剂以便在连续的前体材料中产生大孔。在更具体的实施方式中，模板法包括溶剂模板化法，其中在支架前体材料中包埋的溶剂被用作模板剂。将含有包埋了溶剂的支架前体材料的复合物冷却，直到所包埋的溶剂冷冻形成溶剂晶体，然后通过蒸发或升华来除去冰冻的溶剂以生成支架前体材料中的大孔。当溶剂是水时，溶剂模板法可以被视为冰模板化法。
在其他方面，本发明涉及使用上述包埋酶的磁性纳米颗粒组合物的方法。在特定的实施方式中，包埋酶的磁性纳米颗粒组合物用于解聚木质素的方法、从水中除去芳香族污染物的方法、通过自由基机理将单体聚合生成聚合物的方法、烯烃环氧化作用的方法、苯酚的卤化反应的方法、在溶液中抑制微生物的生长和功能的方法以及将二氧化碳转化为甲醇的方法。
在其他方面，本发明涉及在包含磁性颗粒(例如任意的BNC或其分级催化剂集合)的液相化学反应中增加空间时间收率和/或总周转数量，从而促进化学反应的方法。在所述方法中，将其中包含磁性颗粒的液相化学反应置于具有选定磁性强度、在液相化学反应中的相对位置和相对运动的多个磁场中，从而在空间上限制所述磁性颗粒，其中所述多个磁场的磁性强度、相对位置和相对运动是由电流被适当地控制或调整的电磁体系统所提供。
由于包含了掺入到大孔构架中的BNC的整体分级集合具有较大的尺寸和整体磁性(mass magnetization)，所以包含酶的BNC可以更加容易地被外部磁场所捕获，因此更容易从反应介质中除去。简化的移除进一步允许对催化剂更方便的重新利用。本申请所述分级组装的催化剂的另一个益处是，较大的尺寸有助于保留酶的活性。另外，当置于用于除去BNC或增强反应的磁场中时，与磁性微粒表面结合的BNC不容易发生过量聚集。
附图简述
图1A、1B：形成包含BNC的分级催化剂集合的第一级集合，所述BNC由磁性纳米颗粒的介孔聚集物与辣根过氧化物酶组成(图1A)，以及通过将BNC掺入到由冰模板化的纤维素组成的大孔支架中来形成第二级集合(图1B)。
图2A、2B：单螺旋(图2A)和双螺旋(图2B)磁性捕捉的排布，特别用于水的治理和/或芳香族化合物的自由基聚合。
图3：用于计算机可编程控制器的排布的电子线路图，所述控制器用于独立控制六个电磁体或者三电磁体的两个阵列。
图4：用于图3中所提供的电子排布的控制输入(“CtrInp”)组件的示例性微控制器。
图5：图片显示了H2O2对DMP氧化速度的影响，所述氧化是在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时，由2.5nM锰过氧化物酶、不同浓度的Au-M60及其BNC所催化的。为了方便，X轴是log10刻度。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了锰过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。
图6：图片显示了H2O2对DMP氧化速度的影响，所述氧化是在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时，由2.5nM通用过氧化物酶、不同浓度的Au-M60及其BNC所催化的。为了方便，X轴是log10刻度。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了通用过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。
图7A，7B：光谱显示了将锰过氧化物酶和通用过氧化物酶用于生物质原料(混合的草)的木质素解聚。图7A显示了水可溶性木质素单体和聚合体的稀释校正的光谱属性。图7B显示了生物质对照校正的光谱。使用25mM MnP和VeP(50mM总共的酶)和400μg.ml-1的Au-MNP来形成BNC。使用0.2mM H2O2开始反应，并且孵育24小时。BNC增加了芳香族化合物从生物质中的释放。
图8A-8C：光谱显示了存在葡萄糖氧化酶时，将锰过氧化物酶和通用过氧化物酶用于生物质原料(混合的草)的木质素解聚。葡萄糖氧化酶在存在葡萄糖时生成过氧化氢。针对不同的过氧化物酶-氧化酶摩尔比，12小时时生物质水解液校正的光谱。使用各25nM的锰过氧化物酶和通用过氧化物酶–15μg.ml-1Au-MNP来形成BNC。图8A：葡萄糖氧化酶是6.125nM(4A：比例是4)；图8B：12.5nM(4B：比例是2)，和图8C：25nM(4C：比例是1)。BNC可以容纳原位氢生成系统以增加芳香族化合物从生物质中的释放，并且使用葡萄糖作为氧化剂。
图9：图片显示了辣根过氧化物酶的BNC集合在磁铁矿微粒上模板化以形成分级大孔催化剂，用于包括苯酚的治理和芳香族化合物的化学转化等应用。
图10：图片显示了使用BNC和BMC、在苯酚和H2O2等摩尔浓度(1mM)、室温下12小时后，除去苯酚的程度。误差条是三次重复的标准偏差。BNC为形成介孔催化剂而在微粒上的模板化对BNC的活性没有害处。
图11A、11B：柱状图显示了在除去苯酚的五次循环中([苯酚]＝[H2O2]＝1mM；室温下反应时间2小时；[HRP]＝30nM，[MNP]＝60ug/ml)，在每次循环之后，催化剂重新使用的表现。图11A是[MMP]/[MNP]/[HRP]＝20:2:1，并且图11B是[MMP]/[MNP]/[HRP]＝160:2:1。误差条是三次重复的标准偏差。分级结构使得催化剂可以重复使用若干次循环。
图12A、12B：两种不同比例BNC以及在磁铁矿微粒上模板化的辣根过氧化物酶BNC的扫描电子显微镜(SEM)图片。BNC在微粒表面上的组装是由磁性相互作用所驱动的自体组装过程。
图13：图片显示了磁性反应器的V型构造；电磁体成对设置并且以1-2的方式循环。使用电磁体(管状9.6x16.7mm、系列E-66-38，加利福尼亚州磁传感器系统公司(MagneticSensor Systems))、简单微控制器以及在微控制器和电磁体之间的接口电路来设计原型系统。电磁体装载在定制台上(custom stand)，使得其可以按照多种配置方案置于小的生物反应器的侧面，所述生物反应器由0.5cm横截面的一次性UV透明塑料小杯(micro-cuvette)组成。
图14：图片显示了磁性反应器的I型构造；电磁体成对设置并且以1-1的方式循环。粉红色表示通过使用高效的基于辣根过氧化物酶的磁性催化剂，从苯酚和氨基芘合成醌亚胺。这个反应显示了苯酚的除去，以及色素、颜料、芳香和精细化学品的合成。
图15：图片显示了使用BNC通过氧化聚合来除去苯酚。苯酚分子被氧化成可相互聚合的苯氧基。这个反应表征了芳香族化合物的治理和通过氧化偶合的聚合。
图16：图片显示了用于水处理的磁性反应器的集成。
图17：图片显示了用于将自由基的生成和聚合解偶联的磁性反应器的内核。
发明详述
在一方面，本发明涉及包含酶的组合物，所述组合物包含吸附一种或多种酶的磁性纳米颗粒的介孔聚集物，其中所述一种或多种酶可以包含或不包含产生自由基的酶(FRP)。吸附酶的磁性纳米颗粒的集合在本申请中也称为“生物纳米催化剂”或“BNC”。本申请所用术语“吸附”旨在与术语“结合”“与……结合”或者“与……聚集”意思相同，只要附着的模式在其使用条件下或者在为后续使用而储存的条件下阻止酶从磁性纳米颗粒释放或者使这种释放基本上最小化。BNC或其贵金属包被的形式也可以吸附到(如位于)大孔支架的表面，所述大孔支架可以是下文所述的磁性微粒的集合和/或任意的连续大孔支架。
BNC包含的介孔是磁性纳米颗粒之间的间质空间。酶可以位于磁性纳米颗粒上的任意位置，例如在BNC的表面和/或包埋进入BNC的介孔中的至少一部分。本申请所用术语“磁性”包括全部种类的可用的磁性属性，包括永久磁性、超顺磁性、顺磁性、铁磁性和亚铁磁性。
磁性纳米颗粒或BNC的尺寸是纳米级，即通常不大于500nm。本申请所用术语“尺寸”可以指，当磁性纳米颗粒大约或基本上是球形时，磁性纳米颗粒的直径。当磁性纳米颗粒不是大约或基本上的球形(如基本上是卵形或不规则形)时，术语“尺寸”可以指磁性纳米颗粒的最长维度或三个维度的平均值。术语“尺寸”也可以指磁性纳米颗粒群的尺寸的平均值(即“平均尺寸”)。在不同的实施方式中，磁性纳米颗粒的尺寸精确地为、大约为、至多为或小于例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm，或者由任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。
在BNC中，可以把单独的磁性纳米颗粒认为是具有上述任意尺寸的初级纳米颗粒(即初级微晶)。BNC中的纳米颗粒聚集物在尺寸上大于纳米颗粒，并且通常具有至少5nm的尺寸(即二级尺寸)。在不同的实施方式中，聚集物的尺寸精确地为、大约为、至少为、大于、至多为、或小于例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm，或者由任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。
通常，初级和/或聚集的磁性纳米颗粒或其BNC具有尺寸的分布范围，即它们在尺寸上通常是分散的，或者分散较窄或者分散较宽。在不同的实施方式中，初级或聚集物尺寸的任意范围可以构成初级或聚集物尺寸的总范围的主要部分或次要部分。例如，在一些实施方式中，初级颗粒尺寸的特定范围(例如至少1、2、3、5或10nm，和至多15、20、25、30、35、40、45或50nm)或者聚集物颗粒尺寸的特定范围(例如至少5、10、15或20nm，和至多50、100、150、200、250或300nm)构成初级颗粒尺寸的总范围的至少或大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施方式中，初级颗粒尺寸的特定范围(例如小于1、2、3、5或10nm，或大于15、20、25、30、35、40、45或50nm)或者聚集物颗粒尺寸的特定范围(例如小于20、10或5nm，或大于25、50、100、150、200、250或300nm)构成初级颗粒尺寸的总范围的不多于或少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
