ES2908463T3 - Constructos de expresión y métodos de modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas - Google Patents

Abstract

Una célula de levadura Pichia metilotrófica que comprende: a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional Mxr1 operativamente unido a al menos un elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1); y b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de las globinas PF00042 operativamente unido a al menos un elemento de AOX1; y c) una molécula recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de hemo seleccionado del grupo que consiste en ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa, y ferroquelatasa, operativamente unido a al menos un elemento promotor inducible por metanol.

Description

DESCRIPCIÓN

Constructos de expresión y métodos de modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas

Campo técnico

Esta descripción se refiere generalmente a constructos de ADN y a métodos de uso de tales constructos de ADN para modificar por ingeniería genética levaduras metilotróficas.

Antecedentes

Se usan habitualmente levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris para la expresión de proteínas recombinantes. Se describen constructos que pueden usarse para expresar eficazmente uno o más polipéptidos en una levadura Pichia metilotrófica en la presente descripción (pero no se reivindican como tal).

Krainer y col. (Microbial Cell Factories (2015) 14:4) describe la expresión de la peroxidasa de rábano picante de la proteína hemo, junto con una ruta de biosíntesis de hemo modificada por ingeniería en P. pastoris usando el sistema promotor de AOX1 inducible por metanol.

Liu y col. (Metabolic Engineering 21 (2014) págs. 9-16) describen la expresión de hemoglobina humana en Saccharomyces cerevisiae que tiene una ruta de biosíntesis modificada por ingeniería para la síntesis de hemo.

El documento WO 2015/153666 A1 describe réplicas de carne que pueden contener una proteína que contiene hemo.

El documento WO 2014/008729 A1 describe un método para eliminar la dependencia del promotor inducido por metanol en una única fuente de carbono de metanol para expresar un polipéptido foráneo. El método comprende activar la expresión del promotor que requiere inducción por metanol aumentando la cantidad de expresión de polipéptido Mit1 en células de levadura metilotrófica, de tal manera que el promotor que dependía originariamente de la inducción por metanol ya no depende únicamente de un metanol y también puede expresar un polipéptido foráneo.

Lin-Cergeino y col. (Molecular and Cellular Biology 26:3 (2006) págs. 883-897) identificaron Mxr1p como regulador clave de la ruta de utilización de metanol y genes peroxisómicos en Pichia pastoris.

“ Notification For Soybean Leghemoglobin Protein Derived from Pichia Pastoris.” , IMPOSSIBLE FOODS. GRAS, 14 de septiembre de 2014, es una presentación de expediente de registro que contiene datos de seguridad alimentaria para leghemoglobina de soja recombinante.

El documento EP 2 058 398 A1 describe la producción de hemoglobina humana recombinante usando levadura Pichia y un vector de expresión que utiliza el promotor de AOX1.

Sumario

Esta descripción describe el uso de cepas de P. pastoris que sobreexpresan el activador transcripcional, Mxr1, a partir del promotor de AOX1 para aumentar la expresión de transgenes que también se expresan a partir del promotor de AOX1, lo que mejora significativamente la producción recombinante de una o más proteínas. Además, la expresión de Mxr1 a partir del promotor de AOX1 crea un bucle de retroalimentación positiva que permite la expresión de otros transgenes a partir del promotor de AOX1 en ausencia de metanol, el inductor obligatorio normalmente, cuando se agotan las fuentes de carbono de represión. La expresión de Mxr1 da como resultado un aumento significativo de la cantidad de proteína producida.

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un primer aspecto, se proporciona una célula de levadura Pichia metilotrófica, que comprende:

a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional Mxr1 operativamente unido a al menos un elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1); y

b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de las globinas (PF00042) operativamente unido a al menos un elemento de AOX1; y

c) una molécula recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de hemo seleccionado del grupo que consiste en ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa y ferroquelatasa, operativamente unido a al menos un elemento promotor inducible por metanol.

Una levadura Pichia metilotrófica representativa es Pichia pastoris.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante se integra de manera estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante se expresa de manera extracromosómica a partir de un plásmido competente para la replicación.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional Mxr1 comprende una secuencia de Mxr1 de Pichia pastoris. Un ácido nucleico representativo que codifica para un activador transcripcional se muestra en DQ395124. Un activador transcripcional representativo tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en ABD57365.

En algunas realizaciones, el elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) es de Pichia pastoris.

La célula de levadura Pichia metilotrófica incluye además una molécula de ácido nucleico que incluye al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido operativamente unido a al menos un elemento promotor inducible por metanol. El al menos un ácido nucleico heterólogo codifica para uno o más polipéptidos implicados en la biosíntesis de hemo que se seleccionan de ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa y ferroquelatasa. Los polipéptidos implicados en la biosíntesis de hemo se unen a al menos un elemento promotor inducible por metanol.

En un segundo aspecto, se proporciona un método para expresar un polipéptido heterólogo en una célula. Un método de este tipo incluye proporcionar una célula de levadura metilotrófica según el primer aspecto; y cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante, expresando de este modo el miembro de la familia de las globinas, PF00042.

En algunas realizaciones, las condiciones en las que se cultivan las células incluyen la adición de hierro o una sal farmacéuticamente aceptable o metabólicamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la etapa de introducción incluye una técnica tal como transducción, electroporación, suministro de partículas biolísticas o transformación química. En algunas realizaciones, la etapa de cultivo incluye cultivar la célula en presencia de metanol.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entendería habitualmente el experto en la técnica a la que pertenecen los métodos y las composiciones de materia. Aunque pueden usarse materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción en la práctica o las pruebas de los métodos y las composiciones de materia, se describen a continuación materiales y métodos adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Descripción de los dibujos

La figura 1 es un esquema que representa las etapas implicadas en la ruta de biosíntesis de hemo.

La figura 2 son esquemas de plásmidos usados en la construcción de la cepa de producción MXY0183.

La figura 3 es un esquema que muestra la generación de las cepas de producción, MXY0183 y MXY0207, a partir de la cepa parental, Bg11.

La figura 4 son esquemas que muestran los plásmidos pGAB y pMx354.

La figura 5 es un esquema que muestra la generación de las cepas de producción libres de selección con antibióticos, MXY0291 y MXY0338, a partir de la cepa parental, Bg 11.

La figura 6 es un esquema de los fragmentos lineales de ADN que contienen Mxr1 y var 3 de LegH que se introdujeron mediante cotransformación para preparar la cepa MXY0291 de producción.

La figura 7 es un esquema que muestra el constructo lineal que expresa LegH bajo el control de promotores constitutivos distintos de pAOX1 de Pichia nativos.

La figura 8 es una fotografía que muestra los cambios fenotípicos asociados con la cepa, MXY0183. Se muestran matraces de agitación al inicio de la inducción (0 h) y a las 72 h tras la inducción. 1, MXY0051; 2, MXY0118; 3, MXY0183.

La figura 9 muestra la producción de LegH a partir de las cepas de P. pastoris modificadas. El panel A es un gel de SDS que muestra los lisados de cepas de P. pastoris hechas crecer en matraces de agitación: 51, MXY0051; 118, MXY0118; 183, MXY0183. El panel B es una tabla que compara la producción de LegH a partir de las cepas MXY0118, MXY0183 y MXY0207.

La figura 10 muestra datos de experimentos con la cepa MXY0206. El panel A es una fotografía de cultivos en matraz de agitación de las cepas MXY0183 (izquierda) y MXY0206 (derecha) después de 48 h de crecimiento en la fuente de carbono de represión. El panel B es una fotografía de los sedimentos celulares a partir de cultivos en matraz de agitación de las cepas MXY0183 (izquierda) y MXY0206 (derecha) después de 48 h de crecimiento en medios BMY. El panel C es un gráfico que muestra el rendimiento relativo de LegH cargada con hemo (en ausencia de cualquier agente de inducción).

La figura 11 es una tabla resumen que muestra rendimientos relativos de cepas descritas en la presente descripción cuando se hacen crecer en presencia de metanol con glicerol o metanol con glucosa en tanques de fermentador de 2 l.

Descripción detallada

Se describen constructos de ácido nucleico (pero no se reivindican como tales) en la presente descripción que permiten modificar por ingeniería genética una célula para aumentar la expresión recombinante de un polipéptido. En algunas variantes, se describen constructos de ácido nucleico (pero no se reivindican como tales) en la presente descripción que permiten modificar por ingeniería genética una célula para aumentar la expresión recombinante de un polipéptido a partir de un promotor inducible en ausencia de la molécula de inducción. Sin estar limitado por ningún mecanismo particular, los métodos descritos en la presente descripción crean un bucle de retroalimentación positiva donde la expresión nativa de bajo nivel de un activador transcripcional induce un promotor que está operativamente unido a un activador transcripcional. Esto conduce a una expresión aumentada del activador transcripcional, así como a uno o más polipéptidos diana que están operativamente unidos al mismo promotor inducible.

Se describen constructos de ácido nucleico (pero no se reivindican como tales) en la presente descripción que permiten modificar por ingeniería genética una célula de levadura metilotrófica. Aunque los métodos se ilustran en la presente descripción usando una especie de Pichia (es decir, P. pastoris), pueden usarse otras especies del género Pichia.

La modificación por ingeniería genética de una célula de levadura metilotrófica incluye típicamente la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante en la célula. Como se describe en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye típicamente un ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional operativamente unido a al menos un elemento promotor inducible.

Las moléculas de ácido nucleico recombinante usadas en los métodos descritos en la presente descripción son típicamente ADN, pero pueden usarse moléculas de ARN en las circunstancias apropiadas. Como se usa en la presente descripción, “exógeno” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula de una fuente externa, donde la fuente externa puede ser la misma o un organismo diferente o un ácido nucleico generado sintéticamente. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede ser un ácido nucleico de un microorganismo (por ejemplo, un género o una especie de levadura metilotrófica) que se introduce en un género o una especie diferente de levadura metilotrófica, sin embargo, un ácido nucleico exógeno también puede ser un ácido nucleico de una levadura metilotrófica que se introduce de manera recombinante en una levadura metilotrófica como copia adicional a pesar de la presencia de una secuencia de ácido nucleico nativa correspondiente. Por ejemplo, P. pastoris contiene un ácido nucleico endógeno que codifica para un activador transcripcional Mxr1; un ácido nucleico de Mxr1 de P. pastoris adicional (por ejemplo, introducido de manera recombinante en P. pastoris) o modificar el ácido nucleico de Mxr1 de P. pastoris endógeno se considera exógeno.

Se conocen en la técnica activadores transcripcionales y ácidos nucleicos que codifican para activadores transcripcionales (por ejemplo, ácidos nucleicos exógenos que codifican para activadores transcripcionales). Por ejemplo, un activador transcripcional de Pichia pastoris es la secuencia de Mxr1. Puede encontrarse una secuencia de ácido nucleico de Mxr1 de P. pastoris representativa, por ejemplo, en el n.° de registro de GenBank DQ395124, mientras que puede encontrarse una secuencia de polipéptido de Mxr1 de P. pastoris representativa, por ejemplo, en el n.° de registro de GenBank ABD57365.

Los activadores transcripcionales tales como Mxr1 pueden expresarse normalmente a niveles bajos. Por lo tanto, es deseable colocar el ácido nucleico exógeno (es decir, el activador transcripcional) bajo el control de un promotor que es inducible. Como se usa en la presente descripción, “operativamente unido” significa que un promotor u otro(s) elemento(s) de expresión se sitúa(n) en relación con una secuencia codificante de ácido nucleico de tal manera que dirija o regule la expresión del ácido nucleico (por ejemplo, en marco).

Hay varios promotores inducibles que pueden usarse cuando se modifican por ingeniería genética levaduras metilotróficas. Por ejemplo, puede usarse un promotor inducible por metanol, o un elemento promotor del mismo. En la presente invención, se usa al menos un elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1), que se transcribe fuertemente en respuesta a metanol.

Un experto en la materia entendería que la molécula de ácido nucleico recombinante descrita (pero no reivindicada como tal) puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica, o puede expresarse de manera extracromosómica a partir de un plásmido competente para la replicación. Los métodos para lograr ambos se conocen bien y se usan habitualmente en la técnica.

