JPH07504807A - プロテアーゼ安定性タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ安定性タンパク質 発明の分野 本発明は、タンパク質分解による破壊に対する安定性が改善されたタンパク質、 このタンパク質をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列を含む発現ベクター及 び細胞、タンパク質を産生ずる方法ならびに本発明の特定のクラスのタンパク質 を含有する洗浄剤添加剤及び組成物に関する。

発明の背景 規則的α−らせん及びβ−シートとは別に、タンパク質の二次的構造は、最も一 般的にはループと呼ばれる不規則な構造を含んでいることが発見されてきている 。このようなループ構造をより精確に規定しようとするいくつかの試みが発表さ れてきた。かくして、Ｊ。

Ｌｅｓｚｃｘｙｎｓｋｉ及びＧ、Ｄ、Ｒｏｓｅ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．１９ ８６．ｐ８４９−８５５は、自ら検査した６７種のタンパク質の大部分について ループを同定した。

これらのループは、セグメントの末端を合わせるため典型的にはｌ又は複数の逆 巻き−（ｅｖｅｒｓｅ　ｔｕｒｎｓ）を含むタンパク質分子の表面上に位置づけ された６〜１６個のアミノ酸残基の連続的セグメントとして特徴づけされる。Ｅ 、Ｊ、　Ｍｉ　Ｉｎｅｒ−Ｗｈｉ　ｔｅ及びＲ，Ｐｏｅｔ、　ＴｌＢ５１２，１ ９８７゜ｐ１８９−１９２は、異なるタイプのループ、まず第１にその水素結合 配置に従って４つの異なるクラスに分類され１個乃至８個の残基という長さをも ち得るβ−ターン又はヘヤビンの構造について記述している。Ｊ、Ｍ、Ｔｈｏｒ ｎｌｏｎｅｔａｌ、、ＢｉｏＥｓｓａｖｓ　８（２）、１９８８．ｐ６３−６８ は、規則的二次タンパク質構造を連結するセグメントとしてループを規定してい る。ループはしばしば結合及び認識部位を形成し１．相同でタンパク質の間での 何らかの可変性（例えば挿入、欠失又は配列変更）は典型的にループ構造にある 。Ｔｈｏｒｎｔｏｎ　ｅｌ　ａｌ、、に従うと、大部分のループは５個以下のア ミノ酸残基を有し、その多くが４個又は５個の残層を有する。

上述のように、さまざまなループ構造が典型的にタンパク質の表面上に存在して いる。従って、これらは、タンパク質の活性に対し通常不利な効果をもつプロテ アーゼ分解による分解を受けやすい。

タンパク質分解酵素による攻撃を受けにくいタンパク質を提供することが、本発 明の目的である。

発明の要約 本発明は、ｌ又は複数のプロテアーゼ不安定アミノ酸フラグメントがプロテアー ゼ非不安定アミノ酸セグメントによって置換されている、プロテアーゼ分解に対 する安定性が改善されたタンパク質に関する。

本書中、「アミノ酸セグメント」というのは、タンパク質分子内のいずれかの場 所にありうるものであって典型的にはタンパク質の規則的二次構造（すなわちα −らせん又はβ−シート）の一部を形成していない２つ、３つ、４つ、５つ又は それ以上のアミノ酸残基を典型的に含む連続的アミノ酸残基の一配列のことを言 う。このようなアミノ酸セグメントはしばしば、このような規則的構造を連結す るループ領域の中に見い出される。「プロテアーゼ不安定Ｊという語は、優先的 にタンパク質分解酵素による分解を受けるアミノ酸セグメントを示すために用い られ、一方「プロテアーゼ非不安定」という語はタンパク質分解酵素により一層 緩慢にしか分解されず又は全く分解されないアミノ酸セグメントを指して用いら れる。

本発明に従うと、いくつかのアミノ酸セグメントが、セグメント内に存在するア ミノ酸及び分子内のその他のアミノ酸とのその接触（例えば水素結合、ファンデ ルワールス接触及びイオン相互作用）のため、比較的タンパク質分解酵素により 分解されにくいことが発見された。さらに、１つのプロテアーゼの存在下で非不 安定であるセグメントがもう１つのプロテアーゼの存在下で不安定でありうるよ うな形で、異なるタンパク質分解酵素が異なるアミノ酸セグメントを優先的に攻 撃することが発見された。非不安定アミノ酸セグメントは、以下の方法で同定で きる。

特定のプロテアーゼに対し不安定である特定のタンパク質のアミノ酸セグメント は、より小さいペプチドフラグメントへのタンパク質の分割を提供するのに充分 な時間そのプロテアーゼを用いてタンパク質をインキュベートすることによって 同定される。タンパク質とプロテアーゼの各々の組合せは、同じ反応条件下で、 タンパク質分解による切断によって生成されたペプチドの同じパターン（いわゆ るペプチド地図）という結果をもたらす。タンパク質のプロテアーゼ分解の進行 は、インキュベーション時間を変化させることによって分析できる。インキュベ ーション時間が非常に短かく保たれた場合、タンパク質内の一次開裂部位は、Ｈ ＰＬＣによるペプチドフラグメントの分離の後のＮ末端アミノ酸配列決定により 同定されつる。

（Ｋ、Ｌ、５ｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、マイクロ配列決定のためのタンパク質及 びペプチド精製の実践指針、１９８９年中の「タンパク質の酵素消化及びＨＰＬ Ｃペプチド分離ｊを参照）。このような同定された一次開裂部位は、次に、コン ピュータグラフィックスを用いて解析することができ、ここで開裂部位はタンパ ク質の既知の３次元構造上でハイライトで示される。上述のように、このような 開裂部位は、タンパク質（少なくとも非タンパク質分解性タンパク質内で）の表 面上、特にループ領域内に位置づけられている。類似の条件下で試験した場合プ ロテアーゼに対して不安定でないと仮定されている同じ及びその他のタンパクｖ ｔ（プロテアーゼ自体を含む）上のアミノ酸セグメントは、適切なデータベース を探索することによりコンパイルされる。ループ領域からも同様に誘導されうる このような非不安定セグメントは、次に、タンパク質のコンピュータグラフィッ クモデルに適合され、適切な配列、三次元構造及びタンパク質内の周囲アミノ酸 残基との接触について評価される。置換アミノ酸セグメント内のアミノ酸残基と このセグメントが導入されたタンパク質配列の間の接触が最適でない場合、より 良い適合を確保するためセグメント内の１又は複数のアミノ酸残基を置換するこ とが可能である。

