AT398434B - Dna aus tolypocladium niveum - Google Patents

Description

AT 398 434 B

Der Pilz Tolypocladium niveum bildet Cyclosporine, eine Gruppe neutraler zyklischer Peptide, zusammengesetzt aus elf Aminosäuren.

Der Pilz wurde ursprünglich als Trichoderma polysporum identifiziert, später als Tolypocladium inflatum Gams erkannt und von Bisset (Cannon, 1986) zu Tolypocladium niveum gestellt. Er wird im weiteren Text als Tolyplocadium niveum bezeichnet. Cyclosporine zeigen bemerkenswerte biologische Effekte: Cyclospo-rin A, der Häuptemetabolit, ist ein potenter Immunsuppressor (SandimmunR).

Nach Entwicklung eines in vitro Systems für die Cylclosporin Biosynthese konnte ein Enzym identifiziert werden, welches die gesamte Peptidbiosynthese katalysiert und daher Cyclosporin-Synthetase genannt wird (Zocher et ai., 1986; Billich und Zocher, 1987). Der Ablauf der Biosynthese erfolgt nicht-ribosomal nach einem Thiotemplate-Mechanismus, wie auch für andere Peptid-Synthetasen beschrieben (Kleinkauf and von Döhren, 1990). Jede Aminosäure wird zuerst in Form eines Adenylats aktiviert, danach in Form eines Thioesters gebunden und mit der folgenden Aminosäure zum Peptid verknüpft. Im Falle von Cyclosporin A werden 7 der als Thioester gebundenen Aminosäuren vor dem Knüpfen der Peptidbindung an der Aminogruppe methyliert (Methylgruppendonor ist S-Adenosyl-methionin). Diese Methylierungsfunktion ist intergraler Bestrandteil des Enzym-Polypeptids (Lawen and Zocher, 1990). Die Cyclisierungsreaktion mit eingeschlossen, führt die Cyclosporin-Synthetase also 40 Teilreaktionen durch. Im Gegensatz zur ribosoma-len Proteinsynthese läuft der Thiotemplate Mechanismus mit geringerer Präzision ab, wodurch in der Natur neben einem Hauptmetaboliten (Cyclosporin A in Tolypocladium niveum) auch andere Cyclosporin-Varian-ten gefunden werden (Variation kann dabei nur an einigen definierten Positionen im Peptid auftreten: Keinkauf and von Döhren, 1990). Weitere Cyclosporine, die bei Fermentationen nicht nachgewiesen werden können, lassen sich über das in vitro System gewinnen, da die Precursoren keinen unerwünschten Verstoffwechselungen unterliegen (Lawen et al., 1989).

Cyclosporin A enthält drei nicht proteinogene Aminosäuren: D-Alanin in Position 8 (Startpunkt der Biosynthese: Lawen et al., 1992), «-Aminobuttersäure in Position 3 und in Postion 1 die ungewöhnliche Aminosäure (4R)-4-[(E)-2-Butenyl]-4-methyl-L-threonin (Bmt oder C9-Aminosäure). Alle drei Aminosäuren müssen über einen eigenen Biosyntheseweg, unabhängig vom Primärstoffwechsel, bereitgestellt werden; so kann D-Alanin von der Cyclosporin-Synthetase nicht durch Epimerisierung von Enzym-gebundenem L-Alanin hergestellt werden, wie dies für die anderen Peptidantibiotika, deren Biosynthese-Mechanismus man kennt, der Fall ist (z.B. Gramicidin-Synthetase, Tyrocidin-Synthetase und ACV-Synthetase). Die Cyclosporin-Synthetase besitzt demnach keine integrale Alanin-Racemase-Funktion (Kleinkauf and von Döhren, 1990).

Obwohl mittlerweile auch andere Pilze gefunden wurden, die Cyclosporine bilden können (Drey-fuss,1986; Nakajima et al., 1989), ist Tolypocladium niveum der wichtigate Organismus für die fermentative Herstellung der Cyclosporine. Der Einfluß verschiedener Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf die Cyclo-sporin-Bildung wurde untersucht (z.B. Agathos, 1986). Über die Genetik des Pilzes ist nur wenig bekannt. Die Cyclosporin-Bildung von pigmentierten Varianten und von Mutanten nach Epichlorhydrin-Behandlung wurde untersucht (Aarnio and Agathos, 1990; Agathos and Parekh, 1990). Sanglier et al.(1989) beschreiben die Isolierung und Charakterisierung einer Mutante, die kein Cyclosporin bildet, stattdessen aber Bmt (s.o.) anhäuft. Die industriell Stammverbesserung führte durch die Auslese von Mutanten und die Optimierung der Fermentatinsbedingungen zu einer wesentlichen Ausbeutesteigerung.

Informationen über die molekulare Biologie von Tolypocladium niveum wurden nicht publiziert. Bei anderen industriel bedeutenden filamentösen Pilzen wurde gezeigt, daß die Methoden der molekularen Genetik einen wesentlichen Beitrag zur Steigerung der Produktivität leisten können. So beschreiben Skatrud et al.(1989) die Transformation eines Cephalosporium acremonium-Stammes, der bereits große Mengen Cephalosporin C bildet, mit dem klonierten Gen für die Expandase/Hydroxylase (cefEF), von dem man annimmt, daß es für die Ausbeute den begrenzenden Schritt darstellt. Unter den Transformanten ließen sich solche identifizieren, die unter industriellen Fermentationsbedingungen 15% mehr Cephalosporin C bilden.

Beschreibung der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung und Charakterisierung des Gens für die Cyclosporin-Synthetase aus Tolypocladium niveum und die Verwendung des isolierten Gens in der Stammverbesse-rung.

Proteinchemische Voraussetzungen:

Ein Protokoll zur Isolierung der Cyclosporin-Synthetase aus Tolypocladium niveum wurde zwar 1990 publiziert (Lawen and Zocher, 1990), ist jedoch nicht dazu geeignet, große Mengen homogenes Enzym in 2

AT 398 434 B kurzer Zeit zu gewinnen. In derselben Veröffentlichung wird der Synthetase noch ein Mr von etwa 650.000 Dalton zugeordnet. Aus Sedimentationsanalysen mit fluoreszenzmarkiertem Protein (Lawen et al., 1992) und durch Extrapolation der Proteingröße vergleichbarer Enzyme (abgeleitet von der DNA-Sequenz: 425 kDa für ACV-Synthetase, welche 3 Aminosäuren verknüpft: Smith et al., 1990; MacCabe et al., 1991; Gutierrez et al., 1991; 570 kDa für Gramicidin Synthetase 2, welche 4 Aminosäuren verknüpft: Turgay et al., 1992) kann man jedoch berechtigt annehmen, daß die Cyclosporin-Synthetase ein Mr um etwa 1.500 kDa besitzt. Das Enzym liegt als eine einzige Polypeptidkette vor und kann weder durch denaturierende noch durch reduzierende Agentien in Untereinheiten zerlegt werden (Lawen and Zocher, 1990). Die Cyclosporin-Synthetase ist somit nach unserem Wissensstand das größte bekannte und identifizierte Multienzym-Polypeptid.

Die enorme Größe des Enzyms erfordert eine von der üblichen Route abweichende Strategie zur Aminosäure-Sequenzierung. Als erste Voraussetzung braucht man wesentlich mehr homogenes Material zur Durchführung von Fragmentierungs-Versuchen, als allgemein üblich. Besonders die weiter unten angeführten Versuche zur Identifizierung funktioneller proteolytischer Fragmente erfordern große Material-Mengen. Deshalb wurde in kompletter Abänderung der publizierten Reinigung ein Protokoll für Cyclosporin-Synthetase entwickelt, welches prinzipiell auch auf analoge Enzyme aus anderen Mikroorganismen angewendet werden kann und im konkreten Beispiel von der Reinigung des Enzyms aus Tolypocladium niveum (Beispiel 1) zu einer substantiellen Verbesserung im Sinne von Ausbeute und dafür erforderlichen Zeitaufwand führte.

Das in der Erfindung angewandte Reinigungsverfahren für Cyclosporin-Synthetase liefert, nach Myzelaufschluß, Nukeinsäurefällung, Proteinfällung und Molekularsiebchromatographie stabile, mindestens 90%-ige, aktive Enzympräparationen, wie sie für die enzymkinetische bzw. proteinchemische Charakterisierung notwendig sind. Die Reinigung kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden. Der Zellaufschluß kann z.B. mit einem Hochdruckhomogenisator oder einer Glaskugelmühle erfolgen, wobei die Zellen sowohl in feuchtem als auch in lyophilisiertem Zustand vorliegen können. Liegen die Zellen feucht vor, wird zweckmäßigerweise ein Druckaufschluß durchgeführt, mit z.B. einer Maunton Gaulin-Apparatur; lyophilisierte Zellen werden zweckmäßigerweise durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Die Nukleinsäurefällung kann mit Polyethylenimin oder Protaminsulfat erfolgen. Für die Proteinfällung eignet sich u.a. Ammonsulfat, wobei eine Sättigung um etwa 50% ausreicht, um die Cyclosporin-Synthetase auszufällen. Der Ammonsulfatniederschlag wird einer Molekularsieb-Chromatographie unterworfen (z.B. HW65-F Fractogel Merck), wobei eine etwa zu 90% homogene Enzympräparation erhalten wird.

Die Zellen können sowohl in feuchtem als auch in lyophilisiertem Zustand aufgeschlossen werden, wobei im ersten Fall in der Regel ein Druckaufschluß (z.B. mit einer Maunton Gaulin-Apparatur) durchgeführt wird, während man lyophilisiertes Myzel durch Zermörsern unter flüssigem Stickstoff aufschließt. Dem Aufschluß folgt eine grobe Klärung des Rohextraktes durch mitteltourige Zentrifugation (im Bereich von ca. 10.000 g) und ein weiterer Klärungsschritt durch Präzipitation von Nukleinsäuren, wobei im allgemeinen auch feine Schwebeteijchen, die die anschließenden Schritte stören können, entfernt werden. Zur Präzipitation der Nukleinsäuren können alle dafür üblichen Reagentien, eingesetzt werden, z.B. Polyethylenimin oder Protaminsulfat; die optimale Menge sollte für jeden Einzelfall ausgetestet werden.

Cyclosporin-Synthetase kann aus diesem geklärten Rohextrakt zusammen mit etwa 20 - 30% des Gesamtproteins durch eine Sättigung mit Ammonsulfat zu 50% präzipitiert werden, wobei der optimale Sättigungswert für jedes Anwendungsbeispiel ermittelt werden muß.

Nach diesem Schritt liegt das Enzym grob angereichert und hoch konzentriert vor; in dieser Form kann es einer Molekularsieb-Chromatografie unterworfen werden. Bei der richtigen Wahl des Moiekuiarsiebs ist es alleine aufgrund der außergewöhnlichen Größe des Enzyms möglich, in einem einzigen weiteren Schritt eine etwa zu 90% homogene Präparation zu erhalten. Durch das Prinzip der Trennung nach Größe kann diese Methode auf jedes analoge Enzym mit den gleichen Erfolgsaussichten angewendet werden. Die Analyse der Reinheit wird in SDS-Polyacrylamidgelen (vorzugsweise 4-15% Gradientengele) durchgeführt.

In Beispiel 1 führt das im Detail für Tolypocladium niveum beschriebene Protokoll zu einer Zeitverkürzung von 4 Tagen auf 10 Stunden und zu einer Ausbeute-Steigerung um etwa den Faktor 4. Als Ausgangsmaterial für die Proteinreinigung wurde Tolypocladium niveum, Stamm 7939/45 verwendet (Lawen et al., 1989).

Der Nachweis der Enzymaktivität über die in vitro Synthese von Cyclosporinen wurde ebenfalls gegenüber der publizierten Methode (Lawen and Zocher, 1990) im Sinne einer Steigerung der Nachweisempfindlichkeit verbessert (Beispiel 2).

Bei einem Protein dieser außerordentlichen Größe ist der Bedarf an Aminosäure-Sequenzen naturgemäß größer als bei Proteinen durchschnittlicher Größe, um eine korrekte Identifizierung des Gens bzw. Genproduktes zu ermöglichen. Abgesehen von der Möglichkeit einer N-terminalen Blockierung ist es technisch nicht durchführbar, ein Enzym dieser Größe so zu präparieren, daß es für N-terminale Sequenzie- 3

AT 398 434 B rung geeignet ist. Aus diesen Gründen war es erforderlich, interne Aminosäure-Sequenzen in ausreichender Anzahl zu beschaffen.

Bei der Fragmentierung eines Proteins dieser Größe entstehen jedoch derart viele Bruchstücke (theoretisch etwa 700, wenn man einen Schnitt pro 20 Aminosäuren postuliert), daß die Standardmethode, das Protein komplett zu fragmentieren und die Fragmente über HP-RPC zu reinigen, nicht anwendbar ist Aus diesem Grund wurde eine Strategie angewandt, die für die Sequenzierung aller Proteine von außergewöhnlicher Größe verwendet werden kann: Wenn man die Fragmentierung unter für die jeweiligen Endoproteinasen suboptimalen Bedingungen durchführt, erhält man wesentlich größere Fragmente.

Die Spaltung der Cyclosporin-Synthetase erfolgt erfindungsgemäß, indem man den pH-Wert adjustiert. Insbesondere gelingt eine Spaltung zu großen Fragmenten von bis zu 200 kDa, indem man den pH-Wert auf etwa 7,5 bringt, in HEPES-Puffer unter Zusatz von EDTA und DTT. Die so erhaltenen Fragmente können dann in an sich bekannter Weise isoliert und angereichert werden, z.B. unter Verwendung von Chromatographie und Elektrophorese, wie Kombination von Anionenaustausch-Chromatographie an MonoQ und HP-RPC, oder Kombination von MonoQ mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese/Elektroblot. Suboptimale Bedingungen erzielt man vor allem durch Abänderung der Pufferbedingungen (Puffersubstanz, pH-Wert), eventuell auch unter Abänderung der Spalt-Temperatur (siehe Beispiel 3 als eine mögliche Variante). Die immer noch sehr zahlreichen Fragmente müssen über jeweils 2 Reinigungsschritte isoliert bzw. angereichert werden, wobei prinzipiell alle chromatografischen und elektrophoretischen Trenntechniken angewendet werden können. Im Falle der Fragmente von Cyclosporin-Synthetase aus Toiypocladium niveum erwiesen sich Kombinstionen von Anionenaustausch-Chromatografie an MonoQ mit HP-RPC (Beispiele 4 und 5) und MonoQ mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese/Elektroblot (Beispiele 4 und 6) als besonders vorteilhaft.

Die Proteinsequenzierung ist nach Laursen, Methods Enzymology 25, 344-359 (1972) bekannt Ebenfalls ist es heute Stand der Technik, die für Proteine kodierenden Gene zu lokalisieren (Rothstein et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLV, 99-105, 1981) und zu sequenzieren (Sänger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467,1977).

Der nichtribosomale Biosynthese-Weg impliziert, daß die Sequenz des cyclischen Peptids durch die entsprechende Anordnung der die Aminosäuren aktivierenden Domänen bestimmt wird. Jede dieser Domänen muß analoge Reaktionen, ausführen, nämlich die Aktivierung der Aminosäure durch Adenylierung und Bindung in Form eines Thioesters, so daß man erwarten kann, daß man in der Proteinsequenz sich wiedernolende, konservierte Motive findet.

Tatsächlich hat man bei den bisher analysierten Peptid-Synthetasen innerhalb der Sequenzen konservierte Bereiche entdeckt, deren Zahl sich mit der Anzahl der zu aktivierenden Aminosäuren deckt: drei bei ACV-Synthetase (aktiviert Aminoadipinsäure, Cystein und Valin: Smith et al., 1990; MacCabe et al., 1991; Gutierrez et al., 1991), jeweils eine bei Gramicidin Synthetase I (Kraetzschmar et al., 1989) und Tyrocidin-Synthetase I (Wekkermann et al., 1988; die beiden bakteriellen Enzym sind jeweils Untereinheit eines Multienzum-Kpmplexes und aktivieren nur eine Aminosäure, nämlich Phenylalanin), und vier konservierte Bereiche in Gramicidin-Synthetase 2, die die Aminosäuren Prolin, Valin, Ornithin und Leucin aktiviert (Turgay et al. 1992).

Eine möglichst genaue Identifizierung und Charakterisierung solcher konservierten Bereiche von Cyclosporin-Synthetase sowohl auf enzymatischer als auch auf genetischer Ebene stellt die Grundlage für ein gezieltes genetic engineering im Sinne einer Veränderung der Enzymspezifität zur Herstellung von Cyclosporin-Varianten in vivo dar.

Deshalb haben wir versucht, auf proteinchemischem Weg proteolytische Fragmente der Cyclosporin-Synthetase zu identifizieren, die mit einer Teilfunktion der Synthetase korreliert werden können. Bei diesen Arbeiten wurden folgende Zuordnungen getroffen: (1) ein Proteinfragment mit Methyltransferase-Funktion (die dieser Arbeit zugrundeliegende Methode ist prinzipiell auf alle Methyltransferasen anwendbar und publiziert in Yu et al. 1983; eine erste Anwendung auf Cyclosporin-Synthetase ist publiziert in Lawen and Zocher, 1990); siehe Beispiel 7; (2) ein Proteinfragment mit Fähigkeit zur Aktivierung von D-Alanin (Beispiel 8) (3) ein Proteinfragment mit Fähigkeit zur Aktivierung von L-Alanin (Beispiel 8).

Die in Beispiel 8 angewandte Methode wurde für diese Aufgabenstellung entwickelt und ist in dieser Form nicht publiziert. Sie macht sich die Tatsache zunutze, daß bei einer limitierten proteolytischen Spaltung von Proteinen unter anderem intakte Domänen abgespalten werden, die aufgrund ihrer korrekten räumlichen Faltung noch in der Lage sind, ihre enzymatische Funktion in beschränktem Umfang auszuüben.

Mit dieser Methode kann daher theoretische jede Aminosäure-aktivierende Domäne identifiziert werden. Die optimalen Bedingungen (für die proteilytische Spaltung und ihre zeitlich Abfolge in Relation zur Aminosäure-Aktiverung) müssen jedoch in jedem Einzelfall ausgetestet werden; außerdem ist die eindeutige identifi- 4

AT 398 434 B zierung einer Domäne nur dann durchführbar, wenn die von ihr aktivierte Aminosäure im Produkt nur einmal vorkommt.

Das Gen wird durch DNA-Hybridisierung mit cyclosporin-synthetase-spezifischen Oligonukleotiden isoliert (Beispiel 10). Ob ein bestimmtes DNA-Teilfragment tatsächlich zum Cyclosporin-Synthetase-Gen gehört, wird durch Northernhybridisierung festgestellt, da ein nicht transkribiertes Nachbarfragment nicht mit der entsprechenden RNA hybridisiert (Beispiel 15). Die DNA-Sequenz der Monierten DNA des Cyclosporin-Synthetase-Gens wird bestimmt und mit Aminosäureteilfragmenten der Cyclosporin-Synthetase verglichen (Beispiele 13 und 14). Voraussetzungen für eine Transformation von Tolypocladium niveum ist eine Methode zur Protoplastierung (Beispeil 17) und ein geeigneter Plasmidvektor (Beispiele 11,12 und 18).

Mit diesen Voraussetzungen ist es möglich, Tolypocladium niveum mit dem vollständigen Gen für die Cyclosporin-Synthetase zu transformieren. Unter den Transformanten lassen sich Stämme finden, die mehrere Kopien dieses Gens oder Kopien mit veränderter Regulation enthalten. Es werden Stämme ausgewählt, die in Testfermentationen eine verstärkte Cyclosporin-Bildung zeigen, b.z.w. schon nach kürzerer Fermentationsdauer die gleiche Menge Cyclosporin bilden können.

Auch über die Aktivität der Cyclosporin-Synthetase ist eine Auswahl der transformierten Stämme möglich, unabhängig davon, ob mehr oder schneller Cyclosporin gebildet wird. Das isolierte Cyclosporin-Synthetase-Gen kann als analytisches Hilfsmittel dienen, um zu bestimmen, ob ein spezieller Stamm von Tolypocladium niveum eine hohe Konzentration der mRNA aufweist oder nicht (Beispiel 15). Solche Stämme können dann einer konventionellen Mutagenese und Stammauswahl unterworfen werden. Selbst wenn der für die Transformation verwendete Ausgangsstamm nicht in der Cyclosporin-Synthetase-Aktivität limitiert ist, wird so ein Stamm bereitgestellt, der potentiell eine größere Cyclosporin-Bildung erlaubt. Die Kombination der klassischen Genetik (Mutation und Stammauswahl) mit der molekularen Genetik (Transformation mit isolierte Genen) erlaubt es, verbesserte Stämme zu isolieren, die durch keine der beiden Methoden allein erreichbar sind: Mittels der klassischen Genetik nicht, weil eine Doppelmutation in einem Selektinsschritt extrem selten ist; mittels der molekularen Genetik nicht, weil u.U. ein unbekannter Faktor begrenzend wirkt.

Eine weitere Anwendung des isolierten Genes ist eine genpezifische Mutagenese. Statt Mutationen im ganzen Genom zu erzeugen - und damit auch viele nicht-beteiligte Gene zu verändern - wird nur das isolierte Gen mit geeigneten Methoden mutiert (Sambroock et al-, 1989) und anschließend nach Tolypocladium niveum transformiert (Beispiel 17). Unter den Transformanten ist der Anteil der Mutanten im Cyclosporin-Synthetase-Gen höher als bei einer Mutagenese des Pilzes. Mutanten, die spezielle Cyclospo-rine vermehrt oder auch vermindert bilden, lassen sich häufiger finden als nach einer konventionellen Mutagenese.

Durch interne Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Beispiel 14c) und Zuordnung spezifischer Teilsequenzen (Beispiel 8 und Beispiel 9, bzw. Beispiel 14ab) können Domänen der Cyclosporin-Synthetase für die Aktivierung der einzelnen Aminosäuren (wie oben für nichtribosomale Peptidsyntheta-sen ausgeführt) lokalisiert werden. Dadurch kann gezielte Mutagenese des Cyclosporin-Synthetase-Gens durchgeführt werden, indem der Genbereich einzelner Domänen untereinander ausgetauscht, ein entsprechender Bereich gezielt entfernt oder das Cyclosporin-Synthetase-Gen auch um einzelne Domänen erweitert werden kann. Nach Transformation solcher mutierten Gene in Tolypocladium niveum können neue Cyclosporin-Varianten zugänglich werden. Für bestimmte Zwecke ist es vorteilhaft, über Tolypocladium niveum-Stämme zu verfügen, die keine aktive Cyclosporin-Synthetase mehr besitzen. Auch dazu kann dad isolierte Gen verwendet werden. Für die Transformation wird dazu eine in vitro hergestellte inaktive Version konstruiert.

Beim Screening nach Mikroorganismen, die Cyclosporine synthetisieren können, ist es unabdingbar, daß die aktiven Metabolite unter den Testbedingungen auch tatsächlich in ausreichender Menge gebildet werden. Solche Substanzen können außerdem leicht veränderte Charakteristika aufweisen und schon deshalb übersehen werden. Das Beispiel 16 beschreibt die Anwendung des isolierten Cyclosporin-Synthetase-Gens, um Mikroorganismen aufzufinden, die Cyclosporin-Synthetase-Gene in ihrem Genom enthalten. Diese Gene müssen dazu nicht aktiv sein. Basierend auf diesen Hybridisierungen lassen sich die entsprechenden Gene analog zu den Beispielen 10, 11 und 12 isolieren und in Tolypocladium niveum transfromieren. Hierfür kann ein Stamm verwendet werden, der keine aktive Cyclosporin-Synthetase mehr enthält. Diese interspezifische Rekombination ist mit anderen Methoden nicht zu erzielen. Wie im vorhergehenden Absatz beschrieben, kann man solche Stämme einem Screeningprogramm unterwerfen. Die genetische Variabilität beruht in diesem Fall auf dem eingebrachten Gen, das mit dem Cyclosporin-Synthetase-Gen hybridisiert.

Schließlich können auch die Kontroll-Sequenzen des Cyclosporin-Synthetase-Gens, wie sie u.a. in synp4 vorliegen (Beispiel 12) zur Konstruktion von Plasmiden benutzt werden, in denen dieser Promotor mit einem 5

AT 398 434 B leicht nachweisbaren Reporter-Gen wie z.B. dem 0-Glucuronidase-Gen (Tada et al. 1991) fusioniert wird. Stämme von Tolypockadium niveum, die mit solchen Plasmiden transformiert werden, erlauben nicht nur die Selektion von regulatorischen Mutanten, sondern ermöglichen es außerdem, die Aktivität des Promotors unbhängig von anderen Teilfunktionen zu messen und zu optimieren.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1: Isolierung aktiver Cyclosporin-Synthetase in elektrophoretisch homogener Form:

Das beschriebene Protokoll weicht vollständig von der in der Literatur beschriebenen Reinigung (Lawen and Zocher, 1990) ab. Bei einer Aufarbeitung von 10 g lyophilisiertem Myzel erhält man innerhalb, von 10 Stunden 50 mg Cyclosporin-Synthetase in elektrophoretisch homogener Form.

Alle Schritte werden zwischen 0" und 4”C durchgeführt. 1. Schritt: 10 g lyophilisiertes Myzel werden unter Zusatz von flüssigem Stickstoff fein zermörsert und in Puffer A aufgeschlämmt. Zur Extraktion der Proteine wird auf Eis 1 Stunde vorsichtig gerührt. Zentrifugation der Zelltrümmer: 10 min bei 10.000 g. 2. Schritt: der Überstand, als Rohextrakt bezeichnet, wird zur Entfernung von Nukleinsäuren einer Polyethyleniminfällung (Endkonzentration 0,1%) unterzogen. Das Präzipitat wird durch 10 min Zentrifugation bei 10.000 g entfernt. 3. Schritt: Der erhaltene Polyethylenimin-Überstand wird einer Ammonsulfatfällung unterworfen: Puffer B wird mit Ammoniumsulfat bei Raumtemperatur gesättigt. Diese Lösung wird bis zu einer Endkonzentration von 50% Sättigung dem Polyethylenimin-Überstand zugetropft. Zur Equilibrierung wird der Fällungsansatz weitere 30 Minuten stehen gelassen. Die präzipitierten Proteine wurden durch 30 min Zentrifugation bei 30.000 g gesammelt. Das erhaltene Pellet wird ad 10 ml in Puffer B resolubilisiert. 4. Schritt: Die resolubilisierte Ammonsulfat-Fraktion wird einer Molekularsieb-Chromatografie unterworfen. Molekularsieb: HW65-F Fractogel von Merck; Säulendimension: 2,6 cm x 93 cm, V = 494 ml; Betrieb mittels FPLC. Laufgeschwindigkeit: 2 ml/min, kontinuierlich unter Puffer B. Die Cyclosporin-Synthetase eluiert unter diesen Bedingungen bei einem Elutionsvolumen von 260 - 310 ml.

Beispiel 2: Nachweis der enzymatischen Aktivität von Cyclosporin-Synthetase:

In Abwandlung von der publizierten Methode (Lawen et al., 1989) wird der Nachweis der Cyclosporin-Synthetase Aktivität wie folgt durchgeführt: 80 Ul Enzumprobe (in Puffer B) werden in einem Gesamtvolumen von 130 ul mit 3,5 mM ATP, 8 mM MgCIa, 10 mM DTT, 10 uM C9-Säure, 690 uM an jeder anderen konstituierenden Aminosäure, und 100 uM S-Adenosyl-methionin + 2 uCi Adenosyl-L-methionin-S-[methyl-3H] (75 Ci/mmol) 1 h bei 22 · C inkubiert. Die Extraktion und der Nachweis des gebildeten Cyclosporin A werden wie beschrieben durchgeführt (Billich and Zocher, 1987).

Beispiel 3: Endoproteinase Spaltungen:

Folgende Endoproteinasen (Boehringer Mannheim, sequencing grade) wurden eingesetzt:

Trypsin aus Rinderpankreas (spaltet nach Arginin und Lysin)

LysC aud Lysobacter enzymogenes (spaltet nach Lysin)

GluC = V8 aus Staphylococcus aureus (spaltet nach Glutaminsäure und Asparaginsäure).

Die Spaltungen werden nicht unter den vom Hersteller empfohlenen, sondern unter "suboptimalen" Bedingungen durchgeführt:

Cyclosporin-Synthetase wird in ihrem Lagerpuffer mit Protease im Verhältnis 100 ug : 1 ug, 2-3 h bei 25 *C inkubiert. Dabei entstehen Fragmente bis zu einer Größer von etwa 200 kDa.

Beispiel 4: MonoQ-Reinigung von Fragmenten :

Puffer 1: 20 mM HEPES pH 7,5, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 5 gv% Glyzerin Puffer 2: Puffer 1 + 500 nM NaCl

Die Reinigung wird an einer handelsüblichen MonoQ-Säule (HR 5/5) von PHARMACIA bei 4'C vorgenommen. Verdünnung (1/5) und Applikation der Protease-verdauten Proteinprobe in Puffer 1; Gradientenelution der Fragmente in 20 ml von 0% auf 100% Puffer 2. 6

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Beispiel 5: HP-RPC-Reinigung von MonoQ-Fraktionen:

Puffer 1: 5% Acetonitril, 0,1% TFA

Puffer 2: 90% Acetonitril, 0,1% TFA Säule: Nucleosil 300A-C4-5U; Dimension 85 x 4,5 mm

Laufgescfiwindigkeit: 1 ml/min

Temperatur: Raumtemperatur

Gradientenelution: in 85 min von 0% auf 100% Puffer 2

Beispiel 6: SDS-PAGE/Blot-Reinigung von MonoQ-Fraktionen: SDS-PAGE wird nach Lämmli (1970) durchgeführt. Dem Elektrophorese-Puffer wird Thioglykolsäure (2 mM) zugesetzt, um die Blockierung der N-Termini durch Restradikale aus der Polymerisationsreaktion zu verhindern. Die Fraktionen der MonoQ-Reinigung werden nach Denaturierung mit SDS zur Elektrophorese eingesetzt. Zur Sequenzierung werden die Proteine aus dem Gel an Glasfasermembranen ("Glassybond" von Biometra) im Semidry-Verfahren geblottet.

