DE69728878T2

DE69728878T2 - Verfahren zur vermehrung der hemoproteinherstellung in filamentösen fungi

Info

Publication number: DE69728878T2
Application number: DE69728878T
Authority: DE
Inventors: L. Susan ELROD; R. Joel CHERRY; Aubrey Jones
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: ATE265534T1; AU3307797A; CN1267556C; DE69728878D1; WO1997047746A1; US6261827B1; EP0910642A1; JP2000512151A; CN1221453A; EP0910642B1; US6100057A; JP3462218B2; DK0910642T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Querverweise zu verwandten Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Continuation-In-Part der Anmeldung, Seriennummer 08/662,752, eingereicht am 10. Juni 1996 und der Seriennummer 60/041,158, eingereicht am 17. März 1997, deren Inhalte vollständig hierin durch Verweis eingeschlossen sind.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Hemoproteinen in einem filamentösen Pilz oder filamentösen Pilzzellen, die in der Lage sind, Hemoproteine herzustellen.
Beschreibung des Standes der Technik
Hem, ein Chelatkomplex aus Protoporphyrin IX und Eisen, dient als eine prosthetische Gruppe von Hemoproteinen. Protoporphyrin IX besteht aus einem Porphyrinring, substituiert mit vier Methylgruppen, zwei Vinylgruppen und zwei Propionsäuregruppen, die ein Eisenatom benötigen, um Hem zu bilden. In die Biosynthese von Hem aus Glycin und Succinyl-CoA sind acht enzymatische Schritte involviert, welche durch die 5-Aminolevulinsäuresynthase (EC 2.3.1.37), die Porphobilinogensynthase (EC 4.2.1.24), die Porphobilinogendeaminase (EC 4.3.1.8), die Uroporphyrinogen III-Synthase (EC 4.2.11.75), die Uroporphyrinogen III-Decarboxalse (EC 4.1.1.37), die Coproporphyrinogen III-Oxidase (EC 1.3.3.3), die Protoporphyrinogen IX-Oxidase (EC 1.3.3.4) und die Ferrochelatase (EC 4.99.1.1) katalysiert sind. Die 5-Aminolevulinsäre-Synthase katalysiert die Kon densation von Glycin und Succinyl-CoA, um 5-Aminolevulinsäure zu bilden. Die Porphobilinogensynthase (ebenfalls 5-Aminolevulinsäuredehydratase oder 5-Aminolevulinsäuredehydrase genannt) katalysiert die Kondensation von zwei Molekülen 5-Aminolevulinsäure, um Porphobilinogen zu bilden. Die Porphobilinogendeaminase (ebenfalls Hydroxymethylbilansynthase oder Uro I-Synthase genannt) katalysiert die Tetrapolymerisierung von Pyrolporphobilinogen in Preuroporphyrinogen. Die Uroporphyrinogen III-Synthase (ebenfalls Uro III-Synthase oder Uro III-Cosynthase genannt) katalysiert ein Re-Arrangement des vierten Ringes von Preuroporphyrinogen, gefolgt von einer Cyclisierung, um Uroporphyrinogen III herzustellen. Die Uroporphyrinogen III-Decarboxylase (ebenfalls Uro D oder Uroporphyrinogendecarboxylase genannt) katalysiert die Decarboxylierung aller vier Essigsäureseitenketten von Uroporphyrinogen-III in Methylgruppen, um Coproporphyrinogen III zu erzielen. Die Coproporphyrinogen III-Oxidase (ebenfalls Coproporphyrinogenase genannt) katalysiert die oxidative Decarboxylation von zwei Porpionatgruppen an den Positionen 2 und 4 der A- und B-Ringe von Coproporphyrinogen III zu Vinylgruppen, um Protoporphyrinogen IX zu erzielen. Die Protoporphyrinogen IX Oxidase katalysiert eine Oxidation von sechs Elektronen von Protoporphyrinogen IX, um Protoporphyrin IX zu erzielen. Die Ferrochelatase (ebenfalls Ferrolyase, Hemsynthase oder ProtoHemferrolyase genannt) katalysiert die Insertion von Eisen in Protoporphyrin, um Hem zu erzielen.
Die Umwandlung eines Apoproteins in ein Hemoprotein ist abhängig von der Verfügbarkeit von Hem, welches durch den Hem-Biosyntheseweg bereitgestellt wird. Die Apoprotein-Form des Hemoproteins verbindet sich mit Hem, um das aktive Hemoprotein herzustellen, was eine Konformation erfordert, die das Hemoprotein stabiler gegen proteolytische Angriffe macht, als das Apoprotein. Wenn die Menge an Hem, die von einem Mikroorganismus produziert wird, geringer ist als die Menge des hergestellten Apoproteins, wird sich Apoprotein anreichern und einer proteolytischen Degradation unterzogen werden, wodurch der Ertrag des aktiven Hemoproteins verringert wird.
Um dieses Problem zu überwinden, zeigte Jensen, dass das Hinzufügen von Hem oder einem Hem-enthaltenden Material zu einer Fermentation zu einer signifikanten Erhöhung des Ertrages einer Peroxidase führt, die von Aspergillus oryzae hergestellt wird (WO 93/19195). Obwohl Hem-Ergänzung zu einem Fermentationsmedium eine signifikante Verbesserung des Ertrages eines Hemoproteins ergibt, ist es nicht kosher, kostspielig und schwierig, dies einem großen Ausmaß zu implementieren.
Wu et al. (1991, Journal of Bacteriology 173: 325–333) offenbart ein Verfahren zur Überexpression einer E. coli NADPH-Sulfidreductase, einem SiroHemoprotein, welches das Einfügen eines Salmonella typhimurium cysG Gens, welches eine Uroporphyrinogen III Methyltransferase kodiert, die für die Synthese von SiroHem erforderlich ist, in ein Plasmid umfasst.
Es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zum Erhöhen der Herstellung eines Hemoproteins in filamentösen Pilzstämmen bereitzustellen, um kommerziell signifikante Mengen zu erzielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Hemoproteins, umfassend:

(a) Einführen in eine filamentöse Pilzzelle,
(i) eine oder mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert;
(ii) eine oder mehrere erste Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines Hem-biosynthetischen Enzyms, welches durch eine endogen in der filamentösen Pilzzelle vorliegende erste Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zu richten, wobei die eine oder mehrere der ersten Kontrollsequenzen funktionsfähig mit der ersten Nukleinsäuresequenz verknüpft sind; und/oder
(iii) eine oder mehrere Kopien von einer oder mehreren zweiten Nukleinsäuresequenzen, welche ein Hem-biosynthetisches Enzym kodieren;
(b) Kultivieren (Züchten) der filamentösen Pilzzelle in einem Nährmedium, welches zur Herstellung des Hemoproteins und des Hem-biosynthetischen Enzyms geeignet ist; und
(c) Gewinnung des Hemoproteins aus dem Nährmedium der filamentösen Pilzzelle.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante filamentöse Pilzzellen, welche eine oder mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die ein Hemoprotein kodiert/kodieren, eine oder mehrere erste Kontrollsequenzen, welche in der Lage ist/sind, die Expression eines Hem-biosynthetischen Enzyms zu richten, kodiert durch eine erste endogen in der filamentösen Pilzzelle vorliegende Nukleinsäuresequenz und/oder eine oder mehrere Kopien einer oder mehrerer zweite Nukleinsäuresequenz(en), welche ein Hem-biosynthetisches Enzym kodiert/kodieren, umfassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE04.
2 zeigt eine Restriktionskarte eines 4,2 kB langen genomischen Fragments, welches ein Aspergillus oryzae 5-Aminolevulinsäuresynthase-Gen enthält. Der Maßstab in Kilobasen (kB) wird unter der Karte gezeigt. Der Pfeil stellt die Lokalisation des offenen Leserahmens des Gens dar.
3 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Aspergillus oryzae 5-Aminolevulinsäuresynthase-Gens (SEQ ID NOS: 1 beziehungsweise 2). Potentiell wichtige Transkriptionsstellen, CCAAT-Box und TATA-Box sind unterstrichen. Die zwei konservierten putativen HRM-Motive sind in einem Kasten dargestellt; der Glycin-Loop, der in die Pyridoxalphosphatase Co-Faktor-Bindung involviert ist, ist eingekreist und
4 zeigt die konservierten Hem-regulatorischen Motive in verschiedenen 5-Aminolevulinsäure-Synthase-Genen. Die Pentapeptid-Motive sind in einem Kasten dargestellt.
5 zeigt den Abgleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für 5-Aminolevulinsäure-Synthasen aus Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae und humanem Eryothrocyt (SEQ ID NOS: 2, 22, 23 beziehungsweise 24). Die konservierten Aminosäuren sind in einem Kasten dargestellt.
6 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pBANe6.
7 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE31.
8 zeigt die Konstruktion des Plasmids pJVi9.
9 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pJeRS6.
10 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pJRoC50.
11 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pAJ005-1.
12 zeigt die Nukleinsäure- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Aspergillus oryzae Porphobilinogensynthase-Gens (SEQ ID NOS: 3 beziehungsweise 4). Die CAAT-Boxen sind unterstrichen, und die TATA-Boxen sind in einem Kasten dargestellt. Das putative Intron ist durch eine gepunktete Unterstreichung identifiziert, und die putative Zinkfinger-Domäne ist durch eine gestrichelte Un terstreichung identifiziert. Die Bibliotheks-Probe ist durch eine dunkle starke Unterstreichung identifiziert, und das aktive Lysin ist eingekreist.
13 zeigt den Abgleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für Porphobilinogensynthasen aus B. subtilis, E. coli, Mensch, Erbse, Ratte, Spinat, Hefe und Aspergillus oryzae (SEQ ID NOS: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 beziehungsweise 4).
14 zeigt eine Restriktionskarte von pAJ023.
15 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE7t1.
16 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE37.
17 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE39.
18 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMT1612.
19 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pBANe13.
20 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pSE38.
21 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pJaL292.
22 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pKS6.
23 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMHan37.
24 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pBANe8.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Hemoproteins, umfassend:

"Hemoprotein" wird hierin definiert als jedes beliebige Mitglied einer Gruppe von Proteinen, welches Hem als eine prosthetische Gruppe enthält. Das Hemoprotein kann ein Globin, ein Cytochrom, eine Oxidoreductase oder jedes beliebige andere Protein sein, das Hem als eine prosthetische Gruppe enthält. Hem-enthaltende Globine schließen Hemoglobin und Myoglobin ein. Hem-enthaltende Cytochrome schließen Cytochrom P450, Cytochrom b, Cytochrom c₁ und Cytochrom c ein. Hem-enthaltende Oxidoreductasen schließen eine Catalase, eine Oxidase, eine Oxygenase, eine Haloperoxidase und eine Peroxidase ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreduktase eine Catalase. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreductase eine Oxidase. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreductase eine Oxygenase. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreductase eine Haloperoxidase. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Oxidoreductase eine Peroxidase. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Peroxidase von einem Coprinos Stamm, einem Arthromyces Stamm oder einem Phanerochaete Stamm erhalten. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Peroxidase von einem Coprinus cinereus Stamm, z. B. Coprinus cinereus IFO 8371, einem Coprinus macrorhizus Stamm oder einem Arthromyces ramosus Stamm erhalten. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Catalase von einem Scytalidium Stamm, einem Aspergillus Stamm oder einem Humicola Stamm erhalten. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Catalase von einem Scytalidium thermophilum Stamm, z. B. Scytalidium thermophilum CBS 117.65, einem Aspergillus niger Stamm oder einem Humicola insolens Stamm erhalten.
Das Hemoprotein kann nativ oder fremd zu der filamentösen Pilzzelle sein.
Die Kontrollsequenzen und/oder die Nukleinsäuresequenzen können durch Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, in die filamentöse Pilzzelle eingeführt werden. Zum Beispiel können die Sequenzen durch homologe oder nicht-homologe Rekombination in das Wirtsgenom eingeführt werden, wobei eine oder mehrere Kopien der Sequenzen in eine einzelne Zielsequenz und/oder mehrere Zielsequenzen integriert werden. Alternativ können die Sequenzen eingeführt werden und als nicht-integrierter Expressionsvektor behalten werden, z. B. ein selbst-replizierendes extrachromosomales Plasmid. Eine Standardvorgehensweise im Stand der Technik zum Einführen einer Nukleinsäuresequenz in eine filamentöse Pilzzelle schließt eine Protoplast-Bildung, eine Transformation der Protoplasten und eine Regeneration der Zellwand der transformierten Protoplasten in einer Weise ein, die im Stand der Technik per se bekannt ist (siehe EP 238 023 und Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156). Die Zelle wird vorzugsweise mit einem integrativen Vektor transformiert, welcher ein Nukleinsäurekonstrukt umfasst, welches die Kontrollsequenzen und/oder Nukleinsäuresequenzen, welche die Hem-biosynthetischen Enzyme kodieren, enthält, wobei das Konstrukt gewöhnlicherweise in das Wirtsgenom der filamentösen Pilzzelle, bevorzugt in das/die Chromosom(en), integriert wird. Der Begriff "Nukleinsäurekonstrukt" wird hierin mit der Bedeutung eines Nukleinsäuremoleküls, entweder einzel- oder doppelsträngig, definiert, welches aus einem natürlicherweise vorkommenden Gen isoliert wird, oder welches modifiziert worden ist, um Segmente von Nukleinsäuren zu enthalten, welche kombiniert und nebeneinander gestellt werden, in einer Weise, die anderenfalls in der Natur nicht existieren würde.
Die filamentösen Pilzzellen der vorliegenden Erfindung werden in einem Nährmedium kultiviert, das für die Herstellung des Hemoproteins und der Hem-biosynthetischen Enzyme geeignet ist, unter Verwenden von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel, können die Zellen durch Schüttelflaschen-Kultivierung, Fermentation in kleinem Maßstab oder in großem Maßstab (einschließlich kontinuierlicher, „batch", „fed-batch" oder Festzustand-Fermentationen) in einem Labor oder industriellen Fermentatoren kultiviert werden, durchgeführt in einem geeignetem Medium und unter Bedingungen, die es erlauben, dass das Hemoprotein exprimiert und/oder isoliert wird. Die Kultivierung findet in einem geeigneten Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, statt, unter Verwenden von im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen (siehe, z. B. Bennett, J. W. und LaSure, L., Hrgs., More Gene Manipulation in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Geeignete Medien sind von herkömmlichen Anbietern erhältlich oder können unter Verwenden von publizierten Zusammensetzungen (z. B. in Katalogen der "American Type Culture Collection") zubereitet werden. Wenn das Hemoprotein in das Nährmedium sekretiert wird, kann das Hemoprotein direkt aus dem Medium gewonnen werden. Das Signalpeptid, welches die Region für die Sekretion der Region des Hemoproteins in der filamentösen Pilz-Wirtszelle kodiert, kann z. B. aus dem Aspergillus oryzae TAKA Amylase-Gen, Aspergillus niger neutrale Amyla se-Gen, dem Rhizomucor miehei Aspartatproteinase-Gen, dem Humicola lanuginosa Cellulase-Gen oder Rhizomucor miehei Lipase-Gen erhalten werden. Wenn das Hemoprotein nicht sekretiert wird, wird es aus den Zelllysaten gewonnen.