この明細書及びクレーム中、以下の略号が使用される：Ｖ＝Ｖａｌ　＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝Ｔｒｐ　＝　）リブトファン Ｍ＝Ｍｅｔ　＝メチオニン Ｇ＝Ｇ１ｙ＝グリシン ５＝Ｓｅｔ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝）レオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システィン Ｙ＝Ｔｙｒ　＝チロシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇ１ｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇ１ｕ＝グルタミン酸 Ｋ　＝　Ｌｙｓ　、＝リジン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン ）１＝Ｈｉｓ　＝ヒスチジン 本発明に従ったリパーゼ変異体を記述する上で、参照を容易にするため、以下の 命名法が用いられる： もとのアミノ酸（単複）；位置（単複）：置換されたアミノ酸（単複） この命名法に従って、例えば位置１６４におけるアラギンに対するチロシンの置 換は以下のように示される：　Ｙ１６４Ｒ例えばセグメントＹＰＲＱ　（配列番 号＝８）に対するアミノ酸２０９−２１２の置換といったアミノ酸セグメントの 置換は、次のとおりに示される：　５ｕｂｓｔ、　（２０９−２１２）ＹＰＲ５ 発明の詳細な開示 特に、プロテアーゼ非不安定アミノ酸セグメントは、リパーゼ又はプロテアーゼ 又は適当な非不安定アミノ酸セグメントが上述のとおり同定されているその他の あらゆるタンパク質から誘導することもできるし、或いは、上述の原則に従って 構築された合成セグメントであってもよい。

非不安定ループ配列が備わった本発明に従うタンパク質は、プロテアーゼが使用 される場合これとしばしば接触し、タンパク質分解による開裂による活性の損失 又は実質的低減を受けることになるあらゆるタンパク質であり得る。かくして、 このタンパク質は、酵素、特にしばしばプロテアーゼと共に用いられる洗浄剤酵 素であり得る。

このような酵素の例としてはアミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、キシ ラナーゼ及びプロテアーゼがある。特に、リパーゼはタンパク質分解による分解 を受けやすく、そのため洗浄剤組成物の中にリパーゼとプロテアーゼの両方を含 み入れることには問題があることが以前から認められていることから、この酵素 はリパーゼである可能性がある（例えばＷＯ３９１０４３６１及びＥＰ４０７２ ２５を参照のこと）。

親リパーゼは、膵臓、胃、肝臓又はリポタンパク質リパーゼといった哺乳動物の リパーゼのようなさまざまな供給源から誘導することができるが、一般に好まし くは微生物リパーゼである。従って、親ゼの中から選択できる。

本発明のリパーゼタンパク質の好ましい態様においては、親すパ産生されたリパ ーゼである（ＥＰ２５８０６８参照）。この態様においては、置換すべきプロテ アーゼ不安定アミノ酸セグメントは、好ましくは、リパーゼ分子の位置２０９〜 ２１２のＲＥＦＧ　（配列番号：１）、リパーゼ分子の位置１６２〜１６５のＤ ＹＧＮ　（配列番号：２）又はリパーゼ分子の位置２３９〜２４２のＥＧＩＤ　 （配列番号：３）である。

特に、セグメントＲＥＦＧは、ＧＡＳＧ　（配列番号：　４　）　、ＧＡＡＧ　 （配列番号−５）　、ＧＡＲＧ　（配列番号：　６）　、ＹＰＧＳ　（配列番号 ：　７）　、ＹＰＲ３（配列番号：　８　’）　、ＨＮＲＧ　（配列番号：　９ 　）　、ＹＴＧＮ　（配列番号：ｌＯ）、ｌ５ＳＥ　（配列番号：　１１）　、 ＮＮＡＧ　（配列番号：　１２）　、５ＦＩＮ　（配列番号：１３）　、ＤＱＮ Ｇ　（配列番号：　１４）　、ＡＳＦＳ　（配列番号：　１５）　、５ＲＧＶ　 （配列番号：　１６）　、ＬＤＴＧ　（配列番号：　１７）　、ＹＹＡＡ　（配 列番号：　１Ｂ）　、ＩＮＤＩ（配列番号：　１９）　、ＷＹＦＱ　（配列番号 ：２０）、及び５ＩＥＮ　（配列番号：２１）から成るグループの中から選ばれ たセグメントによって置換されうる；セグメントＤＹＧＮ　（配列番号＝２）は 、ＧＳＴＹ　（配列番号＝２２）、ＤＳＴＮ　（配列番号：　２３）　、ＰＤＬ Ｒ（配列番号：　２４）　、ＬＤＴＧ、　（配列番号；２５）　、ＧＮＲＹ　（ 配列番号：　２６）　、ＳＧＶＭ　（配列番、号＋　２７）　、ＲＹＰＳ　（配 列番号：　２８）　、ＮＧＬＶ　（配列番号＋　２９）　、５ＦＳＩ　（配列番 号：　３０）　、ＬＧＳＰ（配列番号：　２８）、ＮＧＬＶ　（配列番号：　２ ９）　、５ＦＳＩ　＜配列番号二２７）、ＲＹＰＳ　（配列番号＋　２８）　、 ＮＧＬＶ　（配列番号：　２９）　、　５ＦＳＩ　（配列番号。

３０）　、ＬＧＳＰ　（配列番号：　３１）　、ＲＡＳＦ　（配列番号：　３２ ）　、ＶＰＷＧ　（配列番号：　３３）　、ＰＤＬＮ　（配列番号：　３４）　 、５ＦＶＰ（配列番号：　３５）　、ＰＤＹＲ（配列番号＋　３６）　、ＰＲＬ Ｐ　（配列番号＋　３７）　、’ｒＶＬＰ　（配列番号：３８）、ＩＧＴＣ（配 列番号−３９）　、ＴＧＧＴ　（配列番号：　４０）　、ＴＮＫＬ　（配列番号 ：４１）及びＶＧＤＶ　（配列番号：４２）から成るグループの中から選ばれた セグメントにより置換されうる；及びセグメントＥＧＩＤ（配列番号：３）は、 ＋ＧＶＬ　（配列番号：　４３）　、ＧＳＴＹ　（配列番号：　４４）　、ＲＹ ＡＮ　（配列番号＋　４５）　、　ＰＮＩＰ　（配列番号；４６）及びＴＬＶＰ 　（配列番号：４７）から成るグループの中から選ばれたセグメントによって置 換されうる。

プロテアーゼ非不安定アミノ酸セグメントを産生ずるための他手順により、セグ メン）ＲＥＦＧ（配列番号：Ｉ）又はＤＹＧＮ　（配列番号：２）内の１又は複 数のアミノ酸残基をリパーゼのプロテアーゼ不安定性を低くすることのできるあ らゆるアミノ酸残基により置換することができる。このようなアミノ酸残基の例 としてはプロリン及びアルギニンがある。特にＡｒｇ２Ｑ９．　Ｇｌｕ２１０． 　Ｐｈｅ２１Ｌ又はＧ１ｙ２Ｌ２はＰｒ。