Beispiel 7: Protein-Fragment mit Methyltransferase-Aktivität: Identifizierung und Reinigung

Das aktive Zentrum von Methyltransferasen kann durch UV-Bestrahlung mit seinem Substrat S-Adenosyl-methionin quervernetzt werden. Diese Tatsache kann man sich zunutze machen, indem man radioaktives Substrat anbietet und somit eine radioaktive Markierung des Enzyms erhält (Yu et al., 1983). Diese Methode, die auch als "Photoaffinity labellingn bezeichnet wird, wurde auch auf Cyclosporin-Synthetase angewendet (Lawen and Zocher, 1990), wobei gezeigt werden konnte, daß bei anschließendem Protease-Verdauung mehrere markierte Proteinfragmente entstehen. Eines dieser markierten Fragmente wird identifiziert, durch Kombination nach den in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden angereichert und dadurch der Sequenzierung zugänglich gemacht (siehe Beispiel 9: as 4). Dieses Fragment besitzt eine Größe von etwa 47.000 Dalton, wobei zu berücksichtigen ist, daß die Größe von Proteinen und ihren Fragmenten durch elektrophoretische Methoden nur näherungsweise bestimmt werden kann, und die angegebene Größe daher nur einen Richtwert darstellt.

Beispiel 8: Aminosäure-aktivierende Proteinfragmente: Identifizierung und Reinigung

Die im folgenden beschriebene Methode wurde für diese Problemstellung neu entwickelt und ist nicht in der Literatur beschrieben. Prinzipiell kann sie für jedes multifunktionelle Enzym eingesetzt werden.

Die Identifizierung von Proteinfragmenten mit Fähigkeit zur Aktivierung einer Aminosäure wird durch Beladung der Synthetase mit radioaktiv markierter Aminosäure unter gleichzeitiger Anwesenheit einer Endoproteinase durchgeführt. Etwa 500 ug gereinigte Cyclosporin-Synthetase werden mit 25 mM ATP und 30 mM MgCfe mit 5 uCi ,4C-D-Alanin oder alternativ mit 5 ix Ci 14C-L-Alanin inkubiert und gleichzeitig mit Endoproteinase V8 im Fall von D-Alanin bzw. mit Endoproteinase LysC im Fall von L-Alanin (nach Beispiel 3) behandelt. Die Reaktion wird nach 3 h durch Präzipitation der Proteine mit TCA gestoppt. Die Fragmente werden in Probenpuffer für SDS-PAGE unter Weglassung reduzierender Agentien resolubilisiert; die Hälfte des Ansatzes wird einer SDS-PAGE unterworfen und das markierte Proteinfragment durch Autoradiografie des Gels nach Inkubation in "Amplify solution" (von NEN) und Trocknung detektiert.

Ergebnis für den Ansatz mit) HC-D-Alanin: Ein Fragment mit Mr von, ca. 130.000 Dalton wurde identifiziert und durch eine Kombination der in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden zur Aminosäure-Sequenzierung angereichert: entsprechende Aminosäure-Sequenz in Beispiel 9: as16.

Ergebnis für den Ansatz mit HC-L-Alanin: Ein Fragment mit Mr von ca. 140.000 Dalton wurde identifiziert und durch eine Kombination der in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Methoden zur Aminosäure-Sequenzierung angereichert: entspechende Aminosäure-Sequenz in Beispiel 9: as13.

Beispiel 9: Aminosäure-Partialsequenzen von Cyclosporin-Synthetase: as1:

GELVVSGDGLARGYTNPALDSDRFVDI as2:

ITVDVEDSFETLVHQVRETT 7

AT 398 434 B as3: gvrlrgplrvdalqealral.ee as4:

QSEVGNDFMGWTSMYDG as5:

NLPAVEDIEPDFATEASV as6:

GSTLYSVIPTTEYTGPVVL as7:

STNEILLLDVAPLSLGI as8:

IELAEVEXALLSS as9:

LWFLDQFNIDALXYLIPFAL as10: EVFD KPVLAPLA as12:

YASINPLVQVMFAVH as13:

LARQARVIPRSAASTLDFVA as14:

AVSARVAPRDNTEIVLXEEY as15:

ALQTALPAYMIPSRIIVL as16:

GLQSLLPPYMIPSRITLLD as17:

LVSQRVAPRNEIEAV as18:

VQAWEAVFDXVAY as19:

QVQGWGEHFDVSXXA as20:

DIRQSEVGNDFMGXT ("X" bedeutet, daß nicht bekannt ist, welche Aminosäure an dieser Stelle vorliegt.)

Beispiel 10: „Isolierung von X-Klonen, die mit einem cyclosporinsynthetase-spezifischen Oligonukleotid hybridisieren a) Konstruktion einer genomischen \-Genbank aus Toiypocladium niveum.

Aus dem Mycel einer in Medium 1 gewachsenen Kultur von Toiypocladium niveum wird DNA isoliert. Jeweils 4 ml einer Sporensuspension des Stammes Toiypocladium niveum ATCC 34921 ( = Beauveria nivea) mit 4x108 Sporen pro ml werden zu 200 ml Medium I in einem 1000 mi Erlenmeyerkolben gegeben und 72 h bei 250 C und 250 Upm geschüttelt. Das Mycel wird mittels eines Büchnertrichters abfiltriert, mit 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA gewaschen und unter flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben. Aus 40 g Mycelfeuchtmasse werden Kerne isoliert, die dann lysiert werden; die DNA wird durch CsCI-EtBr-Zentrifugation gereinigt. Diese Methode - die Isolierung von hochmolekularer DNA aus Zellkernen - wurde von Jofuku und Goldberg (1988) für Pflanzen beschrieben und kann für Pilzmycel verwendet werden. Erhalten werden 4,3 mg DNA, die in einem 0,5%igem Agarose-Gel eine Bande ergibt, die eine geringere Mobilität als X-DNA aufweist. 40ug dieser DNA werden mit 1,4 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau3A in 10mM Tris-Cl pH7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTE, 50 mM NaCI 60 min bei 37'C und anschließend 10 min bei 65°C inkubiert. Daß Ausmaß der Spaltung wird auf einem Agarose-Gel überprüft: Ein Teil der DNA ist zwischen 10 und 20 kb groß. Die DNA wird dann auf zwei NaCI-Gradienten aufgetragen, die durch Einfrieren und langsames Wiederauftauenlassen bei 40 C von zwei Beckman SW28.1 Ultrazentrifugen-Röhrchen mit 20% NaCi in TE hergestellt wurden. Zentrifugiert wird für 16 h bei 14000 Upm in der Beckman-Ultrazentrifuge L8M im Rotor SW28.1. Der Inhalt der Röhrchen wird fraktioniert. Fraktionen mit DNA, die größer als 10 kb ist, werden 8

AT 398 434 B vereinigt und gegen TE dialysiert. Nach einer Konzentrierung der DNA auf 500 ng/ml wird sie mit XEMBL3-DNA (Promega Inc.). die mit EcoRI und BamHI gespalten wurde, vereint. In 5 ul werden 1,5 ug der DNA und 1 ug XEMBL3-DNA (gespalten mit EcoRI und BamHI) in 30 mM Tris-Cl pH7,5, 10 mM MgCh, 10 mM DTE, 2,5 mM ATP nach Zugabe von 0,5 U T4-DNA-Ligase 16 h bei 16°C ligiert (DNA-Konzentration 500ug/ml). Das Ligationsgemisch wird mit Hilfe von Protein-Extrakten ("Packaging mixes", Amersham) in vitro verpackt. Die entstandenen λ-Lysate werden mit E. coli KW251 (Promega Inc.) getitert. Erhalten werden etwa 4,5x10* pru. b) Isolierung von x-Klonen 40.000 rekombinante Phagen der Tolypocladium inflatum-Genbank aus Beispiel 10a werden mit dem Stamm E. coli KW251 auf 90 mm TB-Platten ausgegossen (TB enthält 10 g/l Bacto Tryptone und 5 g/l NaCI und 0,7% Agarose, der pH7,5 wird mit NaOH eingestellt). Von jeder Platte werden zwei Abdrücke auf Nitrocellulose (Stratagene) gemacht (Maniatis et al., 1982). Aus der Aminosäure-Sequenz des Fragmentes as9 (Beispiel 9) der Cyclosporin-Synthetase läßt sich auf Grund des genetischen Codes ein Oligonukleotid-Gemisch (96 verschiedene Oligonukleotide, jeweils 20 Nukleotide lang) mit den Sequenzen 5' GCA TCA ATA TTA AAT TGÄ. TC 3'

6 G ' G G C G T herstellen. 1,5 ttg dieses Oligonukleotid-Gemisches werden in 25 ul 50 mM Tris-Cl pH 9, 510 mM MgCfe, 5 mM DTE, 5% Glycerin mit 150 uCi γ-ΑΤΡ PP) mit 20 U Polynukleotid-Kinase (Boehringer) 30 min bei 37 *C inkubiert. Über 80% der Radioaktivität werden eingebaut. Die Hybridisierung wird bei 37 ° C in 400 ml 6xSSPE (Maniatis et al., 1982), SxDenhard’s Lösung (Maniatis et al., 1982), 0,1% SDS, 100 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA (Maniatis et al., 1982), 0,1 mM ATP, 1,4x1ο5 cpm/ml 32P-markiertem Oligonukleotid-Gemisch für 16 h durchgeführt. Die Filter werden dreimal 5 min und zweimal je 30 min in 6xSSC(Maniatis et al., 1982) bei 4*C gewaschen. Anschließend werden die Filter für 10 min bei 37*C in einer TMAC-Waschlösung, die nach den Angaben von Wood et al., (1985) hergestellt wurde, gewaschen. Schließlich werden die Filter 30 min in der TMAC-Waschlösung bei 57 *C gewaschen, getrocknet und für 10 Tage mit einem Kodak XOmatik AR Roentgenfilm exponiert. Bereiche der Agaroseschicht, die positiven Signalen auf dem Roentgenfilm entsprechen, werden ausgestochen und in SM-Puffer resuspendiert. Eine geeignete Verdünnung wird mit KW251 erneut auf eine TB-Platte ausgegossen. Die Plaques werden wiederum auf Nitrozellulose übertragen. Aus Plaques, die in der zweiten Hybridisierung positive Hybridisierungssignale ergeben, wird die DNA isoliert. Die gereinigte DNA dieser Phagen wird für Southern-Hybridisierungen und Restriktionsanalysen verwendet. Abbildung 1 zeigt die Restriktionskarte des Toiypo-cladium niveum-Anteils eines solchen λ-Klons ( = XSYN3). Außerdem werden Subklonierungen in verschiedene Plasmidvektoren (z.B. PUC18, Pharmacia) durchgeführt.

Zur Isolierung von X-Klonen, die die angrenzenden DNA-Fragmente enthalten ("Genomic walking") wird die oben beschriebene Methode der Plaquehybridisierung mehrfach wiederholt, wobei jeweils die randständigen Restriktionsfragmente als 32P-markierte Sonden eingesetzt werden. Um die DNA zu klonieren, die such an die in Fig.1 schematich wiedergegebene Region (XSYN3) anschließt, wird das Fragment S5 verwendet (Fig.1). Die Hybridisierung wird dann bei 42 °C in 6xSSPE, 50% Formamid, 5xDenhard’s Lösung, 0,1% SDS, 100 wg/ml denaturierte Heringssperma-DNA, 100 U.M ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA wird vor der Hybridisierung 5 min auf 100”C erhitzt und in Eis abgekühlt. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min in 2xSSC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 0,2xSSC, 0,1 %SDS bei 65 · C. Die getrockneten Filter werdend autoradiografiert. Mit den Bereichen der Agarose, die positiven Signalen entsprechen, wird weiterverfahren, wie oben beschrieben.

Beispiel 11: Isolierung von Cosmidklonen, die Teile des Cyclosporin-Synthetase-Gens enthalten a) Konstruktion einer genomischen Cosmid-Genbank aus Tolypocladium niveum

Es werden Protoplasten hergestellt, wie in Beispiel 17 dargestellt. Ca. 109 Protoplasten werden vorsichtig in 2 ml TE lysiert. Es wird 0.1 mg/ml RNase A zugesetzt und 20 min bei 37 * C inkubiert. Nach Zugabe von 0.5% SDS und 0.1 mg/ml Proteinase K wird weitere 40 min bei 55 °C inkubiert. Der Ansatz wird sehr schonend je zweimal mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloro- 9

AT 398 434 B form/lsoamylalkohol (24:1) extrahiert (Maniatis et al., 1982). Der wäßrige leicht viskose Überstand wird mit einem Zehntel Volumen 3 M Natriumazetat (pH 5.2) versetzt, mit dem 2.5 fachen Volumen absolutem, -20 *C kaltem Ethanol überschichtet und die DNA in Form feiner Fäden mittels Glasstäben an der Phasengrenze aufgespult. Die DNA wird in 3 ml TE mindestens 20 h gelöst. Je nach Qualität der Protoplasten werden ca. 500 ug/ml DNA erhalten. Analyse mit FIGE (0.8% Agarose, 0.5 x TBE (Maniatis et al, 1982) 6 V/cm, Vorwärtspuls 0.2 bis 3 s, Puls-Verhältnis 3.0, Laufzeit 5 h) ergibt eine Größe von mehr als 150 kb.

Zweimal 135 ug DNA werden mit 7.5 bzw. 15 Einheiten des Restriktionsenzyms Ndell (Fa.Boehringer Mannheim) für 1 h bei 37*C in 1 ml Puffer (Tris-Azetat 33 mM, Magnesiumazetat 10 mM, Kaliumazetat 66 mM, DTT 0.5 mM, pH 7.9) geschnitten. Aliquots der Restriktionen werden mittels FIGE überprüft und ergeben ein Maximum der erhaltenen Fragmente bei etwa 45 bzw. 30 kb.

Mit einem Gradientenmischer werden in Ultrazentrifugenröhrchen lineare NaCI-Dichtegradienten von 30% bis 5% in 3 mM EDTA pH 8.0 hergestellt und die DNAs aufgetragen. Nach Zentrifugation für 5 h bei 37.000 Upm und 25* C (Beckman Ultrazentrifuge L7-65, Rotor SW 41) wird der Gradient in 500 ul Fraktionen geerntet. Nur Fraktionen mit DNA von mehr als 30 kb und weniger als 50 kb werden dreimal 2 h gegen TE dialysiert, mit Ethanol gefällt und in je 50 ul TE gelöst.

Als Kloniervektor wird sCos 1 (Fa.Stratagene) verwendet. Die BamHI und Xbal geschnittenen Vektorarme werden hergestellt und modifiziert, wie von Evans et al. (1989) angegeben. 1 ug davon werden mit ca. 500 ng der DNA Fragmente in 20 ul Ligationsmix (Tris-HCI 66 mM, MgCfe 5 mM, DTE 1 mM, ATP 1 mM, pH 7.5) mit 16 Einheiten T4-DNA-Ligase (Fa.Boehringer) 16 h bei 12 *C ligiert. Je 4 ul des Ansatzes werden mit Packaging-Extrakten (Gigapak, Fa.Stratagene) in Lambda Phagenhüllen verpackt. Als Wirtstamm für die Infektion wird E.coli SRB (FaStratagene) verwendet, die Bakteriophagen-Lambda kompetenten Zellen werden nach Sambrook et al.(1989) hergestellt. Nach der Infektion werden die Ansätze in Aliquots auf LB-Medium (Maniatis et al., 1982) mit 75 ug/ml Ampicillin plattiert. Rekombinante Klone werden als Kolonien nach 20 h bei 37 · C erkennbar. Insgesamt werden ca. 50.000 Kolonien erhalten, die dann in 0.9% NaCI/20% Glycerin suspendiert und bei -70 * C gelagert werden. Eine Analyse von 40 willkürlich ausgewählten Klonen durch Isolierung und Restriktion der enthaltenen Cosmide ergibt, daß alle Klone rekombinante Cosmide enthalten: die durchschnittliche Insertgröße beträgt 36 kb. b) Isolierung von Cosmidklonen

Die Cosmid-Genbank aus Beispiel 11a wird in einer Dichte von ca. 2.500 Kolonien pro 85 mm Platte auf LB Medium, mit 75 ug/ml Ampicillin, (Maniatis et al., 1982) plattiert. Der Transfer auf je zwei Nylon-Membranen (Duralon UV, Stratagene) wird durchgeführt, wie bei Sambrook et al.(1989) beschrieben. Das 1.6 kb Hindill - Fragment aus \syn3 (siehe Abbildung 1) wird mittels "Random-Priming" (FaStratagene) mit alpha-32P-dATP markiert und als Hybridisierungssonde verwendet.

Die Vorhybridjsierung wird 6 h, die Hybridisierung 18 h bei 42 °C in 5xSSC, 40%,Formamid, 5xDenhardt's (Maniatis et al., 1982), 0.1% SDS, 25 mM NaH2PC>4. pH 6.5, 250 ug/ml Heringsperma-DNA durchgeführt. Die Filter werden 2x10 min in 2xSSC / 0.1% SDS bei Raumtemperatur und 2 x 40 min in 1xSSC / 0.1% SDS bei 60 “C gewaschen. Die Membranen werden 14 h auf Röntgenfilm (Kodak Xomatic AR) exponiert. Kolonien von positiven Signalen werden gereinigt, die entsprechende Cosmid-DNA daraus isoliert und durch verschiedene Restriktionsanalysen und Hybridisierungen mit der markierten Xsyn3-Sonde, sowie der VektorDNA sCos1 charakterisiert. Abbildung 4 zeigt die Restriktionskarte des Monierten Bereiches eines solchen Cosmids, syncos13; die darin enthaltene Tolypocladium niveum DNA beträgt etwa 35 kb und schließt auch den Bereich von Xsyn3 ein.

Beispiel 12: Isolierung eines P1-Klons mit dem vollständigen Gen für die Cyclosporin-Synthetase

Protoplasten von Tolypocladium niveum werden, wie in Beispiel 17 beschrieben, hergestellt und in einer Dichte von 103/ml in TPS suspendiert. Je 1 ml dieser Suspension wird mit 1 ml geschmolzener und auf 40’C temperierter 1.6% Agarose (Incert, Fa.FMC) gemischt und mittels eines Gießstandes (BioRad) in kleine, 1.5 mm dicke Blöckchen gegossen. Nach Erstarren werden die Blöckchen in Lysepuffer (0.45 M EDTA pH 8.0,1% N-Lauroylsarkosin, 1 mg/ml Proteinase K) überführt und für 16 h bei 55 · C inkubiert.

Die Blöckchen werden 3 x 2 h unter langsamem Schwenken in 0.5 M EDTA pH 8.0 gewaschen und bei 4*C gelagert. Vor den entsprechenden Restriktionen werden die Blöckchen in kleine Streifen geschnitten, in Eppendorf-Röhrchen überführt und 4 x 2 h und 1 x 16 h in TE gewaschen. In vier parallelen Ansätzen werden die Blöckchen bei 4*C in je 300 al 1 x BamHI-Puffer (Fa.NEB), supplementiert mit 100 ug/ml Rinderserumalbumin (Fa.NEB) und 80 uM S-Adenosylmethionin, 3 h auf Eis vorinkubiert. Anschließend 10

AT 398 434 B werden je 2 Einheiten BamHI (Fa.NEB) und 16, 20, 24 bzw. 28 Einheiten BamHI-Methylase (Fa.NEB) zugesetzt, weitere 90 min auf Eis und 3 h bei 37* C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 20 mM EDTA und 0.5 mg/ml Proteinase K 30 min bei 37 "C gestoppt.

Die Blöckchen werden auf ein 1% Agarosegel (Seaplaque, Fa.FMC) aufgetragen und die DNA-Fragmente 5 durch Pulsfeldgelefektrophorese getrennt (Chef DR II; Fa.BioRad), 0.5 x TBE ( Maniatis et al., 1982), Switch Intervall von 8 - 16 s, 150 V, 16 h, 12’C) Der Bereich der DNA-Fragmente zwischen 70 und 100 kb wird aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose mittels Agarase I (Fa.NEB) hydrolysiert.

Als Kloniervektor wird pNS528tetl4-Ad10-SacllB (Fa.DuPont-NEN) verwendet. Die Vektorarme werden präpariert, wie bei Pierce et al.(1982) angegeben. Etwa 250 ng davon werden mit ca. 500 ng der DNA-10 Fraktion 16 h bei 16* C ligiert (Durchführung wie in Beispiel 11, 15 ul Gesamtvolumen). Nach Erhitzen der Ligation für 10 min auf 70 “C werden 4 ul Aliquots mit Pacase (Fa.DuPont-NEN) geschnitten und durch Zusatz des "Head/Tair-Exraktes in Bakteriophagen P1 - Hüllen verpackt, wie bei Pierce und Sternberg (1991) beschrieben. Nach Infektion von E.coli NS3529 wird auf LB-Medium (Maniatis et al., 1982) mit 25 ug/ml Kanamycin und 5% Saccharose plattiert. Rekombinante Klone werden nach Inkubation der Platten 15 bei 37'C für 20 h sichtbar. Insgesamt werden etwa 2000 Kolonien erhalten, die als Pool in 0.9% NaCI / 20% Glycerin bei -70" C als "P1-Bank" gelagert werden.

Die Genbank (10 x 500 Kolonien) wird gescreent wie in Beispiel 11 (Cosmid-Klone) dargestellt. Es wird unter anderen ein positiver Klon erhalten, der alle Fragmente des Cosmid-Klones syncos13 sowie zusätzlich noch weitere etwa 30 kb in 5'-Richtung des CyclosporinSynthetase-Gens enthält. Hybridisierung mit den 20 aus Aminosäure-Sequenzen abgeleiteten Oligonukleotid-Gemischen (siehe Beispiel 9, sowie Durchführung Beispiel 10) zeigt, daß alle getesteten Sequenzen auf diesem P1-Klon (synp4) enthalten sind. Damit ist gesichert, daß das vollständige Gen für die Cyclosporin-Synthetase auf diesem Klon synp4 enthalten ist. 25 30 35 40 45 50 11 55

AT 398 434 B

Beispiel 13: DNA-Teilsequenz des Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum ATCC34921 a) Ein Teil der in syncos 13 Monierten DNA (Beispiel 12b) wird sequenziert. Man erhält folgende DNA-Sequenz: 10 20 30 40 50 60

AAGCTTGTTT TGCTCGGCAG TGGTGTCACA GCCCCCGAGC AAGAGAACCC CGAGGTGGAA 70 80 90 100 110 120

GCTGTTGGTA TTCAAGAGAT CTTGGCCGGC ACTGGACTGG ACAAGACACAAGGCAGCAAC 130 140 150 160 170 180

GCCCGACCCT CGGCAACGAG CCTTGCTTAT GTTATCTTCA CCTCTGGTTC AACCGGCAAG 190 200 210 220 230 . 240

CCCAAGGGCG TCATGGTCGA ACATCGTAGC GTTACGAGAT TGGCAAAGCC CAGCAÄCGTT 250 260 270 280 290 300

ATCTCCÄAGC TACCACAAGG AGCCAGGGTG GCGCACCTCG CCAACATTGC CTTCGATGCC 310 320 330 340 350 360

TCGATCTGGG AAATTGCCAC AACTCTTCTG AATGGAGCCA CGCTTGTTTG TCTGGACTAT 370 380 390 400 410 420

CACACCGTTC TCGACTGCAG GACTCTCAAA GAAGTCTTCG AAAGGGAAAG CATTACGGTT 430 440 450 460 470 480

GTCACACTGA TGCCTGCGCT CCTCAAGCAG TGCGTGGCCG AAATACCCGA -GACCCTCGCA 490 500 510 520 530 540

CACCTCGACC TCCTGTACÄC CGGTGGAGAT CGAGTGGGTG GTCACGATGC TATGCGGGCT 550 560 570 580 590 600

CGCTCGCTAG TCAAGATCGG CATGTTCAGC GGTTACGGCC CTACGGAGAA CACCGTCATC 610 620 630 640 650 660

AGCÄCCATCT ACGAAGTTGA TGCAGACGAG ATGTTTGTGA ATGGTGTGCC TATCGGCAAG 670 680 690 700 710 720

ACTGTAAGCA ACTCTGGGGC ATATGTTATG GACAGGAATC AGCAGCTGGT GCCTAGTGGC 12

AT 398 434 B

730 • 740 750 760 770 780 GTGGTAGGTG AGCTTGTGGT CACTGGCGAT GGCCTTGCTC GCGGATACAC TGATCCATCC 790 800 810 . 820 830 840 CTAAACAAGA ACCGCTTCAT TTACATCACT GTCA&TGGAG AGAGTATCAG GGCATATCGG 850 860 870 880 •890 900 ACTGGCGATC GGGTGAGGTA CCGGCCTCÄT GATCTGCAGA TTGAÄTTCTT TGGCCGCATG 910 920 930 940 950 960 GACCAGCAGG TCAAGATCCG TGGCCATCGA ATCGAGCCGG GAGAGGTGGA GAGCGGATTG 970 980 990 1000 1010 1020 CTCAGTCACA ACTCGGTACÄ AGACGCCGCG GTCGTCATTT GCGCGCCAGC AGATCAAGAC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 TCAGGCGCGG AAATGGTGGC ATTCGTTGCC GCCCGGAATA CCGAAGACGA AGACACCCAG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GAGGAAGAAG CAGTCGATCA GGTTCAAGGG TGGGAGACGC ACTTCGÄAAC GGCCGCAXAT U150 1160 1170 1180 1190 1200 TCAGAAGTCA AGGACATTCG AGAGTCAGAA GTCGGTAACG- ACTTCATGGG CTGGACTTCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1 i GCAGCGAGAT CGACAAGACA GATATGCACG AGTGGCTCAA GGACACCATG 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1 | TCGACGCCAG· AGAGCCGGGC CACGTACTGG AGATCGGTAC CGGCACCGGC 1330 1340 1350 .1360 1370 1380 ATGGTCATGT TCAACCTTGC CAAGTGTCCT GGTCTGCAGG GCTACGTCGG TTTCGAGCCT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 TCAAAGTCGG CÄGCCCAATT CGTCAATGÄT GCAGCCCAGT CATTCCCGGC TCTGAAGGAT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GGCCGGTCAA TAGTCCATGT GGGCACGGCG ACAGACATCA ACAAGGCTGG GCCGATTCAA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CCACGCCTCG TCGTTATGÄA CTCAGTAGCG CAGTATTTCC CCACGCCAGA GTACCTCTTC * 1570 1580 1590 1600 1610 1620 AGGGTTGTGG AGGCCCTTGT ACAGATCCCA AGCGTGGAAC GCATCGTCTT TGGTGACÄTG 1630 1640 1650 1660 1670 1680 AGAACCAAGG CCATCAACAG AGAGTTCGTC GCAAGCCGAG CATTGCACAC CCTCGGCGAG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 AAGGCAAACA AGCGCCTGGT CCGCCAGATG ATCTATGAGC TCGAAGCCAA CGAAGAGGAA 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CTTCTGACGG ACCCTGCATT CTTTACÄTCT TTGCGTACGC GCTTGGGTGA GAAGATCÄAG 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GACG7CGAAA TTCTCCCCAA GACGATGAAG GCTACCAACG AGCTCAGCAA GTACCGATAT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 GCCGCAGTAC TACATGTGCG TGGCTCGAGÄ GAACAATCAA CTATACACCA AGTCTCTCCC 13