Das resultierende Hemoprotein kann durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden. Zum Beispiel, kann das Hemoprotein aus dem Nährmedium durch herkömmliche Vorgehensweisen gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Zentrifugation, Filtration, Extration, Spray-Trocknen, Evaporation oder Präzipitation. Das gewonnene Protein kann dann durch eine Vielzahl chromotographischer Vorgehensweisen, z. B. Ionaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen weiter aufgereinigt werden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hemoprotein in höheren Mengen in einer filamentösen Pilzzelle hergestellt, indem eine oder mehrere ersten Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines Hem-biosynthetischen Enzyms, welches durch die endogen in der filamentösen Pilzzelle vorliegende ersten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zu richten, wobei die eine oder mehreren ersten Kontrollsequenzen funktionsfähig mit der ersten Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Die erste Nukleinsäuresequenz kann jede beliebige filamentöse Pilz-Nukleinsäuresequenz sein, die ein Hem-biosynthetisches Enzym kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer 5-Aminolevulinsäuresynthase, einer Porphobilinogensynthase, einer Porphobilinogendeaminase, einer Uroporphyrinogensynthase, einer Uroporphyrinogendecarboxylase, einer Coproporphyrinogenoxidase, einer Protoporphyrinogenoxidase und einer Ferrochelatase, wobei die erste Nukleinsäuresequenz endogen in der filamentösen Pilz-Wirtszelle vorliegt. Der Begriff "endogen" wird hierin definiert als ursprünglich aus der filamentösen Pilz-Wirtszelle stammend.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" bedeutet hierin, dass alle Komponenten eingeschlossen werden, die notwendig oder vorteilhaft für die Expression der kodierenden Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz sind. Die Kontrollsequenzen können nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, sein, können aus anderen Quellen erhalten werden oder können eine Kombination von nativen und fremden Kontrollsequenzen sein. Die fremden Kontrollsequenzen können die natürlichen Kontrollsequenzen leicht ersetzen oder zu ihnen hinzugefügt werden, um eine verstärkte Herstellung des gewünschten Hem-biosynthetischen Enzyms, in Bezug zu der natürlichen Kontrollsequenz, welche normalerweise mit der kodierenden Sequenz assoziiert ist, zu erhalten. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator. Für die Expression unter der Steuerung der Kontrollsequenzen wird die erste Nukleinsäuresequenz, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, funktionsfähig mit den Kontrollsequenzen verknüpft, in einer Weise, dass die Expression der kodierenden Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontollsequenzen kompatibel sind. Der Begriff "kodierende Sequenz (Kodierungssequenz)" wie hierin definiert, stellt eine Sequenz dar, die in mRNA transkribiert wird und in ein Hem-biosynthetisches Enzym translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle der oben erwähnten Kontrollsequenzen gestellt wird. Die Begrenzungen der kodierenden Sequenz werden durch ein Translations-Start-Codon an dem 5'-Terminus und einem Translations-Stop-Codon an dem 3'-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann einschließen, ist jedoch nicht hierauf beschränkt, DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen.
Die erste Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz sein, eine Nukleinsäuresequenz, welche durch den filamentösen Pilz-Wirt für die Expression der ersten Nukleinsäuresequenz erkannt wird. Die Promotor-Sequenz enthält Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen, welche die Expression des Hem-biosynthetischen Enzyms vermitteln. Der Promotor kann jede beliebige Promotorsequenz sein, die Transkriptionsaktivität in der gewählten Wirtszelle aufweist und kann aus Genen erhalten werden, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Beispiele von geeigneten Promotoren zum Richten der Transkription der ersten Nukleinsäuresequenz in einem filamentösen Pilz-Wirt sind Promotoren, die aus den Genen erhalten werden, die für die Aspergillus oryzae TAKA-Amylase, die Rhizomucor miehei Aspartatproteinase, die Aspergillus niger neutrale α-Amylase, die Aspergillus niger oder die Aspergillus awamori Glucoamylase (glaA), die Rhizomucor miehei Lipase, die Aspergillus oryzae alkaline Protease, die Aspergillus oryzae Triosephosphat-Isomerase, die Aspergillus nidulans Acetamidase und Hybride hiervon. Besonders bevorzugte Promotoren sind die TAKA-Amylase, das NA2-tpi (ein Hybrid der Promotoren aus den Genen, welche die Aspergillus niger neutrale α-Amylase und die Aspergillus oryzae Triosephosphatisomerase kodieren) und glaA Promotoren.
Die erste Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Transkriptions-Terminatorsequenz sein, eine Sequenz, welche durch den filamentösen Pilz-Wirt als Termination der Transkription erkannt wird. Die Terminatorsequenz wird funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, verknüpft. Die Terminatorsequenz kann nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, sein oder kann aus anderen Quellen erhalten werden, d. h. eine fremde Terminatorsequenz. Jeder beliebige Terminator, welcher in der gewählten filamentösen Pilz-Wirtszelle funktionell ist, ist geeignet, um in der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, besonders bevorzugte Terminatoren jedoch werden aus den Genen erhalten, welche die Aspergillus oryzae TAKA-Amylase, die Aspergillus niger Glucoamylase, die Aspergillus nidulans Anthranilatsynthase und die Aspergillus niger alpha-Glucosidase kodieren.
Die erste Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Leadersequenz, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, welche für die Translation durch den fi lamentösen Pilz-Wirt wichtig ist, sein. Die Leadersequenz wird funktionsfähig mit dem 5'-Terminus der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, verknüpft. Die Leadersequenz kann nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz sein oder kann aus anderen Quellen erhalten werden, d. h. eine fremde Leadersequenz. Jede beliebige Leadersequenz, die in der gewählten filamentösen Pilz-Wirtszelle funktionell ist, ist geeignet, in der vorliegenden Erfindung verwendbar zu sein, besonders bevorzugte Leader werden jedoch aus den Genen erhalten, welche die Aspergillus oryzae TAKA-Amylase und die Aspergillus oryzae Triosephosphatisomerase kodieren.
Die erste Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Polyadenylierungssequenz sein, eine Sequenz, welche funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der ersten Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, und welche, wenn sie transkribiert wird, von dem filamentösen Pilz-Wirt erkannt wird, um der transkribierten mRNA Polyadenosin-Reste hinzuzufügen. Die Polyadenylierungssequenz kann nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, sein oder kann aus anderen Quellen erhalten werden, d. h. eine fremde Polyadenylierungssequenz. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, die in dem gewählten Pilz-Wirt funktionell ist, ist geeignet, in der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, besonders bevorzugte Polyadenylierungssequenzen werden jedoch von den Genen erhalten, welche die Aspergillus oryzae TAKA-Amylase, die Aspergillus niger Glucoamylase, die Aspergillus nidulans Anthranilatsynthase und die Aspergillus niger alpha-Glucosidase kodieren.
Die erste Kontrollsequenz kann ebenfalls eine ein Signalpeptid kodierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Amino-Terminus des Hem-biosynthetischen Enzyms verknüpft ist, und die Lokalisation des Hem-biosynthetischen Enzyms in einzelne Zellkompartimente erlaubt. Die Signalpeptid-kodierende Region kann nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, sein oder kann aus fremden Quellen erhalten werden. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz kann inhärent eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, die natürlicherweise in dem Translations-Leserahmen mit dem Segment der kodierenden Region verknüpft ist, welche das lokalisierte Hem-biosynthetische Enzym kodiert. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz Nukleinsäuren enthalten, welche eine Signalpeptid-kodierende Region enthält, die fremd zu dem Anteil der kodierenden Sequenz ist, welche das lokalisierte Hem-biosynthetische Enzym kodiert. Die Signalpeptid-kodierende Region kann von einem Neurospora crassa ATPase-Gen (Viebrock et al., 1982, EMBO Journal 1: 565–571) oder von einem Saccharomyces cerevisiae Cytochrom-c-Peroxidase-Gen (Kaput et al., 1982, Journal of Biological Chemistry 257: 15054–15058) erhalten werden. Es kann jedoch jede beliebige Signalpeptid-kodierende Region in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welche in der Lage ist, die Lokalisierung des Hem-biosynthetischen Enzyms in einem gewählten filamentösen Pilz-Wirt zu ermöglichen.
Die erste Kontrollsequenz kann eine ebenfalls eine Propeptid-kodierende Region sein, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die an dem Amino-Terminus eines reifen biochemisch aktiven Polypeptids positioniert ist. Das resultierende Polypeptid ist als ein Proenzym oder ein Propolypeptid (oder in einigen Fällen ein Zymogen) bekannt. Proenzyme sind im Allgemeinen inaktiv und können durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids von dem Proenzym in reife, aktive Polypeptide umgewandelt werden. Ein biochemisch aktives Polypeptid wird hierin als ein Hem-biosynthetisches Enzym definiert, welches in einer aktiven Form hergestellt wird, welche die biochemische Aktivität seines natürlichen Gegenstücks durchführt. Die Propeptid-Sequenz kann nativ zu der ersten Nukleinsäuresequenz, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodiert, sein oder kann aus anderen Quellen erhalten werden, d. h. eine fremde Propeptid-Sequenz. Die Nukleinsäuresequenz, die ein Propeptid kodiert, kann aus den Genen erhalten werden, welche den Saccharomyces cerevisiae Alpha-Faktor und die Myceliophthora thermophilum Laccase kodieren.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hemoprotein in höheren Mengen in einer filamentösen Pilzzelle hergestellt, indem in die filamentöse Pilzzelle eine oder mehrere Kopien einer oder mehrerer zweiter Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden, welche ein Hem-biosynthetisches Enzym kodieren. Die zweite Nukleinsäuresequenz kann jede beliebige Nukleinsäuresequenz sein, die ein Hem-biosynthetisches Enzym kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer 5'-Aminolevulinsäuresynthase, einer Porphobilinogensynthase, einer Porphobilinogendeaminase, einer Uroporphyrinogensynthase, einer Uroporphyrinogendecarboxylase, einer Coproporphinogenoxidase, einer Protoporphyrinogenoxidase und einer Ferrochelatase. Die zweiten Nukleinsäuresequenzen können von jeder beliebigen mikrobiellen Quelle erhalten werden. Die Wahl der Quelle der zweiten Nukleinsäuresequenz wird von der filamentösen Pilz-Wirtszelle abhängig sein, bevorzugte Quellen sind jedoch Pilz-Quellen, z. B. Hefen und filamentöse Pilze. Bevorzugte filamentöse Pilzzellquellen schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, Spezien von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliphthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma. Bevorzugte Hefequellen schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, Spezies von Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Yarrowia. Weiterhin können die zweiten Nukleinsäuresequenzen nativ zu der filamentösen Pilz-Wirtszelle sein. Die zweite Nukleinsäuresequenz kann eine oder mehrere der folgenden sein:

1. 5-Aminolevulinsäure-Synthase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Urban-Grimal et al., 1986, European Journal of Biochemistry 156: 511–59);
b. Aspergillus nidulans (Bradshaw et al., 1993, Current Genetics 23: 501–507);
c. Rhodobacter sphaeroides (Tai et al., 1988, Gene 70: 139–152);
d. Rhodobacter capsulatus (Hornberger et al., 1990, Molecular General Genetics 211: 371–378); und
e. Escherichia coli (Drolet et al., 1989, Molecular General Genetics 216: 347–352).
2. Porphobilinogen-Synthase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Myers et al., 1987, Journal of Biological Chemistry 262: 16822–16829);
b. Staphylococcus aureus (Kafala und Sasarman, 1994, Canadian Journal of Microbiology 40: 651–657);
c. Rhodobacter sphaeroides (Delaunay et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 2712–2715);
d. Escherichia coli (Echelard et al., 1988, Molecular General Genetics 214: 503–508); und
e. Bacillus subtilis (Hansson et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 2590–2599).
3. Porphobilinogen-Deaminase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Keng et al., 1992, Molecular General Genetics 234: 33–433);
b. Mensch (Yoo et al., 1993, Genomics 15: 221–29; Raich et al., 1986, Nucleic Acids Research 14: 5955–5968);
c. Escherichia coli (Thomas und Jordan, 1986, Nucleic Acids Research 14: 6215–6226); und
d. Bacillus subtilis (Petricek et al., 1990, Journal of Bacteriology 172: 2250–2258).
4. Uroporphyrinogen-III-Synthase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Amillet und Labbe-Bois, 1995, Yeast 11: 419–424);
b. Bacillus subtilis (Hansson et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 2590–2599); und
c. Escherichia coli (Jordan et al., 1987, Nucleic Acids Research. 15: 10583).
5. Uroporphyrinogen III-Decarboxylase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Garey et al., 1992, European Journal of Biochemistry 205: 1011–1016); und
b. Mensch (Romeo et al., 1986, Journal of Biological Chemistry 261: 9825–9831).
6. Coproporphyrinogen III-Oxidase-Gene:
a. Mensch (Martasek et al., 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 911: 3024–3028);
b. Escherichia coli (Troup et al., 1994, Journal of Bacteriology 176: 673–680); und
c. Saccharomyces cerevisiae (Zaagorec et al., 1986, Journal of Biological Chemistry 263: 9718–9724).
7. Protoporphyrinogen IX-Oxidase-Gene:
a. Mensch (Taketani et al., 1995, Genomics 29: 698–703);
b. Bacillus subtilis (Dailey et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 813–815); und
c. Escherichia coli (Sasarman et al., 1993, Canadian Journal of Microbiology 39: 155–161).
8. Ferrochelatase-Gene:
a. Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois, 1990, Journal of Biological Chemistry 265: 7278–72883);
b. Rind (Shibuya et al., 1995, Biochimica Biophysica Acta 1231: 117–120);
c. Bradyrhizobium japonicum (Frustaci und O'Brian, 1993, Applied Environmental Microbiology 59: 347–2351);
d. Escherichia coli (Frustaci und O'Brian, 1993, Journal of Bacteriology 175: 2154–2156); und
e. Bacillus subtilis (Hansson und Hederstedt, 1992, Journal of Bacteriology 174: 8081–88093).