Como se demuestra en la presente descripción, los activadores transcripcionales regulados por metanol en Pichia pueden unirse al promotor de AOX1 y actuar cooperativamente con Mxr1 para activar la transcripción a partir del promotor de AOX1. En algunas realizaciones, dos activadores transcripcionales regulados por metanol (por ejemplo, Mxr1 y Mit1) pueden unirse operativamente a un elemento promotor inducible por metanol.

Una cepa que incluye una molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en la presente descripción puede usarse para regular (por ejemplo, sobreexpresar) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de las globinas (PF00042) operativamente unido a al menos un elemento de AOX1 en la célula de levadura metilotrófica. Una segunda molécula de ácido nucleico recombinante puede incluir, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de interés. De manera similar al ácido nucleico exógeno que codifica para el activador transcripcional, un ácido nucleico heterólogo se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no sea nativa para el genoma o en el genoma de un organismo (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico de un microorganismo (por ejemplo, un género o una especie de levadura metilotrófica) que se introduce en un género o una especie diferente de levadura metilotrófica).

Los ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el uno o más polipéptidos de interés comprenden un ácido nucleico que codifica para al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de un cofactor hemo, seleccionado de ácidos nucleicos que codifican para las 8 enzimas diferentes implicadas en la biosíntesis de hemo como se determina y se anota a partir de la secuencia del genoma de Pichia pastoris, que son ácidos nucleicos heterólogos que codifican para ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa y ferroquelatasa. Para la modificación por ingeniería genética de levaduras metilotróficas para que contengan más de un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, transgenes), una combinación de promotores inducibles por metanol y constitutivos, o elementos de los mismos, puede combinarse para aumentar adicionalmente la expresión de tales ácidos nucleicos.

Estudios anteriores en Saccharomyces cerevisiae identificaron la ALA deshidratasa y la porfobilinógeno desaminasa como enzimas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de hemo (véase, por ejemplo, Hoffman y col., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 310(4):1247-53). Sin embargo, la expresión heteróloga de enzimas de hemo individuales en P. pastoris a partir del promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) no logró superar las limitaciones asociadas con la expresión de una proteína recombinante que contiene un cofactor hemo (véase Krainer y col., 2015, Microb. Cell Fact., 13;14-4). Como se describe en la presente descripción, la expresión altamente eficiente de una proteína que contiene hemo recombinante en P. pastoris se logró coexpresando toda la ruta de biosíntesis de hemo a partir de promotores inducibles por metanol, aunque se apreciaría que uno o más de los genes implicados en la ruta de biosíntesis de hemo podrían expresarse a partir de uno o más promotores constitutivos.

Además de las enzimas implicadas en la biosíntesis del cofactor de hierro, se entiende que está presente un ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de proteínas globinas (PF00042 en la base de datos de Pfam) que incluye hemoglobinas vegetales. En los ejemplos en la presente descripción, se presenta un ácido nucleico que codifica para leghemoglobina de soja (LegH). LegH es una proteína que se une al cofactor de hierro, hemo, lo que da como resultado una absorción característica a 415 nm y un color rojo distintivo. La proteína LegH (también conocida como LGB2) se encuentra de manera natural en nódulos radicales de soja (véase, por ejemplo, el n.° de registro de UniprotKB P02236), y la secuencia de ácido nucleico usada en la presente descripción se optimizó con codones para la expresión en P. pastoris. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2014/110539 y WO 2014/110532.

Un ácido nucleico heterólogo adicional que codifica para un polipéptido de interés puede ser, por ejemplo, y sin limitación, una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa o un anticuerpo contra cualquiera de tales polipéptidos. En otras realizaciones, un ácido nucleico heterólogo puede codificar para una o más enzimas implicadas en la ruta para la producción de moléculas pequeñas, tales como etanol, ácido láctico, butanol, ácido adípico o ácido succínico.

De manera similar al ácido nucleico exógeno que codifica para el activador transcripcional, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de interés puede unirse operativamente a un elemento promotor inducible (por ejemplo, un elemento promotor inducible por metanol), o el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de interés puede unirse operativamente a un promotor constitutivo o elemento promotor constitutivo. Los promotores inducibles y elementos de los mismos se han analizado anteriormente. Se conocen en la técnica promotores constitutivos y los elementos promotores constitutivos. Por ejemplo, un promotor constitutivo usado habitualmente de P. pastoris es el promotor, o una parte del mismo, del gen del factor de elongación transcripcional EF-1a (TEF1), que se transcribe fuertemente de manera constitutiva. Sin embargo, pueden usarse otros promotores constitutivos, o elementos promotores de los mismos incluyendo, sin limitación, el promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de P. pastoris (véase, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank U62648.1), el promotor de la posible proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol (Gpi), GCW14p (PAS_chr 1-4_0586), de P. pastoris (véase, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank XM_002490678), o el promotor del gen de la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK1) de P. pastoris (véase, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank AY288296).

De manera similar a la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente descripción, la segunda molécula de ácido nucleico recombinante puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica, o puede expresarse de manera extracromosómica a partir de un plásmido competente para la replicación.

El experto en la materia entenderá que puede combinarse una combinación de promotores inducibles (por ejemplo, inducibles por metanol) y constitutivos (o elementos promotores de los mismos) para aumentar adicionalmente la expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos operativamente unidos al mismo.

Un experto en la materia apreciará que un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de interés operativamente unido a un elemento promotor puede separarse de la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente descripción, o puede ser contigua al ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional operativamente unido a un elemento promotor contenido dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente descripción. Un experto en la materia también apreciará que, si la segunda molécula de ácido nucleico es contigua a la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente descripción, que un único promotor, o elemento promotor del mismo, puede usarse para dirigir la transcripción de ambos o todos los genes (por ejemplo, el ácido nucleico exógeno que codifica para el activador transcripcional, así como el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el polipéptido o polipéptidos de interés).

Se conocen en la técnica métodos de introducción de ácidos nucleicos en células de levaduras metilotróficas e incluyen, sin limitación, transducción, electroporación, suministro de partículas biolísticas y transformación química.

Además, se conocen en la técnica métodos de cultivo de células de levaduras metilotróficas. Véase, por ejemplo, Pichia Protocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg, Ed., 2007, 2a Ed., Humana Press, Inc. En algunas circunstancias, puede ser deseable introducir o añadir metanol a los medios de cultivo, aunque, como se demuestra en la presente descripción, no se requiere metanol para obtener una expresión eficiente a altos niveles de uno o más polipéptidos de interés. En algunas circunstancias (por ejemplo, cuando se expresan uno o más ácidos nucleicos que codifican para enzima(s) implicada(s) en una biosíntesis de cofactores de hierro), puede ser deseable complementar el medio de cultivo con hierro o una sal farmacéuticamente aceptable o metabólicamente aceptable (o GRAS) del mismo.

Las cepas de Pichia pueden crecer en metanol como única fuente de carbono. La utilización de metanol se inicia mediante la conversión de metanol en formaldehído mediante la acción de la alcohol oxidasa. La levadura metilotrófica, Pichia pastoris, contiene dos genes para las alcohol oxidasas, AOX1 y AOX2. Las cepas con actividad alcohol oxidasa reducida (“ utilización de metanol lenta” o cepas MutS) a menudo producen más de una proteína recombinante expresada a partir del promotor de AOX1 que las cepas que no tienen actividad alcohol oxidasa reducida. Las cepas mutadas en ambos genes AOX y que carecen completamente de actividad alcohol oxidasa no pueden metabolizar el metanol, pero todavía pueden inducirse para la expresión a partir del promotor de AOX1 por metanol. Estas cepas retienen la capacidad de usar otras fuentes de carbono para el crecimiento, pero todavía expresan proteínas heterólogas a partir del promotor de AOX1 tras la adición de metanol. Debido a que estas cepas no metabolizan metanol (“ menos utilización de metanol” o cepas Mut), se requiere mucho menos metanol para la inducción de la expresión de proteínas, y las cepas que portan estas mutaciones evitan problemas relacionados con la alimentación de metanol en fermentaciones a gran escala. Véase, por ejemplo, Chiruvolu y col., 1997, Enzyme Microb. Technol., 21:277-83. Se determinó en la presente descripción que la expresión de LegH a partir del promotor de AOX1 en cepas Mut mejoró considerablemente el rendimiento de LegH. Por lo tanto, puede usarse una levadura metilotrófica que tiene una mutación tanto en el gen AOX1 como en el gen AOX2 en los métodos descritos en la presente descripción.

La proteína de interés, o un complejo que incluye una o más proteínas de interés (por ejemplo, LegH unida a hemo, una deshidrina, una fitasa, una proteasa, una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa o un anticuerpo) pueden purificarse a partir de las células de levadura. Se conocen en la técnica métodos de purificación de polipéptidos. Como se usa en la presente descripción, un polipéptido “ purificado” es un polipéptido que se ha separado o purificado de componentes celulares que lo acompañan de manera natural. Típicamente, el polipéptido se considera “ purificado” cuando está libre en al menos el 70 % (por ejemplo, al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 99 %) en peso seco, de los polipéptidos y las moléculas que se producen de manera natural con los que está asociado de manera natural. Dado que un polipéptido que se sintetiza químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de manera natural, un polipéptido sintético está “purificado”

Como se usa en la presente descripción, los ácidos nucleicos pueden incluir ADN y ARN, e incluye ácidos nucleicos que contienen uno o más análogos de nucleótido o modificaciones de la cadena principal. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, lo que depende generalmente de su uso previsto. También se proporcionan ácidos nucleicos y polipéptidos que difieren de una secuencia dada. Los ácidos nucleicos y polipéptidos pueden tener una identidad de secuencia de al menos el 50 % (por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 %) con una secuencia de ácido nucleico o polipéptido dada.

Al calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácido entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide entre la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácido alineados) y se multiplica por 100 para llegar a un porcentaje de valor de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una parte de una o ambas secuencias hasta el tamaño de longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una única secuencia puede alinearse con más de otra secuencia y, por lo tanto, puede tener diferentes valores de identidad de secuencia en porcentaje en cada región alineada.

La alineación de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse usando el programa informático ClustalW y los parámetros por defecto, lo que permite que las alineaciones de secuencias de ácido nucleico o de polipéptido se lleven a cabo a través de toda su longitud (alineación global). Chenna y col., 2003, Nucleic Acids Res., 31 (13):3497-500. ClustalW calcula la mejor coincidencia entre una secuencia de consulta y una o más secuencias objetivo, y las alinea de modo que pueden determinarse identidades, similitudes y diferencias. Pueden insertarse huecos de uno o más residuos en una secuencia de consulta, una secuencia objetivo, o ambas, para maximizar alineaciones de secuencia. Para la alineación por parejas rápida de secuencias de ácido nucleico, pueden usarse los parámetros por defecto (es decir, tamaño de palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización por hueco: 5); para una alineación de múltiples secuencias de ácido nucleico, pueden usarse los siguientes parámetros: penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de hueco: 5,0; y transiciones de peso: sí. Para la alineación por parejas rápida de secuencias de polipéptido, pueden usarse los siguientes parámetros: tamaño de palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; y penalización por hueco: 3. Para la alineación múltiple de secuencias de polipéptido, pueden usarse los siguientes parámetros: matriz de pesos: Blosum; penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de hueco: 0,05; huecos hidrófilos: activado; residuos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; y penalización por hueco específico de residuo: activado. ClustalW puede ejecutarse, por ejemplo, en el sitio web de inicio de Search Launcher de la Escuela de Medicina de Baylor o en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática en la malla mundial.

Pueden introducirse cambios en una molécula de ácido nucleico, lo que conduce de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Por ejemplo, pueden introducirse cambios en secuencias codificantes de ácido nucleico usando mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR) o sintetizando químicamente una molécula de ácido nucleico que tiene tales cambios. Tales cambios de ácido nucleico pueden conducir a sustituciones de aminoácidos conservativas y/o no conservativas en uno o más residuos de aminoácido. Una “ sustitución de aminoácidos conservativa” es aquella en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido diferente que tiene una cadena lateral similar (véase, por ejemplo, Dayhoff y col. (1978, en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 (Supl. 3):345-352), que proporciona tablas de frecuencias para sustituciones de aminoácidos), y una sustitución no conservativa es aquella en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que no tiene una cadena lateral similar. Las secuencias de ácido nucleico y/o de polipéptido pueden modificarse como se describe en la presente descripción para mejorar una o más propiedades incluyendo, sin limitación, expresión aumentada (por ejemplo, transcripción y/o traducción), regulación más estricta, desregulación, pérdida de represión de catabolitos, modificación de especificidad, secreción, termoestabilidad, estabilidad frente a disolventes, estabilidad oxidativa, resistencia a proteasas, actividad catalítica y/o color.

Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico “ aislada” es una molécula de ácido nucleico que está libre de secuencias que flanquean de manera natural uno o ambos extremos del ácido nucleico en el genoma del organismo a partir del cual se deriva la molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, un ADNc o fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o digestión con endonucleasas de restricción). Tal molécula de ácido nucleico aislada se introduce generalmente en un vector (por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión) por conveniencia de manipulación o para generar una molécula de ácido nucleico de fusión, analizada en mayor detalle a continuación. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico modificada por ingeniería tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.

Pueden aislarse ácidos nucleicos usando técnicas rutinarias en la técnica. Por ejemplo, pueden aislarse ácidos nucleicos usando cualquier método incluyendo, sin limitación, tecnología de ácido nucleico recombinante y/o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las técnicas generales de PCR se describen, por ejemplo, en PCR Primer; A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Las técnicas de ácido nucleico recombinante incluyen, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción y ligamiento, que pueden usarse para aislar un ácido nucleico. Los ácidos nucleicos aislados también pueden sintetizarse químicamente, o bien como una única molécula de ácido nucleico o bien como una serie de oligonucleótidos.

Los polipéptidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales (por ejemplo, una muestra biológica) mediante métodos conocidos, tales como intercambio iónico con DEAE, filtración en gel y cromatografía de hidroxiapatita. Un polipéptido también puede purificarse, por ejemplo, expresando un ácido nucleico en un vector de expresión. Además, puede obtenerse un polipéptido purificado mediante síntesis química. El grado de pureza de un polipéptido puede medirse usando cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis mediante HPLC.

Un constructo o vector que contiene un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido) también se describe pero no se reivindica como tal. Los constructos o vectores, incluyendo constructos o vectores de expresión, están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante en la técnica. Un constructo o vector que contiene un ácido nucleico puede tener elementos de expresión operativamente unidos a dicho ácido nucleico, y puede incluir además secuencias tales como las que codifican para un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Un constructo o vector que contiene un ácido nucleico puede codificar para un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, un polipéptido operativamente unido a un polipéptido heterólogo, que puede estar en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido). Polipéptidos heterólogos representativos son aquellos que pueden usarse en la purificación del polipéptido codificado (por ejemplo, etiqueta de 6xHis, glutatión S-transferasa (GST))

Los elementos de expresión incluyen secuencias de ácido nucleico que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácido nucleico. Un ejemplo de un elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de un ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, de levadura, de insecto, de mamífero o viral, y los vectores pueden contener una combinación de elementos de diferentes orígenes.

Los vectores como se describen en la presente descripción pueden introducirse en una célula huésped. Como se usa en la presente descripción, “célula huésped” se refiere a la célula particular en la que se introduce el ácido nucleico y también incluye la progenie de tal célula que porta el vector. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, pueden expresarse ácidos nucleicos en células bacterianas tales como E. coli, o en células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la técnica conocen otras células huésped adecuadas. Muchos métodos para introducir ácidos nucleicos en células huésped, tanto in vivo como in vitro, se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transformación con polietilenglicol (PEG), choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus.

Pueden detectarse ácidos nucleicos usando cualquier número de técnicas de amplificación (véase, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; y las patentes US-4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; y 4.965.188) con un par apropiado de oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores). Se han desarrollado varias modificaciones de la PCR original y pueden usarse para detectar un ácido nucleico.

Los ácidos nucleicos también pueden detectarse usando hibridación. La hibridación entre ácidos nucleicos se analiza con detalle en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; secciones 7.37-7.57, 9.47-9.57, 11.7-11.8 y 11.45-11.57). Sambrook y col., describen condiciones de transferencia de tipo Southern adecuadas para sondas de oligonucleótido de menos de aproximadamente 100 nucleótidos (secciones 11.45-11.46). La Tm entre una secuencia que tiene menos de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia puede calcularse usando la fórmula proporcionada en la sección 11.46. Sambrook y col., además, describen condiciones de transferencia de tipo Southern para sondas de oligonucleótido de más de aproximadamente 100 nucleótidos (véanse las secciones 9.47-9.54). La Tm entre una secuencia de más de 100 nucleótidos de longitud y una segunda secuencia puede calcularse usando la fórmula proporcionada en las secciones 9.50-9.51 de Sambrook y col.

Las condiciones en las que se prehibridan e hibridan membranas que contienen ácidos nucleicos, así como las condiciones en las que se lavan membranas que contienen ácidos nucleicos para eliminar la sonda unida de manera no específica y en exceso, pueden desempeñar un papel significativo en la rigurosidad de la hibridación. Tales hibridaciones y lavados pueden realizarse, cuando sea apropiado, en condiciones de rigurosidad moderada o alta. Por ejemplo, las condiciones de lavado pueden hacerse más rigurosas disminuyendo la concentración de sal en las disoluciones de lavado y/o aumentando la temperatura a la que se realizan los lavados. Simplemente a manera de ejemplo, las condiciones de alta rigurosidad incluyen típicamente un lavado de las membranas en SSC 0,2x a 65 °C.

Además, interpretar la cantidad de hibridación puede verse afectada, por ejemplo, por la actividad específica de la sonda de oligonucleótido marcada, por el número de sitios de unión a la sonda en el ácido nucleico molde al que se ha hibridado la sonda, y por la cantidad de exposición de una autorradiografía u otro medio de detección. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que aunque puede usarse cualquier número de condiciones de hibridación y lavado para examinar la hibridación de una molécula de ácido nucleico sonda a ácidos nucleicos diana inmovilizados, es más importante examinar la hibridación de una sonda a ácidos nucleicos diana en condiciones idénticas de hibridación, lavado y exposición. Preferiblemente, los ácidos nucleicos diana están en la misma membrana.

Se considera que una molécula de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico pero no a otro ácido nucleico si la hibridación con un ácido nucleico es al menos 5 veces (por ejemplo, al menos 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces) mayor que la hibridación a otro ácido nucleico. La cantidad de hibridación puede cuantificarse directamente en una membrana o a partir de una autorradiografía usando, por ejemplo, un sistema PhosphorImager o un densitómetro (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Pueden detectarse polipéptidos usando anticuerpos. Las técnicas para detectar polipéptidos usando anticuerpos incluyen ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), inmunotransferencias de tipo Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Un anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Puede generarse un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica para un polipéptido usando métodos que se conocen bien en la técnica. El anticuerpo puede unirse a un soporte sólido tal como una placa de microtitulación usando métodos conocidos en la técnica. En presencia de un polipéptido, se forma un complejo anticuerpo-polipéptido.

La detección (por ejemplo, de un producto de amplificación, un complejo de hibridación o un polipéptido) se logra generalmente usando marcadores detectables. El término “ marcador” pretende abarcar el uso de marcadores directos así como marcadores indirectos. Los marcadores detectables incluyen enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos.

Se describen métodos en la presente descripción (pero no se reivindican como tales) que pueden usarse para generar una cepa que carece de secuencias para la selección (es decir, que carece de un marcador seleccionable). Estos métodos incluyen el uso de un vector de ADN de plásmido circular y una secuencia de ADN lineal; el vector de ADN de plásmido circular contiene un marcador de selección y un origen de replicación de ADN (también conocido como una secuencia de replicación autónoma (ARS)), y la secuencia de ADN lineal contiene secuencias para la integración en el genoma de Pichia mediante recombinación homóloga. La molécula de ADN lineal puede incluir adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas de interés tales como, sin limitación, legH unida a hemo, una deshidrina, una fitasa, una proteasa una catalasa, una lipasa, una peroxidasa, una amilasa, una transglutaminasa, una oxidorreductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una ligasa, una o más enzimas implicadas en la ruta para la producción de moléculas pequeñas, tales como etanol, ácido láctico, butanol, ácido adípico o ácido succínico, o un anticuerpo contra cualquiera de tales proteínas.

Pueden transformarse células de Pichia tanto con moléculas de ADN como con transformantes seleccionados por la presencia del marcador seleccionable en el plásmido circular. Los transformantes pueden cribarse luego por la integración de la molécula de ADN lineal en el genoma usando, por ejemplo, PCR. Una vez que se identifican transformantes con la integración correcta de la molécula de ADN lineal libre de marcador, las células pueden hacerse crecer en ausencia de selección para el plásmido circular. Debido a que el plásmido portador de marcador no se mantiene estable en ausencia de selección, el plásmido se pierde, a menudo muy rápidamente, después de relajarse la selección. La cepa resultante porta el ADN lineal integrado en ausencia de secuencias heterólogas para la selección. Por lo tanto, este enfoque puede usarse para construir cepas de Pichia que carecen de un marcador seleccionable (por ejemplo, un marcador de selección heterólogo) con poco o ningún impacto sobre el rendimiento de la proteína recombinante.

Según la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los métodos y las composiciones de materia descritos en las reivindicaciones.

Ejemplos

Parte A. Materiales y métodos

Ejemplo 1— Reacción en cadena de la polimerasa

Se amplificaron genes de interés a partir de moldes de ADN genómico o de ADN de plásmido usando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs). Brevemente, se incuban 0,6 pM de cada uno de los cebadores directo e inverso con 10-50 ng de ADN molde y 400 pM de mezcla de nucleótidos en presencia de 1-2 U de ADN polimerasa Phusion. Las condiciones de reacción fueron las siguientes:

Ejemplo 2— Construcción del plásmido mediante ligamiento

Se incubaron 50-100 ng de plásmido digerido con enzimas de restricción y un exceso molar 3 x de insertos amplificados por PCR en presencia de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs). Se llevó a cabo el ligamiento a 16 0C durante más de 2 h. Se transformaron 2 pl de reacción de ligamiento en células de E. co lielectrocompetentes DH10B

Ejemplo 3— Transformación en células competentes resistentes al fago T1 ElectroMax DH10B de E. coli

Se transformaron 1,5-2 pl de mezcla de ligamiento en 20 pl de células competentes resistentes al fago T1 ElectroMax DH10B (Invitrogen, n.° de cat. 12033-015) mediante electroporación usando un instrumento MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV usando una cubeta de 1 mm de espacio (BioRad, n.° de cat. 165-2089); después se añadió un pulso de 1 ml de SOC a las células y se incubaron las células a 37 0C durante 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10 pl de mezcla de recuperación en placas de agar LB que contenían ampicilina a una concentración de 100 pg/ml. Se incubaron las placas durante la noche a 37 0C.

Ejemplo 4— Linealización del ADN de plásmido para la transformación en P. pastoris

Se digirió ADN de plásmido con la endonucleasa de restricción Pmel (New England BioLabs, n.° de cat. R0560L) en tampón CutSmart 1x durante 1-4 horas a 37 0C o endonucleasa de restricción Sfil en tampón CutSmart 1x durante 1-4 horas a 50 0C (New England BioLabs, n.° de cat. R0123L). Se purificó en gel el plásmido linealizado a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, n.° de cat. D4002). Se eluyó el A^d N en 20 pl de H2O.

Ejemplo 5— Preparación de células competentes para la transformación en P. pastoris

Se hicieron crecer cepas seleccionadas de P. pastoris hasta una fase de crecimiento exponencial media (~2 de DO) en 25 ml de medio YPD. Se recogieron las células mediante centrifugación a 930 x g durante 15 minutos. Se resuspendió el sedimento celular en 2 ml de una disolución de YPD al 80 % y HEPES 200 mM, pH 6,8. Se añadieron 75 pl de DTT 1 M. Se mezcló el sedimento celular resuspendido a 100 rpm a 30 0C durante 25 minutos. Se añadió un volumen de 40 ml de agua estéril, enfriada con hielo a la suspensión, y se recogieron las células mediante centrifugación a 1125 x g durante 15 minutos y se pusieron en hielo. Se resuspendió el sedimento celular en 40 ml de agua enfriada con hielo y se recogió como antes para dos etapas de lavado adicionales. Luego se resuspendió el sedimento celular en 20 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo y se recogió mediante centrifugación como antes. Se suspendió el sedimento celular final en 0,3 ml de sorbitol estéril, enfriado con hielo, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 0C.