AT 398 434 B 1930 1940 1950 .1960 1970 1980

AACGCCTGGA TAGACTTTGC GGCAGACGGT CTCGACCGGC AGACCCTCAT CAACTTGCTG 1990 2000 2010 2020 2030 2040

AAGGAGCACA. AGGATGCCGG GACCGTCGCT ATCGGTAATA TCCCGTACAG CAAGACCATT 2050 2060 2070 2080 2090 2100

GTTGAGCGGT TTGTCAACAA GTCACTGAGC GAGGATGATA TGGAGGAAGG CCAGAACTCA 2110 2120 2130 2140 2150 2160

CTGGACGGÄT CAGCTTGGGT. TGCAGCCGTC CGGATGGCCG CTCAAAGCTG CCCATCACTC 2170 2180 2190 2200 2210 2220

SATGCAATGG ATGTCAAGGA GATTGCTCAG GAGGCGGGAT ACCAGGTCGA AGTCAGTTGG . 2230 2240 2250 2260 2270 2280

GCGCGTCAAT GGTCCCÄGAA TGGTGCGCTC GATGCCATCT TCCATGACTT CGAACCGCCC .2290 2300 2310 2320 2330 2340

AAGGAGGGTG CTCGCACACT TATTGAGTTC CCGACGGATT ACGAAGGCCG GAATGTGAAC 2350 2360 2370 2380 2390 2400

ACCTTAACGA AGCGTCCCCT GAACAGCATT CAAAGCCGCC GTCTTGGGAC GCASATCCGC »1Ό 2420 2430 2440 2450 2460

GAGAAGCTGC AGACCCTCCT GCCGCCTTAC ATGATCCCAT CGCGCATCAT GGTCCTTGAT 2470 2480 2.490 2500 2510 2520

CAGATGCCTG TCAACAACAA CGGCAAGATT GACCGCAAGG AGCTTGTGCG GAGAGCTATC 2530 2540 2550 2560 2570 2580

GTGGCCCCGA AGCCAAGGTC AGCGGCTACT CGGGTAGCCC CCCGCAATGA GATCGAGGCT 2590 2600 2610 2620 2630 2640

ATTCTGAGAG ACGAATTCGA GGACGTGCTC GGAACAGAAG TCAGCGTGCT GGATAACTTC 2650 2660 2670 2680 2690 2700

TTTGATCTCG GCGGGCACTC ACTTATGGCC ACGAAGCTCG CCGCCCGCGT TAGCCGCCGC 2710 2720 2730 2740 2750 2760

CTTGATGCCC ATATTTCCAT CAAAGATGTC TTTGATCAGC CGGTGCTGGC GGATCTTGCG 2770 2780 2790 2800 2810 2820

GCGTCCATCC AGAGAGAATC GGCTCCTCAT GAACCGATTC CGCAAAGGCC TTACACCGGG 2830 2840 2850 2860 2870 2880

CCGGCTGAAC AGTCATTTGC CCAAGGTCGC CTATGGTTCC TTGACCAGCT TAACCTTGGC 2890 2900 2910 2920 2930 2940

GCGACCTGGT ACCTGATGCC TTTAGCCATC CGTATCCGTG GCCAGTTGAG GGTAGCTGCG 2950 2960 2970 2980 2990 3000

TTGTCTGCCG CACTCTTCGC CTTGGAGAGA CGACATGAGA CCTTGAGAAC CACCTTTGAA 3010 3020 3030 3040 3050 3060

GAAAGCGÄCG GCGTTGGCGT GCAAATTGTT GGAGAGGCTC GCAACTCAGA CCTTCGGGTT 14

AT 398 434 B 3070 3080 3090 3100 3110 3120

CATGACGTTT CTACCGGAGA. CGACGGGGAG TACCTTGAGG TACTCAGGAG GGAACAGACT 3130 3140 3150 3160 3170 3180

GTGCCCTTCG ACCTCTCGTC AGAGCCTGGC TGGAGGGTTT GCCTGGTCAA AACGGGCGAA 3190 3200 3210 3220 3230 3240

GAGGATCAXG TACTATCCAT CGTCATGCAC CATATTATTT ACGACGGCTG GTCCGTGGAC 3250 3260 327Ö 3280 3290 3300

ATTCTCCGCG GAGAGTTGGG TCAATTCTAT TCCGCTGCGC TACGCGGCCA GGACCCCTTG 3310 3320 3330 3340 3350 3360

CTGCACGCCA ACCCCCTTCC TATTCAATAC CGGGATTTCG CAGCGTGGCA AAGGGAGGCA 3370 3380 3390 3400 3410 3420

AAACAGGTCG AAGAGCATCA ACGTCAACTT GGGTACTGGT CGAAACAGCT CGTTGACAGC 3430 3440 3450 3460 3470 3480

ACTCCAGCTG AGCTCTTGAC GGATCTGCCT CGCCCGTCTA TCTTGTCCGG TCGTGCCGGG 3490 . 3500 3510 3520 3530 3540

TCGGTGGATG TCACGATCGA. AGGCTCTGTT TACGGAGCCC TTCAGXCATT CTGCCGCACG 3550 3560 3570 3580 3590 3600

CGTTCGGTAA CCACATTCGT TGTGCTTCTG ACTGTGTTCC GGÄTTGCGCA TTTCCGTCTC 3610 3620 3630 3640 3650 3660

ACTGCCGTCG ATGACGCGAC TAXCGGCACG CCTATCGCAA ACCGTAACCG.TCCTGAGCTG 3670 3680 3690 3700 3710 3720

GAGACGTTGG TTGGCTGCTT TGTAAACACG CAATGXATGC GTATCAGCAT AGCCGACGAC 3730 3740 . 3750 3760 3770 3780

GATAACTTTG AAX3GTCTTGT GCGACAGGTG CGTAATGTTG CAACGGCAGC TTACGCGÄAG 3790 3800 3810 3820 3830 3840

CAAGATGTTC CTTTCGÄACG AATCGTGTCC GCCCTAGTTC CAGGGTCGAG AAACAGATCC 3850 3860 3870 3880 3890 3900

CGCAACCCCC TGGTXCAGCT CATGTTTGCT GTCCAGTCCG TGGAAGATTA TGACCAGGTC 3910 3920 3930 3940 3950 3960

CGACTCGAGG GCTTGGAGAG TGTCATGATG CCTGGAGAAG CCTCCACACG CTTXGATATG 3970 3980 3990 4000 4010 4020

GAATTCCACC TCGTCCCCGG CGATCAGAAG CTTACGGGCA GCGTTCTTTA CTCCTCAGAC 4030 4040 4050 4060 4070 4080

CTTTTTGAGC AAGGCACTAT CCAGAACTTC GTCGACATCT TCCAAGAATG TCTTCGCTCC 4090 4100 4110 4120 4130 4140

GTCCTGGACC AGCCATTGAC CCCGATCTCC GTTC77CCCT TCAGCAACGC CATTTCAAAC 4150 4160 4170 4180 4190 4200

CTCGAGAGCT TGGATCTCCT GGAGATGCCG ACCTCAGACT ACCCCCGCGA TCGGACAGTC 4210 4220 4230 4240 4250 4260

GTTGATCTCT TCCGAGAGCA AGCGGCAATC TGCCCCGACA GCATCGCCGT CAAAGACTCA 15

AT 398 434 B 4270 4280 4290 4300 4310 4320

TCGTCGCAAC TGACATATGC TCAACTGGAT GAGCAATCCG ACCGTGTTGC CGCCTGGCTG 4330 4340 4350 4360 4370 4380

CACGAGCGCC ACATGCCGGC GG&GTCTTTG GTCGGTGTAC TGTCGCCACG GTCGTGCGAG 4390 4400 4410 4420 4430 4440

ACTATCÄTCG CGTACTTTGG CATCATGAAG GCAAACCTGG CTTACCTGCC GTTGGATGTT 4450 ' 4460 4470 4480 4490 4500

TATGCGCCAG ATGCCCGTCT GGCGGCTATC CTGGATACAG TCGAAGGCGA AAGACTGCTT 4510 4520 4530 4540 4550 4560

CTGTTGGGCG CAGGTGTCCC TCAGCCCGGC ATCCAGATCC CTCGCCTGTC AACAGCATAC 4570 4580 4590 4600 4610 4620

ATCGCGGAAG CACTGAGCCA TGCCACGACC GTCGATGTCA CTTCCATCCC ÄCAGCCCTCG 4630 4640 4650 4660 4670 4680

GCCACCÄQCC TTGCGTACGT CATTTTCACT TCGGGATCTA CTGGCAAGCC CÄAGGGTGTC 4690 4700 4710 4720 4730 4740

ATGATCGAGC ATCGCGGCAT CGTGCGCCTG GTTAG&GATA CCAACGTCAA CGTGTTCCCG 4750 4760 4770 -4780 4790 4800 -

GAATCGGGAT CAGCTTTGCC TGTCTCTGAC TTCTCCAACC TCGCCTGGGA TGCGGCGACT 4810 4820 4830 4840 4850 4860

TGGGAGATCT ACACTGCCGT GCTCAATGGA GGGACCGTTG TGTGCATTGA CCGAGACACC 4870 4880 4890 4900 4910 4920

ATGCTGGACA TAGCCGCGTT GAACTCAACA TTCCGGAAGG AGAACGTTCG GGCTGCCTTC 4930 4940 4950 4960 4970 4980

TTCACCCCTG CCTTCCTGAA GCAATGCCTT GCCGAGACGC CAGAGCTGGT CGCCAACCTA 4990 5000 5010 5020 5030 5040

GAGÄTCCTTC ACACGGCAGG CGATCGTCTC GATCCTGGAG ATGCCAACCT GGCTGGAAAG 5050 5060 5070 5080 5090 5100

ACAGCCAAGG GTGGTATCTT CAACGTCCTG GGTCACACAG AGAACACTGC CTATAGTACC 5110 5120 5130 5140 5150 5160

TTCTACCCTG TGGTTGGTGA GGAGACGTTC GTCAATGGTG TCCCCGTCGG TCGCGGCATC 5170 5180 5190 5200 5210 5220

AGCAACTCCC ATGCATATAT CATCGACCGA CACCAGAAGC TCGTACCCGC AGGTGTCATG 5230 5240 5250 5260 5270 5280

GGAGAGCTTA TTCTCACTGG CGACGGTGTT GCGCGAGGTT ACACCGACTC TGCGCTGAAC 5290 5300 5310 5320 5330 5340

AAGGATCGAT TCGTTTACAT CGATATCAAC GGCAAAAGCA CATGGTCGTA CCGCACAGGC 5350 5360 5370 5380 5390 5400

GATAAGGGAC GTTATCGACC AAGGGACGGC CAGCTGGAAT TCITTGGCCG CATGGACCAA 16 ΑΤ 398 434 Β

5410 5420 5430 5440 5450 5460 ATGGTCAAGA TCCGTGGTGT TCGAATCGAA CCCGGCGAAG TTGÄGCTCAC CCTGCTCGAC 5470 5480 5490· 5500 5510 5520 CATAAGTCCG TCCTGGCCGC GACTGTGGTG GTCAGAAGAC CACCCAATGG CGACCCGGAG 5530 '5540 5550 5560 .5570 5580 ATGATTGCCT TCATCACCAT CGACGCTGAA GACGACCTGC AAACTCACAA GGCCATTTAC 5590 5600 5610 5620 5630 5640 1 1 AGGGTATCTT GCCCGCGTAC ATGATTCCCT CACACCTTGT CATCCTTGAC 5650 5660 5670 5680 5690 5700 CAGATGCCGG TCACCGACAA CGGTAAGGTC GATCGCAAGG ATCTCGCACT CAGAGCGCAG 5710 5720 5730 5740 5750 .5760 ACAGTACAGA AACGCAGGTC TACCGCTGCA AGGGTACCAC CTCGTGACGA GGTGGAGGCT 5770 5780 5790 5800 5810 5820 GTTCTTTGCG AAGAGTACAG CAACTTACTT GAAGTTGAGG TTGGCATTAC CGACGGATTC 5830 5840 5850 5860 5870 5880 TTCGAGCTGG GTGGACATTC GCTCCTCGCC ACCAAGCTTG CGGCCCGCCT AAGCCGACAA 5890 5900 5910 5920 5930 5940 CTCÄACACTC •GCGTSTCWST CAAGGACGTC TTTGACCAGC CAÄTACTCGC TGACCTCGCT 5950 5960 5970 5980 5990 6000 GATATCATCC GCCGCGGTTC CCATCGCCAC GATCCGATTC CTGCCACTCC ATACACGGGC 6010 6020 6030 6040 6050 6060 CCTGTCGAAC AGTCGTTCGC TCAGGGCCGC CTGTGGTTCT TGGA&CA&CT GAACCTAGGT 6070 6080 6090 6100 6110 6120 GCCAGCTGGT ACTTGATGCC CTTCGCGATC CGGATGCGTG GGCCCCTCCA GACAAAGGCG 6130 '6140 6150 6160 6170 6180 CTGGCTGTCG CACTGAACGC CTTGGTGCAC CGGCACGAGG CGTTGCGGAC GACTTTCGAG 6190 6200 6210 6220 6230 6240 GACCACGATG GGGTTGGTGT TCAGGXCATT CAACCAAAGT CÄAGCCAAGA CCTGCGGATC 6250 6260 6270 6280 6290 6300 ATCGACCTAT CAGACGCTGT AGATGAIACT GCCTATCTCG CCGCGCTCAA GAGGGAACAG 6310 6320 6330 6340 6350 6360 ACAACAGCCT TCGACCTGAC CTCXGAACCA GGGTGGAGAG TGTC&CTOTT ACGCCTAGGT 6370 6380 6390 6400 6410 6420 1 1 ACATCCTTTC TATCGTTATG CACCACAXXA TCTCTGATGG CTGGÄCTGTT 6430 6440 6450 6460 6470 6480 GATGTGCTAC GACAAGAAC7 CGGCCAGTTC TATTCAGCTG CGATCAGGGG TCAGGAGCCT 6490 6500 6510 6520 6530 6540 TTATCGCAGG CCAAGTCCCT. CCCTATTCAA TACCGCGACT TTGCTGTTTG GCAGAGGCAG 6550 6560 6570 6580 6590 6600 GAGAACCAGA TCAAGGAGCA AGCGAAGCAG CTCAAGTATT GGTCACAGCA GCTCGCAGAT 17

AT 398 434 B

6610 6620 6630 6640 6650 6660 AGCACCCCCT GCGAGTTCCT AACGGACCTC CCTCGGCCCT CTATCCTGTC TGGTGAAGGT 6670 6680 6690 6700 6710 6720 GACGCCGTTC CTATGGTGAT TGATGGCACG GTG1ATCAGC TCCTTACTGA TTTCTGCCGG 6730 6740 6750 6760 6770 6780 ACGCACCAAG TCACATCGTT CTCAGTCCTG CTCGCAGCCT TCCGCACTGC CCACTACCGC 6790 6800 6810 6820 6830 6840 CTTACCGGGA CACTCGACGC GACGGTTGGC ACACCAATCG CTAACCGGAA CCGGCCAGAG 6850 6860 6870 6880 6890 6900 TTGGAAGGTC TGATCGGTTT CTTCGTTAAC ACGCAGTGTA TGAGGATGGC AATCAGTGAG 6910 6920 6930 6940 6950 6960 actgaaacct TTGAGTCACT. AGTCCAGCAG GTTCGCTTGA CTACGACAGA AGCCTTTGCG 6970 6980 6990 7000 7010 7020 AACCAAGATG TGCCGTTTGA GCAGATTGTG TCAACCCTTC TTCCTGGGTC ACGAGATACG 7030 7040 7050 7060 7070 7080 TCAAGGÄACC CGCTTGTGCA GGTCATGTTT GCCCTGCAAT CACAGCAAGA CCTCGGAAGA 7090 7100 7110 -7120 7130· 7140 ATCCAGCTGG AAGGTÄTGAC GGACGAAGCT CTGGAAACGC CGCTGTCGAC GAGACTCGAC 7150 7160 7170 7180 7190 7200 CTTGAGGTTC ACCTCTTCCA GGAGGTTGGA AAGCTGAGCG GCAGCCTCTT GTACTCCAGG 7210 7220 7230 7240 7250 "7260 GACCTCTTCG AGGTCGAGAC GATTCGTGGA ATCGTTGATG TGTTCCTGGA GATCTTGCGC 7270 7280 7290 7300 7310 7320 CGCGGCCTTG AGCAACCCAA GCAGCGACTG ATGGCCATGC CAATTACCGA TGGCATCACA 7330 7340 7350 • 7360 7370 7380 A&GCTACGCG ACCAGGGTCT CCTAACAGTG GCGAAACCAS CCTACCCTCG CGAATCGAGT 7390 7400 7410 7420 7430 7440 GTCATAGATC TGTTCAGACA GCAGGTTGCC GCCGCACCGG ATGCCATCGC TGTGTGGGAT ,7450 7460 7470 7480 7490 7500 TCCTCCTCÄA CATTGACCTA tcccgacctc GATGGGCAAT CGAACAAGCT CGCCCACTGG 7510 7520 7530 7540 7550 7560 CTGTGCCAGC GCAATAIGGC CCCAGAGACC TTGGTAGCTG TATTCGCGCC ACGCTCATGC 7570 7580 7590 7600 7610 7620 CTCACCATCG TCGCATTCCT CGGTGTTTTG AAGGCTAATC TGGCCTACCT GCCCTTGGAT 7630 7640 7650 7660 7670 7680 GTCAATGCGC CTGCTGCTCG TATCGAGGCT ATCCTGTCAG CAGTACCAGG CCACAAGCTG 7690' 7700 7710 7720 7730 7740 GTCCTGGTGC AGGCTCATGG GCCCGAGCTT GGCCTGACGA TGGCTGATAC TGAACTGGTG 18

AT 398 434 B 7750 7760 7770 7780 . 7790 7800

CAGATCGACG AGGCACTTGC ATCCAGTTCA TCCGGTGACC ATGAGCAGAT CCAIGCCTCC 7810 7820 7830 7840 7850 7860

GGCCCTACTG CCACAAGTCT TGCCTACGTG ATGTTTACGT CAGGGTCTAC TGGGAAACCA 7870 7880 7890 7900 7910 7920

AAGGGTGTCÄ TGATCGACCA CCGCAGCATC ATTCGÄCTTG TCAAGAACAG CGA3JGTTGTT 7930 7940 7950 7960 7970 7980

GCCACTCTGC CTACGCCAGT CCGGATGGCG AATGTATCAA ACCTTGCCTT CGACATCTCG 7990 8000 8010 8020 8030 8040

GTGCAAGAAA TCTACACGGC GCTCCTAAAC GGTGGCACTC TGGTCTGCTT GGACTATCTG . 8050 8060 8070 8080 8090 8100

ACGCTATTGG ACAGCAAAAT TCTTEÄTAAC GTTTTTGTGG AAGCACAGGT CAACGCCGCC 8110 8120 8130 8140 8150 8160

ATCTTCACGC CGGTTCTCCT CAAGCAATGT CTrGGAAACA TGCCCGCCAT CATCAGTCGC 8170 8180 8190 8200 8210 8220

CTGAGTGTTC TCTTTAACGT TGGTGACAGG CTGGATGCCC ACGATGCTGT GGCTGCATCA 8230 8240 8250 8260 8270 8280

GGCCTGAICC AAGACGCCGT AXACAACGCC TACGGTCCCA CGGAGAACGG -CATGCAGAGT 8290 8300 8310 8320 8330 8340

ACGATGTACÄ AGGTCGÄCGT CAATGAGCCT TTCGTCAACG GCGTCCCGAT CGGTCGATCC 8350 8360 8370 8380 8390 8400

ATCACCAACt CTGGGGCTTA CGTCÄTGGAC GGCAATCAAC AGCTCGTATC TCCTGGTGTG 8410 8420 8430 8440 8450 8460

ATGGGAGAAA TTGTCGTTAC CGGTGATGGT CTTGCCCGTG GCTAIACAGA CTCAGCCCTA 8470 8480 6490 8500 8510 8520

GACGAGGACC GGTTTGTTCA CGTCACGATC GATGGTGAGG AAAATATCAA GGCATACCGA 8530 8540 8550 8560 8570 8580

ACCGGTGATC GAGTCCGCTA CCGGCCCAAG GACTTTGAGA TTGAATTCTT CGGCCGTATG 8590 8600 8610 8620 8630 8640

GATCAACAGG TGAAGATTCG TGGTCACCGC ATTGAGCCAG CAGAAGTGGA ACATGCACTG 8650 8660 8670 8680 8690 8700

CTCGGCCACG ACTTGGTTCA CGATGCAGCT GTCGTGCTTC GAAAGCCÄGC AAATCAAGAA 8710 8720 8730 8740 8750 8760

CCAGAGATGA TTGCTTTCAT CACCAGCCAG GAAGACGAGA CTATCGAGCA GCATGAGTCA . 8770 8780 8790 8800 8810 8820

AACAAGCAGG TCCAAGGCTG GGGAGAGCAT TTCGACGTAA GCAGGTATGC TGATATCAAG 8830 8840 8850 8860 8870 8880

GATCTCGACA CTTCTACCTT TGGTCACGAC TTTTTGGGAT GGACATCTAT GTATGACGGA 8890 8900 8910 8920 8930 8940

GTTGACATTC CTGTCAACGA GATGAAAGAG TGGCTTGATG AAACTACGGC CTCCCTCCTA 19

AT 398 434 B 8950 8960. 8970 8980 8990 9000

GACAACCGCC CACCTGGTCA TATCCTCGAG ATCGGAGCCG GÄÄCTGGCA7 GATTCTATCT 9010 9020 9030 9040 9050 9060

AACCTGGGGA AAGTCGACGG CCTACAGÄAG TATGTCGGTC TTGACCCGGC TCCCTCAGCC 9070 9080 9090 9100 9110 9120

GCAATCTTTG TCAACGAAGC CGTCAAGTCT CTGCCAAGTC TAGCCGGTAA GGCCCGGGTA 9130 9140 9150 9160 9170 9180

CTTGTTGGAA CTGCCCTGGA XA7CGGTTCT CTGGACAAGA ATGAGATCGA ACCTGAGCTT 9190 9200 9210 9220 9230 9240

gtggttatca actccgtggc ccagtacttc cccacatcag AGTACTTGAT CAAGGTGGTC 9250 9260 9270 9280 9290 9300

AÄAGCTGTTG TGGAAGTGCC CAGCGTCAAG CGTGTTTTCT TTGGCGATAT CAGATCCCAG 9310 9320 9330 9340 9350 9360

GCCCTTAACA GGGACTTCCT TGCAGCTCGT GCCGTTGGTG CGTTGGGTGA CAATGCTAGC 9370 9380 9390 9400 9410 9420

AAAGAGCAGA TCCGGGAAAA 6ATCGCAGAG CTCGAAGAGA GCGAAGAAGA ACTTCTCGTG 9430 9440 9450 -9460 -9470 9486

GACGCAGCCT TCTTCGTGAG CTTGAGAAGC CAGCTGCCCA ACATCAAGCA CGTTGAGGTC 9490 9500 9510 . 9520 9530 9540

CTGCCG&AGC TGATGAAGGC GACCAACGAG CTGAGCTCGT AGAGATATGC TGCGGTTCTA 9550 9560 9570 9580 9590 9600

CACATCAGCC ACAACGAAGA GGAGCAGCTG CTCATACAGG ATATCGATCC CACAGCATGG 9610 9620 9630 9640 9650 9660

GTTGACTTTG CAGCAACGCA AAAGGACTCT CAAGGTCTGA GAAACCTTCT ACAACAAGGA 9670 9680 9690 9700 9710 9720

CGAGATGATG TGATGATCGC GGTCGGGAAC ATCCCGTACA GCÄAGACCAT AG7GGAGCGA 9730 9740 9750 9760 9770 9780

CACATTATGA ACTCTCTTGA CCAAGATCAC GTCAACTCAC TCGACGGGAC ATCCTGGATC 9790 9800 9810 9820 9830 9840

TCAGATGCTC GATCAGCCGC TGCAATCTGC ACTTCGTTCG ACGCACCCGC CCTCACGCAG 9850 9860 9870 9880 9890 9900

TTGGCCAAGG AGGAGGGATT CCGGGTAGAG TTGAGCTGGG CGCGACAGAG ATCTCAAAAC 9910 9920 9930 9940 9950, 9960

GGCGCCCTCG ATGCCGTTTT CCACCGTCTT GCAACCGATG CAAATTGCGA GCGCAGTCGT 9970 9980 9990 10000 10010 10020

GTCCTGGTAC ACTTCCCTAC CGACCATCAA GGTCGACAAC TTCGAACCCT GACGAACCGG 10030 10040 10050 10060 10070 10080

CCACTCCAGC GAGCTCAGAG CCGCCGTATC GAGTCACÄAG TCTTCGAGGC ACTGCAGACA 20

AT 398 434 B 10090 10100 10110 10120 10130 10140

GCACTGCCGG CCTACATGAT CCCATCGCGC ATTÄTCGTGC TCCCGCAGAT GCCGACCAAC .10150 10160 101T0 10180 10190 10200

GCCAACGGCA AAGTGGACAG GAAACAGCTC GCTCGCCGCG CGCAGGTTGT GGCCAAGAGA 10210 10220 10230 10240 10250 10260

AAGGCAGTGT CAGCGCGCGT TGCGCCTCGT AATGACACCG AGATAGTTCT TTGCGAGGAA 10270 10280 10290 10300 10310 10320

IACGCAGATA TCCTAGGAAC TGAAGTTGGC ATCACGGACA ACTTCTTCGA CATGGGCGGG 10330 10340 10350 1036Θ 10370 10380

CATTCACTCA TGGCTACGAA GCTCGCAGCC CGACTAAGCC GGCGACTAGA TACCCGGGTT 10390 10400 10410 10420 10430 10440

ACGGTCAAGG AGGTGTTCGA TAAACCCGTC CTGGCTGACC TCGCTGCTTC GATCGAACAG 10450 10460 10470 10480 10490 10500 GGCTCGACÄC ctcatctgcc tattgcctca tcggtgtatt ccggaccggt ggagcagtcg 10510 10520 10530 10540 10550 10560 TACGCCCAÄG gtcgcttgtg gttcttggat cagttcaacc tcaacgcgac gtggtatcac 10570 10580 10590' 10600 10610 10620

ATGTCGCTGG CGATGAGGCT GCTCGGGCCG CTCAACATGG·ACGCGCTGGA CGTGGCCTTA 10630 10640 10650 10660 10670 10680

CGGGCGCTGG AGCAGCGACA CGAGACGCTT CGCACAACCT TTGAGGCTCA AAAGGACATC 10690 10700 10710 10720 10730 10740

GGCGTCCAGG TCGTTCATGA GGCCGGAATG AAGAGGCTCA AGGTCCTTGA CCTATCAGAC 10750 10760 10770 10780 10790 10800

AAGAACGAGA AGGAGCACAT GGCCGTGCTA GAGAATGAAC AGATGAGACC GTTCACTCTT 10810 10820 10830 10840 10850 10860

GCTTCAGAGC CAGGCTGGAA GGGTCATCTT GCTCGCCTTG GCCCCACGGA GTATATCCTC 10870 10880 10890 10900 10910 10920

TCCCTCGTCA TGCATCACAT GTTCTCAGAC GGCTGGTCCG TTGATATCCT GAGACAGGAG 10930 10940 10950 10960 10970 10980

CTCGGTCAAT TCTACTCAGC CGCTTTACGT GGCAGGGATC CGTTATCTCA GGTCAAGCCC 10990 11000 11010 11020 11030 11040

CTCCCAATAC AATATCGTGA CTTTGCGGCT TGGCAGAAGG AAGCTGCCCA AGTTGCCGAG 11Q50 11060 11070 11080 11090 11100

CATGAGAGGC AGCTCGCGTA CTGGGAGAAC CAGTTAGCTG ACAGTACTCC CGGTGAGCTT 11110 11120 11130 . 11140 11150 11160

CTGACCGACT TTCCCCGCCC ACAGTTCCTG AGTGGGAAGG CTGGTGTCAT CCCGGTCACC 11170 11180 11190 11200 11210 11220

ATTGAGGGGC CGGTCTACGA GAAGCTTCTG AAGTTCTCCA AGGAGCGCCA GGTAACTCTG 11230 11240 11250 11260 11270 11280

TTCTCGGTGC TATTAACAGC GTTCCGGGCC ACACACTTTC GTCTCACTGG TGCAGAGGAT 21

AT 398 434 B 11290 11300. 11310 11320 11330 11340

GCTACGATCG GTACCCCAAT TGCAAATCGC AACCGGCCAG AACTCGAGCA TATCATTGGA 11350 11360 11370 11380 11390 11400

TTCTTC-GTCA ACACCCAATG CATGCGTCTT CTCCTCGATA CCGGCAGCAC ATTCGAATCC 11410 11420 11430 11440 11450 11460

CTAGTCCAGC ATGTTCGGTC CGTGGCTACA GAIGCCTATT CCAATCAGGA TATTCCCTTC 11470 11480 11490 11500 11510 11520

GAACGGATCG TCTCGGCACT TCTCCCTGGC TCGAGAGATG CCTCACGAAG CCCACTAATC 11530 11540 11550 11560 11570 11580

CAGCTTATGT TTGCCTTGCA CTCACAGCCÄ GATCTCGGGA ACATTACTCT CGAAGGACTC . 11590 11600 11610 11620 11630 11640

GAGCATGAGC GCCTGCCÄAC AAGCGTCGCA ACACGTTTCG ACATGGAGTT CCACCTGTTC 11650 11660 11670 11680 11690 11700

CAAGAGCCTA ACAAGCTGAG TGGTTCAATA CTCTTTGCCG ATGAGCTCTT CCAGCCTGAA 11710 11720 11730 11740 11750 11760 ACAATCAACA gcgtcgtgac TGTGTTCCAG gagatactcc gacgcggcct cgaccaaccc ' -11770 .......11780 11790 11800 11810- 11820.