又はＡｒｇによって置換でき、そして／又はＡｓｎ１６５．　Ｔｙｒ１６３、Ｇ Ｉｙ１６４又はＡｓｎ１６５はＰｒｏ又はＡｒｇで置換することができる。

もう１つの態様におい、では、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮ Ａ配列を含むＤＮＡ構成体に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は 、例えば、まず最初に適切なｃＤＮＡ又はゲノミックライブラリを確立しタンパ ク質の全部の又は一部のアミノ酸配列をベースにして合成されたオリゴヌクレオ チドプローブに対するハイブリッド形成といった従来の手順によって陽性クロー ンについてスクリーニングすることによって単離できる。このとき、例えば、周 知の手順に従って望まれるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを 用いた部位特異的突然変異誘発により、このタンパク質をコードするゲノミック 又はｃＤＮＡ配列を、置換アミノ酸セグメントを導入したい部位に対応する部位 で修正することが可能である。

あるいは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、Ｓ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇ ｅ及びＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ　ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　（テトラヘドロン通信）２２゜１９８１．ｐｐ　１８５ｆ）−１８６９によ って記述されているホスフォアミダイト方法、又はＭａｔｔｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、３　１９８４．ｐｐ　８０１〜８０５により記述さ れている方法といった立証済みの標準的方法により合成的に調製することも可能 である。ホスフォアミダイト方法に従うと、オリゴヌクレオチドは、例えば自動 式ＤＮＡ合成機の中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベ クター中でクローニングされる。

最後に、ＤＮＡ配列は、標準的な技術によりＤＮＡ構成体全体のさまざまな部分 に対応する合成、ゲノミック又はｃＤＮＡ由来の（該当するように）フラグメン トを連結することによって調製された、ゲノミック及び合成の混合、合成とｃＤ ＮＡの混合又はゲノミックとｃＤＮＡの混合に由来するものでありうる。ＤＮＡ 構成体は、例えばＵＳ４．６８３．２０２又はＲ，に、５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ 、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８８．ｐｐ　４８７−４９１内に記述され ているように特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によっても調製す ることができる。

本発明に従うと、上述の方法又は当該技術分野において既知のあらゆる方法によ り生成されたＤＮＡ配列を、典型的にはプロモーター、オペレーター、リポソー ム結合部位、翻訳開始シグナル、そして任意には抑制遺伝子又はさまざまな活性 化遺伝子をコードする制御配列を含む組換え型発現ベクターの中に挿入すること が可能である。

発現されたタンパク質の分泌を可能にするため、タンパク質コード配列に先立っ て「シグナル配列」を挿入することが可能である。制御配列の指揮下での発現の ためには、本発明に従って処理すべき標的遺伝子が、適切なリーディングフレー ム内で制御配列に対し用可能に結合される。プラスミドベクター内に含まれ得し かも突然変異体タンパク質遺伝子の転写を支持することのできるプロモーター配 列としては、原核生物β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒ ｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９７８．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、　７５；３７２７−３V３１） 及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３．Ｐｒｏｃ　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８０．２ｌ−２５）が含まれるが、これらに制限されるわけではな い。

さらなる参考文献はＳｃｉ’ｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９Ｂ０．２ ４２　ニア４−９４中の「組換え型細菌からの有用なタンパク質」の中にも見い 出すことができる。

当該タンパク質の産生のために用いられる宿主細胞は、昆虫細胞などの高等真核 細胞又は、酵母や糸状菌を含む細菌又は真菌といった原核又は真核微生物であり うる。

適切な酵母細胞の例としては、サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）などのサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ又は ハンゼヌラ・ポリモルフｙ　（ｌ（ａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ） などのハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ　ｌａ）属又はピヒア・パストリス（Ｐｉｃ ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）からのメチロトロー フ酵母の細胞が含まれる。適切な細菌細胞の例としてはバチルス・ズブチリス（ し５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス・リケニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ ｒｍｉｓ）又はバチルス・レングス（Ｂ、１ｅｎｔｕｓ）の細胞といったバチル ス１つの態様に従うと、宿主細胞はＤＮＡ配列を担持する発現ベクターによって 形質転換される。発現がＢ、ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）といった分泌 性微生物の中で行なわれる場合、シグナル配列が翻訳開始シグナルの後そして問 題のＤＮＡ配列の前にあり得る。このシグナル配列は発現産物を細胞壁まで輸送 するように作用し、この細胞壁において分泌時点で産物から開裂される。上述の ような「制御配列」という語は、シグナル配列が存在する場合それを含むものと されている。

本発明のタンパク質を産生ずる現在好ましい方法においては、宿主生物として糸 状菌類が用いられる。糸状菌類の宿主生物は、有利組換え型タンパク質を生産す るための宿主としてこれまで用いられてきたものであってよい。組換え型タンパ ク質の生産におけるＡ。

オリゼー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）の使用については、例えばＥＰ２３８．０２３の 中で広範に記述されている。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）内でのタンパク質の発現のためには 、タンパク質変異体をコードするＤＮＡ配列の前に１つのプロモーターがくる。

このプロモーターはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）内で強い転写活 性を示すあらゆるＤＮＡ配列であってよく、又アミラーゼ、グルコアミラーゼ、 プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素といった細胞外又は細胞内タ ンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる。

ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ　（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ ｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ、ニが−（Ａ、ｎｉｇｅｒ）中性 α−アミラーゼ、Ａ、ニガー（醇　ｎｉｇｅｒ）酸性安定α−アミラーゼ、Ａ。

ルカリ性プロテアーゼ又はＡ、オリゼー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）　トリオースリン 酸イソメラーゼをコードする遺伝子から誘導されたものがある。

特に宿主生体がＡ、オリゼー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）である場合、本発明の方法に おいて用いるための好ましいプロモーターは、Ａ、オリゼゼプロモーターの配列 は、ＥＰ２３８０２３を見ればわかる。

ターミネーション及びポリアゾニレ−ジョン配列は、適切にもプロモーターと同 じ供給源から誘導されつる。

真菌宿主細胞を形質転換するために用いられる技術は、適切にはＥＰ２３８０２ ３に記されているものでありうる。

宿主細胞からのタンパク質の分泌を確保するために、タンノ（り質をコードする ＤＮＡ配列の前には、天然のシグナル配列又はその機能的部分又は細胞からのタ ンパク質の分泌を提供する合成配列でありうる１つのシグナル配列があり得る。

特に、シグナル配列は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　ｓｐ、ア ミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ（ Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）リパーゼ又はプロテアーゼをコードする 遺伝子又はフミコーラ（）ｌｕｍｉｃｏｌａ）セルラーゼ、キシラナーゼ又はリ パーゼをコードする遺伝子から誘導されつる。このシグナル配列は好ましくはＡ 、オリゼー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）　ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ、ニガー（Ａ、ｎｉ ｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ、ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ）酸性安定α−アミ ラーゼ又はＡ、ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼをコードする遺伝子 から誘導される。

形質転換された宿主細胞を培養するのに使用される培地は、アスペルギルス（Ａ ｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）細胞を成長させるのに適した従来のあらゆる培地であ ってよい。形質転換体は通常安定しており、選択圧の無い状態で培養可能である 。しかしながら、形質転換体が不安定であるということがわかっている場合、選 択のために、細胞内に導入される選択標識を使用することができる。