根据制备聚集物的单个初级微晶的量，磁性纳米颗粒聚集物(即“聚集物”)或其BNC可以具有任意程度的多孔性，包括基本上没有孔。在特定的实施方式中，聚集物是介孔性的，因为包含间质介孔(即位于由堆积排列形成的、在初级磁性纳米颗粒之间的介孔)。介孔的尺寸通常是至少2nm和至多50nm。在不同的实施方式中，介孔具有的孔尺寸可以精确地为或大约是例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm，或者由任意两个上述示例性孔尺寸的所限定的范围中的孔尺寸。与颗粒尺寸的情况类似，介孔通常具有尺寸的分布范围，即它们在尺寸上通常是分散的，或者分散较窄或者分散较宽。在不同的实施方式中，介孔尺寸的任意范围可以构成介孔尺寸总范围或者总的孔体积的主要部分或次要部分。例如，在一些实施方式中，介孔尺寸的特定范围(例如至少2、3或5，和至多8、10、15、20、25或30nm)构成介孔尺寸总范围或者总的孔体积的至少或多于50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施方式中，介孔尺寸的特定范围(例如小于2、3、4或5nm，或大于10、15、20、25、30、35、40、45或50nm)构成介孔尺寸总范围或者总的孔体积的不多于或少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。
磁性纳米颗粒可以具有本领域已知的任意组合物。在一些实施方式中，磁性纳米颗粒是或者包含具有磁性的零价金属部分。一些此类零价金属的示例包含钴、镍和铁，及其混合物和合金。在其他实施方式中，磁性纳米颗粒是或者包含磁性金属的氧化物，例如钴、镍或铁的氧化物，或其混合物。在一些实施方式中，磁性纳米颗粒具有不同的核部分和表面部分。例如，磁性纳米颗粒可以具有由元素铁、钴和镍组成的核部分，以及由钝化层组成的表面部分，例如金属氧化物或贵金属包衣(例如金层、铂层、钯层或银层)。在其他实施方式中，金属氧化物磁性纳米颗粒或其聚集物使用贵金属包衣来包被。例如贵金属包衣可以降低磁性纳米颗粒表面上电荷的数量，这有利于增加在溶液中的分散性并且可以更好地控制BNC的尺寸。贵金属包衣可保护磁性纳米颗粒免于氧化、溶解，所述溶解通过沥滤的作用，或者当在生物化学反应或方法中使用螯合的有机酸，例如柠檬酸、丙二酸或酒石酸时，通过螯合的作用。钝化层可以具有任意合适的厚度，具体而言至少、至多或少于例如0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或者这些值中任意两个所限定的范围中的厚度。
在特定实施方式中，磁性纳米颗粒具有氧化铁组合物。氧化铁组合物可以是本领域已知的任意的磁性或超顺磁性氧化铁组合物，例如磁铁矿(Fe3O4)、赤铁矿(α-Fe2O3)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)或如式AB2O4的尖晶石铁氧体，其中A是二价金属(如Zn2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Ba2+、Sr2+或其组合)并且B是三价金属(如Fe3+、Cr3+或其组合)。
在特定实施方式中，上述磁性纳米颗粒(BNC)的介孔聚集物掺入到连续的大孔支架中以形成具有第一级和第二级集合的分级催化剂集合。BNC中存在第一级集合。在将BNC掺入连续的大孔支架中存在第二级集合。整体的分级催化剂集合是磁性的，因为至少有BNC。
本申请中，术语“连续的”当用于大孔支架时，是指不是颗粒集合的材料，即不是由颗粒或离散的物体互相组装以形成的宏观结构。与颗粒集合相反，连续的结构在大孔周围基本上是无缝的和均一的，而所述大孔周期性地打断所述无缝的和均一的结构。因此，连续的支架中的大孔不是聚集的颗粒之间的间质空间。然而，连续的支架可以是由更小的初级连续支架的集合或聚集物构成，只要初级连续支架的集合或聚集物不包含由初级连续支架之间的间质空间形成的大孔(即大于50nm并且至多100微米)就可以。具体而言，在无机材料例如陶瓷或元素(elemental)材料的情况下，连续的支架可以包含也可以不包含体晶体结构域或相的边界。
大孔支架包含尺寸大于50nm的大孔(即大尺寸的孔)。在不同的实施方式中，大孔的尺寸精确地为、大约为、至少为、大于、至多为或小于例如60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1微米(1μm)、1.2μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、or 100μm，或者任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。
大孔支架可以具有任何合适的尺寸，只要其能够容纳大孔就行。在典型实施方式中，大孔支架具有至少一个尺寸维度是大尺度。所述至少一个大尺度的维度是大于50nm，且可以是上面提供的大孔的任意值，并且特别是，维度精确地为、大约为、至少为、大于、至多为或小于例如1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、2mm、5mm、或1cm，或者任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。当仅有一个或两个尺寸维度是大尺度时，剩下的一个或两个维度可以是纳米级尺度，例如上面针对磁性纳米颗粒所提供的任意值(例如，独立地为、精确地为、大约为、至少为、大于、至多为或小于例如1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100nm，或者由任意两个上述值所限定的范围中的值)。在一些实施方式中，大孔支架的至少两个或全部尺寸维度是大尺度。
在第一组实施方式中，BNC掺入的连续大孔支架是磁性的，即使在没有BNC时也是磁性的。所述连续的大孔支架可以由于，例如由磁性聚合物组合物组成，而具有磁性。磁性聚合物的示例是PANiCNQ，如本领域熟知，所述PANiCNQ是四氰基喹啉甲烷(TCNQ)和聚苯胺的翠绿亚胺形式(PANi)的结合。或者，或另外，所述连续的大孔支架可以由于其中具有包埋了不属于BNC的磁性颗粒而具有磁性。不属于BNC的磁性颗粒可以是，例如不与FRP酶或任意的酶结合的磁性纳米颗粒或微粒。尽管与大孔尺寸无关，但是磁性微粒可以具有上面针对大孔提供的尺寸或尺寸分布。在特定的实施方式中，磁性微粒的尺寸大约为、精确地为或至少是20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000nm，或者由任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。在一些实施方式中，连续的大孔支架具有包埋在其中的磁性微粒，所述磁性微粒吸附到BNC的至少一部分上，或者其中磁性微粒不与BNC结合或不吸附到BNC上。
在第二组实施方式中，BNC掺入的连续支架是非磁性的。然而，由于至少存在掺入在其中的BNC，所以包含非磁性支架的分级催化剂集合的整体还是磁性的。
在一个实施方式中，连续的大孔支架(或其前体)具有聚合物组合物。聚合物组合物可以是本领域已知的任意的固体有机的、无机的或混合有机-无机的聚合物组合物，并且可以是合成的或用作粘合剂的生物聚合物。优选地，聚合物大孔支架在水中或分级催化剂所用的其他溶剂中不溶解或不降解。合成的有机聚合物的一些实例包含乙烯基加成聚合物(例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸盐、聚(甲基丙烯酸甲酯/盐)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇等)、含氟聚合物(例如聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯等)、环氧化物(例如酚醛树脂、间苯二酚–甲醛树脂)、聚酰胺、聚亚安酯、聚酯、聚酰亚胺、聚苯并咪唑及其共聚物。生物聚合物的一些示例包含多糖(例如纤维素、半纤维素、木聚糖、几丁聚糖、菊粉、旋糖苷、琼脂糖和褐藻酸)，聚乳酸和聚乙醇酸。在纤维素的特定示例中，纤维素可以是来自微生物或藻类的纤维素。无机的或混合有机-无机的聚合物的一些示例包含聚硅氧烷(例如由溶胶凝胶合成所制备的，例如聚二甲硅氧烷)和聚磷腈。在一些实施方式中，大孔支架不含有上文所提供的任意一种或多种类别或特定类型的聚合物组合物。
在另一个实施方式中，连续的大孔支架(或其前体)具有非聚合物组合物。非聚合物组合物可以具有例如陶瓷或元素组合物。陶瓷组合物可以是晶体的、多晶体的或无定形的，并且可以是本领域已知的任意组合物，包含氧化物组合物(例如氧化铝、氧化铍、二氧化铈、氧化钇或氧化锆)和非氧化物组合物(例如碳化物、硅化物、氮化物、硼化物或硫化物组合物)。元素组合物也可以是晶体的、多晶体的或无定形的，并且可以具有任意合适的元素组合物，例如碳、铝或硅。
在其他实施方式中，BNC存在于非连续的大孔支持物中，所述非连续的大孔支持物包含(或由下述构成)磁性微粒(MMP)的集合(即聚合物)，所述集合包含在磁性微粒之间的作为间质空间的大孔。磁性微粒通常是铁磁性的。BNC被包埋在磁性微粒聚合物的大孔的至少一部分中，并且还可以位于磁性微粒的表面。BNC能通过磁性相互作用与磁性微粒的表面结合。磁性微粒可以用或不用金属氧化物或贵金属包衣层来包被。在一些实施方式中，如上文所述，BNC-MMP集合掺入(即包埋)到连续的大孔支架中，从而提供分级催化剂集合。
单个的磁性纳米颗粒或其聚集物或其BNC具有任意合适的磁性度。例如，磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架集合可以具有至少或至多5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度(Ms)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架集合优选具有不多于(即至多)或小于5emu/g，或更优选至多或小于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、0.5emu/g或0.1emu/g的剩余磁化强度(Mr)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架集合的表面磁场可以是大约或至少为，例如0.5、1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯(G)，或者由任意两个上面数值所限定的范围中的磁场。如果包含微粒，微粒也可以具有任意上述磁性强度。
磁性纳米颗粒或其聚集物可以制成吸附合适量的酶，根据具体用途可以多至或低于饱和水平，以生成所得的BNC。在不同的实施方式中，磁性纳米颗粒或其聚集物可以吸附大约、至少、至多、或少于例如1、5、10、15、20、25或30pmol/m2的酶。另外，磁性纳米颗粒或其聚集物可以吸附的酶的量是大约、至少、至多或少于，例如饱和水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