CAAGTCTCGA TTTCTACTAT GCCCCTGACT GATGGGTTGA TTGATCTCGA GAAACTGGGC 11830 11840 11850 11860 11870 11880

TTGCTGGAAA TCGAGAGCAG CAACTTCCCT CGCGACTACT CGGTTGTCGA CGTCTTCCGA 11890 11900 11910 11920 11930 11940

CAGCAGGTGG CTGCCAATCC AAATGCGCCC GCTGTCGTGG ATTCGGAGAC ATCCATGAGC 11950 . 11960 11970 11980 11990 12000 TACACCTCGC TAGATCAGAA gtctgagcag ATTGCTGCCT ggttacacgc tcaaggcctc 12010 12020 12030 12040. 12050 12060

CGCCCTGAGT CATTGATCTG CGTGATGGCG CCACGATCTT TCGAAACGAT CGTCTCCTTA 12070 12080 12090 12100 12110 12120 TTCGGTATtT TGAAGGCTGG ctacgcctac ctgcctctgg atgtgaattc ccctgcagct 12130 12140 12150 12160 12170 12180

CGAATCCAAC GGATCCTATC CGAGGTTGAA GGAAAAAGAC TGGTACTGCT AGGATCAGGG 12190 12200 12210 12220 12230 12240

ATAGACATGC CTCAAAGCGA CCGAATGGAT GTTGAAACCG CTCGAATTCA GGACATCCTA 12250 12260 12270 12280 12290 12300

ACGAACACAA AGGTCGAGAG ATCTGATCCC ATGAGCÄGGC CATCGGCAAC TAGCCTTGCC 12310 12320 12330 12340 12350 12360

TATGTCATCT TCACCTCCGG GTCAACTGGC CGTCCCAAGG GCGTGATGAT CGAGCATCGC 12370 12380 12390 12400 12410 12420

AATATTCTGC GCCTTGTCAA GCAGTCTAAT GTTACGTCTC AGCTGCCGCA GGATCTGCGC 22

AT 398 434 B

12430 12440 12450 12460 12470 12480 ATGGCACAIA TCTCCAACCT AGCCTTTGAC GCSTCCATCT GGGAGAEATT CACGGGAAXT 12490 12500 12510 12520 . 12530 12540 TTGAATGGCG GCGCCCTTAT TTGCATTGAT TACETCACTT TGCTGGASAG TCÄAGCCCTC 12550 12560 12570 12580 12590 12600 CGGACGACÄT TCGAÄAÄAGC CAGGGTCAAT GCTACCCTAT TCGCGCCGGC CTTGCTCÄAA 12610 12620 12630 12640 12650 12660 GAATGCCTCA ATCACGCGCC GACCTTGTTT GAGGATCTCA AAGTGCTCTA TATCGGTGGC 12670 12680 12690 12700 12710 12720 GACCGACTCG ATGCCACCGA CGGGGCCAAA ATAGAAGCCC TTGTGAAGGG CACGGTCTAC 12730 12740 12750 12760 12770 12780 i | 1 GAACACAGTC ATGAGCACGA TCTACAGGCT CACAGATGGA 12790 12800 12810 12820 12830 12840 GAGTCTTATG CTAACGGTGT GCCAATCGGC AATGCTGTGA GCAGCTCTGG CGCTTATATC 12850 12860 12870 12880 12890 12900 1 CGTTCCTCCC GGTGTTATGG GAGAGCTCGT TGTGAGCGGC 12910 12920 12930 12940 12950 12960 GÄTGGCCTCG CCCGTGGCTA CACCAACTCG ACCCTCÄATG CTGASGG7TT CGTTGAEATT 12970 12980 ' 12990 13000 13010 13020 GTCATCAACG ATCAAAAAGC CCGCGCATAC CGGACCGGAG ATCGCACTCG TTACCGGCCC 13030 13040 13050 13060 13070 13080 AAGGATGGTA GCATCGAGTT CTTCGGCCGT ATGGATCAGC AAGTTAAAAT CCGTGGTCAT 13090 13100 13110 13120 13130 13140 CGAGTTGAGC CGGCCGAGGT CGAGCAAGCC ATGCTCGGCA ATAAGGCTAT CCATGATGCA 13150 13160 13170 13180 13190. 13200 GCAGTTGTTG TTCAGGCGGT GGATGGGCAG GAAACGGAGA TGATCGGCTT TGSTTCCATG 13210 13220 13230 13240 13250 13260 GCCAGCGACA gattcagcga AGGGG&GGAG •GAGATCACCA ACCAAGTCCA GGAGTGGGAA , 13270 13280 13290 13300 13310 13320 GACCACTTCG AAAGCACCGC CTACGCTGGC ATTGAGGCCA TCGACCAGGC TACCCTGGGA 13330 13340 13350 13360 13370 13380 CGCGATTTCA CTTCÄTGGAC o •4 0 1 1 AACGGCAACT TGATTGACAA AGCCGAAATG 13390 13400 13410 13420 13430 13440 GAGGAGTGGC TTGACGATAC AATGCAATCC CTCCTTGATA AGGAGGATGC CAGGCCGTGT 13450 13460 13470 13480 13490 13500 GCTGAGATCG GAACAGGTAC CGGCATGGTT CTATTCAATT TGCCCAAGAA CGATGGCCTT 13510 13520 13530 13540 13550 13560 SAGAGCTATG TCGGTATAGA GCCTTCACGG TCTGCAGCCT TGTTCGTCGA CAAAGCAGCC 13570 13580 13590 13600 13610 13620 CSAGA.TTTCC CAGGTCTGCÄ AGGAAAGACG CAAATCCTTG TCGSCACÄGC CGAGGACATC 23

AT 398 434 B 13630 13640 13650 13660 13670 13680

AÄGCTGGTCA AfiGACTTCCA CCCTGACGTG GTTGTCATTA ACTCGGTAGC CCAATATTTC 13690 13700 13710 13720 13730 13740

CCGAGCCGGA GCTACCTTGT ACAGATAGCG AGCGAACTGA TTCACATGAC CAGGGTCAAG 13750 13760 13770 13780 13790 13800

ACGATCTTCT TTGGAGATAT GCGATCCTGG GCCACCAACA GGGATTTCCT CGTGTCCCGA 13810 13820 13830 13840 13850 13860

GCTCTTTACA CGCTÄGGTGA CAAGGCTACA AAGGATCAGA TTCGCCAGGA GGTTGCCCGA 13870 13880 13890 13900 13910 13920

CTTGAGGAGA ATGAAGACGA GTTGCTTGTT GACCCAGGAT TCTTCACCTC TTTGACCÄGC 13930 13340 13950 13960 13970 13980

CÄATGGCCCG GCAAGGTCAA GCATGTTGAG ÄTCTTGCCGA AGCGGATGAG GACGAGCAAT 13990 14006 14010 14020 14030 14040

GAACTAAGCT CGTACCGATA TGCTGCGGTG CTACACATCT GCAGGGATGG GGAGGGTAGG 14050 14060 14070 14080 14090 14100

AACAGATATG GCAGGCGTGT CCACTCAGTG GAAGAGAACG CCTGGATCGA CTTCGCGTCG 14110 14120 14130 14140 - 14150 14160

TCTGGCATGG ATCGTCACGC CCTCGTTCAG ATGCTCGATG AACGTAGAGA CGCCAAGACT 14170 14180 14190 14200 14210 14220

GTCGCCATCG GCAAGATCCC TGACAGCAAC ACGATCAACG AGCGACACTT TACGACATCC 14230 14240 14250 14260 14270 14280

CTGGATACTG AGGGAGAAGG CATTGCCCAA GATTCACTGG ATGGATCCGC CTGGCAATCG 14290 ‘ 14300 14310 14320 14330 14340

GCTACGAAGG CAATGGCCGC GCGCTGTCCT TGCCTTTCCG TCACCGAACT GGTCGAGATC 14350 14360 14370 14380 14390 14400

GGCCAAGCGG CÄGGATTCAG GGTCGAGGTC AGCTGGGCTC GTCAACGATC CCAACATGGT 14410 14420 14430 14440 14450 14460

GCACTGGACG TCGTCTTCCA TCATCTTGAA GATGACAGAG TAGGCCGCGT CTTGATCAAC 14470 14480 14490 14500 14510 14520

TTCCCCACAG ACTTCGAGCG TCTACCCCCT AGCACCGGCC TGACCAGTCG GCCGCTGCAG 14530 14540 14550 14560 14570 14580 CGCATCCAGA accgtcggtt cgastcgcag atccgcgaac agctgcaaac actgctgcca 14590 14600 14610 14620 14630 14640

CCTTATATGG TTCCATCACG GATCGTCGTG TTGGAGCGGA TGCCTCTCAA CGCAAACÄGC 14650 14660 14670 14680 14690 14700

AAAGTCGACC GTAAAGAATT GGCAAGGAAG GCGAGGACCC TACAAACCAT CAAGCCTTCT 14710 14720 14730 14740 14750 14760

GCAACGCGCG JGGCTCCTCG CÄACGATATT GAAGCCGTCT TGTGCGACGA GTTCCAGGCA 24

AT 398 434 B 14770 · 14780 14790

GTTCTTGGTG TTACAGTCGG AGTCATGGAT 14830 14840 14850

ATGGCTACGA AACTGGCCGC CCGTCTCAGT 14890 14900 14910

GATATC7TCA ACCAACCAAT CCTTCAAGAT 14950 14960 14970

CCTCATGAAG CTATTCCCTC CACGCCCTAC 15010 15020 15030

GGCCGTCTAT GGTTCTTGGA TCAGCTGAAT 1507a 15080 15090

GCGAGTCGCT TGCGAGGCCC GCTTCGGATC 15130 15.140 15150

GAGGCGCGGC ACGAGTCCCT GCGCACCACA 15190 15200 15210

ATTGTACGCG CTGCGCGCAA CAAGCAGCTG \ 15250 15260 15270

GCGT&TCTCG" CAGCATVGAA GCÄAGAGCAA 15310 15320 15330

GGCTGGCGAG TAGGACTGTT GCGCTTGGGA 15370 15380 15390

CACCAC&TCA TATCTGÄCGG ATGGTCGGTT 15430 15440 15450

TACTCGAATG CCTCATCGCA GCCCGCTCCT 15490 15500 15510

TGGCAGAAGC AGGATAGTCA GATCGCTGAG 15550 15560 15570

CAACTGGTCA ACAGCAAGCC GGCTGAGCTC 15610 15620 15630

TCTGGCGATG CTGATGTCAT ACCGATAGAG 15670 15680 15690

TCGTTTTGTC GCGCTCGGCA TGTCACCAGC 15730 15740 15750

GCTCACTACC GCCTAACTGG GGCCGAAGAT 15790 15800 15810

AATCGACCTG AGCTTGAAGG CCTCATTGGA 15850 15860 15870

CCTGTTAAGA GCGAGGACAC ATTTGACACG 15910 15920 15930

GAGGCCCAGG ACAACCAAGA TGTCCCGTTC 14800 '14810 .14820

AACTTTTTCG AGT7GGGCGG ACACTCCCTG 14860 14870 14880

CGCCGCCTCG ACACCCGCGT CTCTGTGAAG 14920 14930 14940

CTCGCGGACG TGGTCCÄGAC TGGCTCCGCT 14980 14990 15000

TCTGGTCCCG TGGA3GCAATC CTTCTCTCAG 15040 15050 15060

CTCAATGCAT CGTGGTACCA CATGCCATTA 15100 15110 15120

GAGGCGCTGC AGTCAGCCCT GGCTACGATT 15160 15170 15180

TTCGAGGAGC AAGATGGTGT TCCCGTTCAG 15220 15230 15240

AGGATCATCG ACGTGTCGGG CAGCGAGGAT 15280 15290 15300

GACGCCGCAT TCGATCTGAC TGCTGAGCCA 15340 15350 15360

CCGGATGATC ATGTCCTGTC TATCGTCATG 15400 .15410 15420

GAIATCCTGC GACAAGAACT CGGGCAGCTC 15460 15470 15480

CTTCCGATTC AATACCGAGA TTTCGCCATC 15520 15530 15540

CACCAAAAGC AGCTGAAGTA CTGGAAGAGA 15580 15590 15600

CTGGCGGACT TCACTCGTCC GAAGGCGTTA 15640 15650 15660

ATTGATGACC AGGTATATCA GAACCTCCGC 15700 15710 15720 TTTGTTGCAC tcttagcagc tttccgggct 15760 15770 15780

GCAAC7ATCG GCTCTCGAAT CGCCAACAGA 15820 15830 15840

TGCTTTGTTA ACACCCÄGTG TCTCCGAATT 15880 15890 15900

TTGGTTAAAC AGGCACGAGA AACGGCGACC 15940 15950 15960

GAGAGGATCG TTTCTTCCAT GGTTGCTAGC 25

AT 398 434 B

15970 15980 15990 16000 16010 16020 1 1 1 TCCACTCGTT CAGGTGATGT TTGCTGTGCA CTCTGAGCAC 16030 16040 16050 16060 - 16070 16080 1 ! CGAAGGTGTT GAGGGGAAGC CCGTTTCGAT GGCAGCGTCC 16090 16100 16110 16120 1613.0 16140 ACACGCTTTG ACGCGGAAAT GCACCTATTT GAGGACCAAG GGATGCTCGG GGGCAACGTC 16150 16160 . 16170 16180 16190 16200 GTCTTTTCGA AGGATCTGTT CGAATCCGAG g ! 1 | CGTGTTCCAG 16210 16220 16230 16240 16250 16260 GAGACCCTGA ggcgtggcct agccaatcct CACGCÄAATC TCGCAACACT TCCTCTTACC 16270 '16280 16290 16300 16310 16320 GAIGGMÜCGC CCAGTCTTCG AAGCCTGTGT CTTCAAGTCA ATCAGCCTGA CTACCCCCGA 16330 16340 16350 16360 16370 16380 i 1 TT7CAGASAG CAGGTAGCAT CGATACCCAA GTCTATCGCC 16390 16400 16410 16420 16430 16440 GTJAICGATG CTTCTTCACA GCTCACCTAC ACCGAGCTCG ACGAG&GASC TAGCCAGCTC . .. . 164S(J 16460 16470 16480 16490 16500 GCCACGTGGC TACGCCGACA AGTCACAGTC CCTGAGGAGC TGGTCGGCGT CCTCGCTCCA 16510 16520 16530 16540 16550 16560 CGGTCCTGTG AGACAATCAT CGCTITCCTC GGCATGATGA AAGCGAATCT CGCCTATCTG 16570 16580 16590 16600 16610 16620 CCACTTGACG TCAACGCACC CGCTGGTCGG ATCGAGACAA TCCTGTCATC 7CTACCAGGA 16630 16640 16650 16660 16670 16680 AACAGGCTTA TTTTACTTGG ATCAGATACG CAGGCGGTCA AGCTTCACGC AAÄCAGCGTT 16690 16700 16710 16720 16730 16740 CGATTCACCC GGATCAGCGA CGCCCTCGTC GAGAGCGGCA GTCCCCCTAC CGAAGAACTT 16750 16760 16770 16780 16790' 16800 TCCACACGGC CGACTGCACA AAGCCTTGCC TATGTCATGT TCACATCAGG CTCAACTGGC 16810 16820 16830 16840 16850 16860 GTCCCGAAGG GTGTCA7GGT AGAGCACCGG GGTATCACAC GTCTCGTGAA AAACAGCAAC 16870 16880 16890 16900 16910 16920 GTGGTCGCAA AGCAACCGGC AGCAGCTGCT ATCGCTCATC TTTCGAACAT TGCTTTCGAC 16930 16940 16950 16960 16970 16980 GCCTCTTCCT GGGAGATATA CGCTCCTCTC CTTAACGGCG GTACAGTCGT CTGCATTGAT 16990 17000 17010 17020 17030 17040 TACTACACCA CGATCGATAT CAAAGCCCTC GAGGCGGTAT TCAAACAGCA CCACATCCGC 17050 17060 17070 17080 17090 17100 GGAGCAAIGC TTCCACCAGC ACTTCTCAAA CAGTGTCTGG TCTCTGGCCC TACTATGATC 26

AT 398 434 B . 17110 17120 17130 ' 17140 17150 : 17160

AGCTCTCTGG AGATÄCTTTT CGCCGCCGGC GATCGGTTGA GCAGCGAAGA TGCCASCCTG 17170 17180 17190 17200 17210 17220

GCGCGACGTG CCGTTGGTTC.GGGCGTTTAC AACGCTTÄCG GCCCTACTGA GAÄCACGGTC 17230 17240 17250 17260 17270 17280

CTGAGTACGA TACACAACÄT CGGCGäGAAT GABGCATTTT CGAATGGCGT TCCCÄTTGGA 17290 17300 17310 17320 17330 17340

AACGCTGTCA GTAACTCCGG TGCCTTTGTC ÄTGGATCAAA ATCAGCAGCT GGTCTCCGCC 17350 17360 .17370 17380 17390 17400

GGTGTGATCG GAGAGCTTGT TGTGACCGGA GATGGCCTTG CCCGCGGATA CÄCAGATTCT 17410 17420 17430 17440 17450 17460

AAGCTTÄGGG TGGATCGATT CATCTATATT ACCCTTGACG GGAACCGGGT CAGAGCTTAC 17470 17480 17490 17500 17510 17520

CGCACGGGCG ACCGTGTCAG GCACCGGCCT AAGGATGGGC AAATTGAGTT CTTCGGGCGA 17530 17540. 17550 17560 17570 17580

ATGGATCAGC AGATCAAGAT. CCGSGG7CA7 CGCATCGAGC CAGCAGAGGT GGAGCAGGCT 17590 17600 17610 17620 17630 17640

- CTCGCCCGTG ACCCGGCCAT CAGCGATTCG GCTGTTATCA CTCAGCTCAC-GGATGAAGAG 17650 17660 17670 17680 17690 17700

GAGCCGGAAC TGGTGGCTTT CTTCTCAITG AAGGGGAATG CCÄACGGCAC CAACGGTGTC 17710 17720 17730 17740 17750 17760

AACGGTGTGA GCGATGAAGA GAAGATCGAC GGCGATGAGC AACATGCTCT GCTGATGGAG 17770 17780 17790 17800 17810 17820

AACAAGATCC GTCACÄACCT ACAGGCGCTG CTCCCCäCTT ACATGATCCC CTCGCGGATC 17830 17840 17850 17860 17870 17880

ATCCÄSGTOG ATCAGCTGCC GGTCAATGCC AACGGXAAGA TTGACCGCAA TGAGCTGGCT 17890 17900 17910 17920 17930 17940

GTTCGAGCCC AGGCAACGCC AAGGACCAGT TCÄGTGTCÄA CCTACGTGGC CCCTCGCÄAC . 17950 17960 17970 17980 17990 18000

GATATCGAAA CCATCATCTG TAAGGAATTC GCAGATATCC TCAGCGTTCG AGTCGGAATC . 18010 18020 1803Q 18040 18050 18060

ACAGACAACT TCTTCGACCT GGGTGGACAC TCACTTATAG CCACCÄAGCT AGCCGCCCGC .18070 18080 18090 18100 18110 18120 CTTAGCCGTC GACTAGATAC TCGCGTGTCT GTTAGGGACG TCTTTGACAC TCCCGTGGTA- 18130 18140 18150 18160 18170 18180

GGCCAATTGG CGGCTTCTAT CCAGCAAGGC TCGACCCCTC ATG&AGCTAT TCCGGCGTTA 18190 18200 18210 18220 18230 18240

TCACACTCGG GACCTGTGCA ACAGTCCTTT GCTCAÄGGCC GTCTTTGG7T CCTGGACCGT 18250 18260 18270 18280 18290 18300

TTCAATCTCA ACGCTGCCTG GTACATCATG CCATTCGGCG TTCGTCTTCG CGGACCTCTC 27

AT 398 434 B 18310 18320 18330 18340 18350 18.360

CGÄGTCGATG CACTTCAGAC TGCATTGAGG GCTCTCGÄAG AACGGCACGA GTTGCTACGC 18370 ' 18380 18390 . 18400 18410^ 18420

ACCAGGTTCG AAGAACAGGA TGGCGTTGGT ATGCAAATCG TTCACTCGCC CCGAATGAGG 18430 18440 18450 18460 18470 18480

GÄCATCTGCG TCGTAGACAT CTCTGGCGCC AATGAGGATC TTGCGAAGCT GAAGGAGGAG ' 18490 18500 18510 18520. 18530 18540

CAGCAAGCTC CTTTCAATCT CTCTACTGAA GTCGCTTGGA GGGTAGCACT CTTCAAGGCT 18550 18560 18570 . 18580 18590 18600

GGAGAGAACC ACCACATCCT CTCTATCGTC ATGCATCACA TAATTTCAGA TGGCTGGTCA 18610 18620 18630 18640 - 18650 18660

GTTGACATCT TCCAGCAGGA GCTTGCCCAA TTCTACTCGG TAGCTGTACG AGGGGATGAC ; 18670 18680 - 18690 18700 18710 18720

CCCCTTTCCC AGGTCÄAACC GCTCCCCATT CACTACCGCG ATTTTGCTGT CTGGCAGAGA 18730 18740. 18750 18760 18770 18780

GAAGATAAGC AAGTTGCCGT TCACGAAAGC CAACTTCAGT ACTGGATAGA GCAGCTCGCG 18750 - 18800 18810 18820 -18830 18840

GATAGCACGC CAGCCGAGAT CCTATCTGAT TTTAACCGAC CGGAGGTCTT GTCCGGCGAA 18850 18860 18870 18880 18890 18900

GCTGGTACAG TTCCCATCGT GATCGAGGAC GAGGTITATG AGAAGCTCTC CCTCTTCTGC 18510 18920 18930 18940 18950. 18960

CGCAATCATC AGGTCACCAG CTTCGTCGTC CTTCTGGCTG CTTTCCGCGT CGCACATTAT 18970 ‘ 18980 18990 19000 19010 19020

CGCCTAACTG GGGCAGAGGA TGCGACTATC GGTACACCAA TTGCGAACCG CAACGGCCGC 19030 19040 19050 19060 19070 19080

GAACTTGAGG ACTTGATCGG TTTCTTTGTC AATACACAAT GCATGAGAAT CGCGCTCGAA 19090 19100 19110 19120 19130 19140

GAACACGÄTA ATTTCCTATC AGTAGTGCGA AGAGTTCGCT CÄACAGCGGC AAGCGCCTTC 19150 19160 19170 19180 19190 19200

GAAAACCAGG ASGTGCCAT? CGAGCGCCTT GTATCTGCAC TTCTGCCCGG CTCTAGÄGAT 19210 19220 19230 19240 19250 19260 gcctcccgga atcccctcgt tcaactcätg tttgtcgtcc actcccagcg aaatctcggt 19270 19280 19290 19300 19310 19320

AAACTGCAAC TGGAGGGCTT GGAAGGCGAA CCAACCCCGT ACACCGCGAC GACCCGCTTC 19330 19340 19350 19360 19370 19380

GATGTTGAGT TCCACCTCTT CGAACAAGAC AAAGGCCTCG CCGGAAATGT TGTCTTCGCA 19390 19400 19410 19420 19430 19440

GCAGACTTGT TCGAGGCTGC CACTATCCGC AGCGTTGTTG AAGTCTTCCA CGAGATCCTC 28

AT 398 434 B

19450 19460 19470 CGTCGTGGTC TCGACCAGCC AS&TÄTCGCa.· 19510 ' 19520 19530 GCGGCGCTCA ACAGCCGTAA - CTTACCCGCA 19570 19580' 19590 G&GGCCTCGG TGGTTGATGT CTTCCAGACA 19630 19640 19650 GTGACCGACA CÄTCCACAAA GCTTACÄIAT 19690 19700 19710 GCGGCTTGGC TGTCCAAACA GÄAGCTACCA 19750 19760 1$770 CGATCCTCTG AGACTATCGT AGCATGCATT 19810 19820 19830 CCCATGGATT CCAACGTCCC CGAAGCCCGT 19870 19880 19890 GAGaAGTTOG TTTTGCTTGG AGCAGGAGTG 19480 - 19490 .19500

ATTTCCACCA TGCCACTTGT CGATGGCGTG 19540 19550 19560

GTTGAAGACA TCGAACCTGA CTTCGCCACC 19600 · 19610 19620

CAAGTGGTCG CTÄACCCAGA TGCCGTGGCT 19660 19670 19680

GCGGAGCTGG ATCAACAATC CGATCATGTC 19720 19730 19740

GCAGAGAGCA TCGTCGTTGT TCTTGCGCCA 19780 19790 19800

GGCATCCTCA AAGCGAACCT CGCATATCTC 19840 19850 19860

CGCGAAGGAA TTCTTTCGGA GATTCCAGGG 19900 19910 19920

CCTATTCCTG ACAAGAAGAC AGCTGATGTC

19930 19940 19950 AGGBiSGGSCT-TCASCAGCGA TATCGTCGCC . 19990 20000 20010 ACTCGGCCAT CTGCATCAAG CCTTGCCTAT 20050 20060 20070 CCAAAGGGTG TCATGGTCGA GCATCGGGGT 20110 20120 20130 AGAAXACCAC AAAGTCTGCG GATGGCACAT 20170 20180 .20190 TGGGAGATAT TCACCACGCT GCTCAATGGA 20230 20240 20250 GTCTTGGACA GCAAAGCACT TTCTGCCGCT 20290 20300 20310 CTCCCACCGG CCTTGCTCAA GCAATGTCTT 20350 20360 20370 GAGTCTCTGT ACATTGGAGG CGACCGCCTT 20410 20420 20430 CTCGTCAAAG GCAAGGCCTA CAATGCCTAC 20470 20480 20490 ATCTATACCA TCGAACACGA GACTTTTGCG 20530 20540 20550 CCCAAGTCCA AGGCCTACAT 1 o 20590 20600 20610 GGAGAGCTTG TCGTTGCTGG CGATGGTCTC 19960 19970 19980

AGCAAS&GAG AGä&GTCCXÄ CTGAGCGGGC 20020 20030 20040

GTTATCTTCA CATCAGGCTC GACAGGTCGG 20080 20090 20100

GTTÄTTTCTT TGGTGAAGCA GAACGCTTCA 20140 20150 20160

GSTTCG8AÜCC TCGCÄTTCGA TGCTTCCGTG 20200 20210 20220

GGAACGCTTT TCTGTATCAG CTACTTTACT 20260 20270 20280

TTCTCCGATC ATCGCATTAA CATCACCCTG 20320 20330 20340

GCAGACGCGC CATCTGTCCT GAGCTCCCTC 20380 20390 20400

GATGGAGCTG ATGCAACCAA GGTGAAGGAC 20440 20450 20460

GGTCCCACCG AGAATTCCGT CATGAGCACG 20500 20510 20520

AATGGCGTTC CCATCGGCAC ATCTTTAGGC 20560 20570 20580

GATCAGCAGC TCGTACCAGC AGGCGTGATG 20620 20630 20640

GCACGAGGGT ATACCGATCC ATCACTGAAC 29

AT 398 434 B • 20650 20660 20670 20680 20690 20700

ACGGGCCGGT TCATCCACAT CACGATCGAT GGCAAACAÄG CTCAGGCAIA C03GA.CXX5GC 20710 20720 2073¾ 20740 20750 20760

GÄTCGAGTCA GÄlACCGACC TAGGGACTAC CAAATCGAGT TCTTTGGCCG T5TAGA5CAG 20770 20780 20790 20000 20810 20820

CAGASCAaSA TTCGCGGTCÄ TCGCATCGÄG CCAGCTGAAG TGGÄGCÄGGC TCTTCTCAGC 20830 20840 20850 20860 20870 20880

GACTCATCGA TCAACGATGC CGTTGTTGTG TCGGCACÄAA ACAAGGAGGG ACTCGAAATG 20890 20900 20910 20920 20930 20940

GTTGGTTACA TCACGACCCA GGCTGCACAA TCCGTCGACA AGGAGGÄAGC CAGCAACAAG 20950 20960 20970 20980 20990 21000

GTGCÄGGAGT GGGAGGCTCA TTTCGACTCA ACTGCATATG CCAACAICGG GGGTATTGAT 21010 21020 21030. 21040 21050 21060

CGCGÄTGCCC TCGGACAGGA CTTCTTATCC TGGACÄTCTA TGXACGACGG CTCATTGATT 21070 21080 21090 21100 21110 21120

CCCGGTG&AS AGATGCAGGA ATGGCTCAACGACACTATGC GCTCACTCCT CGACAACCAA 21130 21140 21150 . . 21160 21170- 21180 CCACCCGGAA aagtgctcga gatcggaact ggtagcggta tggtgctgtt cäatctgggc 21190 21200 21210 21220 21230 21240

AASGTTGAGG GACTACAGAG CTATGCCGGT CTTGAGCCCT CGCGCTCGGT CACCGCCTGG 21250 21260 21270 21280 21290 21300

GTTAACAAGG CAATCGAÄAC TTTCCCAAGC.CTGGCAGGAA GCGCCCGAGT CCÄCGTTGGA 21310 21320 21330 21340 21350 21360

ACCGCCGAGG ATATCAGCTC CATTGATGGA CTTCGTTCCG ATCTCGTTGT GATCAACTCA 21370 21380 21390 21400 21410 21420

GTCGCCCAAT ACTTCCCÄAG TCGAGAATAT CTCGCTGAGC TGACGGCCAA CTTGATTCGA 21430 21440 21450 - 21460 21470 21480

CTGCCCGGCG TTAAGCGTAT TTTCTTCGGT GACATGAGAA CGTATGCTAC CAATAAGGAC 21490 21500 21510 21520 21530 21540

TTCTTGGTGG CACGAGCAGT CCATACCCTA GGGTCCAATG CATCGAAGGC CATGGTTCGA 21550 21560 21570 21580 21590 21600

CAACAAGTGG CCAAGCTTGA AGATGACGAG, GAAGAGTTGC TTGTTGACCC TGCCTTCTTC 21610 21620 21630 21640 21650 21660

ACCAGCCTGA GCGACCAGTT CCCTGACGAA ATCAAGCATG TCGAAATTCT GCCAAAGAGG 21670 21680 21690 21700 21710 -21720

ATGGCCGCGA CCAACGAACT CAGCTCTTAC AGATATGCTG CTGTGATTGA TGTGGGAGGC 21730 21740 21750 21760 21770 21780

G&CCAGATGC CGAATGGGGA GGATGAGGAI AAGCAATGGG CTGTCAAGGA TATCAATCCG 30

AT 398 434 B 21790 21800 21810 21820 21830 21840

AA<3<3CCTG<3G TGGACTTTGC T<5<3GACGA<3G ATGGACCGTC AGGCTCTCTT GCAGCTCCTT 21850 21860· 21870 21880 21890 21900

CAGGACCGCC AACGTGGCGA TGACGTTGTT GCCGTCAGTA ACATCCCATA CAGCAAGACC 21910 21920 21930 21940 21950 21960

ATCATGGAGC GCCATCTGTC TCAGTCACTT GATGATGACG AGGACGGCAC TTCAGCGGTA .21970 21980 21990 22000 22010 22020

GACGGAACGG CCTGGATATC GCGTACGCAA TCACGGGCGA AGGÄATGCCC TGCTCTCTCA 22030 22040 22050 22060 22070 22080

GTGGCCGACC TGATTGAGAT TGGTAAGGGG ATCGGCTTCG AAGTTGAGGC CAGCTGGGCT 22090 22100 . 22110 22120 22130 22140

CGACAACACT CCCAGCGCGG CGGACTCGAT GCTGTTTTCC ACCGATTCGA ACCACGAAGA 22150 22160 22170 22180 22190 22200

CACTCAGGTC ATGTCATGTT CAGGTTCCCG ACTGAACACA AGGGCCGGTC TTCGAGCAGT 22210 22220 22230 22240 22250 22260

CTGACGAATC GCCCGCTACA CCTGCTTCAG AGCCGCCGAC TGGAGGCAAA GGTCCGCGAG 22270 22280 22290 22300 22310 22320

CGGCTGCAÄT CACTGCTTCC ACCGTACATG ATTCCGTCTC- GGATCAGGTT GCTCGATCAG 22330 22340 22350 22360 22370 22380

ATGCCTCTCA CGTCCAACGG CAAGGTGGAT CGCAAGAAGC TTGCTCGACA AGCCCGGGTC 22390 22400 22410 22420 22430 22440

ATCCCAAGAA GTGCGGCAAG CACGTTGGAC TTTGTGGCGC CACGCACGGA AATCGAAGTC 22450 22460 22470 22480 22490 22500

GTCGTCTGCG AAGAATTTAC CGATCTACTA GGCGTCAAGG TTGGGATCAC AGACAACTTC 22510 22520 22530 22540 22550 22560

TTCGAGTTGG GCGGCCÄETC <3CT<3CT<3GCC ACGAAACTGA GCGCACGTCT AAGTCGCAGA 22570 22580 22590 22600 22810 22620

CTGGACGCCG GTATCACTGT GAAGCAGGTC TTTGACCAGC CAGTACTTGC TGATCTTGCT ' 22630 22640 22650 22660 22670 22680

GCTTCTATTC TTCÄAGGCTC GTCTCGTCAC AGGTCTATCC CGTCTTTACC CTACGAAGGA 22690 22700 22710 22720 22730 22740

CCCGTGGÄGC A5TCCTTTGC CCAGGGGCGC CTGTGGTTCC TCGÄCCAGTT CAACATCGAT 22750 22760 22770 22780 22790. 22800

GCCTTGTGGT ACCTTATTCC ATTTGCÄCTC CGCATGCGCG GGCCGCTGCA AGTTGACGCC 22810 22820 22830 22840 22850 22860.