宿主細胞から分泌された成熟タンパク質は、遠心分離又は濾過による培地からの 細胞の分離及び硫酸アンモニウムといった塩を用いた培地のタンパク様成分の沈 降を含む周知の手順、及びそれに続くイオン交換クロマトグラフィ、アフィニテ ィクロマトグラフイなどといったクロマトグラフィ手順により、有利に培地から 回収されうる。

本発明はまた、本発明に従ったリパーゼタンパク質及び、好ましくは粉化しない 顆粒状の、安定化した液体の又は防御された酵素の形をしたプロテアーゼを含む 洗浄剤添加剤にも関する。粉化しない顆粒は、例えば米国特許４．１０６．９９ １及び４．６６１．４５２（共にＮｏｖ。

Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓに対するもの）に従って生成することができ、又任意 には当該技術分野において既知の方法によってコーティングすることもできる。

液体酵素調製物は例えば、立証された方法に従ってプロピレングリコールといっ た多価アルコール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を付加することによって 安定化することができる。その他の酵素安定剤は、当該技術分野において周知の ものである。防御された酵素は、［！Ｐ２３８２１６内で開示されている方法に 従って調製することができる。

洗浄剤添加剤は、適切には、添加剤１グラムあたり０，０２〜２００■の酵素タ ンパク質を含有しつる。洗浄剤添加剤にはさらに、従来洗浄剤添加剤の中に含ま れてきたセルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はアミラーゼといったｌ又は複数のそ の他の酵素が含まれうるということがわかるだろう。

さらにもう１つの態様において、本発明は、本発明のリパーゼタンパク質及びプ ロテアーゼを含む洗浄剤組成物にも関する。本発明の洗浄剤組成物は付加的には 、陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、両向性又は両性イオンタイプのもので ありうる界面活性剤ならびにこれらの界面活性剤クラスの混合物を含む。適切な 界面活性剤の標準的な例としては、線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩（ＬＡ Ｓ）　、アルファオレフィンスルフォン酸塩（ＡＯＳ）、エトキシアルコール硫 酸塩（ＡＥＯＳ）　、アルコールエトオキシ酸塩（ＡＥＯ）、アルキル硫酸塩（ ＡＳ）　、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩 がある。

本発明の洗浄剤組成物は、例えばビルグー、漂白剤、漂白剤活性化剤、防腐剤、 沈殿防止剤、土砂再沈着防止剤、香料、酵素安定化剤などといった当該技術分野 において既知のその他の洗浄剤成分を含むことができる。

本発明の洗浄剤組成物は、例えば粉末又は液体としてといったように、便利なあ らゆる形態で調剤可能である。酵素は、上述のように酵素安定化剤を含有させる ことによって液体洗浄剤の中で安定化されつる。通常、本発明の洗浄剤組成物の 溶液のｐＨは７〜１２で、場合によっては７．０〜ｌ０１５である。本発明の洗 浄剤組成物には、上述のように別々に又は組合せた添加剤の形で、セルラーゼ、 ペルオキシダーゼ又はアミラーゼといったその他の洗浄剤酵素を含めることがで きる。

図面の簡単な説明 本発明について以下で添付図面を参照して記述する。なお図面中、図１はプラス ミドｐＡＯ１の制限地図を示す：図２はプラスミドｐＡＨＬの制限地図を示す： 図３はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるリパーゼ変異体をコードするプラ スミドの調製を、概略的に示す。

図４は、ＰＣＨによる３段階突然変異誘発を概略的に示す。

図５は、野生型Ｈ，ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼのものと比較した本発明の変 異体リパーゼのプロテアーゼ安定性を示す。

本発明はさらに、請求されている本発明の範囲をいかなる形であれ制限する意図 をもたない以下の例において、説明される。

方法 中でのその発現及び特徴づけは、欧州特許第３０５２１６号中に記述されている 。発現プラスミドはｐ９６０と名付けられた。

本出願中で使用される発現プラスミドは、リパーゼコーディング領域に対しちょ うど３′のところでのわずかな修正を除いて、ｐ９６０と同一である。修正は、 以下の要領で行なった：すなわち、Ｎｒｕ　Ｉ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて ｐ９６０を消化した。これら２つの部位の間で、フレノウポリメラーゼでＮｈｅ 　Ｉフラグメントがフィル−インされているプラスミドｐＢＲ３２２からのＢａ ｍＨＩ　／　Ｎｈｅ　Ｉフラグメントをクローニングし、かくして非反復Ｂａｍ ＨＩ及びＮｈｅ　１部位を含むプラスミドｐＡＯ１（図１）が生成された。これ らの非反復部位の間で、ｐ９６０からのＢａｍ）Ｉ　Ｉ　／　Ｘｂａ　Ｉフラグ メントをクローニングしてｐＡＨＬを得た（図２）。

リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発リパーゼ遺伝子内に突然変 異を導入するために用いられるアプローチは、Ｎｅ１ｓｏｎ　＆　Ｌｏｎｇ、Ａ ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（分析生化学）１８０゜１４７ 〜１５１（１９８９）により記述されている。これには、ＰＣＲ反応におけるプ ライマーの１つとして化学合成したＤＮＡ鎖を用いることにより導入された望ま しい突然変異を含むＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの３段階生成 が関与する。ＰＣＲで生成されたフラグメントから、制限酵素での分割により、 突然変異を支持するＤＮＡフラグメントを分離させ、これを発現プラスミド内に 再度挿入することができる。この方法は、例１に徹底的に記述されている。図３ 及び図４では、この方法についてさらに説明されている。

アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の形質転 換（一般手順） Ａ、オリゼー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）の胞子を用いて１００−のＹＰＤ（Ｓｈｅｒ ｍａｎｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 （酵母遺伝学における諸方法）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）を接種し、約２４時間振とうさせながらインキ ュベートした。ミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通してのろ過により菌糸を 収穫し０．６ＭのＭｇＳＯ４で洗浄した。菌糸を、１５ｄの１．２ＭのＭｇ５Ｏ ＋　、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ５、ｐＨ５，８の中で懸濁させた。

懸濁液を氷上で冷却し、１２０．のＮｏｖｏｚｙｍ■２３４、パッチ１６８７を 含むｌ−の緩衝液を付加した。５分後、１２ｍｇ／−のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　Ｈ ２Ｓ型）をｌ−付加し、多数のプロトプラストが顕微鏡下で検査した試料の中に 見えるようになるまで、３７℃で１．５〜２．５時間、穏やかに撹拌しながらイ ンキュベーションを続行した。

ミラクロスを通して懸濁液をろ過し、ろ液を無菌試験管内に移し、５−の０．６ Ｍソルビトール、　１００１Ｍトリス−ＨＣｌ！、ｐＨ７，０を上に置いた。１ ０００ｇで１５分間遠心分離を行ない、Ｍｇ５Ｏ＋クッションの頂部から原形質 体を収集した。プロトプラスト懸濁液に対して２体積のＳＴＣ（１，２Ｍのソル ビトール、１０＋ｎＭのトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５，１０ｍＭのＣａＣｆｚ） を付加し、混合物を１０００　ｇで５分間遠心分離した。原形質体ペレットを３ −のＳＴＣ内で再度懸濁させ再びペレット化させた。