Ejemplo 6— Transformación en P. pastoris

Se transformaron 30-100 ng de ADN de plásmido linealizado en 30 pl de células de P. pastoris electrocompetentes usando una cubeta GenePulser de 1 mm de espacio (BioRad) con un instrumento GenePulser (BioRad) ajustado a 1,15 kV. Se añadió 1 ml de YPD/sorbitol 1 M y se mezcló a una razón de 1:1 a las células. Se permitió que las células se recuperasen durante 3 h a 30 °C con agitación a 100 rpm. Se sembraron 100 pl de la mezcla de recuperación en una placa de YPD que contenía el antibiótico apropiado, y se sembraron el resto de las células en una placa YPD con el antibiótico apropiado. Se incubaron las placas a 30 °C durante 48 horas. Se sembraron en línea placas de transformación primaria en placas de YPD con el antibiótico apropiado, y se incubaron las placas durante 48 h a 300C. Se parchearon clones individuales en placas de YPD con antibióticos y se usaron los parches para realizar PCR de colonias o preparación de ADNg para confirmar la integración en el cromosoma y para hacer crecer las cepas en matraces de agitación para un análisis adicional.

Ejemplo 7— Crecimiento de cultivos en matraces de agitación para la producción de LegH

Se inoculó una cepa de un parche nuevo en medio de crecimiento BMGY (BMY complementado con glicerol al 0,75 %) y se hizo crecer durante la noche a 30 0C con agitación a 200 rpm. Al día siguiente, se indujo la expresión de LegH con metanol diluyendo el cultivo durante la noche con medio BMMY (BMY metanol al 1 %) complementado con citrato de amonio y Fe (III) 0,1 mM. Se hizo crecer el cultivo hasta una DO600 de 0,5-0,7. Se añadió antiespumante hasta una concentración final del 0,01 %. Se hicieron crecer los cultivos durante 72 horas en total; se complementaron los cultivos con metanol cada 24 horas añadiendo 1/10 de volumen del matraz de agitación de medio BMMY 10x (BMY metanol al 10 %). Se recogieron las células después de 72 h de crecimiento inducido mediante centrifugación.

Ejemplo 8— Medio de matraz de agitación

Se preparó medio BMY disolviendo 10 g de extracto de levadura y 20 g de Soytone en 790 ml de agua. Se esterilizó la mezcla mediante tratamiento en autoclave y se enfrió hasta temperatura ambiente. Se sometieron a esterilzación por filtración (PES de tamaño de poro de 0,2 pm) 100 ml de tampón de fosfato de potasio 1 M (pH 6,0) y 100 ml de base nitrogenada de levadura 10x sin aminoácidos (13,4 g de polvo de YNB por 100 ml; Sigma-Aldrich) y se añadió al medio. No se requiere ajuste del pH.

Componentes de medios BMY

Se disolvieron en agua los siguientes componentes, y se sometieron a tratamiento en autoclave para esterilizarlos. Medio de baja osmolaridad para matraz de agitación

Ejemplo 9— Alimentaciones y medio de fermentación

Se disolvieron los componentes indicados a continuación y se enrasó con agua. Los componentes eran de calidad alimentaria FCC o equivalente. Se esterilizó el medio mediante tratamiento en autoclave, por medio de esterilización con vapor in situ, o con un equivalente.

Medio de baja osmolaridad con glicerol 95 g/l para fermentación

Después de la esterilización, se permitió que se enfriase el medio hasta temperatura ambiente y se añadió lo siguiente:

La disolución PTM1 de metales traza se comercializan como una mezcla en polvo a partir de Sunrise Science (n.° de cat. 4052-A-B-1L). Se mezclaron la bolsa A y la bolsa B en 950 ml de agua y se añadieron 5 ml de ácido sulfúrico. Se espera cierta precipitación tras mezclar; se sometió la mezcla a esterilización por filtración (PES de 0,2 pm de tamaño de poro) y se almacenó a 4 0C en la oscuridad.

Fórmula de disolución de vitaminas

Alternativamente, puede prepararse la PTM1 de metales traza de la siguiente manera:

Se mezclan los componentes entre sí, se esterilizan por filtración y se almacenan a temperatura ambiente. Se preparó la mezcla de alimentación de glicerol mezclando 17,5 g de AmberFerm 4000 en 320 ml de agua y agitando para disolver. Se añadió la mezcla agua-AmberFerm a 850 g de glicerol y se mezcló bien mediante agitación vigorosa. Se esterilizó la mezcla de alimentación mediante tratamiento en autoclave.

Disolución de alimentación de glicerol

Se preparó la alimentación de metanol usando metanol al 99-100 % complementado con 12 ml/l de disolución PTM1.

Ejemplo 10: Protocolo para la fermentación de alta transferencia de oxígeno a escala de laboratorio

Protocolo de matraz de agitación de siembra

En una campana de bioseguridad aséptica, se mezclaron medio de baja osmolaridad y BMY en una razón de medio de baja osmo.:BMY de 9:1. Se añadió glicerol, a una concentración de 12,5 g/l, al medio. Se usó glicerol/glicerina de calidad alimentaria USP (pureza del 99,7 % en una disolución de glicerol/agua al 50 % v/v (63 % p/p) y se sometió a tratamiento en autoclave para esterilizarlo. Se añadió Sigma 204 o un antiespumante equivalente al medio a una concentración de 0,25 ml/l. Se recuperaron viales de siembra de glicerol, se pulverizaron fuera con etanol o IPA al 70 % y se descongelaron dentro de una campana de bioseguridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min. Se inocularon matraces de agitación con deflectores con viales de siembra de glicerol; se usaron 1 ml de vial de inóculo cada 1 l de medio de matraz de agitación. Se hicieron crecer los cultivos a 30 0C durante 24 horas con agitación (200 rpm con una carrera de 1"). Se usó una razón de entre 1:10 y 1:5 del volumen del medio real:volumen de matraz de agitación nominal. Se usaron habitualmente con éxito un matraz de volumen nominal de 2,8 l con de 250 a 500 ml de medio. Se midió la DO a 600 nm después de 24 horas de crecimiento; si la DO era de 15 o mayor, se usó el cultivo para inocular un fermentador. Si la DO era menor de 15, se hizo crecer el cultivo durante 1-2 horas más antes de determinar la DO de nuevo. Si no se alcanzó una DO de 15 después de 15 a 30 horas, se consideró que el matraz de siembra había fallado.

Protocolo de fermentación

Se prepararon las alimentaciones y el medio de fermentación como se describe en la presente descripción. El volumen inicial debe ser de aproximadamente el 40 % del volumen máximo del fermentador, por ejemplo, 4 l, si el volumen de trabajo máximo del fermentador es de 10 l. Esto se debe a que el proceso se aproximará al volumen de trabajo máximo al final de la fermentación. Se inocula el fermentador con simiente en matraz de agitación al 10 % de la razón de inóculofermentador, por ejemplo, si están presentes 4 l de medio inicial en el fermentador, se inocula el fermentador con aproximadamente 0,4 l de simiente de matraz de agitación. El volumen total en el fermentador en este punto se denomina volumen T0, por ejemplo, 4,4 l en este ejemplo representativo. Los controles de proceso incluyen lo siguiente: temperatura de 30 ‘ C; oxígeno disuelto controlado por cascada de agitación-aireación para mantener un punto de consigna de saturación del 20 %; y pH controlado mediante la adición de NH4OH al 28 %, el punto de consigna dependerá de la fase del proceso.

Fase discontinua (desde la inoculación hasta el agotamiento del glicerol, señalizado por el aumento brusco de DO): Dependiendo de la capacidad de respuesta del control de PID para el oxígeno disuelto, puede observarse un fuerte aumento brusco de DO o una rápida disminución de las velocidades de agitación-aireación o una combinación de ambos cuando las células agotan el glicerol presente en el medio. La fase discontinua de alimentación se inicia cuando sucede esto. La duración de la fase discontinua es de aproximadamente 20 horas, pero hasta 24 horas se considera aceptable. El punto de consigna del pH es de 5,0. El peso celular húmedo al final de la fase discontinua será de aproximadamente 220 g/l.

Fase discontinua de alimentación: se inicia la alimentación de glicerol para lograr 12-14 g/l/h de glicerol puro basado en el volumen T0. Se mantuvo la federación hasta alcanzar aproximadamente 350 g/l de peso celular húmedo, lo que debería tardar aproximadamente 7-10 horas. El punto de consigna del pH es de 5,0.

Fase de transición: Se toma una muestra antes de comenzar la fase de transición. Se inició la alimentación de metanol para lograr 1 g/l/h de metanol puro, basado en el volumen T0, hasta que se alcanzó una concentración de metanol de 1­ 2 g/l en el caldo de fermentación. Se ajustó la velocidad de alimentación de metanol durante el resto de la fermentación para mantener una concentración de metanol de 0,25-1 g/l en caldo. Se redujo la federación de glicerol desde 12-14 g/l/h hasta 8-9 g/l/h de glicerol puro, basado en el volumen T0, linealmente en el transcurso de 2 horas. También sería aceptable la reducción gradual de la velocidad de alimentación cada 20 min. Se cambió el punto de consigna del pH a 3,5, y se permitió que la fermentación se ajustase de manera natural al nuevo punto de consigna (es decir, sin adición de ácido).

Fase de producción (desde el final de la rampa de alimentación de glicerol hasta el final de la fermentación): El punto de consigna del pH fue de 3,5. Se mantuvo una concentración de metanol de 0,25-1 g/l en el caldo de fermentación. Se mantuvo la velocidad de alimentación de glicerol a 8-9 g/l/h de glicerol puro, basado en el volumen T0. Se tomaron muestras aproximadamente cada 12 horas. Se centrifugaron las muestras a de 4000 a 7000 FCR a 4 °C, y se decantó el sobrenadante. Se reservó el sobrenadante en un tubo independiente. Se congelaron los sedimentos y 3 muestras de 5 ml de los sobrenadantes en cada punto de tiempo a -80 0C. Si no puede mantenerse una DO del 15-20 % durante la producción, incluso a las velocidades máximas de aireación y agitación para el recipiente, puede reducirse la velocidad de alimentación de glicerol hasta 5 g/l/h de glicerol puro, basado en el volumen T0. La fermentación terminó 60 horas después de la inoculación. A una escala de 1000 l, el proceso de recogida consistió en apagar las alimentaciones y la aireación, enfriar el caldo hasta 8 °C, y concentrar la pasta usando una centrífuga de pila de discos o Sharples. La recogida generalmente tarda aproximadamente 5-10 horas y no incurre en una pérdida detectable de calidad del producto. Para escala de laboratorio, es suficiente recoger, además de 3 muestras de 5 ml, una muestra adicional de 50 ml al final. El peso celular húmedo era > 450 g/l, y los sedimentos centrifugados parecían de color rosa, en oposición a los sedimentos centrifugados de las muestras de preinducción, que parecían de color más blanco. El cambio de color del caldo de color blanco a un rosa más pronunciado comenzó después de aproximadamente 6-12 horas de inducción.

Parte B. Construcción de cepas de producción

Cepa de producción MXY0183

Ejemplo 11— Clonación de cada enzima de la ruta de biosíntesis de hemo en un vector de integración pGAN o pGAZ

Se adquirieron pGAN (con el marcador de selección nat) y pGAZ (con el marcador de selección zeocina) de Biogrammatics, Inc (Carlsbad, CA). Se colocó cada gen bajo el control del promotor de AOX1, y se colocó el terminador de FDH inmediatamente después del codón de terminación de cada gen. Se amplificaron por PCR los genes en la ruta de biosíntesis de hemo a partir de la cepa de P. pastoris de tipo natural o se subclonaron a partir de constructos anteriores.

La ruta de biosíntesis de hemo, incluyendo las enzimas implicadas en la biosíntesis de hemo, se muestra en la figura 1. Los productos intermedios producidos durante la biosíntesis de hemo se muestran en los recuadros, y la enzima que cataliza cada etapa se muestra a la derecha. Se muestran con subrayado las etapas enzimáticas limitantes de la velocidad, como se muestra en S. cerevisiae.