CTCGCTGCTG CCCTGGTGGC ACTTGAAGAG CGTCATGAAT CTCTGCGCAC AACGTTTGAG 22870 22880 22890 22900 22910 22926

GAACGAGACG GAGTCGGCAT CCAAGTGGTG CAACCCCTCC GCACGACCAA GGATATCCGG 22930 22940 22950 22960 22970 22980

ATCATCGACG TGTCAGGCAT GCGAGACGAC GACGCCTACC TCGAGCCATT GCAGAAAGAA 31

22990 23000 23010 CAGCÄGACTC CTTTCGACCT TGCTTCAGAG 23050 23050 23070 GGAAAGGASG ACCACATCCT CTCTATTGTC 23110 23120 23130 ACTGÄ&GTCT TGCAAAGGGA ACTCGGTCAA 23170 23180 23190 CCCTTATCGC AßGTTGCCeC GCTTCCTATT 23230 23240 23250 CAAGAGGAAC AGGTCGCTGA GAGTCAAAGG- 23290 23300 23310 GÄGAGTAGCC CGGCTGAGCT CTTGGCTGAC 23350 23360 23370 GCAGGCAGCG TGTCTTTCGT GATCAACGAT 23410 23420 \ 23430 CGGTCTCGCC AAGTAACCAC CTTTÄCGACT -23470 23420 23490 CGAATGACCG GGTCAGACGA CGCAACTATT 23530 23540 23550 GAGCTTGAAÄ ACTTGATCGG CTGCTTCGTC 23590 23600 23610 GACGA7GASA CGTTTGAATC ACTGGTACÄA 23650 23660 23670 GAGAATCAAG ACGTTCCGTT TGAACGAATC 23710 23720 23730 ACGTCCGGAA ACCCCCTAGT ACAGCTTCTC 23770 23780 23790 AGGATCCAGC TCGACGGTGT CGTCGATGAG 23830 23840 . 23850 GATCTCGAAT TCCACGCCTT CCAAGAGGCC 23890 23900 23910 ACGGACCTGT TCC&5CCCGA GACGATCCAA 23950 23960 23970 CAGCGTGGCC TGGAGCAGCC GCAGAGTCCC 24010 24020 24030 GCTCAGCTCC GÄGATGCCGG CGCGCTGCAG 24070 24080 24090 TCCCTCGTCG ATGTCTTCCA GCAGCAGGCT

AT 398 434 B 23020 23030 23040

CCTGGCTGGA GGGTAGCACT GCTGAAGCTT 23080 23090 23100

ATGCÄCCACÄ TCATCTCTGA CGGGTGGTCT 23140 23150 23160

TTCTACTTGG CAGCGAAATC CGGGAAAGCC 23200 23210 23220

CAjGTATCGCG ATTTTGCTGT TTGGCAGAGA 23260 23270 23280

CAGCTCGACT ACTGGAAGAA GCAGCTTGCG s 23320 23330 23340

TACACCAGGC CGAACGTACT GTCTGGAGAG 23380 23390 23400

TCGGTTTACA AGAGCCTCGT CTCCTTCTGC 23440 23450 23460

TTACTGGCAG CGTTTCGCGC CGCTCACTAT 23500 "23510 23520

GGCACGCGAA TTGCCAATCG CAACAGGCCT 23560 23570 23580

AATACCCAGT GCATGCGSAT CACTATCGGC 23620 23630 23640

CAGGTACGGT CTACCACCGC GACAGCCTTC 23680 23690 23700

GTTTCCACCC TCAGTGGCGG GTCCAGGGAT 23740 23750 23760

TTTGCGGTTC ATTCTCAACA AGGCCTGGGC 23800 23810 23820

CCGGTTCTGT CGACCGTTTC GACTCGGTTC 23860 23870 23880

GACCGGCTCA ATGGAAGTGT CATGTTTGCC 23920 23930 23940

GGTTTCGTTG CGGTTGTCGA AGAGGTTCTA 23980 23990 24000

ATCGCÄACCA TGCCGCTGGC CGÄAGGCATC 24040 24050 24060

ATGCCAÄAGT CTGATTACCC TCGCAACGCG 24100 24110 24120

ATGGCCAGCC CGTCAACTGT CGCCGTCACT 32

AT 398 434 B 24130 24140 24150

GACTCGACCT CCÄAGCTGAC GTATGCCGAG 24190 24200 . 24210

TATCTGCGTC GGCAGCAACT CCCGGCGGAG 24250 24260 - 24270

TGTOÄGACGA TCATCGCGTT CCTAGCTATT 24310 24320 24330

GACGTCAACA CGCCATCTGC TCGCATGGAA 24370 24380 24390

CTCATCTTGG TTGGCTCGGG CGTCCGCCAT 24430 24440 ' 24450

ATGCTGATCA GCGACACGGT TACCGGGACT 24490 24500 24510

GTCCGACCCA GTGCTACAAG TCTCGCATAT 24550 24560 24570

CCAAAGGGTG TCATG6TGGA GCACCGTGCT 24610 24620 24630

GTGACTCäCä-TGCCACCAGG GACACGGA2G 24670 24680 24690

TCACT.GTTCG AGATGTGCGC AACGCTCCTC 24730 24740 24750

CTGACCCTTC TTGACAGCAC CÄTGCTCCGG 24790 24800 24810

GCCATCTTCC CGCCAGCACT CCTGCGACAG 24850 24860 24870

ATGTTAGAGG CTGTTTACGT TGCCGGTGAT 24910 24920 24930

CAGGCACTGG CCGGGCCTCG TGTGTAGAAC '24970 . 24980 24990

AGCACGATAT ATAACATCGA TAAGCACGAT 25030 25040 25050

GCTGTCAGCA A7TCAGGGGC CTATGTCATG 25090 25100 25110

GTGATGGGÄG AGCTGGTTGT TACAGGAGAG 25150 25160 25170

CTCGATACGG ACCGCTTCGT CACCGTCACG 25210 25220 25230

ACGGGTGACC GGGTGCGATA TCGACCAAAG 25270 25280 25290

GACCAGCAGG CCAAGATTCG CGGCCACCGT 24160 24170 24180

CTGGATCGAC TCTCCGATCA AGCTGCTTCC 24220 24230 24240

ACAATGGTGG CCGTTCTGGC ACCGCGCTCT 24280 24290 24300

CTCAAAGGAA ATCTTGCCTA CATGCCTCTC 24340 24350 24360

GCCATCATAT CGTCCGTCCC AGGGCGTAGG 24400 24410 24420

GCTGATATCA ACGTACCGAA CGGAAAGACG ' 24460 24470 . 24480

GATGCTATTG GCACTCCCGA ACCTCTGGTT 24520 24530 24540

GTCATCTTCA CTTCAGGGTC AACGGGCAAG 24580 24590 24600

ATCATGCGCC TTGTGAAGGA CAGTAACGTC 24640 24650 24660

GCCCACGTGA CGAATATCGC ATTCGACGTT 24700 24710 24720

AACGGCGGAA CTCTAGTCTG CÄTTGACTAC 24760 2477Q> 24780

GAGACGTTTG AGCGTGAGCA GGTTCGCGCA 24820 24830 24840

TGCTTGGTCÄ ACÄTGCCCGA TGCGATCGGC 24880 24890 24900

CGCTTCCACT CCCGCGACGC CCGCGCAACC 24940 24950 24960

GCGTATGGCC CAACTGAGAA CGCAATCCTT 25000 25010 25020

CCGTATGTGA ACGGTGTTCC TATCGGTAGC 25060 25070 25080

GAXCGGAACC AGCAGCTTCT CCCTCCCGGT 25120 25130 25140

GGTGTAGCTC GCGGCTATAC CGACGCAAGT 25180 25190 25200

ATCGATGGCC AGCGCCAGAG GGCGIACCGC 25240 25250 25260

GGÄTTCCAGA TAGAGTTCTT CGGCCGCCTG 25300 25310 25320

GTTGAACTGG GCGAGGTCGA ACATGCTCTG 33

AT 398 434 B 25330 - .25340 25350 - 25350 . :25370 25300

CTCAGCGAGÄ ÄTTCAGTCÄ.C GGATGCGGCT GTCGTACTCC GCACGATGGÄ AGAGGAGG&C 25390 25400 25410 25420 25430 25440

CCGCAACTGG ITGCCT7TGX GACTACTGAT CACGAÄTATC GCTCGGGTTC GAGCÄACGAA 25450 2S460 25470 25480 25490 25500

GAGGAGGATC CGTACGCCAC ACAGGCAGCA GGCGATÄTGC GCAAGCGACT CCGGTCGCTT 25510 25520 25530 25540 25550 -25560

CTGCCAIACT ACATGGTCCC GTCCCGGGTG ACAATACTCA GGCAAATGCC TCTCAACGCC 25570 25580 25590, . 25600 25610 . 25620

AACGGCA&GG TGGACCGAAA AGACCTCGCT CGGCGGGrCCC AGATGACTCC GACAGCAAGC 25630 25640 25650 25660 25670 25680

AGCTCGGGCC CCGTGCATGT GGCTCCTCGC AACGAGACTG AGGCAGCAAT TTGCGÄCGAG 25690 25700 25710 25720 25730 25740

TTCG&GACTA TACTCGGAGT CAAGGTGGGA ATCACAGACA ACTTCTTCGA ACTAGGCGGG 25750 2S7-60 25770 25780 25790 25800-

CACTCACTCC TGGCCACCAA ACTCGCTGCT CGGCTCAGCC GCCGGATGGG CCTTCGCATA 25810 25820 25830 . 25840 25850 25860

TCCGTCAAGG ATCTGTTTGA CGATCCTGTT CCTGTTTCTC TCGCCGGCAA GCTGGAACAA 25870 25880 25890 25900 25910 25920

CAGCAGGGGT TCTCGGGAGA AGATGAAAGC TCGACAGTTG GTATTGTCCC CTTCGAÄCTC 25930 25940 25950 25960 25970 25980

CTCCCCGCGG AAATGTCGAG AGAGATCATC CAGCGCGATG TTGTACCTCA GATTGAGÄAC 25990 26000 26010 26020 26030 26040

GGTCACAGCA GACCCCTGGA CATGTATCGA GCCACGCAGA CGCAGATCTT CTTCCTGCAC 26050 26060 26070 26080 - 26090 26100

GACAAAGCGA CGGGCCACCC AGCCACGCCG CCACTGTTCT CCTTGGACTT CCCCGAGACC 26110 26120 26130 26140 26150 26160

GCCGACTGCC GTCGTCTGGC AAGCGCCTGC GCCGCTCTCG TCCAGCACTT TGACAIATTC 26170 26180 26190 26200 . 26210 26220

AGAACCGTGT TCGTGTCAAG AGGCGGCCGC TTCTACCAÄG TTGTTCTTGC TCATCTCGAT 26230 26240 26250 26260 26270 26280

GTACCTGTCG AGGTCATCGA GACCGAGCAA GAGTTGGATG AGGTTGCTCT CGCGCTGCAT 26290 26300 26310 26320 26330 26340

-GAAGCAGACA AGCAGCAGCC CCTACGTCTG GGACGTGCGA TGCTGCGGAT CGCCATCCTC 26350 26360 - 26370 26380 26390 26400

AAGAGACCGG GAGCCAAGAT GCGACTTGTT CTCCGAATGT CTCATTCCCT GTACGACGGC 26410 26420 26430 26440 26450 26460

TTGAGTCTTG AACACATCGT CAACGCTCTA CATGCCTTGT ACAGTGATAA GCACCTTGCG 34

AT 398 434 B 28470 28480 2649Ό 26500 28510, 28520

CAAGCACCCA AGTTTGGTCT CTACATGCAT CACATGGCTA GCCGACGTGC AGAGGGCTAC 28530 26540 26550 26560 26570 26580

A&TTTCTGGC GATCTÄTTCT TCAGGGCTCT TCAATGACAT CCCTGAAGCG CTCTGTCGGC 26590 26600 26610 26620 .26630 26640

GCCCTCGAGG CCATGACGCC GTCTGCCGGT AGATGGCäGA CGTCAAAGTC CATCAGOÄTC 26650 26660 26670 26680 26690 26700

CCTCCXGCGG CACTCAAGÄA CGGCATTACG CAGGCGACCC TCTTCACCGC CGCCGTCTCT 26710 26720 26730 26740 26750 26760

CTCTTGCTCG CCAAGCATAC CAAGTCGACA GACGTCGTCT TCGGCCGCGT CGTATCTGGA 26770 26780 26790 26800 26810 26820

CGAGAGGATC TCTCCAIAAA CTGCCAAGAC ATCGTGGGAC CTTGCATCAA CGAGGTGCCT 26830 26840 26850 25860 . 26870 26880

GTGCGCGTTC GGATCGACGA GGGCGACGAC ATGGGTGGTC TGCTGCGCGC CATTCAAGÄC 26890 26900 26910 26920 26930 26940

CAGTACACCA GCAGCTTCCG GCACGAGACC TTGGGCTTGC AAGAAGTGAA GGAGAACTGC 26950 26960 . 26970 2.6980 26990 27000

ACGGACTGGA' CTGRTGGGAC CAAGGAGTTC AGTTGCTGCA TTGCCTTCCA GAACCTCAAC 27010 27020 27030- 27040 27050 27060

CTGCATCCTG ÄGGCCGAGAT TGAAGGGCAG CÄGATTCGCC TGGAGGGTTT GCGAGCAAAG 27070 27080 27090 27100 . 27110 27120

GATCAAÖCAC GCCAGGCCAA TGGTCATGCC CCAAATGGCA CGAACGGCAC GAATGGCACG 27130 27140 27150 27160 2717Ö 27180

AATGGCACGA ATGGCGCGAA CGGCACGAAT GGCACGAATG GCACGAATGG TACCCATGCC 27190 27200 27210 · 27220 27230 27240

AACGGTATCA ATGGTAGCAA CGGTGTCAAT GGCCGCGA3A GCAACGTGGT TTCAGCCGCT 27250 27260 2727Ό 27280 27290 27300

GGCGATCAAG CTCCTGTTCA CGATCTGGAC ATTGTTGGGA TTCCGGA6CC CGACGGCÄGC 27310 27320 27330 27340 27350 27360

GTCAAGATTG GCATTGGTGC GAGCCGGCAG ATCCTTGGAG AGAAGGTCGT GGGCAGCATG 2737Ö 27380 27390 27400 27410 27420

CTCAATGAAC TTTGCGAGAC CATGCTCGCT TTGAGCAGAA CATAGCAGCT TTTCCAGGGA 27430 27440 27450 27460 27470 27480

GATTGGTTGG ATGGACAAGA TTCTCTTCAA TTATGGAGGT TGGCATGAGG CAACAGGAGG 27490 27500 27510 27520 27530 27540

ACTACTGACT TTTCATGTTT TTTGGGGTTT TTTGGGGTTT TCTTTTTCCT TTCATCTTTA 27550 27560 27570

CTTGATGCGC GATGTCTGCT TTCCTCTAGA ATTC b) Aus dieser DNA läßt sich ein Polypeptid mit folgender Aminosäuresequenz ableiten: 35 20

AT 398 434 B 10

K 1 V L L G s G V T 30 A V g' I Ό Ξ I L A G 50 & R P s A T s L A X 70 P K G V M V E B R S 90 I S K L P Q G . A R V 110 s I • W E I A Γ T Xi L 130 H T V L D C R T L K 150 V T L M P A L L K Q .. 170 B L D L X. X T G G D 190 R s L V K I G M F S 210 S T I X Ξ V D A -D z 230 T V, s N S G A X V M 250 V V G E L V V r· G ' D • 270 L N K N R F I X. I T 290 T G D R V R X R P Ή 310 D Q Q V K I - R G B R - 330 1 S E N S V Q D A A 350 S G A E M V A F V A 370 E E E A V D C V Q G 390 S E V K D I R Q S E 410

A P Ξ Q E N .P E. V E T G L D K Γ Q G 40 S N V I F T S G S T 60 G K V T R L A K P s o > . 00 · a A H L A N I A F 100 D A N G A T L V C 1 120 D X E V F £ R E S I 140 T V C V A E I P E T 160 L A R V G G Ξ D A M 180 R A G X G . P T E N T 200 V I M F V N G V P I 220 G K D R N Q Q 1 V P 240 S G G L A . R G X“ T D 260 P S V N G E S I R A 280 X R D L Q I Ξ F F G 300 R M 1 E P G E V E S 320 A L V V I C A P A D 340 Q D A R N T E D E D 360 T Q W E T Ξ F E T A 380 A X V G N D F M G W 400 T S 420 36

AT 398 434 B

M Y D’ G s E I D K Γ D M Ξ E W L N I? ‘ T M E M I Ϊ. D A- R E 430 P G fl V L E . I G T- G 440 T -G M V M F N L A K 450 C P . G L Q G Y V G F 460-E P' S .K S A A Q F V 470 K D A A Q S F P A L 480-K D G E s' I. V Ξ V G . 490 T. A T D I N K A G P 500 I Q P E L V V I' N S 510 V A Q Y F P T P Ξ Y 520 L F E • V V E· A £ V Q 530 i p S V E R X V F G 540 D M E T N A I N R D 550 F V A S R A L~ B T L 560 G Ξ k A N K R - L V R 570 Q M I Y Ξ L Ξ A N E 580 E E L L .T D P . A F F 590 T S L R T - R L G Ξ K 600 I K H V E X L P K T 610 Μ K A T H Ξ L S K Y 620 R Y A A V L H V R G 630 S R E Q S T I H Q V 640 S P N A w X D F A A 650 D G L D R Q T 1 I N 660 L L K E ' H K D A G T 670 V A X G N I P Y s K 680 T I V E R. F V . N R S 690 L S Ξ D D M E E ' G Q 700 N S L D G S A H V A 710 A V R M A A Q S C P 720 S L D A , M D V K E I 730 A Q E •A G Y Q V E V 740 S W A R Q W S Q H G 750 A 1 D A I F E H F E 760 P P K Ξ G A E T I I 770 E F P T D Y E G R N 780 V N T L T N R P L N 790 S I Q s R R L G T Q 800 I R E K L Q T L X. P 810 P Y M X P S R I M V 820 L D Q M P V N N -N G 830 K I D R K E L V R R 840 A I 37 860

AT 398 434 B

V A P IC P R S A 850 A- T I L R D E 'F E . D 870 V L 5 F D . L G G H S L 890 Μ A L D A S I S I K 910 V V 70 A S Ι Q R E s A 930 P B P A Ε Q S F -A Q 950 G R 75 A T W Y L M P X 970 A . I h S A A L F A L 990 E R 20 E s D G V G V Q 1010 I v Ξ D V S T G D D 1030· G Ξ V P F D L S S Ξ 1050 P G 25 E D E V L S I V 1070 Μ B I L R G E L G Q 1090 F - Y 30 L E A K P L P I 1110 Q Ϊ K Q V Ξ E Ξ Q R 1130 Q I> 35 T P A Ξ L I» T D 1150 L P s V D V T I E G 1170 S V 40 R s V T T F V V 1190 L L T A V D D A T I 1210 G T 45 Ξ T L V G C F V 1230 N T D N F Ξ G L V R 1250 Q V

R V A P R N E - I Ξ A G T E V S V 1 D . 880 N F T K L A A R V S 900 R. R F D Q · P V L·- A D 920 Ϊ. A E P I P Q R P Y 940 T G L w F L D . Q L ΪΤ 960 L G’ R I R G Q L R V 980 A A R H Ξ T L R X T 1000 F E G E A R N S D L 1020 R V Y L E V L R R Ξ 1040 Q T w R V c L V K T. 1060 G E E I I Y D G W s 1080 V D S A A L R G Q D 1100 P L R D F A A W Q R 1120 E A G Y W S K Q L Y 1140 D S R P s I L S G R 1160 A G Y G A L Q S F C 1180 R T T V F R X A Ξ F 1200 R L P X A N R N R P 1220 E L Q c M R I S I A 1240 D D R N V A T A A Y 1260 A N 50 38 55

AT 398 434 B

Q D V. P F £ R I 1270 -V S A L V p' g s R N 1280 T s R N P L V Q II M • 1290 F A .V Q s V E D Y D 1300 Q . .V R 1 E 6 L E S V 1310 Μ M P G E A S T R F 1320 D M E F •H 1 V P € 0 -1330 Q κ L T G S V Ι Y S 1340 S D L F E Q G T I Q 1350 N F V D I F Q Ε C L 1360 R S V 'L D Q . E Xi T P 1370 I S V L P F S N A I 1380 S N L E S X. D I. 1 E 1390 Μ P T S D Y P R D R 1400 T V V D 1 F R • E Q A 1410 A X C P D s I A V K 1420 D S S S Q L T Y A Q 1430 L D E Q S D R V A A 1440 W L H E R H M P A E 1450 S L V G- V L S P R S 1460 C E 1470 1480

Γ I I A Y F € 1 Μ K A· N Xi A Y I. P L D V Y A P D A R L A 1490 A I 1 D T V E G E R 1500 1 L L L G A G V P Q 1510 P G I Q I P P L S T 1520 A Y I A E A L S E A 1530 T . T . V p V T S I P Q 1540 P S A T S L A Y. V I 1550 F T s G s I G Ε P K 1560 G V H I E H R G I V 1570 R L V R 0 T N ν N V 1580 F P Ξ s G S A L P V 1590 S H F S N L A W D A 1600 A X W E I. Y T A V L 1610 N G G T V V C I D R 1620 D T M L D .1 A A L N 1630 • S T • F R K Ξ N V R A 1640 A F F T P A F L K 0 1650 C L A E T P Ξ L V A 1660 N L E I L B T A G D 1670 R L D P G D A N L A 1680 G K 39

AT 398 434 B 1690

T. A K G G I F N v τ G a T Ξ N X A F X P V V G Ξ : E 1710 T F V N G V P V G S N s H A X I - I 1730 D R B Q K 1 V P A 6·' Ξ τ' I L T G D 1750 G V A R G X I D S K D- R F V X I D 1770 I N G K S I w S X D K A R · X R P R . 1790 D G Ω τ E F F G R M V K I R G V R ' 1810 I E P G E V Ξ 1 X E K: s V L A A Γ 1830 V V V R R P P N G M I A F I T I D 1850 A E D D V Q T B ' K K H L 0 G X L P 1870 A X H I P s B I> V Q M P V X D N G 1890 K V D R K D L A τ T. V G K R R S X 1910 .A A R V P P R D E V 1 C Ξ E X S N 193Q 1 L Ξ V E . V G I T F D L G G B s X. 1950 L A X K 1 A A R τ L N T R V S V K 1970 D V F D Q P I L A D I I R R G s B 1990 R B D P I P A I P P V E Q S F A 0 2010 G R L w F 1 E Q L A s W X . L M P F 2030 A I R M R G P L Q L A V A τ N A L 2050 V B R B £ A X, R T D Ξ D G V G V Q 2070 V I 0 P K S s Q D I D L S D A V D 2090 D I A X L A A L K 40

AT 398 434 B

T T A F D’ L T 9 2110 E- E G W R V S L L R 2120 L G D D D Y I Ir s I 2130 V M . S E X I.. s D G W 2140 T V D V L R Q E L G 2150 Q F. Y S A A X R G Q 2160 E P L S Q A K S L E 2170 I Q Y R D F A V W Q 2180 R Q E N. Q I K E Q A 2190 . K Q 1 K Y W S Q Q L 2200 A D S T E c . E F L T 2210 D L P R P s I 1 S G 2220 E A D A V E M V I D 2230 G T V Y Q L L T D F 2240 C R r * H Q V T s F S 2250 V L L A A F R T A H 2260 Y R L T G T L D A T 2270 V G T. E I A N R N R 2280 E E L E G L I G F F 2290 V N T Q c M R M A I 2300 S E T E T F E S L V 2310 Q 2 V . R L T T T E A 2320 F A N Q D V E F Ξ 0 2330 I V s T L 1 E G S R 2340 D T S R N E L V Q V 2350 M F A ' L Q S Q Q D L 2360 G R X Q. L E G . M T D 2370 E A L E T E L S T R 2380 L D h E V E L F Q Ξ 2390 V G K L s G S L 1 Y 2400 S T D L F ~ E V E T X 2410 R G I V D V F L E I 2420 1 R R G ' L E Q E K Q 2430 R 1 M A M E I T D G 2440 I T K 1 R D Q G L L 2450 T V A K E A -Y- E R E 2460 S S V I D L F R Q Q 2470 V A A A E D A I A V 2480 W · D s s S T 1 T Y A 2490 D s L D G Q S N K 1 A 2500 H W L c Q R N M A E 2510 E T L V A V F A E R 2520 S C 41

AT 398 434 B

L ' T I V A F X G 2530 V X K A N X A Y. x' P 2540 X D V N A P A A R I 2550 E A I X S A V P G Ξ 2560 K X V L V Ö A H G P 2570 E X G X T M A D T Ξ 2580 X V δ I D E A . X A s 2590 S S S G D a E Ö I H 2600 A S G P T A T s X A 2610 Y V M F T s G S T G 2620 K P K G V M I D H :R 2630 S I I R X V K N s D 2640 V V A T X P Τ' P V R .2650 Μ A N V S N X A F D 2660 I S V δ E I Y T A X 2670 X' N • G G T X V C X D 2680 Y X T L X D S K I X 2690 Y N V F V E A δ V N 2700 A A M F T P V X X K 2710 Q C X G N M P A I I 2720 S R X S . V X F N ' V G 2730 D R X D A B D A V A 2740 A S G X I ö D A V Y 2750. N A Y G P T E R G M 2760 ö s T -M Y K V 0 V ’ N 2770 E P F V N G V P I G 2780 . R S X T H s G A Y V 2790 M 0 G N δ δ X V s P 2800 G V M G E I V V T G 2810 D G X A R G Y T D S 2820 A X D E D R F V a V 2830 T I D G E Ξ N I K A 2840 Y R T G D R V R Y R 2850 P K D F E I E F F G 2860 R M D Q Q V X I R G 2870 Ξ R I Ξ P A E V E B 2880 A X X G H D X V a D 2890 A A V V X R K P A N 2900 Ö E P E M I A F I T 2910 S Q Ξ D Ξ T I E δ a 2920 £ S N K Q V δ G w G 2930 e a F . D V s R Y A D 2940 I K 42

AT 398 434 B 2350

D L D T S T F G B D F X G w T S M V D X P V N E M 2970 R E . W X D Ξ T T A D Ν’ . R P P G H I 2990 X E I G ' A G T G M N L <5 K V D G X 3010 Q K Y v · G X D P A A I F V N Ξ A V 3030 K S X P S X A G R X V G T A X D I 3050. G S X D R H E I 2 V V I S" S V A 2 3070 Y F P T S E Y X I R A V V E V P s • 3090 V K R V F F G D I A X. ' N R D F X A 3110 A R A V R A X G D R E Q X R E K I 3130 A: E X E E S E E Ξ D P A F F V s X 3150 R -S Q X P N I R B L E R L M R A T 3170 Η E X S S Y R Y A B · I S B N E E Ξ 3190 Q L X ' X Q D I D P V c F A A T 2 R 3210 D S Q G X R N X X R D D V M X A V 3230 G N I P Y S R T I H X M N S X D ' 2 3250 D B V K s X D G Γ S D , A R S A A A 3270 X C T s F D A P A X A K E E G F R 3290 V E X s w A R 2 R G A X D A V F B 3310 R X A Γ Ό A N C Ξ V L V H F P T D 3330 B Q G R Q X R T X P L Q R A Q S R 3350 R X ·< E S Q V F E A 43

AT 398 434 B 3370

A . L P . -Ä Y Μ I P S R I I V L P Q M -.P 3390

A N G - K V D R K Q 1 A R R A Q V V A 3410

KA V SARVAPR NDTE I V L C

Y A Ώ I L G T E 3430 V . G 1' T D N F F n M a S L M A T K - L 3450 A A R L. S R R L D T T. V K E V F D K 3470 P V L A D L A A s I G s T P H L P I 3490 A S S V Y S G P V Ξ Y A Q G R L W F 3510 L D Ω F N L H A T W M s L A M R L L 3530 . "G P L N M D A L D V R A L E · Q R Ξ E 3550 T z, R T T F E A Q K G V Q V V H Ξ A 3570 G M K R L K V 1 D L K N E K E H M A 3590 V L E N E ö M • R P F A •S E P G W K G 3610 B L A R L G P T E Y S L V M Ξ a M F 3630 S D G W S V 0 I L R L G Q F Y s A A 3650 L R G R D P L s Q V L P I Q Y R D F 3670 A A W Q K E A A -Q V H E R Q 1 A Y W 3690 E ' N Q 1 A D S T P G L T D F P R P Q 3710 F L S G K A G V I P I E G P V Y Ξ K 3730 L 1 K F S K Ξ R Q V F S V L . 1 T A F 3750 R A T H F R L T G A A T I G T P I A 3770 N R N R P Ξ L E H I 44