この段階をくり返し行なった。最終的に、プロトプラストを０．２〜１−のＳＴ Ｃ内で再度懸濁させた。

ｌＯμｌののＳＴＣ中で５〜２５μｇのｐ３ＳＲ２（Ｈｙｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｍｏ１．ａｎｄＣｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　、第３巻、ｋ　８　、１４３０−１４ ３９．１９８３年８月内で記述されたプラスミドを支持するＡ、ニドランス（Ａ 、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　ａｍｄＳ遺伝子）と１００μｌのプロ・ドプラスト懸濁 液を混合した。２５分間、室温で混合物を放置した。０．２２の６０％のＰＥＧ 　４０００　（ＢＤＨ２９５７６）、１０ｍＭのＣａＣ１ｔ及び１０ｍＭのトリ ス−ＨＣｌ５ｐ）１７．５を付加し、入念に混合しく２度）、最終的に０．８艷 の同じ溶液を付加して入念に混合した。

２５分間混合物を室温で放置し、１５分間２５００　ｇで回転させ、ペレットを ２−の１．２Ｍソルビトール内で再度懸濁させた。もう１回の沈降の後、１．０ Ｍのスクロース、ｐＨ＝７．０．窒素供給源としての１０ｍＭのアセトアミド及 びバックグラウンド成長を阻害するための２０ｍＭのＣｓＣｌを含む最小プレー ト（Ｃｏｖｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１１３（１ ９６６）５１−５６）上に、原形質体を伸展させた。３７℃で４〜７日間インキ ュベートした後、胞子を採収し、無菌水の中に懸濁させ、単一コロニーとして展 伸させた。この手順を反復し、第２の再分離の後半−コロニーの胞子を規定のプ ロトプラストとして保管した。

実施例 例！ フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｎ＋１ｃｏｌａ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパ ーゼの５ｕｂｓｔ、　（亜株）　（２０９−２１２）ＧＡＳＧ変異体を発現する プラスミドの構築ｍＭのジチオトレイトール、ｌμｇのプラスミド及び２単位の ５ｐｈＩという反応混合物５０μｌ中の制限酵素ｓｐｈ　Ｉを用いて、円形プラ スミドｐＡＨＬを線状化した。３７℃で２時間消化を行なった。フェノール（ト リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５で平衡化されたもの）で反応混合物を抽出し、氷温の ９６％のエタノール２体積を加えることによって沈殿させた。遠心分離及びペレ ット乾燥の後、線状化ＤＮＡと５０ｕｌの）ＩｚＯの中で溶解させ、アガロース ゲル上で濃度を評価した。

３段階ＰＣＲ突然変異誘発 図５で示されているように、３段階突然変異誘発には、次の４つのプライマーの 使用が関与している：すなわち、突然変異誘発プライマー（＝Ａ）　：　５　’ 　−ＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴ−ＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡ ＡＣＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＴＡＧＧ−３’　（配列番号 ＝４８）。

ＰＣＲヘルパー１　（＝Ｂ）　：　５　’　−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴ ＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡ−ＴＴＡＡＡＴＣＧＧＣ−３’　（配列番号＝ ４９）。

ＰＣＲヘルパー２　（＝Ｃ）　：　５　’　−ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧ ＴＧＴＣＴ〜３′　（配列番号：５０）。

ＰＣＲハンドル（＝Ｄ）　：　５　’　−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣ−３’　（配列番号＝５１）。

ヘルパー１及びヘルパー２は、コーディング領域の外側の配列に対し相補的であ り、かくして突然変異体配列の構築においてあらゆる突然変異誘発プライマーと 組合わせて使用可能である。

３６の段階は全て、ｌ　ＯｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，５０ｍＭのＫＣ ｌ、１、５ｍＭのＭｇＣ１ｘ、　０．００１％のゼラチン、　０．２＋ｎＭのｄ ＡＴＰ、０．２＋ｎＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのＴＴＰ 、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含む緩衝液の中で行なわれた。

段階１においては、合計１００μｌの反応混合物となるまで、１００ｐＩ１１０ １のブライ７−Ａ、１０１００ｐ＋のプライマーＢ及び１　ｆｍｏｌの線状化さ れたプラスミドを付加し、９５℃で２分、３７℃で２分、７２℃で３分から成る １５サイクルを行なった。

ＰＣＲ産物の濃度をアガロースゲル上で評価した。次に第２段階を行なった。０ ．６ｐｍｏ　ｌの第１段階の産物及び１　ｆｍｏｌの線状化されたプラスミドを 、前述の緩衝液合計１００μｌの中に含み入れ、９５℃で５分、３７℃で２分そ して７２℃で１０分から成るｌサイクルを行なった。

第２段階の反応混合物に対して、１００１００ｐのプライマー〇及び１０１００ ｐ＋のブライｖ−Ｄを付加しく各々ｌμｆ）、９５℃で２分、３７℃で２分、７ ２℃で３分から成る２０サイクルを行なった。この操作が、突然変異誘発手順に おいて段階３を構成していた。

突然変異を受けた制限フラグメントの単離段階３からの産物をアガロースゲルか ら分離し、２０μｌのＨ２Ｏの中で再度溶解させた。その後、これを、１００＋ ｎＭのＮａＣ１，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，９，１０ｍＭのＭｇＣ１ ２、ｌ　ｍＭのＤＴＴ　、　１０単位のＢａｍ１Ｉ及びｌＯ単位のＢｓｔＸＩの 組成をもつ合計体積５０μｌの中で、制限酵素Ｂａｍ）ｌ　Ｉ及びＢｓｔＸＩを 用いて消化させた。３７℃で２時間インキュベーションを行なった。７３３ｂｐ のＢａｍＨＩ　／　Ｂｓ　ｔＸ　Ｉフラグメントをアガロースゲルから単離させ た。

分割させ、アガロースゲルから大きいフラグメントを分離させた。

このベクターに対して、以上で分離した突然変異を受けたフラグメントを連結さ せ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換するのに連結反応混合を用いた。制限酵 素を用いての形質転換体からのプラスミド調製物の分割によりフラグメントの存 在及び方向性を確認した。Ｓａｎｇａｒによって開発されたチェインターミネー タ法を用いて２本鎖プラスミド上で配列分析を行なった。プラスミドはｐＡＨＬ Ｓ（２０９−２１２）ＧＡＳＧと名付けられ、置換されたコドン以外、ｐＡＨＬ と同一である。

例２ フミコーラ（１−１ｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼのその他の変異体を発現するプラ スミドの構築 例１に記されているものと同じ方法を用いて、以下の突然変異体を構築した： フラグメントＹＰＲ３でアミノ酸残基２０９−２１２を置換することによる、５ ｕｂｓｔ１２０９−２１２）ＹＰＲ３；フラグメントＰＲＬＰでアミノ酸残基１ ６２−１６５を置換することによる、５ｕｂｓｔ、（１６２−１６５）ＰＲＬＰ 　；アルギニン（Ｒ）残基で位置１６４にてチロシン（Ｙ）残基を置換すること による、Ｙ１６４Ｒ。

