AT398578B - Isolierung eines synthetase-gens und seine verwendung - Google Patents
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Description
AT 398 578 B
Der Pilz Tolypocladlum niveum bildet Cyclosporine, eine Gruppe neutraler zyklischer Peptide, zusammengesetzt aus elf Aminosäuren. Cyclosporine zeigen bemerkenswerte biologische Effekte: Cyclosporin A, der Hauptmetabolit, ist ein potenter Immunsuppressor (SandimmunR).
Nach Entwicklung eines in vitro Systems für die Cyclosporin Biosynthese konnte ein Enzym identifiziert 5 werden, welches die gesamte Peptidbiosynthese katalysiert und daher Cyclosporin-Synthetase genannt wird (Zocher et ai. 1986, Billich and Zocher 1987). Der Ablauf der Biosynthese erfolgt nichtribosomal nach einem Thiotemplate-Mechanismus, wie auch für andere Peptid-Synthetasen beschrieben (Kleinkauf and von Döhren 1990). Jede Aminosäure wird zuerst in Form eines Adenylats aktiviert, danach in Form eines Thioesters gebunden und mit der folgenden Aminosäure zum Peptid verknüpft. Im Falle von Cyclosporin A io werden 7 der als Thioester gebundenen Aminosäuren vor dem Knüpfen der Peptidbindung an der Aminogruppe methyliert (Methylgruppendonor ist S-Adenosyl-Methionin). Diese Methylierungsfunktion ist integraler Bestandteil des Enzym-Polypeptids (Lawen and Zocher 1990). Die Cyclisierungsreaktion mit eingeschlossen, führt die Cyclosporin Synthetase also 40 Teilreaktionen durch.
Im Gegensatz zur ribosomalen Proteinsynthese läuft der Thiotemplate Mechanismus mit geringerer Präzi-15 sion ab, wodurch in der Natur neben einem Hauptmetaboliten (Cyclosporin A in Tolypocladium niveum) auch andere Cyclosporin-Varianten gefunden werden (Variation kann dabei nur an einigen definierten Positionen im Peptid auftreten; Kleinkauf and von Döhren 1990). Weitere Cyclosporine, die bei Fermentationen nicht nachgewiesen werden können, lassen sich über das in vitro System gewinnen, da die Precursoren keinen unerwünschten Verstoffwechselungen unterliegen (Lawen et al. 1989). 20 Cyclosporin A enthält drei nicht proteinogene Aminosäuren: D-Alanin in Position 8 (Startpunkt der Biosynthese; Lawen et al. 1992), α-Aminobuttersäure in Position 3 und an Position 1 die ungewöhnliche Aminosäure (4R)-4-[(E)-2-Butenyl]-4-Methyl-L-Threonin (Bmt oder C9-Aminosäure). Alle drei Aminosäuren müssen über einen eigenen Biosyntheseweg, unabhängig vom Primärstoffwechsel, bereitgestellt werden; so kann D-Alanin von der Cyclosporin Synthetase nicht durch Epimerisierung von Enzym-gebundenem L-25 Alanin hergestellt werden, wie dies für die anderen Peptidantibiotika, deren Biosynthese-Mechanismus man kennt, der Fall ist (z.B. Gramicidin Synthetase, Tyrocidin Synthetase und ACV-Synthetase). Die Cyclosporin Synthetase besitzt demnach keine integrale Alanin-Racemase-Funktion (Kleinkauf and von Döhren 1990).
Obwohl mittlerweile auch andere Pilze gefunden wurden, die Cyclosporine bilden können (Dreyfuss, 1986; Nakajima et al., 1989), ist Tolypocladium niveum der wichtigste Organismus für die fermentative 30 Herstellung der Cyclosporine. Der Einfluß verschiedener Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf die Cyclo-sporin-Bildung wurde untersucht (z.B. Agathos, 1986). Über die Genetik des Pilzes ist nur wenig bekannt. Die Cyclosporin-Bildung von pigmentierten Varianten und von Mutanten nach Epichlorhydrin-Behandlung wurde untersucht (Aarnio and Agathos 1990; Agathos and Parekh 1990). Sanglier et al.(l989) beschreiben die Isolierung und Charakterisierung einer Mutante, die kein Cyclosporin bildet, stattdessen aber Bmt (s.o.) 35 anhäuft. Die industrielle Stammverbesserung führte durch die Auslese von Mutanten und die Optimierung der Fermentationsbedingungen zu einer wesentlichen Ausbeutesteigerung.
Informationen über die molekulare Biologie von Tolypocladium niveum wurden nicht publiziert. Bei anderen industriell bedeutenden filamentösen Pilzen wurde gezeigt, daß die Methoden der molekularen Genetik einen wesentlichen Beitrag zur Steigerung der Produktivität leisten können. So beschreiben Skatrud 40 et al. (1989) die Transformation eines Cephalosporium acremonium-Stammes, der bereits große Mengen Cephalosporin C bildet, mit dem klonierten Gen für die Expandase/Hydroxylase (ce/EF), von dem man annimmt, daß es für die Ausbeute den begrenzenden Schritt darstellt. Unter den Transformanten ließen sich solche identifizieren, die unter industriellen Fermentationsbedingungen 15% mehr Cephalosporin C bilden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung und Charakterisierung des Gens für die Cyclospo-45 rin-Synthetase aus Tolypocladium niveum und die Verwendung des isolierten Gens in der Stammverbesserung.
Proteinchemische Voraussetzungen: so Ein Protokoll zur Isolierung der Cyclosporin Synthetase aus Tolypocladium niveum wurde zwar 1990 publiziert (Lawen and Zocher 1990), ist jedoch nicht dazu geeignet, große Mengen homogenes Enzym in kurzer Zeit zu gewinnen. In derselben Veröffentlichung wird der Synthetase noch ein Mr von etwa 650.000 Dalton zugeordnet. Aus Sedimentationsanalysen mit fluoreszenzmarkiertem Protein (Lawen et al. 1992) und durch Extrapolation der Proteingröße vergleichbarer Enzyme (abgeleitet von der DNA-Sequenz: 425 kDa für 55 ACV-Synthetase, welche 3 Aminosäuren verknüpft, Smith et al. 1990, MacCabe et al. 1991, Gutierrez et al.1991; 570 kDa für Gramicidin Synthetase 2, welche 4 Aminosäuren verknüpft, Turgay et al. 1992) kann man jedoch berechtigt annehmen, daß die Cyclosporin synthetase ein Mr um etwa 1.500 kDa besitzt. Das Enzym liegt als eine einzige Polypeptidkette vor und kann weder durch denaturierende noch durch 2
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Die enorme Größe des Enzyms erfordert eine von der üblichen Route abweichende Strategie zur Aminosäure-Sequenzierung. Als erste Voraussetzung braucht man wesentlich mehr homogenes Material zur Durchführung von Fragmentierungs-Versuchen, als allgemein üblich. Besonders die weiter unten angeführten Versuche zur Identifizierung funktioneller proteolytischer Fragmente erfordern große Material-Mengen. Deshalb wurde in kompletter Abänderung der publizierten Reinigung ein Protokoll für Cyclosporin Synthetase entwickelt, welches prinzipiell auch auf analoge Enzyme aus anderen Mikroorganismen angewendet werden kann und im konkreten Beispiel von der Reinigung des Enzyms aus Tolypocladium niveum (Beispiel 1) zu einer substantiellen Verbesserung im Sinne von Ausbeute und dafür erforderlichen Zeitaufwand führte.
Das In der Erfindung angewandte Reinigungsverfahren für Cyclosporin Synthetase liefert, nach Myzei-aufschluß, Nukleinsäurefäliung, Proteinfällung und Molekularsiebchromatographie stabile, mindestens 90%-ige, aktive Enzympräparationen, wie sie für die enzymkinetische bzw. proteinchemische Charakterisierung notwendig sind. Die Reinigung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden. Der Zellaufschluß kann z.B. mit einem Hochdruckhomogenisator oder Glaskugelmühle erfolgen, wobei die Zellen sowohl in feuchtem als auch in lyophilisiertem Zustand vorliegen können. Liegen die Zellen feucht vor, wird zweckmäßigerweise ein Druckaufschluß durchgeführt, mit z.B. einer Maunton Gaulin-Apparatur; lyophilisierte Zellen werden zweckmäßigerweise durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Die Nukleinsäurefällung kann mit Polyethylenimin oder Protaminsulfat erfolgen. Für die Proteinfällung eignet sich u.a. Ammonsulfat, wobei eine Sättigung um etwa 50% ausreicht, um die Cyclosporin Synthetase auszufällen. Der Ammonsulfatniederschlag wird einer Molekularsieb-Chromatographie unterworfen (z.B. HW65-F Fractogel Merck), wobei eine etwa zu 90% homogene Enzympräparation erhalten wird.
Die Zellen können sowohl in feuchtem als auch in lyophilisiertem Zustand aufgeschlossen werden, wobei im ersten Fall in der Regel ein Druckaufschluß (z.B. mit einer Maunton Gauiin-Apparatur) durchgeführt wird, während man lyophilisiertes Myzel durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff aufschließt. Dem Aufschluß folgt eine grobe Klärung des Rohextrakts durch mitteltourige Zentrifugation (im Bereich von ca. 10.000 g) und ein weiterer Kiärungsschritt durch Präzipitation von Nukleinsäuren, wobei im allgemeinen auch feine Schwebeteilchen, die die anschließenden Schritte stören können, entfernt werden. Zur Präzipitation der Nukleinsäuren können alle dafür üblichen Reagentien eingesetzt werden, wie z.B. Polyethylenimin oder Protaminsulfat; die optimale Menge sollte für jeden Einzelfall ausgetestet werden.
Cyclosporin Synthetase kann aus diesem geklärten Rohextrakt zusammen mit etwa 20 - 30% des Gesamtproteins durch eine Sättigung mit Ammonsulfat zu 50% präzipitiert werden, wobei der optimale Sättigungswert für jedes Anwendungsbeispiel ermittelt werden muß.
Nach diesem Schritt liegt das Enzym grob angereichert und hoch konzentriert vor; in dieser Form kann es einer Molekularsieb-Chromatografie unterworfen werden. Bei der richtigen Wahl des Molekularsiebs ist es alleine aufgrund der außergewöhnlichen Größe des Enzyms möglich, in einem einzigen weiteren Schritt eine etwa zu 90% homogene Präparation zu erhalten. Durch das Prinzip der Trennung nach Größe kann diese Methode auf jedes analoge Enzym mit den gleichen Erfolgsaussichten angewendet werden. Die Analyse der Reinheit wird in SDS-Polyacrylamidgelen (vorzugsweise 4-15% Gradientengele) durchgeführt.
In Beispiel 1 führt das im Detail für Tolypocladium niveum beschriebene Protokoll zu einer Zeitverkürzung von 4 Tagen auf 10 Stunden und zu einer Ausbeute-Steigerung um etwa den Faktor 4. Ais Ausgangsmaterial für die Proteinreinigung wurde Tolypocladium niveum, Stamm 7939/45 verwendet (Lawen et al. 1989). Der Nachweis der Enzymaktivität über die in vitro Synthese von Cyclosporinen wurde ebenfalls gegenüber der publizierten Methode (Lawen and Zocher 1990) im Sinne einer Steigerung der Nachweisempfindlichkeit verbessert (Beispiel 2).
Bei einem Protein dieser außerordentlichen Größe ist der Bedarf an Aminosäure-Sequenzen naturgemäß größer als bei Proteinen durchschnittlicher Größe, um eine korrekte Identifizierung des Gens bzw. Genprodukts zu ermöglichen. Abgesehen von der Möglichkeit einer N-terminalen Blockierung ist es technisch nicht durchführbar, ein Enzym dieser Größe so zu präparieren, daß es für N-terminale Sequenzierung geeignet ist. Aus diesen Gründen war es erforderlich, interne Aminosäure-Sequenzen in ausreichender Anzahl zu beschaffen. Bei der Fragmentierung eines Proteins dieser Größe entstehen jedoch derart viele Bruchstücke (theoretisch etwa 700, wenn man einen Schnitt pro 20 Aminosäuren postuliert), daß die Standardmethode, das Protein komplett zu fragmentieren und die Fragmente über HP-RPC zu reinigen, nicht anwendbar ist. Aus diesem Grund wurde eine Strategie angewandt, die für die Sequenzierung aller Proteine von außergewöhnlicher Größe verwendet werden kann: Wenn man die Fragmentierung unter für die jeweiligen Endoproteinasen suboptimalen Bedingungen durchführt, erhält man wesentlich größere 3
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Fragmente.
Die Spaltung der Cyclosporin Synthetase erfolgt erfindungsgemäß, indem man den pH-Wert adjustiert. Insbesondere gelingt eine Spaltung zu grossen Fragmenten von bis zu 200 kDa, indem man den pH-Wert auf etwa 7,5 bringt, in HEPES-Puffer unter Zusatz von EDTA und DTT. Die so erhaltenen Fragmente können dann in an sich bekannter Weise isoliert und angereichert werden, z.B. unter Verwendung von Chromatographie und Elektrophorese, wie Kombination von Anionenaustausch-Chromatographie an MonoQ und HP-RPC, oder Kombination von MonoO mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese/Elektroblot. Suboptimale Bedingungen erzielt man vor allem durch Abänderung der Pufferbedingungen (Puffersubstanz, pH-Wert), eventuell auch unter Abänderung der Spalt-Temperatur (siehe Beispiel 3 als eine mögliche Variante). Die immer noch sehr zahlreichen Fragmente müssen über jeweils 2 Reinigungsschritte isoliert bzw. angereichert werden, wobei prinzipiell alle chromatografischen und elektrophoretischen Trenntechniken angewendet werden können. Im Falle der Fragmente von Cyclosporin Synthetase aus Tolypocladium niveum erwiesen sich Kombinationen von Anionenaustausch-Chromatografie an MonoQ mit HP-RPC (Beispiele 4 und 5) und MonoQ mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese/Elektroblot (Beispiele 4 und 6) als besonders vorteilhaft.
Die Proteinsequenzierung ist nach Laursen, Methods Enzymology 25, 344-359 (1972) bekannt. Ebenfalls ist es heute Stand der Technik, die für Proteine kodierenden Gene zu lokalisieren (Rothstein et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLV, 99-105, 1981) und zu sequenzieren (Sänger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467, 1977).
Der nichtribosomale Biosynthese-Weg impliziert, daß die Sequenz des cyclischen Peptids durch die entsprechende Anordnung der die Aminosäuren aktivierenden Domänen bestimmt wird. Jede dieser Domänen muß analoge Reaktionen ausführen, nämlich die Aktivierung der Aminosäure durch Adenylierung und Bindung in Form eines Thioesters, so daß man erwarten kann, daß man in der Proteinsequenz sich wiederholende, konservierte Motive findet.
Tatsächlich hat man bei den bisher analysierten Peptid-Synthetasen innerhalb der Sequenzen konservierte Bereiche entdeckt, deren Zahl sich mit der Anzahl der zu aktivierenden Aminosäuren deckt: drei bei ACV-Synthetase (aktiviert Aminoadipinsäure, Cystein und Valin; Smith et al. 1990, MacCabe et al. 1991, Gutierrez et al., 1991), jeweils eine bei Gramicidin Synthetase I (Kraetzschmar et al. 1989) und Tyrocidin Synthetase I (Weckermann et al. 1988; die beiden bakteriellen Enzyme sind jeweils Untereinheit eines Multienzym-Komplexes und aktivieren nur eine Aminosäure, nämlich Phenylalanin), und vier konservierte Bereiche in Gramicidin Synthetase 2, die die Aminosäuren Prolin, Valin, Ornithin und Leucin aktiviert (Turgay et al. 1992).
