DE69435050T2

DE69435050T2 - Alpha-1,4-glucan lyase aus einem pilz, ihre reinigung, genklonierung und expression in mikroorganismen

Info

Publication number: DE69435050T2
Application number: DE69435050T
Authority: DE
Inventors: Kirsten Bojsen; Shukun Yu; Karsten Mathias Kragh; Tove Martel Christensen; Jan Marcussen
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2014-10-16
Also published as: EP0723591A1; AU693116B2; GB2296243A; CA2174117A1; DE69435050D1; JP2007312790A; KR100376748B1; JP4028595B2; JPH09505989A; WO1995010617A3; JP2005034156A; EP0723591B1; GB2296243B; CN1133069A; GB9321302D0; AU7856294A; US5908760A; ATE380874T1; GB9605354D0; NZ274508A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, insbesondere α-1,4-Glucanlyase ("GL"). Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Extrahieren derselben.
Die FR-A-2617502 und Baute et al. in Phytochemistry [1988], Band 27, Nr. 11, S. 3401–3403, berichten über die Herstellung von 1,5-D-Anhydrofructose ("AF") in Morchella vulgaris durch eine offensichtliche enzymatische Reaktion. Die Produktionsausbeute von AF ist relativ gering. Trotz eines Verweises auf eine mögliche enzymatische Reaktion stellt keines dieser beiden Dokumente irgendwelche Aminosäuresequenzdaten für irgendein Enzym, geschweige denn irgendwelche Nukleotidsequenzinformationen dar. Diese Dokumente besagen, daß AF ein Vorläufer für die Herstellung des antibiotischen Pyrons Microthecin sein kann.
Yu et al. in Biochimica et Biophysica Acta [1993], Band 1156, S. 313–320, berichten über die Herstellung von GL aus Rotalgen und deren Verwendung zum Abbau von α-1,4-Glucan für die Herstellung von AF. Die Produktionsausbeute von AF ist relativ gering. Trotz eines Verweises auf das Enzym GL stellt dieses Dokument keinerlei Aminosäuresequenzdaten für dieses Enzym, geschweige denn irgendwelche Informationen zu Nukleotidsequenzen, die dieses codieren, dar. Dieses Dokument deutet auch an, daß die Quelle von GL nur Algen sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms α-1,4-Glucanlyase bereitgestellt, welches das Isolieren von α-1,4-Glucanlyase aus einer Kultur eines Pilzes, die im wesentlichen frei von jeglichen anderen Organismen ist, umfaßt, wobei die α-1,4-Glucanlyase unter Verwendung eines Gels, welches durch das Enzym nicht abgebaut wird und auf Cyclodextrin basiert, isoliert und/oder weiter gereinigt wird. Bevorzugter basiert das Gel auf Beta-Cyclodextrin.
Es wird auch ein GL-Enzym bereitgestellt, hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Vorzugsweise ist der Pilz Morchella costata oder Morchella vulgaris.
Vorzugsweise umfaßt das Enzym die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.
Der Begriff "jegliche Variante davon" bedeutet jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Addition einer Aminosäure aus oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß das resultierende Enzym Lyaseaktivität besitzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, die dass Enzym α-1,4-Glucanlyase codiert, wobei vorzugsweise die Sequenz nicht in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt (d. h. sie ist nicht Teil des natürlichen Genoms eines zellulären Organismus, welcher das Enzym exprimiert).
Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz.
Vorzugsweise umfaßt die DNA-Sequenz eine Sequenz, die die gleiche ist wie oder komplementär ist zu SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4.
Der Ausdruck "wesentliche Homologie" deckt Homologie hinsichtlich Struktur und/oder Nukleotidkomponenten und/oder biologischer Aktivität ab.
Der Ausdruck "enthält jegliche geeignete Codonsubstitutionen" deckt jegliche Codonersetzung oder -substitution mit einem anderen Codon, welches dieselbe Aminosäure codiert, oder jegliche Addition oder Entfernung desselben ab, mit der Maßgabe, daß das resultierende Enzym Lyaseaktivität besitzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms α-1,4-Glucanlyase bereitgestellt, welches das Exprimieren der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Es wird auch die Verwendung von Beta-Cyclodextrin zum Reinigen eines Enzyms, vorzugsweise GL, bereitgestellt.
Es wird auch eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, wobei die DNA-Sequenz aus wenigstens einer Sequenz besteht, die die gleiche ist wie oder komplementär ist zu SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4, wobei vorzugsweise die Sequenz in isolierter Form vorliegt.
Daher werden auch Verfahren betreffend das Isolieren des Enzyms α-1,4-Glucanlyase aus einem Pilz bereitgestellt. Der Pilz kann beispielsweise irgendeiner von Discina perlata, Discina parma, Gyromitra gigas, Gyromitra infula, Mitrophora hybrida, Morchella conica, Morchella costata, Morchella elata, Morchella hortensis, Morchella rotunda, Morchella vulgaris, Peziza badia, Sarcosphaera eximia, Disciotis venosa, Gyromitra esculenta, Helvella crispa, Helvella lacunosa, Leptopodia elastica, Verpa digitaliformis und anderen Formen von Morchella sein. Vorzugsweise ist der Pilz Morchella costata oder Morchella vulgaris.
Die anfängliche Enzymreinigung kann durch das von Yu et al. (ebd.) beschriebene Verfahren durchgeführt werden.
Vorzugsweise umfaßt die anfängliche Enzymreinigung jedoch ein optimiertes Verfahren, bei dem ein fester Träger verwendet wird, welcher sich während der Reinigungsstufe nicht zersetzt. Dieser Gelträger hat weiterhin den Vorteil, daß er mit standardmäßiger Proteinreinigungs-Laborausrüstung kompatibel ist.
Die Einzelheiten dieser optimierten Reinigungsstrategie werden später ausgeführt. Die Reinigung wird durch bekannte Standardtechniken für die Proteinreinigung beendet.
Die Reinheit des Enzyms kann unter Verwendung von komplementären elektroforetischen Techniken leicht festgestellt werden.
Die gereinigte Lyase GL wurde gemäß pI-, Temperatur- und pH-Optima charakterisiert.
In diesem Zusammenhang zeigt die Pilzlyase einen pI von ungefähr 5,4, bestimmt mittels isoelektrischer Fokussierung auf Gelen mit einem pH-Gradienten von 3 bis 9. Das Molekulargewicht, bestimmt mittels SDS-PAGE auf 8–25%-igen Gradientengelen, betrug 110 kDa. Das Enzym zeigt ein pH-Optimum im Bereich von pH 5–7. Es wurde herausgefunden, daß das Temperaturoptimum zwischen 30–45°C liegt.