磁性纳米颗粒或其聚集物或其BNC具有任意合适的孔体积。例如磁性纳米颗粒或其聚集物可以具有的孔体积是大约、至少、至多或少于例如0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1cm3/g，或者任意两个上述值所限定的范围中的孔体积。
磁性纳米颗粒或其聚集物或其BNC具有任意合适的特定表面积。例如磁性纳米颗粒或其聚集物可以具有的特定表面积是大约、至少、至多或少于例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g。
对于本发明的目的，优选酶的功能是把扩散性底物转化成扩散性产物。酶可以是任意来源的酶，例如来自真菌、微生物、动物或植物。
在特定实施方式中，酶具有生成自由基的属性，即“FRP酶”。在特定实施方式中，FRP酶是属于EC 1酶家族的氧化还原酶。EC 1氧化还原酶可以是例如作用于供体的CH-OH基团的EC 1.1氧化还原酶，作用于供体的醛或氧代基团的EC 1.2氧化还原酶，作用于供体的CH-CH基团的EC 1.3氧化还原酶，作用于供体的CH-NH2基团的EC 1.4氧化还原酶，作用于供体的CH-NH基团的EC 1.5氧化还原酶，作用于NADH或NADPH的EC 1.6氧化还原酶，作用于作为供体的各种含氮化合物的EC 1.7氧化还原酶，作用于作为供体的硫基团(sulfur group)的EC 1.8氧化还原酶，作用于供体的血红素基团的EC 1.9氧化还原酶，作用于作为供体的二元酚和相关物质的EC 1.10氧化还原酶，作用于作为受体的过氧化物的EC 1.11氧化还原酶，作用于作为供体的氢的EC 1.12氧化还原酶，作用于单个供体与分子氧的结合的EC1.13氧化还原酶(加氧酶)，作用于成对供体与分子氧的结合或还原的EC 1.14氧化还原酶，作用于作为受体的过氧化物的EC 1.15氧化还原酶，氧化金属铁的EC 1.16氧化还原酶，作用于CH或CH2基团的EC 1.17氧化还原酶，作用于作为供体的铁-硫蛋白的EC 1.18氧化还原酶，作用于作为供体的还原的黄素氧还蛋白的EC 1.19氧化还原酶，作用于作为供体的磷或砷的EC 1.20氧化还原酶，作用于X-H和Y-H以形成X-Y键的EC 1.21氧化还原酶，EC 1.97氧化还原酶，使用氢作为还原剂的EC 1.98氧化还原酶和使用氧作为氧化剂的EC 1.99氧化还原酶。氧化还原酶也可以特异性地鉴定为属于上文所述EC 1.1组中任意的亚种。
在第一个特定实施方式的集合中，FRP酶选自EC 1.1型的氧化还原酶。可以进一步将EC 1.1酶鉴定为属于任意下述亚型：以NAD或NADP作为受体的EC 1.1.1、以细胞色素作为受体的EC 1.1.2、以氧作为受体的EC 1.1.3、以二硫化物作为受体的EC 1.1.4、以醌或类似化合物作为受体的EC 1.1.5和作用于其它受体的EC 1.1.99。在更特定的实施方式中，所述FRP酶被鉴定为属于上文所述的任意EC 1.1亚型的亚型。例如，所述FRP酶可以被鉴定为属于任意EC 1.1.3亚型，如EC 1.1.3.3(苹果酸氧化酶)、EC 1.1.3.4(葡萄糖氧化酶)、EC1.1.3.5(己糖氧化酶)、EC 1.1.3.6(胆固醇氧化酶)、EC 1.1.3.7(芳基-醇氧化酶)、EC1.1.3.8(L-古洛糖酸内酯氧化酶)、EC 1.1.3.9(半乳糖氧化酶)EC 1.1.3.10(吡喃糖氧化酶)、EC 1.1.3.11(L-山梨糖氧化酶)EC 1.1.3.12(吡哆醇4-氧化酶)、EC 1.1.3.13(醇氧化酶)、EC 1.1.3.14(儿茶酚氧化酶)、EC 1.1.3.15(2-羟基酸氧化酶)、EC 1.1.3.16(蜕皮素氧化酶)、EC 1.1.3.17(胆碱氧化酶)、EC 1.1.3.18(仲醇氧化酶)、EC 1.1.3.19(4-羟基扁桃酸氧化酶)、EC 1.1.3.20(长链醇氧化酶)、EC 1.1.3.21(甘油-3-磷酸氧化酶)、EC1.1.3.22、EC 1.1.3.23(硫胺素氧化酶)、EC 1.1.3.24(L-半乳糖内酯氧化酶)、EC1.1.3.25、EC 1.1.3.26、EC 1.1.3.27(羟基植烷酸氧化酶)、EC 1.1.3.28(核苷酶)、EC1.1.3.29(N-酰基己糖胺氧化酶)、EC 1.1.3.30(聚乙烯醇氧化酶)、EC 1.1.3.31、EC1.1.3.32、EC 1.1.3.33、EC 1.1.3.34、EC 1.1.3.35、EC 1.1.3.36、EC 1.1.3.37(D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶)、EC 1.1.3.38(香草醇氧化酶)、EC 1.1.3.39(核苷氧化酶，H2O2形成)、EC 1.1.3.40(D-甘露醇氧化酶)和EC 1.1.3.41(木糖醇氧化酶)。
在第二个特定实施方式集合中，FRP酶选自EC 1.10型的氧化还原酶。可以进一步将EC 1.10酶鉴定为属于任意下述亚型：以NAD或NADP作为受体的EC 1.10.1、以细胞色素作为受体的EC 1.10.2、以氧作为受体的EC 1.10.3和具有其它受体的EC 1.10.99。更特别地，EC 1.10.1酶可以是，例如EC 1.10.1.1，即反式-苊-1,2-二醇脱氢酶。更特别地，EC1.10.2酶可以是，例如EC 1.10.2.1(细胞色素-b5还原酶)或EC 1.10.2.2(细胞色素-c还原酶)。更特别地，EC 1.10.3酶可以是，例如EC 1.10.3.1(儿茶酚氧化酶)、EC 1.10.3.2(漆酶)、EC1.10.3.3(L-抗坏血酸氧化酶)、EC 1.10.3.4(o-氨基苯酚氧化酶)、EC 1.10.3.5(3-羟氨苯甲酸氧化酶)、EC 1.10.3.6(利福霉素-B氧化酶)、EC 1.10.3.7或EC 1.10.3.8。更特别地，EC 1.10.99酶可以是，例如EC 1.10.99.1(塑醌-质体蓝素还原酶)、EC 1.10.99.2(核糖二氢烟酰胺脱氢酶，醌)或EC 1.10.99.3(紫黄质去环氧酶)。
在第三个特定实施方式集合中，FRP酶选自EC 1.11型的氧化还原酶。可以将EC1.11酶进一步鉴定为属于EC 1.11.1亚型(过氧化物酶)。更特别地，EC 1.11.1酶可以是例如EC 1.11.1.1(NADH过氧化物酶)、EC 1.11.1.2(NADPH过氧化物酶)、EC 1.11.1.3(脂肪酸过氧化物酶)、EC 1.11.1.4、EC 1.11.1.5(细胞色素-c过氧化物酶)、EC 1.11.1.6(过氧化氢酶)、EC 1.11.1.7(过氧化物酶)、EC 1.11.1.8(碘过氧化物酶)、EC 1.11.1.9(谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.10(氯过氧化物酶)、EC 1.11.1.11(L-抗坏血酸过氧化物酶)、EC1.11.1.12(磷脂-过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶)、EC 1.11.1.13(锰过氧化物酶)、EC1.11.1.14(二芳基丙烷过氧化物酶)或EC 1.11.1.15(过氧化物氧化还原酶)。
在特定实施方式中，FRP酶是过氧化物酶。过氧化物酶还可以进一步按照功能分类，例如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或通用过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为真菌、细菌、动物或植物过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为I类、II类或III类过氧化物酶。还可以将过氧化物酶分为髓过氧化物酶(MPO)、嗜曙红细胞过氧化物酶(EPO)、乳酸过氧化物酶(LPO)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、前列腺素H合成酶(PGHS)、谷胱甘肽过氧化物酶、卤化过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、辣根过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜菁过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、大麦过氧化物酶或者过氧蛋白。在特定实施方式中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
在一些实施方式中，使用单一的酶，所述酶可以是或不是FRP酶。在其他实施方式中，使用酶的组合，所述组合包含或不包含FRP酶。酶的组合可以是例如任意两种或三种选自任意上述类型或亚类的氧化还原酶。在一些实施方式中，使用FRP酶(例如，EC 1酶)的组合。在特定实施方式中，使用EC 1.1酶的组合。在其它特定实施方式中，使用EC 1.10酶的组合。在其它特定实施方式中，使用EC 1.11酶的组合。在其它实施方式中，使用上文所述的任意特定FRP酶和过氧化物酶的组合(例如，EC 1.1或EC 1.1.3酶和过氧化物酶的组合)。当使用FRP酶的组合时，可以将两种或更多酶排布在核-壳类型的排布中，即第一种FRP酶在磁性纳米粒子或其聚集物的核部分或表面部分，并且第二种(不同的)FRP酶覆盖的区域里也存在第一种FRP酶。第二种FRP酶可以是磁性纳米粒子的聚集物或者在其表面上，覆盖在第一种酶的上面。
在多酶系统中，控制不同的酶在介孔聚集物内的分布情况有利于为不同反应的解偶联，以及允许反应底物和产物从一层向另一层扩散或者向BNC的核扩散。因而，当在BNC的狭窄孔结构内进行酶反应时，核/壳分布允许更好地控制被包封的不同FRP酶的动力学。通过将进行类似反应(例如，两种或多种过氧化物酶或者一种过氧化物酶和一种漆酶)但具有不同反应要求(底物、底物浓度等)的酶进行组合，能够有利地增加BNC的通用性，以便在广泛和多变的反应条件下进行高效率的反应。通过将偶联的反应的酶进行组合，能够确保底物在酶的附近产生，并且不再需要有害的和不稳定的化学底物，如过氧化氢。例如，葡萄糖氧化酶能够从葡萄糖产生过氧化氢，而葡萄糖是一种便宜和无害的化合物。