Eine möglichst genaue Identifizierung· und Charakterisierung solcher konservierten Bereiche von Cyclosporin Synthetase sowohl auf enzymatischer als auch auf genetischer Ebene stellt die Grundlage für ein gezieltes genetic engineering im Sinne einer Veränderung der Enzymspezifität zur Herstellung von Cyclosporin-Varianten in vivo dar.
Deshalb haben wir versucht, auf proteinchemischem Weg proteolytische Fragmente der Cyclosporin Synthetase zu identifizieren, die mit einer Teilfunktion der Synthetase korreliert werden können. Bei diesen Arbeiten wurden folgende Zuordnungen getroffen: (1) ein Proteinfragment mit Methyltransferase-Funktion (die dieser Arbeit zugrundeliegende Methode ist prinzipiell auf alle Methyltransferasen anwendbar und publiziert in Yu et al. 1983; eine erste Anwendung auf Cyclosporin Synthetase ist publiziert in Lawen and Zocher 1990); siehe Beispiel 7; (2) ein Proteinfragment mit Fähigkeit zur Aktivierung von D-Alanin (Beispiel 8) (3) ein Proteinfragment mit Fähigkeit zur Aktivierung von L-Alanin (Beispiel 8).
Die in Beispiel 8 angewandte Methode wurde für diese Aufgabenstellung entwickelt und ist in dieser Form nicht publiziert. Sie macht sich die Tatsache zunutze, daß bei einer limitierten proteolytischen Spaltung von Proteinen unter anderem intakte Domänen abgespalten werden, die aufgrund ihrer korrekten räumlichen Faltung noch in der Lage sind, ihre enzymatische Funktion in beschränktem Umfang auszuüben. Mit dieser Methode kann daher theoretisch jede Aminosäureaktivierende Domäne identifiziert werden. Die optimalen Bedingungen (für die proteolytische Spaltung und ihre zeitliche Abfolge in Relation zur Aminosäure-Aktiverung) müssen jedoch in jedem Einzelfall ausgetestet werden; außerdem ist die eindeutige Identifizierung einer Domäne nur dann durchführbar, wenn die von ihr aktivierte Aminosäure im Produkt nur einmal vorkommt.
Das Gen wird isoliert durch DNA-Hybridisierung mit cyclosporin-synthetase-spezifischen Oligonukleoti-den (Beispiel 10). Ob ein bestimmtes DNA-Teilfragment tatsächlich zum Cyclosporin-Synthetase-Gen gehört, wird durch Northernhybridisierung festgestellt, da ein nicht transkribiertes Nachbarfragment nicht mit der entsprechenden RNA hybridisiert (Beispiel 15). Die DNA-Sequenz der Monierten DNA des Cyclosporin-Synthetase-Gens wird bestimmt und mit Aminosäureteilfragmenten der Cyclosporin-Synthetase verglichen 4
AT 398 578 B (Beispiele 13 und 14). Voraussetzungen für eine Transformation von Tolypocladium niveum ist eine Methode zur Protoplastierung (Beispiel 17) und ein geeigneter Plasmidvektor (Beispiele 11,12 und 18).
Mit diesen Voraussetzungen ist es möglich, Tolypocladium niveum mit dem vollständigen Gen für die Cyclosporin-Synthetase zu transformieren. Unter den Transformanten lassen sich Stämme finden, die mehrere Kopien dieses Gens oder Kopien mit veränderter Regulation enthalten. Es werden Stämme ausgewählt, die in Testfermentationen eine verstärkte Cyclosporin-Bildung zeigen, b.z.w. schon nach kürzerer Fermentationsdauer die gleiche Menge Cyclosporin bilden können.
Auch über die Aktivität der Cyclosporin-Synthetase ist eine Auswahl der transformierten Stämme möglich, unabhängig davon, ob mehr oder schneller Cyclosporin gebildet wird. Das isolierte Cyclosporin-Synthetase-Gen kann als analytisches Hilfsmittel dienen, um zu bestimmen, ob ein spezieller Stamm von Tolypocladium niveum eine hohe Konzentration der mRNA aufweist oder nicht (Beispiel 15). Solche Stämme können dann einer konventionellen Mutagenese und Stammauswahl unterworfen werden. Selbst wenn der für die Transformation verwendete Ausgangsstamm nicht in der Cyclosporin-Synthetase-Aktivität limitiert ist, wird so ein Stamm bereitgestellt, der potentiell eine größere Cyclosporin-Bildung erlaubt. Die Kombination der klassischen Genetik (Mutation und Stammauswahl) mit der molekularen Genetik (Transformation mit isolierten Genen) erlaubt es, verbesserte Stämme zu isolieren, die für keine der beiden Methoden allein erreichbar sind: Für die klassische Genetik nicht, weil eine Doppelmutation in einem Selektionsschritt extrem selten ist; für die molekulare Genetik nicht, weil u.U. ein unbekannter Faktor begrenzend wirkt.
Eine weitere Anwendung des isolierten Genes ist eine genspezifische Mutagenese. Statt Mutationen im ganzen Genom zu erzeugen - und damit auch viele nicht-beteiligte Gene zu verändern - wird nur das isolierte Gen mit geeigneten Methoden mutiert (Sambroock et al. 1989) und anschließend nach Tolypocladium niveum transformiert (Beispiel 17). Unter den Transformanten ist der Anteil der Mutanten im Cyclosporin-Synthetase-Gen höher als bei einer Mutagenese des Pilzes. Mutanten, die spezielle Cyciospo-rine vermehrt oder auch vermindert bilden, lassen sich häufiger finden als nach einer konventionellen Mutagenese.
Durch interne Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Beispiel 14c) und Zuordnung spezifischer Teilsequenzen (Beispiel 8 und Beispiel 9, bzw. Beispiel 14ab) können Domänen der Cyclospor-insynthetase für die Aktivierung der einzelnen Aminosäuren (wie oben für nichtribosomale Peptidsyntheta-sen ausgeführt) lokalisiert werden. Dadurch kann gezielte Mutagenese des Cyclosporinsynthetase-Gens durchgeführt werden, indem der Genbereich einzelner Domänen untereinander ausgetauscht, ein entsprechender Bereich gezielt entfernt oder das Cyclosporinsynthetase-Gen auch um einzelne Domänen erweitert werden kann. Nach Transformation solcher mutierten Gene in Tolypocladium niveum können neue Cyclosporin-Varianten zugänglich werden. Für bestimmte Zwecke ist es vorteilhaft, über Tolypocladium niveum-Stämme zu verfügen, die keine aktive Cyclosporin-Synthetase mehr besitzen. Auch dazu kann das isolierte Gen verwendet werden. Für die Transformation wird dazu eine in vitro hergestellte inaktive Version konstruiert.
Beim Screening nach Mikroorganismen, die Cyclosporine synthetisieren können, ist es unabdingbar, daß die aktiven Metabolite unter den Testbedingungen auch tatsächlich in ausreichender Menge gebildet werden. Solche Substanzen können außerdem leicht veränderte Charakteristika aufweisen, und schon deshalb übersehen werden. Das Beispiel 16 beschreibt die Anwendung des isolierten Cyclosporin-Syntheta-se-Gens, um Mikroorganismen aufzufinden, die Cyclosporin-Synthetase-Gene in ihrem Genom enthalten. Diese Gene müssen dazu nicht aktiv sein. Basierend auf diesen Hybridisierungen lassen sich die entsprechenden Gene analog zu den Beispielen 10, 11 und 12 isolieren und in Tolypocladium niveum transformieren. Hierfür kann ein Stamm verwendet werden, der keine aktive Cyclosporin-Synthetase mehr enthält. Diese interspezifische Rekombination ist mit anderen Methoden nicht zu erzielen. Wie im vorhergehenden Absatz beschrieben, kann man solche Stämme einem Screeningprogramm unterwerfen. Die genetische Variabilität beruht in diesem Fall auf dem eingebrachten Gen, das mit dem Cyclosporin-Synthetase-Gen hybridisiert. Schließlich können auch die Kontroll-Sequenzen des Cyclosporin-Synthetase-Gens, wie sie u.a. in synp4 vorliegen (Beispiel 12) zur Konstruktion von Plasmiden benutzt werden, in denen dieser Promotor mit einem leicht nachweisbaren Reporter-Gen wie z.B. dem jö-Glucuronidase-Gen (Tada et al. 1991) fusioniert wird. Stamme von Tolypocladium niveum, die mit solchen Plasmiden transformiert werden, erlauben nicht nur die Selektion von regulatorischen Mutanten, sondern ermöglichen es außerdem, die Aktivität des Promotors unbhängig von anderen Teilfunktionen zu messen und zu optimieren.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken. 5
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Beispiel 1: Isolierung aktiver Cyclosporin Synthetase in elektrophoretisch homogener Form:
Das beschriebene Protokoll weicht vollständig von der in der Literatur beschriebenen Reinigung (Lawen and Zocher 1990) ab. Bei einer Aufarbeitung von 10 g lyophilisiertem Myzel erhält man innerhalb von 10 Stunden 50 mg Cyclosporin Synthetase in elektrophoretisch homogener Form.
Alle Schritte wurden zwischen 0* und 4°C durchgeführt. 1. Schritt: 10 g lyophilisiertes Myzel wurden unter Zusatz von flüssigem Stickstoff fein zermörsert und in Puffer A aufgeschlämmt (Puffer A: 0,2 M HEPES pH 7,8, 0,3 M KCl, 4 mM EDTA, 40 (v/v)% Glyzerin, 10 mM DTT). Zur Extraktion der Proteine wurde auf Eis 1 Stunde vorsichtig gerührt. Zentrifugation der Zelltrümmer: 10 Minuten bei 10.000 g. 2. Schritt: Der Überstand, als Rohextrakt bezeichnet, wurde zur Entfernung von Nukleinsäuren einer Poiyethyleniminfäilung (Endkonzentration 0,1%) unterzogen. Das Präzipitat wurde durch 10 Minuten Zentrifugation bei 10.000 g entfernt. 3. Schritt: Der erhaltene Polyethylenimin-Überstand wurde einer Ammonsulfatfällung unterworfen: Puffer B (0,1 M HEPES pH 7,8, 4 mM EDTA, 15 (v/v)% Glyzerin, 4 mM DTT) wurde mit Ammoniumsulfat bei Raumtemperatur gesättigt. Diese Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 50% Sättigung dem Polyethylenimin-Überstand zugetropft. Zur Equilibrierung wurde der Fällungsansatz weitere 30 Minuten stehen gelassen. Die präzipitierten Proteine wurden durch 30 Minuten Zentrifugation bei 30.000 g gesammelt. Das erhaltene Pellet wurde ad 10 ml in Puffer B resolubilisiert. 4. Schritt: Die resoiubilisierte Ammonsulfat-Fraktion wurde einer Molekularsieb-Chromatografie unterworfen. Molekularsieb: HW65-F Fractogel von Merck; Säulendimension: 2,6 cm x 93 cm, V = 494 ml; Betrieb mittels FPLC. Laufgeschwindigkeit: 2 mi/min, kontinuierlich unter Puffer B. Die Cyclosporin Synthetase eluiert unter diesen Bedingungen bei einem Elutionsvolumen von 260 - 310 ml.
Beispiel 2: Nachweis der enzymatischen Aktivität von Cyclosporin Synthetase:
In Abwandlung von der publizierten Methode (Lawen et al. 1989) wurde der Nachweis der Cyclosporin Synthetase Aktivität wie folgt durchgeführt: 80 ul Enzymprobe (in Puffer B: siehe Beispiel 1) wurden in einem Gesamtvolumen von 130 ul mit 3,5 mM ATP, 8 mM MgCfe, 10 mM DTT, 10 uM C9-Säure, 690 uM an jeder anderen konstituierenden Aminosäure, und 100 um S-Adenosyl-Methionin + 2 uCi Adenosyl-L-Methionin-S-[methyl-3H] (75 Ci/mmol) 1 Stunde bei 22 "C inkubiert. Die Extraktion und der Nachweis des gebildeten Cyclosporin A wurden wie beschrieben durchgeführt (Billich and Zocher 1987).
Beispiel 3: Endoproteinase Spaltungen:
Folgende„Endoproteinasen (Boehringer Mannheim, sequencing grade) wurden eingesetzt:
Trypsin aus Rinderpankreas (spaltet nach Arginin und Lysin) LysC aus Lysobacter enzymogenes (spaltet nach Lysin) GluC = V8 aus Staphyiococcus aureus (spaltet nach Glutaminsäure und Asparaginsäure).
Die Spaltungen wurden nicht unter den vom Hersteller empfohlenen, sondern unter "suboptimalen" Bedingungen durchgeführt: Cyclosporin Synthetase wurde in ihrem Lagerpuffer (0,1 M HEPES pH 7,5, 4 mM EDTA, 4 mM DTT, 15 (g/v)% Glyzerin) mit Protease im Verhältnis 100 ug : 1 ug, 2-3 Stunden bei 25 °C inkubiert. Dabei entstehen Fragmente bis zu einer Größe von etwa 200 kDa.
Beispiel 4: MonoQ-Reinigung von Fragmenten :
Puffer 1: 20 mM HEPES pH 7,5, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 5 gv% Glyzerin Puffer 2: Puffer 1 + 500 mM NaCI
Die Reinigung wurde an einer handelsüblichen MonoQ-Säule (HR 5/5) von PHARMACIA bei 4°C vorgenommen. Verdünnung (1:5) und Applikation der Protease-verdauten Proteinprobe in Puffer 1; Gradientenelution der Fragmente in 20 ml von 0% auf 100% Puffer 2.
Beispiel 5: HP-RPC-Reinigung von MonoQ-Fraktionen:
Puffer 1: 5% Acetonitril, 0,1% TFA Puffer 2: 90% Acetonitril, 0,1% TFA Säule: Nucleosil 300A-C4-5U: Dimension 85 x 4,5 mm Laufgeschwindigkeit: 1 ml/min 6
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Temperatur: Raumtemperatur
Gradientenelution: in 85 Minuten von 0% auf 100% Puffer 2
Beispiel 6: SDS-PAGE/Blot-Reinigung von MonoQ-Fraktionen: SDS-PAGE wurde nach Lämmii (1970) durchgeführt. Dem Elektrophorese-Puffer wurde Thioglykolsäure (2 mM) zugesetzt, um die Blockierung der N-Termini durch Restradikale aus der Polymerisationsreaktion zu verhindern. Die Fraktionen der MonoQ-Reinigung wurden nach Denaturierung mit SDS zur Elektrophorese eingesetzt. Zur Sequenzierung wurden die Proteine aus dem Gel an Glasfasermembranen ("Glassybond" von Biometra) im Semidry-Verfahren geblottet.
Beispiel 7: Protein-Fragment mit Methyltransferase-Aktivität: Identifizierung und Reinigung
Das aktive Zentrum von Methyltransferasen kann durch UV-Bestrahlung mit seinem Substrat S-Adenosyl-Methionin quervernetzt werden. Diese Tatsache kann man sich zunutze machen, indem man radioaktives Substrat anbietet und somit eine radioaktive Markierung des Enzyms erhält (Yu et al. 1983). Diese Methode, die auch als "Photoaffinity labelling" bezeichnet wird, wurde auch auf Cyclosporin Synthetase angewendet (Lawen and Zocher 1990), wobei gezeigt werden konnte, daß bei anschließendem Protease-Verdau mehrere markierte Proteinfragmente entstehen. Von uns wurde eines dieser markierten Fragmente identifiziert und durch Kombination von den in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden angereichert und dadurch der Sequenzierung zugänglich gemacht (siehe Beispiel 9: as 4). Dieses Fragment besitzt eine Größe von etwa 47.000 Dalton, wobei zu berücksichtigen ist, daß die Größe von Proteinen und ihren Fragmenten durch elektrophoretische Methoden nur näherungsweise bestimmt werden kann, und die angegebene Größe daher nur einen Richtwert darstellt.