GL-Quellen Optimaler pH-Wert Optimaler pH-Bereich Optimale Temperatur

M. costata 6,5 5,5–7,5 37°C, 40°C

M. vulgaris 6,4 5,9–7,6 43°C, 48°C
Die Parameter wurden unter Verwendung von Glycogen als Substrat bestimmt; weitere Parameter wurden unter Verwendung von Amylopektin als Substrat bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die α-1,4-Glucanlyase durch Affinitätschromatographie auf β-Cyclodextrin-Sepharose, Ionenaustausch auf Mono Q HR 5/5 und Gelfiltration auf Superose 12-Säulen aus dem Pilz Morchella costata gereinigt.
PAS-Färbung zeigt, daß die Pilzlyase nicht glycosyliert wurde. In dem zellfreien Pilzextrakt wurde durch Gel-Aktivitätsfärbung auf Elektroforesegelen nur eine Form von α-1,4-Glucanlyase detektiert.
Das Enzym sollte vorzugsweise sekregiert werden, um seine Reinigung zu vereinfachen. Um dies zu tun, wird die DNA, die das reife Enzym codiert, mit einer Signalsequenz, einem Promotor und einem Terminator von dem ausgewählten Wirt fusioniert.
Für die Expression in Aspergillus niger werden der gpdA-(aus dem Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen von Aspergillus nidulans)Promotor und die Signalsequenz an das 5'-Ende der DNA, die die reife Lyase codiert – wie z. B. SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 –, fusioniert. Die Terminatorsequenz aus dem A. niger-trpC-Gen wird 3' zu dem Gen plaziert (Punt, P. J. et al. (1991): J. Biotech. 17, 19–34). Diese Konstruktion wird in einen Vektor eingebracht, welcher einen Replikationsursprung und einen Selektionsursprung für E. coli und einen Selektionsmarker für A. niger enthält. Beispiele von Selektionsmarkern für A. niger sind das amdS-Gen, das argB-Gen, das pyrG-Gen, das hygB-Gen, das BmIR-Gen, die allesamt für die Selektion von Transformanten verwendet wurden. Dieses Plasmid kann in A. niger umgewandelt werden, und die reife Lyase kann aus dem Kulturmedium der Transformanten gewonnen werden.
Das Konstrukt kann in einen Protease-defizienten Stamm umgewandelt werden, um den proteolytischen Abbau der Lyase im Kulturmedium zu reduzieren (Archer, D. B. et al. (1992): Biotechnol. Lett. 14, 357–362).
Die Aminosäurezusammensetzung kann gemäß dem Verfahren von Barholt und Jensen (Anal. Biochem. [1989], Band 177, S. 318–322) festgestellt werden. Die Probe für die Aminosäureanalyse des gereinigten Enzyms kann 69 μg/ml Protein enthalten.
Die Aminosäuresequenzen der GL-Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 gezeigt.
Die nachfolgenden Proben wurden am 3. Oktober 1994 gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) in 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1RY hinterlegt:
E. coli, enthaltend Plasmid pMC (NCIMB 40687) – [Ref. DH5alpha-pMC],
E. coli, enthaltend Plasmid pMV1 (NCIMB 40688) – [Ref. DH5alpha-pMV1], und
E. coli, enthaltend Plasmid pMV2 (NCIMB 40689) – [Ref. DH5alpha-pMV2].
Plasmid pMC ist ein pBluescript II KS, enthaltend ein 4,1 kb großes Fragment, welches aus einer genomischen Bibliothek, konstruiert aus Morchella costata, isoliert wurde. Das Fragment enthält ein Gen, welches α-1,4-Glucanlyase codiert.
Plasmid pMV1 ist ein pBluescript II KS, enthaltend ein 2,45 kb großes Fragment, welches aus einer genomischen Bibliothek, konstruiert aus Morchella vulgaris, isoliert wurde. Das Fragment enthält das 5'-Ende eines Gens, welches α-1,4-Glucanlyase codiert.
Plasmid MV2 ist ein pPUC19, enthaltend ein 3,1 kb großes Fragment, welches aus einer genomischen Bibliothek, konstruiert aus Morchella vulgaris, isoliert wurde. Das Fragment enthält das 3'-Ende eines Gens, welches α-1,4-Glucanlyase codiert.
In der nachfolgenden Diskussion steht MC für Morchella costata und MV steht für Morchella vulgaris.