アルギニン（Ｒ）残基で位置２１２にてグリシン（Ｇ）残基を置換することによ る、Ｇ２１２Ｒ。

プロリン（Ｐ）残基で位置２１２にてグリシン（Ｇ）残基を置換することによる 、０２１２Ｐ　、及び アルギニン（Ｒ）残基で位置２１０のグルタミン酸（Ｅ）残基を置換することに よる、Ｅ２１０Ｒ。

プラスミド名（ｐＡ）ＩＬとそれに続く上述の突然変異名）及び修正に用いられ たプライマーを、以下にリストアツブする。

プラスミド名　プライマーＡ配列 ｐＡＨＬｓ（２０９−２１２）ＹＰＲ５５’−ＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣ ＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡ−ＡＧＡＴＣＴＴＧＧＧＴＡＣＧＧＣＧ ＧＧＡＧＴＣＴＡＧＧ−３’　（配列番号＝５２） ｐＡＨＬＳ（１６２−１６５）ＰＲＬＰ　５’−ＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧＴＣＧＡ ＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＣＧ−ＣＡＧＧＴＣＴＧＣ−３’　（配列 番号：５３）ｐＡＨＬＹ１６４Ｒ５’　−ＣＡＣＧＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＣ ＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号＝５４） ｐＡｌｌＬＧ２１２Ｒ５’　−ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＡＴＴＣＧＣ ＧＣＧ−３’（配列番号：５５） ｐＡＨＬＧ２１２Ｐ　５’　−ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＣ ＧＣＧ−３’（配列番号＝５６） ＰＡＨＬＥ２１０Ｒ５’　−ＧＴＡＡＣＣＧＡＡＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧ− ３’（配列番号：５７） 例３ Ａ、　ｏｒｙｚａｅ内のリパーゼ変異体の発現上述のプラスミドを上記方法の項 で示した形質転換手順に記されているようにＡ、ニドランス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａ ｎｓ）からのａｍｄｓ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２を用いた同時形質転換により、Ａ 、　ｏｒｙｚａｅ　ＩＦＯ４１７７に形質転換した。上述のように調製した原形 質体を、同量の発現プラスミドと９３ＳＲ２の混合物を用いてインキュベートし 、各々約５μｇずつを使用した。唯一の窒素供給源としてアセトアミドを使用で きた形質転換体を２回再分離した。３日間ＹＰＤで成長させた後、以下に記述す るリパーゼ活性についての検定を用いて培養上清を分析した。

さらに研究するための最高の形質転換体を選択し、３０℃で４日間２００−のＦ Ｇ４培地（３％の粗びき大豆粉、３％のマルトデキストリン、１％のペプトン、 ｐＨは４ＭのＮａｐ）（で７．０に調整）上でｌｊ’入り振とうフラスコ内でこ れを成長させた。

例４ 本発明のリパーゼ変異体の精製 リパーゼ活性についての検定 リパーゼのための基質は、乳化剤としてアラビアゴムを用いてグリセリントリブ チラード（ＭＥＲＣＫ）を乳化することによって調製した。

ｐＨ−スタット方法を用いてリパーゼ活性をｐＨ７で検定した。リパーゼ活性１ 単位（ＬＵ／■）は、１分あたりに１マイクロモルの脂肪酸を遊離させるのに必 要とされる量として定義づけされた。

段階ｌニー発酵上清を遠心分離し、沈殿物を廃棄する。上清のｐＨを７に調整し 、同量の低ａ９６％エタノールを漸進的に付加する。水浴の中で３０分間混合物 を放置する。沈殿物を遠心分離し廃棄する。

段階２ニーイオン交換クロマトグラフイ。上清をろ過し、５０ｍＭのトリス−酢 酸緩衝液ｐＨ７で均衡化したＤＥＡＥ−ファスト・フロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　ＴＭ）カラム上に適用する。２８０ｎｍでの吸収が０．０５００より低くなる まで同じ緩衝液でカラムを洗浄する。５力ラム体積を用いて同じ緩衝液（０〜０ ．５ＭのＮａＣｌ　）内で線形塩勾配にて結合した酵素活性を溶離させる。酵素 活性を含む分画をプールする。

段階３；−疎水性クロマトグラフィー、固体酢酸アンモニウムを付加することに より、酵素活性を含むプールのモル濃度を０．８Ｍに調整する。０．８Ｍの酢酸 アンモニウムで予め均衡化されたＴＳＫゲルブチル−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５ ０　Ｃカラム（日本の東ソー株式会社から入手可能）上に酵素を適用する。未結 合の材料を０．８Ｍの酢酸アンモニウムで洗浄し、精製水を用いて結合した材料 を溶離させる。

段階４ニーリパーゼ活性を含むプールを水で希釈して、伝導度を２ｍｓにｐＨを ７に調製する。５０ｍＭのトリス−酢酸緩衝液ｐＨ７で予め平衡化された高性能 Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に、プールを適用する。結合し た酵素を直線塩勾配で溶離させる。

例５ 変異体タンパク質のプロテアーゼ安定性上記例４で記述したように、変異体リパ ーゼ５ｕｂｓｔ、　（亜株Ｘ１６２−１６５）ＰＲＬＰ、　５ｕｂｓｔ、（２０ ９−２１２）ＹＰＲ５，５ｕｂｓｔ、（２０９−２１２）ＧＡＳＧ、　Ｇ２１２ Ｒ及びＧ２１２Ｐを精製し、各々０．１Ｍのトリス−ｐｕｆｆｅｒ　ｃ　ｂｕｆ ｆｅｒ緩衝液の誤り？）ｐＨ９，０を用いて希釈する。その後リパーゼ対プロテ アーゼが１対５である割合で、５ａｖｌｎａｓｅ”　（５０％のモノプロピレン グリコール（ＭＰＧ）、１％の硼酸中１００■／−）を含むプロテアーゼ溶液を 付加した。２２℃で反応を行なった。適切な時点で、反応混合物からプローブを 取り出し直ちに上述のリパーゼ活性検定に付した。