Beispiel 8: Aminosäure-aktivierende Proteinfragmente: Identifizierung und Reinigung
Die im folgenden beschriebene Methode wurde für diese Problemstellung neu entwickelt und ist nicht in der Literatur beschrieben. Prinzipiell kann sie für jedes multifunktionelle Enzym eingesetzt werden.
Die Identifizierung von Proteinfragmenten mit Fähigkeit zur Aktivierung einer Aminosäure wurde durch Beladung der Synthetase mit radioaktiv markierter Aminosäure unter gleichzeitiger Anwesenheit einer Endoproteinase durchgeführt. Etwa 500 u.g gereinigte Cyclosporin Synthetase wurden mit 25 mM ATP und 30 mM MgCb mit 5 uCi 14C-D-Alanin oder alternativ mit 5 uCi ,4C-L-Alanin inkubiert und gleichzeitig mit Endoproteinase V8 im Fall von D-Alanin bzw. mit Endoproteinase LysC im Fall von L-Alanin (nach Beispiel 3) behandelt. Die Reaktion wurde nach 3 Stunden durch Präzipitation der Proteine mit TCA gestoppt. Die Fragmente wurden in Probenpuffer für SDS-PAGE unter Weglassung reduzierender Agentien resolubilisiert; die Hälfte des Ansatzes wurde einer SDS-PAGE unterworfen und das markierte. Proteinfragment durch Autoradiografie des Geis nach Inkubation in "Amplify solution" (von NEN) und Trocknung detektiert.
Ergebnis für den Ansatz mit 14C-D-Alanin: Ein Fragment mit M, von ca. 130.000 Dalton wurde identifiziert, und durch eine Kombination der in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden zur Aminosäure-Sequenzierung angereichert; entsprechende Aminosäure-Sequenz in Beispiel 9: as16. Ergebnis für den Ansatz mit uC-L-Alanin: Ein Fragment mit Mr von ca. 140.000 Dalton wurde identifiziert, und durch eine Kombination der in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden zur Aminosäure-Sequenzierung angereichert; entsprechende Aminosäure-Sequenz in Beispiel 9: as13.
Beispiel 9: Aminosäure-Partialsequenzen von Cyclosporin Synthetase: as1:
GELVVSGDGLARGYTNPALDSDRFVDI as2:
ITVDVEDSFETLVHQVRETT as3:
GVRLRGPLRVDALQEALRALEE as4:
QSEVGNDFMGWTSMYDG as5:
NLPAVEDIEPDFATEASV 7
AT 398 578 B as6:
GSTLYSVIPTTEYTGPVVL as7: STNE1LLLDVAPLSLGI 5 as8:
IELAEVEXALLSS as9:
LWFLDQFNIDALXYLIPFAL as10:
10 EVFDKPVLAPLA as12:
YASINPLVQVMFAVH as13: LARQARVIPRSAASTLDFVA 15 as14:
AVSARVAPRDNTEIVLXEEY as15:
ALQTALPAYMIPSRIIVL as16:
20 GLQSLLPPYMIPSRITLLD as17:
LVSQRVAPRNEIEAV as18: VQAWEAVFDXVAY 25 as19: QVQGWGEHFDVSXXA as20:
DIRQSEVGNDFMGXT ("x" bedeutet, daß nicht bekannt ist, welche Aminosäure an dieser Stelle vorliegt.) 30
Beispiel 10: Isolierung von \-Klonen, die mit einem cyclosporin-synthetase-spezifischen Oligonukleotid hybridisieren a Konstruktion einer genomischen λ-Genbank aus Tolypocladium niveum. 35
Aus dem Mycel einer in Medium 1 gewachsenen Kultur von Tolypocladium niveum wird DNA isoliert: Medium 1 enthält 50 g/i Maltose, 10 g/l Caseinpepton (tryptisch verdaut, Fluka), 5 g/i KH2PO4 und 2,5 g/l KCl; der pH-Wert 5,6 wird mit Phosphorsäure eingestellt. Jeweils 4ml einer Sporensuspension des Stammes Tolypocladium niveum ATCC 34921 ( = Beauveria nivea) mit 4x108 Sporen pro mi werden zu 40 200 ml Medium 1 in einem 11-Erlenmeyerkolben gegeben und 72 h bei 25’C und 250 Upm geschüttelt. Das Mycei wird mittels eines Büchnertrichters abfiltriert, mit 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1mM EDTA gewaschen und unter flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Aus 40 g Mycelfeuchtmasse werden Kerne isoliert, die dann iysiert werden; die DNA wird durch CsCI-EtBr-Zentrifugation gereinigt. Diese Methode -die Isolierung von hochmolekularer DNA aus Zellkernen - wurde von Jofuku und Goldberg (1988) für 45 Pflanzen beschrieben und kann für Pilzmycel verwendet werden. Erhalten werden 4,3 mg DNA, die in einem 0,5%igem Agarose-Gel eine Bande ergibt, die eine geringere Mobilität als X-DNA aufweist. 40ug dieser DNA werden mit 1,4 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau3A in 10mM Tris-Cl pH7,5, 10 mM MgCl2, 1mM DTE, 50 mM NaCI 60 min bei 37 “C und anschließend 10 min bei 65 °C inkubiert. Daß Ausmaß der Spaltung wird auf einem Agarose-Gel überprüft: Ein Teil der DNA ist zwischen 10 und 20 kb 50 groß. Die DNA wird dann auf zwei NaCI-Gradienten aufgetragen, die durch Einfrieren und langsames Wiederauftauenlassen bei 4 ° C von zwei Beckman SW28.1 Ultrazentrifugen-Röhrchen mit 20 % NaCI in TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) hergestellt wurden. Zentrifugiert wird für 16 h bei 14000 Upm in der Beckman-Ultrazentrifuge L8M im Rotor SW28.1. Der Inhalt der Röhrchen wird fraktioniert. Fraktionen mit DNA, die größer als 10 kb ist, werden vereinigt und gegen TE dialysiert. Nach einer Konzentrierung der 55 DNA auf 500ng/ml wird sie mit XEMBL3-DNA (Promega Inc.), die mit EcoRI und BamHI gespalten wurde, vereint. In 5ul werden 1,5 u.g der DNA und 1 ug XEMBL3-DNA (gespalten mit EcoRI und ßamHI) in 30 mM Tris-Cl pH7,5, 10 mM MgCfe, 10 mM DTE, 2,5 mM ATP nach Zugabe von 0,5 U T4-DNA-Ligase 16 h bei 16°C ligiert (DNA-Konzentration 500ug/ml). Das Ligationsgemisch wird mit Hilfe von Protein-Extrakten 8
AT 398 578 B ("Packaging mixes", Amersham) in vitro verpackt. Die entstandenen X-Lysate werden mit E. coli KW251 (Promega Inc.) getitert. Erhalten werden etwa 4,5x105 pfu. b Isolierung von X-Klonen 40 000 rekombinante Phagen der Tolypocladium inflatum-Genbank aus Beispiel 10a werden mit dem Stamm E. coli KW251 auf 90 mm TB- Platten ausgegossen ( TB enthält 10 g/l Bacto Tryptone und 5 g/l NaCI und 0,7% Agarose, der pH7,5 wird mit NaOH eingestellt). Von jeder Platte werden zwei Abdrücke auf Nitrocellulose (Stratagene) gemacht (Maniatis et al., 1982). Aus der Aminosäure-Sequenz des Fragmentes as9 (Beispiel 9) der Cyclosporin-Synthetase läßt sich auf Grund des genetischen Codes ein Oligonukleotid-Gemisch (96 verschiedene Oligonukleotide, jeweils 20 Nukleotide lang) mit den Sequenzen
5' GCA TCA ATA TTA AAT TGA TC 3' G G G G C G T hersteilen. 1,5 ug dieses Oligonukleotid-Gemisches werden in 25ul 50 mM Tris-Cl pH 9,510 mM MgCfe, 5mM DTE, 5% Glycerin mit 150 uCi 7-ATP (32P) mit 20 U Polynukleotid-Kinase ( Boehringer) 30 min bei 37 *C inkubiert. Über 80% der Radioaktivität werden eingebaut. Die Hybridisierung wird bei 37· in 400 ml 6xSSPE (Maniatis et al. 1982), 5xDenhard's Lösung (Maniatis et al., 1982), 0,1 % SDS, 100 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA (Maniatis et al., 1982), 0,1 mM ΑΤΡ, 1.4X106 cpm/m! 32P-markiertem Oligonukleotid-Gemisch für 16 h durchgeführt. Die Filter werden dreimal 5 min und zweimal je 30 min in 6xSSC (Maniatis et al., 1982) bei 4 · C gewaschen. Anschließend werden die Filter für 10 min bei 37 · C in einer TMAC (Tetramethylammoniumchlorid)-Waschlösung, die nach den Angaben von Wood et al., 1985 hergestelit wurde) gewaschen. Schließlich werden die Filter 30 min in der TMAC-Waschlösung bei 57 · C gewaschen, getrocknet und für 10 Tage mit einem Kodak XOmatik AR Roentgenfilm exponiert. Bereiche der Agaroseschicht, die positiven Signalen auf dem Roentgenfilm entsprechen, werden ausgestochen und in SM-Puffer (5,8 g/l NaCI, 2 g/l MgSO«.x7H20 und 50 mM Tris-Cl pH7,5) resuspendiert. Eine geeignete Verdünnung wird mit KW251 erneut auf eine TB-Platte ausgegossen. Die Plaques werden wiederrum auf Nitrozellulose übertragen. Aus Plaques, die in der zweiten Hybridisierung positive Hybridisierungssignal ergeben, wird die DNA isoliert. Die gereinigte DNA dieser Phagen wird für Southern-Hybridisierungen und Restriktionsanalysen verwendet. Abbildung 1 zeigt die Restriktionskarte des Tolypocladium niveum-Anteils eines solchen λ-Klons ( = XSYN3). Außerdem werden Subklonierungen in verschiedene Plasmidvektoren (z.B. pUC1ß, Pharmacia) durchgeführt.
Zur Isolierung von λ-Klonen, die die angrenzenden DNA-Fragmente enthalten ("Genomic walking") wird die oben beschriebene Methode der Plaquehybridisierung mehrfach wiederholt, wobei jeweils die randständigen Restriktionsfragmente als 32P-markierte Sonden eingesetzt werden. Um die DNA zu klonieren, die sich an die in Abb.1 schematisch wiedergegebene Region (XSYN3) anschließt, wird das Fragment S5 verwendet ( Abb.1). Die Hybridisierung wird dann bei 42 *C in 6xSSPE, 50% Formamid, 5xDenhard's Lösung, 0,1% SDS, 100 ug/ml denaturierte Heringssperma-DNA, 100 uM ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA wird vor der Hybridisierung 5 min auf 100'C erhitzt und in Eis abgekühlt. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min In 2xSSC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 0,2xSSC, 0,1%SDS bei 65 °C. Die getrockneten Filter werden autoradiografiert. Mit den Bereichen der Agarose, die positiven Signalen entsprechen wird weiterverfahren, wie oben beschrieben.
Beispiel 11: Isolierung von Cosmidklonen, die Teile des Cyclosporinsynthetase-Gens enthalten a Konstruktion einer genomischen Cosmid-Genbank aus Tolypocladium niveum
Es werden Protoplasten hergestellt, wie in Beispiel 17 dargestellt. Ca. 109 Protoplasten werden vorsichtig in 2 ml TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) lysiert. Es wird 0.1 mg/ml RNase A zugesetzt und 20 min bei 37 · C inkubiert. Nach Zugabe von 0.5 % SDS und 0.1 mg/ml Proteinase K wird weitere 40 min bei 55 ”C inkubiert. Der Ansatz wird sehr schonend je zweimal mit TE-gesättigtem Phenol, Phe-nol/Chloroform (1:1) und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert (Maniatis et al., 1982). Der wässrige leicht viskose Überstand wird mit einem Zehntel Volumen 3 M Natriumazetat (pH 5.2) versetzt, mit dem 2.5 9
AT 398 578 B fachen Volumen absolutem, -20 *C kaltem Ethanol überschichtet und die DNA in Form feiner Fäden mittels Glasstäben an der Phasengrenze aufgespult. Die DNA wird in 3 ml TE mindestens 20 h gelöst. Je nach Qualität der Protoplasten werden ca. 500 ug/ml DNA erhalten. Analyse mit FIGE (0.8 % Agarose, 0.5 x TBE (Maniatis et ai. 1982), 6 V/cm, Vorwärtspuls 0.2 bis 3 s, Puls-Verhältnis 3.0, Laufzeit 5 h) ergibt eine Größe von mehr als 150 kb.
Zweimal 135 ug DNA werden mit 7.5 bzw. 15 Einheiten des Restriktionsenzyms Ndell (Fa.Boehringer Mannheim) für 1 h bei 37·C in 1 ml Puffer (Tris-Azetat 33 mM, Magnesiumazetat 10 mM, Kaliumazetat 66 mM, DTT 0.5 mM, pH 7.9) geschnitten. Aiiquots der Restriktionen werden mittels FIGE überprüft und ergeben ein Maximum der erhaltenen Fragmente bei etwa 45 bzw. 30 kb. Mit einem Gradientenmischer werden in Ultrazentrifugenröhrchen lineare NaCI-Dichtegradienten von 30 % bis 5 % in 3 mM EDTA pH 8.0 hergestellt und die DNAs aufgetragen. Nach Zentrifugation für 5 h bei 37000 Upm und 25 ° C (Beckman Ultrazentrifuge L7-65, Rotor SW 41) wird der Gradient in 500 ul Fraktionen geerntet. Nur Fraktionen mit DNA von mehr als 30 kb und weniger als 50 kb werden dreimal 2 h gegen TE (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 8.0) dialysiert, mit Ethanol gefällt und in je 50 ul TE gelöst.
Als Kloniervektor wird sCos 1 (Fa.Stratagene) verwendet. Die BamHI und Xbal geschnittenen Vektorarme werden hergestellt und modifiziert, wie von Evans et al. (1989) angegeben. 1 ug davon werden mit ca. 500 ng der DNA Fragmente in 20 ul Ligationsmix (Tris-HCI 66 mM, MgCI2 5 mM, DTE 1 mM, ATP 1 mM, pH 7.5) mit 16 Einheiten T4-DNA-Ligase (Fa.Boehringer) 16 h bei 12 *C ligiert. Je 4 ul des Ansatzes werden mit Packaging-Extrakten (Gigapak, Fa.Stratagene) in Lambda Phagenhüllen verpackt. Als Wirtstamm für die Infektion wird E.coli SRB (Fa.Stratagene) verwendet, die Bakteriophagen-Lambda kompetenten Zellen werden nach Sambrook et al.(1989) hergestellt. Nach der Infektion werden die Ansätze in Aiiquots auf LB-Medium (Maniatis et al., 1982) mit 75 ug/ml Ampicillin plattiert. Rekombinante Klone werden als Kolonien nach 20 h bei 37 ° C erkennbar. Insgesamt werden ca. 50000 Kolonien erhalten, die dann in 0.9 % NaCI/20 % Glycerin suspendiert und bei -70 ”C gelagert werden. Eine Analyse von 40 willkürlich ausgewählten Klonen durch Isolierung und Restriktion der enthaltenen Cosmide ergibt, daß alle Klone rekombinante Cosmide enthalten; die durchschnittliche Insertgröße beträgt 36 kb. b Isolierung von Cosmidklonen
Die Cosmid-Genbank aus Beispiel 11a wird in einer Dichte von ca. 2500 Kolonien pro 85 mm Platte auf LB Medium mit 75 ug/ml Ampicillin (Maniatis et al., 1982) plattiert. Der Transfer auf je zwei Nylon-Membranen (Duralon UV, Stratagene) wird durchgeführt, wie bei Sambrook et al.(l989) beschrieben. Das 1.6 kb Hindill - Fragment aus Xsyn3 (siehe Abbildung 1) wird mittels "Random-Priming” (Fa.Stratagene) mit alpha-32P-dATP markiert und als Hybridisierungssonde verwendet.