Wie erwähnt, war die GL codierende Sequenz aus Morchella vulgaris in zwei Plasmiden enthalten. Wie in 5 (wird später diskutiert), auf die nun Bezug genommen wird, zu erkennen ist, enthält pMV1 die Nukleotide von Position 454 bis Position 2902, und pMV2 enthält die Nukleotide abstromig von (und einschließlich) Position 2897. Wie in den 2 und 3 (werden später diskutiert), auf die nun Bezug genommen wird, zu erkennen ist, kann man, um die codierenden Sequenzen zu ligieren, pMV2 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdauen und dann das relevante Fragment in pMV1, verdaut mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI, einbringen.
Hochgradig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhalten daher ein GL-Enzym, erhältlich durch die Expression der GL codierenden Sequenzen, die in Plasmiden vorliegen, welche Gegenstand von entweder Hinterlegung NCIMB 40687 oder Hinterlegung NCIMB 40688 und Hinterlegung NCIMB 40689 sind.
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich beispielhaft beschrieben.
In den nachfolgenden Beispielen wird auf die begleitenden Figuren Bezug genommen, in denen:
1 eine Plasmidkarte von pMC zeigt,
2 eine Plasmidkarte von pMV1 zeigt,
3 eine Plasmidkarte von pMV2 zeigt,
4 die GL codierende Sequenz und einen Teil der nicht-translatierten 5'- und 3'-Regionen für genomische DNA, erhalten aus Morchella costata, zeigt,
5 die GL codierende Sequenz und einen Teil der nicht-translatierten 5'- und 3'-Regionen für genomische DNA, erhalten aus Morchella vulgaris, zeigt,
6 einen Vergleich der GL codierenden Sequenzen und der nicht-translatierten Regionen von Morchella costata und Morchella vulgaris zeigt,
7 die als SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz zeigt, die Positionen der Peptidfragmente, die sequenziert wurden, zeigt und
8 die als SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz zeigt, die Positionen der Peptidfragmente, die sequenziert wurden, zeigt.
Genauer gesagt beträgt in 4 die Gesamtzahl an Basen 4726 und die DNA-Sequenzzusammensetzung ist: 1336 A, 1070 C, 1051 G, 1269 T. Das ATG-Startcodon ist in Fettdruck gezeigt. Die Introns sind unterstrichen. Das Stopcodon ist kursiv dargestellt.
In 5 beträgt die Gesamtzahl an Basen 4670 und die DNA-Sequenzzusammensetzung ist: 1253 A, 1072 C, 1080 G, 1265 T. Das ATG-Startcodon ist in Fettdruck gezeigt. Die Introns sind unterstrichen. Das Stopcodon ist kursiv dargestellt.
In 6 sind die beiden ausgerichteten Sequenzen diejenigen, die aus MC (Gesamtzahl an Resten: 1066) und MV (Gesamtzahl an Resten: 1070) erhalten wurden. Die verwendete Vergleichsmatrix war eine Strukturgenmatrize (Verlust offene Lücke: 10; Verlust Einheitslücke: 2). In dieser Figur ist das Zeichen, das verwendet wird, um zu zeigen, daß zwei ausgerichtete Reste identisch sind, ":". Das Zeichen, das verwendet wird, um zu zeigen, daß zwei ausgerichtete Reste ähnlich sind, ist ".". Die Aminosäuren, von denen es heißt, daß sie "ähnlich" sind, sind: A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, M, V; F, Y, W. Insgesamt besteht Identität: 920 (86,30%), Ähnlichkeit: 51 (4,78%). Die Anzahl an in MC eingebrachten Lücken ist 1 und die Anzahl an in MV eingebrachten Lücken ist 1.
In den angefügten Sequenzlisten ist SEQ ID NO: 1 die Aminosäuresequenz für GL, erhalten aus Morchella costata, SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz für GL, erhalten aus Morchella vulgaris, SEQ ID NO: 3 ist die codierende Nukleotidsequenz für GL, erhalten aus Morchella costata, und SEQ ID NO: 4 ist die codierende Nukleotidsequenz für GL, erhalten aus Morchella vulgaris.
In SEQ ID NO: 1 beträgt die Gesamtzahl an Resten 1066. Das GL-Enzym hat die Aminosäurezusammensetzung:

46 Ala 13 Cys 25 His 18 Met 73 Thr

50 Arg 37 Gln 54 Ile 43 Phe 23 Trp

56 Asn 55 Glu 70 Leu 56 Pro 71 Tyr

75 Asp 89 Gly 71 Lys 63 Ser 78 Val
In SEQ ID NO: 2 beträgt die Gesamtzahl an Resten 1070. Das GL-Enzym hat die Aminosäurezusammensetzung:

51 Ala 13 Cys 22 His 17 Met 71 Thr

50 Arg 40 Gln 57 Ile 45 Phe 24 Trp

62 Asn 58 Glu 74 Leu 62 Pro 69 Tyr

74 Asp 87 Gly 61 Lys 55 Ser 78 Val
1. ENZYMREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER α-1,4-GLUCANLYASE AUS DEM PILZ MORCHELLA COSTATA
1.1 Materialien und Methoden
Der Pilz Morchella costata wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Der Pilz wurde unter Verwendung des von der ATCC empfohlenen Kulturmediums bei 25°C auf einem Schüttler gezüchtet. Die Myzele wurden mittels Filtration geerntet und mit 0,9% NaCl gewaschen.
Die Pilzzellen wurden durch Homogenisation, gefolgt von Ultraschallbehandlung auf Eis für 6 × 3 Min. in 50 mM Citrat-NaOH, pH 6,2 (Puffer A), aufgebrochen. Die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation bei 25.000 × g für 40 Min. entfernt. Der bei diesem Verfahren erhaltene Überstand wurde als zellfreier Extrakt angesehen und wurde nach Abtrennung auf 8–25%-igen Gradientengelen für Aktivitätsfärbung und Western-Blotten verwendet.
1.2 Abtrennung durch β-Cyclodextrin-Sepharosegel
Der zellfreie Extrakt wurde direkt auf eine β-Cyclodextrin-Sepharosegel 46-Säule (2,6 × 18 cm), voräquilibriert mit Puffer A, aufgebracht. Die Säule wurde mit 3 Volumen Puffer A und 2 Volumen Puffer A, enthaltend 1 M NaCl, gewaschen. α-1,4-Glucanlyase wurde mit 2% Dextrinen in Puffer A eluiert. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und der Puffer wurde gegen 20 mM Bis-tris-propan-HCl (pH 7,0, Puffer B) ausgetauscht.
Die aktiven Fraktionen wurden auf eine Mono Q HR 5/5-Säule, voräquilibriert mit Puffer B, aufgebracht. Die Pilzlyase wurde mit Puffer B in einem linearen Gradienten von 0,3 M NaCl eluiert.
Das Lyasepräparat, das nach β-Cyclodextrin-Sepharose-Chromatographie erhalten wurde, wurde alternativ auf 150 μl konzentriert und auf eine Superose 12-Säule aufgebracht, die unter FPLC-Bedingungen betrieben wurde.
1.3 Test hinsichtlich α-1,4-Glucanlyaseaktivität und Bedingungen für die Bestimmung von Substratspezifität, pH- und Temperaturoptimum
Das Reaktionsgemisch für den Test der α-1,4-Glucanlyaseaktivität enthielt 10 mg ml^–1 Amylopektin und 25 mM Mes-NaOH (pH 6,0).
Die Reaktion wurde bei 30°C für 30 Min. durchgeführt und durch Zugabe von 3,5-Dinitrosalicylsäurereagens gestoppt. Die optische Dichte bei 550 nm wurde nach Stehenlassen bei Raumtemperatur für 10 Min. gemessen. 10 mM EDTA wurde zu dem Testgemisch zugegeben, wenn zellfreie Extrakte verwendet wurden.
Das Substrat Amylopektin in dem Testgemisch kann durch andere Substrate ersetzt werden, und die Reaktionstemperatur kann wie im Text angegeben variieren.
Bei den Untersuchungen zum pH-Optimum enthielt das Reaktionsgemisch 10 mg ml^–1 Amylopektin oder Maltotetraose in einem 40 mM Puffer. Die verwendeten Puffer waren Glycin-NaOH (pH 2,0–3,5), HoAc-NaoAc (pH 3,5–5,5), Mes-NaOH (pH 5,5–6,7), Mops-NaOH (pH 6,0–8,0) und Bicin-NaOH (pH 7,6–9,0). Die Reaktionen wurden bei 30°C für 30 Min. durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen in den Untersuchungen zum Temperaturoptimum waren die gleichen wie oben, mit der Ausnahme, daß der Puffer Mops-NaOH (pH 6,0) in allen Experimenten verwendet wurde. Die Reaktionstemperatur wurde wie im Text angegeben variiert.
SDS-PAGE, Nativ-PAGE und isoelektrische Fokussierung wurden unter Verwendung von 8–25%-igen Gradientengelen bzw. Gelen mit einem pH-Gradienten von 3–9 auf PhastSystem (Pharmacia, Schweden) durchgeführt. Nach der Elektroforese wurden die Gele mittels Silberfärbung gemäß den vom Hersteller (Pharmacia) empfohlenen Verfahren gefärbt. Die Glycoproteine wurden mittels PAS, eingestellt auf das PhastSystem, gefärbt. Für die Aktivitätsfärbung wurde die Elektroforese unter nativen Bedingungen bei 6°C durchgeführt.
Nach der Elektroforese wurde das Gel in der Gegenwart von 1% löslicher Stärke bei 30°C über Nacht inkubiert. Die Aktivitätsbande der Pilzlyase wurde durch Färbung mit I₂/KI-Lösung gezeigt.
1.4 Ergebnisse
1.4.1 Reinigung, Molekularmasse und isoelektrischer Punkt der α-1,4-Glucanlyase
Es wurde herausgefunden, daß die Pilzlyase an Säulen adsorbierte, die mit β-Cyclodextrin-Sepharose, Stärken und roter Sepharose beladen waren. Mit β-Cyclodextrin-Sepharose-4B-Gel und Stärken beladene Säulen wurden für Reinigungszwecke verwendet.
Das durch diese Stufe erhaltene Lyasepräparat enthielt nur geringfügige kontaminierende Proteine mit einer Molekularmasse, die größer war als die der Pilzlyase. Die Verunreinigung wurde entweder mittels Ionenaustauschchromatographie auf Mono Q HR 5/5 oder, was effizienter war, mittels Gelfiltration auf Superose 12 entfernt.
Das gereinigte Enzym hatte ein farbloses Erscheinungsbild und zeigte keine Absorption im Bereich des sichtbaren Lichts. Die Molekularmasse wurde mit 110 kDa bestimmt, wie mittels SDS-PAGE berechnet.