AT 398 434 B F F V N T 2 C M 3790 R L £ £ . D T G . S T F X. V Q Ξ V R s V 3810 A T D A Y s N 2 D I £ R I V . s ' A £ £ 3830 P G S R D A S R S P Q L M F A £ H S 3850 2 P D £ G N I- T £ E Ξ Ξ £ R L P T S 3870 V A T R F D M £ F Ξ 2 Ξ P N K £ s G 3890 S I £ F A. D £ £ F 2 T I N S V V T V 3910 F 2 £ I £ R R G £ D Q V S I s T u P 3930 L T D G £ I D £ E K L L £ I £ •s . s N 3950 F P . R D Y s V V D V Q Q V Λ A N P K 3970 ' A P A V V D S Ξ T S Y T s L D 2 K S 3990 £ 2 I A A W £ H A 2 R F £ S £ I c V 4010 Μ A P R S F £ T I V F € I L K A G. Y 4030 A Y £ P L D V N s P R I 2 P X £ S £ 4050 V £ G K R £ V £ £ G I D M P 2 S D R 4070 M. D V £ T A R I 2 D T N T K V £ R S 4090. D P .M S R P S A T S Y V I F T S € S 4110 T G R P K G V M I £ N I £ R £ V K 2 4130 S N V T s 2 £ P 2 D M λ H I S N £ A 4150 F D A s I W £ I F T L N G G A £ I C 4170 I D Y F T £ £ D S 2 R Γ T F £ K A R 4190 V N A T £ F A P A £ 45

AT 398 434 B

E C X· N H A P I 4210 L F E D L K V L Y I D R X> D A X 0 A 4230 A K I Q A L V K G I N A Y € P T E N 4250 I . V M ' S I X Y R L X E S . Y A N G V P 4270 I G N A V s s S G A M 0 Q K Q R L V ; 4290 P P G V M G E L V V- D G L A R G Y T 4310 N S T L N A D R F V V I N D Q K A R 4330 A Y R I G D R I R Y K D G S I Ξ F F 4350 G R M D Q Q V K I R R V E P A Ξ V E 4370 Q A U L G N K A I B ft V V V Q A V D 4390 G Q E T E M I G F -V A s D R F S E G· 4410 E E E X I N Q V Q E D B F E S T A Y 4430 A G X E A X 0 Q A X R 0 F T S W X S 4450 Μ Y N G N L X D K A E E W E D D I M • 4470 Q S L 1 D .. K Ξ 0 A R A E X G I G X G 4490 Μ V L F N L P K N D E S Y V G I Ξ P 4510 S R S A A L F V D K Q D *F P G 1 Q G 4530 K X Q I L V G T A E K I> V K D F H P 4550 D V V V I N S V A Q P S R s Y L V Q 4570 I A s E L I B M I S T X F F G 0 M R 4590 S W A I N R D F L V A L Y T L G D K 4610 A X K D Q I R Q E V 46

AT 398 434 B

4630 XEE NEDEXI V DPAFFTS L 4650 Q W P G KVKHVE 1LPKRMRT 4670 EXSSYRYAAV IiHlCRDGE 4690 N R . Y G R R V H S V EENAHIDF 4710 S G .MDRHAXVQ MLDERRDA 4730 V A I G N I P H S N T INERHFT 4750 X'DTE. GEGIAQ DSLDGSAW 4770 A TKAMAARCP CLSVTELV 4790 GQA AGFRVEV S WARQRSQ 4810 AXDV VFHH XE D D R V G R V L~ 4830 · FRT DFERLPP STGLTSRP 4850 RIQNRRFESQ IREQ XQTL 4870 PYMVRSRIVV LERMPLKA 4890 KVDRKE1ARK· A R T 1 Q T I K 4910 atrvaprnd i E A V L C D E F 4930 VLGVTVGVMD HFFELGGH 4950 MATKLA ARLS R R X D TRVS 4970 DIFNQPILQD X A D V V Q T G 4990 PEEAIPSTPY SGPVEQSF 5010 GRLWF1.DQLN LNASWYHM 5030 ASRLRGP1RI EALQSALA 47

AT 398 434 B

E A R E Ξ s II R 5050 T T F Ξ Ξ Ω D G V P 5060 V Q I V R A A R N K 5070 Ω L R I X ' D V S G Γ 5080 E D A Ϋ L A A L K Ώ 5090 E Q D A A F D L T A 5100 E P G ’ w R V A L L R 5110 L . G P D D Ξ V L S I 5120 V M ff H I I S D G W 5130 S V D I X. R Ω Ξ L G 51-40 Ω L Y S N A s S Q P 5150 A P L P I Ω Y R D F 5160 A I W .. Ω K Ω E> S Ω I 5170 A E H Q K Ω L N Y W 5180 K R Q 1 V N S K P A 5190 E 1 L A D F T R P K 5200 A L S G D A D V I P 5210 I Ξ X D D. Q V Y Ω N 5220 L R s F C R A . R B V 5230 T S F V A L L A A F 5240 R A A E Y R L T G A 5250 Ξ 0 A T .1 G S P I A 5260 N R N R P E L Ξ G L 5270 I G C F V N. T . Ω c L 5280 R X P V K S E D T F 5290 D T L V K Q A R E T 5300 A T Ξ A Q D N Ω D V 5310 P F - E R I V S S M V 5320 A S S R 0 T S R N P 5330 L V Ω V M F A V H S 5340 Q H 0 L G N I R L E 5350 G V Ξ G K P V S M A 5360 ' A ' S T R F D A E M H 5370 I. F E D Ω G M X G G 5380 N V V F S K D L F E 5390. S E T I R S V V A V 5400 F Ω Ξ T L R R G L A 5410 N P B A N L A T L P 5420 L T D G L P S 1 R S 5430 L C L Ω V N Q P D- Y 5440 P R D A S V X D V F 5450 R E Q V A S I P K S 5460 I A 48

AT 398 434 B

V I D A S s Q Σι 5470 T Y T Ξ X D E R s s- 5480 Q X A T W X R R Q V 5490 T V P E E X V G V X . 5500 A P R s c E T X I A 5510 F X G ' I I K A N X A 5520 Y X P L D V N A P A 5530 .G R I E T I X S s X 5540 P G N R . L I X X G S 5550 - D T Q A V K X "H A N 5560 S V R F - T R X S D A 5570 L . V . Ξ S G s P P T E 5580 Ξ X S X R P X A Q S 5590 L A Y V M F T S G S 5600 T G V P K G V M V Ξ 5610 E R G I T R X V K N 5620 S N V V A K Q P A A 5630 A A . I A H X s N I A 5640 F D A s S W E I Y A 5650 P X X N G G T V V C 5660 I D Y Y I I I D X K 5670 A 1 E A V F K Q B H 5680 I R G A M L P P A L 5690 X K Q C X V s A P T 5700 Μ X S S ' L E X X F A 5710 A G D R X S s Q D A 5720 I X A R R A V G S G 5730 V Y N A Y G P T E N 5740 X V L S T I H N I G 5750 E N ε A F S N G V P 5760 I G N A V s N S G A 5770 F V M D Q N Q Q X V 5780 S A G V „ I G E L V V 5790 T · G D G X A R G Y T 5800 . D S K L R V D R F I 5810 · Y I X X D G N R V R 5820 A Y R T G D R V R H 5830 R P K D G Q I E F F 5840 G R M D Q Q I K I R 5850 G H R I E P A E V E 5860 Q A L A R D P A X S 5870 D S A V X T Q X T 0 5880 E E 49

AT 398 434 B 5890

E P E L V A F F S L 5910 5 N G V s D Q E. K X D 5930 N K I R H N L Q A L 5950 10 I fi V D Q L P V N A 5970 V R A Q A T P R T S 5990 15 0 I E T I I C K E F 6010 T D N F F D X G G . B 6030 L S R R L D T R V S 6050 20 G Q L A A S I Q Q G 6070 S . H S G P V Q Q S F 6090 25 F N 1 N A A w Y X ' M 6110 R V 0 A L Q T A L R 6130 30 Γ . X F E E 0 0 G V G 6150 D X C V V D I S G A 6170 35 Q Q A P F N L s T E 6190 G E N H H X Zi s I V 6210 V D ' I F Q Q E L A Q 6230 40 P L s Q V K· P L P I 6250 Q D K Q V A V Ξ E S· 6270 45 D S T P A E. I L S D 6290 A G T V P X V I Ξ D

K G N A N G T N 5900 G V G D E Ω B A L L 5920 JA Ξ II P T Y M I P S 5940 R I N G K I 0 R N Ξ 5960 L A S V s T Y V A P 5980 R N A 0 I L s V R V 6000 G I S L X A T K L A 6020. A R V R 0 V F D T P 6040 V V s T P a Ξ A I P 6060 A L A Q G R L W F L 6080 0 R P F G V R L R G 6100 P L A L E Ξ R B E L 6120 1 R M Q I V B S P R 6140 M R N E 0 L A K L K 6160 E E V A w R V A L F 6180 K A M H Η' I X S D G 6200 W S F Y S V A V R G 6220 B D B Y R D F A V W 6240 Q R Q L Q Y N I E Q 6260 L A F N R P E V L . S 6280 G E E V Y Ξ K L S L 6300 F C 50 50 55

AT 398 434 B

R N H Q V T s F 6310 V V L L A A F R V A 6320-H Y •R L T G A E D A 6330 T I G T P I A N R N 6340 R P E L E D L I G F 6350 F . V N T Q c M R X A 6360 I. E E h' D N F 1. S V 6370 V R R V R s Γ A A S 6380 A F E H Q D V P F Ξ 6390 R L V s A L L P G S 6400 R D A S R N P L V Q 6410 L U F V V a S Q R N 6420 L G K i Q I E ‘ G 1 Ξ 6430 G E 'P T P Y T A T ' T 6440 R F D V E F a L F E 6450 Q D G L A G N V V 6460 F A A D L F E A A T 6470 I R s V V E V F H Ξ 6480 I L R R G L D Q P d" 6490 I A I s T M P L V D 6500 G L A A L N s R K L 6510 P A V E D I E P D F 6520 A T E A S V V D V F 6530 Q T Q V V A H P D A 6540 L Ä V T . D T s T K L 6550 T. Y A E L D Q Q S D 6560 Η V A A ff L s K Q E 6570 1 P A E S I V V V L 6580 A P R . S S E T I V A 6590 C I G I L K A N . L A 6600 Y X. P M D S N V P E 6610 A R R Q A I L S Ξ I 6620 P G E K. F V L L G A 6630 G V P I P D N K T A 6640 D V R· M V F I S D I 6650 V A S K T D K S Y S 6660 P G T R P S A s S 1 6670 A Y V I F T S G S I 6680 G R P K G V M V E H 6690 R G V 1 S L V K Q N 6700 A S R I P Q S L R M 6710 A H V s N L A F D A 6720 S V 51

AT 398 434 B 6730

ff Ξ I F . T T L L N G G T 1 F C X S V L D S Κ A L s 6750 A A F s D H R I ff L P P A Ι. L K Q 6770 C „ L A D A P S V L E s L Y I G G D 6790 R L D G A D A X K L V K G K A Y N 6810 A Y G P X Ξ N s V I Y T I £ E Ξ T 6830 F A ff G V P I G I P K S K A Y - X M 6850 D Q D Q Q L V P A G E L V V. A G D. 6870 G L A R G Y T D P T G R F I H '1 T 6890 X D G K Q V Q A Y D R V R Y R P R 6910 D Y Q I E F F G R Q I K I R G H R 6930 X E- P A E V E Q A D s S I N D A V 6950 V V s A Q N K E G V G Y I T I Q A 6970 A Q s V D K Ξ E A V Q E ff E A E F 6990 D S X A Y A ff I G R D λ L G Q D F 7010 1 S ff T S M Y D G P R E E M Q E ff 7030 . L N D T M R S L L P P G K V L E I 7050 G T G T G M V L F K V E .G 1 Q S Y 7070 A G L E P S R S V V ff K A I E T F 7090 P s 1 A G S A R V T Ά E D I S s I 7110 D G L R S D L V V V A Q Y F P s R 7130 E Y L A E L I A N 52

AT 398 434 B

L P G V K R F L V A R A Q 0 V A K L T s £ S D Q M A A T N Ξ H. Q M P N G K A W. V D F Q D R Q R G X M E R E £ D G T A W I V A D L I Ξ R Q Ξ S Q R S S G H V M £ Γ » R P £ R L Q .S £ £ M P L T S K I - P R s A A V L C E E F F E £ G G H L D A G I T A S I L Q G

I F 7150 F G D M V E 7170 T £ G S E D 7190 D E Ξ E F P 7210 D Ξ '1 K £ S 7230 S Y R y E 0 7250 E D - K Q A G 7270 T R M D D D 7290 V V A V S Q 7310 S - L D D S R 7330 T Q S R I G . 7350 K G I G G G 7370 £ D A V F R 7390 F P. T E E £ 7410 £ Q S R P P. .7430 Y M I P G K 7450 V D R K S T 7470 £ D F V T D 7490 £ £ G V s £ 7510 £ A T K V K 7530 Q V F D s S 7550 R B R S

R Γ . -Y A T N A s K A £ £ V £ F Ξ V Ξ I £ A A V I E W A V K D R Q A £ £ S N Ί P y D Ξ D G T A K E C P F Ξ V E A F B R F E B K G R S R £ E A K S R I T £ K £ A R Q A P R T E K V G I T £ S A R £ Q P V £ A 1 P S £ P 53

AT 398 434 B

P V . E Q S F A Q 7570 G R L W F L D Q F A L W ϊ X I P F 7590 A L R M R G P L 'Q X A A A L V A L 7 €10 Ξ E R H Ξ S L R T E R D G V G I Q 7630 V V Q P L R T T K I I D V" S G M R 7650 D D · D A Y L E P X Q Q T P F D L A 7670 S E P G K R ' V A X 6 K D D H I L S' 7690 I V M E H I X S D T E V 1 Q R E L 7710 G Q F Y L A A K s P X S 0 V A P L 7730 P X Q Y R D F A V Q E E Q V A E S .7750 Q· R ' Q L D Y W K K D S .S P A £ L L 7770 A D X T R P N . V L A G S V S F V I ' 7790 N D s V Y K S L V R S R Q V T T F 7810 T T L L A A F R A R M T G s D D A 7830 T I G T P . I Ä N R E L E N 1 I G C 7850 F V N T Q c M R I D D E T F E S L 7870 V Q' Q V R s T T A E. N ' Q D V P F E 7890 R I V s T L S A G T S R N P L V 2 7910 I> L F A V E s Q Q R I Q L D G V V 7930 D E P V L S T V S D L E F H A F Q 7950 Ξ A D R L N G $ V T D L F Q P E ~ T 7970 I Q G F V A V V E 54

AT 398 434 B

Q R G L E Q p· Q 7990 S P I A T M P L A A ' Q L R D Ά G A 8010 L Q M P x- S ' 0 Y P S I V D V F Q Q. 8030 <2 A M A s P S T V Ό S T- S X L T Y 8050 A £ 1 D R t S D Q Y L R R Q Q L P ’ 8070 A £ T M V A V L A C E T I I A F L 8090 A I L K A N L A Y D V X T . P S A R 8110 Μ Ξ A X I S S V P J, I L V G S G V 8130 R · H A D X N V P N M L I s D T V T 8150 G · T D A I G T P Ξ V R' P s A T s L 8170 A Y V i F T s G ‘ S P X G V M V £ H 8190 R A .1 M R L V X D V T H M P P A T 8210 R M A H V T N I A S L ' F E M c A T 8230 L L E G G T L V C L T L. L D s T M 8250 L R E T F E R E Q A I F P P A L L 8270 R Q C L V N M P D M L E A V Y V A 8290 G D R F H S R D A Q A L A G P R V 8310 Y N A Y G P T E N S T I ' Y N I D X 8330 H 0 P Y V ' N G V P A V s N S G A Y 8350 V M D R N Q Q X · L V M G E L V V T 8370 G £ G V A R G Y T L D T D R F V T 8390 V T I D G Q R Q R 55

AI 398 434 B

T G D . R V R Y R 8410 P K G F Q I E F F G 8420 R L D Q Q Ä K I R G 8430 H R- V E L -G E V Ξ Ξ 8440 A L L S E N s V T D 8450 A A V V L R T M E E-. 8460 E D P Q I V A F V T 8470 T D H E Y R S G S S 8480 N E E. E D P Y A T Q -8430 A A G D M R K R L R 8500 S L L P Y Y M V P S 8510 H V T I L R Q M P Xi 8520 Η A N G K V D R K D 8530 L A R R A Q M T . P T 8540 A S S S G P V H V A 8550 P' . R N E T Ξ A A I c 8560 D E F e' T I L G V K 8570 V G I T D N F F E L 8580 G G' H s L 1 A T K L 8530 A A R L S R R M G L 8600 R I S V K D I F D D 8610 P V P V S L A G K L 8620 E Q Q Q G F S G E D 8630 Ξ S s T V G X V P F 8640 Q L L P A Ξ M S R E 8650 X X Q R D V V P Ω I 8660 Ξ N G H S T P 1 D H 8670 Y P A T Q T Q I F F 8680 L Ξ D K A T G E P A 8690 T P P L F S L D F P 8700 E T A D C R R 1 A S 8710 A C A A L V Q E F D 8720 I F R T V F V S R G 8730 G R F Y Q V V Xi A B 8740 L . D V P V E V I E T 8750 E Q Ξ L d’ E V A L A 8760 L E E A D K Q Q P L 8770 R L G R A M L R I A 8780 I L K R P G A K M R 8790 L V L R M S E S L Y 8800 D G L S L E Ξ I V N 8810 A L H A L Y S D K Ξ 8820 L A 56

ÄT 398 434 B 8830 8840

Q A P K F G L Y Μ B Ξ M A S R R A E G - Y • 8850 8860 N F •W R S I L Q G S S M Γ s Jj K ä .5 V <S 8870 8880 A I Ξ A M X P S A G T w Q T J8 K S I R X ! 8890 8900 P P A A L K H G I T Q A X L F T A A V S 8910 8920 L L L A R B T K S T D V V F G R V V S G 8930 8940 R Q D. X. S I N C Q T> I V G P C I N E V P 8950 8960 V R V R 1' D E G .D D M G G L L R A I Q D ' 8970 8980 Q Y T. S s F R B E T L G 1 Q E V K Ξ N C 8990 9000 X D w T D A X K E F S C c I . A F Q N L N 9010 9020 I H P E A Ξ I E G Q Q Ϊ . R L' • E- ’ " G L p· A K 9030 9040 D Q A R Q A "S G B A P N G Γ N G T ,N G T 9050 9060 N G T N G A N G T N G X N G T K G T Η A 9070 9080 N G I N G S N G V N G R D S N V V s λ A 9090 9100 G D Q A P V H 0 L D I V G I P E P t> G S 9110 9120 V K I G I G A S R Q X L G E K V V G S M 9130 9140 X. H Ξ 1 c E I M L A X. S R T 0 Q L F Q G 9150 9160 D W L D G Q D· S 1 Q L w R L A 0 G K R R 9170 9180 T T D F S C F L G F F G V F F F L s S L 9190 L D A R · C L L S S R X

Beispiel 14: Vergleich der aus der DNA abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen mit den Aminosäure-Teilsequenzen der Cyciosporin-Synthetase a)Die DNA aus Beispiel 13a wird auf Grund des genetischen Codes in eine Aminosäuresequenz übersetzt (d.h. Position 6093 der Proteinsequenz entspricht Position 18279 der DNA-Sequenz und mit den vorliegenden Aminosäure-Teilsequenzen (Beispiel 9) verglichen: 57

AT 398 434 B AS-T*ilaeqaenz 3

G V R L R G P L R V D A L' Q Ξ A L R A L E E G V R L R G P L R V D A L Q T A L R A L E E 6093 * 6114 AS-T*il«equenx 4 Q S E V G N D F M G W T S M Y D Q S E V G N D F M G W T S M Y D 388 403 AS-T«ils«quenx 5 N L P A V E D I E P D F A T E A S V N L P A V E D I E P D F A T S A s V 6507 6524 AS-T*il*«qu*nr 9 L W F. L D Q' F N I D A L X Ϊ L I P F A L L W F L D Q F N. I D A L w Y L I P F A L 7571 * 7590 (Die Position 13 der AS-Teilsequenz as9 ("X”; Beispiel 9 konnte nicht bestimmt werden.) AS-T«i.ls«quenz 10 E V F D K P V L A P E V F D K P V L A D 3464 AS-Texl**queni 12 PL V Q V M F A V H P L V Q ’ V M F A V H 5328 ’ 5337 AS-Teilaequens 13 LARQARVIPRSAAS T LD FVA LARQARVIPRSAAS TLDFVA 7454 7473 58

AT 398 434 B AS rTeilseqoenz 14 D N T Ξ .1 v L X E E Y N * D * T E I V L c * S E Y 3421 M I P s R I I V L M ' I P s· R I I V L 3374 X P s R I T L L D I P s R I T L L D 7439

. A V S A R V A P R

A V S A' R V A P R 3402 . AS-Teilseqoenr 15

A L Q T A L P A Y ALQTALPAY 3357 AS-T«x*«qu«nz 16

. L Q. S L L P P Y M

L Q S If L P P Y M 7422 (Die Position 1 der AS-Teilsequenz as16 (Beispiel 9) stimmt mit der aus der DNA abgeleiteten AS-Sequenz nicht überein.) AS- Teile«qu«nz 19 Q V Q G W G E H QVQGWGE H 2923 AS-Teils«qu«XUE 20 D I R Q S E V G D I R Q S E V G 385 F D V S X X A F D V S R Y A * * 2937 N D F M G X T N D F M G W T * 399

Vergleich der Aminosäureteilsequenz aus Beispiel 13b mit sich selbst (AS-Positionen 6157-6416 mit Positionen 7657-7916). b) Vergleich der AS-Teilsequenz abgeleitet aus der DNA-Sequenz von Beispiel 13 a (AS-Positionen 685 bis 945) mit der AS-Teilsequenz aus Beispiel 13 c (AS-Positionen 10 bis 270):

LQKEQQT PF

| I I I : I I

I^KEEQQAPF

LL KLGKDDH III i

LFKAGENHH

R V A I I I R V A IIS I I I IIS

D L 1 A • • s • • E 1 P G W 1 N L S T E V A w I L S I V M H H 1 1 1 1 1 1 1 1 I L S I V M H H 59

AT 398 434 B

D I <3 I W I S I T Ξ • V L Q I R E I L l G Q I F I Y I L A A . I K D G W S V D I F Q Q S L & Q F Y S V A V

S € K A P L S Q V A P L P I . Q Y R D F A I * J I I I I 1 1 \ I I » 1 \ 1 1 R G H D P L S Q V K P L P I H Y R D F A

V w Q R Q E E Q V A E S Q R Q L D Y w s I 1 1 1 1 : 1 l I 1 1 1 1 y w Q R Q D E Q V A V' Η E S Q L Q Y w I

R Q L A D S S P A E L L. A O Y T R P N V \ 1 I 1 1 : 1 1 1 * * 1 : - I Z 1 1 1 E Q L A D S T P ,A E I ' L S D F N R P E V

L S G E A G S V S F V I N D S V Y K S L I I 1 1 1 1 Z r. \ 1 1 1 1 1 L s G E A G T V P '1 V I E D E V Y E K L V s F C R S R Q V T T F T T L L A A F R 1 1 1 z ~l I 1 • • l 1 1 1 1 i 1 S L F c R N H Q V T s F V V Ir L A A F R

A A. E Y R H T G S 0 D A T I G T P I A N i 1 1 1 • • 1 - 1 z ♦- • 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 V. A E Y R L T G A E D A T I G T P I A N

R 1 N I R 1 P 1 E 1 L 1 E I N L 1 I 1 G 1 c F 1 V 1 N \ T 1 Q 1 C 1 M 1 R 1 R N R P E L E D L I G F F V N T Q c U R I 1, . T * « I G D • O E • • T F 1 E S 1 L V l- Q Q V 1 R i s 1 T 1 T I A L S E B D N F L S V V R R V R s T A A 1 T A t •F I E f N I Q t D V 1 P I F 1 E I R I I V 1 s I T L 1 s A 1 A S 1 A 1 F 1 E I N 1 Q' I D 1 V 1 P 1 F 1 E 1 R L 1 V 1 s A 1 L L P 944 G s R O T S R N P L V Q L L F A V E s Q 1 1 i 1 ; 1 i 1 1 1 1 i 1 z 1 1 1 1 ! G s R D A s R N P L V Q L M F V V E s Q 270

Insgesamt sind 178 von 261 Aminosäuren identisch (=68,2%), gekennzeichnet durch weitere Aminosäurereste sind funktionell ähnlich, gekennzeichnet durch

Beispiel 15: Isolierung von RNA aus dem Mycel von Tolypocladium niveum und Northernhybridisierung

Ein 1000 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Medium 4 (Dreyfuss et al., 1976) wird mit einer Sporensuspension von Tolypocladium niveum ATCC34921 beimpft (1x107 Sporen/ml) und 96 h bei 250 Upm und 25 "C geschüttelt. 1000 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Medium 5 (Dreyfuss et al. , 1976) werden mit 10 60

AT 398 434 B ml der Vorkultur beimpft und, 7 Tage bei 25 *C und 250 Upm geschüttelt. Die Konzentration von Cyclosporin A wird bestimmt (Dreyfuss et al., 1976). Erreicht werden 100 u.g/ml. Aus 8 g Mycelfeuchtmase wird RNA isoliert, dazu wird das Mycel abfiltriert, mit TE gewaschen und unter flüssigem Stickstoff in einer Reibschale zu einem feinem Pulver zerrieben. Die RNA-Isolierung erfolgt nach der von Cathala et al. (1983) beschriebenen Methode. Erhalten werden 4 mg RNA, die bei -70 *C aufbewahrt wird. 10 ng der RNA werden auf einem denaturierenden 1,2%igem Agarose-Gel, das 0,6 M Formaldehyd enthält, aufgetrennt. Der Elektrophorese-Puffer ist 0,2 M MOPS, 50 mM, Natriumazetat, 10 mM EDTA, pH 7,0. Die RNA wird in einem Puffer gelöst, der aus 0,72 ml Formamid, 0,16 ml 10fach konzentriertem Elektrophorese-Puffer, 0,26 ml Formaldehyd, 0,18 ml Wasser und 0,10 ml Glycerin gemischt wird. Die Proben werden 2 min auf 100’C erhitzt und bei 115 V, 100 mA 2h aufgetrennt. Das Gel wird dreimal 20 min in 10xSSC geschüttelt, auf Hybond N-Filter geblottet und durch UV-Behandlung fixiert. Die Hybridisierung wird bei 42 *C in 6xSSPE, 50% Formamid, 5xDenhard's Lösung, 0,1% SDS, 100 ug/ml denaturierte Heringssperma-DNA, 100 uM ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA (Teilfragmente der in den Beispielen 9 bis 12 beschriebenen klonierten DNAs) werden vor der Hybridisierung 5 min auf 100°C erhitzt und in Eis abgekühlt. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min in 2xSSC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 0,2xSSC, 0,1% SDS bei 65 "C. Die getrockneten Filter werden autoradiografiert. Ist das als Sonde verwendete Fragment ein Teilfragment des Cyclosporin-Synthetase-Gens läßt sich nach 24 - 72 h Autoradiografie bei -70 *C auf dem Roentgenfilm eine Bande nachweisen, die eine deutlich geringere Mobilität aufweist als das größte der verwendeten Moleküle der Vergleichs-RNA (9500 b; RNA-Ladder, BRL). Fig.1 faßt das Ergebnis solcher Hybridisierungen zusammen: Relativ zur Reatriktionskarte eines λ-Klons, dessen Isolierung in Beispiel 10 beschrieben wurde, sind die Positionen einzelner Restriktionsfragmente angegeben, die als Sonden in Northem-Hybridisierungen eingesetzt wurden. Die ausgefüllten Rectitecke symbolisieren, daß die oben beschriebene Bande nachgewiesen werden kann (E2, E3, E1, S3, S5), während die Rechtecke mit den Querstrichen für solche Fragmente stehen, die nicht mit einer solchen Bande hybridisieren (E4, S2).-(Das Fragment S4 wurde nicht als Sonde eingesetzt).

Beispiel 16: Identifizierung von homologen Synthetase-Genen

Aus verschiedenen Pilzstämmen wird DNA isoliert: 100ml Medium 1 (Dreyfuss et ai.,1976) werden mit 1 xl 08 Piizsporen beimpft und 72 h bei 25 °C und 250 Upm geschüttelt. Das Mycel wird abfiltriert, mit TE gewaschen und lyophilisiert. In einem Eppendorf-Homogenisator werden 100 mg lyophilisiertes Mycel zu 700 ul Lysis-Puffer (200 mM Tris-Cl pH 8,5, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) und 100 mg Aluminiumoxid-Pulver (SigmaA2039) gegebebn und homogenisiert. Dann werden 500 ul Phenol-Chloroform zugegeben und kräftig durchmischt. Nach 15 min Zentrifugieren wird die Extraktion wiedeholt. Zum Überstand werden 0,1xVolumen 3 M Natrumazetat pH 5,2 und 0,6xVolumen i-Propanol zugegeben und durchmischt. 5 min Zentrifugation; das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, kurz getrocknet und in 100 ul TE mit 100ug/ml RNase gelöst und 15 min bei 37’C inkubiert. Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung werden wiederholt.

Jeweils 5 ul dieser DNAs werden mit Xhol gespalten, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf Nylon-Filter geblottet. Diese Filter werden mit 32P-markierter XSYN3-DNA als Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt, wie sie in Beispiel 10 beschrieben sind ("Genomic walking"). Die Hybridisierungen können aber auch unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt werden.