Die Vorhybridisierung wird 6 h, die Hybridisierung 18 h bei 42 'C in 5 x SSC, 40 % Formamid, 5 x Denhardt's (Maniatis et al., 1982), 0.1 % SDS, 25 mM NaH2PCU pH 6.5, 250 ug/ml Heringsperma-DNA durchgeführt. Die Filter werden 2x10 min in 2 x SSC / 0.1 % SDS bei Raumtemperatur und 2 x 40 min in 1 x SSC / 0.1 % SDS bei 60 ”C gewaschen. Die Membranen werden 14 h auf Röntgenfilm (Kodak Xomatic AR) exponiert. Kolonien von positiven Signalen werden gereinigt, die entsprechende Cosmid-DNA daraus isoliert und durch verschiedene Restriktionsanalysen und Hybridisierungen mit der markierten \syn3-Sonde, sowie der Vektor-DNA sCosi charakterisiert. Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte des klonierten Bereiches eines solchen Cosmids, syncos13; die darin enthaltene Tolypocladium niveum DNA beträgt etwa 35 kb und schließt auch den Bereich von Xsyn3 ein.
Beispiel 12: Isolierung eines P1-Klons mit dem vollständigen Gen für die Cyclosporinsynthetase
Protoplasten von Tolypocladium niveum werden hergestellt, wie in Beispiel 17 beschrieben und in einer Dichte von 109/ml in TP$ suspendiert. Je 1 ml dieser Suspension wird mit 1 ml geschmolzener und auf 40 • C temperierter 1.6 % Agarose (Incert, Fa.FMC) gemischt und mittels eines Gießstandes (BioRad) in kleine, 1.5 mm dicke Blöckchen gegossen. Nach Erstarren werden die Blöckchen in Lysepuffer (0.45 H EDTA pH 8.0,1 % N-Lauroylsarkosin, 1 mg/ml Proteinase K) überführt und für 16 h bei 55 ° C inkubiert.
Die Blöckchen werden 3 x 2 h unter langsamem Schwenken in 0.5 M EDTA pH 8.0 gewaschen und bei 4 •C gelagert. Vor den entsprechenden Restriktionen werden die Blöckchen in kleine Streifen geschnitten, in Eppendorf-Röhrchen überführt und 4 x 2 h und 1 x 16 h in TE gewaschen. In vier parallelen Ansätzen werden die Blöckchen bei 4 *C in je 300 ul 1 x BamHi-Puffer (Fa.NEB), supplementiert mit 100 ug/ml Rinderserumalbumin (Fa.NEB) und 80 uM S-Adenosylmethionin 3 h auf Eis vorinkubiert. Anschließend werden je 2 Einheiten BamHI (Fa.NEB) und 16, 20, 24 bzw. 28 Einheiten BamHI-Methylase (Fa.NEB) zugesetzt, weitere 90 min auf Eis und 3 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 10
AT 398 578 B 20 mM EDTA und 0.5 mg/ml Proteinase K 30 min bei 37 · C gestoppt.
Die Blöckchen werden auf ein 1 % Agarosegel (Seaplaque, Fa.FMC) aufgetragen und die DNA-Fragmente durch Pulsfeldgelelektrophorese getrennt (Chef DR II; Fa.BioRad), 0.5 x TBE ( Maniatis et al., 1982), Switch Intervall von 8 -16 s, 150 V, 16 h, 12 *C)
Der Bereich der DNA-Fragmente zwischen 70 und 100 kb wird aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose mittels Agarase I (Fa.NEB) hydrolysiert.
Als Kloniervektor wird pNS528tet14-Ad10-SacilB (Fa.DuPont-NEN) verwendet. Die Vektorarme werden präpariert, wie bei Pierce et al.(1992) angegeben. Etwa 250 ng davon werden mit ca. 500 ng der DNA-Fraktion 16 h bei 16 *C ligiert (Durchführung wie in Beispiel 11, 15 Ul Gesamtvolumen). Nach Erhitzen der Ligation für 10 min auf 70 “C werden 4 ul Aliquots mit Pacase (Fa.DuPont-NEN) geschnitten und durch Zusatz des "Head/Tail"-Extraktes in Bakteriophagen P1 - Hüllen verpackt, wie bei Pierce und Sternberg (1991) beschrieben. Nach Infektion von E.coli NS3529 wird auf LB-Medium (Maniatis et al., 1982) mit 25 iig/ml Kanamycin und 5 % Saccharose plattiert. Rekombinante Klone werden nach Inkubation der Platten bei 37 · C für 20 h sichtbar. Insgesamt werden etwa 2000 Kolonien erhalten, die als Pool in 0.9 % NaCI / 20 % Glycerin bei -70 *C als nP1-Bank" gelagert werden.
Die Genbank ( 10 x 500 Kolonien) wird gescreent wie in Beispiel 11 (Cosmid-Klone) dargestellt. Es wird unter anderen ein positiver Klon erhalten, der alle Fragmente des Cosmid-Klones syncosl3 sowie zusätzlich noch weitere etwa 30 kb in 5'-Richtung des Cyclosporinsynthetasegens enthält.
Hybridisierung mit den aus Aminosäure-Sequenzen abgeleiteten Oligonukleotid-Gemischen (siehe Beispiel 9, sowie Durchführung Beispiel 10) zeigt, daß alle getesteten Sequenzen auf diesem P1-Klon (synp4) enthalten sind. Damit ist gesichert, daß das vollständige Gen für die Cyclosporinsynthetase auf diesem Klon synp4 enthalten ist. 11
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Beispiel 13: DNA-Teilsequenz des Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum ATCC34Q21 a Das 2890 bp große Sa/I-Restriktionsfragment, das in Fig. 1 als "S3" gekennzeichnet ist, wird sequenziert. Man erhält folgende DNA-Sequenz:
10 20 30 40 50 60 GTCGACAAGG AGGAAGCCAG CAACAAGGTG CAGGAGTGGG AGGCTCATTT CGACTCÄACT 70 80 90 100 110 120 GCATATGCCA ACATCGGGGG TATTGATCGC GATGCCCTCG GACAGGACTT CTTATCCTGG 130 140 150 160 170 180 ACATCTATGT ACGACGGCTC ATTGATTCCC CGTGAAGAGA TGCAGGAATG GCTCAACGAC 190 200 210 220 230 240 ACTATGCGCT CÄCTCCTCGA CAACCAACCA CCCGGAAAAG TGCTCGAGAT CGGAACTGGT 250 260 270 280 290 300 ACCGGTATGG TGCTGTTCAA TCTCGGCAAG GTTGAGGGAC TACAGAGCTA TGCCGGTCTT 310 320 330 340 350 360 GAGCCCTCGC GCTCCGTCAC CGCCTGGGTT AACAAGGGAA TCGAAACTTT CCCAAGCCTG 370 380 390 • 400 410 420 GCAGGAAGCG CCCGAGTCCA CG7TGGAACC GCCGAGGATA TCAGCTCCAT TGATGGACTT 430 440 450 460 470 480 CGTTCCGATC TCGTTGTGAT CAACTCAGTC GCCCAATACT TCCCAAGTCG AGAATATCTC 490 500 510 520 530 540 GCTGAGCTGA CGGCCAACTT GATTCGACTG CCCGGCGTTA AGCGTATTTT CTTCGGTGAC 550 560 570 580 590 600 ATGAGAACGT ATGCTACCAA TAAGGACTTC TTGGTGGCAC GAGCAGTCCA TACCCTAGGG 610 620 630 640 650 660 TCCAATGCAT CGAAGGCCAT GGTTCGACAA CAAGTGGCCA AGCTTGAAGA TGACGAGGAA 670 680 690 • 700 710 720 GAGTTGCTTG TTGACCCTGC CTTCTTCACC AGCCTGAGCG ACGAGTTCCC TGACGAAATC 730 740 750 760 770 780 AAGCATGTCG AAATTCTGCC AAAGAGGATG GCCGCGACCA ACGAACTGAG CTCTTACAGA 790 800 810 820 830 840 TATGCTGCTG TCATTCATGT GGGAGGCCAC CAGATGCCGA ATGGGGAGGA TGAGGATAAG 850 860 870 880 890 900 CAATGGGCTG TCAAGGATAT CAATCCGAAG GCCTGGGTGG ACTTTGCTGG CACGAGGATG 910 920 930 940 950 960 GACCGTCAGG CTCTCTTGCA GCTCCTTciG GACCGCCAAC GTGGCGATGA CGTTGTTGCC 970 980 990 1000 1010 1020 GTCAGTAACA TCCCATACAG CAAGACCÄTC ATGGAGCGCC ATCTGTCTCA GTCACTTGAT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GATGACGAGG ACGGCACTTC AGCGGTAGAC GGAACGGCCT GGATATCGCG TACGCAATCA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CGGGCGAAGG AATGCCCTGC TCTCTCAGTG GCCGACCTGA TTGAGATTGG TAAGGGGATC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GGCTTCGAAG TTGAGGCCAG CTGGGCTCGA CAACACTCCC AGCGCGGCGG ACTCGATGCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTTTTCCACC GATTCGAACC ACCAAGACAC TCAGGTCATG TCATGTTCAG GTTCCCGACT 1270 1280 1290 1300 1310 1320 GAACACAAGG GCCGGTCTTC GAGCAGTCTC ACGAATCGCC CGCTACACCT GCTTCAGAGC 12
AT 398 578 B
1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGCCGACTGG AGGCAAAGGT CGCGAGCGGC TGCAATCACT GCTTCCACCG TACATGATTC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CGTCTCGGAT CACGTTGCTC GATCAGATGC CTCTCACGTC CAACGGCÄAG GTGGATCGCA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGAAGCTTGC TCGACAAGCC CGGGTCATCC CAAGAAGTGC GGCAAGGACG TTGGACTTTG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TGGCGCCACG CACGGAAATC GAAGTCGTCC TCTGCGAAGA ATTTACCGAT CTACTAGGCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 TCAAGGTTGG CATCACAGAC AACTTCTTCG AGTTGGGCGG CCATTCGCTG CTGGCCACGA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 AACTGAGCGC ACGTCTAAGT CGCAGACTGG ACGCCGGTAT CACTGTGAAG GAGGTCTTTG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ACCAGCCAGT ACTTGCTGAT CTTGCTGCTT CTATTCTTCA AGGCTCGTCT CGTCACAGGT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CTATCCCGTC TTTACCCTAC GAAGGACCCG TGGAGGAGTC CTTTGCCCAG GGGCGCCTGT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GGTTCCTCGA CCAGTTCAAC ATCGATGCCT TGTGGTACCT TATTCCATTT GCACTCCGCA 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TGCGCGGGCC GCTGCAAGTT GACGCCCTCG CTGCTGCCCT GGTGGCACTT GAAGAGCGTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ATGAATCTCT GCGCACAACG TTTGAGGAAC GAGACGGAGT CGGCATCCAA GTGGTGGAAC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CCCTCCGCAC GACCAAGGAT ATCCGGATCA TCGACGTGTC AGGCATGCGA GACGACGACG 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CCTACCTCGA GCCATTGCAG AAAGAACAGC AGACTCCTTT CGACCTTGCT TCAGAGCCTG 2110 2120 2130 2140 2150 2160 GCTGGAGGGT AGCACTGCTG AAGCTTGGAA AGGATGACCA CATCCTCTCT ATTGTCATGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 ACCACATCAT CTCTGACGGG TGGTCTACTG AAGTCTTGCA AAGGGAACTC GGTCÄATTCT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 ACTTGGCAGC GAAATCCGGG AAAGCCCCCT TATCGCAGGT TGCCCCGCTT CCTATTCAGT 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ATCGCGATTT TGCTGTTTGG CAGAGACAAG AGGAACAGGT CGCTGAGAGT CAAAGGCAGC 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCGACTACTG GAAGAAGCAG CTTGCGGACA GTAGCCCGGC TGAGCTCTTG GCTGACTACA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 CCAGGCCGAA CGTACTGTCT GGAGAGGCAG GCAGCGTGTC TTTCGTGATC AACGATTCGG 2470 2480 2490 2500 2510 2520 TTTACAAGAG CCTCGTCTCC TTCTGCCGGT CTCGCCAAGT AACCACCTTT ACGACTTTAC ' 2530 2540 2550 2560 2570 2580 TGGCAGCGTT TCGCGCCGCT CACTATCGÄA TGACCGGGTC AGACGACGCA ACTATTGGCA 2590 2600 2610 2620 2630 2640 CGCCAATTGC CAATCGCAAC AGGCCTGAGC TTGAAAACTT GATCGGCTGC TTCGTCAATA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 CCCAGTGCAT GCGTATCACT ATCGGCGACG ATGAGACGTT TGAATCACTG GTACAACAGG 2710 2720 2730 2740 2750 2760 TACGGTCTAC CACCGCGACA GCCTTCGAGA ATCAAGACGT TCCGTTTGÄA CGAATCGTTT 2770 2780 2790 2800 2810 2820 CCACCCTCAG TGCCGGGTCC AGGGATACGT CCCGÄAACCC CCTAGTACAG CTTCTCTTTG 2830 2840 2850 2860 2870 2880 CGGTTGATTC TCAACAAGGC CTGGGCAGGA TCCAGCTCGA CGGTGTCGTC GATGAGCCGG 2890 TTCTGTCGAC 13
AT 398 578 B b Das 2482 bp große Sa/I-Restriktionsfragment, das in Fig. 1 als "S5" gekennzeichnet ist, wird sequenziert. Man erhält folgende DNA-Sequenz: 10 20 30 40 50 60 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTGCGAA GCTGAAGGAG GAGCAGCAAG CTCCTTTCÄA 70 80 90 100 110 120 TCTCTCTACT GAAGTCGCTT GGAGGGTAGC ACTCTTCAAG GCTGGAGAGA ACCACCACAT 130 140 150 160 170 180 CCTCTCTATC GTCATGCATC ACATAATTTC AGÄTGGCTGG TCAGTTGACA TCTTCCAGCA 190 200 210 220 230 240 GGAGCTTGCC CÄATTCTACT CGGTAGCTGT ACGAGGGCAT GACCCCCTTT CCCAGGTCAA 250 260 270 280 290 300 ACCGCTCCCC ATTGACTACC GCGATTTTGC TGTCTGGCAG AGAGAAGATA AGCAAGTTGC 310 320 330 340 350 360 CGTTCACGAA AGCCAACTTC AGTACTGGAT AGAGCAGCTC GCGGATAGCA CGCCAGCCGA 370 380 390 400 410 420 GATCCTATCT GATTTTAACC GACCGGAGGT CTTGTCCGGC GAAGCTGGTA CAGTTCCCAT 430 440 450 460 470 480 CGTGATCGAG GACGAGGTTT ATGAGAAGCT CTCCCTCTTC TGCCGCAATC ATCAGGTCAC 490 500 510 520 530 540 CAGCTTCGTC GTCCTTCTGG CTGCTTTCCG CGTCGCACAT TATCGCCTAA CTGGGGCAGA 550 560 570 580 590 600 GGATGCGACT ATCGGTACAC CAAT7GCGAA CCGCAACCGC CCCGAACTTG AGGACTTGAT 610 620 630 640 650 660 CGGTTTCTTT GTCAATACAC AATGCATGAG AATCGCGCTC GAAGAACACG ATAATTTCCT 670 680 690 700 710 720 ATCAGTAGTG CGAAGAGTTC GCTCAACAGC GGCAAGCGCC TTCGAAAACC AGGATGTGCC 730 740 750 760 770 780 ATTCGAGCGC CTTGTATCTG CACTTCTGCC CGGCTCTAGA GATGCCTCCC GGAATCCCCT 790 800 810 820 830 840 CGTTCAACTC ATGTTTGTCG TCCACTCCCA GCGAAATCTC GGTAAACTGC AACTGGAGGG 850 860 870 880 890 900 CTTGGAAGGC GAACCAACCC CGTACACCGC GACGACCCGC TTCGATGTTG AGTTCCACCT 910 920 930 940 950 960 CTTCGAACÄA GACAAAGGCC TCGCCGGAAA TGTTGTCTTC GCAGCAGACT TGTTCGAGGC 970 980 990 1000 1010 1020 TGCCACTATC CGCAGCGTTG TTGAAGTCTT CCACGAGATC CTCCGTCGTG GTCTCGACCA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GCCAGATATC GCÄATTTCCA CCATGCCACT TGTCGATGGC CTGGCGGCGC TCAACAGCCG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TAACTTACCC GCAGTTGAAG ACATCGAACC TGACTTCGCC ACCGAGGCCT CGGTGGTTGA 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGTCTTCCAG ACACAAGTGG TCGCTAACCC AGATGCCCTG GCTG7GACCG ACACATCCAC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AAAGCTTACA TATGCGGAGC TGGATCAACA ATCCGATCAT GTCGCGGCTT GGCTGTCCAA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ACAGAAGCTA CCAGCAGAGA GCATCGTCGT TGTTCTTGCG CCACGATCCT CTGAGACTAT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGTAGCATGC ATTGGCATCC TCÄAAGCGAA CCTCGCATAT CTCCCCATGG ATTCCAACGT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CCCCGAAGCC CGTCGCCAAG CAATTCTTTC GGAGATTCCA GGGGAGAAGT TCGTTTTGCT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 "TGGAGCAGGA GTGCCTATTC CTGACAACAA GACAGCTGAT GTCAGGATGG TCTTCATCAG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CGATATCGTC GCCAGCAAGA CAGACAAGTC CTACTCACCC GGCACTCGGC CATCTGCATC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 AAGCCTTGCC TATGTTATGT TCACATCAGG CTCGACAGGT CGGCCAAAGG GTGTCATGGT 1630 1640 1650 1660 1670 1680 14