Die gereinigte Pilzlyase zeigte einen isoelektrischen Punkt von pI 5,4, bestimmt mittels isoelektrischer Fokussierung auf Gelen mit einem pH-Gradienten von 3 bis 9. In den nativen Elektroforesegelen erschien das Enzym als eine einzelne Bande. Diese Bande zeigte Stärke abbauende Aktivität, detektiert mittels Aktivitätsfärbung. In Abhängigkeit vom Alter der Kultur, aus der das Enzym extrahiert wurde, zeigte sich das Enzym auf den nativen Gelen und den Gelen der isoelektrischen Fokussierung entweder als eine scharfe Bande oder als eine diffusere Bande mit der gleichen Migrationsgeschwindigkeit und dem gleichen pI.
1.4.2 Das pH- und Temperaturoptimum der durch Pilzlyase katalysierten Reaktion
Es wurde herausgefunden, daß der optimale pH-Bereich für die durch Pilzlyase katalysierte Reaktion zwischen pH 5 und pH 7 liegt.
1.4.3 Substratspezifität
Die gereinigte Pilzlyase baute Maltosaccharide von Maltose zu Maltoheptaose ab. Die Abbaugeschwindigkeiten variierten jedoch. Die höchste Aktivität wurde mit Maltotetraose (Aktivität gleich 100%), gefolgt von Maltohexaose (97%), Maltoheptaose (76%), Maltotriose (56%), erzielt, und die niedrigste Aktivität wurde bei Maltose (2%) beobachtet.
Amylopektin, Amylose und Glycogen wurden ebenfalls durch die Pilzlyase abgebaut (% wird bestimmt). Die Pilzlyase war eine Exolyase und keine Endolyase, da sie p-Nitrophenyl-α-D-Maltoheptaose abbaute, jedoch keine am reduzierenden Ende blockierte p-Nitrophenyl-α-D-Maltoheptaose abbaute.
1.5 Morchella vulgaris
Die Protokolle für die Enzymreinigung und Charakterisierung von Alpha-1,4-Glucanlyase, erhalten aus Morchella vulgaris, waren die gleichen wie diejenigen oben für Morchella costata (mit ähnlichen Ergebnissen – siehe die oben genannten Ergebnisse).
2. AMINOSÄURESEQUENZIERUNG DER α-1,4-GLUCANLYASE AUS PILZ
2.1 Aminosäuresequenzierung der Lyasen
Die Lyasen wurden entweder mit Endoproteinase Arg-C aus Clostridium histolyticum oder Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter enzymogenes, beide in Sequenzierungsqualität, erworben von Boehringer Mannheim, Deutschland, verdaut. Für den Verdau mit Endoproteinase Arg-C wurde gefriergetrocknete Lyase (0,1 mg) in 50 μl 10 M Harnstoff, 50 mM Methylamin, 0,1 M Trip-HCl, pH 7,6, gelöst. Nach Überlagerung mit N₂ und Zugabe von 10 μl 50 mM DTT und 5 mM EDTA wurde das Protein für 10 Min. bei 50°C unter N₂ denaturiert und reduziert. Anschließend wurde 1 μg Endoproteinase Arg-C in 10 μl 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, zugegeben, mit N₂ überlagert, und der Verdau wurde für 6 h bei 37°C durchgeführt.
Für die anschließende Derivatisierung von Cystein wurden 12,5 μl 100 mM Iodacetamid zugegeben, und die Lösung wurde für 15 Min. bei RT im Dunkeln unter N₂ inkubiert.
Für den Verdau mit Endoproteinase Lys-C wurde gefriergetrocknete Lyase (0,1 mg) in 50 μl 8 M Harnstoff, 0,4 M NH₄HCO₃, pH 8,4, gelöst. Nach Überlagerung mit N₂ und Zugabe von 5 μl 45 mM DTT wurde das Protein für 15 Min. bei 50°C unter N₂ denaturiert und reduziert. Nach Abkühlen auf RT wurden 5 μl 100 mM Iodacetamid zugegeben, um die Cysteine für 15 Min. bei RT im Dunkeln unter N₂ zu derivatisieren. Anschließend wurden 90 μl Wasser und 5 μg Endoproteinase Lys-C in 50 μl 50 mM Tricin und 10 mM EDTA, pH 8,0, zugegeben, und der Verdau wurde für 24 h bei 37°C unter N₂ durchgeführt.
Die resultierenden Peptide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC auf einer VYDAC C18-Säule (0,46 × 15 cm, 10 μm, The Separations Group, Kalifornien) unter Verwendung von Lösungsmittel A: 0,1% TFA in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1% TFA in Acetonitril getrennt. Ausgewählte Peptide wurden auf einer Develosil C18-Säule (0,46 × 10 cm, 3 μm, Dr. Ole Schou, Novo Nordisk, Dänemark) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems erneut chromatographiert, ehe Sequenzieren auf einem Applied Biosystems 476A-Sequenzierer unter Anwendung von schnellen Zyklen mit pulsierender Flüssigkeit erfolgte.
Die Aminosäuresequenzinformation des aus dem Pilz Morchella costata abgeleiteten Enzyms ist in 7 gezeigt.
Die Aminosäuresequenzinformation des aus dem Pilz Morchella vulgaris abgeleiteten Enzyms ist in 8 gezeigt.
3. DNA-SEQUENZIERUNG VON GENEN, DIE DIE α-1,4-GLUCANLYASE AUS PILZ CODIEREN
3.1 VERFAHREN FÜR MOLEKULARBIOLOGIE
DNA wurde isoliert, wie es von Dellaporte et al. (1983 – Plant Mol. Biol. Rep., Band 1, S. 19–21) beschrieben wurde.
3.2 PCR
Die Herstellung des relevanten DNA-Moleküls erfolgte unter Verwendung des Gene Amp-DNA-Vervielfältigungskits (Perkin Elmer Cetus, USA) und gemäß den Anleitungen des Herstellers, mit der Ausnahme, daß die Taq-Polymerase später zugegeben wurde (siehe PCR-Zyklen) und die Temperaturzyklen wie folgt geändert wurden: PCR-Zyklen:

Anzahl der Zyklen °C Zeit (Min.)

1 98 5

60 5

Zugabe von Taq-Polymerase und Öl

35 94 1

47 2

72 3

1 72 20
3.3 KLONIEREN VON PCR-FRAGMENTEN
PCR-Fragmente wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers in pT7Blue (von Novagen) kloniert.
3.4 DNA-SEQUENZIERUNG
Doppelstrangige DNA wurde im wesentlichen gemäß dem Didesoxyverfahren von Sanger et al. (1979) unter Verwendung des Auto Read-Sequenzierungskits (Pharmacia) und des Pharmacia LKB-A. L. F.-DNA-Sequenzierers sequenziert. (Lit.: Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A. R. (1979). DNA sequencing with chain-determinating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467).
3.5 SCREENEN DER BIBLIOTHEKEN
Das Screenen der Lambda-Zap-Bibliotheken, erhalten von Stratagene, wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Vorhybridisierung und die Hybridisierung in 2 × SSC, 0,1% SDS, 10 × Denhardt'scher Lösung und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt wurden.
Zu der Hybridisierungslösung wurde eine 32P-markierte denaturierte Sonde zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 55°C. Die Filter wurden zweimal in 2 × SSC, 0,1% SDS und zweimal in 1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen.
3.6 SONDE
Die klonierten PCR-Fragmente wurden durch Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen aus dem pT7blue-Vektor isoliert. Die Fragmente wurden mittels Agarosegelelektroforese von dem Vektor getrennt und die Fragmente wurden mittels Agarase (Boehringer Mannheim) von der Agarose gereinigt. Da die Fragmente nur 90–240 bp lang waren, wurden die isolierten Fragmente vor Markierung mit 32P-dCTP unter Verwendung von entweder Prime-It-Random-Primer-Kit (Stratagene) oder Ready to Go-DNA-Markierungskit (Pharmacia) einer Ligationsreaktion ausgesetzt.
3.7 ERGEBNISSE
3.7.1 Erzeugung von PCR-DNA-Fragmenten, die α-1,4-Glucanlyase codieren
Die Aminosäuresequenzen (unten gezeigt) dreier einander überlappender tryptischer Peptide von α-1,4-Glucanlyase wurden verwendet, um gemischte Oligonukleotide zu erzeugen, die als PCR-Primer für die Vervielfältigung von DNA, isoliert sowohl aus MC als auch aus MV, verwendet werden konnten.
Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr
In der ersten PCR-Vervielfältigung wurden die Primer A1/A2 (siehe unten) als aufstromige Primer verwendet, und die Primer B1/B2 (siehe unten) wurden als abstromige Primer verwendet.
Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%-igen LMT-Agarosegel analysiert, und Fragmente der erwarteten Größen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Agarase (Boehringer Mannheim) behandelt und in den pT7blue-Vektor (Novagen) kloniert und sequenziert.
Die klonierten Fragmente aus der PCR-Vervielfältigung codierten Aminosäuren, die den sequenzierten Peptiden (siehe oben) entsprachen, und in jedem Fall zusätzlich zu zwei Intronsequenzen. Für MC entspricht die mittels PCR vervielfältigte DNA-Sequenz der Sequenz, die unter Bezugnahme auf 4 von Position 1202 bis Position 1522 gezeigt ist. Für MV entspricht die mit tels PCR vervielfältigte DNA-Sequenz der Sequenz, die unter Bezugnahme auf 5 von Position 1218 bis Position 1535 gezeigt ist.
3.7.2 Screenen der genomischen Bibliotheken mit den klonierten PCR-Fragmenten
Das Screenen der Bibliotheken mit dem oben genannten Klon ergab zwei Klone für jede Quelle. Für MC wurden die beiden Klone unter Bildung der in 4 gezeigten Sequenz (siehe unten) kombiniert. Für MV konnten die beiden Klone in der oben beschriebenen Weise unter Bildung der in 5 gezeigten Sequenz kombiniert werden.
Eine zusätzliche PCR wurde durchgeführt, um den MC-Klon mit PstI-, PvuII-, AscI- und NcoI-Restriktionsstellen unmittelbar vor dem ATG-Startcodon zu ergänzen, wobei das folgende Oligonukleotid als aufstromiger Primer verwendet wurde:
und ein Primer, welcher die Komplementsequenz von bp 1297–1318 in 4 enthielt, wurde als abstromiger Primer verwendet.
Die vollständige Sequenz für MC wurde erzeugt durch Klonieren des 5'-Endes des Gens als ein BglII-Eco-RI-Fragment von einem der genomischen Klone (erster Klon) in die BamHI-EcoRI-Stellen des pBluescript II KS+-Vektors von Stratagene. Das 3'-Ende des Gens wurde darin in den modifizierten pBluescript II KS+-Vektor kloniert durch Ligieren eines NspV(stumpfendig gemacht unter Verwendung des Kits zur Erzeugung von stumpfen DNA-Enden von Amersham International)-EcoRI-Fragments des anderen genomischen Klons (zweiter Klon), nachdem der modifizierte pBluescript II KS+-Vektor mit EcoRI und EcoRV verdaut worden war. Dann wurde der dazwischenliegende Teil des Gens als ein EcoRI-Fragment des ersten Klons in den weiter modifizierten pBluescript II KS+-Vektor kloniert durch Ligieren dieses Fragments in den weiter modifizierten pBluescript II KS+-Vektor, verdaut mit EcoRI.