在另一个方面，本发明涉及其中包埋了酶的磁性纳米颗粒的介孔聚集物(BNC)生成的方法。在特定的实施方式中，通过将可溶性酶和磁性纳米颗粒的单分散溶液混合来制备BNC，所述磁性纳米颗粒可以有或没有包衣。通过声波处理纳米颗粒，可以获得纳米颗粒在混合前的单分散状态。在持久搅拌的情况下孵育酶和单分散的纳米颗粒，直到所有的酶都被吸附并且形成了簇。需要调节用于BNC合成的溶液的pH，使得酶的表面基团的整体静电电荷与纳米颗粒的表面的整体静电电荷相反。为了最优化地形成BNC，应该调节溶液的pH以预防纳米颗粒的自体聚集，并且通常不希望存在反离子。在一个实施方式中，为了最优化地形成BNC，酶和纳米颗粒的表面电位(pKa)不多于三个单位，以限制过量聚集和成团。在另一个实施方式中，为了最优化形成BNC，酶的浓度不多于纳米颗粒表面的整体结合容量的大约80％，以防止过量聚集。BNC簇的尺寸与溶液中纳米颗粒和酶的比例有关。通常，酶越多，簇变得越大。为了最优活性以及限制底物和产物的扩散障碍，簇通常应大于约200nm。
磁性纳米颗粒或其聚集物或其BNC也可以用贵金属包被，所述贵金属例如金、铂或钯。或者，或另外，磁性纳米颗粒或其聚集物或其BNC可以使用金属氧化物层(例如二氧化硅或二氧化钛)或聚合物保护衣来包被，以保护磁性纳米颗粒不被氧化。可以使用任意方法用于包被磁性纳米颗粒。例如，在特定的实施方式中，磁性纳米颗粒分散在包含贵金属盐的溶液中，并且使用还原条件处理贵金属盐。在还原贵金属前，可以通过将双功能分子结合到磁性纳米颗粒的表面来促进上述方法。用于这个目的的双功能分子应该包含用于结合磁性纳米颗粒部分(如上述)以及用于结合贵金属离子的贵金属结合部分(例如胺、硫醇、磷化氢或螯合剂)。任选地，一旦金属离子结合到纳米颗粒表面，可以(例如通过磁性捕获，过滤或倾析)洗掉磁性纳米颗粒的多余的贵金属。由于贵金属连接到表面，上述方法提供了一种更具有选择性的方法，用于生成贵金属包衣(即不伴随生成贵金属纳米颗粒)以及更均一的包衣。在一些实施方式中，在酶被包含到磁性纳米颗粒中之前进行贵金属包衣，这种情况下，酶随后结合到贵金属包衣上。酶可以结合到贵金属包衣上，例如，通过使用双功能分子对贵金属包衣进行功能化，所述双功能分子能够结合到贵金属包衣上并且具有用于结合酶的另一个活性基团。
在另一个方面，本发明涉及用于生成分级催化剂集合的方法，所述分级催化剂集合包含掺入到大孔支架中的BNC，如上所述。在典型实施方式中，通过在水性溶液中将BNC或其贵金属包衣形式与大孔支架接触，使得纳米颗粒吸附到大孔支架的表面，由此将BNC或其贵金属包衣形式吸附到大孔支架的表面。在所述方法中，BNC通常在溶液(即液体溶液)中与大孔支架接触，以将BNC基本上包埋进入支架的大孔中。溶液可以包含水和/或使得BNC与支架之间可以有效并密切接触的任意溶液。通常，通过自体组装机制，即通过磁性相互作用、物理吸附和/或化学吸附，BNC会吸附到或吸附进入支架中。在将BNC包埋进入支架之后，可以不经过进一步加工即可使用催化剂集合，或者催化剂集合可以在水或合适溶剂中润洗，或者在使用之前贮存，例如在适合于保存酶的溶液中。在一些实施方式中，BNC附着到磁性微粒的表面，并且BNC-微粒集合包埋进入连续的大孔支架中。
将BNC模板化到大孔支架上的步骤可以在用于生成BNC的相同缓冲液中进行。少量大孔支架通常按顺序加入到BNC中，直到上清液澄清，这表明所有的BNC已经被捕捉到支架的表面上。通常通过使用小电磁体捕获装载了BNC的支架，然后通过纳米颗粒簇的吸光度来监测上清液的颜色。捕获BNC所需的支架的数量取决于支架的整体磁性和表面积。或者，可以测定支架的结合容量，并且加入合适量的BNC以实现完全的捕获。为了增加溶液中材料的整体磁性，可以使用非功能化的支架来稀释BNC功能化的支架，而不改变该方法所需的酶的浓度。
可以使用任意合适的方法来制备连续的大孔支架。本领域已知的用于在材料中掺入大孔的任意方法都可以考虑在本申请中使用。在特定的实施方式中，所述连续的大孔支架是由模板(模板化)法生产，所述方法包括(i)生产复合物(composite)，所述复合物包含在其中包埋了牺牲模板剂的支架前体材料或组合物，和(ii)选择性除去牺牲模板剂以便在支架前体材料中产生大孔。在第一组实施方式中，模板法使用溶剂作为模板剂，其中溶剂包埋在支架前体材料中。在溶剂模板法中，将包含包埋了溶剂的支架前体材料的复合物冷却，直到所包埋的溶剂冷冻形成溶剂晶体，然后通过蒸发或升华来除去冰冻的溶剂，以生成支架前体材料中的大孔。当溶剂是水时，溶剂模板方法可以被视为冰模板化法。在第二组实施方式中，模板方法使用固体牺牲模板剂，所述固体牺牲模板剂包埋在支架前体材料。牺牲模板剂可以是例如聚合物或金属氧化物物质，所述聚合物或金属氧化物物质可以在掺入支架前体之后再选择性除去。此类牺牲模板剂的掺入为本领域熟知。通过本领域熟知的方法，牺牲模板剂可以通过酸或碱沥滤、溶剂溶解或热解分解来选择性除去。在另一个实施方式中，牺牲模板是可燃尽(burn-out)的材料，所述材料在接触足够的热量时，会蒸发或分解以生成大孔。
本领域传统使用的形成大孔方法的其他细节可以在例如下列文献中找到：L.Yang等，“Robust Macroporous Materials of Chiral Polyaniline Composites(手性聚苯胺复合物的强的大孔材料)”，Chem.Mater.，18(2)，第297-3000页(2006)；M.Abdullah等，“Preparation of Oxide Particles with Ordered Macropores by ColloidalTemplating and Spray Pyrolysis(通过胶体模板和喷雾热分解来制备具有有序大孔的氧化物颗粒)”，ActaMaterialia，52，第5151-5156页(2004)；T.Niu等，“Preparation ofMeso-Macroporous A-Alumina Using Carbon Nanotube as the Template for theMesopore and Their Application to the Preferential Oxidation of CO in H2-RichGases(使用碳纳米管作为介孔的模板来制备介孔-大孔A氧化铝以及其对富含H2的气体中CO优先氧化的应用)”，Journal of Porous Materials,卷20，第4期，第789-798页(2013)；和M.Davis等，“Formation of Three-Dimensional Ordered Hierarchically PorousMetal Oxides via a Hybridized Epoxide Assisted/Colloidal Crystal TemplatingApproach(通过杂交的环氧化物辅助的/胶体晶体模板方法来形成三维有序分级孔金属氧化物)”，ACS Appl.Mater.Interfaces，5(16)，第7786-7792页，(2013)，所有这些文献都通过引用并入本申请。
图1A和1B描绘了用于在分级催化剂集合中分别生成第一级和第二级集合的示例性方法。图1A显示了形成分级催化剂集合的第一级集合的示例性方法，所述分级催化剂集合包含了由磁性纳米颗粒和辣根过氧化物酶的介孔聚集物构成的BNC。图1B显示了形成第二级集合的示例性方法，所述方法是通过将图1A的BNC掺入到由冰模板连续材料组成的大孔支架中，所述冰模板连续材料例如聚合物材料如生物聚合物，所述生物聚合物可以是多糖如纤维素。在一些实施方式中，使用前可以将支架材料进行超声处理，从而解开或者分散单个的材料片状物、纤维或带状物。上述冰模板法可以用于其他聚合物，例如壳聚糖、琼脂和聚合物树脂。
在另一个方面，本发明涉及解聚木质素的方法，即木质素解聚方法，其中将上文所述的任意BNC或BNC-支架结构用于解聚木质素或促进木质素解聚。被解聚的木质素可以是任意含有木质素的材料。前体木质素可以是自然界中存在的或本领域公知的多种多样的木质素成分中的任意一种。
如本领域所公知的，在自然界中没有统一的木质素成分。木质素是在不同种属的植物之间呈现出显著组分差异的随机聚合物。多种其它条件如环境条件、寿命和处理方法均影响木质素的成分。木质素的差异主要是三种醇单元的比例，即p-香豆醇、愈创木醇和芥子醇。p-香豆醇、愈创木醇和芥子醇的聚合作用分别形成木质素聚合物的p-羟苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)组分。前体木质素可以具有多种多样的H、G和S组分相对重量百分百(wt％)中的任意一种。除了木质素的天然差异之外，还可能进一步存在由于对木质素处理方法不同造成的成分差异。例如，前体木质素可能是硫酸盐木质素、亚硫酸盐木质素(即木质素磺酸盐)或无硫木质素。
木质素是地球上最丰富的芳香生物聚合物，但是由于其化学成分和物理结构存在明显的随机性，因而其对转化和生物转化具有化学抗性。可以将木质素认为是多糖纤维之间的“胶”或“环氧树脂”，其为脉管植物的细胞壁提供了强度、刚性和保护。从化学的角度看，木质素是由苯丙素(phenyl-propanoid)分子(包括松柏醇、芥子醇和香豆醇)通过芳基键、醚键和碳碳键聚合形成的高度异质性的聚合物。
基于1吨生物质生产100加仑乙醇且所述生物质(例如木材和草)含有平均约20％的木质素的假设，能够迅速估算出一个年生产能力为1亿加仑的生物提炼厂能够生产约200,000吨木质素材料。仅就美国而言，为达到2020年时替代20％汽油的目标，相当于约350亿加仑乙醇，每年将产生共计约7亿吨木质素。在世界范围内木质素的实际生产情况约为每年9千万吨，所述木质素大部分为造纸工业的副产物硫酸盐木质素。换言之，在世界范围内木质素的生产将以高于一个数量级的方式增长。
根据用途和化学纯度，可以将木质素用于生产低价和高价产品。直到最近，木质素产品的市场还没有足够庞大、具有竞争力或吸引力，与来自其燃烧的回收的能量相比，不足以弥补其分离和纯化的成本。这主要是因为油料的成本仍较低而且供应较高，从而为化学和材料工业提供基础材料。然而，在基于生物燃料和生物产物共同生产的碳水化合物经济框架下，用于转化的高纯度的分离木质素预计其原始材料是每kg$1.10，相比之下用于混烧时为$0.04。低端应用主要用作分散剂、用于碳固定的土壤改良剂、肥料吸附剂和杀虫剂、以及燃料，这些应用在提取后很少或不需要进一步的转化。需要将木质素解聚的高端应用包括生产酚类前体(例如DMSO、香草醛、苯酚和芳香化合物)和聚合物组分(例如环氧树脂、聚氨酯泡沫、酚醛树脂粉末、碳纤维以及胶和粘合剂)。