AT 398 578 B
CGAGCATCGG GGTGTTATTT CTTTGGTGAA GCAGAACGCT TCAAGAATAC CACAAAGTCT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GCGGATGGCA CATGTTTCCA ATCTCGCATT CGATGCTTCC GTGTGGGAGA TATTGACCAC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 GCTGCTCAAT GGAGGAACGC TTTTCTGTAT CAGCTACTTT ACTGTCTTGG ACAGCAAAGC 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACTTTCTGCC GCTTTCTCCG ATCATCGCAT TAACATCACC CTGCTCCCAC CGGCCTTGCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 CAAGCAATGT CTTGCAGACG CGCCATCTGT CCTGAGCTCC CTCGAGTCTC TGTACATTGG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 AGGCGACCGC CTTGATGGAG CTGATGCAAC CAAGGTGAAG GACCTCGTCÄ AAGGCAAGGC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CTACAATGCC TACGGTCCGA CCGAGAATTC CGTCATGAGC ACGATCTATA CCATCGAACA 205Ö 2060 2070 2080 2090 2100 CG&GACTTTT GCGAATGGCG TTCCCATCGG CACATCTTTA GGCCCCAAGT CCAAGGCCTA 2110 2120 2130 2140 2150 2160 AATTATGGAC CAGGATCAGC AGCTCGTACC AGCAGGCGTG ATGGGAGAGC TTGTCGTTGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 TGGCGATGGT CTCGCACGAG GGTATACCGA TCCATCACTG AACACGGGCC GGTTCATCCA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 CATCACGATC GATGGCAAAC AAGTTCAGGC ATACCGGACC GGCGATCGAG TCAGATACCG 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ACCTAGGGAC TACCÄAATCG AGTTCTTTGG CCGTTTAGAT CAGCAGATGA AGATTCGCGG 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCATCGCATC GAGCCAGCTG AAGTGGAGCA GGCTCTTCTC AGCGACTCAT CGATCAACGA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TGCCGTTGTT GTGTCGGCAC AAAACAAGGA GGGACTCGAA ATGGTTGGTT ACATCACGAC 2470 2480 CCAGGCTGCA CAATCCGTCG AC c Aus der DNA-Sequenz von S5 (siehe b) läßt sich eine Poiypeptid-Sequenz ableiten: 15
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T C R S T D L A 10 K L K Ξ E Q Q A P F 20 N L s T E V A W R V 30 A L F K A G E N H H 40 I L s I V M H H I I 50 S D G w S V D I F Q 60 Q E L A Q F Y S V A 70 V R G H D P L s Q V 80 K P L P I H Y R D F 90 A V W Q R Q D K Q V 100 A V H E s Q L Q Y W 110 I E Q L A D S T P A 120 Ξ I L S D F N R P E 130 V L S G E A G T V P 140 I V I E D E V Y E K 150 L S L F C R N H Q V 160 T S F V V L L A A F 170 R V A H Y R L T G A 180 Ξ D A T I G T P I A 190 N R N R P E L E D L 200 I G F F V N T Q c M 210 R I A L E Ξ H D N F 220 L S V V R R V R s T 230 A A S A F E N Q D V 240 P F E R L V S A L L 250 P G S R D A S R N P 260 L V Q L M F V V H S 270 Q R N L G K L Q L Ξ 280 G L E G E P T P Y T 290 A T T R F D V E F H 300 L F E Q D K G L A G 310 N V V F A A D L F E 320 A A T I R s V V E V 330 F H E I L R R G L D 340 Q P D I A I S T M P 350 L V D G I> A A L N S 360 R N L P A V E D I E 370 P D F A T E A S V V 380 D V F Q T Q V V A N 390 P D A L A V T D T s 400 T K L T Y A Ξ L D Q 410 Q s D H V A A W L s 420 K Q K L P A E S I V 430 V V L A P R S S E T 440 I V A C I G I L K A 450 N L A Y L P M D S N 460 V P Ξ A R R Q A I L 470 S E I P G E K F V L 480 L G A G V P I P D N 490 K T A D V R M V F I 500 S D I V A S K T D K 510 S Y S P G T R P S A 520 S S L A Y V I F T S 530 G S T G R P K G V M 540 V E H R G V I S L V 550 K Q N A S R I P Q S 560 L R 16
AT 398 578 B 570 580
MAHVSNLAFDASVWEIFTTL 590 600
LNGGTLFCI SYFTVLD SKAL 610 620
SAAFSDHRINITLLPPALLK 630 640
QCLADAPSVLSSLESLYIGG 650 660
DRLDGADATKVKDLVKGKAY 670 680
NAYGPTENSVMSTIYTIEHE 690 700
TFANGVPIGTSLGPKSKAYI 710 720
MDQDQQLVPAGVMGELVVAG 730 740
DGLARGYTDP SLNTGRFIHI 750 760
TIDGKQVQAYRTGDRVRYRP 770 780
RDYQIEFFGRLDQQIKIRGH 790 800
RIEPAEVEQALLSDSSINDA 810 820
VVVSAQNKEGLEMVGYITTQ
A A Q S V D V
Beispiel 14: Vergleich der aus der DNA abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen mit den Aminosäure-Teilse· quenzen der Cyclosporin-Synthetase a Die DNA aus Beispiel 13a wird auf Grund des genetischen Codes in Aminosäuresequenzen übersetzt (d.h. Position 482 der Proteinsequenz entspricht Position 1446 der DNA-Sequenz) und mit den vorliegenden Aminosäure-Teilsequenzen (Beispiel 9) verglichen: 17
AT 398 578 B AS-Teilsequenz 13 L A R Q A R V I P R S A A S T L D F V A L 482 A R Q A R V I P R S A A S T L D F V A 501 AS-Teisequenz 16 L Q S L L P P Y M I P s R I T L L D L 447 Q S L L P P Y M I P s R I T L L D 467 (Die Position 1 der AS-Teilsequenz asl6 (Beispiel 9) stimmt mit der aus der DNA abgeleiteten AS-Sequenz nicht überein.) AS-Teilsequenz 9 LWFLDQFNIDALXYLIPFAL LWFLDQFNIDALWYL IPFAL 618 ic (Die Position 13 der AS-Teilsequenz as9 ("X"; Beispiel 9 konnte nicht bestimmt werden.) b Die Aminosäuresequenz aus Beispiel 13 c wird mit den Aminosäureteilsequenzen aus Beispiel 9 verglichen: AS-Teilsequenz 5 355 372
N Ί» P A V E D IEPDFATEASV NLPAV-ED IEPDFATEASV c Vergleich der AS-Teilsequenz abgeleitet aus der DNA-Sequenz von Beispiel 13 a (AS-Positionen 685 bis 945) mit der AS-Teilsequenz aus Beispiel 13 c (AS-Positionen 10 bis 270): 18
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L 1 Q K Ξ I Q f Q 1 T P 1 F 1 D L I A S E | P G w I R V I A I 1 L K E 1 E 1 Q 1 Q A 1 P 1 F N 1 L S T 1 E V A 1 w i R 1 V 1 A L I L K L G I K D D H I I 1 L I S 1 I 1 V I M 1 H 1 H I I I I 1 S I 1 L F 1 K A 1 G E N H I H 1 I 1 L 1 s 1 I 1 V 1 M 1 H 1 H 1 I 1 I 1 s D I G I w I S I T E V L Q 1 R Ξ I L I G Q 1 F 1 Y I L A A 1 K 1 D 1 G 1 w 1 s V D I F 1 Q Q 1 E 1 L A 1 Q I F 1 Y S V 1 A V S I G K A | P 1 L 1 s 1 Q I V 1 A P 1 L I P I I I Q Y I R I D 1 F 1 A I 1 R G H 1 D 1 P 1 L 1 s 1 Q 1 V K 1 P 1 L 1 P 1 I H 1 Y I R 1 D 1 F 1 A V I W | Q 1 R 1 Q I Ξ Ξ Q l V 1 A I A E S Q R Q 1 L I D Y I W 1 K 1 V 1 W 1 Q 1 R 1 Q D K 1 Q 1 V V H E S 1 Q 1 L Q 1 Y 1 w I K Q L A I D I S 1 s P A I E | L L 1 A D | Y T R I P | N V I E 1 Q 1 L 1 A 1 D 1 s T 1 P 1 A 1 Ξ I I L S 1 D F N 1 R 1 P Ξ 1 V L I S 1 G I E I A I G 1 s V I S F V | I 1 N D 1 S V | Y | K S L 1 1 L 1 s 1 G 1 E I A 1 G T 1 V P I 1 V 1 X E 1 D Ξ 1 V 1 V Ξ K 1 L V s F 1 C 1 R 1 S R Q I V I T 1 T F I T T L 1 L I A | A 1 F I R 1 S L 1 F 1 c 1 R N H 1 Q I V 1 T s 1 F V V 1 L 1 L 1 A 1 A 1 F 1 R A A I H | Y I R 1 M T I G | s D D I A | T I I G I T I P I I I A I N 1 V 1 A 1 H 1 Y 1 R L 1 T 1 G A Ξ 1 D 1 A 1 T 1 I 1 G 1 T 1 P 1 I 1 A i N 19
AT 398 578 B R 1 N 1 R 1 P 1 Ξ I L I Ξ 1 N L J I 1 G I c F 1 V 1 N T I Q 1 c I M I R 1 1 R I N I R 1 P 1 E 1 L 1 E D ( L 1 I 1 G F 1 F 1 V 1 N 1 T 1 Q 1 c 1 M 1 R I 1 T I G D D Ξ T F 1 E S 1 L V I Q Q V | R t s I T I T 1 I A L Ξ Ξ H • D N 1 F L 1 s V 1 V R R 1 V 1 R 1 s 1 T A A 1 T A 1 F 1 Ξ 1 N 1 Q 1 D 1 V 1 P 1 F 1 Ξ 1 R 1 I V 1 s 1 T L 1 s A A S A F E N Q D V P F Ξ R L V s A L L P 944 6 | S I R 1 D t T S f R 1 N 1 P I L 1 V I Q 1 L I L F I A V t H 1 S I Q I 1 6 1 s 1 R 1 D A 1 s 1 R 1 N 1 P 1 L -1 V 1 Q 1 L • M 1 F V 1 V 1 H 1 S 1 Q 270
Insgesamt sind 178 von 261 Aminosäuren identisch ( = 68,2%), gekennzeichnet durch weitere Aminosäurereste sind funktionell ähnlich, gekennzeichnet durch
Beispiel 15: Isolierung von RNA aus dem Mycel von Tolypocladium niveum und Northernhybridisierung
Ein 11-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Medium 4 (Dreyfuss et al., 1976) wird mit einer Sporensuspension von Tolypocladium niveum ATCC34921 beimpft (1x107 Sporen/ml) und 96 h bei 250 Upm und 25 *C geschüttelt. 11-Erlenmeyerkolben mit 100ml Medium 5 (Dreyfuss et al. , 1976) werden mit 10 ml der Vorkultur beimpft und 7 Tage bei 25 · C und 250 Upm geschüttelt. Die Konzentration von Cyclosporin A wird bestimmt (Dreyfuss et al., 1976). Erreicht werden 100 ug/ml. Aus 8 g Mycelfeuchtmase wird RNA isoliert, dazu wird das Mycel abfiltriert, mit TE (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1mM EDTA) gewaschen und unter flüssigem Stickstoff in einer Reibschale zu einem feinem Pulver zerrieben. Die RNA-Isolierung erfolgt nach der von Cathala et al. (1983) beschriebenen Methode. Erhalten werden 4 mg RNA, die bei -70 "C aufbewahrt wird. 10 ug der RNA werden auf einem denaturierenden 1,2%igem Agarose-Gel, das 0,6 M Formaldehyd enthält, aufgetrennt. Der Elektrophorese-Puffer ist 0,2 M MOPS, 50 mM Natriumazetat, 10mM EDTA, pH 7,0. Die RNA wird in einem Puffer gelöst, der aus 0,72 ml Formamid, 0,16 ml 10fach konzentriertem Elektrophorese-Puffer, 0,26 ml Formaldehyd, 0,18 ml Wasser und 0,10 ml Glycerin gemischt wird. Die Proben werden 2 min auf 100 °C erhitzt und bei 115 V, 100 mA 2h aufgetrennt. Das Gel wird dreimal 20 min in 10xSSC geschüttelt, auf Hybond N-Filter geblottet und durch UV-Behandlung fixiert. Die Hybridisierung wird bei 42 °C in 6xSSPE, 50% Formamid, 5xDenhard's Lösung, 0,1% SDS, 100 ug/ml denaturierte Heringssperma-DNA, 100 u.M ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA (Teilfragmente der in den Beispielen 9 bis 12 beschriebenen Monierten DNAs) werden vor der Hybridisierung 5 min auf 100*C erhitzt und in Eis abgekühlt. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min in 2xSSC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 0,2xSSC, 0,1%SDS bei 65 "C. Die getrockneten Filter werden autoradio-grafiert. Ist das als Sonde verwendete Fragment ein Teilfragment des Cyclosporin-Synthetase-Gens läßt sich nach 24 - 72 h Autoradiografie bei -70’C auf dem Roentgenfilm eine Bande nachweisen, die eine deutlich geringere Mobilität aufweist als das größte der verwendeten Moleküle der Vergleichs-RNA (9500 b; RNA-Ladder, BRL). Fig.1 faßt das Ergebnis solcher Hybridisierungen zusammen: Relativ zur Restriktionskarte eines X-Klons, dessen Isolierung in Beispiel 10 beschrieben wurde, sind die Positionen einzelner Restriktionsfragmente angegeben, die als Sonden in Northern-Hybridisierungen eingesetzt wurden. Die ausgefüilten Rechtecke symbolisieren, daß die oben beschriebene Bande nachgewiesen werden kann (E2, E3, E1, S3, S5), während die Rechtecke mit den Querstrichen für solche Fragmente stehen, die nicht mit einer solchen Bande hybridisieren (E4, S2).(Das Fragment S4 wurde nicht als Sonde eingesetzt). 20
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Beispiel 16: Identifizierung von homologen Synthetase-Genen
Aus verschiedenen Pilzstämmen wird DNA isoliert: 100ml Medium 1 (Dreyfuss et al.,1976) werden mit 1x108 Pilzsporen beimpft und 72 h bei 25 °C und 250Upm geschüttelt. Das Mycel wird abfiltriert, mit TE gewaschen und lyophilisiert. In einem Eppendorf-Homogenisator werden 100mg lyophilisiertes Mycel zu 700 ul Lysis-Puffer (200 mM Tris-Cl pH 8,5, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS) und 100 mg Aluminiumoxid-Pulver (SigmaA2039) gegeben und homogenisiert. Dann werden 500 ul Phenol-Chloroform zugegeben und kräftig durchmischt. Nach 15 min zentrifugieren wird die Extraktion wiederholt. Zum Überstand werden 0,1 xVolumen 3 M Natriumazetat pH5,2 und 0,6x Volumen i-Propanol zugegeben und durchmischt. 5 min Zentrifugation; das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, kurz getrocknet und in 100 ul TE mit 100ug/ml RNase gelöst und 15 min bei 37'C inkubiert. Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung werden wiederholt.