Se amplificaron por PCR genes de ALA sintasa, ALA deshidratasa, UPGIII sintasa, UPGIII descarboxilasa, CPG oxidasa y PPG oxidasa con cebadores que contenían sitios para el reconocimiento por la endonucleasa de restricción, BsaI. Se sintetizaron los oligonucleótidos por ElimBiopharm.

Se usó ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, n.° de cat. M0530L) para amplificar genes a partir de ADN genómico. Se obtuvieron productos de PCR y se purificaron usando DNA Clean&Concentrator-5 (n.° de cat. D4004) y se eluyó el ^a Dⁿ en 25 pl de H2O. Se digirieron ADN de vector, pGAZ y pGAN, y los productos de PCR con BsaI (New England BioLabs, n.° de cat. R0535S) en un volumen de reacción de 50 pl a 37 0C.

Se purificaron los vectores linealizados y los productos de PCR digeridos a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, n.° de cat. D4002). Se eluyó el ADN en 20 pl de H2O. Se configuraron las reacciones de ligamiento en 10 pl a 16 0C durante la noche usando ADN ligasa de T4 (New England BioLabs, n.° de cat. M0202S).

Se subclonaron los genes de ferroquelatasa y PBD a partir de plásmidos construidos previamente: pJAZ_PBD se digirió con BstBI(Bsp119I) (ThermoScientific, FD0124) y NotI (ThermoScientific, FD0596) en tampón Fast Digest 1x durante 5 min a 37 0C. pJAZ_Ferroch se digirió con MfeI (MunI, ThermoScientific, FD0753) y NotI (ThermoScientific, FD0596) en tampón Fast Digest 1x durante 5 min a 37 0C.

Se purificaron los productos digeridos a partir de un gel de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de A ^d N en gel Zymoclean (Zymo Research, n.° de cat. D4002). Se eluyó el ^a Dⁿ en 20 pl de H2O.

Se configuraron las reacciones de ligamiento en 10 pl de reacción a 16 °C durante la noche usando ADN ligasa de T4 (New England BioLabs, n.° de cat. M0202S).

Se transformaron 1,5 pl de mezcla de ligamiento en 20 pl de células competentes resistentes al fago T1 ElectroMax DH10B (Invitrogen, n.° de cat. 12033-015) mediante electroporación usando un instrumento MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; se incubaron las células a 37 0C en 1 ml de SOC durante 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10 pl de mezcla de recuperación en placas de agar LB que contenían ampicilina a una concentración de 100 pg/ml. Se incubaron las placas durante la noche a 37 0C. Se cribaron las colonias mediante PCR de colonias para determinar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de los genes.

Ejemplo 12-Ensamblaje de genes de biosíntesis de hemo en plásmidos para la integración en el genoma de mutS de P. pastoris

Se amplificó por PCR el casete completo “promotor-gen-terminador” con cebadores que contenían sitios para endonucleasas de restricción para ensamblar plásmidos para la integración en el genoma de Pichia.

Ensamblar Paox1_UPS_FDHterm- Paox1_UPD_FDHterm-Paox1_CPO_FDH term. en el plásmido pGAN (pMx327) Se usó pGAN-CPGoxidasa (pMx312) como vector para clonar los casetes de UPS y UPD. Se amplificó por PCR el casete de UPG III sintasa a partir de pMx310 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenía sitios de reconocimiento NheI y SphI para las endonucleasas de restricción de manera correspondiente:

Se amplificó por PCR el casete de UPG III descarboxilasa a partir de pMx311 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenía sitios de reconocimiento SphI y AgeI para las endonucleasas de restricción de manera correspondiente:

Se usó ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, n.° de cat M0530L) para amplificar ADN a partir de los plásmidos.

Se purificaron los productos de PCR obtenidos usando DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Research, n.° de cat. D4004) y se eluyó el ADN en 25 pl de H2O.

Se digirió pGAN-CPGoxidasa (pMx312) designado como vector en tampón CutSmart 1x con NheI-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3131S) y AgeI-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3552S) durante la noche a 37 qC.

Se digirió el producto de PCR del casete UPG III sintasa en tampón CutSmart 1x con NheI-HF (New England BioLabs, n. ° de cat. R3131S) y SphI-HF (New England BioLabs, n. ° de cat. R3182S) durante la noche a 37 0C. Se digirió el producto de PCR del casete de UPG III descarboxilasa en tampón CutSmart 1x con SphI-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3182S) y AgeI-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3552S) durante la noche a 37 qC.

Se purificaron en gel el vector digerido y los productos de PCR a partir de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, n.° de cat. D4002). Se eluyó el ADN en 20 pl de H2O. Se configuró el ligamiento de tres vías entre el casete de UPG III sintasa digerido con NheI-SphI, el casete de UPG III descarboxilasa digerido con SphI-AgeI y un vector digerido con NheI-AgeI en 10 pl a 16 0C durante la noche usando ADN ligasa de T4 (New England BioLabs, n.° de cat. M0202S).

Se transformaron 1,5 pl de mezcla de ligamiento en 20 pl de células competentes resistentes al fago T1 ElectroMax DH10B (Invitrogen, n.° de cat. 12033-015) mediante electroporación usando un instrumento MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; se incubaron las células a 37 0C en 1 ml de SOC durante 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10 pl de mezcla de recuperación en placas de agar LB que contenían ampicilina a una concentración de 100 pg/ml. Se incubaron las placas durante la noche a 37 0C. Se cribaron las colonias mediante PCR de colonias para determinar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de las uniones entre vector e insertos.

Ensamblaje del casete Paox1_ALAsynthase_FDH1term.- Paox1_PPGox¡dase_FDH1term- Paox1_Fc_FDH1term.-Paox1_PBD_FDH1term (pMx330)

a. Amplificación por PCR de casetes de gen:

Se amplificó por PCR el casete de ALA sintasa a partir de pMx310 con cebadores para el promotor de AOX1/term¡nador de FDH1 que contenía sitios de reconocimiento Nhel y Xhol para las endonucleasas de restricción de manera correspondiente:

Se amplificó por PCR el casete de PPG oxidasa a partir de pMx313 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenía sitios de reconocimiento Xhol y Aflll para las endonucleasas de restricción de manera correspondiente:

Se amplificó por PCR el casete de ferroquelatasa a partir de pMx323 con cebadores para el promotor de AOX1/terminador de FDH1 que contenía los sitios de reconocimiento Aflll y Agel para las endonucleasas de restricción de manera correspondiente:

Se amplificó por PCR el marcador G418 a partir del plásmido pJAG adquirido de Biogrammatics usando los siguientes cebadores:

Se usó ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs, n.° de cat M0530L) para amplificar ADN a partir de los plásmidos. Se obtuvieron los productos de PCR y se purificaron usando DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Research, n.° de cat. D4004) y se eluyó el ADN en 25 pl de H2O.

b. Preparación de vectores

Se digirió pGAZ-PBD (pMx321) designado como vector en tampón CutSmart 1x con Nhel-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3131S) y Xhol (New England BioLabs, n.° de cat. R0146S) durante la noche a 37 0C.

Se digirió pGAZ-ALAsyn.-PBD (pMx328) en tampón NEBuffer 3.1 1x con Mlul (New England BioLabs, n.° de cat. R0198S) y BbvCl (New England BioLabs, n.° de cat. R0601S) durante la noche a 37 0C.

Se digirió pGAG-ALAsyn-PBD (pMx332) en tampón CutSmart 1x con Xhol (New England BioLabs, n.° de cat. R0146S) y Agel-HF (New England BioLabs, n.° de cat. R3552S) durante la noche a 37 0C.

c. Producción de constructos intermedios y ensamblaje de un casete final

Se purificaron en gel el vector digerido y los productos de PCR a partir de agarosa al 0,8 % usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, n.° de cat. D4002). Se eluyó el ADN en 20 pl de H2O.

Se ligó el vector pGAZ-PBD (pMx321), digerido con endonucleasas de restricción Nhel-Xhol, con el producto de PCR del casete de ALA sintasa digerido con las mismas enzimas en 10 pl de reacción a 16 0C durante la noche usando ADN ligasa de T4 (New England BioLabs, n. ° de cat. M0202S) para producir un plásmido pGAZ-ALAsyn.-PBD (pMx328).

Se ligó pGAG-ALAsyn-PBD (pMx332) digerido con las endonucleasas de restricción Xhol y Agel-HF con los productos de PCR del casete de PPG oxidasa y el casete de ferroquelatasa digeridos con las endonucleasas de restricción Xhol, Aflll y Aflll, Agel-HF de manera correspondiente en una reacción de ligamiento de tres vías usando ADN ligasa de T4 (New England BioLabs, n.° de cat. M0202S) para producir un pGAG-ALAsynthase_PPGoxidase_Fc_PBD (pMx330).

Se transformaron 1,5 pl de mezcla de ligamiento en 20 pl de células competentes resistentes al fago T1 ElectroMax DH10B (lnvitrogen, n.° de cat. 12033-015) mediante electroporación usando un instrumento MicroPulser (BioRad) ajustado a 1,7 kV; se incubaron las células a 37 0C en 1 ml de SOC durante 1 h con agitación a 200 rpm. Se sembraron 10 pl de mezcla de recuperación en placas de agar LB que contenían ampicilina a una concentración de 100 pg/ml. Se incubaron las placas durante la noche a 37 0C. Se cribaron las colonias mediante PCR de colonias para determinar la presencia del inserto. Se confirmaron las secuencias de las uniones entre el vector y los insertos.

Ejemplo 13— lntegración de plásmidos linealizados con casetes de genes en el genoma de Bg11 de P. pastoris

Los plásmidos que se usaron para generar la cepa de producción, MXY0183, se muestran en la figura 2. Las etapas emprendidas para realizar las modificaciones que condujeron a la cepa de producción, MXY0183, se representan en la figura 3.

La primera enzima que ha de introducirse en el genoma de Bg11 de P. pastoris fue ALAD. Se linealizó un plásmido que contenía ALAD dirigido por pAOX1 (pMX229, figura 2i y figura 3) usando la enzima de restricción Pmel (New England BioLab). Se purificó el plásmido linealizado a partir de un gel de agarosa al 0,8 % como se describe y se transformó en P. pastoris usando recombinación homóloga en el locus de AOX1 nativo, generando la cepa MXY099 (figura 3).

Se linealizó un plásmido que contenía dos copias del gen LegH de soja (secuencia optimizada para P. pastoris; ld. de sec. n.°:3) bajo el control del promotor pAOX1 designado como pMX282 (figura 2ii y figura 3) usando la enzima de restricción Sfil. Se purificó el plásmido linealizado a partir de un gel de agarosa al 0,8 % como se describe y se transformó en la cepa de P. pastoris que contiene ALAD, generando la cepa MXY0118 (figura 3). Se usó qPCR y se determinó que la cepa MXY0118 contenía varias copias del gen LegH, probablemente debido a la concatamerización del plásmido, pMX282, en el momento de la recombinación.

Se linealizó un plásmido pMX327 (figura 2iii y figura 3) que contenía genes que codificaban para uroporfirinógeno lll sintasa (UPS), uroporfirinógeno lll descarboxilasa (UPD) y coproporfirinógeno lll oxidasa (CPO) (las enzimas que catalizan las etapas 4, 5 y 6, respectivamente) bajo control del promotor de AOX1, con la endonucleasa de restricción Sfil y se introdujo en MXY0118, produciendo la cepa MXY0170 (figura 3).

Se ensamblaron genes que codificaban para ALA sintasa (ALAS), protoporfirina lll oxidasa (PPO), ferroquelatasa (FC) y porfobilinógeno desaminasa (PBD) (las enzimas que catalizan las etapas 1, 7, 8 y 3, respectivamente) del genoma de P. pastoris en el plásmido pMX330 (figura 2iv y figura 3). Se linealizó pMX330 con la endonucleasa de restricción Sfil y se transformó en MXY0170, lo que condujo a la generación de la cepa MXY0183 (figura 3). Se confirmó el genotipo de MXY0183 usando PCR y qPCR.