在自然界中，木质素的转化通过特定微生物(特别是真菌和细菌)进行。木质纤维细菌和真菌具有降解木质素以获得生物质纤维素成分的能力。为实现这一目标，木质纤维细菌和真菌分泌一系列氧化还原酶，包括漆酶、氧化酶和过氧化物酶，以及产生有机酸和H2O2的过氧化氢酶。最强的氧化还原酶由被称为白腐真菌的特定类型的真菌产生，所述酶专门用于木质纤维的降解。不同类型的真菌过氧化物酶底物的性质不同。
木质素过氧化物酶(LiP，E.C.1.11.1.14)催化大量模型化合物的C-C键氧化裂解，并将苄基醇氧化为醛或酮。木质素过氧化物酶催化的典型反应为Cα-Cα裂解、Cα氧化、烷基芳基裂解、芳环裂解、脱甲基化、羟基化和聚合。白腐担子真菌中，木质素过氧化物酶参与了木质素的氧化分解。木质素过氧化物酶利用H2O2催化非酚芳环成为芳基阳离子自由基的氧化反应。典型的例子是藜芦醇(3,4-二甲氧基苄基醇)通过中间形成藜芦基阳离子和苄基自由基成为藜芦醛(3,4-二甲氧基苄基醛)的氧化反应：藜芦醇+H2O2→藜芦醛+2H2O。锰过氧化物酶(MnP；E.C.1.11.1.13)与LiP(至多1.5V)相比具有更低的氧化还原电位(至多1.1V)，并且锰过氧化物酶催化木质素和酚类化合物的由Mn介导的氧化反应。这种酶利用H2O2催化Mn(II)成为Mn(III)的氧化反应。在存在二羧基酸的条件下，高反应性Mn(III)通过螯合作用稳定化：2Mn(II)+2H++H2O2→2Mn(III)+2H2O。MnP的目的为产生小而高效的氧化剂，所述氧化剂扩散进入木质化细胞壁中，并从内部实现对木质素的解聚。通用过氧化物酶(合成的混合过氧化物酶，锰-木质素过氧化物酶：VeP EC1.11.1.16)是一种相当新颖的木质素分解酶，其具有锰过氧化物酶(Mn(II)的氧化反应)、木质素过氧化物酶(非酚芳香化合物不依赖于Mn的氧化反应)和植物过氧化物酶(氢醌和经取代的苯酚的氧化反应)的组合催化性质。在本申请所述的木质素解聚方法中可以使用上文所述过氧化物酶中的任意一种或其组合。
在第一个实施方式中，含有木质素的材料是部分地或基本上与木材的其它成分(例如，纤维素和半纤维素成分)分离的木质素形式，因为所述材料通常经过木质纤维素材料的预处理方法，上述方法的细节是木质纤维素处理和转化领域所熟知的。预处理方法用于将木质素与含木质素的来源中的其它成分分离，或者用于削弱木质素与其它成分之间的结合。如本领域所熟知的，可以通过例如提取对木质素进行进一步分离。在第二个实施方式中，含有木质素的材料是含有木质素的消耗品如纸张或纸板，所述消耗品可以经过或不经过预处理。在第三个实施方式中，含有木质素的材料是含有木质素的天然原料(即粗木质纤维材料)，如木屑、草(例如柳枝稷和混合草)、玉米秸秆(例如玉米植物的叶、外皮、茎或穗轴)、甘蔗、锯末、麻或其组合，所有这些通常均经过预处理以使得木质素能够用于解聚反应。
在木质素解聚方法中，在利用结合了酶的磁性纳米粒子或其聚集物的自由基活性使木质素部分或完全解聚的条件下，将上文所述的任意BNC或BNC-支架结构与含有木质素的材料接触。通常通过将BNC或BNC-支架结构与含有木质素的材料一同加入水溶液中使其接触，所述水溶液例如是对含有木质素的材料进行预处理方法中使用的水溶液。在一些实施方式中，在解聚方法中使用室温条件(例如，至少10、15、18、20或22℃和至多25℃、30℃或40℃，或者其中的任意范围)。在其它实施方式中，在解聚方法中使用升高的温度条件(例如，高于40℃，或者至少或高于45、50或60℃，或者达到FRP酶降解或失去大量活性的温度)。在其它实施方式中，在解聚方法中使用降低的温度条件(例如，低于15℃，或者至多或低于10、5或0℃)。通过解聚，木质素断裂为比原始形式更短的片段。完全解聚使得全部或大部分木质素(例如，至少80、90或95％)转化为木质素的至少一个或多个基本结构单元，即松柏醇、芥子醇和香豆醇及其衍生物。一般而言，部分解聚使得少于80％或者至多70、60、50、40、30、20、10、5或1％的木质素转化为初级的结构单元，其余的木质素转化为含有两个、三个、四个或更多个(甚至至多10、20、50、100、200、500或1000个)结构单元的片段(例如，分别为来自松柏醇、芥子醇和香豆醇的p-羟苯基、愈创木基和紫丁香基单元)。由于木质素解聚的不同程度可以优选用于不同的应用，因而可以对解聚条件进行适当调整以提供适宜程度的解聚或与其它相比偏向于产生一种或多种类型的解聚产物。
由于每种含有木质素材料具有不同分布和相对量的每种结构单元，因而解聚产生的各种产物的相对量非常依赖于含有木质素材料的类型。在解聚方法中通常还产生其它的解聚产物，例如芳香醛、酮、醇和酸，一般量较少。在不需要此类其它产物的实施方式中，可以通过调整反应条件优选地减少或消除这些产物，所述反应条件包括选择适当的FRP结合磁性纳米粒子或其聚集物。
可以将上文所述的任意BNC或BNC-支架结构用于木质素解聚方法。在特定实施方式中，用于木质素解聚方法的酶是FRP酶，例如过氧化物酶，特别地，是降解木质素的过氧化物酶如木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶、锰过氧化物酶或其组合(包括其核-壳组合)。更特别地，FRP酶还可以是真菌、细菌或植物的过氧化物酶。在特定实施方式中，FRP酶是两个FRP酶的系统，如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的组合，或者过氧化物酶和/或氧化酶与漆酶的组合。
在一些实施方式中，木质素解聚方法与下游方法是偶联的(即，整合的)，在所述下游方法中将木质素解聚方法生产的解聚产物用于生产其它产品。下游方法可以将木质素解聚产物转化为例如生物燃料或工业化学产品，例如聚合物、塑料、聚合物前体(单体)、溶剂、粘合剂、涂料、洗涤剂、润滑剂、食品、药品、或香料或其前体。或者，下游方法可以将木质素解聚产物掺入到任意此类最终产品中。
在一些实施方式中，木质素解聚方法与上游方法是偶联的，在所述上游方法中提供用于本申请所述的木质素解聚方法的含有木质素的材料。上游方法可以是例如纸或纸浆生产方法、生物质转化为生物燃料的方法(即主要是将纤维素材料水解并转化为生物燃料)或者生物质转化为乙醇的发酵方法(即主要是将纤维素材料水解并转化为乙醇)。
在另一个方面，本发明涉及一种从水中除去芳香族污染物的方法(即水体治理方法)。在所述方法中，将受到一种或多种芳香族物质污染的水与任意上文所述的BNC或BNC-支架结构接触，以使得芳香族物质沉淀，即形成不溶性物质。然后优选对沉淀的(即沉积)材料如通过离心或沉降进行进一步分离，并通过例如过滤或倾析将其从水中除去。不受任何理论限制，认为芳香族物质与结合了酶的磁性纳米粒子所产生的自由基反应，以产生来源于芳香族物质的聚合物质。芳香族污染物可以是任意芳香族物质，包括那些在受污染水中更常见到的物质。在一些实施方式中，芳香族污染物是苯或苯的衍生物，如卤代苯(例如氯苯、二氯苯、溴苯或多氯联苯即PCB)、烷基苯(例如甲苯、乙苯或二甲苯)、酚类物质(例如苯酚、间苯二酚、儿茶酚、多元酚或取代酚，例如甲酚)、醚化苯(例如茴香醚)、稠环化合物(例如萘或聚芳烃)、芳香胺(例如苯胺和N-烷基或N,N-二烷基取代苯胺)、苯甲酸化合物(例如苯甲酸及其酯和苯甲酸的羟基取代衍生物)或者生物活性的芳香族化合物(例如由细菌、真菌或植物所生成的)。在其它实施方式中，芳香族污染物是杂芳香族物质如呋喃、吡喃、二恶英、噻吩、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡咯、咪唑、吲哚及其衍生物。
可以将任意上文所述的BNC或BNC-支架结构用于水体治理方法。在特定实施方式中，在水体治理方法中使用的酶是FRP酶，例如辣根过氧化物酶或者辣根过氧化物酶与氧化酶的组合。
在另一个方面，本发明涉及通过自由基机理使可聚合的单体聚合的方法。在所述方法中，将一种或多种类型的单体与任意上文所述的BNC或BNC-支架结构反应以使得单体聚合。所述单体可以是，例如上文所述用于水体治理方法中的任意物质。在特定实施方式中，所述单体是或者包括乙烯基加成单体。在聚合中，产生乙烯基加成聚合物。此类单体的一些示例包括乙烯、丙烯、丁二烯、丙烯酸及其酯、异丁烯酸及其酯、丙烯腈、乙酸乙烯酯、苯乙烯、二乙烯基苯、氟化乙烯和氯化乙烯。在其它实施方式中，所述单体是酚类化合物。在聚合中，产生酚树脂或聚合物。聚合方法可以采用本领域熟知的用于实施聚合反应的任意条件和装置，特别是用于实施由自由基引发的聚合反应的那些条件和装置。
在另一个方面，本发明涉及用于烯烃环氧化作用的方法。在所述方法中，在存在氧的情况下，使烯烃与上文所述的任意BNC或BNC-支架结构反应，前提条件是BNC或BNC-支架结构包含氧转移酶例如过氧化物酶或脂肪酶。反应优选地在显著更低的温度下进行(例如室温大约25℃)，显著低于与本领域中传统使用的环氧化烯烃的温度。烯烃可以是例如乙烯或丙烯，并且终产物可以是例如环氧乙烷或氧化丙烯。
在特定的实施方式中，环氧化方法使用固定在磁性支架上BNC中固定的氯过氧化物酶或脂肪酶或者这两者。包含酶的催化剂可以与磁性反应器一起(例如通过下文进一步描述的磁性陷阱的方法)在连续流动系统或分批式系统中使用。在连续流动系统中，催化剂通过电磁体的磁场保持在反应器中。从上游加入试剂(烯烃和氧化剂)，并且与反应区中的酶反应。氧化剂可以是，例如，过氧化氢或葡萄糖，如果使用氯过氧化物酶与葡萄糖氧化酶的话。溶液可以是水溶液或有机溶液(如二氧己环)或者是与酶相容的任意溶剂。连续的液流从酶的附近除去反应的产物，并且阻止底物和产物积累到可抑制的水平。由于具有不同的溶解度，产物通常集中到转化方法的下游，并且由于环氧化物基团的稳定性较差，产物随后在次级反应中反应。在分批式系统中，试剂通常与催化剂混合，搅拌，并且当反应完成时，通过磁性捕获将催化剂从批料中除去。由于具有不同的溶解度，反应的产物被集中起来，并且随后反应。捕获的催化剂可以重新用于新的分批式反应。
在另一个方面，本发明涉及用于苯酚类的卤化反应的方法。在所述方法中，苯酚类与上文所述的任意BNC或BNC-支架结构反应，前提条件是BNC或BNC-支架结构包含氧转移酶例如过氧化物酶或脂肪酶包含卤化酶，例如氯过氧化物酶。苯酚反应物可以是苯酚自身，或者是任意合适的苯酚衍生物，例如任意上述提供的苯酚类化合物。苯酚类产物可以是例如氯化的、溴化的或碘化的苯酚化合物。