Mit DNA aus Tolypocladium niveum werden folgende, hybridisierende Banden erhalten (alle Angaben sind Schätzungen auf Grund der Mobilität im Gel): 3,6 kb, 3,4 kb, 3,2 kb, 3,0 kb, 2,3 kb, 1,9 kb und 0,7 kb. DNA aus Fusarium solani ATCC 46829 zeigt ebenfalls Banden mit 3,6 kb, 3,4 kb, 1,9 kb und 0,7 kb, außerdem eine weitere Bande mit etwa 2,1 kb. Auch DNA aus Necosmospora vasinfecta ATCC24402 zeigt die Banden mit 3,6 kb, 3,4 kb, 1,9 kb und 0,7 kb und darüber hinaus zwei Banden mit 2,9 kb und 1,8 kb. DNA aus Tolypocladium geodes, Acremonium sp. S42160/F, Paecilomyces sp. S84-21622/F, Verticillum sp. 85-22022/F (Dreyfuss, 1986) zeigen jeweils mehrere hybridisierende Banden im Bereich 0,7 kb bis 7 kb. Basierend auf der DNA-Sequenz von Beispiel 13a können folgende Oligonukleotid-Parre synthetisiert werden: 61

AT 398 434 B 5' GA.TGCÄACTATCGGCTCTCC 3' (Positionen 15749-15767) ' 5' CCCTCXaA^GACTTCAS$& 3' (Positionen 18523-18504; Gegenstrang) oder auch 5' ACÄTCGGGGGTATTGATCGC 3' (Positionen 28984-21003) 5' ACTQ3TCCACGGGTCCTTCG 3r . (Positionen 22693-22074; Gegenstrang)

Wenn man 50 ng der Tolypocladium geodes CBS723.70-DNA mit dem ersten der beiden oben beschriebenen Oligonukleotid-Paare amplufiziert (Sambroock et al., 1989: 30 Zyklen: 1 min 30 sec 94 *C; 2 min 30 sec 50 ’C; 6 min 72 °C) entsteht eine DNA von 350 bp. Sequenziert man diese DNA, erhält man folgende Teilsequenz: 10 20 30 40 50 60

ATGCAACTAT CGGCTCTCCA ATTGCGAACA GAÄATCGAGC AGAGCTTGAG GGCCTTATTG 70 80 90 100 110. 120

GCTGTTTTGT GAATACTCAG TGTATGAGAC TGCCAGTTAC CGATGAAGAT ACATTCGCCA 130 140 150. 160 170

ATTTGATTGA CTGTGTACGA GAGACGTCAA CCGAGGCCTT GAGCACCAAG ATATCCTT

Diese DNA-Sequenz weist eine Homologie von 75,1% zu der DNA-Sequenz aus Beispiel 13 a auf.

Wenn man 50 ng der Neocosmospora vasinfecta ATCC24402-DNA mit dem zweiten der beiden oben beschriebenen Oligonukleotid-Paare amplifiziert (Sambroock et al., 1989: 30 Zyklen: 1 min 30 sec 94 *C; 2 min 30 sec 50 °C; 6 min 72 °C) entsteht eine DNA von 1713 bp. Sequenziert man diese DNA, erhält man folgende Teilsequenz: 62

AT 398 434 B 10 20 30 -40 SO. 60

ACÄTCGGGGG ΊΆΤΤGASCGC GATGCCCTCG GACAGGACTT CTTÄTCCTGS ACaTCCSCTGT 70 80 90 100 110 120

ACGAGGGCTC ATTGATTCCC CGGGAAGAGA TGCAGGAATG GCTCAGCGAC ÄCTÄSGCACT 130 140 ISO . 160 170 180

GACTCCTCGA CAACCÄGCCA CCCGGAAGAS TGCTCGAGAT CGGAACTGGT ACCGGTATGG 190 200 210 220 230 240

TGCTTTTCAA TCTCGGCAAG GTTGAGGGAC TACAGAGCTA TGCCGGTCTT GAGCCCTCGC 250 260 270 280 290 300

GCTCCGTCAC TGCCTGGGTT AACAAGGCAA TCGAAACTTT CCCAAGCCTG GCAGGAAGCG 310 320 330 340 350 360

CCCGAGTCCA GGTTGGAAGC GCCGAGGATC TCAGCTCCAT CAATGGACTG CGTGCCGATC 370 380. . 390 400 410 420

TCCTTGTGA3T CAACTCGGTC GCCCAATACT TCCCAAGTCG AGAATATCTC GCTGAGCTGA 430 440 450 460 470 480

CSGCCAACTT GATTCGACTG CCCGGCGTCA AGCGTATTTT CTTCGGCGAC ATGAGAACCT 490 500 510 520 530 540

' "STGCCACCäA 7AAGGACTTC TTGGTGGCAC GAGCAGTCCA TAGCCTAGGG TCCAATGCAT 550 560 570 580 590 600

CTAAGGCCAT GGTTCGAGAA CAGGTGGCCA AGCTTGÄAGA TGACGAGGAA GAGTTGCTTG 610 620 630 640 650 660

TTGACCCTGC CTTCTTCACC AGCCTGAGCG ACCAGTTCCC TGACGAAÄTC AAGCACGTCG 670 - 680 690 7Q0 710 720

AGATTCTGCC AAAGAGGATG GCCGCGÄCCA ACGAACTCAG CTCTTACCGA TATGCTGCTG 730 740 750 760 770 780

TTATTCATGT GGGAGGGCAC GAGATGCCGA ATGGGGAGGA TGAGGATAAG CAATGGGCTG 790 800 . 810 820 830 840

TCAAGGATAT CGATCCGAAG GCCTGGGTGG ACTTCGCCGG CACGAGGATG GACCGTCAGG 850- 860 870 880 890 900

CTCTCTTGCA GCTCC7CCAG GACCGCCAAC GTGGCGATGA CGTTGTTGCC GTCAGTAACA 910 920 . 930 940 950 960

TCCCATACAG CAAGACCATC ATGGAGCGCC ATCTGTCTCA GTCACTTGAC GATGACGAGG 970 980 990 1000 1010 1020 ACGGCACTTC agätgcagac ggaacggcct ggatatcggc cactcaatca cgggcgaagg 1030 1040 1050 1060 1070 1080

AATGCCCTGC TCTCTCAGTG GCCGACCTGA TTGAGATTGG TAAGGGGATC GGCTTCCAAG 1090 1100 1110 1120 1130 1140

TTGAGACCAG CTGGGCTCSA CAACACTCCC AGCGCGGCGG ACTCGATGCT GTTTTCCACC 1150 1160 1170 1180 1190 1200

GATTCGAAAA ACCAAGACAC TCGGGTCATG TCATGTTCAG GTTCCCAACT GAACACAAGG 63

AT 398 434 B 1210 1220 1230 1240 . 1250 12.60

GGCCGGTCTT CGAGCAST.CT. CACGÄA7CGC CCGCTACACC TGGTTCAGAG CCGCCGGC7G 1270 1280 1290 1300 1310' 1320

GAGGCAAAGG TCCGCGAGCG- GCTGCAATCG CTGCTTCCAT CGTACATGAT TCCCTCTCSG 1330 1340 1350 1360 ' 1370 1380

ATCATGTTGC TCGATCAGAT GCCTCTCACG TCCAACGGCA AGGTGGATCG CAAGAAGCTC 1390 1400 1410 1420 1430 1440

GCTCGACAAG CCCGGGTCAT CCCÄACAATT GCCGCAAGCA CGTTGGACTT TGTGGCGCGC 1450 1460 1470 1480 . 1490 1500

ACGCACGGAA ATCSAGGTCG GTTCTCTGCG AAGAATTTAC CGATCTACTA GGCGTCAAGG 1510 1520 1530 1540 1550 1560

TCGGCA.TTAC AGACAACTTC TTCGAGTTGG GCGGCCATTC GCTGCTGGCC ACGAAACTGA 1570 1580 1590 .1600 1610 1620

GCGCACGTCT AAGTCGCAGA CTGGACGCCG GTGTCACTGT GAAGGAGATC 7TTGACGAGC 1630 1640 * 1650 1660 1670 1680

CAGTACTTGC TGATCTTGCT GCTTCTATTC GTCAAGGCTC GTCCCGTCAC AGGTCTATCC •...... 1690 1700 . 1710

CGTCTTTACC CTACGAAGGA CCCGTGGAGC AGT

Diese DNA-Sequenz weist eine Homologie von 96,3% zu der DNA-Sequenz auf Beispiel 13a auf.

Beispiel 17: Protoplastierung und Transformation von Tolypocladium niveum a) Methode 1: 200 ml Medium 1 in einem Erlenmeyerkolben werden mit 109 Sporen von Tolypocladium niveum beimpft und bei 27 *C, 250 Upm für ca. 70 h inkubiert. Es werden 200 ul (0.1 %) /3-Mercaptoethanol zugesetzt und weitere 16 h inkubiert. Das Mycel wird durch Zentrifugation geerntet (Beckman Zentrifuge J2-21, Rotor JA14, 8000 Upm, 20 *C, 5 min), in 40 mi TPS gewaschen und das Pelletvolumen durch Zentrifugation,in kalibrierten Röhrchen bei 2.000 g (in Beckman Zentrifuge GPR, Rotor GH3.7, 3000 Upm, 5 min) abgemessen. Das Mycel wird in TPS suspendiert (je 1 ml Pelletvoiumen werden 3 ml TPS verwendet) und das gleiche Volumen Protoplastierungsiösung zugesetzt (Novozym 234 10 mg/ml (Fa. Novo Industri, Charge PPM-2415), Cytohelicase 5 mg/ml (Fa. IBF), Zymolyase 20T 1 mg/ml (Fa. Seikagaku Kogyo, C.No.120491) in TPS). Es wird bei 27"C und 80 Upm für ca. 60 min inkubiert. Die Protoplasten werden durch Milchfilter filtriert, abzentrifugiert (700 g, 10 min) und in insgesamt 4 ml TPS aufgenommen. Je 1 ml dieser Suspension wird auf 4 ml 35% Saccharose-Lösung aufgetragen und bei 600 g, 20 *C, für 20 min zentrifugiert. Die Protoplasten-Banden an der Phasengrenzfläche werden abgezogen, mit TPS auf je 10 ml verdünnt, abzentrifugiert, in je 200 ul TPS vorsichtig resuspendiert und die Suspensionen vereinigt. Pro 1 ml Peiletvolumen Ausgangsmycel (siehe oben) werden ca. 2x108 Protoplasten erhalten.

Die Protoplastensuspension wird abzentrifugiert (700 g, 10 min) und in 1 M Sorbit, 50 mM CaCk in einer Dichte von 1x108 suspendiert. Jeweils 90 ul dieser Suspension werden mit 10 ul der zu transformierenden Vektor-DNA, die das amdS-Gen aus Aspergillus nidulans enthält, z.B. Plasmid p3SR2 (Hynes et al., 1983), (1 - 10 ug, gelost in Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) versetzt und 25 ul PEG 6000-Lsg zugegeben (25% PEG 6000, 50 mM CaCI2, 10 mM Tris-HCI, pH 7.5, frisch hergestellt aus den Stammiö-sungen: 60% PEG 6000 (Fa.BDH), 250 mM Tris-HCI pH 7.5, 250 mM CaCk). Der Transformationsansatz wird 20 min auf Eis gestellt und anschließend werden weitere 500 ui der gemischten PEG 6000-Lösung zugegeben und vorsichtig durchmischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wird 1 ml 0.9 M NaCI, 50 mM CaCk zugesetzt, der ganze Ansatz zu 7 ml aufgeschmolzenem und auf 45 · C temperiertem Weichagar TMMAAC + N gegeben und auf vorgewärmte TMMAAC + N Platten ausgegossen. Medium TMMAAC + N enthält Glukose 6 g/l, KH2PCU 3 g/l, KCl 0.5 g/l, MgS(V7H20, 0.4 g/l, CaCI2.2H20 0.2 g/l, Acrylamid 8 mM, CsCI 2.1 g/l, Spurenelement-Lösung 1 ml/l, 0.6 M NaCI; für Platten werden 15 g/l für Weichagar 7 g/l Agar- 64

AT 398 434 B

Agar (Merck) zugesetzt. Die Spurenelement-Lösung enthält 1 mg/ml FeS0«..7H20, 9 mg/ml ZnSCU.7H20, 0.4 mg/ml CuS04..5H20,0.1 mg/ml MnSC>4..H20, 0.1 mg/ml H3BO3 und 0.1 mg/ml Na2Mo04.H20. Transformanten sind in der Lage, Acrylamid als Stickstoffquelle im Medium zu nutzen und können daher nach etwa drei Wochen bei 25 · C als Kolonien gegenüber schwachem Hintergrundwachstum identifiziert werden. b) Methode 2:

Es werden zweimal je 4,0 mi der Tolypocladium niveum-Sporen (ATCC34921; 5x108/ml) in einen 11-Erlenmeyerkolben mit 200 ml Medium 1 gegeben und bei 25 * C bei 250 Upm 65 h geschüttelt.Das Mycel wird über eine sterile Porzellanfritte mit Nylon-Gaze GMX abfiltriert und mit TE nachgewaschen und in 40 ml YG (5g/l Hefe Extrakt, 20 g/l Dextrose ) resuspendiert. Zentrifugation: 900xg; 20 ”C; 5 min. Das Pellet wird in YG (ca. 1ml Pellet in 5 ml) resuspendiert: zu 5ml Suspension werden 5ml Protoplastierungslösung zugegeben. Die Protoplastierungslösung wird aus einer Lösung hergestellt, die 1,1 M KCl und 0,1 M Zitronensäure enthält. Der pH 5,8 wird mit KOH eingestellt. Driselase (Sigma D9515) wird zugegeben (15 mg/ml; Lagerung bei -20 *C); die Suspension bleibt 15 min im Eis: Entfernung des Stärke-Carriers durch Zentrifugation : 5 min 2000 Upm, Novozym wird zugegeben (4mg/ml), Rinderserumalbumin (Sigma A7096, 20mg/ml). Diese Lösung wird durch Millipore SLGV025LS filtriert und bleibt bis zur Verwendung im Eis. Bei 37 *C wird 2,5 h geschüttelt bei 250 Upm. Die Präparation wird durch eine Milchfilter filtriert. Die Protoplasten werden abzentrifugiert (700g: 20 ”C, 5 min) und in STC (1,2 M Sorbit, 50 mM CaCI2 10 mM Tris-HCI pH 7,5) vorsichtig resuspendiert. 5 ml 35%ige Saccharose-Lösung werden mit der Suspension vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (600g; 20*C; 20 min). Die Banden werden abgezogen und auf ca.5ml mit STC verdünnt. Aus 200 ml Kultur werden 2x1ο8 Protoplasten erhalten. 50 ul der Protoplastensupension (1x10* /ml) werden in ein steriles Eppendorfgefäß geben; zugegeben werden 5 ug Plasmid-DNA in TE und 12,5 ul PEG-Lösung (20% PEG 4000, 50 mM CaCI2, 10 mM Tris-HCL pH7,5). Diese Losung wird aus separat autoklavierten Stammlösungen gemischt: 1 M CaCI2, 1M Tris-HCI pH7,5, 60% PEG 4000 (Riedel de Häen). Nachdem die Mischung 20 min im Eis stand, werden 0,5 ml der PEG-Lösung zu gegeben und vorsichtig durchmischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wird 1 ml 0,9 M NaCI, 50 mM CaCI2 vorsichtig dazugemischt. Die Suspension wird in 10ml TM88-Sorbit-Weichagar (20 g/l Malzextrakt, 4 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bacto Agar, 218 g/l Sorbit, pH 5,7) (45 ”C) gegeben und auf TM88-Sorbit-Platten (10 ml TM88-Sorbit-Agar: 20 g/l Malzextrakt,4 g/l Hefeextrakt, 30 g/l Bacto Agar, 218 g/l Sorbit, pH 5,7) ausgegossen. Nach 15 - 20 h bei 25” C werden 10 ml TM88-Sorbit-Agar mit 600 ug/ml Hygromycin (45 ” C) aufgegossen.

Hygromycinresistente Transformanten lassen sich nach 7 Tagen bei 25 ”C nachweisen.

Beispiel 18: Konstruktion des Vektors pSIM10, pSIM11 and pSIMl2 und Transformation mit diesen Plasmiden a) Isolierung des Cyclophilin-Gens aus Tolypocladium niveum

Wie in Beispiel 10 beschrieben, wird die Tolypocladium niveum-Genbank mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde gescreent.

Die Hybridisierung wird bei 42'C in 6xSSPE, 30% Formamid, 5xDenhard's Lösung, 0,1% SDS, 100 ug/ml denaturiert Heringssperma-DNA, 100 uM ATP durchgeführt. Die 32P-markierte DNA (Teilfragmente der DNA des Cyclophilin-Gens aus Neurospora crassa, Tropschug et al., 1988) werden vor der Hybridisierung 5 min auf 100”C erhitzt und in Eis abgekühlt. Nach 16 bis 20 h werden die Filter gewaschen: Dreimal 10 min in 2x$SC, 0,1% SDS und zweimal 30 min in 1xSSC, 0,1% SDS bei 45 *C. Die getrockneten Filter werden autoradiografiert. Die gereinigte DNA von \-Phagen, wird in Plasmide subkloiert und durch Restriktionskar-tiertung, Southernhybridisierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert. Folgende DNA-Sequenz wird erhalten: 65

AT 398 434 B 10 20 30 40 50 60

CÄTC3U3CÄATCATGGGCAACÄÄAGTCTTCTTCGACATTGÄGTGGGAGGGCCCCGTCATGC M G N K V F F D I E W E G . P V M 70 80 90 1Q0 110 120 AGGGCGGCAAGCCTACCTCTACCGTCAAAGAGCAGTCTGGTCGCATCÄACTTCAAGCTGT Q G G K P T S T V K E Q S G R X N F K L 130 140 150 160 170 180 ACGATGACGTCGTCCCCAAGACCGCGAGAAACTTCCGCGCTCTCTGCACGGGCGAGAAGG Y D D V V PKT A R N F R A L C T G E K 190 . 200 210 220 230 240 GCTTCGGCTÄCGAGGGCTCGTCCTTCACGTATACTCCCGAGTTCATGCTCAGGGCGGCGA G F . G Y E G S S F T Y T P E F M L R A A 250 260 270 280 290 300 CTTACCCGCGTAACGGCACTGGCGGCAAGTCCATCTACGGCGAGÄAGTTTGCCGATGAGA T Y P R N G T G G K S I Y G E KFA D E 310 320 330 340 350 360

ACTTCCAGCTGAAGCACGACCGCCCCGGTCTGCTGTCCATGGCTAACGCTGGCCCCAACA

NFQLKHDRPGLLSMANAGPN 370 380 390 400 410 420

CCAACGGCTCCCAGTTCTTCGTCACCACCGTCGTCACCTCGTGGCTCAACGGCCGCCACG T N G S Q F F V T T V . V T S W L N G R H 430 440 450 460 470 480 TCGTCTTCGGCGAGGTCGCTGACCAGGAGTCCCTGGACGTCGTCÄAGGCCCTTGAGGCCA V V F G E V A D ' 0 E S L D V v· K A -L E A 490 500 . 510 520 530 540

CTGGCTCTGGTAGCGGCGCIGTCAAGTACAACÄAGCGCGCCACCATTGTCAAGTCTGGCG 1 G S G A V K ' Y N- K R A T CO bei > H G 550 560 570 580 590 600

AGCTGTAAGCTATGGCATTCTGTGTATCTTGCGATTTCCTGCACCCAATTCGGACGGACA EL* €10 620 . 630 640 650

AÄÄGAGGCGCTGCCCACAGCAAGGACCTTTGGTTCACGGGAeGGCTTGAA

Die dargestelite Sequenz ist homolog zum Cyclophilin-Gen von N. crassa. Unter der DNA-Sequenz ist die abgeleitete Sequenz des Genproduktes wiedergegeben (Startcodon ATG = 12-14, Stopcodon TAA = 546-548). b) Konstruktion des Vektors pSIM10 und Transformation mit diesem Plasmid

Auf Grund der in Beispiel 18a wiedergegebenen DNA-Sequenz wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das folgende Sequenzen aufweist: 5’ GAAGACTTTGTTATCGATGATTGCTGAT 3'

Dieses Oligonukleotid ist weitgehend komplementär zu der in Beispiel I8a9 gezeigten Sequenz (Pos. 13 bis 43); allerdings wird der Bereich des ATGs (23-25) so verändert, daß eine Clal-Schnittstelle entsteht (ATCGAT). Ein zweites Oligonukleotid enthält eine Sequenz des Plasmides pUC18 und eine Erkennungssequenz für BamHI: 66

AT 398 434 B 5’ GGGATATCGTGAATTGTAATACGACTCACTATA 3'

Ein Plasmid, welches das 2,7 kb EcoRI-Hindlll-Fragment aus Beispiel 18a Moniert in pUCl8 enthält, wird mit Hindlll linearisiert. 1 ng der Plasmid-DNA werden mit den oben beschriebenen Oligonukleotiden amplifiziert (Sambroock et al., 1989): 30 Zyklen: 1 min 30 sec 94 ”C; 2 min 30 sec 50 *C; 6 min 72’C. Es entsteht eine DNA von 2,1 kb. Diese DNA wird nach Chloroform-Extraktion durch Ultrafiltration (Ultrafree MC 100 000; Millipore) gereinigt und im entsprechend Puffer mit den Enzymen Clal und BamHI gespalten. 50 ng dieser DNA werden mit 50 ng BamHI und Clal-gespaltener DNA des Plasmides pGEM7Zf (Promega) ligiert. Das neu entstandene Plasmid wird mit Clal und Xbal gespalten und mit einem 1,76 kb großen Clal-Xbal-Restriktionsfragment aus dem Plasmid pCSN44 (Staben et al., 1989) ligiert. Eine Restriktionskarte dieses Plasmides (pSIM10) ist in Abbildung 3 wiedergegeben.

Das 2157 bp-BamHI-Clal-Restriktionsfragment des Plasmides (4715-6865 in Abbildung 3), das den Promotor des Cyclophilin-Gens enthält, weist folgende DNA-Sequenz auf: .1.0. ..... ,20 30 40 50 60

GGATCCGTGA ATTGTAATAC GACTCACTAT AGGGCGAATT CGCTCGACGT CACCTAGGAG 70 80 90 100 110 120

ATCAGCCAGC TCCTTGGCCC TGTTCCGCAC"GTTGATGCCC TGGTCTTTGC CGTTTGGATC 130 140 150 160 170 180

GATGÄAGTGG AACTGGCGCA GCATCTTCAA AAGTGTGATG TGTCCCCGAG CGTCATCÄAT 190 200 210 220 230 240

CACACGCTCA GAGCCATGCT TGACGAGGAA CTCGAGCAGT TGCAGAGCCT TGTAGATCTG 250 260 270 280 290 , 300

GCGCCACTCC TCGGCCGACT TCTCCGTGAA CCGTCGATAT ATCATCGGCA TGATCTCGTT 310 320 330 340 350 360

GAGGGTTTGG CTGGTTCTGT TAGCTGAAGC CGGGCTGTTC AGTCGTCGAA CCGCGTACTA 370 380 . 390 400 410 420

GTTGAAGGTG CCATTGGCAA TCTCCTGCAT AATACTGGAC GA7GCTCCCC ATGGCTCGTT 430 440 450 460 470 480

GTTCGTTGCC TCTCGGACCT AGTACACGGA GTTAGCCACC GTGTTAACAA ACCGTCGCGG 490 500 510 520 530 540

CCGCAGACTA ACCTTGGACT CCATCTCGGT ATAGTTCATA ACAGCTACAT GCCAGGTCAG 550 560 570 580 590 600

CATTGGACGC GCCAGGGCTG AGGTCAGGCC TGGTACCATT TTGCGCCTTT CGGAACCCAG 610 620 630 640 650 660

CCTTGAGGTC GTACAAGGTC AGGTTGGAGA CTGTGTTCTT GATGTCGTTC AAGTCCATTT 67

670 - 680 690 TGGCA.Ga.TTC GaCTTaGCGa GaCCGGCCGG 730 740 750 AGTCGCTGAT GaGCGATGGT TGTGGTGCAA 790 800 810 GCTTGTCGCG ATGGaCAGCT GGACTTTC6G 850 860 .870 GGTCaGAGGG ATGATCACGT GATATGGGTC 910 920 930 TCTCCAAGCC AGAGGCAGCA GAGATTATAT . 970 . 980. 990 AATATGGTAT TTATGTTGGC AATTGCÄTGA 1030 1040 1050 GAGGGCTTGC ATACCAGAGG CTGCGGGTGC 1090 1100 1110 CCAGAACGAC TGCTAATAAG CCGCGACGGA 1150 1160 1170 CAGCTTTCGA CTCAGCCATT -TGAACTTGCG 1210 1220 1230 TGTACTTCTA CCGCATTACC TCCTGTACGA 1270 1280 1290 TTGTTCTCGT CACATGCCCT CCCCAGCATG 1330 1340 . 1350 CGACACATCA CAAAGGCTTC ACCCAGCAGA 1390 1400' 1410 GAGCGACATG CAGCGCTTCC CTGGAAGCCA 1450 1460 1470 GCCAGGGGGC CTCCGTCCCC CAGAATGGAT 1510 1520 1530 TCCCGATCAA GCCAGAGCCC GCCGGCGATG 1570 1580 1590 GTGTGCTGGT TGGCTGGAGG TGGGTGGCCT 1630 . 1640 1650 TGGAAGCTGC TGCAGCTGGT CGGAACGCAC 1690 1700 1710 TCGAGCGCCC ATTGGGGTTC CCGCGAAGGT 1750 1760 1770 CCGGCCAGAG CTGAGCTCGC TGGTCTGGCA 1810 1820 1830 GCGATGAGCG CAGCGGCCAG AGCTCCGGGC

AT 398 434 B 700 710 720

GAGCGGCAGA GGAGTTGTCG' ÄTTCAGCACG 760 - 770 780

GTCGATGGTC CGAGGGCGGG TGGTAGAGGT 820 830 840.

GCCGCCAGCG ACAGCTACCC GGCCTTGATG 880 890 900

GGAGTCGCAT CGTACTTCGT ACCAGCATCA 940 950 960

GACTGGAAAT GTGAAACGAA ATAAACCGTC

1000 1010 1020 TGCATCCCGG TGGAATTGAA CTAGAACGTC 1060 1070 1080

ATCGTGGGCA GCGGTACCTG AGACTTCAGG 1120 1130 1140

GCCAAAACTT TTCCCCTTTC CAGAGGCTCT 1180 1190 1200

ACTCAAGCCC GTTCATAACA _ CTTCÄTCTCT -1240 1250 1260

ATTGTAATCC CAGGTATGTC TATTTTCCTG 1300 1310 1320

CGCAATGTCT TTGGACAACG CAGCTCCTCT 1360' v 1370 1380

GCACGCGAGA GCCTGCGCGC GACAGCCTGC 1420 1430 1440

ACTGCACCAG CCTGGAAAGT TGCGCAGTTT 1480 1490 1500

GGCACTCCTC GGCTTGACCT GGAGCGCTGC 1540 1550 1560

GGGACTGGCC GCGCCAGCCT CTGCACATGA

1600 1610 1620 TTGGCCTCCC AACCAGTCCC CACCATTTGC 1660 1670 1680

CCAAGCCGTT GAGCTCAGCG CTCTGTCGGG 1720 1730 1740

CCTTTGACTG GGCCGGGGCC ACTCGTCTTG 1780 1790 1800

GCGACAGCAG CCGGGAGCTC CGTTGTCTAG 1840 1850 1860

CGGATCGGTG ACCTCACAGC CGTGGAAGCT 68

AT 398 434 B 1870 1880 1890 1900 1910 1920

CCTGGGCCCC CGÄATCAAGG ACCGCAAITC CACGTGäCTG GCCGGTTGCT CCCCTTCCGG 1930 . 1940 1950 . 1960 1970 1980 CATTGCCCGC CCCGCTATTA CACCCCTTTG CGCGCCCTGG TTGGTTGÄAA GTCCCACCGC. 1990 2000 2010 2020 2030 2040

TÄACTTTTAA CCCCTCGAGC AGCCTTCAAA ATGAAGTCAA CGCTCCTTCG ACCCGTCCTA 2050 2060 . 2070 2080 2090 2100

CCCCGCTATA AGCTCTGCTC CCCCGGGTCA· AGATCTTTCC CTCTTCCACA ACTTGCATCA 2110 2120 2130 2140 2150

GCTTCCAACA CATTGCGAGC TGCTCGATTC TTCTCCGCÄA CATCAGCÄÄT GATCGAT

Das Plasmid pSIMIO kann zur Transformation von Tolypolcladium niveum verwendet werden, wie in Beispiel 17 beschrieben. DNA aus Transfromanten wird mit BamHI gespalten und nach Gelelektrophorese auf eine Nylon-Membran geblottet. Als radioaktive Sonde wird das 1,8 kb Bglll-Fragment aus pSIMIO (Abb.3) verwendet. Unter den Transformanten lassen sich so solche identifizieren, bei denen das Plasmid pSIMIO ein- oder mehrmals im Genom integriert vorliegt.

Die Xhol-Schnittstelle im Plasmid pSIMIO (4925) erlaubt die Konstruktion von Plasmiden, die definierte Teile des Cyclosporin-Synthetase-Gens enthalten, mit denen eine gezielte Inaktivierung des Cyclosporin-Synthetase-Gens möglich ist: pSIM11 enthält ein 3,6 kb Xhol-Restriktionsfragment (22960-26584 in Beispiel 13a). Setzt man das mit EcoRV linearisierte Plasmid zur Transformation ein, erhält man etwa 30% Transformanten, die kein Cyclosporin mehr bilden. Durch Southernhybridisierungen mit DNA aus solchen Transformanten läßt sich zeigen, daß ein 8,4 kb Xbal-Fragment nicht mehr nachweisbar ist, dafür aber zwei neue Restriktionsfragmente mit 10,6 kb und 8,2 kb. pSIM12 enthält ein 0,8 kb Xhol-Restriktionsfragment (20338-21136 in Beispiel 13a). Setzt man das mit Sali linearisierte Plasmid zur Transformation ein, erhält man etwa 30% Transformanten, die kein Cyclosporin mehr bilden. Durch Southernhybridisierungen mit DNA aus solchen Transformanten läßt sich zeigen, daß ein 8,4 kb Xbal-Fragment nicht mehr nachweisbar ist, dafür aber zwei neue Restriktionsfragmente mit 10,4 kb und 5,6 kb.

In den Beispielen werden folgende Medien und Puffer verwendet:

Puffer A: 0.2 M HEPES pH 7.8, 0.3 M KCl, 4 mM EDTA, 40 (v/v)% Glyzerin, 10 mM DTT

Puffer B: 0.1 M HEPES pH 7.8, 4 mM EDTA, 15 (v/v)% Glyzerin, 4 mM DTT

Lagerpuffer: 0.1 M HEPES pH 7.5, 4 mM EDTA, 15 (v/v)% Glyzerin, 4 mM DTT

Medium, 1: 50 g/l Maltose, 10 g/l Caseinpepton (tryptisch verdaut, Fluka), 5 g/l KH2PO+, 2.5 g/l KCl, pH 5.6 (eingestellt mit Phosphorsäure)

TE: 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA SM-Puffer: 5.8 g/l NaCI, 2 g/l MgS0tx7 H20, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5 TPS: 0.6 M NaCI, 66 mM KH2PO4, pH 6.2

Figurenlegenden:

Figur 1: Restriktionskarte des in XSYN3 klonierten Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum.