Jeweils 5 ul dieser DNAs werden mit Xho\ gespalten, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf Nylon-Filter geblottet. Diese Filter werden mit 32P-markierter XSYN3-DNA als Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt, wie sie in Beispiel 10 beschrieben sind ("Genomic waiking"). Die Hybridisierungen können aber auch unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Mit DNA aus Tolypocladium niveum werden folgende hybridisierende Banden erhalten (alle Angaben sind Schätzungen auf Grund der Mobilität im Gel): 3,6kb, 3,4 kb, 3,2kb, 3,0kb, 2,3 kb, 1,9kb und 0,7kb. DNA aus Fusarium solar)i ATCC 46829 zeigt ebenfalls Banden mit 3,6kb, 3,4kb, 1,9kb und 0,7kb, außerdem eine weitere Bande mit etwa 2,lkb. Auch DNA aus Neocosmospora vasinfecta ATCC24402 zeigt die Banden mit 3,6kb, 3,4kb, 1,9 kb und 0,7kb und darüber hinaus zwei Banden mit 2,9kb und 1,8 kb. DNA aus Tolyocladium geodes, Acremonium sp. S42160/F, Paecilomyces sp. S84-21622/F, Verticilli-um sp. 85-22022/F (Dreyfuss, 1986) zeigen jeweils mehrere hybridisierende Banden im Bereich 0,7kb bis 7 kb.
Beispiel 17: Protoplastierung und Transformation von Tolypocladium niveum a Methode 1 : 200 ml Medium 1 ( Maltose (Monohydrat) 50 g/l, Caseinpepton, tryptisch verdaut (Fluka 70169) 10 g/l, KH2PO* 5 g/l, KCl 2.5 g/l pH 5.6) in einem Erlenmeyerkolben werden mit 109 Sporen von Tolypocladium niveum beimpft und bei 27 eC, 250 Upm für ca. 70 h inkubiert. Es werden 200 wl (0.1 %) ß-Mercaptoethanol zugesetzt und weitere 16 h inkubiert. Das Mycel wird durch Zentrifugation geerntet (Beckman Zentrifuge J2-21, Rotor JA14, 8000 Upm, 20 *C, 5 min), in 40 ml TPS (NaCI 0.6 M, KH2PO* / NaiHPO* 66 mM pH 6.2) gewaschen und das Pelletvolumen durch Zentrifugation in kalibrierten Röhrchen bei 2000 g,(in Beckman Zentrifuge GPR, Rotor GH3.7, 3000 Upm, 5 min) abgemessen. Das Mycel wird in TPS suspendiert (je 1 ml Pelletvolumen werden 3 ml TPS verwendet) und das gleiche Volumen Protopla-stierungslösung zu gesetzt (Novozym 234 10 mg/ml (Fa. Novo Industri, Charge PPM-2415), Cytohelicase 5 mg/ml (Fa. IBF), Zymolyase 20T 1 mg/ml (Fa. Seikagaku Kogyo, C.No.120491) in TPS). Es wird bei 27 ’C und 80 Upm für ca. 60 min inkubiert. Die Protoplasten werden durch Milchfilter filtriert, abzentrifugiert (700 g, 10 min) und in insgesamt 4 ml TPS aufgenommen. Je 1 ml dieser Suspension wird auf 4 ml 35% Saccharose-Lösung aufgetragen und bei 600 g, 20 * C, für 20 min zentrifugiert. Die Protoplasten-Banden an der Phasengrenzfläche werden abgezogen, mit TPS auf je 10 ml verdünnt, abzentrifugiert, in je 200 ul TPS vorsichtig resuspendiert und die Suspensionen vereinigt. Pro 1 ml Pelletvolumen Ausgangsmycel (siehe oben) werden ca. 2 * 10s Protoplasten erhalten.
Die Protoplastensuspension wird abzentrifugiert (700 g, 10 min) und in 1 M Sorbit, 50 mM CaCb in einer Dichte von 1x108 suspendiert. Jeweils 90 ul dieser Suspension werden mit 10 ui der zu transformierenden Vektor-DNA, die das amdS-Gen aus Aspergillus nidulans enthält, z.B. Plasmid p3SR2 (Hynes et al., 1983), (1 - 10 ug, gelöst in Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) versetzt und 25 Ul PEG 6000-Lsg zugegeben (25 % PEG 6000, 50 mM CaCI2, 10 mM Tris-HCI, pH 7.5, frisch hergestellt aus den Stammlösungen: 60 % PEG 6000 (Fa.BDH), 250 mM Tris-HCI pH 7.5, 250 mM CaCI2). Der Transformationsansatz wird 20 min auf Eis gestellt und anschließend werden weitere 500 ul der gemischten PEG 6000-Lösung zugegeben und vorsichtig durchmischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wird 1 ml 0.9 M NaCI, 50 mM CaCl2 zugesetzt, der ganze Ansatz zu 7 ml aufgeschmolzenem und auf 45 “C temperiertem Weichagar TMMAAC + N gegeben und auf vorgewärmte TMMAAC + N Platten ausgegossen. Medium TMMAAC + N enthält Glukose 6 g/l, ΚΗ2ΡΟ< 3 g/l, KCl 0.5 g/l, MgSO* ’ 7 H20 0.4 g/l, CaCI2 * 2 H20 0.2 g/l, Acrylamid 8 mM, CsCI 2.1 g/l, Spurenelement-Lösung 1 ml/l, 0.6 M NaCI; für Platten werden 15 g/l für 21
AT 398 578 B
Weichagar 7 g/l Agar-Agar (Merck) zugesetzt. Die Spurenelement-Lösung enthält 1 mg/ml FeSO* * 7 H2O, 9 mg/ml Zn SO* * 7 H2O, 0.4 mg/ml CuSOt * 5 H2O, 0.1 mg/ml MnSCk * H20, 0.1 mg/ml H3BO3 und 0.1 mg/ml NazMoO* ’ H2O. Transformanten sind in der Lage, Acrylamid als Stickstoffquelle im Medium zu nutzen und können daher nach etwa drei Wochen bei 25 *C als Kolonien gegenüber schwachem Hintergrundwachstum identifiziert werden. b Methode 2:
Es werden zweimal je 4,0 ml der Tolypoclacfium niveum-Sporen (ATCC34921; 5x10®/ml) in einen 11-Erlenmeyerkolben mit 200 ml Medium 1 ( 50 g/l Maltose(Monohydrat), 10 g/l Caseinpepton, tryptisch verdaut, FLUKA 70169, 5 g/l KH2PO4, 2,5 g/l KCl, pH5,6) gegeben und bei 25*C bei 250 Upm 65 h geschüttelt.Das Mycel wird über eine sterile Porzellanfritte mit Nylon-Gaze GMX abfiltriert und mit TE (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1mM EDTA) nachgewaschen und in 40 ml YG (5g/l Hefe Extrakt, 20 g/l Dextrose ) resuspendiert. Zentrifugation: 900xg; 20 *C; 5 min. Das Pellet wird in YG (ca. 1ml Pellet in 5 ml) resuspendiert; zu 5ml Suspension werden 5ml Protoplastierungslösung zugegeben. Die Protoplastierungslö-sung wird aus einer Lösung hergestelit, die 1,1M KCl und 0,1 M Zitronensäure enthält. Der pH 5,8 wird mit KOH eingestellt. Driselase (Sigma D9515) wird zugegeben (I5mg/ml; Lagerung bei - 200 C); die Suspension bleibt 15 min im Eis: Entfernung des Stärke-Carriers durch Zentrifugation : 5 min 2000 Upm, Novozym wird zugegeben (4mg/ml), Rinderserumalbumin (Sigma A7096, 20mg/ml). Diese Lösung wird durch Millipore SLGV025LS filtriert und bleibt bis zur Verwendung im Eis. Bei 37 *C wird 2,5 h geschüttelt bei 250 Upm. Die Präparation wird durch ein Milchfilter filtriert. Die Protoplasten werden abzentrifugiert (700g; 20 * C; 5 min) und in STC (1,2M Sorbit, 50 mM CaCt, 10 mM Tris-HCI pH7,5) vorsichtig resuspendiert. 5ml 35%ige Saccharose-Lösung werden mit der Suspension vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (600g; 20 · C; 20 min). Die Banden werden abgezogen und auf ca.5ml mit STC verdünnt. Aus 200 ml Kultur werden 2x10® Protoplasten erhalten. 50 ul der Protopiastensupension (1x10® /ml) werden in ein steriles Eppendorfgefäß geben; zugegeben werden 5 ug Plasmid-DNA in TE und 12,5 ul PEG-Lösung (20% PEG4000, 50mM CaCh, 10mM Tris-HCI pH7,5. Diese Lösung wird aus separat autoklavierten Stammlösungen gemischt: 1 M CaCb, 1M Tris-HCI pH7,5, 60% PEG4000 (Riedel de Häen). Nachdem die Mischung 20 min im Eis stand, werden 0,5ml der PEG-Lösung zugegeben und vorsichtig durchmischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wird 1ml 0,9M NaCI, 50mM CaCb vorsichtig dazugemischt. Die Suspension wird in 10ml TM88-Sorbit-Weichagar (20 g/l Malzextrakt, 4 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bacto Agar, 218 g/l Sorbit, pH5,7) (45'C) gegeben und auf TM88-Sorbit-Platten (10ml TM88-Sorbit-Agar: 20 g/l Malzextrakt,4 g/l Hefeextrakt, 30 g/l Bacto Agar, 218 g/l Sorbit, pH5,7) ausgegossen. Nach 15 - 20h bei 25 °C werden 10ml TM88-Sorbit-Agar mit 600 ug/ml Hygromycin (45 · C) aufgegossen.
Hygromycinresistente Transformanten lassen sich nach 7 Tagen bei 25 eC nachweisen.
Beispiel 18: Konstruktion des Vektors pSIM10 und Transformation mit diesem Plasmid a Isolierung des Cyclophilin-Gens aus Tolypocladium niveum
Wie in Beispiel 10 beschrieben, wird die Tolypocladium niveum-Genbank mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde gescreent. Die Hybridisierung wird bei 42 *C in 6xSSPE, 30% Formamid, 5xDen-hard's Lösung, 0,1% SDS, 100 u.g/ml denaturierte Heringssperma-DNA, 100 uM ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA (Teilfragmente der DNA des Cyclophilin-Gens aus Neurospora crassa, Tropschug et al., 1988) werden vor der Hybridisierung 5 min auf 100 *C erhitzt und in Eis abgekühit. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min in 2xSSC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 1xSSC, 0,1% SDS bei 45 *C. Die getrockneten Filter werden autoradiografiert. Die gereinigte DNA von λ-Phagen, wird in Plasmide subkloniert und durch Restriktionskartierung, Southernhybridisierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert. Folgende DNA-Sequenz wird erhalten: 22
AT 398 578 B 10 20 30 40 50 60 CTTCTCCGCA ACATCAGCAA TCATGGGCAA CAAAGTCTTC TTCGACATTG AGTGGGAGGG 70 80 90 100 110 120 CCCCGTCATG CAGGGCGGCA AGCCTACCTC TACCGTCAAA GAGCAGTCTG GTCGCATCAA - 130 140 150 160 170 180 CTTCAAGCTG TACGATGACG TCGTCCCCAA GACCGCGAGA AACTTCCGCG CTCTCTGCAC 190 200 210 220 230 240 GGGCGAGAAG GGCTTCGGCT ACGAGGGCTC GTCCTTCACG TATACTCCCG AGTTCATGCT 250 260 270
CAGGGCGGCG ACTTACCCGC GTAACGGCAC TGGCGCTA
Abbildung 2 zeigt ein 2,7kb großes EcoRI-H/ndlll-Fragment, das diese Sequenz umfasst. Die Sequenz ist durch ein Rechteck "CyT" dargestellt. Da die dargestellte Sequenz homolog zum 5'-Ende des Cyclophilin-Gens von N. crassa ist, handelt es sich bei dem ATG [23,24,25] um das Startcodon. Die in Fig. 2 gezeigte DNA enthält also den Promotor dieses Gens. b Konstruktion des Vektors pSIM10 und Transformation mit diesem Plasmid
Auf Grund der in Beispiel 18a wiedergegebenen DNA-Sequenz wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das folgende Sequenzen aufweist: 5' GAAGACTTTGTTATCGATGATTGCTGAT 3'
Dieses Oligonukleotid ist weitgehend komplementär zu der in Beispiel 18a9 gezeigten Sequenz (Pos. 13 bis 43); allerdings wird der Bereich des ATGs (23-25) so verändert, daß eine C/al-Schnittstelle entsteht (ATCGAT). Ein zweites Oligonukleotid enthält eine Sequenz des Plasmides pUCl8 und eine Erkennugsse-quenz für BamHl: 5’ GGGATATCGTGAATTGTAATACGACTCACTATA 3'
Ein Plasmid, welches das 2,7 kb EcoRI-H/ndlll-Fragment aus Beispiel 18a kloniert in pUCl8 enthält, wird mit Hindlll linearisiert. 1 ng der Plasmid-DNA werden mit den oben beschriebenen Oligonukleotiden amplifiziert (Sambroock et al., 1989): 30 Zyklen: 1 min 30 sec 94 “C; 2 min 30 sec 50 ” C; 6 min 72 *C. Es entsteht eine DNA von 2,1 kb. Diese DNA wird nach Chloroform-Extraktion durch Ultrafiltration (Ultrafree MC 100 000; Millipore) gereinigt und im entsprechenden Puffer mit den Enzymen C/al und BamHl gespalten. 50 ng dieser DNA werden mit 50 ng BamHl und C/al-gespaltener DNA des Plasmides pGEM7Zf (Promega) ligiert. Das neu entstandene Plasmid wird mit C/al und Xbal gespalten und mit einem 1,76 kb großen C/al-.Yöal-Restriktionsfragment aus dem Plasmid pCSN44 (Staben et al., 1989) ligiert. Eine Restriktionskarte dieses Plasmides (pSIM10) ist in Abbildung 3 wiedergegeben.