4. EXPRESSION DES GL-GENS IN MIKROORGANISMEN
Die DNA-Sequenz, die GL codiert, kann in Mikroorganismen eingebracht werden, um das Enzym mit hoher spezifischer Aktivität und in großen Mengen herzustellen.
In diesem Zusammenhang wurde das MC-Gen (4) als ein stumpfendiges XbaI-XhoI-(unter Verwendung des Kits zur Erzeugung von stumpfen DNA-Enden von Amersham International)Fragment in den Pichia-Expressionsvektor pHIL-D2 (welcher den AOX1-Promotor enthält) kloniert, mit EcoRI verdaut und für die Expression in Pichia pastoris (gemäß dem Protokoll, wie es in dem Pichia-Expressionskit, geliefert von Invitrogen, angegeben ist) stumpfendig gemacht (unter Verwendung des Kits zur Erzeugung von stumpfen DNA-Enden von Amersham international).
In einer weiteren Ausführungsform wurde das MC-Gen 1 (das gleiche wie in 4, mit der Ausnahme, daß es mittels PCR so modifiziert wurde, daß Restriktionsstellen wie oben beschrieben eingebracht wurden) als ein stumpfendiges PvuII-XhoI-Fragment (unter Verwendung des Kits zur Erzeugung von stumpfen DNA-Enden von Amersham International) in den Aspergilius-Expressionsvektor pBARMTE1 (welcher den Methyltryptophan-Resistenzpromotor aus Neuropera crassa enthält) kloniert, verdaut mit SmaI für die Expression in Aspergillus niger (Pall et al. (1993) Fungal Genet. Newslett., Band 40, Seiten 59–62). Die Protoplasten wurden gemäß Daboussi et al. (Curr. Genet. (1989), Band 15, S. 453–456) unter Verwendung der lysierenden Enzyme Sigma L-2773 und der Lyticase Sigma L-8012 hergestellt. Die Transformation der Protoplasten wurde gemäß dem von Buxton et al. (Gene (1985), Band 37, S. 207–214) angegebenen Protokoll vorgenommen, mit der Ausnahme, daß zum Plattieren der transformierten Protoplasten das in Punt et al. (Methods in Enzymology (1992), Band 216, S. 447–457) dargelegte Protokoll befolgt wurde, jedoch unter Verwendung von 0,6% osmotisch stabilisierter Deckagarose.
Die Ergebnisse zeigten, daß Lyaseaktivität in den transformierten Pichia pastoris und Aspergillus niger beobachtet wurde. Diese Experimente werden nun beschrieben.
ANALYSEN VON PICHIA-LYASETRANSFORMANTEN UND ASPERGILLUS-LYASETRANSFORMANTEN
ALLGEMEINE VERFAHREN
Herstellung von zellfreien Extrakten
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 9000 U. p. M. für 5 Min. geerntet und mit 0,9% NaCl gewaschen und in Aufbrechpuffer (50 mM K-Phosphat, pH 7,5, enthaltend 1 mM EDTA, und 5% Glycerol) resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Glasperlen und Vortexbehandlung aufgebrochen. Der Aufbrechpuffer enthielt 1 mM PMSF (Proteaseinhibitor). Der Lyaseextrakt (Überstand) wurde nach Zentrifugation bei 9000 U. p. M. für 5 Min., gefolgt von Zentrifugation bei 20.000 × g für 5 Min. erhalten.
Test der Lyaseaktivität durch alkalisches 3,5-Dinitrosalicylsäurereagens (DNS)
Ein Volumen Lyaseextrakt wurde mit einem gleichen Volumen 4%-iger Amylopektinlösung gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei einer kontrollierten Temperatur inkubiert, und Proben wurden zu spezifizierten Intervallen entnommen und auf AF analysiert.
Die Lyaseaktivität wurde auch unter Verwendung eines radioaktiven Verfahrens analysiert.
Das Reaktionsgemisch enthielt 10 μl ¹⁴C-Stärkelösung (1 μCi; Sigma Chemicals Co.) und 10 μl des Lyaseextrakts. Das Reaktionsgemisch wurde bei 25°C über Nacht stehen gelassen und dann in dem üblichen TLC-System analysiert. Die erzeugte radioaktive AF wurde unter Verwendung eines Instant Imagers (Pachard Instrument Co., Inc., Meriden, CT) detektiert.
Elektroforese und Western-Blotten
SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 8–25%-igen Gradientengelen und des PhastSystems (Pharmacia) durchgeführt. Western-Blots wurden auch auf einer Semidry-Transfereinheit des PhastSystems durchgeführt. Gegen die Lyase, die aus den in Qingdao (China) gesammelten Rotalgen gereinigt wurde, gezüchtete primäre Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Schwein-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an alkalische Phosphatase (Dako A/S, Glostrup, Dänemark), wurden als sekundäre Antikörper und in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Teil I, Analyse der Pichia-Transformanten, die das oben genannte Konstrukt enthalten