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die zweiten Nukleinsäuresequenzen von einer Spezies von Aspergillus erhalten. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform werden die zweiten Nukleinsäuresequenzen von Aspergillus ficuum, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae erhalten. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform werden die zweiten Nukleinsäuresequenzen von einer Spezies von Saccharomyces erhalten. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform werden die zweiten Nukleinsäuresequenzen von Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis erhalten.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die zweite Nukleinsäuresequenz, welche eine 5-Aminolevulinsäuresynthase kodiert, von dem Aspergillus oryzae Stamm A1560 (IFO 4177) erhalten, z. B. die in SEQ ID NO: 1 ausgewiese Nukleinsäuresequenz. Die zweite Nukleinsäuresequenz, die eine 5-Aminolevulinsäuresynthase kodiert, kann ebenfalls eine Nukleinsäuresequenz darstellen, die für die 5-Aminolevulinsäuresynthase mit der in SEQ ID NO: 2 ausgewiesenen Aminosäuresequenz kodiert, welche sich von der SEQ ID NO: 1 durch die Degeneration des genetischen Codes unterscheidet. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die zweite Nukleinsäuresequenz, welche eine Porphobilinogensynthase kodiert, von dem Aspergillus oryzae Stamm A1560 (IFO 4177) erhalten, z. B. die in SEQ ID NO: 3 ausgewiesene Nukleinsäuresequenz. Die zweite Nukleinsäuresequenz, die eine Porphobilinogensynthase kodiert, kann ferner eine Nukleinsäuresequenz sein, die für die Porphobilinogensynthase kodiert, welche die in SEQ ID NO: 4 ausgewiesene Aminosäuresequenz besitzt, welche sich von der SEQ ID NO: 3 durch die Degeneration des genetischen Codes unterscheidet. Die zweiten Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen ferner sowohl die in SEQ ID NO: 1 als auch SEQ ID NO: 3 angezeigten genomischen Sequenzen als auch die korrespondierenden cDNA- und RNA-Sequenzen. Der Ausdruck "Nukleinsäuresequenzen", wie hierin verwendet, ist so zu verstehen, dass sämtliche solcher Variationen umfasst sind, einschließlich synthetischer DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zweite Nukleinsäuresequenz, funktionsfähig verknüpft mit einer oder mehreren zweiten Kontrollsequenzen, in den filamentösen Pilz-Wirt eingeführt. Die zweiten Kontrollsequenzen können nativ zu den zweiten Nukleinsäuresequenzen, welche das Hem-biosynthetische Enzym kodieren, sein oder können teilweise oder insgesamt von fremden Quellen erhalten werden. Die fremden Kontrollsequenzen können die natürlichen Kontrollsequenzen einfach ersetzen, um eine verstärkte Herstellung des gewünschten Hem-biosynthetischen Enzyms in Bezug zu der natürlichen Kontrollsequenz, welche natürlicherweise mit der kodierenden Sequenz assoziiert ist, zu erhalten. Die zweiten Kontrollsequenzen können jede beliebige der Kontrollsequenzen sein, die oben im Zusammenhang mit der ersten Kontrollsequenz aufgeführt wurden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere Kopien der einen oder mehreren ersten Kontrollsequenzen und eine oder mehrere Kopien der einen oder mehreren zweiten Nukleinsäuresequenzen in die filamentöse Pilzzelle eingeführt werden. Bevorzugt sind die zweiten Nukleinsäuresequenzen funktionsfähig mit einer oder mehreren zweiten Kontrollsequenzen verknüpft.
Die ersten Kontrollsequenzen, die zweiten Nukleinsäuresequenzen und/oder die zweiten Kontrollsequenzen können in demselben Nukleinsäurekonstrukt enthalten sein oder sie können in verschiedenen Nukleinsäurekonstrukten enthalten sein. Jedes Nukleinsäurekonstrukt kann Integrationselemente zum Richten der Integration durch homologe Rekombination in das Genom des Pilz-Wirtes an eine präzise Stelle umfassen. Um die höchste Wahrscheinlichkeit der Integration an einer präzisen Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente bevorzugt eine ausrei chende Anzahl Nukleinsäuren enthalten, wie 100 bis 1500 Basenpaare, bevorzugt 400 bis 1500 Basenpaare und am stärksten bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare, welche hochgradig homolog mit der entsprechenden Zielsequenz sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können jede beliebige Sequenz aufweisen, die homolog zu der Zielsequenz in dem Genom der filamentösen Pilz-Wirtszelle ist. Weiterhin können die Integrationselemente nicht-kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen sein. Auf der anderen Seiten kann jedes Nukleinsäurekonstrukt in das Genom der filamentösen Pilz-Wirtszelle durch nicht-homologe Rekombination integriert werden.
Die Nukleinsäurekonstrukte können in einen geeigneten Vektor inseriert werden oder die zweiten Nukleinsäuresequenzen können direkt in einen Vektor inseriert werden, der bereits die Kontrollsequenzen enthält, unter Verwenden von molekularbiologischen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Vektoren können jeder beliebige Vektor sein, der geeigneterweise rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterworfen werden kann, und der die Expression einer Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung bewirken kann. Die Wahl eines Vektors wird typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der filamentösen Pilzzelle, in welche der Vektor einzuführen ist, abhängen. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation erfolgt, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die filamentöse Pilzzelle eingeführt wird, in das Genom integriert wird und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches/e er integriert worden ist, repliziert wird. Das Vektorsystem kann aus einem einzelnen Vektor oder Plasmid oder zwei oder mehreren Vektoren oder Plasmiden bestehen, die zusammen die Gesamt-DNA enthalten, die in das Genom des filamentösen Pilz-Wirtes einzuführen ist.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, welche eine einfache Selektion der transformierten Zellen erlaubt/erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt eine Biocid- oder virale Resistenz, eine Resistenz gegenüber Schwermetallen, Phototrophie oder Auxotrophie und dergleichen bereitstellt. Der selektierbare Marker kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus, jedoch nicht hierauf beschränkt, amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC, bar und hygB. Bevorzugt für die Verwendung in einer Aspergillus Zelle sind die amdS- und pyrG-Marker von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und der bar-Marker von Streptomyces hygroscopicus. Weiterhin kann die Selektion durch Co-Transformation vorgenommen werden, z. B. wie in WO 91/17243 beschrieben, wo der selektierbare Marker in einem separaten Vektor enthalten ist.
Die Vorgehensweisen, die verwendet werden, um die Nukleinsäurekonstrukte, den Promotor, den Terminator und andere Elemente zu ligieren und diese in geeignete Vektoren einzufügen, welche die für die Replikation erforderliche Information enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen das Einführen einer oder mehrerer Kopie(n) von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenz(en), welche das Hemoprotein in der filamentösen Pilzzelle kodieren. Die Nukleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert, wird vor Schritt (b) eingeführt. Die Nukleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert, kann in demselben Vektor wie die ersten Kontrollsequenzen, die zweiten Nukleinsäuresequenzen und die zweiten Kontrollsequenzen enthalten sein oder sie können in verschiedenen Vektoren enthalten sein. Bevorzugt sind die Nukleinsäuresequenzen, welche die Hemoproteine kodieren, funktionsfähig mit dritten Kontrollsequenzen verknüpft. Die oben ausgeführten Kontrollsequenzen in Verbindung mit den ersten Kontrollsequenzen sind ebenfalls als dritte Kontrollsequenzen anwendbar.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ferner das Einführen einer Quelle von Hem, Analoga hiervon oder einem oder mehreren Signalweg-Zwischenprodukten („pathway intermediates") in das Nährmedium umfassen. Siehe "Product Brochure of Porphyrin Products Inc. (Logan, UT)", um die Hem-Analoga und Signalweg-Zwischenprodukte aufzulisten. Zum Beispiel kann/können, wenn eine Nukleinsäuresequenz, die eines der Enzyme des Hem-Biosynthesewegs kodiert, in eine filamentöse Pilzzelle eingeführt wird, ein oder mehrere Signalweg-Zwischenprodukte in einem oder mehreren vorangehenden Schritten, geschwindigkeitslimitierend sein. In solch einem Fall kann man das Kulturmedium mit diesen einen oder mehreren Signalweg-Zwischenprodukten ergänzen. Um diese Signalweg-Zwischenprodukte in die Zelle einzuführen, kann man ein Enzym verwenden, welches in der Lage ist, die Zellmembran zu semipermeabilisieren, z. B. NOVOZYM 234^TM (Novo Nordisk A/S).
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ferner das Einführen einer Eisenquelle in das Nährmedium umfassen. Alternativ umfassen die Verfahren ferner das Einführen eines beliebigen Metallions, das die Porphyrin-Synthese induzieren kann. Siehe z. B. Mamet et al., 1996, BioMetals, 9: 73–77.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante filamentöse Pilzzellen, welche eine oder mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die ein Hemoprotein kodieren, eine oder mehrere erste Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines Hem-biosynthetischen Enzyms, das durch eine erste Nukleinsäuresequenz endogen in der filamentösen Pilzzelle kodiert wird, zu richten (steuern) und/oder eine oder mehrere Kopien von einer oder mehreren zweiten Nukleinsäuresequenzen, welche ein Hem-biosynthetisches Enzym kodieren, umfassen. Die Sequenzen können in das Genom der Pilzzelle integiert werden, oder sie können in einem selbst-replizierendem extrachromosomalem Vektor enthalten sein.
Die filamentösen Pilzzellen der vorliegenden Erfindung umfassen eine oder mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz, die ein Hemoprotein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert, funktionsfähig mit dritten Kontrollsequenzen verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression des Hemoproteins in der filamentösen Pilzzelle zu richten, wobei die Nukleinsäuresequenz, die das Hemoprotein kodiert, in das Genom der Pilzzelle integriert wird oder in einem selbst-replizierendem extrachromosomalem Vektor enthalten ist.
Die Wahl der filamentösen Pilz-Wirtszelle wird in großem Ausmaß von der Quelle der Kontrollsequenzen, der Nukleinsäuresequenzen, die die Hem-biosynthetischen Enzyme kodieren, und des Hemoproteins abhängig sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Zelle einer Spezies von, jedoch nicht hierauf beschränkt, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliphthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Aspergillus Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Acremonium Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Fusarium Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Humicola Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Myceliophthora Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Mucor Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Neurospora Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Penicillium Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Thielavia Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Tolypocladium Zelle. In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Trichoderma Zelle. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Aspergillus ficuum Zelle, eine Aspergillus foetidus Zelle, eine Aspergillus japonicus Zelle, eine Aspergillus niger Zelle, eine Aspergillus nidulans Zelle oder eine Aspergillus oryzae Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Fusarium oxysporum Zelle oder eine Fusarium graminearum Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Humicol insolens Zelle oder eine Humicola lanuginosus Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Myceliophthora thermophilum Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Mucor miehei Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Neurospora crassa Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Penicillium purpurogenum Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Thielavia terrestris Zelle. In einer anderen am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilz-Wirtszelle eine Trichoderma harzianum Zelle, eine Trichoderma koningii Zelle, eine Trichoderma longibrachiatum Zelle, eine Trichoderma reesei Zelle oder eine Trichoderma viride Zelle.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht dazu gedacht sind, den Gegenstand der Erfindung zu begrenzen.
Beispiele
Beispiel 1: Extraktion genomischer DNA aus dem Aspergillus oryzae Stamm A1560
Der Aspergillus oryzae Stamm A1560 (IFO 4177) wurde in 25 ml 0,5% Hefeextrakt – 2% Glucose (YEG)-Medium für 24 Stunden bei 32°C und 250 rpm wach sen gelassen. Die Mycelia wurden dann mittels Filtration durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) gesammelt und einmal mit 25 ml 10 mM Tris-1 mM EDTA (TE)-Puffer gewaschen. Der Überschuss an Puffer wurde von den Mycelia abgegossen, welche nachfolgend in flüssigem Stickstoff gefroren wurden. Die gefrorenen Mycelia wurden in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver zerrieben und das Pulver wurde zu 20 ml TE-Puffer und 5 ml 20 Gew.-% Natriumdodecylsulfat (Sodiumdodecylsulfat, SDS) in einem Einweg-Plastikzentrifugationsröhrchen hinzugefügt. Die Mischung wurde mehrere Male vorsichtig umgedreht, um ein Vermischen sicherzustellen, und zweimal mit gleichem Volumen an Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1 V/V/V) extrahiert. Es wurde Natriumacetat (3 M Lösung) bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol, um die Nukleinsäuren zu präzipitieren. Die Nukleinsäuren wurden dann durch Zentrifugation des Röhrchens bei 15.000 × g für 30 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde 30 Minuten luftgetrocknet, bevor die Resuspension in 0,5 ml TE-Puffer erfolgte. Es wurde DNase-freie Ribonuklease A bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Es wurde dann Proteinase K bei einer Konzentration von 200 μg/ml hinzugefügt und die Mischung wurde eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde die Mischung zweimal mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1 V/V/V) extrahiert, bevor die DNA mit Natriumacetat und Ethanol wie vorher beschrieben präzipitiert wurde. Das DNA-Pellet wurde unter Vakuum getrocknet, in TE-Puffer resuspendiert und bei 4°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids pSE04
Es wurde genomische DNA von dem Aspergillus nidulans Stamm A26 (Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, KS), unter Verwenden der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Das Plasmid pSE04 wurde durch Ligation von PCR-Fragmenten aus einer Amplifizierungsreaktion, die As pergillus nidulans A 26 genomische DNA enthielt, konstruiert. Die Amplifizierungs-Reaktion enthielt die folgenden Komponenten: 50 ng Aspergillus nidulans A26 genomische DNA, 100 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 50 pmol der Primer ALAS3d 5'-TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC-3' (SEQ ID NO: 5) und ALAS4e 5'-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG-3' (SEQ ID NO: 6), 2 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer Corp., Branchburg, NJ), und 1 × Taq DNA Polymerasepuffer (Perkin Elmer Corp, Branchburg, NJ). Die Reaktionsmischung wurde in einem Perkin Elmer Thermal-Cycler (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ) inkubiert, programmiert für 30 Zyklen, jeder bei 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 90 Sekunden. Das 2 kB PCR-Produkt wurde nach einer Elektrophorese unter Verwenden eines 1,1%igen Agarosegels niedriger Schmelztemperatur (FMC, Rockland, ME) mit 40 mM Tris-Acetat – 1 mM Dinatrium EDTA (TAE)-Puffer durch Ausschneiden isoliert und in den pCRII-Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Angaben des Herstellers subkloniert, um pSE04 (1) herzustellen.
Beispiel 3: Aspergillus oryzae Stamm A1560 DNA-Bibliotheken und Identifikation von ALA-Synthase (hemA)-Klonen
Es wurden Aspergillus oryzae Stamm A1560 genomische DNA-Bibliotheken konstruiert unter Verwenden des bakteriophagen Klonierungsvektors λZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Instruktionen des Herstellers unter Verwenden von E. coli Y1090ZL Zellen als Wirt zum Plattieren und zur Aufreinigung des rekombinanten Bakteriophagen und E. coli DH10Bzip zum Ausschneiden einzelner pZL1-hemA-Klone. Die gesamte Zell-DNA, wie in Beispiel 1 zubereitet, wurde teilweise mit Tsp509I verdaut und in einem 1%igen Agarosegel mit 50 mM Tris-50 – 50 mM Borat – 1mM Di-natrium-EDTA (TBE)-Puffer größenfraktioniert. Die DNA-Fragmente, welche in den Größenbereich 4 bis 7 kB wanderten, wurden unter Verwenden von „Prep-a-Gene"-Reagenzien (BioRad Laboratories, Hercules, CA) aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente wurden mit EcoRI-geschnittenen und dephosphorylierten λZipLox-Vektorarmen ligiert und die Ligationsmischungen wurden unter Verwenden von herkömmlichen Verpackungsextrakten („packaging extracts") (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt („packaged"). Die verpackten DNA-Bibliotheken wurden in E. coli Y1090ZL-Zellen amplifiziert. Die nicht-amplifizierte genomische Bibliothek enthielt 1 × 10⁶ pfu/ml.