Cepa de producción MXY0207

Ejemplo 14— Construcción del vector de expresión de pGAB

Se construyó el vector de expresión de pGAB (figura 4A) reemplazando el marco de lectura abierto del gen de resistencia a zeocina en el vector pGAZ (BioGrammatics, lnc., Carlsbad, CA) con el marco de lectura abierto del gen de la blasticidina S desaminasa (BSD) a partir de Aspergillus terreus, que permite la selección de transformantes que portan el plásmido con el antibiótico blasticidina S.

Se amplificó el marco de lectura abierto de BSD a partir de una molécula de ADN sintetizada comercialmente usando los cebadores de oligonucleótido MxO0476 y MxO0477 usando una reacción en cadena de la polimerasa de alta fidelidad como se describe en la presente descripción.

Se purificó el producto de PCR de BSD mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1 % en tampón TBE 1x (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) y se visualizó usando la tinción para geles de ADN SYBR Safe (Life Technologies, Carlsbad, CA). Se cortó el fragmento de ADN deseado del gel de agarosa y se recuperó el ADN usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, Irvine, CA).

Se digirieron el producto de PCR de BSD purificado y el vector pGAZ con 10 unidades de cada una de las endonucleasas de restricción MluI y BbvCI (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante 1 hora a 37 0C en tampón NEBuffer 3.1 1x (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, B^s A 100 pg/ml, pH 7,9 a 25 0C). Se recuperaron los productos de ADN digeridos, mediante electroforesis en gel como se ha descrito anteriormente.

Se incubaron el vector pGAZ y el producto de BSD digerido con Mlul y BbvIC purificado con 400 unidades de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs) en tampón de reacción de ADN ligasa de T4 1x (Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 0C) en una reacción de 20 pl, a 16 0C durante 2 horas en una reacción de 20 pl. Se transformaron células DH10B de E. coli electrocompetentes con 2 pl de la reacción de ligamiento y se seleccionaron transformantes resistentes a antibióticos en placas de agar LSB complementadas con ampicilina 100 pg/pl.

Ejemplo 15— Construcción del vector de expresión de Mxr1

Se construyó el vector de expresión de Mxr1, pMx354, introduciendo el marco de lectura abierto de Mxr1 en el vector de pGAB (figura 4B). Se insertó el marco de lectura abierto de Mxr1 en pGAB con el inicio de la traducción inmediatamente en el sentido de 3' del promotor de alcohol oxidasa 1 inducible por metanol (AOX1) de Pichia pastoris y la señal de parada de la traducción seguida inmediatamente de la secuencia de terminador de la transcripción del gen FDH1 de P. pastoris.

Se amplificó el marco de lectura abierto que codifica para la proteína Mxr1 a partir de ADN genómico aislado de la cepa Bg11 MutS de Pichia pastoris obtenida de BioGrammatics, Inc. (Carlsbad, CA). Se amplificó el marco de lectura abierto de Mxr1 a partir de ADN genómico de P. pastoris con los cebadores MxO0495 (TTT TGC GGC CGC ATG AGC AAT CTA CCC CCA ACT TTT G (Id. de sec. n.°:45) y MxO0496 (AAA AGC GGC CGC CTA GAC ACC ACC ATC TAG TCG GTT (Id. de sec. n.°:46), que adjuntó sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción NotI flanqueantes. La amplificación se logró usando la reacción en cadena de la polimerasa como se describe en la presente descripción.

Se digirieron el vector de pGAB y el producto de PCR de Mxr1 amplificado con 10 unidades de endonucleasa de restricción NotI (New England Biolabs) durante 1 hora a 37 0C en tampón NEBuffer 3.1 1x (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, BSA 100 pg/ml, pH 7,9 a 25 0C). Después de la digestión, el vector pMx352 digerido con NotI se trató con 5 unidades de fosfatasa Antarctic (New England Biolabs) durante 15 minutos a 37 0C en tampón de fosfatasa Antarctic 1x (Bis-Tris-propano-HCl 50 mM, MgCl21 mM, ZnCl20,1 mM, pH 6 a 25 0C).

Se separaron el fragmento de Mxr1 amplificado digerido con NotI y el vector pMx352 mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % en tampón TBE 1x (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) y se visualizó usando la tinción para geles de ADN SYBR Safe (Life Technologies, Carlsbad, CA). Se escindieron los fragmentos de ADN deseados del gel de agarosa y se recuperó el ADN usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean (Zymo Research, Irvine, cA).

Se introdujo el fragmento digerido con NotI que contiene el marco de lectura abierto de Mxr1 en pGAB en un sitio NotI inmediatamente en el sentido de 3' del promotor de AOX1 mediante ligamiento. Se incubó una mezcla que contenía 137 ng de ADN digerido con NotI que codificaba para el marco de lectura abierto de Mxr1 y 60 ng de pMx352 digerido con NotI, tratado con fosfatasa, con 400 unidades de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs) en tampón de reacción de ADN ligasa de T4 1x (Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, ATP 1 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 0C) en una reacción de 20 pl, a 16 0C, durante 2 horas en una reacción de 20 pl. Se transformaron células DH10B de E. coli electrocompetentes con 2 pl de la reacción de ligamiento y se seleccionaron transformantes resistentes a antibióticos en placas de agar LSB complementadas con ampicilina 100 pg/pl. Se incubaron las placas durante la noche a 37 0C. Se cribaron las colonias para determinar la presencia del inserto mediante PCR usando los cebadores MxO0495 y MxO0496. Se confirmó la secuencia del vector final mediante secuenciación de ADN.

Durante la clonación, se introdujeron 6 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal de Mxr1. El marco de lectura abierto de Mxr1 se muestra bajo la sección “secuencias de ácido nucleico” , mostrándose con subrayado los aminoácidos residuales de la clonación. Las cepas de producción de Pichia que contienen la secuencia de Mxr1 que tiene los 6 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal y las cepas de Pichia que contienen Mxr1 de tipo natural (es decir, sin los 6 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal) fueron indistinguibles en los tanques de fermentación.

Ejemplo 16— Construcción del vector de expresión de Mxr1 nativo

Se usó un plásmido que contenía el gen regulador de la transcripción Mxr1 bajo el control del promotor pAOX1, designado como pMX354, como molde para la amplificación por PCR. El extremo 3’ del promotor de AOX1, el marco de lectura abierto de LegH y el terminador de AOX1 se amplificaron a partir de pMX354 usando los cebadores MxO0617 y MxO0647 mostrados a continuación. El terminador de AOX1, el ligador y el extremo 5’ del promotor de AOX1 se amplificaron a partir de pMX382 usando los cebadores MxO0618 y MxO0646.

Se obtuvieron productos de PCR y se purificaron usando DNA Clean&Concentrator-5 y se eluyó el ADN en 12 |ul de H2O. Se combinaron luego los productos de PCR purificados y se usaron como molde para una tanda posterior de amplificación por PCR usando los cebadores MxO0617 y MxO0618. El producto de PCR resultante estaba compuesto por el extremo 3' del promotor de AOX1, seguido del marco de lectura abierto de Mxr1, el terminador de AOX1, una secuencia ligadora corta y el extremo 5' del promotor de AOX1. Se obtuvo el producto de PCR y se purificó como se describe en la presente descripción. Se clonó el producto de PCR purificado en el vector pCR™-Blunt II-TOPO® usando el kit de clonación por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, n.° de cat. K 2800-20) para crear el vector pMX402.

Ejemplo 17— Construcción de las cepas de P. pastoris MXY0206 y MXY0207

Se introdujo el vector de expresión de Mxr1, pMx354 (figura 4B) en la cepa MXY0183 mediante transformación de ADN (figura 3).

Se linealizó el vector pMx354 (1,5 |ug) en un sitio Pmel único en las secuencias promotoras de AOX1 mediante digestión con 20 unidades de la endonucleasa de restricción Pmel (New England Biolabs) durante 1 hora a 37 0C en tampón NEBuffer 41x (acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 a 25 °C).

Se purificó el vector pMX354 digerido con Pmel, mediante electroforesis en gel, se recuperó usando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean como se ha descrito anteriormente. Se introdujo el vector pMX354 linealizado en la cepa MXY-9 mediante transformación y selección en medio que contiene blasticidina. Se obtuvieron dos clones independientes a partir de la transformación y se designaron como MXY0206 y MXY0207. La presencia de una copia adicional de Mxr1 bajo el control del promotor de AOX1 en estas cepas se confirmó mediante PCR.

Cepa de producción MXY0291

Ejemplo 18— Construcción de las cepas MXY0213 y MXY0260

La figura 5 muestra las etapas emprendidas para construir la cepa MXY0213 libre de marcador de antibiótico que contiene 7 enzimas de la ruta de biosíntesis de hemo. Se introdujo un fragmento lineal de ADN que contenía Mxr1 variante (6 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal) bajo pAOX1, con homología con el promotor pAOX1 en cada extremo, usando cotransformación (figura 5 y figura 6 i). Este casete de expresión de Mxr1 lineal se introdujo simultáneamente en la cepa de Pichia MXY213 con el plásmido pIL75 mediante transformación. El vector pIL75 porta una secuencia de replicación autónoma panARS (Liachko & Dunham, 2014, FEMS Yeast Res., 14:364-7), que permite el mantenimiento del vector de plásmido sin integración en el genoma de las células transformadas y un marcador kanMX para la selección de transformantes con el antibiótico G418. Las células transformadas se seleccionaron en medio complementado con G418 para detectar la presencia del marcador kanMX en el plásmido pIL75. Se cribaron los transformantes de Pichia mediante PCR de colonias para transformantes que tanto captaron el plásmido pIL75 como habían integrado correctamente el casete de expresión de Mxr1.

Ejemplo 19— Cotransformación para introducir el casete de expresión de LegH en Pichia

Se usó un plásmido que contenía una variante con optimización de codones de Pichia pastoris diferente del gen LegH de soja (variante 3; Id. de sec. n.°:5) bajo el control del promotor pAOX1 designado como pMX399 como fuente de molde para la amplificación por PCR del gen. La cadena principal del plásmido de clonación TOPO pMX401 se amplificó por PCR. El inserto y el vector se ensamblaron usando el ensamblaje de Gibson (kit de ensamblaje de Gibson NEB) para generar el plásmido pMX422. Este plásmido se usó como molde para una tanda posterior de amplificación por PCR usando los cebadores MxO0617 y MxO0618 mostrados a continuación.

El producto de PCR resultante estaba compuesto, en la dirección 5' a 3', por el extremo 3' del promotor de AOX1, seguido por el marco de lectura abierto de var 3 de LegH, el terminador de AOX1, una secuencia ligadora corta y el extremo 5' del promotor de AOX1 (figura 6ii). Se obtuvo el producto de PCR y se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa como se describe en la presente descripción.

Se seleccionaron por PCR los transformantes con casete de expresión de LegH integrado en el genoma y se caracterizaron por el número de copias del gen LegH usando qPCR.

Ejemplo 20 — Curado de transformantes de vectores de plásmido que portan marcadores de selección

En los clones en los que se demostró que el casete de expresión de LegH de soja se integró correctamente por PCR de colonias y en un alto número de copias mediante qPCR, se eliminó el plásmido pIL75 requerido para la selección en G418 mediante la relajación de la selección para el antibiótico. Se sembraron en línea los transformantes para colonias individuales en medios que carecían de antibiótico G418. Debido a que el plásmido panARS no se mantiene estable en ausencia de selección, se perdió rápidamente pIL75 a partir de las células transformadas en esta condición. La cepa de Pichia resultante, MXY0291, contiene secuencias para la expresión de LegH en un número de copias similar a MXY0207, pero carece de secuencias heterólogas para la selección.

Cepas de producción MXY0330, MXY0333 y MXY0338

Ejemplo 21— Construcción de la cepa MXY0306

La PCR de genotipo de la cepa MXY0291 reveló que una parte de la secuencia codificante de CPG oxidasa se había delecionado durante la construcción de esta cepa. La región codificante de CPG oxidasa de longitud completa se restableció mediante la sustitución de la copia truncada. En resumen, se generó un fragmento de ADN lineal que contenía el promotor pAOX1 y la región codificante de CPG oxidasa de longitud completa mediante amplificación por PCR del plásmido pMX312 usando los cebadores MxO0866 y MxO0867 mostrados a continuación.