在特定实施方式中，卤化反应的方法使用固定在磁性支架上BNC中固定的氯过氧化物酶。包含酶的催化剂可以与磁性反应器一起(例如通过下文进一步描述的磁性陷阱方法)在连续流动系统或分批式系统中使用。在连续流动系统中，催化剂通过电磁体的磁场保持在反应器中。从上游加入试剂(苯酚或苯酚衍生物，氧化剂，和氧化剂，卤离子例如I-、Br-或Cl-)，并且与反应区中的酶反应。氧化剂可以是，例如，过氧化氢或葡萄糖，如果使用氯过氧化物酶与葡萄糖氧化酶的话。溶液可以是水溶液或有机溶液(如二氧己环)或者是与酶相容的任意溶剂。连续的液流从酶的附近除去反应的产物，并且防止底物和产物积累到可抑制的水平。由于具有不同的挥发度和溶解度，产物通常集中到转化方法的下游。在分批式系统中，试剂通常与催化剂混合，搅拌，并且当反应完成时，通过磁性捕获将催化剂从批料中除去。由于具有不同的挥发度和溶解度，反应的产物被集中起来。捕获的催化剂可以重新用于新的批料反应。
在另一个方面，本发明涉及用于在溶液中抑制微生物的生长和功能的方法。在所述方法中，使用上文所述的任意BNC或BNC-支架结构处理包含微生物的水(即微生物污染的水)，前提是BNC或BNC-支架结构包含FRP酶，例如过氧化物酶，或者更特别地，乳过氧化物酶(LPO)或乳过氧化物酶与葡萄糖氧化酶的结合。
LPO系统被认为是人体抵御微生物感染的天然机制之一，因为在存在硫氰酸盐和过氧化氢条件下，LPO显示出广泛的抗真菌和抗细菌活性。因此，乳过氧化物酶被用于保存食物、化妆品和眼科溶液。另外，乳过氧化物酶还用于牙科和伤口处理中。乳过氧化物酶也可用作抗肿瘤剂和抗病毒剂。乳过氧化物酶底物包含溴化物、碘化物和硫氰酸盐。从这种酶的反应中生成的氧化的产物具有潜在的杀菌活性。乳过氧化物酶催化剂可以与上述磁性陷阱反应器结合使用，从而分别从硫氰酸盐、溴化物和碘化物中生成具有广泛活性的亚硫氰酸根(hypothiocyanite)、次溴酸根和次碘酸根离子。然后这些离子与流出物一起释放，在所述流出物中这些离子引起下游微生物的氧化压力，因而净化所述流出物。或者，可以在分批式反应器中或在水溶液中的某个表面上使用催化剂，然后通过磁化的收集器捕获催化剂。例如，据报道，亚硫氰酸盐抗细菌的作用是由于巯基(SH)的氧化。细菌细胞质膜中SH基的氧化造成运输葡萄糖能力的损失，并且也造成钾离子、氨基酸和肽的泄露，因而引起微生物的死亡。通常认为乳过氧化物酶的产物是安全的，并且是非诱变的，因此与食品和健康应用相容。
在另一个方面，本发明涉及用于将二氧化碳转化为甲醇的方法。在所述方法中，二氧化碳与上文所述的任意BNC或BNC-支架结构反应，前提是BNC或BNC-支架结构包含脱氢酶系统，包含至少两种、三种、或至少四种脱氢酶。脱氢酶可以包含例如甲酸脱氢酶(NAD+氧化还原酶，例如EC 1.2.1.2；或高铁细胞色素-b1氧化还原酶，例如EC 1.2.2.1)，与甲醛脱氢酶(例如EC 1.2.1.2)或者甲酸盐:高铁细胞色素b1氧化还原酶(例如EC 1.2.2.1)中的细胞色素联用；乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)；和葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.99.10)。
二氧化碳通过甲酸脱氢酶转化成甲酸，甲酸通过甲醛脱氢酶转化成甲醛，并且甲醛通过乙醇脱氢酶转化成甲醇。葡萄糖脱氢酶重新循环NAD+辅因子，所述NAD+辅因子来自甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和乙醇脱氢酶与其底物(CO2、甲酸和/或甲醛)和NADH的反应。理论上的摩尔比例是三分子葡萄糖使一分子CO2转化成甲醇。在特定实施方式中，甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和乙醇脱氢酶单独地或一起包封在BNC中。然后将BNC模板化到磁性支架上。然后将使用葡萄糖脱氢酶制备的BNC加入前面的催化剂中。这种构造允许俘获和重新利用辅因子，并且在甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的附近将辅因子的使用最大化。
或者，CO2转化方法能与三个不同的顺序的反应解偶联：使用甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化剂，以从CO2中合成甲酸；然后使用甲醛脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化剂，以从甲酸合成甲醛；然后使用乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，以从甲醛中合成甲醇。可以使用在流动反应器中单独的反应区或者单独的分批式方法。因此所述方法用于生成甲酸、甲醛和/或甲醇。
对于上文所述的任意方法而言，BNC-支架结构可以优选地通过磁分离进行捕获以防止污染最终产品。而且，本申请所述的BNC-支架结构的进一步优势是其能够在多种情况下保持活性并在被捕获后能够再生，这允许BNC-支架结构在被捕获后重新使用，因而增加了酶的总周转数量(TTN)。在经过若干个循环后，活性出现下降的BNC-支架系统可以优选地被容易地提取和浓缩成其固体形式，以提供浪费更少和更高效的方法。具体而言，通过酶的变性、超声处理和纯化，以使其重新储存和重新使用新鲜的功能性酶，从而可以将金属包被的BNC用于其它用途。BNC-支架结构在使用较低强度磁场的方法应用中具有吸引力。BNC-支架结构保持为稳定的、纳米化的并具有介孔的结构，这有助于在保持酶的活性同时增加磁性催化剂的整体密度和整体磁化率。这些超微结构使其本身更易于被由小的永磁体和弱场电磁体产生的外部磁场所控制。在将BNC-支架结构磁性捕获时，可以清除和更换反应溶液，因此只要酶保持其在方法中的活性水平，BNC-支架结构就可以连续使用。
在另一个方面，本发明涉及一种磁性陷阱方法，用于增加液相化学反应的空间时间收率和/或总周转数量，所述液相化学反应包含磁性颗粒以促进化学反应。在所述方法中，将包含上文所述BNC或BNC-支架结构的液相化学反应置于由一个或多个电磁体的多个磁场(即“动态磁性陷阱反应器”或“DMTR”)中，每个电磁体可以独立地被调整从而提供具有所需磁性强度、在液相化学反应中的相对位置和相对运动的磁场，从而在空间上限定磁性颗粒。在所述方法中，多个磁场的磁性强度、相对位置和相对运动由电流被适当地控制或调整的电磁体系统所提供。具体而言，通过以限制反应体积空间的方式应用磁场，可以增加空间时间收率。
任意上文所述的BNC或其分级催化剂集合可以用于磁性陷阱方法。在特定实施方式中，在移动的外部磁场的影响下，BNC或其分级催化剂集合优选地在反应过程中以“流体”的方式作用。流体移动的特征是，当用电磁体吸引时，BNC或其分级催化剂集合的聚集物(即“云”)在与反应器壁的碰撞中崩塌。这样，从催化剂中可以排出酶的反应产物。当“云”在其他方向移动时，能吸收新鲜的与酶反应的底物，然后当“云”撞击到对面的壁时，再将产物排出。这是磁性支架的重要属性，因为这种方式可以使得磁性支架像“微型泵”那样起作用(即与推挤海绵类似)。
在一些实施方式中，所述限制产生至少第一反应区和第二反应区，在各个反应区中可以进行独立的反应。前述实施方式中的目的是为了避免在催化剂附近积累底物和产物。由酶生成的自由基具有高度活性，并且可以与酶反应，或者在催化剂的表面聚合。为了避免这种对整体方法和酶的效率有害的情况，将所述方法解偶联到反应体积1和反应体积2，在反应体积1中生成自由基，在反应体积2中互相反应并且没有催化剂。通过由电磁体产生的交替磁场将磁性催化剂保留在反应体积1中，而溶液和试剂流经催化剂，进行反应，并且通过液流带走。控制所述方法的参数主要是诱导的磁场的强度和用以限制磁性催化剂的跳动频率，以及在反应器中的溶液的流速。
在其他实施方式中，磁性陷阱方法包括反应完成之后，通过使用动态磁性陷阱反应器来磁性捕获磁性粒子。在这个设定中，开启电磁体，从而捕获全部的磁性催化剂。通常除去或冲掉包含反应产物的溶液，用于下一步处理。通常在批料中再装满包含新鲜的要转化的底物溶液。通常，电磁体阵列继续进行开启/关闭循环，以搅动批料中的磁性催化剂。当催化剂达到最终使用寿命时，可以通过电磁体捕获催化剂，并且可以使用润洗溶液来充满反应器。然后可以关闭电磁体，以释放磁性催化剂并将其用润洗溶液冲出。可以使用第二电磁体阵列在下游的次级方法中，从润洗溶液中浓缩和提取磁性催化剂。
在磁性陷阱方法的特定实施方式中，向电磁体施加的电流是由计算机程序控制，以提供所述多个磁场的磁性强度、在液相化学反应中的相对位置和相对运动的所需集合，从而导致酶功能化的磁性颗粒的空间限制。可以使用任意所需数量的电磁体，并且电磁体可以以任意方式放置在反应容器的附近，以实现例如反应容积的限制、对反应的分离或对磁性颗粒的磁性捕获。电磁体也可以以阵列方式排列，例如双电磁体的两个阵列、三电磁体的两个阵列、四电磁体的两个阵列、双电磁体的三个阵列、三电磁体的三个阵列等等，每个单独的电磁体或电磁体的每个阵列被独立地操作和控制。
例如可以分别使用电磁体的单螺旋或双螺旋排列，特别是如图2A和2B图所示。磁性阵列包含计算机控制和可编程的电磁体，所述电磁体将磁性催化剂保持在反应区内并且防止酶向溶液中沥滤。如图2A和2B所示，当特别用于芳香族化合物的聚合或包含此类芳香族化合物的水体治理时，可以适当地操作电磁体阵列，以将BNC或BNC-支架集合磁性捕获，从而促进自由基聚合在反应容器的限定的一个或多个部分中，而反应体积的其他部分可用于非磁性诱导的反应或物理方法，例如聚合物浓缩或沉降。将芳香族化合物的氧化和其聚合分开进行，防止了在催化剂附近形成多酚类。多酚对催化剂(和酶)的分子捕获称为产物抑制。分子捕获所造成的产物抑制是不可逆的，并且造成催化效率的重大损失。另外，在单独的反应器中，通过包含絮凝剂例如盐或二价阳离子，或者通过包含偶合表面例如沙或有机材料，所述絮凝剂或偶合表面可捕获多酚和自由基，可以倾向于在反应器的底部进行聚合和浓缩。
根据所需的结果，磁场的运动可以是任意合适的运动，例如扫描垂直(上和/或下)运动、扫描水平(左和/或右)运动(例如“乒乓球运动”)，数字八(“8”)运动，对角线上下(“V”)运动、双对角线(W运动)、扫描水平、对角线向下扫描水平(Z运动)。可以需要其他类型的运动以控制催化剂在溶液中的运动，前提条件是液体的流动可以被电磁体产生的反作用力所抵消。由于与反应器的几何结构相对的电磁体几何结构和电磁体的电源开启/关闭循环，导致了运动。催化剂运动的速度是由电磁体(电源开启/关闭)的频率和来自这些磁体的磁场强度决定，这是向电磁体提供的电流强度的函数。可以设计计算机程序以产生任意需要的运动。
例如，可以设计计算机程序以提供磁场的交替运动或“乒乓球”运动。通过顺序开启一个磁体和关闭其对应方来实现乒乓球运动。诱导乒乓球运动的此类程序的一个示例如下所示：
int period＝1000；//以毫秒(msec)设定周期
void setup(){