Bakteriophagen-DNA von 7 × 10⁴ Plaques wurde auf doppelte kreisförmige ("duplicate circular") Nytran-Plus-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) transferiert und mit einer Digoxigenin (DIG)-markierten Probe, welche mittels PCR-Amplifikation aus genomischer DNA von Aspergillus nidulans hemA von dem Plasmid pSE04, beschrieben in Beispiel 2, zubereitet wurde, sondiert ("probed"). Die Amplifikationsreaktion enthielt die folgenden Komponenten: 1 × DIG-Sondierungsynthesemischung (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 100 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 pmol des Primers ALAS3d und des Primers ALAS4e, beschrieben in Beispiel 2, 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 1 × Taq DNA-Polymerasepuffer. Die Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Thermal-Cycler, programmiert für 30 Zyklen, jeder bei 95°C für 1 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten, inkubiert. Die denaturierte Probe wurde zu dem Hybridisierungspuffer bei einer Konzentration von 2 ng/ml hinzugefügt und über Nacht mit prähybridisierten Membranen inkubiert. Die Prähybridisierung und die Hybridisierung wurde bei 42°C in 5 × SSC, 0,1-%igem Sarkosyl, 0,02-%igem SDS, 1-%igem Genius Blocking Agent (Blockiermittel) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 30-%igem Formamid durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal in 5 × SSC-0,1-%igem SDS gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen in 2 × SSC-0,1%-igem SDS. Jede Waschung wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die gewaschene Membran wurde mit einem Kodak X-OMAT-AR-Film für ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur belichtet gefolgt von der Entwicklung unter Verwenden eines Konika QX-70 automatischen Filmprozessor gemäß den Instruktionen des Herstellers. Die Anfangs-Plaques wurden ein zweites Mal aufgereinigt und durchsucht. Fünf Klone wurden identifiziert und in pZL-Derivate ausgeschnitten gemäß den Instruktionen des Herstellers (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Die pZL-Derivate wurden als E. coli DH5αpSE11, pSE13, pSE15, pSE17 und pSE20 bezeichnet. Für diese Klone wurde festgestellt, dass sie überlappen und eine 4,2 kB-Region überspannen, für welche die Restriktionskarte in 2 gezeigt ist.
Beispiel 4: Southern Hybridisierung von genomischer DNA des Aspergillus oryzae Stamms A1560 mit einer 5-Aminolevulinsäure-Synthase (hemA)-Sonde
Genomische DNA (10 μg) von dem Aspergillus oryzae Stamm A1560, zubereitet wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde entweder mit BamHI oder EcoRI verdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem 1-%igen Agarose-TBE-Gel aufgetrennt. Die DNA wurde auf eine Nytran-Plus-Membran in 0,4 N NaOH unter Verwenden einer TurboBlot-Apparatur (Schleicher & Schuell, Keene, NH) gemäß den Instruktionen des Herstellers transferiert. Die Membran wurde für 2 Stunden bei 42°C in 5 × SSC, 0,1%-igem Sarkosyl, 0,02%-igem SDS, 1%-igem Genius Blocking Agent (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 50%-igem Formamid in einem Hybaid-Ofen (Labnet, Woodbridge, NJ) prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde mit einer DIG-markierten hemA-Sonde ausgeführt, die durch eine PCR-Amplifikation erzeugt wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der Ausnahme, dass der hemA-Klon pSE17 als Template verwendet wurde mit dem Primer hemA5' 5'-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 7) und dem Primer hemA3' 5'-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3' (SEQ ID NO: 8). Die DIG-markierte hemA-Sonde (1 ng Sonde/ml Lösung) wurde zu frischem Hybridisierungspuffer hinzugefügt und mit der Membran über Nacht bei 42°C inkubiert. Nachfolgend wurde die Membran zweimal für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur in 5 × SSC-0,1%-igem SDS gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen unter den selben Bedingungen in 2 × SSC-0,1%-igem SDS. Die gewaschenen Membranen wurden für ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Kodak X-OMAT-AR-Film belichtet, gefolgt von der Entwicklung un ter Verwenden eines Konika QX-70 automatischen Filmprozessors gemäß den Instruktionen des Herstellers.
Die Southern Blot-Hybridisierung von genomischer DNA von Aspergillus oryzae mit der Aspergillus oryzae hemA-Sonde zeigte die Anwesenheit von Hybridisierungssignalen, die konsistent mit der Kopieanzahl eines einzelnen Gens war. Eine 1,7 kB-Bande, die in der BamHI-Spur beobachtet wurde, wurde anhand der Restriktionskarte (2) vorausberechnet.
Beispiel 5: Charakterisierung des Aspergillus oryzae A1560 5-Aminolevulinsäure-Synthase (hemA)-Gens
E. coli DH5α pSE17, beschrieben in Beispiel 3 wurde einer DNA-Sequenzierung gemäß der folgenden Vorgehensweise unterzogen. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem „Applied Biosystems Model 373A" automatisiertem DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) an beiden Strängen durchgeführt unter Verwenden der Primerwanderungs-Technik mit Farbstoff-Terminator-Chemie (Giesekce et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47–60) unter Verwenden des M13-Reverse (–48) und des M13-Forward (–20)-Primers (New England Biolabs, Beverly, MA) und Primern, die einzigartig zu der sequenzierten DNA waren.
Die Nukleotidsequenz des klonierten Gens ergab einen offenen Leserahmen von 1911 Nukleotiden, wie in 3 (SEQ ID NO: 1) gezeigt. Die kodierende Sequenz enthielt keine Introns, was durch cDNA-Klonierung und Sequenzanalyse bestätigt wurde, was im Gegensatz zu dem Aspergillus nidulans hemA-Gen steht, welches ein Intron an seinem 5'-Ende enthält (Bradshaw et al., 1993, Current Genetics 23: 501–507). Die 5' nicht-translatierte Sequenz enthält einige Pyrimidinreiche und AT-reiche Regionen, wie in anderen Pilzgenen (Gurr et al., 1987, In Kinghorn, J. R. (Hrsg.), Gene Structure in Eukaryotic Microbes, S. 93–139, IRL Press, Oxford), eine CCAAT-Sequenz an Position –249 und eine putative TATA- Box, lokalisiert an der Position –35. Die CCAAT-Sequenz ist eine Konsensus-Bindungsstelle für Transkriptionsregulatoren, welche die Transkription in Antwort auf Sauerstoff modulieren, wie der Hap2/3/4-Transkriptionsregulationskomplex in Hefe und Menschen (Olesen and Guarente, 1990, Molecular and Cellular Biology 12: 2302–2314). Dieser regulatorische Komplex ist ebenfalls in Säugetieren konserviert und eine CCAAT-Bindungsaktivität wurde bei Aspergillus nidulans identifiziert (Davis et al., 1993, Genetica 90: 133–145). Die Bedeutung dieser Sequenz in dem Aspergillus oryzae hemA-Gen ist nicht bekannt und wurde aufgrund der begrenzten Sequenzinformationen in der Aspergillus nidulans hemA 5'-Region nicht bestätigt (Bradshaw et al., 1993, supra). Die Transkriptionsregulation des Aspergillus oryzae hemA-Gens in Antwort auf Sauerstoff ist gegenwärtig nicht bekannt, jedoch scheint das Aspergillus nidulans hemA-Gen sogar unter Bedingungen der Sauerstoffbeschränkung nicht transkriptionell reguliert zu werden (Bradshaw et al., 1993, supra). Interessanterweise wird das HEM1-Gen aus der Hefe ebenfalls konstitutiv exprimiert, jedoch wird seine Expression durch ein Gleichgewicht zwischen positiven und negativen Regulationsstellen gesteuert (Keng and Guarente, 1987, Proceedings of the National academy of Sciences USA 84: 9113–9117). Ein (AC)₃₅-Wiederholungsmotiv tritt in der 3'-nicht-translatierten Region auf. Ähnliche Wiederholungen sind ebenfalls in subtelomeren, Intron- und Promotor-Regionen von Säugetier- und Hefegenen beobachtet worden und haben keine Funktion, obwohl sie mit Gen-Amplifikationsvorgängen in Verbindung gebracht wurden (Passananti et al., 1987, EMBO Journal 6: 1697–1703).
Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Aspergillus oryzae Stamms A1560 Gen-Produkts wird in 3 (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Die Nukleotidsequenz kodiert ein vorausberechnetes Protein von 636 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 68 kDa. Sofern dieses Enzym in den Mitochondrien lokalisiert ist, wird für den N-Terminus vorausgesagt, dass er eine mitochondriale Leader-Sequenz enthält. In der Tat sind die ersten 35 Aminosäuren reich an Serin-, Threonin-, Lysin- und Argininresten, was konsistent mit der Funktion als mitochondrialer Leader ist.
Ein potenzielles Hem-regulatorisches Motiv (HRM) tritt in den vermuteten mitochondrialen Leader-Sequenzen sowohl von Aspergillus nidulans als auch Aspergillus oryzae hemA-Sequenzen (4) auf. Für HRMs, die bei den Leader-Sequenzen lokalisiert sind, wird angenommen, dass sie den Import von 5'-Aminolevulinsäuresynthase-Proteinen in die Mitochondrien von Mäusen über direkte Interaktionen mit Hem verhindern (Lathrop und Timko, 1993, Science 259: 522–525; Zhang and Guarente, 1995, EMBO Journal 14: 313–320). Ein zweites potenzielles HRM tritt ebenfalls am Anfang der Sequenz des putativ reifen Proteins auf. Es ist möglich, dass die HRMs eine Rolle in der Regulation der 5'-Aminolevulinsäuresynthaseaktivität spielen. Interessanterweise enthält die Saccharomyces cerevisiae 5'-Aminolevulinsäuresynthase-Proteinsequenz keine putativen HRMs und scheint kein Schlüssel-regulatorischer Schritt in der Hem-Biosynthese von Hefe zu sein (Labbe-Bois and Labbe, In Daley, Harry A., Hrsg., Biosynthesis of Heme and Chlorophylls, 1990, McGraw Hill Publishers, New York, S. 235–285).
Insgesamt besitzt die in 5 gezeigte abgeleite Aminosäuresequenz 81% Identität mit dem Aspergillus nidulans hemA-Gen (SEQ ID NO: 22), 57% Identität mit dem Saccharomyces cerevisiae HEM1-Gen (SEQ ID NO: 23; Urban-Grimal, 1986, European Journal of Biochemistry 156: 511–519) und 51% Identität mit dem humanen Erythrozyten-Gen hem1 (ALAS2) (SEQ ID NO: 24; Bishop, 1990, Nucleic Acids Research 18: 7187–7188), welche unter Verwenden des "Applied Biosystems GeneAssist Program" (blosum62.mat matrix) bestimmt wurden. Der höchste Konservationsgrad tritt jedoch in dem C-terminalen zwei Drittel des Proteins auf, welches die katalytische Domäne enthält. Weiterhin ist der Lysin- und der Glycin-Loop, die wichtig für die katalytische Aktivität und die Pyridoxalphosphatat Co-Faktor-Bindung in anderen 5'-Aminolevulinsäuresynthase-Enzymen sind (Ferreira et al., 1995, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27: 151–159; Ferreira, 1995, Protein Science 4: 1001–1006) ebenfalls hochkonserviert.
Beispiel 6: Konstruktion des Plasmids pSE31
Das Plasmid pSE31 wurde durch gerichtete Klonierung der PCR-amplifizierten Aspergillus oryzae hemA DNA in pBANe6 (6) konstruiert. Die PCR-Amplifizierungs-Reaktion wurde unter Verwenden von DNA des hemA-Klons E. coli DH5α pSE17, beschrieben in Beispiel 3, wobei die Reaktion die folgenden Komponenten enthielt: 50 ng pSE17, 2 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA), 1 × Vent DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs, Beverly, MA), 400 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 50 pmol des Primers hemA5' 5'-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 7) und Primer hemA3' 5'-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3' (SEQ ID NO: 8). Die Reaktionsmischung wurde in einem Perkin Elmer Thermal-Cycler, programmiert für 30 Zyklen, jeder bei 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 90 Sekunden, inkubiert. Der Primer hemA5' enthält eine SwaI-Stelle (unterstrichen) und der Primer hemA3' enthälte eine PacI-Stelle (unterstrichen), welche zur Klonierung in pBANe6, verdaut mit SwaI und PacI, verwendet wurden, um pSE31 (7) herzustellen.
Beispiel 7: Konstruktion des Aspergillus oryzae Stamms JRoC50.3.18A
Das Aspergillus oryzae Stamm JRoC50.3.18A-enthaltende Plasmid pJR0C50 wurde wie folgt konstruiert. Es wurden Coprinus cinereus IFO 8371 Peroxidase cDNA-Fragmente mittels PCR präpariert, unter Verwenden der unten gezeigten spezifischen Oligonukleotid-Primern (Saiki et al., 1988, Science 239: 487–491), konstruiert auf der Basis der Aminosäuresequenz der Coprinus macrorhizus Peroxidase (Baunsgaard et al., 1993, European Journal of Biochemistry 213: 605–611):

1. 5'-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3' (SEQ ID NO: 9)
2. 3'-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5' (SEQ ID NO: 10)
3. 5'-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3' (SEQ ID NO: 11)
4. 3'-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5' (SEQ ID NO: 12)
5. 5'-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3' (SEQ ID NO: 13)
6. 5'-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3' (SEQ ID NO: 14)
7. 3'-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5' (SEQ ID NO: 15)

Die PCR wurde unter Verwenden des "Gene Amp Kits" und Apparats (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Reaktion bei 28°C für die ersten 3 Zyklen durchgeführt wurde, um eine bessere Hybridisierung mit der Erststrang-cDNA (präpariert aus mRNA erhalten von dem Coprinus cinereus Stamm IFO 8371) zu erhalten, und nachfolgend bei 65°C für 30 PCR-Zyklen.
Die Primer wurden wie folgt kombiniert: 1 mit 2; 3 mit 4; 5 mit 7; 6 mit 7; 1 mit 4; und 3 mit 7. Die PCR-Fragmente wurden um eine EcoRI-Stelle an dem 5'-Ende und eine BamHI-Stelle an dem 3'-Ende erweitert. Die Reaktionen wurden in einem 1%-igen Agarose-TBE-Gel analysiert, wobei Banden von der erwarteten Größe in allen Reaktionen gefunden wurden. Um zu bestätigen, dass die Banden Peroxidase-spezifischen Sequenzen entsprechen, wurde das Gel einem Southern Blot unterworfen und mit einer Oligonukleotid-Sonde mit der folgenden Sequenz hybridisiert, die zwischen den primern 3 und 4 positioniert ist:
5'-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-3' (SEQ ID NO: 16)
Es wurde gefunden, dass die Sonde mit Banden von ungefähr 130 Bp, 420 Bp, 540 Bp und 240 Bp hybridisiert, was bestätigt, dass die beobachteten DNA-Banden den Peroxidase-Sequenzen entsprechen.
DNA aus verschiedenen PCR-Reaktionen wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in das Plasmid pUC19 (New England BioLabs, Beverly, MA) kloniert. Kolo nien, welche die korrekten PCR-Fragmente enthielten, wurden durch Hybridisierung unter Verwenden der oben beschriebenen Oligonukleotid-Sonde (SEQ ID NO: 16), identifiziert. DNA von positiven Kolonien wurde durch Restrikions-Mapping und teilweiser DNA-Sequenzanalyse, wie von Sanger et al. beschrieben (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463–5467), analisiert. Ein 430 Bp-Fragment von einem der Klone, welches durch Verwenden der Primer 1 und 4 erhalten wurde, wurde verwendet, um eine Coprinus cinereus cDNA-Library zu screenen, wie unten beschrieben.