図５では、出発材料のパーセントで表わした残留活性が、野生型Ｈｕｍｆｃｏｌ ａ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ（ｗｔ）及び変異体リパーゼについて、イン キュベーション時間との関係において示されている。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）名称：ノボ　ノルディスク　Ａ／５（Ｂ）町名：ノボ　アレ （Ｃ）市：バグスバエルト （Ｅ）国：チンマーク （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＤＫ−２８８０（Ｇ）電話：　＋４５４４４４ ８８８８（Ｈ）テレファックス：　＋４５４４４９３２５６（Ｉ）テレックス： 　３７３０４ （ｉｉ）発明の名称ニブロチアーゼ安定性タンパク質（ｉｉｉ）配列の数＝５７ （ｉｖ　）コンピューターリーダプルホーム：（Ａ）記録媒体：フロッピーディ スク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンバーティブル（Ｃ）オペレーティン グシステム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｐａｔｅ ｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｒｅ　＃１．０Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ＥＰＯ） （ｖｉ　）先の出願日 （Ａ）出願番号：　ＷＯＰＣＴ／ＤＫ９１１００３５０（Ｂ）出願日：　１９９ １年１１月２６日（２）配列番号：ｌの情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：ｌ： Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ （２）配列番号：２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型二ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ （２）配列番号＝３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル二Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓｐ （２）配列番号＝４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：ＮＯ （■）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝４： Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ ■ （２）配列番号：５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー；鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇａｙ ■ （２）配列番号＝６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （■）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ （２）配列番号ニアの情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝７： Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ （２）配列番号＝８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号；１２：Ａｓｎ　Ａｓｎ＾Ｉａ　Ｇｌｙ （２）配列番号：１３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｌ）配列の記載：配列番号：１３：Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ａｓｎ （２）配列番号＝１４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載二配列番号：１４：Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ （２）配列番号＝１５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｎ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型；内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１５：Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ （２）配列番号：１６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１６＝Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ （２）配列番号＝１７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド　。

（ｉｉ）ハイホセテイカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１７：Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ （２）配列番号：１８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティ力ルーＮ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （Ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８：Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ （２）配列番号＝１９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセテ、イカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （Ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９：ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ｌｉｅ （２）配列番号＝２０の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル；Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２ｏ：Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ ■ （２）配列番号：　２１（７７情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１：Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ ■ （２）配列番号：２２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル二Ｎ。

（ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２２：Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ ■ （２）配列番号：２３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２３：Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ （２）配列番号：２４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２８：Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ （２）配列番号：２９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２９：Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ ■ （２）配列番号：３０の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｌ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３０：Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ （２）配列番号：３１の情報 （ｉ）配列の特徴二 （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３１：Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号：３２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル二Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３２＝Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ ■ （２）配列番号：３３の情報 （ｉ）配列の特徴； （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３３：Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ （２）配列番号＝３４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：ＮＯ （伍）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３４：Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ ■ （２）配列番号：３５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ一、４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （Ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３５：Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

！ （２）配列番号＝３６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３６：Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ （２）配列番号コ３７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ　）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：ＮＯ （ｍ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３７：Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

（２）配列番号：３８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｊ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：ＮＯ （市）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 ／ｖｉ）＋９′Ｅｌｌ／Ａｔｐ針−？Ｓｒ’万１１釆会・ＡＯ・（ｘｉ）配列の 記載：配列番号＝３８：Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

（２）配列番号：３９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ一４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）８４の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３９：１１ｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ （２）配列番号＝４０の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型；ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティカル；Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝４２：（ｘｌ）　ｌクリジノ６Ｃ早入　：　口 乙クリを下テ　、　ｑυ　。

Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４４：Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ （２）配列番号：４５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイホセティヵル：Ｎ。

（ｉｉ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４５：Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ ■ （２）配列番号：４６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティヵル：Ｎ。

（伍）アンチセンス＝Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝４６：Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｒｌｅ　Ｐｒ。

（２）配列番号＝４７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｎ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４７：Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

（２）配列番号：４８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス；Ｎｏ （Ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４８：ＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧ　ＴＡＣＴＣＴＧ ＧＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴ　ＧＴＡＡＣＣＡＧＡＡ　ＧＣＡＣＣＣＧＧＣＧＧ ＧＡＧＴＣＴＡＧＧ　６０ （２）配列番号：４９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）ハイホセティカル：ＮＯ （市）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝４９：ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧ　ＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡ　ＴＴＡＡＡＴＣＧＧＣ４０（２）配列番号：５０ の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （■）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （χ１）配列の記載：配列番号：５０：ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴ　ＣＡＣＧＧＴＧ ＴＣＴ　２０（２）配列番号＝５１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）ハイホセティカル＝ＮＯ （ｉｉｉ）アンチセンス＋Ｎ０ （Ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５１：ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧ　ＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣ２０（２）配列番号：５２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｎ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５２：ＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧ　ＴＡＣＴＣＴＧ ＧＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴ　ＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴ　ＧＧＧＴＡＣＧＧＣＧＧ ＧＡＧＴＣＴＡＧＧ　６０ （２）配列番号：５３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー；鎖状 （１ｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５３：ＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧ　ＴＣＧＡＴＴＧ ＧＣ八　ＡＴＣＴＴＧＧＴＣＣへＣＧＣへＧＧＴＣＴ　ＧＣ４２（２）配列番号 ＝５４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （市）ハイホセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５４：ＣＡＣＧＴＣＧＡＴＡ　ＴＣＧＣＧＡＣ ＣＡＴ　ＴＴＣＣＡＣＧ　２７（２）配列番号：５５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ一６０塩基対 （Ｂ）　型二 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー二鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイホセテイカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号；５５：ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴ　ＡＴＣＴＡＡＡ ＴＴＣＧＣＧＣＧ　２５（２）配列番号＝５６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）型： （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）ハイホセテイカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝５６：ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴ　ＡＴＧＧＡＡＡ ＴＴＣＧＣＧＣＧ　２５（２）配列番号；５７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６０塩基対 （Ｂ）　型コ （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：鎖状 （ｉｊ　）分子の型：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイホセテイカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：内部 （ｘｉ）配列の記載；配列番号＝５７：ＧＴＡＡＣＣＧＡＡＴ　ＣＴＧＣＧＣＧ ＧＣＧ　ＧＧ　２２Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ 市　突然変異を内含する３段階ＰＣＲ 十　制限酵素による開裂、フラグメントの単離型　発現プラスミド内への再クロ ーニングＴＥＰ３ Ｆｉｇ、　４ −◆−５ＵＢＳＴ、　（２０９−２１２）４ＰＲ５−嚢−Ｇ２１２Ｐ −÷−Ｇ２１２Ｒ Ｆｉｇ、５ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年５月２６日