Das Plasmid pSIM10 kann zur Transformation von Tolypocladium niveum verwendet werden, wie in Beispiel 17 beschrieben. DNA aus Transformanten wird mit BamHl gespalten und nach Gelelektrophorese auf eine Nylon-Membran geblottet. Als radioaktive Sonde wird das 1,8 kb ßg/lI-Fragment aus pSIM10 (Abb.3) verwendet. Unter den Transformanten lassen sich so solche identifizieren, bei denen das Plasmid pSIM10 ein- oder mehrmals im Genom integriert vorliegt.
Figuren beschriebung :
Fig. 1: Restriktionskarte des in XSYN3 Monierten Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum.
Relativ zu einer Skala (2.0, 4.0, 6.0,..Kb) ist die Lage von einigen Restriktionsschnittstellen wiedergegeben. Darunter sind als Rechtecke verschiedene in Plasmide subklonierte Teilfragmente symbolisiert (S5, E3, S3,..). Ist das entsprechende Rechteck ausgefüllt, bedeutet dies, daß das entsprechende DNA-Fragment bei Northern-Hybridisierungen mit einer hochmolekularen RNA reagiert (S5, E3, S3, E1, E2). Rechtecke mit Längslinien: In Northern-Hybridisierungen wurden keine Banden erhalten (E4, S2). Leere Rechtecke: die DNA wurde nicht als Sonde eingesetzt (S4).
Die beiden folgenden Tabellen geben die in Fig. 1 gezeichneten Fragment- (S5, H2,..) und Enzympositionen in bp an: 23
AT 398 578 B
Start Ende Name 1 2500 S5 1300 3300 H2 2000 5400 E3 2500 5300 S3 4700 11750 H3 5300 8400 S4 5400 7000 E1 7000 9200 E2 9200 12100 E4 10250 13850 S2
ENZYME
Sali 1, Hindlll 1300, EcoRI 2000, Sali 2500, Hindlll 3300, Hindlll 3800, Hindlll 4700, Sali 5300, EcoRI 5400, EcoRI 7000, Sali 8400, EcoRI 9200, Sali Sali 10250, 13850 Hindlll 11750, EcoRI 12100,
Fig. 2: Restriktionskarte des Cyclophilin-Promotor-Fragmentes.
Wiedergegeben ist die Restriktionskarte eines 2,7 kb großen DNA-Fragments (Skala in bp). Das Rechteck "CyT" entspricht der 278 bp DNA-Sequenz, die in Beispiel 18 wiedergegeben ist.
Die DNA links davon wird zur Konstruktion des Plasmides p SIM10 ( Beispiel 18) benutzt.
Fig. 3: Restriktionskarte von Plasmid pSIMIO
Konstruktion und Struktur des Plasmides sind in Beispiel 18 beschrieben. Die Positionen sind in bp wiedergegeben. 4714 - 6882: DNA aus Tolypocladium niveum enthält den Promotor des Cyclophilin-Gens. 6882 -1761: enthält das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen aus dem Plasmid pCSN44 (Staben et al. 1989). 1761 - 4714: pGEM7Zf (Promega Inc.).
Fig. 4: Restriktionskarte des in syncosl3 klonierten Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum.
Die Lage einiger Restriktionsschnittstellen ist dargestellt. Die Lage des in Xsyn3 klonierten Teiles ist durch den schraffierten Balken markiert.
Alle in den Fig. 1, 2, 3 und 4 gezeigten Restriktionskarten sind nur ungefähre Wiedergaben von Restriktionsschnittstellen in DNA-Molekülen. Die gezeichneten Abstände sind proportional zu den tatsächlichen Abständen, aber die tatsächlichen Abstände können sich davon unterscheiden. Nicht alle Restriktionschnittsteilen sind wiedergegeben, es können durchaus weitere Schnittstellen vorhanden sein.
Verwendete Abkürzungen: uCi Mikrocurie ug Mikrogramm m Mikroiiter ACV Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin amdS Acetamidase-Gen as Aminosäure ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat 24
AT 398 578 B bp Basenpaare DNA Desoxyribonukleinsäure DTE Dithioerythrit DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA' Aethylendiamintetraessigsäure FIGE Feldinversionsgelelektrophorese FPLC Fast Performance Liquid Chromatography 9 Gramm (g/v)% Gewicht/Volumen in % h Stunden HEPES N-2-Hydroxyethyl-piperazine-N-2-propansulfonsäure HP-RPC High Pressure - Reversed Phase Chromatography kb Kilobase; 1000 Nukleotide kDa Kilodalton I Liter mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mM Millimolar MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure Mr relative Molmasse N. crassa Neurospora crassa ng Nanogramm PEG Polyethylenglykol pfu plaquebildende Einheiten pH pH-Wert RNA Ribonukleinsäure SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese sec Sekunden SSC 150 mM NaCI, 15 mM Natriumzitrat, pH7,0 SSPE 180 mM NaCI, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH7,7 TE 10 mM Tris-Cl pH 7.5,1 mM EDTA * TFA Trifluoressigsäure Tris T ris(hydroxymethyl)aminomethane Upm Umdrehungen pro Minute V Volumen (v/v)% Volumen Prozent YAC Yeast artificial chromosome •c Grad Celsius Außerdem werden die für Restriktionsendonukleasen üblichen Abkürzungen
Eco RI, Hind\\\, Cla\,..\ Maniatis et al., 1982). Für DNA-Sequenzen werden die Nukleotid-Abkürzungen A, T, C, G und für Polypeptide die Aminosäure-Abkürzungen (Arg, Asn, Asp, Cys,..; b.z.w. R, N, D, C,...) benutzt (Sambroock et al., 1989).
Literaturliste: T. H. Aarnio and S. N. Agathos (1989)
Production of Extracellular Enzymes and Cyclosporin by Tolypocladium-Inflatum and Morphologically Related Fungi, BIOTECHLET11 (1989) Nr. 11, S. 759-764. T. H. Aarnio and S. N. Agathos (1990),
Pigmented Variants of Tolypocladium-Inflatum in Relation to Cyclosporin-A Production,
Appl Microbiol Biotechnol 33 (1990) Nr. 4, S. 435-437. A. Billich and R. Zocher (1987)
Enzymatic Synthesis of Cyclosporin A J. Biol. Chem. 262, 36, 17258-17259 25
AT 398 578 B P.F. Cannon (1986)
International Commission on the taxonomy of fungi (ICTF): name changes in fungi of microbiological, industrial and medical importance. Part 2 Microbiological Sciences 3 (1986) Nr. 9, S. 285-287. G. T. Chun and S. N. Agathos (1991)
Comparative Studies of Physiological and Environmental Effects on the Production of Cyclosporin-A in Suspended and Immobilized Cells of Tolypocladium-Infiatum,
Biotechnol Bioeng 37 (1991) Nr. 3, S. 256-265. M. Dreyfuss, E. Harri, H. Hofmann, H. Kobel, W. Pache and H. Tscherter (1976)
Cyclosporin A and C
European J. Appl. Microbiology 3 (1976), S. 125-133. Μ. M. Dreyfuss (1986)
Neue Erkentnisse aus einem pharmakologischen Pilz-Screening,
Sydowia 39 (1986), S. 22-36. G. A. Evans, K. Lewis and B. E. Rothenberg (1989)
High efficiency vectors for cosmid microcloning and genomic anaiysis,
Gene 79 (1989) 9 - 20. S. Gutierrez, B. Diez, E. Montenegro and J. F. Martin (1991)
Characterization of the Cephaiosporium acremonium pcbAB Gene Encoding a-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valine Synthetase, a Large Multidomain Peptide Synthetase: Linkage to the pcbC Gene as a Cluster of Early Cephalosporin Biosynthetic Genes and Evidence of Multiple Functional Domains J. Bacteriol. 173, 2354-2365 M. J. Hynes, C. M. Corrick and J. A. King (1983)
Isolation of genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the anaiysis of structural and regulatory mutations.
Molec.Cell.BiOl. 3 (1983) 1430-1439 C. E. Isaac, A. Jones and Μ. A. Pickard (1990)
Production of Cyclosporins by Tolypocladium-Niveum Strains, ANTIM AG CH 34 (1990) Nr. 1, S. 121-127. K. D. Jofuku and R. B. Goldberg, Analysis of plant gene structure, in: Plant molecular biology. a practical approach (C. H. Shaw, Hrsg.), 1. Aufl., IRL press, Oxford 1988, S. 37- 66. H. Kleinkauf and H. v. Döhren (1990)
Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics Eur. J. Biochem. 192,1-15 H. Kobel and R. Traber (1982)
Directed biosynthesis of Cyclosporins,
European J. A.ppi. Microbioi. Biotechnol. 14 (1982), S. 237- 240. J. Kraetzschmar, M. Krause and Μ. A. Marahiel (1989)
Gramicidin S Biosynthesis Operon Containing the Structural Genes grsA and grsB has an Open Reading Frame Encoding a Protein Homologous to Fatty Acid Thioesterases J. Bacteriol 171, 5422-5429 U. K. Laemmli (1970)
Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227, 680 - 685 A. Lawen, R. Traber, D. Geyl, R. Zocher and H. Kleinkauf (1989)
Cell-Free Biosynthesis of New Cyclosporins J. Antibiotics 42, 8, 1283-1289 A. Lawen, J. Dittmann, B. Schmidt, D. Riesner and H. Kieinkauf (1992)
Enzymatic biosynthesis of cyclosporin A and analogues Biochimie 74, in press A. Lawen and R. Zocher (1990)
Cyclosporin Synthetase. The Most Complex Peptide Synthesizing Multienzyme Polypeptide So Far Descri-bed J. Biol. Chem. 265, 19,11355-11360 J. Lee and S. N. Agathos (1991)
Dynamics of L-Valine in Relation to the Production of Cyclosporin-A by Tolypocladium-Infiatum,
Appl Microbioi Biotechnol 34 (1991) Nr. 4, S. 513-517. A. P. McCabe, H. v. Liempt, H. Palissa, Μ. B. R. Riach, E. Pfeifer, H. v. Döhren and J. R. Kinghorn (1991) 26
AT 398 578 B 5-(L-a-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Aspergillus nidulans. Molecular characterization of the acvA gene encoding the first enzyme of the penicillin biosynthetic pathway J. Biol. Chem. 266, 12646 T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambroock, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor 1982/1. H. Nakajima, T. Hamasaki, k. Tanaka, Y. Kimura, S. Udagawa and Y. Horie (1989)
Production of Cyclosporin by fungi belonging to the genus Neocosmospora,
Agric. Biol. Chern. 53 (1989) Nr. 8, S. 2291-2292. J. C. Pierce and N. Sternberg (1991)
Using the bacteriophage P1 System to clone high molecular weight (HMW) genomic DNA,
Methods Enzymol. In press J. C. Pierce, B. Sauer and N. Sternberg A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 System: Improved cloning efficacy.
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 2056 - 2060. J. Sambroock, E.F.Fritsch and T. Maniatis Molecular Cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989/2 J. J. Sanglier, R. Traber, R. H. Buck, H. Hofmann and H. Kobel (1990)
Isolation of (4R)-4-<(E)-2-Butenyl>-4-Methyl-L-Threonine, the Characteristic Structural Element of Cyclospo-rins, from a Blocked Mutant of Tolypocladium-Infiatum, JAntibiot 43 (1990) Nr. 6, S. 707-714. D. J. Smith, A. J. Earl and G. Turner (1990)
The multifunctional peptide synthetase performing the first Step of penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum is a 421.073 dalton protein similar to Bacillus brevis peptide antibiotic synthetases EMBO J. 9, 2743-2750 C. Staben, B. Jensen, M. Singer, J. Pollock, M. Schechtman, J. Kinsey and E. Selker (1989)
Use of a bacterial Hygromycin B resistance gene as a dominant selectable marker in Neurospora crassa transformation,
Fungal Genetics Newsletter 36 (1989), S. 79. S. Tada, K. Gomi, K. Kitamoto, H. Takahashi, G. Tamura und S. Hara (1991)
Construction of a Fusion Gene Comprising the Taka-Amylase- A Promoter and the Escherichia-Coli beta-Glucuronidase Gene and Analysis of Its Expression in Aspergillus-Oryzae,
Mol Gen Genet 229 (1991) Nr. 2, S. 301-306. M. Tropschug, D.W. Nicholson, F. Hartl, H. Köhler, N. Pfänner, E. Wächter and W. Neupert (1988) Cyclosporin A-binding Protein (Cyclophilin) of Neurospora crassa. One gene codes for both the cytosolic and mitochondrial forms.