pinMode(6,OUTPUT)；//设定u轴输出管脚pinMode(6,OUTPUT)；与9配对(pairedwith 9)
pinMode(7,OUTPUT)；//设定u轴输出管脚；与10配对
pinMode(8,OUTPUT)；//设定u轴输出管脚；与11配对
pinMode(9,OUTPUT)；//设定v轴输出管脚；与6配对
pinMode(10,OUTPUT)；//设定v轴输出管脚；与7配对
pinMode(11,OUTPUT)；//设定v轴输出管脚；与8配对
}
void loop(){
digitalWrite(6,HIGH)；//开启u轴
digitalWrite(7,LOW)；//关闭u轴
digitalWrite(8,HIGH)；//开启u轴
digitalWrite(9,LOW)；//关闭v轴
digitalWrite(10,HIGH)；//开启v轴
digitalWrite(11,LOW)；//关闭v轴
delay(ceil(period/2))；//延迟给定的间隔
digitalWrite(6,LOW)；//开启u轴
digitalWrite(7,HIGH)；//关闭u轴
digitalWrite(8,LOW)；/开启u轴
digitalWrite(9,HIGH)；//关闭v轴
digitalWrite(10,LOW)；//开启v轴
digitalWrite(11,HIGH)；//关闭v轴
delay(ceil(period/2))；//延迟给定的间隔
}
本发明还涉及进行上述磁性陷阱方法的装置。装置应该包括至少一个反应室，上述反应室由合适的反应容器材料制成并且具有至少两个相对的壁；一个或多个排列在所述至少两个相对的壁的外表面上的电磁体(通常是电磁体阵列)，和计算机可编程的控制器，所述控制器用于控制电磁体的电流。基于使用的控制器或通过应用多个控制器，可以扩展电磁体的数量。反应室可以设计成，例如，分批式反应器，或者是用于连续生产的流动池。此类反应容器的设计和制造是本领域熟知的。在典型实施方式中，装置还包括通过使用一个或多个计算机可编程的控制器来单独控制电磁体的方法，所述控制器控制电磁体的开启/关闭的频率。计算机可编程的控制器可以具有如图3所示的电子设置。在图3中，仅为示例性目的所示，可编程电子板可以使用例如12V电源和6输出(+5V)。微控制器控制输入(“CtrInp”名称)可以例如如图4所示，图4显示了常见的市售可得的控制板(例如ArduinoTMUNO)，所述控制板具有14个数字输入/输出管脚(其中六个可以用作PWM输出)，六个模拟输入，16MHz晶体振荡器，USB连接，电源组，ICSP数据接头和重置按键。每个输出可以控制电磁体或电磁体阵列。所述板由提供12V电源的外部电力发电机提供电源。+5V的输出是针对基线(0/+5V)而言。USB端口用于程控微控制器板。
实施例
木质素解聚
由于对工业部门而言过氧化物酶有氧化作用的潜能，所以已经充分研究了过氧化物酶。但是，过氧化物酶特别易于发生底物抑制，所述底物抑制阻碍了大规模的基于过氧化物酶的生物技术的发展。本申请显示了在与包被金的磁性纳米颗粒(Au-MNP)联用时，真菌的分解木质素的过氧化物酶的活性和顺应力显著增加。集合具有比游离酶更好的活性，并且可以用于能量原料的木质素成分的增强的解聚反应。这个结果显示集合可以包括复杂的酶系统以克服这个酶家族目前的物理和生化限制，并且生成新一代的木质素催化剂。基于酶的催化剂显示了双峰(bimodal)活性，在0.1和1mM的H2O2之间以及在高于500mM的H2O2时有两个最大值。在对酶最优浓度的范围内，Au-MNP没有活性。如图5和6所示，观察到了使用两种类型磁铁矿纳米颗粒(Au-M90和Au-M60)制备的催化剂在起始速度上有区别，其中Au-M90对速度和最优H2O2浓度这两方面都具有更加显著的效果。M60指在60℃时形成的磁铁矿纳米颗粒，和M90指在90℃时形成的磁铁矿纳米颗粒。形成过程的温度影响微晶的尺寸，并且最终影响纳米颗粒的磁性属性。M90纳米颗粒的平均直径是约10nm，而M60纳米颗粒的平均直径是约8nm。
图5显示了在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时、H2O2对由2.5nM锰过氧化物酶、不同浓度的Au-M60及其BNC所催化的DMP氧化速度的影响。为了方便，X轴是log10刻度。金的包衣防止了磁性核(磁铁矿)在酶活性所需的缓冲液中发生溶解。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了锰过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。当酶被包埋在金包被的纳米颗粒簇中时，抑制减少50倍。在这个过氧化氢的浓度范围(0.001-10mM)中，纳米颗粒没有固有的催化活性。
图6显示了在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时、H2O2对由2.5nM通用过氧化物酶、不同浓度的Au-M60及其BNC所催化的DMP氧化速度的影响。为了方便，X轴是log10刻度。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了通用过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。当酶被包埋在金包被的纳米颗粒中时，抑制减少28倍。在这个过氧化氢的浓度范围(0.001-10mM)中，纳米颗粒没有固有的催化活性。
如图5和6所示，随着Au-MNP浓度的增加，峰速度下降，但是H2O2的最优浓度变成更高的浓度。这在动力学参数中表现为，随着MNP浓度增加，Vmax下降。随着Au-MNP浓度增加，酶的抑制常数(Ki)增加。与游离的锰过氧化物酶相比，使用Au-M90时抑制下降50倍，而使用Au-M60抑制时下降约30倍。引人注意的是，认为是更低的Km和更高的Ki值驱动了对BNC所观察到的速度的相对增加。金的包衣防止了磁性核(磁铁矿)在酶活性所需缓冲液中发生溶解。如果没有金包衣，磁铁矿纳米颗粒在低于pH 5的丙二酸中通常在10分钟内就全部溶解。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了锰过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。
过氧化物酶催化体系用于解聚草生物质，生成可溶的芳香族化合物，随后使用UV和荧光光谱分析。针对这个应用，以等摩尔比例混合锰过氧化物酶和通用过氧化物酶。初始测试中直接使用过氧化氢，但由于酶的用量而不能得出结论。为检测生物质的任意活性所需的酶的浓度，如果一次性加入会有抑制性。通过在反应过程中维持较低的氧化剂浓度，可以显著提高酶的稳定性。在这种情况下，通过仔细控制过氧化物的加入量，将过氧化氢浓度保持在低水平，从而降低背景的氧化。过量过氧化氢“关闭”酶的作用是熟知的，并且传统方法解决这种作用是通过复杂的反应器设计，使用反馈回路来精确控制H2O2的原料流。为了避免这种问题，选择将过氧化物酶与产生过氧化物的酶(例如熟知的葡萄糖氧化酶(Gox))偶联，从而原位生成H2O2。Gox在氧的存在下将葡萄糖转化成过氧化氢和葡萄糖酸内酯。
结合葡萄糖氧化酶–过氧化物酶体系以与金包被的纳米颗粒进行组装，以用于生物质的转化。如图7A、7B、8A、8B和8C所示，过氧化物酶+氧化酶的混合体系比单独的酶对生物质具有更高的活性。图7A显示了用在金包被的BNC中固定或非固定的锰过氧化物酶和通用过氧化物酶混合物处理之后，上清液的UV-可见光光谱。图7B显示了在减去参照生物质光谱之后的相同的光谱。在这些实验条件下，使用过氧化氢作为氧化剂，只有当酶固定在BNC上时，酶才具有从生物质中释放芳香族化合物的功能。向生物质悬浮液中直接加入过氧化物会引起酶的底物抑制。因此，需要以少量递增的方式加入过氧化物以避免达到抑制水平。为了避免这种情况，通过在过氧化物酶BNC中加入葡萄糖氧化酶(Gox)，以原位生成过氧化氢(图8A、8B、8C)。Gox在氧的存在下将葡萄糖转化成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。这种氧化酶/过氧化物酶体系允许通过氧化酶来调节过氧化氢的生成速度，以满足过氧化物酶的消耗速度。在合适的稳态情况下，过氧化氢没有到达抑制浓度。在真实生物质上测试催化剂(BNC)，并且在UV范围内监测芳香族化合物分子(从木质素)的释放(光谱经过校正，并且根据对照样品进行扣减)。通过比较图8A、8B和8C，发现了更加合适的最优比例是1分子Gox对4分子过氧化物酶。发现跟游离酶体系相比，包埋锰过氧化物酶、通用过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的BNC对真实生物质的活性高出约30％。如图8B和8C所示，在真实生物质中，当过氧化物的浓度对游离酶更加有害时，Au-MNP保护酶免于抑制。
在锰过氧化物酶和通用过氧化物酶联合使用并且存在锰的条件下，BNC增加了可溶性芳香族化合物从生物质中的释放。用金包被的磁性纳米颗粒制备的BNC可以固定在磁性支架上，以方便重复使用。可以通过调整BNC中葡萄糖氧化酶的浓度来控制过氧化氢的生成速度。然而，由于在更高的过氧化氢浓度中具有更低的酶抑制，含更多金的金包被的纳米颗粒(AuM90)提供了更高的转化率。
除去苯酚
在这个实施例中报道了新的分级混合催化剂家族及其在高级氧化方法和除去苯酚中的应用，所述催化剂包含与磁性纳米颗粒组装的辣根过氧化物酶(HRP)及其在微粒中的掺入。分级混合催化剂可以通过图9所示的方法组装。在类似条件下，混合过氧化物酶催化剂的活性比游离的HRP高三倍，并且除去苯酚的能力比游离的HRP高三倍。在这种情况下，苯酚是代表酚类化合物的模型分子；评估了BNC除去苯酚的功效。
如图10所示，将BNC模板化到磁性支架不改变在BNC中包封的酶的活性，所述活性比游离酶更高效。这个结果显示所有体系都有效除去苯酚，但是在相同的浓度HRP下，BNC比游离酶更有效。另外，为了达到除去多于90％的苯酚，BNC中需要的HRP量比需要的游离HRP的量少三倍到四倍。
可以通过如图12A和12B中所示的磁性微粒与BNC的比例来控制磁性支架上BNC的组装。在图12A中，在样品支持物表面上可以看到过量的BNC。在图12B中，加入额外的磁性支架以捕获过量的BNC，这使得游离的BNC不再存在。上述结果显示了将BNC模板化到磁性支架的方法以创建分级结构。此类结构的至少一个优点在如图11A和11B所示的除去苯酚的结果中得以体现。与图11A相比，模板化的BNC(图11B)容易被除去，并且在分批式条件下数次反应循环后保持有活性。游离酶的活性在第一次循环后迅速下降，而模板化的BNC在这些分批式条件下在第五次循环后仍然保持了与游离酶相比巨大的活性。