MC-Lyase, intrazellulär in Pichia pastoris exprimiert

Name der Kultur Spezifische Aktivität*

A18 10

A20 32

A21 8

A22 8

A24 6

*Die spezifische Aktivität wurde definiert als nmol AF produziert pro Min. pro mg Protein bei 25°C.

Teil II, Die Aspergillus-Transformanten
Ergebnisse

I. Die Lyaseaktivität wurde nach 5 Tagen Inkubation (Minimalmedium, enthaltend 0,2% Kasein) als enzymatisches Hydrolysat durch das alkalische 3,5-Dinitrosalicylsäurereagens bestimmt

Analyse der Lyaseaktivität in zellfreien Extrakten

Name der Kultur Spezifische Aktivität*

8.13 11

8.16 538

8.19 37

Die Ergebnisse zeigen, daß die MC-Lyase intrazellulär in A. niger exprimiert wurde.
Anstelle von Aspergillus niger als Wirt könnten auch andere wichtige industrielle Mikroorganismen, für die gute Expressionssysteme bekannt sind, verwendet werden, wie beispielsweise: Aspergillus oryzae, Aspergillus sp., Trichoderma sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus sp., Streptomyces sp. oder E. coli.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen jegliche der nachfolgend genannten: Einen transformierten Wirtsorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von AF als Folge der Einbringung einer DNA-Sequenz wie hierin beschrieben; einen solchen transformierten Wirtsorganismus, der ein Mikroorganismus ist – wobei vorzugsweise der Wirtsorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bakterien, Schimmelpilzen, Pilzen und Hefe, vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Pichia, Bacillus, Streptomyces, Escherichia, wie Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Escherichia coli; ein Verfahren zum Herstellen des Zuckers 1,5-D-Anhydrofructose, umfassend das Inkontaktbringen eines Alpha-1,4-glucans (z. B. Stärke) mit dem Enzym α-1,4-Glucanlyase, exprimiert durch einen transformierten Wirtsorganismus, welcher eine diese codie rende Nukleotidsequenz umfaßt, wobei vorzugsweise die Nukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist, wobei vorzugsweise die DNA-Sequenz eine der hier zuvor beschriebenen Sequenzen ist; einen Vektor, in welchen eine Nukleotidsequenz wie hier zuvor beschrieben aufgenommen ist, wobei vorzugsweise der Vektor ein Replikationsvektor ist, wobei vorzugsweise der Vektor ein Expressionsvektor ist, welcher die Nukleotidsequenz abstromig von einer Promotorsequenz enthält, wobei der Vektor vorzugsweise einen Marker (wie z. B. einen Resistenzmarker) enthält; zelluläre Organismen oder eine Zellinie, die mit einem solchen Vektor transformiert ist/sind; ein Verfahren zum Herstellen des Produkts α-1,4-Glucanlyase oder irgendeiner Nukleotidsequenz oder eines Teils davon, die bzw. der dieses codiert, wobei das Verfahren das Kultivieren eines solchen Organismus (oder von Zellen aus einer Zellinie), transfiziert mit einem solchen Vektor, und das Gewinnen des Produkts umfaßt.
Weitere Modifikationen der vorliegenden Erfindung liegen für Fachleute auf dem Gebiet auf der Hand, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pilz-α-1,4-Glucanlyase, welches umfaßt, daß man α-1,4-Glucanlyase aus einer Kultur eines Pilzes isoliert, die im wesentlichen frei von irgendwelchen anderen Organismen ist, wobei die α-1,4-Glucanlyase unter Verwendung eines Gels, welches durch das Enzym nicht abgebaut wird und wobei das Gel auf Cyclodextrin basiert, isoliert und/oder weiter gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gel auf Beta-Cyclodextrin basiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der Pilz Morchella costata oder Morchella vulgaris ist.
Isoliertes Pilz-α-1,4-Glucanlyaseenzym, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, wobei das Enzym aus einer Kultur eines Pilzes erhalten werden kann.
Nukleotidsequenz, die ein Pilz-α-1,4-Glucanlyaseenzym codiert, wobei die Sequenz eine DNA-Sequenz ist, welche eine Sequenz umfaßt, die die gleiche ist wie oder komplementär ist zu SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4.
Verfahren zur Herstellung des Enzyms α-1,4-Glucanlyase, welches das Exprimieren der Nukleotidsequenz nach Anspruch 5 umfaßt.
Nukleotidsequenz, die das α-1,4-Glucanlyaseenzym nach Anspruch 4 codieren kann.