Se introdujo el fragmento de ADN de pAOX1-CPGoxidasa lineal en la cepa MXY0291 mediante cotransformación con el plásmido pIL75. Se seleccionaron transformantes en el medio que contenía G418 y luego se cribaron para determinar la presencia de la región codificante de CPGoxidasa de longitud completa por PCR. Se identificó un aislado que contenía la CPGoxidasa de longitud completa y se curó posteriormente del vector de plásmido requerido para la selección en G418 como se ha descrito anteriormente. Esta cepa se designó como MXY0306 (véase la figura 5).

Ejemplo 22— Constructos lineales para cepas promotoras híbridas

Se expresó la variante 3 de LegH bajo la dirección de cada uno de las tres promotores constitutivos de Pichia pastoris nativos indicados en la presente descripción. Los constructos lineales se muestran en la figura 7, y contenían la mitad en 3’ del promotor, seguido de var3 de LegH, seguido por el terminador de la transcripción de FDH1. Esto estuvo seguido inmediatamente por el casete de resistencia a antibióticos que contenía el promotor pTEF de Ashbyan gossypii, el gen de acetamidasa (amdS) de Aspergillus nidulans y el terminador de TEF de Ashbyan gossypii. Finalmente, el constructo contenía la mitad en 5’ del promotor. Este casete lineal se amplificó usando los cebadores de oligonucleótido enumerados en la tabla a continuación para generar constructos que contienen varios cientos de pares de bases en los extremos 5' y 3' que son homólogos al promotor respectivo en el genoma de Pichia nativo.

Cebadores usados para amplificar los constructos lineales

Se transformaron células MXY0306 competentes con cada uno de los casetes lineales y se seleccionaron los transformantes que contenían el casete de selección de amdS basándose en su capacidad para crecer en placas de agar que contenían acetamida como única fuente de nitrógeno. Se purificaron estas cepas, se aislaron y se verificó por PCR la presencia de LegH bajo el control del promotor constitutivo (figura 5).

Ejemplo 23— Secuencias de ácido nucleico

Secuencia de ácido nucleico de Mxr1 (los nucleótidos subrayados codifican para 6 aminoácidos en el extremo N-terminal introducidos durante la clonación) (Id. de sec. n. °:1)

ATGCGAGACCGCGGCCGCAT G AG CAAT C T AC C C C CAAC T T T TG G T TC C AC TAGACAAT C T C CAGA AGACCAAT CACCTCCCGTGCCCAAGGAGCTGTCATTCAATGGGACCACACCCTCAGGAAAGCTAC GC T T AT T T GT C T GT CAGACAT G TAC T C GAGCAT TTG CTCGT CAGGAACAC T T GAAAC GACACGAA AGGTCTCACACCAAGGAGAAACCTTTCAGCTGCGGCATTTGTTCTCGTAAATTCAGCCGTCGAGA T C T G T T AT T GAG AC AT G C C CAAAAAC T G C AC AG CAAC T G C T C T GAT G C G G C C AT AAC AAG AC T AA GG CG CA A GG CA A CTCG TCGGTCTTCTAATGCCGCGGGTTCCATATCTGGTTCTACTCCGGTGACA ACGCCAAATACTATGGGTACGCCCGAAGATGGCGAGAAACGAAAAGTTCAGAAACTGGCCGGCCG C C GGGAC T CAAAT GAAC AGAAAC TGCAAC T G CAAC AACAAC AT C TACAG CAACAAC CAC AG T T G C AAT AC CAACAAT C T C T T AAGC AG CAT GAAAAT C AAG T C C AG CAGC C T GAT CAAGAT C CAT T GATA T C C CC GAGAAT GCAAT TAT T CAAT GAT T C CAAC CAT CAC GTAAACAAT T T GT T T GAT C T T GGAC T AAGAAGA GCTTCCTTCTCCGCCG TTAG TG GA A A TA A TTA TG CCCA TTA TG TG AA TA ATTTTCA A C AAG AT G C CTCTTC TA C CAAT C CAAAT CAAGAT T CAAAT AAT G C C G AAT T T GAGAAT AT T G AAT T T TCTACCCCACAAATGATGCCCGTTGAAGATGCTGAAACTTGGATGAACAACATGGGTCCAATTCC GAACTT C T CT C T C GAT GT G AAC AG GAAC AT T GG T GAT AGC T T T ACAGATAT ACAAC ACAAGAAT T C AG AG C C T AT T AT AT C C GAAC C G C C C AAG GAC AC C G C T C CAAAC G AC AAG AAG T T GAAT G G C T AC T C T T T T TAC GAAGCC C C CAT C AAGC CAT TAGAAT C C C TAT T T T C T G T C AG GAAT AC AAAG AGAAA C AAG T AT AAAAC AAAT GAC GAC T C T C C AGAC AC C G T G GAT AAT AAC T C C G CAC C G G C T G C T AAT A CCA TTCA A G A A CTTG A G TCTTCTTTG A A TG CA TCCA A G A A TTTTTG CTTG CCA A CTG G TTA TTCC TTCTA TG G TA A TTTG G A CCA A CA G A CTTTCTCTA A CA CG TTA TCA TG CA CTTCTTCTA A TG CCA C AAT T T C G C C CAT T C TAC T C GAT AAC T C CAT T AAT AAT AAC T C CAC T AGT GAC G T GAGAC CAGAAT T TAGAACAC AAAG T G T CAC C T C T GAAAT GAG T C AAG C C C C T C C C C C T C C T CAAAAAAAC AAC T C G A A A TA TTCCA CCG A A G TTCTTTTTA CCA G CA A CA TG CG G TCG TTTA TTCA CTA CG CTCTTTCCA A GTATCCTTTTATTGGTGTGCCCACTCCAACTCTTCCGGAGAACGAAAGACTAAATGAATATGCTG AT T CAT T CAC CAAC C G T T T C T T AAAT CAT T AT C C T T T C AT AC AT G T CAC GAT T C T C AAAG AAT AC T C C C T T T T CAAG GCAAT T T T AG AT GAGAAT GAG T C GAC TAAGAAC T GGGAAAAT AAT CAG T T T T A CTTAG A GA A CCAA CGA A TA TCA A TTGTTTGTCTTCCTCTTTTG GTGG CTACGA TAG GTGCA GTAC TAT CAAAC AAC AAAAAG GAT G C T T C GAAT T T AT AC GAAG C T T CAAG G C G T T G TAT T CAT G T T T AC T T AGAT T C C AG G AAAAAGAT AC C C AC T T C C T T G T C C G C AAAT AAC AAT GAC T C T C C AC T T T G G C T A A TTCA A TCCCTG ACGTTA TCTGTTA TGTATGG GTTA TTTGCGG ACA ATGA CATTA G TTTG A ATG TCGTGATCAGACAAGTTAACGCACTTAATTCTCTGGTCAAGACTTCGGGCCTGAATAGGACCTCA AT T AT AGAT C T T T T C AAC AT C AAC AAAC C T T T G GAT AAT G AAC T C T G GAAT C AAT T C G T GAAAAT AGAGT C C AC C GTAAG GAC AAT C C AC AC GAT T T T T C AAAT C AG T T C C AAC T TAAG CG CCTTGTA CA

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Secuencia de proteína Mxr1 (los 6 aminoácidos subrayados en el extremo N-terminal introducidos durante la clonación) (Id. de sec. n.°:2)

M R D R G R M SN LP P T FG ST R Q SP E D Q SP P V P K E LSFN G T T P SG K LR L FV C Q T C T R A FA R Q E H LK R H E R S H T K E K P F SC G IC S R K F S R R D L L L R H A Q K L H SN C S D A A IT R L R R K A T R R S SN A A G S IS G S T P V T TPNTM GTPEDGEKRKVQKLAGRRDSNEQKLQLQQQHLQQQPQLQYQQSLKQHENQVQQPDQDPLI SPR M Q LFN D SN H H V N N LFD LG LRR A SFSA V SG N N Y A H Y V N N FQ Q D A SSTN PN Q D SN N A EFEN IEF STPQ M M P V ED A ET W M N N M G PIPN FSLD V N R N IG D SFT D IQ H K N SEP IISEP PK D T A PN D K K LN G Y SF Y E A P IK P L E SL F SV R N T K R N K Y K T N D D SP D T V D N N SA P A A N T IQ E L E SSL N A SK N F C L P T G Y S F Y G N L D Q Q T F SN T L SC T S SN A T IS P IL L D N S IN N N S T S D V R P E F R T Q SV T SE M S Q A P P P P Q K N N S K Y S T E V L F T S N M R S F 1H Y A L S K Y P F IG V P T P T L P E N E R L N E Y A D S F T N R F L N H Y P F 1H V T IL K E Y SL F K A IL D E N E ST K N W E N N Q F Y L E N Q R ISIV C L P L L V A T IG A V L SN N K K D A SN L Y E A SR R C 1H V Y L D SR K K IP T S L S A N N N D SP L W L IQ S L T L S V M Y G L F A D N D ISL N W IR Q V N A L N S L V K T S G L N R T S IID L F N IN K P L D N E L W N Q F V K IE S T V R T 1H T IF Q IS S N L S A L Y N IIP S L K ID D L M IT L P V P T T L W Q A D SF V K F K SL SY G N Q IP F Q Y T R V L Q N L ID Y N Q P L SD G K F L Y E N H V SE F G L IC L Q N G L H Q Y SY F Q K L T A V N N R E D A L F T K V V N SL H SW D R M ISN SD L F P K K IY Q Q SC L IL D SK L L N N F L IV K SSL K V ST G DVS SL N K L K E N V W L K N W N Q V C A IY Y N SF M N IP A P SIQ K K Y N D IE F V D D M IN L SL IIIK IM K L IF Y N N V K D N Y E D E N D F K L Q E L N L T F D N F D E K ISL N L T IL F D IF L M IY K IIT N Y E K F M K IK H K F N Y Y N S N SN ISFL H H FE L SSV IN N T Q M N Q N D Y M K T D ID E K L D Q L FH IY Q T FF R L Y L D L E K F M K FK FN Y H D F E T E F SSL SISN IL N T H A A SN N D T N A A D A M N A K D E K ISP T T L N SV L L A D E G N E N SG R N N D SD R L F M L N E L IN F E V G L K F L K IG E SF F D F L Y E N N Y K F 1H F K N L N D G M F H IR IY L E N R L D G G V *

Secuencia de ácido nucleico de LegH con optimización de codones de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:3) ATGGGTGCTTTCA CCGA G AA G CA GG A AG CA CTTGTTTCCTCTTCG TTCG AA G CTTTTA A GG CTAA CA TCCCTCA A TA CTCTG TTGTGTTTTA CA CGTCCATTCTA G A AA A A GCTCCTGCTGCCA A GG A CC TCTTCTCTTTTCTGTCCAA CGG TG TA GA TCCATCCA ATCCCA A A TTA ACA GGTCA CGCTG AG A AA TTGTTCGGTTTAGTCAGAGATAGCGCTGGACAATTGAAAGCAAATGGTACTGTGGTTGCTGATGC TGCCTTGGGCAGCATCCATGCACAGAAGGCAATTACAGACCCACAATTTGTTGTTGTGAAGGAAG CTCTGCTTAAAACTATAAAGGAAGCCGTCGGAGACAAATGGAGTGACGAGTTGTCATCAGCTTGG GAG G TAG C T TAT GAT GAG T T G G C C G CAG CAAT CAAAAAG G CAT T C TAA

Secuencia de aminoácidos de LegH con optimización de codones de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:4)

M G A F T E K Q E A L V S SS F E A F K A N IP Q Y S W F Y T SIL E K A P A A K D L F SF L S N G V D P S N P K L T G H A E K LFG LV R D SA G Q L K A N G T W A D A A L G S1H A Q K A IT D P Q FV W K E A LLK T IK E A V G D K W SD E LSSA W EVAYDELAAA IK K A F

Secuencia de ácido nucleico de la variante 3 de LegH con optimización de codones de Pichia pastoris (Id. de sec. n. °:5)