Es wurde Gesamt-RNA extrahiert aus homogenisierten Coprinus cinereus Stamm IFO 8371 Mycelien, gesammelt zum Zeitpunkt der maximalen Peroxidase-Aktivität gemäß den Verfahren, beschrieben von Boel et al. (1984, EMBO Journal 3: 1097–1102) und Chirgwin et al. (1979, Biochemistry 18: 5294–5299). Poly(A)-enthaltende RNA wurde durch zwei Zyklen Affinitätschromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose erhalten, wie von Aviv und Leder (1972, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69: 1408–1412) beschrieben, erhalten. Es wurde cDNA mit dem cDNA-Synthese-Kit (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert. Ungefähr 50.000 E. coli Rekombinante aus der Coprinus cinereus cDNA-Bibliothek wurden auf Whatman-540-Papierfilter transferiert. Die Kolonien wurden lysiert und immobilisiert, wie von Gerger et al. (1979, Nucleic Acids Research 7: 2115–2135) beschrieben. Die Filter wurden mit ³²P-markierter 430 Bp Peroxidase-spezifischer Sonde in 0,2 × SSC-0,1%-igem SDS hybridisiert. Die Hybridisierung und Waschung der Filter wurde bei 65°C durchgeführt, gefolgt von einer Autoradiographie für 24 Stunden mit einem Intensivierungs-Schirm. Nach der Autoradiographie wurden die Filter bei ansteigenden Temperaturen gewaschen, gefolgt von einer Autoradiographie von 24 Stunden mit einem Intensivierungs-Schirm. Auf diese Weise wurden mehr als 50 positive Klone identifiziert. Es wurde Minipräp-Plasmid-DNA aus den hybridisierten Kolonien durch Standardvorgehensweisen (Birnboim und Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7: 1513–1523) isoliert und die DNA-Sequenzen der cDNA-Inserts wurden durch die Sanger-Didesoxy-Vorgehensweise (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463–5467) bestimmt. Eine der Kolonien wurde ausgewählt und der Vektor wurde als pCiP bezeichnet. Das Peroxidase-cDNA-Fragment wurde aus dem Vektor durch Schneiden mit BamHI/XhoI ausgeschnitten und wurde durch Agarosegel-Elektrophorese aufgereinigt, elektroeluiert und für Ligationsreaktionen fertiggestellt. Das cDNA-Fragment wurde mit BamHI/XhoI-verdautem pHD414 ligiert, um pJVi9 zu erzeugen, wobei die cDNA unter der Transkriptionskontrolle des TAKA-Promotors von Aspergillus oryzae und des AMG^TM (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark)-Terminators von Aspergillus niger wie in 8 gezeigt, stand.
Die cDNA, welche die Coprinus cinereus Peroxidase kodiert, wurde aus dem Plasmid pJVi9 als BamHI-XhoI-Fragment ausgeschnitten und in das Plasmid pJeRS6 (9) kloniert, um das Plasmid pJRoC50 (10) herzustellen, welches pyrG als selektierbaren Marker, den TAKA-Promotor und den amdS-Terminator enthält.
Transformanten des Aspergillus oryzae Stamms HowB425 wurden unter Verwenden von 5 μg aufgereinigtem Plasmid pJRoC50 hergestellt, wie nachfolgend mit den folgenden Änderungen beschrieben. Die Agar-Oberschicht wurde ausgelassen und die Protoplasten wurden direkt auf Minimalmedium-Platten ausplattiert. Die Transformation wurde mit Protoplasten bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten wurden dann mit 5 μg DNA für 20 Minuten auf Eis platziert. Ein ml SPTC (40%-iges PEG 4000, 0,8 M Sorbitol, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) wurde hinzugefügt und die Protoplasten wurden bei 34°C für 30 Minuten inkubiert. Die Transformation wurde direkt auf Platten, welche Minimalmedium enthielten, ausplattiert. Das Minimalmedium (pH 6,5) war zusammengesetzt aus 6 g NaNO₃, 0,52 g KCl, 1,52 g KH₂PO₄, 1 ml Spurenmetalle, 1 g Glucose, 500 mg MgSO₄-7H₂O, 342,3 g Sucrose und 20 g Noble-Agar pro Liter. Die Spurenmetall-Lösung (1000×) war zusammengesetzt aus 22 g ZnSO₄-7H₂O, 11 g H₃BO₃, 5 g MnCl₂-4H₂O, 5 g FeSO₄-7H₂O, 1,6 g CoCl₂-5H₂O, 1,6 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ und 50 g Na₄EDTA pro Liter. Die Platten wur den 5 bis 7 Tage bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit dem gleichen Medium transferiert und 3 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert.
Sechsundsechzig Transformanten wurden auf ihre Peroxidase-Aktivität hin untersucht unter Verwenden des folgenden Enzym-Assays: 180 μl Substratpuffer {20 ml 0,1 M Kaliumphosphat-0,01%-iges Tween-80 pH 7,0, 250 μl 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) (ABTS)-Lösung (22 mg/ml) und 2 μl 30%-iges Hydrogenperoxid} wurden zu 20 μl Kultur-Überstand hinzugefügt, welcher 1 : 900 verdünnt wurde, woraufhin schnell eine Messung der Absorption bei 405 nm bei 25°C unter Verwenden eines "Molecular Devices Thermomax Microplate Reader" (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) erfolgte. Die Messungen wurden alle 10 Sekunden über eine Periode von 2 Minuten unter Mischen aufgezeichnet und die V_max-Werte wurden unter Verwenden des SOFTmax-Programms (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) berechnet. Die Peroxidase-Einheiten (POXU) pro ml wurden unter Verwenden einer Standardkurve bestimmt, welche mit einer bekannten Menge an Cinereus coprinus Peroxidase als Standard konstruiert wurde. Eine POXU wurde definiert als die Menge an Enzym, die die Umwandlung von 1,0 μmol pro Minute von 0,88 mM H₂O₂, 1,67 mM ABTS, 0,1 M Phosphat pH 7,0 bei 30°C, katalysiert. Von den vier Transformanten, welche die höchsten Level exprimierten, wurden durch Streifen („streaking") von Sporen und Picken von isolierten Kolonien unter Verwenden der gleichen Platten und unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben, Sporen aufgereinigt.
Es wurden endgültige Bewertungen in Schüttelflaschen durchgeführt, wobei ungefähr 5 × 10⁶ Sporen von jedem Transformanten in 25 ml MY25-Medium, enthaltend 1%-igem Hefeextrakt, 2,5%-iger Maltose, 0,2%-igem Harnstoff und 1 × MY-Salze pH 6,5, inokuliert. Die 1 × MY-Salze waren zusammengesetzt aus 2 g MgSO₄-7H₂O, 2 g K₂PO₄, 10 g KH₂PO₄, 2 g Zitronensäure, 0,5 ml Spurenmetall-Lösung und 1 ml 10% CaCl₂-2H₂O pro Liter. Die Spurenmetall-Lösung war zusammengesetzt aus 13,9 g FeSO₄-7H₂O, 8,5 g MnSO₄-H₂O, 14,28 g ZnSO₄-7H₂O, 1,63 g CuSO₄, 0,24 g NiCl₂-6H₂O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Es wurde Hemin bis zu einer Endkonzentration von 0,01 mg/ml aus einem frischen 10 mg/ml-Stock, präpariert in 50 mM NaOH, hinzugefügt. Die Schüttelflaschen wurden bei 34°C und 200 rpm für 7 bis 8 Tage inkubiert. Der beste Peroxidase-Hersteller wurde als JRoC50.3.18A bezeichnet.
Beispiel 8: Transformation von Aspergillus oryzae JRoC50.3.18A mit pSE31
Der Aspergillus oryzae Stamm JRoC50.3.18A wurde mit pSE31 transformiert, um zu bestimmen, ob eine Überexprimierung des hemA-Gens die Peroxidase-Herstellung erhöhte.
Die Transformation wurde mit Protoplasten bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten wurden bei 34°C mit 10 μg DNA und 200 μl 60%-iger PEG 4000-10 mM HEPES-10 mM CaCl₂-Lösung für 30 Minuten inkubiert. Drei ml SPTC (40%-iges PEG 4000, 0,8 M Sorbitol, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) wurden hinzugefügt und die Protoplasten wurden direkt auf COVE-Transformationsplatten ausplattiert (pro Liter: 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO₄-7H₂O, 1,52 g KH₂PO₄, 1 ml Spurenmetall-Lösung, wie in Beispiel 7 beschrieben, 342,3 g Sucrose, 25 g Noble-Agar, 10 ml 1 M Acetamid, und 10 ml 3 M CsCl) für amdS-Transformationen. Die Platten wurden 5–7 Tage bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit dem gleichen Medium transferiert und 3 bis 5 Tage bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden dann durch Streifen der Sporen und Picken isolierter Kolonien unter Verwenden der gleichen Platten unter den gleichen Bedingungen aufgereinigt.
Beispiel 9: Peroxidase-Herstellung durch hemA-Transformanten
Die Transformanten aus Beispiel 8 wurden in einzelne Wells inokuliert bei ungefähr 1 × 10⁵ Sporen pro Well einer 24-Well-Microtiter-Platte, welche 1 ml MY25-Medium von einer viertel Stärke enthielt, welches zusammengesetzt war aus 0,25%-igen Hefeextrakt, 0,63%-ige Maltose und 0,05%-igen Harnstoff pH 6,5 und 1 × MY-Salz (siehe Beispiel 7). Die Microtiter-Platten wurden bei 34°C und 100 rpm in einer Feuchtkammer für 5 Tage inkubiert.
Die Peroxidase-Herstellungs-Level wurden unter Verwenden des in Beispiel 7 beschriebenen Enzymassays bestimmt. Die Resultate der Microtiter-Platten-Tests demonstrieren, dass der Durchschnitt an POXU/ml hemA-Transformanten 1,4-fach größer war als der Durchschnitt an Nur-Vektor-Transformanten mit dem besten hemA-Transformanten, welcher einen 1,6-fachen Anstieg in der Peroxidase-Herstellung zeigt.
Ein geringer Anteil (39%) der hemA-Transformanten zeigt Peroxidase-Level, die ähnlich zu dem Großteil der Nur-Vektor-Kontrollen ist. Es wurde eine PCR-Amplifizierung unter Verwenden von 50 ng genomischer DNA, isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben, von jedem Transformanten durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Primer hemA3' (siehe Beispiel 4) und der Primer 5'-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-3' (SEQ ID NO: 17) verwendet wurden. Diese Analyse zeigte, dass die hemA-Transformanten die Expressionskassette enthalten.
Elf der besten hemA-Transformanten, die oben erhalten wurden, wurden in Schüttelflaschen kultiviert, um die Wirkungen auf die Peroxidase-Herstellung besser zu bewerten. Für die Schüttelflaschen-Bewertungen wurden ungefähr 50 × 10⁶ Sporen von jedem Transformanten in 25 ml MY25-Medium, enthaltend 1%-igen Hefeextrakt, 2,5%-ige Maltose, 0,2%-igen Harnstroff und 1 × MY-Salze pH 6,5 (siehe Beispiel 7) inokuliert. Die Schüttelflaschen wurden bei 34°C und 200 rpm für 7 bis 8 Tage inkubiert. Die Peroxidase-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Resultate demonstrieren, dass 5 Transformanten, SE01-15, SE01-20, SE01-26, SE01-28 und SE01-32, Peroxidase-Level herstellten, die größer waren als die Allein-Vektor-Kontrollstämme, wobei drei Transformanten Peroxidase bei einem Level exprimierten, der 1,9-fach größer war als der Durchschnitt der Kontrollperoxidase-Level. Die verbleibenden sechs hemA-Transformanten zeigten Peroxidase-Level, die vergleichbar mit den Kontroll-Level waren.
Der Transformant SE01-28 und ein Kontrollstamm SE05-18 (pBAN46 Allein-Vektor-Transformant) wurde in 2 Liter Fermentation wachsen gelassen, unter Verwenden eines Standard-„fed-batch"-Protokoll, das einen Sirup mit hohem Maltoseanteil als Kohlenstoffquelle besaß. „Batch" und Zufuhr („feed") wurden mit FeCl₃ auf ungefähr 0,4 mM ergänzt. Die positiv aufgelöste Sauerstoffspannung wurde in beiden Kulturen beibehalten durch Zufuhr („feed") mit einer Rate von ungefähr 2 g Saccharid pro Liter pro Stunde von Tag Drei bis Tag Acht. Dieser Level wurde in einer schrittweisen Art über die Tage Zwei und Drei erreicht. Die Biomasse in beiden Kulturen war ungefähr gleich während der Dauer der Fermentation.
Ein 2-facher Anstieg der Peroxidase-Aktivität wurde bei SE01-28 gegenüber dem Kontrollstamm SE05-18 beobachtet. Es lag ebenfalls ein 2-facher Anstieg in dem Polypeptid-Level für SE01-28 bezogen auf den Kontrollstamm SE05-18 vor.
Die Gesamtresultate demonstrierten, dass die Überexpression des hemA-Gens in einem 2-fachen Anstieg des Peroxidase-Ertrags resultierte. Die Daten zeigen ferner an, dass hemA einen regulatorischen Schlüsselpunkt während der Hem-Biosynthese in filamentösen Pilzen darstellen kann, die über eine genetische Manipulation, die Hemoprotein-Herstellung in der Abwesenheit von Hemin-Ergänzung verbessern kann.
Beispiel 10: Erzeugung einer genomischen hemB-Sonde mittels PCR
Degenerierte PCR-Primer wurden basierend auf der Aminosäuresequenz, welche ein 126 Bp hemB-Fragment von Aspergillus oryzae flankiert (Jesper Vind, 1994, Ph. D. Dissertation, University of Copenhagen, Dänemark) und den homologen Regionen von Hefe- und humanen hemB-Klonen (Myers et al., Journal of Biological Chemistry 262: 16822–16829; Wetmur et al., 1986, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83: 7703–7707) gestaltet. Die Oligonukleotid-Primer wurden unter Verwenden eines "Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA-Synthesizers" synthetisiert. Sense
5'-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATGGA-3' (SEQ ID NO: 18) und Antisense
5'-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC(AG)TA-3' (SEQ ID NO: 19)
Primer wurden verwendet, um das hemB-Fragment unter Verwenden von pJVi 60 (Vind, 1994, supra) als Template mittels PCR zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion (50 μl) war zusammengesetzt aus 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 Gew.-% Gelatine, 200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 500 ng pJVi 60 und 50 pmol von jedem der oben beschriebenen PCR-Primer. Die Reaktion wurde bei 95°C für 3 Minuten inkubiert und auf 80°C abgekühlt. Dann wurden 5 Einheiten Taq-Polymerase hinzugefügt. Die Reaktion wurde in einem Perkin Elmer 9600-Thermal-Cycler, programmiert für 35 Zyklen, jeder bei 95°C für 30 Sekunden, 45°C für 1 Minuten und 72°C für 1 Minuten inkubiert. Dem letzten Zyklus folgend wurde die Reaktion bei 72°C für 5 Minuten inkubiert. Ein vorausberechnetes 126 Bp hemB-PCR-Produkt wurde in einen PCR-II-Vektor kloniert, um das Plasmid pAJ005-1 (11) herzustellen.