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．１又は複数のプロテアーゼ不安定アミノ酸セグメントがプロテアーゼ非不安 定アミノ酸セグメントによって置換されている、プロテアーゼ分解に対する安定 性が改善されたタンパク質。
2. ２．酵素である、請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
3. ３．プロテアーゼ非不安定アミノ酸セグメントがリパーゼ又はプロテアーゼから 誘導されているか又は合成セグメントである、請求の範囲第１項又は第２項に記 載のタンパク質。
4. ４．リパーゼである、請求の範囲第２項又は第３項に記載のタンパク質。
5. ５．親りパーゼが微生物リパーゼである、請求の範囲第４項に記載のリパーゼタ ンパク質。
6. ６．親りパーゼが真菌リパーゼである、請求の範囲第５項に記載のリパーゼタン パク質。
7. ７．親りパーゼがフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）又はリゾムコール（Ｒｈｄｉ ｚｏｍｕｃｏｒ）菌種である、請求の範囲第６項に記載のリパーゼタンパク質。
8. ８．親りパーゼがフミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎ ｏｓａ）リパーゼである、請求の範囲第７項に記載のリパーゼタンパク質。
9. ９．プロテアーゼ不安定アミノ酸セグメントがリパーゼ分子の位置２０９−２１ ２でＲＥＦＧ（配列番号：１）、リパーゼ分子の位置１６２−１６５でＤＹＧＮ （配列番号：２）、又はリパーゼ分子の位置２３９−２４２でＥＧＩＤ（配列番 号：３）である、請求の範囲第８項に記載のリパーゼタンパク質。
10. １０．セグメントＲＥＦＱ（配列番号：１）が、ＧＡＳＧ（配列番号：４）、Ｇ ＡＡＧ（配列番号：５）、ＧＡＲＧ（配列番号：６）、ＹＰＧＳ（配列番号：７ ）、ＹＰＲＳ（配列番号：８）、ＨＮＲＧ（配列番号：９）、ＹＴＧＮ（配列番 号：：１０）、ＩＳＳＥ（配列番号：１１）、ＮＮＡＧ（配列番号：１２）、Ｓ ＦｌＮ（配列番号：１３）、ＤＱＮＧ（配列番号：１４）、ＡＳＦＳ（配列番号 ：１５）、ＳＲＧＶ（配列番号：１６）、ＬＤＧ（配列番号：１７）、ＹＹＡＡ （配列番号：１８）、ＩＮＤＩ（配列番号：１９）、ＷＹＦＧ（配列番号：２０ ）、及びＳＩＥＮ（配列番号：２１）から成るグループの中から選はれたセグメ ントによって置換される請求の範囲第９項に記載のリパーゼタンパク質。
11. １１．セグメントＤＹＧＮ（配列番号：２）がＧＳＴＹ（配列番号：２２）、Ｄ ＳＴＮ（配列番号：２３）、ＰＯＬＲ（配列番号：２４）、ＬＤＴＧ（配列番号 ：２５）、ＧＨＲＹ（配列番号：２６）、ＳＧＶＭ（配列番号：２７）、ＲＹＰ Ｓ（配列番号：２８）、ＮＧＬＶ（配列番号：２９）、ＳＦＳＩ（配列番号：３ ０）、ＬＧＳＰ（配列番号：３１）、ＲＡＳＦ（配列番号：３２）、ＶＰＷＧ（ 配列番号：３３）、ＰＤＬＮ（配列番号：３４）、ＳＦＶＰ（配列番号：３５） 、ＰＤＹＲ（配列番号：３６）、ＰＲＬＰ（配列番号：３７）、ＴＶＬＰ（配列 番号：３８）、ＩＧＴＣ（配列番号：３９）、ＴＣＧＴ（配列番号：４０）、Ｔ ＮＫＬ（配列番号：４１）、及びＶＧＤＶ（配列番号：４２）から成るグループ の中から選ばれたセグメントによって置換されている、請求の範囲第９項に記載 のリパーゼタンパク質。
12. １２．セグメントＥＧＩＤ（配列番号：３）がＩＧＹＬ（配列番号：４３）、Ｇ ＳＴＹ（配列番号：４４）、ＲＹＡＮ（配列番号：４５）、ＰＮＩＰ（配列番号 ：４６）及びＴＬＶＰ（配列番号：４７）から成るグループの中から選ばれたセ グメントによって置換されている、請求の範囲第９項に記載のリパーゼタンパク 質。
13. １３．プロテアーゼ非不安定アミノ酸セグメントを産生するため、セグメントＲ ＥＦＧ（配列番号：１）又はＤＹＧＮ（配列番号：２）内の単数又は複数のアミ ノ酸残基がプロリン又はアルギニンによって置換されている、請求の範囲第９項 に記載のリパーゼタンパク質。
14. １４．Ｇｌｙ２１２がＰｒｏ又はＡｒｇによって置換され及び／又はＧｌｙ１６ ４がＰｒｏ又はＡｒｇによって置換されている、請求の範囲第１３項に記載のリ パーゼタンパク質。
15. １５．親リパーゼがリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅ ｉ）リパーゼである、請求の範囲第７項に記載のリパーゼタンパク質。
16. １６．親りパーゼが酵母リパーゼである、請求の範囲第５項に記載のリパーゼタ ンパク質。
17. １７．酵母リパーゼがキャニディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼである、請求の 範囲第１６項に記載のリパーゼタンパク質。
18. １８．親りパーゼが細菌性リパーゼである、請求の範囲第５項に記載のリパーゼ タンパク質。
19. １９．親りパーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株から誘導さ れている、請求の範囲第１８項に記載のリパーゼタンパク質。
20. ２０．請求の範囲第１項乃至第１９項のいずれか１項に記載のタンパク質をコー ドするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成体。
21. ２１．請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡ構成体を支持する組換え型発現ベクタ ー。
22. ２２．請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡ構成体又は請求の範囲第２１項に記載 のベクターで形質転換される細胞。
23. ２３．例えばＡ．ニガー（Ａ．Ｎ１ｇｅｒ）、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ ）又はＡ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）といったアスペルギルス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する真菌細胞；例えばＳ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅ ｒｅＶｉｓｉａｅ）といったサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の 菌株又はＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏ１ｙｍｏｒｐｈａ）といったハンセヌラ（ Ｈａｎｓｅｎｌａ）属又はＤ．ハストリス（ｐ．ｐａｓｔｏｒｌｓ）といったヒ ヒア（ＰＩｃｈｌａ）属からのメチロトローフ酵母に属する酵母細胞，又はＢ． ズブチリス例えば（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（ＢＬｉｃｈ ｃｍＩｆｏｍｉｓ）又はＢ．レいタス（Ｂ．１ｅｎｔｕｓ）といったＢａｃｉｌ ｌｕｓ菌株に属する細菌細胞である、請求の範囲第２２項に記載の細胞。
24. ２４．請求の範囲第２２項又は第２３項に記載の細胞がタンパク質の産生を可能 にする条件下で培養され、タンパク質がその後この培養から回収される、請求の 範囲第１項乃至第１９項のいずれかに記載のタンパク質を産生する方法。
25. ２５．任意には、粉化しない顆粒状の、安定化された液体の又は保護された酵素 の形をしたプロテアーゼ、ならびに請求の範囲第４項乃至第１９項のいずれかに 記載のリパーゼタンパク質を含む洗浄剤添加剤。
26. ２６．添加剤１ｇにっき０．０２−２００ｍｇの酵素タンパク質を含む、請求の 範囲第２５項に記載の洗浄剤添加剤。
27. ２７．アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及び／又はセルラーゼといったもう１つの 酵素を付加的に含んでいる請求の範囲第２５項又は第２６項に記載の洗浄剤添加 剤。
28. ２８．請求の範囲第４項乃至第１９項のいずれかに記載のリパーゼタンパク質な らびにプロテアーゼを含む洗浄剤添加剤。
29. ２９．アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及び／又はセルラーゼといったもう１つの 酵素を付加的に含む、請求の範囲第２８項に記載の洗浄剤組成物。
30. ３０．液体形状をしている、請求の範囲第２８項又は第２９項に記載の洗浄剤組 成物。