通常，在H2O2存在时，HRP催化酚化合物的氧化，因而产生自由基。苯氧基随后在非酶促方法中互相反应以浓缩或形成聚合物。为了在连续流动方式中使用分级催化剂，本申请设计了由电磁体构成的反应器系统。所述系统如图13和图14所示。这些图分别显示了V型构造和I型构造。由电磁体驱动的催化剂的前后移动将催化剂保持在反应器的给定反应区内。催化剂的运动是由电磁体阵列的几何结构、电磁体电源的顺序开/关以及电磁体产生的磁场的强度来驱动的。当所述构造用于苯酚和芳香族化合物的治理时，可以允许在反应器体积内将反应区分隔开。
如图17所示，对苯酚的情况而言，当使用例如上述合适的电磁体构造时，自由基的产生可以与多酚的聚合分隔开。酶(以及在BNC中捕获的酶)把苯酚氧化成自由基形式。这些高度活性的基团互相反应以形成多酚。通过包含絮凝剂或二价盐，可以进一步浓缩这些多酚。在图15中大致描述了上述的苯酚除去(聚合)的方法。图右侧部分所示的棕色颗粒是由BNC介导的聚合而生成的多酚。可以通过沉淀或过滤，很容易地除去这些微米到毫米尺寸的多酚颗粒。
此类反应器用于水体治理应用的示例示于图16。磁性反应器使得基于酶的催化剂不受水流影响，并且磁性反应器置于污染的液体蓄水池和接受蓄水池之间。使聚合的污染物通过微粒床例如沙或其他颗粒材料，使其从水中分离。根据污染的严重情况，水可以在系统中循环若干次。
如上所述混合的催化剂降低来自底物的抑制，并且限制来自反应产物的失活，所述抑制和失活对游离酶或传统方法固定的酶来说非常常见。当在微米尺寸磁性颗粒上支持HRP/磁性纳米颗粒混合物时，可以提高重复利用性，并且可以使用上述的特定设计的磁性驱动反应器来限制。报道的混合催化剂的功能使其对于多个工业和环境应用有吸引力，并且通过消除大部分抑制为实际应用创造条件，所述抑制妨碍了游离酶或传统方法固定的酶的应用。
尽管已对本发明的优选实施方式进行了显示和描述，但是本领域技术人员仍可以在由所附权利要求所定义的本发明的保护范围内，对本申请进行多种改变和修改。

Claims (32)

1.一种分级催化剂组合物，所述组合物包含连续的大孔支架，在所述支架中掺入了自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物，其中通过磁力将第一种酶包封在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的介孔中，其中所述第一种酶的功能是将可扩散的底物转化为可扩散的产物，其中所述大孔支架是磁性的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一种酶包含产生自由基的酶。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第一种酶包含氧化还原酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述氧化还原酶包含过氧化物酶。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述过氧化物酶选自辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶、氯过氧化物酶和乳过氧化物酶。
6.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含第二种酶。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第一种酶是过氧化物酶和所述第二种酶是葡萄糖氧化酶。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第一种酶是过氧化物酶和所述第二种酶是漆酶。
9.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含磁性颗粒，所述磁性颗粒不属于所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物，所述磁性颗粒包埋在所述连续的大孔支架中。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述连续的大孔支架具有聚合物组合物。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述连续的大孔支架具有孔径大于50nm至多达100μm的大孔。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分级催化剂组合物具有允许其易于被外部磁场捕获和控制的整体磁性。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述连续的大孔支架是磁性聚合物。
14.一种用于生产分级催化剂组合物的方法，包括将多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物与在溶液中的连续的大孔支架接触，以便将所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物包埋进入所述连续的大孔支架的多个大孔中，其中通过磁力将酶包封在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的介孔中，其中所述大孔支架是磁性的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述连续的大孔支架是由模板法生产，所述模板法包括(i)生产复合物，所述复合物包含在其中包埋了牺牲模板剂的支架前体材料，和(ii)选择性除去所述牺牲模板剂以便在所述支架前体材料中产生大孔。
16.一种用于解聚木质素的方法，所述方法包括将所述木质素暴露于分级催化剂组合物，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中所述聚集物包含通过磁力包封在所述介孔中的产生自由基的酶，将所述介孔聚集物暴露于过氧化氢，使得所述产生自由基的酶从所述过氧化氢中产生自由基，所述自由基从所述介孔聚集物中扩散，和使用所述自由基解聚所述木质素以生产解聚产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述解聚产物选自以下组成的组：松柏醇、芥子醇、香豆醇及其衍生物。
18.一种从水中除去芳香族物质的方法，所述方法包括将含有所述芳香族物质的水与分级催化剂组合物接触，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的所述介孔中通过磁力包封了产生自由基的酶，其聚合所述芳香族物质并从水中除去聚合的芳香族物质。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述芳香族物质选自取代的苯酚、多酚、芳香胺及其混合物。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述芳香族物质选自取代的苯酚、芳香胺、具有生物活性的芳香物及其混合物。
21.一种用于通过自由基反应将可聚合的单体聚合的方法，所述方法包括将所述单体与分级催化剂组合物反应，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的所述介孔中通过磁力包封了产生自由基的酶，并且其中所述酶引起单体的聚合。
22.一种用于烯烃环氧化的方法，所述方法包括在存在氧的条件下将烯烃与分级催化剂组合物反应，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的所述介孔中通过磁力包封了氧转移酶，并且其中所述酶用于生产氧化烯。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述氧转移酶是氯过氧化物酶或脂肪酶。
24.一种用于苯酚的卤化反应的方法，所述方法包括将苯酚与分级催化剂组合物反应，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中在所述磁性纳米颗粒的介孔聚集物的介孔中通过磁力包封了卤化酶，并且其中所述酶用于产生卤化的苯酚。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述卤化酶是氯过氧化物酶。
26.一种用于在溶液中抑制微生物的生长的方法，所述方法包括将所述溶液暴露于分级催化剂组合物，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中所述聚集物包含通过磁力包封在所述介孔中的产生自由基的酶，将所述介孔聚集物暴露于过氧化氢，使得所述产生自由基的酶从所述过氧化氢中产生自由基，所述自由基从所述介孔聚集物中扩散，并用所述自由基抑制所述微生物的生长。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述产生自由基的酶包含乳过氧化物酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中将葡萄糖氧化酶与所述乳过氧化物酶组合。
29.一种用于将二氧化碳转化为甲醇的方法，所述方法包括将二氧化碳与分级催化剂组合物反应，所述组合物包含在其中掺入了多个自体组装的磁性纳米颗粒的介孔聚集物的大孔支架，其中所述大孔支架是磁性的，且其中所述聚集物包含通过磁力包封在磁性纳米颗粒的所述介孔聚集物的所述介孔中的甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，其中甲醇由二氧化碳产生。
30.一种用于增加液相化学反应的空间时间收率的装置，其包括在反应室中的根据权利要求1所述的分级催化剂组合物、位于所述反应室外表面的多个在空间上相反的电磁体，和用于控制在一个或多个所述电磁体中的电流的控制器，其中所述电磁体可在多个时间点进行操作以控制所述分级催化剂组合物在所述反应室内的位置。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述反应室是分批式反应器。
32.根据权利要求30所述的装置，其中所述反应室是流通池反应器。
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