Beispiel 11: Aspergillus oryzae Stamm A1560 DNA-Bibliotheken und Identifizierung von Porphobilinogensynthase (hemB)-Klonen
Genomische DNA-Bibliotheken wurden aus dem Aspergillus oryzae Stamm A1560 konstruiert, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Es wurde Bakteriophagen-DNA von ungefähr 8 × 10⁴ Plaques auf doppelte kreisförmige Nytran-Plus-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) transferiert und mit einem ²³P-markierten PCR-Produkt, welches aus der Amplifizierung des hemB-Fragments von pAJ005-1 (siehe Beispiel 10) stammt, sondiert, gemäß Mertz und Rashtchian (1994, Analytical Biochemistry 221: 160–165). Die Amplifizierungs-Reaktion (50 μl) enthielt die folgenden Komponenten: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (Gewicht/Volumen) Gelatine, 0,04 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 5 μl ³²P-dCTP (3000 Ci/mmol, 3,3 μM; Amersham, Arlington Heights, IL) und 50 pmol jeweils von dem Sense-Primer 5'-GTGGCTCCGAGTGATAT-3' (SEQ ID NO: 20) und dem Antisense-Primer 5'-GCATCGCGAAAAGGACCG-3' (SEQ ID NO: 21). Die Reaktion wurde auf 95°C für 3 Minuten erhitzt, gefolgt von der Zugabe von 5 Einheiten Taq-Polymerase. Die Reaktion wurde dann in einem Perkin Elmer Thermal-Cycler, programmiert für 30 Zyklen, jeder Zyklus bei 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute inkubiert. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex-G50-Säule (Pharmacia, Alameda, CA) passiert, um einzeln eingebaute Nukleotide zu entfernen, dann denaturiert und dem Hybridisierungspuffer hinzugefügt. Es wurde eine denaturierte Probe (10⁶ cpm/ml) zu dem Hybridisierungspuffer hinzugefügt und über Nacht mit prähybridisierten Membranen inkubiert. Prähybridisierung und Hybridisierung wurden bei 42°C in 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat pH 7, 5 × Denhardt's-Lösung, 0,1% (Gewicht/Volumen) SDS, 5 mM EDTA pH 8, 10 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 50%-igem Formamid durchgeführt. Die Membranen wurden 4 × in 0,1 × SSC, 0,1%-igem SDS für 15 Minuten bei 42°C gewaschen. Die Anfangs-Plaques, die ein positives Signal gaben, wurden ein zweites Mal gescreent und aufgereinigt gemäß den In struktionen des Herstellers. Zehn genomische Klone, die ein positives Signal herstellten, wurden aus dem λZipLox-Vektor als pZL-Derivate ausgeschnitten, gemäß den Instruktionen des Herstellers (Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD) und gemäß dem Verfahren von Hattori und Sakaki (1986, Analytical Biochemistry 152: 232–237) sequenziert. Die pZL-Derivate wurden als pAJ007-1 bis pAJ007-10 bezeichnet. Der Klon E. coli DH5α pAJ007-6 enthielt ein 3,7 kB großes genomisches Fragment, basierend auf der Restriktionskarte, und wurde weiter analysiert.
Beispiel 12: Charakterisierung des Porphobilinogensynthase (hemB)-Gens
E. coli DH5α pAJ007-6, beschrieben in Beispiel 11, wurde einer DNA-Sequenzierung unterzogen, gemäß der in Beispiel 11 beschriebenen Vorgehensweise.
Die Nukleotidsequenz des klonierten Aspergillus oryzae A1560 hemB-Gens enthüllte einen offenen Leserahmen von 1308 Nukleotiden, wie in 12 (SEQ ID NO: 3) gezeigt, welcher ein 374 Aminosäuren-langes Polypeptid mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 40 kDa kodiert, wie in 12 (SEQ ID NO: 4) gezeigt. Die Nukleotidsequenz enthält ein 48 Bp-langes putatives Intron, welches durch Splice-Stellen-Konsensussequenzen flankiert wird und eine innere Konsensussequenz enthält, die von (Unkles, 1992, in Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Kapitel 2, J. R. Kinghorn und G. Turner, Hrsg., Blackie Academic and Professional Publications) vorausgesagt wurde. Die 3'-Splice-Stelle (TAG) ist 254 Bp stromabwärts des Met lokalisiert, eine 5'-Splice-Stelle (GTCCGC) ist 46 Bp stromabwärts der 3'-Splice-Stelle lokalisiert und die innere Konsensussequenz (TCTAAC) ist 30 Bp stromabwärts der 5'-Splice-Stelle lokalisiert. Die 5'-nicht-translatierte Region enthält zwei CAAT-Motive an den Positionen –377 und –233 und kann eine wichtige Rolle in der Transkriptionsregulation spielen (Gurr et al., 1987, supra). Zusätzlich wurden einige putative TATA-ähnliche Boxen in der 3'-nicht-translatierten Region (–117, –208, –650) gefunden.
Wie erwartet scheint hemB keine Leader-Sequenz an dem N-Terminus zu enthalten, da es cytoplasmatisch in anderen Organismen, mit Ausnahme von Pflanzen, vorliegt (Bottemley und Muller-Eberhard, 1988, Seminars in Hematology 25: 282–302).
Ein Abgleich der Aminosäure von dem Aspergillus oryzae hemB-Gen (SEQ ID NO: 4) mit anderen hemB-Genen ist in 13 gezeigt. Die abgeleitete hemB-Aminosäuresequenz von Hefe (SEQ ID NO: 31; Myers et al., 1987, supra), Mensch (SEQ ID NO: 27; Wetmur et al., 1986, supra), Ratte (SEQ ID NO: 29; Bishop et al., 1989, Nucleic Acid Research 14: 10115) und E. coli (SEQ ID NO: 26; Li et al., 2989, Gene 75: 177–184) besitzen jeweils 63%, 55%, 55% und 40% Identität zu der Aspergillus oryzae hemB-Aminosäuresequenz. Die abgeleiteten hemB-Aminosäuresequenzen von Erbse (SEQ ID NO: 28; Bsese et al., 1991, Journal of Biological Chemistry 266: 17060–17066), Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 25; Hansson et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 2590–2599) und Spinat (SEQ ID NO: 30; Scharmburg und Schneider-Poetsch, 1991, EMBL Data Library) zeigen geringere Ähnlichkeit (jeweils 40%, 39% und 33% Identität). Jedoch enthalten sowohl die Erbsen als auch die Spinat-hemB-Aminosäuresequenzen eine N-terminale Chloroplasten-Signalsequenz und ihre Ähnlichkeit zu Aspergillus oryzae hemB würde signifikant ansteigen, wenn sie als reife Polypeptide abgeglichen werden würden. Basierend auf diesem Abgleichen, ist die aktive Lysin-Stelle von Aspergillus oryzae hemB an der Aminosäure 299 lokalisiert (Jaffe, 1995, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27: 169–179) und eine konservierte Zinkfinger-ähnliche Domäne, wie von Berg (1986, Nature 319: 264–265) vorausgesagt, ist an den Aminosäuren 166 bis 180 lokalisiert. Von dem Zinkfinger ist angenommen worden, dass er eine Oxidation der Sulfhydryl-Gruppen an der aktiven Stelle durch die Bindung von Zn²⁺ verhindert (Jaffa, 1995, supra). Von der entsprechenden Domäne in Pflanzen hemB wird angenommen, dass sie Mg²⁺ eher als Zn²⁺ bindet (Bsese et al., 1991, supra). Interessanterweise ist der erste Rest der hemB-Finger-Domäne ein Thr (an Position 166), welches an dieser Position in der Pflanzen-Metall-bindenden Domäne konserviert ist. Jedoch sind die restlichen Positionen in der hemB-Zinkfinger-Domäne konserviert.
Beispiel 13: Konstruktion von pAJ023
Das Plasmid pAJ023 (14) wurde durch PCR-Amplifizierung der Aspergillus oryzae hemB-kodierenden Region konstruiert und in den Aspergillus oryzae Expressionsvektor pBANE6 subkloniert. Das Amplifizierungs-Produkt wurde so gestaltet, dass es 5'-SwaI und 3'-PacI-Restriktionsstellen enthält, um das Klonieren in pBANe6 zu vereinfachen. Die Amplifizierungsreaktion (50 μl) enthielt die folgenden Komponenten: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (Gewicht/Volumen) Gelatine, 200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 200 ng pAJ007-6 DNA und 50 pmol von jedem der unten gezeigten Primer:
PBG10 (Sense): 5'-GCATATTTAAATGATGTCCTTTTCTAATCTCGT-3' (SEQ ID NO: 38)
PBG11A (Antisense): 5'-ATATTAATTAATCCATCTAGCTAAATCATT-3' (SEQ ID NO: 39)
Die unterstrichenen Regionen von PBG10 und PBG11A enthielten jeweils die Klonierungs-Restriktionssequenzen SwaI und PacI. Die Reaktion wurde bei 95°C für 3 Minuten inkubiert und auf 80°C abgekühlt. Fünf Einheiten PWO (BM) Polymerase wurden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Perkin Elmer 9600-Thermo-Cycler, programmiert für 30 Zyklen, jeder bei 95°C für 30 Sekunden, 57°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute inkubiert. Dem letzten Zyklus folgend wurde die Reaktionsmischung bei 72°C für 5 Minuten inkubiert. Das endgültige PCR-Produkt wurde Gel-aufgereinigt, mit SwaI und PacI verdaut und mit dem Vektor pBANe6 ligiert, welcher mit SwaI und PacI verdaut wurde, um pAJ023 zu erzeugen.
Beispiel 14: Transformation von Aspergillus oryzae JroC50.3.18A mit pAJ023
Der Aspergillus oryzae Stamm JRoC50.3.18A wurde mit pAJ023 transformiert, um zu bestimmen, ob eine Überexpression des Aspergillus oryzae hemB-Gens die Peroxidase-Herstellung erhöht. Als Kontrolle wurde ebenfalls pBANe6 verwendet, um Aspergillus oryzae JRoc50.3.18 zu transformieren. Die Transformation wurde mit Protoplasten bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten wurden mit 10 μg DNA für 30 Minuten auf Eis platziert. Ein ml SPTC wurde hinzugefügt und die Protoplasten wurden bei 34°C für 20 Minuten inkubiert. Es wurden Aliquots von 0,25 ml der Transformation zu 15 ml COVE-Agar-Oberschicht (siehe Beispiel 8) hinzugefügt, bevor ein Ausplattieren auf COVE-Transformationsplatten erfolgte. Die Platten wurden 5 bis 7 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit dem gleichen Medium transferiert und 3 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert.
Beispiel 15: Peroxidase-Herstellung durch hemB-Anfangs-Transformanten
Eine Gesamtanzahl von 20 Aspergillus oryzae hemB-Transformanten und 42 Kontroll-Tranformanten (Transformanten von JRoC50.3.18A mit dem Aspergillus oryzae Expressionsvektor ohne Aspergillus oryzae hemB) wurden in 24-Well-Platten wachsen gelassen und auf ihre Peroxidase-Herstellung hin untersucht, wie in Beispiel 7 beschrieben.
Die Resultate der Peroxidase-Assays zeigten keinen Anstieg in der Anzahl an Transformanten, die höhere Level an Peroxidase-Aktivität in Bezug zu den Kontroll-Transformanten herstellen.
Beispiel 16: Konstruktion von pSE37 und pSE38
pSE7t1 (15) wurde durch Ligierung einer PCR-amplifizierten Region des Aspergillus oryzae A1560 hemA-offenen Leserahmens in pCRII (Invitrogen, San Diego, DA) gemäß den Instruktionen des Herstellers konstruiert. Der hemA-offene Leserahmen wurde mittels PCR amplifiziert unter Verwenden der Primer hemA5' (SEQ ID NO: 7) und hemA3' (SEQ ID NO: 8), beschrieben in Beispiel 4 von pSE17 (Beispiel 3), gemäß den gleichen PCR-Bedingungen wie in Beispiel 6 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Konzentration von jedem dNTP 50 μM betrug. Das Plasmid pSE37 (16) wurde durch Ligieren des 1940 Bp-langen SwaI-PacI-Fragments, welches die hemA-kodierende Region von pSE7t1 enthält, in SwaI-PacI-geschnittenem pSE39 (17), konstruiert.
pSE39 wurde durch Ligation eines stumpfen 2033 Bp-langen HindIII-EcoRI-Fragments von pMT1612 (18) mit dem stumpfen NsiI-Fragment von pBA-Ne13 (19), welches den pyrG-selektierbaren Marker durch den bar-selektierbaren Marker ersetzt hat, was eine Resistenz gegenüber Basta vermittelt, konstruiert. Das Plasmid pSE38 (28) wurde durch Ligieren eines 1137 Bp SwaI-PacI-Fragments, welches den hemB-offenen Leserahmen von pAJ23 (14) enthält, in SwaI-PacI-geschnittenen pSE39 (17), konstruiert.
Beispiel 17: Wirkung der hemA- und hemB-Co-Überexpression auf die Coprinus cinereus Peroxidase-Herstellung
Der Aspergillus oryzae Stamm SE01-28, beschrieben in Beispiel 9, wurde mit pSE38 transformiert, um neue Transformanten, die als Aspergillus oryzae SE27 bezeichnet wurden, gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren zu erzeugen, mit den Ausnahmen, dass die Basta-Resistenz für die Selektion verwendet wurde, und dass 2–8 μg NdeI-verdautes pSE338 pro Transformation direkt aus der Reaktion hinzugefügt wurde, so dass ~5 U (Einheiten) Enzym in die Transformationsmischung eingeschlossen wurden. Die Medien für die Basta-Selektion enthielten 20 ml COVE-Salze, 1 M Sucrose, 25 g/l Noble-Agar, 10 mM Harnstoff und entweder 5 mg/ml Basta (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) zur Transformation oder 10 mg/ml Basta, um die Transformanten beizubehalten. Die COVE-Salze waren zusammengesetzt aus 26 g KCl, 26 g MgSO₄-7H₂O, 76 g KH₂PO₄ und 50 ml COVE-Spurenelementen pro Liter deionisiertem Wasser. Die COVE-Spurenelemente waren zusammengesetzt aus 0,04 g Na₂B₄O₇-10H₂O, 0,4 g CuSO₄-5H₂O, 1,2 g FeSO₄-7H₂O, 0,7 g MnSO₄-H₂O, 0,8 g Na₂MoO₂-H₂O, 10 g ZnSO₄-7H₂O pro Liter deionisiertem Wasser. Es wurde Maltose bis zu einer Endkonzentration von 2,5% hinzugefügt, wenn es angezeigt war. Das Basta-Selektions-Oberschichtmedium war das gleiche wie oben, mit der Ausnahme, dass Basta vor der Verwendung hinzugefügt wurde.
Es wurden ebenfalls zwei Kontroll-Populationen, eine hemA-Überexpressions-Population (Aspergillus oryzae SE01-28, transformiert mit pSE39 = Aspergillus oryzae SE28-Stämmen) und eine Vektor-transformierte Population (Aspergillus oryzae JRoC50.3.18A, transformiert mit pSE39 = Aspergillus oryzae SE22-Stämme) unter Verwenden der gleichen, oben beschriebenen, Vorgehensweise konstruiert.
Die Transformanten wurden dann in einzelne Wells bei ungefähr 1 × 10⁵ Sporen pro Well von 24-Well-Mikrotiter-Platten, die 1 ml des MY25-Mediums mit einer viertel Stärke enthielten, inokuliert. Die Mikrotiter-Platten wurden bei 34°C und 100 rpm in einer Feuchtkammer für 5 Tage inkubiert. Die Peroxidase-Herstellungs-Level wurden unter Verwenden des in Beispiel 7 beschriebenen Enzym-Assays bestimmt.