Journal of Biological Chemistry 263 (1988) Nr. 28, S. 14433-14440. K. Turgay, M. Krause, and Μ. A. Marahiel (1992) 4 Homologous Domains in the Primary Structure of GrsB Are Related to Domains in a Superfamily of
Adenylate-Forming Enzymes
Molecular Microbiol. 6, 4, 529-546 R. Weckermann, R. Fuerbass and Μ. A. Marahiel (1988)
Complete nucleotide sequence of the tycA gene encoding the tyrocidine synthetase 1 from Bacillus brevis Nucleic Acids Res. 16,11841 W.l. Wood, J. Gitschier, L.A. Lasky and R.M. Lawn (1985)
Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium Chloride: A method for oligonucleoti-de screening of highly complex iibraries,
Proc. Natl. Acad. Sei. 82 (1985), S. 1585 P. H. Yu (1983)
Specific Photoactivated Covalent Binding of S-Adenosyl-Methionine to Phenylethanolamine-N-Methyl Trans-ferase
Biochim. Biophys. Acta 742, 517 R. Zocher, T. Nihira, E: Paul, N. Madry, H. Peeters, H. Kleinkauf and U. Keller (1986). Biosynthesis of Cyclosporin A: Partial Purification and Properties of a Multifunctional Enzyme from Tolypocladium inflatum. Biochemistry 25, 550-553 27
Claims (14)
- AT 398 578 B Patentansprüche 1. Eine isolierte DNA aus Tolypocladium niveum ATCC 34921, die für das Enzym Cyclosporin-Synthetase kodiert und die folgende Teilsequenzen (kodierender Strang) aufweist: a) das in Figur 1 als "S3" bezeichnete 2890 bp große Sall-Restriktionsfragment mit folgender DNA- Sequenz: 10 20 30 40 50 60 GTCGACÄAGG AGGAAGCCAG CAACAAGGTG CAGGÄGTGGG AGGCTCATTT CGACTCAACT 70 80 90 100 110 120 GCATATGCCA ACATCGGGGG TATTGATCGC GATGCCCTCG GACAGGACTT CTTATCCTGG 130 140 150 160 170 180 ACATCTATGT ACGACGGCTC ATTGATTCCC CGTGÄAGAGA TGCAGGAATG GCTCAACGAC 190 200 210 220 230 240 ACTATGCGCT CACTCCTCGA CAACCAACCA CCCGGAAAAG TGCTCGAGAT CGGAACTGGT 250 260 270 280 290 300 ACCGGTATGG TGCTGTTCAA TCTCGGCÄAG GTTGAGGGAG TACAGAGCTA TGCCGGTCTT 310 320 330 340 350 360 GAGCCCTCGC GCTCCGTCAC CGCCTGGGTT AACAAGGCAA TCGAÄACTTT CCCAAGCCTG 370 380 390 400 410 420 GCAGGAAGCG CCCGÄGTCCA CGTTGGAACC GCCGAGGATA TCAGCTCCÄT TGATGGACTT 430 440 450 460 470 480 CGTTCCGATC TCGTTGTGAT CÄACTCAGTC GCCCÄATACT TCCCAAGTCG AGAATATCTC 490 500 510 520 530 540 GCTGAGCTGA CGGCCAACTT GATTCGACTG CCCGGCGTTA AGCGTATTTT CTTCGGTGAC 550 560 570 580 590 600 ATGAGAACGT ATGCTACCAA TAAGGACTTC TTGGTGGCAC GAGCAGTCCA TACCCTAGGG 610 620 630 640 650 660 TCCAATGCAT CGAAGGCCAT GGTTCGACAA CAAGTGGCCA AGCTTGAAGA TGACGAGGAA 670 680 690 700 710 720 GAGTTGCTTG TTGACCCTGC CTTCTTCACC AGCCTGAGCG ACCAGTTCCC TGACGAAATC 730 740 750 760 770 780 AAGCATGTCG AAATTCTGCC AAAGAGGATG GCCGCGACCA ACGAACTGAG CTCTTACAGA 790 800 810 820 830 840 TATGCTGCTG TCATTCATGT GGGAGGCCAC CAGATGCCGA ATGGGGAGGA TGAGGATAAG 850 860 870 880 890 900 CAATGGGCTG TCAAGGATAT CAATCCGAAG GCCTGGGTGG ACTTTGCTGG CACGAGGATG 910 920 930 940 950 960 GACCGTCAGG CTCTCTTGCA GCTCCTTCAG GACCGCGAAC GTGGCGATGA CGTTGTTGCC 970 980 990 1000 1010 1020 GTCAGTAACA TCCCATACAG CAAGACCATC ATGGAGCGCC ATCTGTCTCA GTCACTTGAT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GATGACGAGG ACGGCACTTC AGCGGTAGAC GGAACGGCCT GGATATCGCG TACGCAATCA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CGGGCGAAGG AATGCCCTGC TCTCTCAGTG GCCGACCTGA TTGAGATTGG TAAGGGGATC 28 AT 398 578 B 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GGCTTCGAAG TTGAGGCCAG CTGGGCTCGA CAACACTCCC AGCGCGGCGG ACTCGATGCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTTTTCCACC GATTCGAACC ACCAAGACAC TCAGGTCATG TCATGTTCÄG GTTCCCGACT 1270 1280 1290 1300 1310 1320 GÄACACAAGG GCCGGTCTTC GAGCAGTCTC ACGAATCGCC CGCTACACCT GCTTCAGAGC 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGCCGACTGG AGGCAAAGGT CGCGAGCGGC TGCAATCACT GCTTCCACCG TACATGATTC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CGTCTCGGAT CACGTTGCTC GATCAGATGC CTCTCACGTC CAACGGCAAG GTGGATCGCA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGAAGCTTGC TCGACAAGCC CGGGTCATCC CAAGAAGTGC GGCAAGCACG TTGGACTTTG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TGGCGCCACG CACGGAAATC GAAGTCGTCC TCTGCGAAGA ATTTACCGAT CTACTAGGCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 TCAAGGTTGG CATCACAGAC AACTTCTTCG AGTTGGGCGG CCATTCGCTG CTGGCCACGA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 AACTGAGCGC ACGTCTAAGT CGCAGACTGG ACGCCGGTAT CACTGTGAAG CAGGTCTTTG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ACCAGCCAGT ACTTGCTGAT CTTGCTGCTT CTATTCTTCA AGGCTCGTCT CGTCACAGGT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CTATCCCGTC TTTACCCTAC GAAGGACCCG TGGAGCAGTC CTTTGCCCAG GGGCGCCTGT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GGTTCCTCGA CCAGTTCAAC ATCGATGCCT TGTGGTACCT TATTCCÄTTT GCACTCCGCA 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TGCGCGGGCC GCTGCAAG7T GACGCCCTCG CTGCTGCCCT GGTGGCACTT GAAGAGCGTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ATGAATCTCT GCGCACAACG TTTGAGGAAC GAGACGGAGT CGGCATCCAA GTGGTGCAAC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CCCTCCGCAC GACCAAGGAT ATCCGGATCA TCGACGTGTC AGGCATGCGA GACGACGACG 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CCTACCTCGA GCCATTGCAG AÄAGAACAGC ÄGACTCCTTT CGACCTTGCT TCäGAGCCTG 2110 2120 2130 2140 2150 2160 GCTGGAGGGT AGGACTGCTG AAGCTTGGAA AGGATGACCA CATCCTCTCT ATTGTCATGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 ACCACATCAT CTCTGACGGG TGGTCTACTG AAGTCTTGCA AAGGGÄACTC GGTCAATTCT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 ACTTGGCAGC GAAATCCGGG ÄAAGCCCCCT TATCGCAGGT TGCCCCGCTT CCTATTCAGT 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ATCGCGATTT TGCTGTTTGG CAGAGACAAG AGGAACAGGT CGCTGAGAGT CAAAGGCÄGC , 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCGACTACTG GAAGAAGCAG CTTGCGGACA GTAGCCCGGC TGAGCTCTTG GCTGACTACA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 CCAGGCCGAA CGTACTGTCT GGAGAGGCAG GCAGCGTGTC TTTCGTGATC AACGATTCGG 2470 2480 2490 2500 2510 2520 TTTACAAGAG CCTCGTCTCC TTCTGCCGGT CTCGCCAAGT AACCACCTTT ACGACTTTAC 2530 2540 2550 2560 2570 2580 'TGGCAGCGTT TCGCGCCGCT CACTATCGAA TGACCGGGTC AGACGACGCA ACTATTGGCA 2590 2600 2610 2620 2630 2640 CGCCAATTGC CAATCGCAAC AGGCCTGAGC TTGAAAACTT GATCGGCTGC TTCGTCAATA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 CCCAGTGCAT GCGTATCACT ATCGGCGACG ATGAGACGTT TGAATCACTG GTACAACAGG 2710 2720 2730 2740 2750 2760 TACGGTCTAC CACCGCGACA GCCTTCGAGA ATCAAGACGT TCCGTTTGAA CGAATCGTTT 2770 2780 2790 2800 2810 2820 CCACCCTCAG TGCCGGGTCC AGGGATACGT CCCGAAACCC CCTAGTACAG CTTCTCTTTG 2830 2840 2850 2860 2870 2880 CGGTTCATTC TCAACAAGGC CTGGGCAGGA TCCAGCTCGA CGGTGTCGTC GATGAGCCGG 2890 TTCTGTCGAC 29 AT 398 578 B b) das in Figur 1 als "S5” bezeichnete 2482 bp große Sall-Restriktionsfragment mit folgender DNA-Sequenz: 10 20 30 40 50 60 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTGCGAA GCTGAAGGAG GAGCAGCAAG CTCCTTTCAA 70 80 90 100 110 120 TCTCTCTACT GAAGTCGCTT GGAGGGTAGC ACTCTTCAAG GCTGGAGAGA ACCACCACAT 130 140 150 160 170 180 CCTCTCTATC GTCATGCATC ACATAATTTC AGATGGCTGG TCAGTTGACA TCTTCCÄGCA 190 200 210 220 230 240 GGAGCTTGCC CAATTCTACT CGGTAGCTGT ACGAGGGCAT GACCCCCTTT CCCAGGTCAA 250 260 270 280 290 300 ACCGCTCCCC ATTCACTACC GCGATTTTGC TGTCTGGCAG AGACAAGATA AGCAAGTTGC 310 320 330 340 350 360 CGTTCACGAA AGCCAACTTC AGTACTGGAT AGAGCAGCTC GCGGATAGGA CGCCAGCCGA 370 380 390 400 410 420 GATCCTATCT GATTTTAACC GACCGGAGGT CTTGTCCGGC GAAGCTGGTA CAGTTCCCAT 430 440 450 460 470 480 CGTGATCGAG GACGAGGTTT ATGAGAAGCT CTCCCTCTTC TGCCGCAATC ATGAGGTCAC 490 500 510 520 530 540 CAGCTTCGTC GTCCTTCTGG CTGCTTTCCG CGTCGGACAT TATCGCCTAA CTGGGGCAGA 550 560 570 580 590 600 GGATGCGACT ATCGGTACAC CAATTGCGAA CCGCÄACCGC CCCGAACTTG AGGACTTGAT 610 620 630 640 650 660 CGGTTTCTTT GTCAATACAC AATGCATGAG AATCGCGCTC GAAGAACACG ATAATTTCCT 670 680 690 700 710 720 ATCAGTAGTG CGAAGAGTTC GCTCAACAGC GGCAAGCGCC TTCGAAAACC AGGATGTGCC 730 740 750 760 770 780 ATTCGAGCGC CTTGTATCTG CACTTCTGCC CGGCTCTAGA GATGCCTCCC GGAATCCCCT 790 800 810 820 830 840 CGTTCAACTC ATGTTTGTCG TCCACTCCCA GCGAAATCTC GGTAAACTGC AACTGGAGGG 850 860 870 880 890 900 CTTGGAAGGC GAACCÄACCC CGTACACCGC GACGACCCGC TTCGATGTTG AGTTCCACCT 910 920 930 940 950 960 CTTCGAACAA GACAAAGGCC TCGCCGGAAA TGTTGTCTTC GCAGCAGACT TGTTCGAGGC 970 980 990 1000 1010 1020 TGCCACTATC CGCAGCGTTG TTGAAGTCTT CCACGAGATC CTCCGTCGTG GTCTCGACCA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GCCAGATATC GCAATTTCCA CCATGCCACT TGTCGATGGC CTGGCGGCGC TCAACAGCCG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TAACTTACCC GCAGTTGAAG ACATCGAACC TGÄCTTCGCC ACCGAGGCCT CGGTGGTTGA 40 50 30 55 AT 398 578 B 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGTCTTCCAG ACACAAGTGG TCGCTAACCC AGATGCCCTG GCTGTGACCG ACACATCCAC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AAAGCTTACA TATGCGGAGC TGGATCAACA ATCCGATCAT GTCGCGGCTT GGCTGTCCAA . 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ACÄGAAGCTA CCAGC&GAGA GCATCGTCGT TGTTCTTGCG CCACGATCCT CTGAGAC7AT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGTAGCATGC ATTGGCATCC TCÄAAGCGAA CCTCGGATAT CTCCCCATGG ATTCCAACGT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CCCCGAAGCC CGTCGCCAAG CAATTCTTTC GGAGATTCCA GGGGAGAAGT TCGTTTTGCT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 TGGAGCAGGA GTGCCTATTC CTGACAAGAA GACAGCTGAT GTCAGGATGG TCTTCATCÄG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CGATATCGTC GCCAGGAAGA CAGACAAGTC CTACTCACCC GGCACTCGGC CATCTGCÄTC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 AAGCCTTGCC TATGTTATCT TCACATCAGG CTCGACAGGT CGGCCAAAGG GTGTCATGGT 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CGAGCATCGG GGTGTTATTT CTTTGGTGAA GCAGAACGCT TCAAGAATAC CÄCAAAGTCT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GCGGATGGCA CATGTTTCCA ATCTCGCATT CGATGCTTCC GTGTGGGAGA TATTCACCAC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 GCTGCTCÄAT GGAGGAACGC TTTTCTGTAT CAGCTACTTT ACTGTCTTGG ACAGGAAAGC 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACTTTCTGCC GCTTTCTCCG ATCATCGCÄT TAACATCACC CTGCTCCCAC CGGCCTTGCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 CAAGCAATGT CTTGCAGACG CGCCATCTGT CCTGAGCTCC CTCGAGTCTC TGTACATTGG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 AGGCGACCGC CTTGATGGAG CTGATGCAAC CAAGGTGAAG GACCTCGTCA AAGGCAAGGC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CTACAATGCC TACGGTCCCA CCGAGAATTC CGTCATGAGC ACGATCTATA CCATCGAACA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CGAGACTTTT GCGAATGGCG TTCCCATCGG CACATCTTTA GGCCCCAAGT CCAAGGCCTA 2110 2120 2130 2140 2150 2160 AATTATGGAC CAGGATCAGC AGCTCGTACC AGCAGGCGTG ATGGGAGAGC TTGTCGTTGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 TGGCGATGGT CTCGCACGAG GGTATACCGA TCCATCACTG AACACGGGCC GGTTCATCCA 2230 2240 2250 2260 2270 2280 CATCACGATC GATGGCAAAC AÄGTTCAGGC ATACCGGACC GGCGATCGAG TGAGATACCG 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ACCTAGGGAC TACCÄAATCG AGTTCTTTGG CCGTTTAGAT CAGCAGATCA AGATTCGCGG '2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCATCGCATC GAGCCAGCTG AAGTGGAGCA GGCTCTTCTC AGCGACTCAT CGATCAACGA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TGCCGTTGTT GTGTCGGCAC AAAACAAGGA GGGACTCGAA ATGGTTGGTT ACATCACGAC 2470 2480 CCAGGCTGCA CAATCCGTCG AC
- 2. Eine isolierte DNA nach Anspruch 1, die eine Restriktionskarte aufweist, wie sie in den Figuren 1 und 4 wiedergegeben ist.
- 3. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das DNA nach den Ansprüchen 1 und 2 enthält.
- 4. Ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei der Vektor entweder ein Plasmid, ein Cosmid, P1- oder YAC-Vektor ist.
- 5. Eine isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei das Molekül syncos13 genannt wird.
- 6. Eine isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei das Molekül synp4 genannt wird.
- 7. Eine isolierte DNA, die für das Protein Cyclophilin kodiert und die folgende Teilsequenz aufweist: 31 AT 398 578 B 10 20 30 40 50 60 CTTCTCCGCA ACATCAGCÄA TCATGGGCAA CAAAGTCTTC TTCGA.CA.TTG AGTGGGAGGG 70 80 90 100 110 120 CCCCGTCATG CAGGGCGGCA AGCCTACCTC TACCGTCÄAA GAGCAGTCTG GTCGCATCAA 130 140 150 160 170 180 CTTCAAGCTG TACGATGACG TCGTCCCCAA GACCGCGAGA AACTTCCGCG CTCTCTGCAC 190 200 210 220 230 240 GGGCGAGAAG GGCTTCGGCT ACGAGGGCTC GTCCTTCACG TATACTCCCG AGTTCATGCT 250 260 270 CAGGGCGGCG ACTTACCCGC GTAACGGCAC TGGCGCTA
- 8. Eine isolierte DNA nach Anspruch 7, die eine Restriktionskarte aufweist, wie sie in Figur 2 wiedergegeben ist.
- 9. Eine isolierte DNA nach den Ansprüchen 7 und 8, eingebaut in eine Vektor-DNA.
- 10. Eine isolierte DNA nach Anspruch 7, wobei das Plasmid pSIM10 genannt wird.
- 11. Verfahren zur Stammverbesserung, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA, die einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 entspricht, in einen Pilz transformiert wird.
- 12. Verfahren zur Stamm Verbesserung nach Anspruch 11, wobei der Pilz Tolypocladium niveum ATCC 34921 ist.
- 13. Zeilen, die mit DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 transformiert sind.
- 14. Verfahren zur Identifizierung von Organismen, die DNAs enthalten, die dem Cyclosporin synthetase-Gen sehr ähnlich sind, wobei die DNA eine oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 6 als Gensonde benutzt wird. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 32
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JP5168915A JPH06225773A (ja) | 1992-07-09 | 1993-07-08 | シクロスポリン合成酵素 |
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Family Applications (1)
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-
1992
- 1992-07-09 AT AT140392A patent/AT398578B/de not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
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CHEMICAL ABSTRACTS 113-73531 * |
CHEMICAL ABSTRACTS 114-19884 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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ATA140392A (de) | 1994-05-15 |
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