Relativ zu einer Skala (2.0, 4.0, 6.0,..Kb) ist die Lage von einigen Restriktionsschnittstellen wiedergegeben. Darunter sind als Rechtecke verschiedene in Plasmide subklonierte Teilfragmente symbolisiert (S5, E3, S3,..). Ist das entsprechende Rechteck ausgefüllt, bedeutet dies, daß das entsprechende DNA-Fragment bei Northern-Hybridisierungen mit einer hochmolekularen RNA reagiert (S5, E3, S3, E1, E2). Rechtecke mit Längslinien: In Northern-Hybridisierungen wurden keine Banden erhalten (E4, S2). Leere Rechtecke: die DNA wurde nicht als Sonde eingesetzt (S4).

Die beiden folgenden Tabellen geben die in Figur 1 gezeichneten Fragment- (S5, H2,..) und Enzumpo-sitionen in bp an: 69

AT 398 434 B

Start Ende Name 1 2500 S5 1300 3300 H2 2000 5400 E3 2500 5300 S3 4700 11750 H3 5300 8400 S4 5400 7000 E1 7000 9200 E2 9200 12100 E4 10250 13850 S2 ENZYME Sali 1, Hindlll 1300, EcoRI 2000, Sali 2500, Hindlll 3300, Hindlll 3800, Hindlll 4700, Sali 5300, EcoRI 5400, EcoRI 7000, Sali 8400, EcoRI 9200, Sali 10250, Hindlll 11750, EcoRI 12100, Sali 13850

Figur 2: Restriktionskarte von Plasmid pSIMlO

Konstruktion und Struktur des Plasmides sind in Beispiel 18 beschrieben. Die Positionen sind in bp wiedergegeben. 4715 - 6865: DNA aus Tolypocladium niveum enthält den Promotor des Cyclophilin-Gens. 6866 -1761: enthält das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen aus dem Plasmid pCSN44 (Staben et ai. 1989). 1761 - 4714: pGEM7Zf (Promega Inc.).

Figur 3: Restriktionskarte des Plasmides pSIM11

Die Konstruktion des Plasmides ist in Beispiel 18 beschrieben. 4925 bis 8549 ist das 3,6 kb Xhol-Restriktionsfragment aus dem Cyclosporin-Synthetase-Gen. 8549-10500 und 1-4925 ist das Plasmid pSIMIO (Figur 2).

Figur 4: Restriktionskarte des Plasmides pSIM12

Die Konstruktion des Plasmides ist in Beispiel 18 beschrieben. 4925 bis 5723 ist das 0,8 kb Xhol-Restriktionsfragment aus dem Cyclosporin-Synthetase-Gen. 5723-7683 und 1-4925 ist das Plasmid pSIMIO (Figur 2).

Figur 5: Restriktionskarte des in syncos13 Monierten Cyclosporin-Synthetase-Gens aus Tolypocladium niveum.

Die Lage einiger Restriktionsschnittstellen ist dargestellt. Die Lage des in Xsyn3 Monierten Teiles ist durch den schraffierten Balken markiert.

Alle in den Figur 1, 2, 3 und 4 gezeigten Restriktionskarten sind nur ungefähre Wiedergaben von Restriktionsschnittstellen in DNA-Molekülen. Die gezeichneten Abstände sind proportional zu den tatsächlichen Abständen, aber die tatsächlichen Abstände können sich davon unterscheiden. Nicht alle Restriktionschnittstellen sind wiedergegeben, es können durchaus weitere Schnittstellen vorhanden sein.

Verwendete Abkürzungen: U.Ci Mikrocurie izg Mikrogramm 70

AT 398 434 B u-l Mikroliter ACV Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin amdS Acetamidase-Gen as Aminosäure ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare DNA Desoxyribonukleinsäure DTE Dithioerythrit DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Aethylendiamintetraessigsäure FIGE Feldinversionsgelelektrophorese FPLC Fast Performance Liquid Chromatography 9 Gramm (g/v)% Gewicht/Volumen in % h Stunden HEPES N-2-Hydroxyethyl-piperazine-N-2-propansulfonsäure HP-RPC High Pressure - Reversed Phase Chromatography kb Kilobase: 1000 Nukleotide kDa Kilodalton I Liter mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mM Millimoiar MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure Mr relative Molmasse N. crassa Neurospora crassa ng Nanogramm PEG Polyethylenglykol pfu plaquebildende Einheiten pH pH-Wert RNA Ribonukleinsäure SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Poiyacrylamid Gelelektrophorese sec Sekunden SSC 150 mM NaCI, 15 mM Natriumzitrat, pH7,0 SSPE 180 mM NaCI, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH7,7 TE 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1mM EDTA TFA Trifluoressigsäure Tris T ris(hydroxymethyl)aminomethane Upm Umdrehungen pro Minute V Volumen (v/v)% Volumen Prozent YAC Yeast artificial chromosome •c Grad Celsius

Außerdem werden die für Restriktionsendonukleasen üblichen Abkürzungen verwendet (Sau3A, Hindlll, EcoRI, Hindlll, Clal,..; Maniatis et al., 1982). Für DNA-Sequenzen werden die Nukleotid-Abkürzungen A, T, C, G und für Polypeptide die Aminosäure-Abkürzungen (Arg, Asn, Asp, Cys,..; b.z.w. R, N, D, C,...) benutzt (Sambroock et al., 1989).

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Claims (13)

1. AT 398 434 B Specific Photoactivated Covalent Binding of S-Adenosyl-Methionine to Phenylethanolamine-N-Methyl Trans-ferase Biochim. Biophys. Acta 742, 517 R. Zocher, T. Nihira, E. Paul, N. Madry, H. Peeters, H. Kleinkauf and U. Keller (1986). Biosynthesis of 5 Cyclosporin A: Partial Purification and Properties of a Multifunctional Enzyme from Tolypocladium inflatum. Biochemistry 25, 550-553 Patentansprüche io 1. Eine isolierte DNA aus Tolypocladium niveum, die für das Enzym Cyclosporin-Synthetase, das eine oder mehrere der folgenden Aminosäure-Teilsequenzen umfasst, kodiert: G V R L R G P L • R V D A L Q E A L R A L G V R L R G P L R V D A L Q T A L R A L Q -s E V G N D F M G ff T S "M Ύ D; N L P A V £ D 1 £' P D F· A T E A S V; L ff F L D Q- F N I D A L X Y L I P F. A 1; L ff F L D Q F N I D A L »' Y L 1 P F A L; E V F D K P V L A P L A; P L V Q V M F A V H; L -A R -Q A R. V I P R S A A s - T L D F V A; A V S A R V A P R D N T E I V L X E E Y; A V s A R V A P R N D T. £ I V L c E E Y; A L Q T A L P A Y M I P S R I I V L; L Q S L ' L P P Y M I P S R T T L L D; Q V Q G ff G E H F· D V S X X A? Q V Q G ff G Ε H F D V s - R Y A? D I R Q S E ν G N D F M G X T; und D I R Q s E V G N D F M G ff T; 15 20 25 30 2. worin "X" bedeutet, dass die Aminosäure nicht bestimmt werden konnte. Eine isolierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Cyclosporin-Synthetase die Aminosäure-Teilsequenz, die in Beispiel 13b) dargestellt ist, umfasst.
2. 3. Eine isolierte DNA nach Anspruch 1, die folgende Teilsequenzen aufweist: a) Das 2890 bp große Sa/I-Restriktionsfragment mit der folgenden DNA-Sequenz: 10 20 30 40 50 60 GTCGACAAGG AGGAAGCCAG CAACAAGGTG CAGGAGTGGG AGGCTCATTT CGACTCAACT 40 70' 80 90 100 110 120 GCATATGCCA ACATCGGGGG TATTGATCGC· GATGCCCTCG GACAGGACTT CTTATCCTGG 130 140 150 160 170 180 ACATCTATGT ACGA.CGGCTC ATTGATTCCC CGTGAAGAGA TGCAGGAAXG GCTCAACGAC 190 200 210 220 230 240 ACTATGCGCT CACTCCTCGA CAACCAACCA CCCGGAAAAG TGCTCGAGAT CGGAACTGGT 45 250 260 270 280 290 300 ACCGGTATGG TGCTGTTCAA TCTCGGCAAG GTTGAGGGAC TACAGAGCTA TGCCGGTCTT 310 320 330 340 350 360 GAGCCCTCGC GCTCCGTCAC CGCCTGGGTT AACAAGGCAA TCGAAACTTT CCCAAGCCTG 50 74 55 AT 398 434 B 430 440 450 460 470 480 CGTTCCGATC TCGTTGTGAT CAACTCAGTC GCCCAATACT TCCCAAGTCG AGAATATCTC 490 500 510 520 530 540 GCTGAGCTGA CGGCCAACTT GATTCGACTG CCCGGCGTTA AGCGTATTTT CTTCGGTGAC 550 560 570 580 590 600 ATGAGAACGT ATGCTACCAA TAAGGACTTC TTGGTGGCAC GAGCAGTCCA TACCCTAGGG 610 620 630 640 650 660 TCCAATGCAT CGAAGGCCAT GGTTCGACAA CAAGTGGCCA AGCTTGAAGA TGACGAGGAA 670 680 690 700 710 720 GAGTTGCTTG TTGACCCTGC CTTCTTCACC AGCCTGAGCG ACCAGTTCCC TGACGAAATC 730 740 750 760 770 780 AAGCATGTCG AAATTCTGCC AAAGAGGATG GCCGCGACCA ACGAACTCAG CTCTTACAGA 790 800 810 820 830 840 TATGCTGCTG TCATTCATGT GGGAGGCCAC CAGATGCCGA ATGGGGAGGA TGAGGATAAG 850 860 870 880 890 900 CAATGGGCTG TCAAGGATAT CAATCCGAAG GCCTGGGTGG ACTTTGCTGG CACGAGGATG 910 920 930 940 950 960 GACCGTCAGG CTCTCTTGCA GCTCCTTCAG GACCGCCAAC GTGGCGATGA CGTTGTTGCC 970 980 990 1000 1010 1020 GTCAGTAACA TCCCATACAG CAAGACCATC ATGGAGCGCC ATCTGTCTCA GTCACTTGAT 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GATGACGAGG ACGGCACTTC AGCGGTAGAC GGAACGGCCT GGATATCGCG TACGCAATCA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CGGGCGAAGG AATGCCCTGC TCTCTCAGTG GCCGACCTGA TTGAGATTGG TAAGGGGATC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GGCTTCGAAG TTGAGGCCAG CTGGGCTCGA CAACACTCCC AGCGCGGCGG ACTCGATGCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTTTTCCACC GATTCGAACC ACCAAGACAC TCAGGTCATG TCATGTTCAG GTTCCCGACT 1270 1280 1290 1300 1310 1320 GAACACAAGG GCCGGTCTTC GAGCAGTCTC ACGAATCGCC CGCTACACCT GCTTCAGAGC 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGCCGACTGG AGGCAAAGGT CGCGAGCGGC TGCAATCACT GCTTCCACCG TACATGATTC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CGTCTCGGAT CACGTTGCTC GATCAGATGC CTCTCACGTC CAACGGCAAG GTGGATCGCA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGAAGCTTGC TCGACAAGCC CGGGTCATCC CAAGAAGTGC GGCAAGCACG TTGGACTTTG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TGGCGCCACG CACGGAAATC GAAGTCGTCC TCTGCGAAGA ATTTACCGAT CTACTAGGCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 TCAAGGTTGG CATCACAGAC AACTTCTTCG AGTTGGGCGG CCATTCGCTG CTGGCCACGA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 AACTGAGCGC ACGTCTAAGT CGCAGACTGG ACGCCGGTAT CACTGTGAAG CAGGTCTTTG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ACCAGCCAGT ACTTGCTGAT CTTGCTGCTT CTATTCTTCA AGGCTCGTCT CGTCACAGGT 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CTATCCCGTC TTTACCCTAC GAAGGACCCG TGGAGCAGTC CTTTGCCCAG GGGCGCCTGT 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GGTTCCTCGA CCAGTTCAAC ATCGATGCCT TGTGGTACCT TATTCCATTT GCACTCCGCA 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TGCGCGGGCC GCTGCAAGTT GACGCCCTCG CTGCTGCCCT GGTGGCACTT GAAGAGCGTC 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ATGAATCTCT GCGCACAACG TTTGAGGAAC GAGACGGAGT CGGCATCCAA GTGGTGCAAC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CCCTCCGCAC GACCAAGGAT ATCCGGATCA TCGACGTGTC AGGCATGCGA GACGACGACG 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CCTACCTCGA GCCATTGCAG AAAGAACAGC AGACTCCTTT CGACCTTGCT TCAGAGCCTG 2110 2120 2130 2140 2150 2160 GCTGGAGGGT AGCACTGCTG AAGCTTGGAA AGGATGACCA CATCCTCTCT ATTGTCATGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 ACCACATCAT CTCTGACGGG TGGTCTACTG AAGTCTTGCA AAGGGAACTC GGTCAATTCT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 ACTTGGCAGC GAAATCCGGG AAAGCCCCCT TATCGCAGGT TGCCCCGCTT CCTATTCAGT 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ATCGCGATTT TGCTGTTTGG CAGAGACAAG AGGAACAGGT CGCTGAGAGT CAAAGGCAGC 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCGACTACTG GAAGAAGCAG CTTGCGGACA GTAGCCCGGC TGAGCTCTTG GCTGACTACA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 75 AT 398 434 B TCGACTACTG GAAGAAGCAG CTSGCGGACA 2410 . 2420 2430 CCAGGCCGÄA CGTACTGTCT GGA'GAGGCAG 2470 2480 '2480 TTTACAAGAG CCTCGTCTCC TTCTGCCGGT 2530 ’254Ö 2550 TGGCAGCGTT ICGCGCCGCT CÄCTATCGAA 2590 2600 2610 CGCCAATTGC CAATCGCAAC AGGCCTGAGC 2650 . 2660 2670 CCCAGIGCAT GCGTAZGACI ATCGGCGACG 27Γ0 2720 2730 TACGGTCTAC CACCGCGACA GCCTTCGAGA 2770 2780 2790 CCÄCCCTCAG TGCCGGGTCC AGGGAIACGT 2830 2840 2850 CGGTTCATTC TCAACAAGGC CTGGGCAGGA 2890 TTCTGTCBSäC GTAGCCCGGC TGAGCTCTTG GCTGACTACA 2440 2450 2460 GCAGCGTGTC TTTCGTGATC AACGATTCGG 25Ö0 2510 v 2520 CTCGCCAAGT AAGCACCTTT ACGACTTTAC 2560 2570 2580 TGACCGGGTC AGACGACGCA ACTATTGGCA 2620 2630 2640 TTGAAAACTT GATCGGCTGC TTCGTCAATA - 2680 ,2690 2700 ATGAGACGTT TGAATCACTG GTACAACAGG 2740 2750 2760 ATCAAGACGT TCCGTTTGAA CGAATCGTTT 2800 2810 2820 CCCGAAACCC CCIAGTACAG CTTCTCTTTG ΛβίΛ 9tnn 500(1 TCCAGCTCGA CGGTGTCGTC GATGAGCCGG b) Das 2482 bp große Sa/i-Restriktionsfragment mit der folgenden DNA-Sequenz: 10 20 30 40 50 60 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTGCGAA GCTGAAGGAG GAGCAGCAAG CTCCTTTCAA 70 80 .90'. 100 110 120 XCTCTCTACT-GAAGTCGCTT GGAGGGTAGC ACTCTTCÄAG GC7GGAGAGA ACCACCACAI 130 140 150 , 160 170 180 CCTCTCTATC GTCATGCATC ACAIAATTTC AGAIGGCTGG TCACTTGACA TCTTCCAGCA 190 200 210 220 230 240 GGAGCTTGCC CAATTCTACT OGGTAGCTGT ACGAGGGCAT GACCCCCTTT CCCAGGTCAA 250 260 270 . 280 -290 300 ACCGCTCCCC ATTCACTACC GCGATTTTGC TGTCTGGCAG AGACAAGÄ1A AGCAAGTTGC 310 . 320 330 340 350 - 360 •CGTTCÄCGAÄ AGCCAACTTC AGTACTGGÄT AGAGCAGCTC GCGGATAGCA CGCCAGCCGA 370 380 390 -400 410 420 GATCCTATCT GATTTTAACC GACCGGAGGT CTTGTCCGGC GAAGCTGGTA CAGTTCCCAI 430 440 450 460 470 480 CGTGATCGAG'GACGAGGTTT ATGAGAAGCT CTCCCTCTTC TGCCGCAATC ATCAGGTCAC 490 500 510 520 530 540 CAGCTTCGTC GTCCTTCTGG CTGCTTTCCG CGTCGCACAT TATCGCCTAA CTGGGGCAGA 550 560 570 580 590 600 GGATGCGACT'ATCGGTACAC CAATTGCGAA CCGCAACCGC CCCGAACTTG AGGACTTGAT 610 620. 630 640 650 660 CGGTTTCTTT CTCAATACAC AATGCATGAG AATCGCGCTC GAAGAACACG ATAATTTCCT 670 680 690 7.00 710 720 ATCAGTAGTG CGAAGAGTTC GCTCAACAGC GGCAAGCGCC TTCGAAAACC AGGATGTGCC 730 740 750 .' 760 770 .780 ATTCGAGCGC CTTGTATCTG CACTTCTGCC·CGGCTCTAGA GAIGCCTCCC GGAATCCCCT 790 800 810 820 830 840 CGTTCAACTC ATGTTTGTCG TCCACTCCCA GCGAAATCTC GGTAAACTGC AACTGGAGGG 850 . 860 870 880 890 900 CTTGGAAGGC GAACCAACCC CGTACACCGC GACGACCCGC TTCGATGTTG AGTTCCACCT . 910 920 930 940 950 960 CTTCGAACAA GACAAAGGCC TCGCCGGÄAA TGTTGTCTTC GCAGCAGACT TGTTCGAGGC 970 980 990' 1000 1010 1020 TGCCACTATC CGCAGCGTTG TTGAAGTCTT CCACGAGATC CTCCGTCGTG GTCTCGRCCA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GCCAGATATC GCAATTTCCA CCATGCCACT TGTCGATGGC CTGGCGGCGC TCAACAGCCG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TAACTTACCC GCAGTTGAAG ACAXCGAACC TGACTTCGCC ACCGAGGCCT CGGXGGTTGA 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGTCTTCCAG ACACAAGTGG TCGCTAACCC AGATGCCCTG GCTGTGACCG ACACATCCAC 76 AT 398 434 B 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AAAGCTTACA TATGCGGAGC TGGATCAACA ATCCGATCAT GTCGCGGCTT GGCTGTCCAA 1270 1280 1290 1300 .1310 1320 ACAGAAGCTA CCAGCAGAGA GCATGGTCGT TGTTCTTGCG CCACGATCCT CTGAGACTAT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGTAGCATGC ATTGGCATCC TCAAAGCGAA CCTCGCATAT CTOCCCATGG ATTCCAAGGT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CCCCGAAGCC CGTCGCCAAG CAATTCTTTC GGAGATTCCA GGGGAGAAGT TCGTTTTGCT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 TGGAGCAGGA GTGCCTAOTC CTGACAACAA GACAGCTGAT GTCAGGATGG TCTTCAICÄß 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CGATATCGTC GCCAGCAAGA CAGACÄAGTC CTACTCACCC GGCACTCGGC CATCTGCATC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 AAGCCTTGCC TATGTTATCT TCACATCAGG CTCGACAGGT CGGCCAAAGG GTGTCATGGT 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CGAGCATCGG GGTGTTATTT CTTTGGTG&A GCAGAACGCT TCAAGAAXAC CACAAAGTCT 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GCGGASGGCA CATGTTTCCA ATCTCGCATT CGATGCTTCC GTGTGGGAGA TATTCACCAC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 GCTGCTCAAT GGAGGAACGC TTTTCTGTAT CAGCTACTTT ACTGTCTTGG ACAGCAAAGC 1810 18.20 1830 1840 1850 1860 ACTTTCTGCC GCTTTCTCCG ATCASCGCAT TAACATCACC CTGCTCCCAC CGGCCTTGCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 CAAGCAATGT CTTGCAGACG CGCCATCTGT CCTGAGCTCC CTCGAGTCTC TGTACATTGG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 AGGCGACCGC CTTGATGGAG CTGATGCAAC CAAGGTGAAG GACCTCGTCA AAGGCAAGGC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CTACAATGCC TACGGTCCCA CCGAGAATTC CGTCATGAGC ACGATCTATA CCATCGAACA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CGAGACTTTT GCGAATGGCG TTCCCATCGG CACATCTTTA GGCCCCAAGT CCAAGGCCTA 2110 2120 2130 2140 2150 2160 AATTATGGAC CAGGATCAGC AGCTCGTACC AGCAGGCGXG ATGGGAGAGC TTGTCGTTGC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 TGGCGATGGT CTCGCACGAG GGTAIACCGA TCCATCACTG AACACGGGCC GGTTCASCCA ,2230 2240 2250 2260 2270 2280 CATCACGATC GATGGCAAAC AAGTTCAGGC ATACCGGACC GGCGATCGAG TCAGATACCG 2290 2300 2310 .2320 .2330 2340 ACCTAGGGAC TACCAAATCG AGTTCTTTGG CCGTTTAGAT CAGCAGATCA AGATTCGCGG 2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCATCGCATC GAGCCAGCTG AAGTGGAGCA GGCTCTTCTC AGCGACTCAT CGATCAACGA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TGCCGTTGTT GTGTCGGCAC AAAACAAGGA GGGACTCGAA ATGGTTGGTT ACATCACGAC 2470 2480 CCAGGCTGCA CAATCCGTCG AC.
3. 4. Eine isolierte DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Restriktionskarte aufweist, wie sie in den Figuren 1 und 5 wiedergegeben ist.
4. 5. Ein rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül DNA, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, enthält.
5. 6. Ein Vektor, dadurch gekennzeichnet dass der Vektor DNA, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, enthält.
6. 7. Ein Vektor nach Anspruch 6, wobei der Vektor entweder ein Plasmid, ein Cosmid, ein P1 - oder ein YAC-Vektor ist.
7. 8. Eine isolierte DNA, die für das Protein Cyclophilin kodiert und die folgende Teilsequenz aufweist: 77 AT 398 434 B 10 20 30 40 50 €0 CTTCTCCGGA ACATCAGCAA tcatgggcaa caaagtcttc ttcgacattg agtgggaggg 70 80 90 100 110 120 CCCCGTCATG CAGGGCGGCÄ AGCCTACCTC TACCGTCAAA GAGCAGTCTG GTCGCATCAA 130 140 150 160 170 180 CTTCAAGCTG TACGATGACG TCGTCCCCAA GACCGCGAGA AACTTCCGCG CTCTCTGCAC 190 .200 . 210 220 230 240 GGGCGAGÄAG GGCTTCGGCT ACGAGGGCTC GTCCTTCACG TATACTCCCG AGTTCATGCT 250 260 270 CAGGGCGGCG ACTTACCCGC GTAACGGCAC TGGCGCTA. Eine isolierte DNA nach Anspruch 8, die folgende DNA-Sequenz aufweist: 10 20 30 40 50 60 GGATCCGTGA ATTGTAATAC GACTCACTAT AGGGCGAATT CGCTCGACGT CACCTAGGAG 70 80 90 100 110 120 ATCAGCCAGC TCCTTGGCCC TGTTCCGCAC GTTGATGCCC TGGTCTTTGC CGTTTGGATC 130 140 150 ' 160 170 180 GATGAAGTGG AACTGGCGCA GCATCTTCAA AAGTGTGATG TGTCCCCGAG CGTCATCAAT 190 200 210 220 230 240 CACACGCTCA GAGCCATGCT TGACGAGGAA CTCGAGCAGT TGCAGAGCCT TGTAGATCTG 250 260 270 280 290 300 GCGCCACTCC TCGGCCGACT TCTCCGTGAA CCGTCGATAT ATCATCGGCA TGATCTCGTT 310 320 330 340 350 360 GAGGGTTTGG CTGGTTCTGT TAGCTGAAGC CGGGCTGTTC AGTCGTCGAA CCGCGTACTA 370 380 390 400 410 420 GTTGAAGGTG CCATTGGCAA TCTCCTGCAT AATACTGGAC GATGCTCCCC ATGGCTCGTT 430 440 450 460 470 480 GTTCGTTGCC TCTCGGACCT AGTACACGGA GTTAGCCACC GTGTTAACAA ACCGTCGCGG 490 500 510 520 530 540 CCGCAGACTA ACCTTGGACT CCATCTCGGT ATAGTTCATA ACAGCTACAT GCCAGGTCAG 550 560 570 580 590 600 CATTGGACGC GCCAGGGCTG AGGTCAGGCC TGGTACCATT TTGCGCCTTT CGGAACCCAG 610 620 630 640 650 660 CCTTGAGGTC GTACAAGGTC AGGTTGGAGA CTGTGTTCTT GATGTCGTTC AAGTCCATTT 670 680 690 700 710 720 TGGCAGATTC GACTTAGCGA GACCGGCCGG GAGCGGCAGA GGAGTTGTCG ATTCAGCACG 730 740 750 760 770 780 78 AT 398 434 B GCTTGTCGCG ATGGACAGCT GGACTTTCGG GCCGCCAGCG ACACCTACCC GGCCTTGATG 850 860 870 880 890 900 GGTCAGAGGG ATGATCACGT GATATGGGTC GGAGTCGCAT CGTACTTCGT ACCAGCATCA 910 920 930 940 950 960 TCTCCAAGCC AGAGGCAGCA GAGATTATAT GACTGCAAAT GTGAAACGAA ATAAACCGTC 970 980 990 1000 1010 1020 aatatggtat TTATGTTGGC AATTGCATGA TGCATCCCGG TGGAATTGAA CTAGAACGTC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAGGGCTTGC ATACCAGAGG CTGCGGGTGC atcgtgggca GCGGTACCTG AGACTTCAGG 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CCAGAACGAC TGCTAATAAG CCGCGACGGA GCCAAAACTT TTCCCCTTTC CAGAGGCTCT 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CAGCTTTCGA CTCAGCCATT TGAACTTGCG ACTCAAGCCC GTTCATAACA CTTCATCTCT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 TGTACTTCTA CCGCATTACC TCCTGTACGA ATTGTAATCC CAGGTATGTC TATTTTCCTG 1270 1280 1290 1300 1310 1320 TTGTTCTCGT CACATGCCCT CCCCAGCATG CGCAATGTCT TTGGACAACG CAGCTCCTCT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CGACACATCA CAAAGGCTTC ACCCAGCAGA GCACGCGAGA GCCTGCGCGC GACAGCCTGC 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GAGCGACATG CAGCGCTTCC CTGGAAGCCA ACTGCACCAG CCTGGAAAGT TGCGCAGTTT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GCCAGGGGGC CTCCGTCCCC CAGAATGGAT GGCACTCCTC GGCTTGACCT GGAGCGCTGC 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TCCCGATCAA GCCAGAGCCC GCCGGCGATG GGGÄCTGGCC GCGCCAGCCT CTGCACATGA 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GTGTGCTGGT TGGCTGGAGG TGGGTGGCCT TTGGCCTCCC AACCAGTCCC CACCATTTGC 1630 1640 1650 1660 1670 1680 TGGAAGCTGC TGCAGCTGGT CGGAACGCAC CCAAGCCGTT GAGCTCAGCG CTCTGTCGGG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 TCGAGCGCCC ATTGGGGTTC CCGCGAAGGT CCTTTGACTG GGCCGGGGCC ACTCGTCTTG 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CCGGCCAGAG CTGAGCTCGC TGGTCTGGCA GCGACAGCAG CCGGGAGCTC CGTTGTCTAG 1810 1820 1830 1840 1850 1860 GCGATGAGCG CAGCGGCCAG AGCTCCGGGC CGGATCGGTG ACCTCACAGC CGTGGAAGCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 CCTGGGCCCC CGAATCAAGG ACCGCAATTC CACGTGACTG GCCGGTTGCT CCCCTTCCGG 1930 1940 1950 1960 1970 1980 CATTGCCCGC CCCGCTATTA CACCCCTTTG CGCGCCCTGG ttggttcaaa GXCCCACCGC 1990 2000 2010 2020 2030 2040 TAACTTTTAA CCCCTCCAGC AGCCTTCAAA ATGAAGTCAA CGCTCCTTCG ACCCCTCCTA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CCCCGCTATA AGCTCTGCTC CCCCGGGTCA AGATCTTTCC CTCTTCCACA ACTTGCATCA 79 AT 398 434 B 2050 2060 2070 2080 2090 2100 CCCCGCTATA AGCTCTGCTC CCCCGGGTCA AGATCTTTCC CTCTTCCACA ACTTGCATCA 2110 2120 2130 2140 2150 GCTTCCAACA CATTCCGAGC TGCTCGATTC TTCTCCGCAA CATCAGCAAT CATCGAT.
8. 10. Eine isolierte DNA nach den Ansprüchen 8 und 9, eingebaut in eine Vektor-DNA. 10
9. 11. Verfahren zur Stammverbesserung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektor nach einem der Ansprüche 6 und 7 in einen Pilz transformiert wird.
10. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz Tolypocladium niveum ist. 15
11. 13. Zellen, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 6 und 7 transformiert sind.
12. 14. Verfahren zur Identifizierung von Organismen, die DNAs enthalten, die dem Cyclosporin Synthetase-Gen sehr ähnlich sind, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA einer oder mehrerer der Ansprüche 1 20 bis 5 als Gensonde benutzt wird.
13. 15. Verfahren zur Verbesserung der Herstellung eines Cyclosporin, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Cyclosporin produzierende Zelle mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 6 und 7 transformieren lässt, und das Cyclosporin isoliert. 25 Hiezu 5 Blatt Zeichnungen 30 35 40 45 50 80 55