Die Resultate demonstrieren einen dramatischen Shift in der Verteilung der Peroxidase-Aktivitäten in Richtung auf höhere Level bei der Population der Aspergillus oryzae SE27-Stämme, wenn diese mit den zwei Kontroll-Populationen, den Aspergillus SE28-Stämmen (hemA-Überexpressions-Population) und den Aspergillus oryzae SE22-Stämmen (eine Vektor-transformierte Population) verglichen werden. Die hemA/hemB-Co-Überexpressions-Stämme zeigten einen 4-fachen Durchschnittsanstieg gegenüber nicht-technisierten („non-engineered") Stämmen (SE22) und einen 1,8-fachen Durchschnittsanstieg gegenüber hemA-Überexpressions-Stämmen (SE28).
Einige der höchsten Peroxidase-herstellenden Transformanten – Aspergillus oryzae Transformanten SE27-3, SE27-8, SE27-12 und SE27-13 – wurden dann in Schüttelflaschen kultiviert. Ungefähr 5 × 10⁶ Sporen wurden in 25 ml MY25-Medium inokuliert und bei 34°C, 200 rpm für 5 Tage inkubiert. Alternativ wurde ein mycelialer Stöpsel („mycelial plug") in eine Schüttelflasche inokuliert, welche 25 ml des MY25-Mediums und 0,002% Novozyme 234 enthielt, und für 2 Tage bei 34°C, 200 rpm inkubiert. Vier ml dieser Kultur wurden verwendet, um Dreifach-Schüttelflaschen zu inokulieren, welche 25 ml des MY25-Mediums enthielten, die bei 34°C, 200 rpm für 5 Tage inkubiert wurden. Die Proben wurden dann entfernt und durch Miracloth gefiltert, um die mycelialen Fragmente zu entfernen, bevor ein Enzymassay für die Peroxidase-Aktivität erfolgte.
Die Peroxidase-Assays der Schüttelflaschen-Kulturen von den Aspergillus oryzae Transformanten SE27-3, SE27-8, SE27-12 und SE27-13 zeigten, dass alle eine höhere Peroxidase-Aktivität herstellten, im Vergleich zu den Kontroll-Stämmen Aspergillus oryzae SE22 und SE28. Die Stämme SE27-12 und SE27-8 zeigten einen 4-fachen Anstieg gegenüber den SE22-Kontroll-Stämmen und einen 2-fachen Anstieg gegenüber den SE28-Kontroll-Stämmen.
Aspergillus oryzae SE27-12 und Aspergillus oryzae SE22 wurden als Kontrolle in einer 2 Liter Fermentation wachsen gelassen, mit und ohne die Zugabe von Hemoglobin unter Verwenden eines Standard-„fed-batch"-Protokoll, welches Sirup mit hohem Maltosegehalt als Kohlenstoffquelle besitzt. „Batch" und Zufuhr („feed") wurden mit FeCl₃ auf ungefähr 0,4 mM ergänzt. Die positive aufgelöste Sauerstoff-Spannung wurde in beiden Kulturen beibehalten durch eine Zufuhr („feed") mit einer Rate von ungefähr 2 g Saccharid pro Liter pro Stunde von Tag Drei bis Tag Acht hinzugefügt wurde. Dieser Level wurde in einer schrittweisen Art über die Tage Zwei und Drei erreicht. Die Biomasse in beiden Kulturen war ungefähr gleich während der Dauer der Fermentation. Es wurden ebenfalls Fermentationen in der Gegenwart von Hemoglobin laufen gelassen. Hemoglobin wurde bis zu einer Endkonzentration von 30 mg/ml „batch"-Medium hinzugefügt.
Die Resultate zeigten, dass ein 6-facher Anstieg der Peroxidase-Herstellung gegenüber SE22 nach 192 Stunden Fermentation vorlag. Ein zusätzlicher 3-facher Anstieg der Peroxidase-Herstellung von SE27-12 verglichen mit SE22 wurde beobachtet, wenn Hemoglobin zu dem Fermentations-Medium hinzugefügt wurde. Der Gesamtanstieg in dem Peroxidase-Ertrag unter Verwenden eines hemA/hemB-technisierten Stammes, der in der Gegenwart von Hemoglobin gewachsen ist, verglichen mit einem nicht-technisierten Stamm ohne hinzugegebenes Hemoglobin, war 10-fach.
Die Resultate zeigen an, dass eine Überexpression von hemA und hemB die Peroxidase-Herstellung synergistisch verbessert.
Beispiel 18: Wirkung der hemA hemB-Co-Überexpression auf die Scytalidium thermophilum Catalase-Herstellung
Der Aspergillus oryzae Stamm HowB411, der ein Scytalidium thermophilum Catalase-Gen (WO 96/34962) enthält und als DLM14.24 bezeichnet wird, wurde technisiert, um hemA und hemB zu co-überexprimieren, um zu bestimmen, ob eine Co-Überexpression die Catalase-Herstellung erhöhen würde. Der Aspergillus oryzae Stamm DLM14.24 wurde co-transformiert unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 17 beschrieben, mit 10 μg jeweils von pSE37 und pSE38, um Transformanten zu erzeugen, die als Aspergillus oryzae SE32 bezeichnet wurden. Kontroll-Stämme, die als Aspergillus oryzae SE24 bezeichnet wurden, wurden durch Transformation von Aspergillus oryzae DLM 14.24 mit pSE39 unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 17 beschrieben, erzeugt.
Die SE32-Transformanten und die Kontroll-Stämme wurden in einzelne Wells bei ungefähr 1 × 10⁵ Sporen pro Well einer 24-Well-Mikrotiter-Platte inokuliert, welche 1 ml M400Da pH 6,0-Medium enthielten, welches zusammengesetzt war aus 50 g Maltosedextrin, 2 g MgSO₄-7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 4 g Zitronensäure, 8 g Hefeextrakt, 2 g Harnstorff 0,5 g CaCl₂-2H₂O und 1 ml Spurenelementen pro Liter. Die Spuren-Metall-Lösung war zusammengesetzt aus 13,9 g FeSO₄-7H₂O, 8,5 g MnSO₄-H₂O, 14,28 g ZnSO₄-7H₂O, 1,63 g CuSO₄, 0,24 g NiCl₂-6H₂O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Die Mikrotiter-Platten wurden bei 34°C und 100 rpm in einer Feuchtkammer für 5 Tage inkubiert. Die Catalase-Herstellungs-Level wurden unter Verwenden des in WO 96/34962 beschriebenen Enzym-Assay bestimmt. Eine CIU wird definiert als die Menge an Catalase, welche ein Micromol Wasserstoffperoxid pro Minute in 12 mM Wasserstoffperoxid – 50 mM Kaliumphosphat pH 7,0 -Puffer bei 25°C zersetzt.
Die Population der Aspergillus oryzae SE32 hemA/hemB-Co-Transformanten, die anfangs analysiert wurden, zeigten eine Catalase-Verteilung, die leicht in Richtung auf eine höhere Catalase-Herstellung geändert war. Die Durchschnitts-CIU/ml der Co-Transformanten-Population war 1,3-fach höher als die Durchschnitts-CIU/ml der Kontroll-Population.
Die besten Aspergillus oryzae-Co-Transformanten SE32-3a, SE32-4a, SE43-6b und SE32-32a wurden dann in Schüttelflaschen, die 25 ml M400Da-Medium enthielten, bei 34°C und 200 rpm für 6 Tage wachsen gelassen und wurden wie vorher beschrieben auf ihre Catalase-Aktivität hin untersucht.
Der beste Stamm, Aspergillus oryzae SE32-32a zeigte einen 1,8-fachen Anstieg in der Catalase-Herstellung, verglichen mit den Kontroll-Stämmen.
Beispiel 19: Konstruktion von Aspergillus oryzae HowB430
pBANe8 wurde so konstruiert, dass er den TAKA/NA2-tpi-Leader-Hybrid-Promotor, das Lipolase^TM-Gen, den AMG-Terminator und ein Volllängen-Aspergillus nidulans amdS-Gen als selektierbaren Marker enthielt. Lipolase^TM (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) ist eine Lipase von Humicola lanuginosus.
Es wurde eine PCR verwendet, um die gewünschten Restriktionsstellen unter Verwenden der Primer 1–4, unten beschrieben, die mit einem "Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer" synthetisiert wurden, einzufügen gemäß den Instruktionen des Herstellers.
Primer 1: 5'-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3' (SEQ ID NO: 32)
Primer 2: 5'-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3' (SEQ ID NO: 33)
Primer 3: 5'-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3' (SEQ ID NO: 34)
Primer 4: 5'-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3' (SEQ ID NO: 35)
Es wurden Amplifizierungs-Reaktionen (100 μl) präpariert unter Verwenden von ungefähr 0,2 μg eines der folgenden Plasmide als Template: pToC90 Plasmid-DNA (Christensen et al., 1988, Biotechnology 6: 1419–1422) wurde als Template mit den Primern 1 und 2 verwendet, um NsiI-flankierende Stellen in das Volllängen-amdS-Gen einzufügen. pJaL292 Plasmid-DNA (21) wurde als Template mit den Primern 3 und 4 verwendet, um eine EcoRI-Stelle an dem 5'-Ende und eine SwaI-Stelle an dem 3'-Ende des NA2-tpi-Leader-Hybrid-Promotors einzufügen. Jede Reaktion enthielt die folgenden Komponenten: 0,2 μg Plasmid-DNA, 48,4 pmol des Forward-Primers, 48,4 pmol des Reverse-Primers, 1 μM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq-Polymerase-Puffer und 2,5 U (Einheiten) Taq-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem Ericomp-Thermal-Cycler, programmiert für einen Zyklus bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten, inkubiert.
Die PCR-Produkte wurden nachfolgend in pCRII unter Verwenden des TA-Cloning-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers subkloniert. Die Transformanten wurden dann gescreent durch Extraktion der Plasmid-DNA aus den Transformanten unter Verwenden eines QIAwell-8-Plasmid-Kits (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers, Restriktionsverdau der Plasmid-DNA, um die Anwesenheit des korrekten Größenfragments zu bestätigen und Sequenzieren der DNA gemäß dem folgenden Verfahren, um das PCR-Produkt zu bestätigen. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem "Applied Biosystems Model 373A" automatisierten DNA-Sequenzierer an beiden Strängen unter Verwenden der Primerwanderungs-Technik mit Farbstoff-Terminator-Chemie (Giesecke et al., 1992, supra) unter Verwenden der M13-Reverse (–48) und M13-Forward (–20)-Primer (New England Biolabs, Beverly, MA) und Primern, die einzigartig zu der zu sequenzierenden DNA sind, durchgeführt. Die Plasmide aus den korrekten Transformanten wurden dann mit den Restriktionsenzymen, für welche sie gestaltet wurden, verdaut, in einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt und unter Verwenden eines "FMC-SpinBind-Kits" (FMC, Rockland, ME) gemäß den Instruktionen des Herstellers, aufgereinigt.
Der NA2-tpi-Leader wurde mittels PCR von pJaL292 (21) mit-EcoRI und SwaI-Restriktionsstellen, platziert an den Enden, amplifiziert. pKS6 (22), welcher den TAKA-Promotor, einen Polylinker, den AMG-Terminator und das Aspergillus nidulans pyrG-Gen enthält, wurde mit EcoRI und SwaI verdaut, um einen Anteil des TAKA-Promotors zu entfernen. Diese Region wurde durch das NA2-tpi-PCR-Produkt ersetzt, um pBANe13 (19) herzustellen.
Das Volllängen-amdS-Gen wurde mittels PCR amplifiziert mit NsiI-Stellen an beiden Enden. pBANe13 wurde mit NsiI verdaut, um das Aspergillus nidulans pyrG-Gen zu entfernen. Diese Region wurde durch das Volllängen-amdS-Gen ersetzt, um pBANe6 (6) herzustellen.
Die unten gezeigten Oligonukleotid-Primer 5 und 6 wurden unter Verwenden eines "Applied Biosystem Model 394 DNA/RNA Synthesizer" gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert, um Restriktionsstellen, welche das Lipase-Gen flankieren, mittels PCR-Amplifizierung einzufügen:
Primer 5: 5'-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3' (SEQ ID NO: 36)
Primer 6: 5'-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3' (SEQ ID NO: 37)
Die Amplifizierungs-Reaktion (100 μl) wurde unter Verwenden von ungefähr 0,2 mg pMHan37 (23) als Template mit den Primern 5 und 6 präpariert. Die Reaktion enthielt die folgenden Komponenten: 0,2 μg pMHan37, 48,4 pmol Primer 5, 48,4 pmol Primer 6, 1 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq-Polymerase-Puffer und 2,5 U (Einheiten) Taq-Polymerase. Die Reaktion wurde in einem Ericomp-Thermal-Cycler, programmiert für einen Zyklus bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 95°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten inkubiert. Zwei ml der Reaktion wurden in einem Agarose-Gel elektrophoriert, um die Amplifizierung des Lipase-Produkts von ungefähr 900 Bp zu bestätigen.
Das PCR-amplifizierte Lipase-Gen wurde in pCRII unter Verwenden des "TA Cloning Kit" gemäß den Instruktionen des Herstellers subkloniert. Die Transformanten wurden dann gescreent durch Extraktion der Plasmid-DNA aus den Transformanten unter Verwenden eines "QIAwell-8 Plasmid Kit" gemäß den Instruktionen des Herstellers, Restriktionsverdauung der Plasmid-DNA und Sequenzieren der DNA gemäß des obigen Verfahrens, um das PCR-Produkt zu bestätigen.
Das Lipase-Gen wurde aus pCRII durch Verdauen mit SwaI und PacI ausgeschnitten und wurde nachfolgend in pBANe6 subkloniert, um pBANe8 (24) zu erhalten. Die Transformanten wurden gescreent durch Extraktion der Plasmid-DNA aus den Transformanten unter Verwenden eines "QIAwell-8-Plasmi Kit" gemäß den Instruktionen des Herstellers, Restriktionsverdau der Plasmid-DNA und Sequenzieren der DNA gemäß des oben beschriebenen Verfahrens, um das Produkt zu bestätigen.
Aspergillus oryzae HowB430 wurde durch Transformation von Aspergillus oryzae HowB425 mit einem linearen Fragment, welches NA2-tpi-Promotor/Lipolase^TM-Gen/AMG-Terminator enthielt, bezeichnet als pBANe8, erzeugt. pBANe8 wurde mit PmeI verdaut und die lineare Expressionskassette wurde durch präparative Agarose-Elektrophorese unter Verwenden von 40 mM Tris-Acetat-1 mM Di-natrium-EDTA (TAE)-Puffer isoliert.
Die Transformation von Aspergillus oryzae HowB425 für amdS wurde mit Protoplasten bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. Zehn μg DNA wurden zu 100 μl Protoplasten hinzugefügt. Ein Volumen von 250 μl PEG (60% PEG 4000-10 mM CaCl₂-10 mM Tris-HCl pH 8,0) wurde dann hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten platziert. Drei ml STC-Medium wurde hinzugefügt und die Mischung wurde auf COVE-Platten, welche mit 10 mM Uridin, selektierend für amdS, ergänzt waren, ausplattiert. Die Platten wurden 7 bis 10 Tage bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit dem gleichen Medium transformiert und 3 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert. Die Transformanten wurden durch Streifen („streaking") von Sporen und Picken von isolierten Kolonien aufgereinigt unter Verwenden der gleichen Platten mit dem gleichen Medium ohne Sucrose unter den gleichen Bedingungen.
Beispiel 20: Spezifität der hemA hemB-Co-Überexpression auf die Hemoprotein-Herstellung
Da Hem in die Bereitstellung von Energie für Zellwachstum und -metabolismus involviert ist, war es wichtig zu zeigen, dass eine erhöhte Hemoprotein-Herstellung ursächlich war, um die Verfügbarkeit von Hem für die Assoziation mit Apo-Enzym zu erhöhen und nicht einfach eine erhöhte Apo-Protein-Herstellung ursächlich war, um Zellmetabolismus und -wachstum zu verstärken. Ein indirektes Verfahren zum Testen dieser Hypothese war es, hemA und hemB in einem Stamm zu co-überexprimieren, der ein heterologes Enzym herstellt, das kein Hemoprotein ist, d. h. eine Lipase. Wenn eine verstärkte Energieverfügbarkeit die Ursache für erhöhte Hemoprotein-Herstellung war, dann sollte ein ähnliches Resultat bei der Lipase-Expression beobachtet werden. Umgekehrt, wenn eine erhöhte Hemoprotein-Herstellung spezifisch ist aufgrund der erhöhten Verfügbarkeit von Hem für den Zusammenbau des reifen Enzyms, dann sollte ein kleiner Effekt auf die Lipase-Expression beobachtet werden.
Der Aspergillus oryzae Stamm HowB430, beschrieben in Beispiel 19, wurde mit pSE37 und pSE38, wie in Beispiel 18 beschrieben, co-transformiert, um einen nicht-Hemoprotein hemA/hemB-Co-Überexpressions-Stamm, den Aspergillus oryzae Stamm SE33, zu erzeugen. Es wurden wiederum Kontroll-Transformanten, bezeichnet als SE34, durch Transformation desselben Stammes mit pSE39 erzeugt.
Die Transformanten wurden in einzelne Wells bei ungefähr 1 × 10⁵ Sporen pro Well einer 24-Well-Mikrotiter-Platte, welche 1 ml MY25-Medium mit einer viertel Stärke enthielt, inokuliert. Die Mikrotiter-Platten wurden bei 34°C und 100 rpm in einer Feuchtkammer für 4 Tage inkubiert. Die Lipase-Herstellungs-Level wurden gemäß des folgenden Verfahrens in Bezug auf einen Lipolase^TM-Standard (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dänemark) bestimmt. Das Assay-Substrat wurde präpariert durch Verdünnen von 1 : 50 Stock-Substrat (21 μl p- Nitrophenylbutyrat/ml DMSO) in MC-Puffer (4 mM CaCl₂-100 mM MOPS pH 7,5), unmittelbar vor der Verwendung. Der Lipolase^TM-Standard wurde so zubereitet, dass er 40 LU/ml in MC-Puffer plus 0,02% Alpha-Olefin-Sulfonat (AOS)-Detergens enthielt, wurde bei 4°C gelagert und dann 1/20 in MC-Puffer verdünnt, grade bevor der Verwendung. Es wurden Proben der Brühe in MC-Puffer, welcher 0,02% AOS-Detergens enthielt, verdünnt und 20 μl Aliquots wurden in Wells einer 96-Well-Platte verteilt, gefolgt von 200 ml verdünntem Substrat. Unter Verwenden eines Plattenlesers wurde die Absorbanz bei 405 nm aufgezeichnet als Differeny aus zwei Ablesungen, die in ungefähr 1-Minuten-Intervallen genommen wurden. Die Lipase-Einheiten/ml (units/ml, LU/ml) wurden relativ zu dem Lipolase^TM-Standard berechnet.
Die Resultate der Lipase-Assays zeigten, dass die hemA/hemB-Co-Transformanten als eine Population 1,25-fach mehr Lipase herstellten, verglichen mit der Kontroll-Tranformanten-Population. Der leichte, aber signifikante Unterschied der Lipolase hemA/hemB-Co-Überexpressions-Population gegenüber der Kontroll-Population kann aufgrund einer geringen Wirkung der erhöhten Hem-Verfügbarkeit auf Zellwachstum und -metabolismus verursacht sein.
Beispiel 21: Wirkung der hemA/hemB-Co-Überexpression auf die Akkumulation von Hem-Signalweg-Zwischenprodukten
Sowohl die Mycelia- und die Kulturbrühen des Großteils der Aspergillus oryzae SE27-Stämme, die in 24-Well-Platten gewachsen sind, wie in Beispiel 17 beschrieben, erscheinen pink oder rot in ihrer Farbe. Die Filtration der Kultur-Brühe eines Aspergillus oryzae SE27-Stammes unter Verwenden einer Centricon-10-Säule (Amicon, Beverly, MA) zeigte, dass die rote Farbe sich in dem Filtrat befand, was nahelegt, dass die Farbe von kleinen Molekülen verursacht wird. Für das Filtrat wurde beobachtet, dass es Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm absorbiert, was konsistent mit Porphyrinen ist.
Um zu bestätigen, dass die rote Farbe in den Aspergillus oryzae SE27-Kulturbrühen durch die Anwesenheit von einem oder mehreren Porphyrinen, involviert in die Hem-Biosynthese, verursacht wurde, wurden die Kulturbrühen mittels HPLC gemäß des Verfahrens, beschrieben von C. A. Burtis und E. R. Ashwood (Hrsg.) In The Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 1994, Kapitel 38, analysiert. Die HPLC-Analysen demonstrierten, dass die Kulturbrühen erhöhte Level an Verbindungen enthielten mit der gleichen Retentionszeit wie Uroporphyrin (uro), hepta-, hexa-, und penta-carboxylierte Porphyrine und Coproporphyrin (copro). Brühen von Aspergillus oryzae SE36 Kontroll-Stämmen (Aspergillus oryzae, transformiert mit pSE39) zeigten eine kleine Akkumulation dieser Zwischenprodukte. Das Verhältnis von Uroporphyrin-Verbindungen zu Coproporphyrin betrug mindestens 3 : 1 in allen hemA/hemB-Co-Überexpressions-Stämmen.
Jeder der hemA/hemB-Co-Überexpressions-Stämme zeigte ebenfalls hohe Level fluoreszierender Kennzeichen von Porphyrin-Verbindungen, während der Kontroll-Stamm keine Fluoreszenz zeigte. Eine Fluoreszenz-Mikroskopie von Mycelia (Anregung bei 420–450, Barriere-Filter bei 520) des Stammes SE27-3 zeigte deutliche Fluoreszenz-Flecken und -Körnchen, welche nicht in den Kontroll-Stämmen SE28-1 oder 22-1 vorhanden waren. Diese Resultate lassen vermuten, dass hemA/hemB-Co-Überexpressions-Stämme größere Menge an Uroporphorin herstellen.
Die Akkumulation dieser Zwischenprodukte kann daraus resultieren, dass die Uroporphyrinogen III-Decarboxylase (Uro D) ein geschwindigkeitslimitierender Schritt in der Biosynthese von Hem wird.
Beispiel 22: Southern-Analyse der Aspergillus oryzae Stämme SE27 und SE32
Es wurde eine Southern-Analyse der Aspergillus oryzae Stämme SE27 und SE32 durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Herstellung der roten Farbe durch Hemo protein-herstellende Stämme mehrfache Kopien von sowohl der hemA- als auch der hemB-Expressionskassette erfordert.
Die gesamte Zell-DNA für jeden Stamm, präpariert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durch Southern-Hybridisierung (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) analysiert. Ungefähr 10 μg jeder DNA-Probe wurde mit PstI oder PvuI verdaut und in einem 1%-igen Agarose-Gel Größen-fraktioniert. Das Gel wurde unter Kurzwellen-UV-Licht fotografiert und für 30 Minuten in 0,25 N HCl, gefolgt von 30 Minuten in 0,4 N NaOH eingeweicht. Die DNA in dem Gel wurde auf eine Hybond-N-Hybridisierungs-Membran (Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert durch Kapillar-Blotting in 0,4 N NaOH unter Verwenden eines Turbo-Blot-Geräts (Schleicher & Schleicher, Keene, NH) gemäß den Instruktionen des Herstellers. Die Membran wurde UV-quervernetzt und wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, prähybridisiert, mit der Ausnahme, dass ein 5%-iges Vistra-Liquid-Blockierungsmittel (Amersham, Arlington Heights, IL) anstelle des Genius-Blockierungsmittels verwendet wurde. Eine Fluoreszenz-markierte Sonde wurde durch Zufalls-Priming des DNA-Fragments, wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwenden eines "Vistra Kits" (Amersham, Arlington Heights, IL) zubereitet. Die Hybridisierung und die Waschschritte wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Das Signal der Fluoreszenz-Probe wurde unter Verwenden des Vistra-Kits gemäß den Instruktionen des Herstellers amplifiziert. Die Fluoreszenz wurde durch Scannen mit einem "Storm Imaging System" (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) detektiert.
Die Southern-Blot-Analyse der Aspergillus oryzae Stämme SE27 und SE32 zeigten, dass mehrfache Kopien von beiden Expressionsplasmiden, pSE37 und pSE38, anwesend waren und dass die Herstellung der roten Farbe die Anwesenheit beider Expressionskassetten erfordert.
HINTERLEGUNG DER MIKROORGANISMEN
Die folgenden Stämme sind gemäß des Budapester Vertrags in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt.
Die Stämme wurden unter Bedingungen hinterlegt, die sicherstellen, dass der Zugang zu den Kulturen während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung erhältlich ist durch das Ausschussmitglied ("Commissioner") von Patenten und Marken, das hierzu unter 37 C. F. R. § 1.14 und 35 U. S. C. § 122 ermächtigt ist. Die Hinterlegungen stellen eine im Wesentlichen reine Kultur von jedem der hinterlegten Stämme dar. Die Hinterlegungen sind erhältlich, wie durch fremde Patentgesetze in Ländern erforderlich, in denen Gegenstücke der gegenständlichen Anmeldung oder ihrer Nachkommen („progeny") eingereicht sind. Jedoch soll verstanden werden, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz konstituiert, um die gegenständliche Erfindung in Beeinträchtigung der Patentrechte, welche durch Regierungsakt erteilt werden, zu praktizieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Hemoproteins, umfassend: (a) Einführen in eine filamentöse Pilzzelle, (i) eine oder mehrere Kopien einer Nucleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert; und (ii) eine oder mehrere erste Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines heme-biosynthetischen Enzyms, welches durch eine erste Nucleinsäuresequenz, die endogen in der filamentösen Pilzzelle ist, kodiert wird, zu steuern, in welchem die eine oder mehrere der ersten Kontrollsequenzen funktionsfähig mit der ersten Nucleinsäuresequenz verknüpft ist; und/oder (iii) eine oder mehrere Kopien von einer oder mehreren zweiten Nucleinsäuresequnzen, welche ein heme-biosyntetisches Enzym kodieren; (b) Kultivieren der filamentösen Pilzzelle in einem Nährmedium, welches zur Herstellung des Hemoproteins und des heme-biosyntetisches Enzyms geeignet ist; und (c) Wiedergewinnung des Hemoproteins aus dem Nährmedium der filamentösen Pilzzelle.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem lediglich eine oder mehreren ersten Kontrollsequenzen in die filamentöse Pilzzelle eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die ersten Kontrollsequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Leader, einer Polyadenylierungs-Sequenz, einem Promotor, einer propeptid-kodierenden Region, einer signalpeptid-kodierenden Region und einem Transkriptions-Terminator.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem lediglich eine oder mehreren Kopien von einer oder mehreren zweiten Nucleinsäuresequenzen in eine filamentöse Pilzzelle eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die eine oder mehreren Nucleinsäuresequenzen funktionsfähig mit einer oder mehreren zweiten Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression der zweiten Nucleinsäuresequenzen zu steuern, verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, in welchem die eine oder mehreren ersten Kontrollsequenzen oder die eine oder mehreren zweiten Nucleinsäuresequenzen aus einem filamentösen Pilzstamm erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die eine oder mehreren Nucleinsäuresequenzen eine 5-Aminolevulinsäure-Synthase kodieren, bevorzugt die 5-Aminolevulinsäure-Synthase, welche die SEQ ID-Nr: 2 besitzt und bevorzugter, in welchem die eine oder mehreren Nucleinsäuresequenzen eine Nucleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID-Nr: 1 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die eine oder mehreren Nucleinsäuresequenzen eine Porphobilinogen-Deaminase, eine Uroporphyrinogen-Synthase, eine Uroporphyrinogen-Decarboxylase, eine Coproporphyrinogen-Oxidase, eine Protoporphyrinogen-Oxidase oder eine Ferrochelatase kodieren.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem eine oder mehrere Kopien der Kontrollsequenz und eine oder mehrere Kopien der Kontrollsequenzen und eine oder mehrere Kopien der zweiten Nucleinsäuresequenz in die filamentöse Pilzzelle eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Einführen einer heme- oder heme-Analog-Quelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Hemoprotein eine Oxidoreductase ist, wie eine Catalase, eine Oxidase, eine Oxagenase, eine Haloperoxidase oder eine Peroxidase.
Verfahren nach Anspruch 11, in welchem die Peroxidase aus einer Art von Cporinus, Arthomyces oder Phanerochaete erhalten wird, zum Beispiel aus einem Coprinus cinereus-Stamm oder einem Coprinus macrorhizus-Stamm.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Hemoprotein nativ zu der filamentösen Pilzzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Hemoprotein fremd zu der filamentösen Pilzzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die filamentöse Pilzzelle eine Zelle von der Art Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma ist, zum Beispiel eine Aspergillus oryzae-Zelle oder eine Aspergillus niger-Zelle.
Rekombinante filamentöse Pilzzelle, welche in der Lage ist, ein Hemoprotein herzustellen, umfassend das Einführen in eine filamentöse Pilzzelle von (i) einer oder mehreren Kopien einer Nucleinsäuresequenz, welche das Hemoprotein kodiert; und (ii) einer oder mehreren ersten Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines heme-biosynthetischen Enzyms, welches durch eine erste Nucleinsäuresequenz endogen in der filamentösen Pilzzelle, zu steuern, wobei die eine oder mehreren der ersten Kontrollsequenzen funktionsfähig mit der ersten Nucleinsäuresequenz verknüpft sind; und/oder (iii) einer oder mehreren Kopien von einer oder mehreren zweiten Nucleinsäuresequenzen, welche ein heme-biosynthetisches Enzym kodieren.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten filamentösen Pilzzelle, umfassend das Einführen in eine rekombinante filamentöse Pilzzelle von (i) einer oder mehreren Kopien einer Nucleinsäuresequenz, welche ein Hemoprotein kodiert; und (ii) einer oder mehreren ersten Kontrollsequenzen, welche in der Lage sind, die Expression eines heme-biosynthetischen Enzyms zu steuern, welches durch eine erste Nucleinsäuresequenz endogen in der filamentösen Pilzzelle ist, kodiert wird, wobei die eine oder mehreren Kontrollsequenzen funktionsfähig mit der ersten Nucleinsäuresequenz verknüpft sind; und/oder (iii) einer oder mehreren Kopien von einer oder mehreren zweiten Nucleinsäuresequenzen, welche ein heme-biosynthetisches Enzym kodieren.