AT G G G T G C AT T T AC AGAAAAAC AAGAG G C T T T AG T AT C C T C AT C T T T T GAAG C T T T C AAAG C C AA TA TTCCTCA A TA CTCCG TTGTTTTCTA TACGTCCA TTTTGG AA A A GG CTCCAG CA G CTAA G GA CC TTTTCTCTTTCTTGTCG AA CGG CG TG GA TCCCTCAA A TCCTA A GCTGA CTG GTCA CG CCGA GA A G CTTTTTGGTTTGGTCAGAGACAGCGCCGGACAGCTGAAAGCTAACGGTACAGTTGTGGCAGATGC TGCCTTGGGATCTATACATGCACAAAAGGCTATCACCGACCCACAGTTTGTGGTTGTAAAAGAGG CTCTACTCAAAACTATCAAGGAAGCAGTTGGTGACAAATGGAGCGATGAATTGTCCAGTGCATGG GAGGTCGCTTACGATGAGTTAGCTGCTGCAATCAAAAAGGCTTTCTAA

Secuencia de aminoácidos de la variante 3 de LegH con optimización de codones de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:6)

M G A FT E K Q E A L V SSSFE A F K A M IP Q Y S W F Y T S IL E K A P A A K D L F S F L S N G V D P S N P K L T G H A E K LFG LV R D SA G Q L K A N G T W A D A A L G S1H A Q K A IT D P Q FW V K E A LLK T IK E A V G D K W SD E LSSA W EV A Y D ELA A A IK K A F

Promotor pAOX1 de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:7)

GAT C T AAC AT C CAAAGAC GAAAG G T T GAAT GAAAC C T T T T T G C CAT C C GAC AT C C AC AG G T C CAT T C T C AC AC AT AAG T G C C AAAC G C AAC AG GAG G G GAT AC AC T AG CAG C AGAC C G T T G C AAAC G CAG G A CCTCCACTCCTCTTCTCCTCA A CA CCCACTTTTGCCA TCG AA A A ACCA G CCCA GTTA TTG GG C TTG A TTG G A G CTCG CTCA TTCCA A TTCCTTCTA TTA G G CTA CTA A CA CCA TG A CTTTA TTA G CCT G TCTA TCCTG G CCCCCCTGG CG A GGTTCA TG TTTG TTTA TTTCCGA A TG CA A CA A GCTCCG CA TT ACACCCGAACAT CA CTCCA GA TGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCA AATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCAT CCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAA A A GTCGG CA TACCG TTTG TCTTGTTTG GTATTG A TTGA CG A ATGCTCA AA A A TA A TCTCA TTA AT GCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAA A CA CCCG CTTTTTG G A TG A TTA TG CA TTG TCTCCA CA TTG TA TG CTTCCA A G A TTCTG G TG G G A A T AC T G C T G AT AG C C T AAC G T T C AT GAT CAAAAT T T AAC T G T T C T AAC CCCTA CTT GAC AG C AAT A TA TA AA CA GA A GGA A GCTG CCCTGTCTTA A A CCTTTTTTTTTATCA T CA TTA TTA G C TTA CTTTC ATAAT T GC GAC T GGT T C CAAT T GACAAGCT T T T GAT T T T AAC GAC T T T TAAC GAC AACT T GAGAA GAT CAAAAAACAAC TAAT TAT T C GAAAC G

Promotor pGAP de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:8)

C GAC T AT T AT C G AT CAAT GAAAT C C AT CAAGAT T GAAAT C T TAAAAT TG CC CC TTT C AC T T GAC A GG A TCCTTTTTTG TA G AA A TGTCTTG GTGTCCTCG TCCA A TCA GG TA GCCA TCTCTGA A ATA TCT GGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGT GG A GTAA TGG AA CCA GA A A CG TCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCA CCGCCCGTTA CCGTCCCTA G

CGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCG T C G C T G G CAATAATAG C G G G C G GAC G C AT G T C AT GAG AT T AT T G GAAAC C AC C AG AAT C G AAT AT A A A A G G CG A A CA CCTTTCCCA A TTTTG G TTTCTCCTG A CCCA A A G A CTTTA A A TTTA A TTTA TTT GT C CC TAT T T CAAT CAAT T GAACAAC T AT CAAAACAC G

Promotor pGCW14de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:9)

CAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACCAT CTTTTG TTTCG G G G A A CCG TG CTCG CC CC G TA A A G TTA A TTTTTTTTTCC CG CG CA G C TTTA A TC T T T C G G C AGAGAAG G C G T T T T C AT C G T AG C G T G G GAAC AG AAT AAT C AG T T CAT G T G C T AT AC AG G C AC AT G G C AG C AG T C AC TAT T T T G C T T T T TAAC C T TAAAG T C GT T CAT CAAT CAT TAAC T GAC C AAT CAGAT T T T T T GCAT T T GC C ACT TAT C TAAAAAT AC T T T T GT AT CT C G CAGAT AC GT T CAGT G GTTTCCAGGACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTTTATTTTTGGTCA CCCACGCAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGTAACACCGCCTAGAG C T T C AG GAAAAAC C AG T AC C T G T GAC C G CAAT T C AC CAT G AT G C AG AAT G T T AAT T T AAAC GAG T GC CAAAT CAAGAT T T CAACAGACAAAT CAAT CGAT C CAT AG T TAC C CAT T CCAGC C TTTTC G TC G TCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAAAAGTCCAGATTAGGGCAGAT T T T GAG T T T AAAAT AG G AAAT AT AAAC AAAT AT AC C G C GAAAAAG G T T T G T T T AT AG C TTTTCG C CTG G TG CC G TA CG G TA TA A A TA C A TA C TC TC CTCCC CC CC CTG G TTCTCTTTTTCTTTTG TTA CT TA CA TTTTA CCG TTCCGTCA CTCGCTTCA CTCA A CA A CA A A A

Promotor pTEF1 de Pichia pastoris (Id. de sec. n.°:10)

ATAACTGTCG CCTCTTTTA TCTG CCGCA CTG CA TGA GG TG TCCCCTTA GTGG GA A A GA GTA CTGA GC CAAC C C TGGAGGACAG CAAGG GAAAAATAC C T ACAAC T T G C T T CAT AAT GGTCG TAAAAACAA TCCTTG TCG G A TA TA A G TG TTG TA G A CTG TCC CTTA TC CTCTG C G A TG TTC TTCC TC TC A A A G TT

^{i r , r p r , m r ,r p 7 \ m r , 7 \ r 7 \ 7\ rnr*7\ 7\ r i 7 \ r i 7 \ r ' r n r i 7 \ r i r i 7\r 'r i r} X U G U m X X O X 'w X O X J r \ X ^ jr iA 3 -£ -X £ - i .X X ( J ^ u n x X X i- Ju T l X X X 1 r * m \ X n r * r * i \ m \ n n m \ C T C G TA C A T G A TTG G C TG A A A TTTCC CTA A A G A A TTTcTTTTTCA CG A A A A TTTTTTTTTTA C A C A A G A TTTTCA G CA GA TA TA A AA TGG AG A GCAG GA CCTCCG CTGTGA CTCTTCTTTTTTTTCTTTT AT T C T C AC T AC AT AC AT TTTA G TTA TTCG C CAAC

Enzima 1 de biosíntesis de hemo- ALA sintasa (Id. de sec. n. °:11)

A TG G A G TTTG TCG CCCG TCA G TCCA TG A A TG CCTG TCCCTTTG TCA G G TCA A CTTCTA CCCA CCA TTTGA A GA A GTTGGCAGCAAACAGTTCTCTAGCTGCTACTGCTAGTCATTGTCCCGTGGTTGGCC CTGCTCTCCAACAGCAGAGATACTACTCTCAACCTTCCAAGCCAGCCCAAGCCCAAACCTCCGAC A TTGCTA CTG GGA TCAAGAAGGATGTTTCTCCGATCCGTATGGACTCTAATGAAACCGCCTTTGA T TACAAT G GAAT GT AT GAG T C T GAT C T T GC GAAT AAAC GTAAAGAT AAC T C GT AT C G T TAT T T C A ATAACAT CAAC C GT C T AGC CAAGGAGT T T C C CAAGG CACAT C GC CAGAC CGAAGAT GACAAGGTG ACCGTCTGGTGCTCTAACGACTACTTAGGAATGGGTAGGCATCCTGAGATTATCAAAACCATGAA G G C TAC C AT G GAC AAG T AC G G T T C C G G AG C AG G AG G AAC T AG GAAC AT T G C AG G T C AT AAC C AC G CCGCTATCAATTTGGAAAGCGAGTTGGCTTGCTTGAACAAGAAGGAAGCGGCTCTGGTGTTTTCA T CAT GT T T CATAGCTAAC GAT GCAAT CAT CT C GT T GT T GGGACAAAAAAT CAAAAAT T T GGT CAT TTTCTCTGACCAGTCGAATCATGCTTCCATGATATTGGGTGTGCGTAACTCCAAAGCGAAGAAGC AC AT C T T C AAG C AC AAC AAT T T GAAG GAT C T G G AG T C G C AG T T AG C T C AG T AC C C C AAG T C GAC T CCTAAACTGATCG CCTTCGA G TCAG TTTACTCTA TGTGTGGA TCTGTGG CTCCCA TTGA G AA G AT TTG CGA TTTGGCTAAAAGGTACGGTGCCCTCACCTTCTTGGATGAAGTTCATGCTGTTGGAATGT A TG GTCCTCATGG ACAGGGTGTAGCTGAGCATTTGGACTTTGATCTGCATTTACAGTCTGGAATC GCCAGTCCTAGCGTGGTGGACAAACGCACCATATTGGATCGTGTCGACATGATTACTGGTACTTG CGGAAAGTCATTTGGTACTGTTGGAGGTTACGTTGCTGGTAGTGCCAACCTAATTGATTGGTTAA GA TCCTA TG CG CCA G G TTTCA TTTTCA CTA CCA CA CTTCCTCCTG CTA TCA TG G CTG G TA CA G CC ACTTCTG TTCG TA TTG TTA GGG CCGA CA TTG A GGCCCGTA T CAAGCAACAGCTTAATACTCGCTA C G T C AAAG AC T C AT T T G AAAAC C T T G G T AT T C C AG T C AT T C C AAAC C C AAG T C AC AT T G T T C C T G T T C T AG T T GGAAAT GCT GCAGAT GC CAAGAAGGCAT C C GAT AT GT T AAT GAACAAACAC C GT AT T TATGTTCAAGCTATTAACTACCCTACTGTGCCTGTCGGTGAAGAACGACTAAGGAT TACTCCTAC T C CAGGT CAT GGAAAGGAGAT T T GT GAC CAGCT GAT CAGCG C T GT C GAC GAT GT T T T TAC T GAGC TTAATTTACCAAGAATCAACAAATGGCAGTCCCAAGGTGGTCATTGCGGTGTTGGTGATGCTAAT T AC G T AC C AGAAC C C AAT C T G T G GAC T C AG GAC C AG C T C AG C T T GAC AAAC C AAG AC T T G C AC T C C AAT G T G C AC AAC C C AG T GAT T GAGCAGAT CGAAACCT CAT C AG G AG T C AG AT TGTAG

Enzima 2 de biosíntesis de hemo- ALA deshidratasa (Id. de sec. n. °:12)

AT G GT G CAT AAG GC T GAATAC T TGGAC GAC CAC C CAAC T CAGAT T T CCAG CAT T C T T T CAGGAG G T TACAAC CAC C CAT TAC TTCGT GAAT GGCAACAT GAAC GT CAAC T CAACAAAAAC AT GT T CAT C T T TC C C C TG TT T G T C AC AG AT C GAC CAGAC GAAG AAG AAC TTA TTCC TA G TC TA CC T AAT AT C AAG A GGTTTGGCGTTAACAAGTTGATTCCTTATGTAGGAGGTTTGGTTTCCAAAGGATTGAGGGCGGT GATCCTATTTGGTGTTCCTCTGAAGCCCGGTGTGAAAGATGAAGAAGGAACGGCCGCTGATGATC C AGAGG GAC C T G T T AT C C AAGC CAT CAAACAC T T GAGAAAG AAC T T T C C T GAC C T GT AT AT CAT C AC C GAT G TCTG TCTA TG T GAG T AC AC C AG C CAT G GAC AT T G T G GAATAC T AT AT G AG GAT G G CAC TAT CAACAGAGAGCTCTCAGTCCGTCGTATTGCTGCTGTAGCTGTCAAATATGCTCAAGCTGGAG C CAAC TC TG TG G C TC C TTC T GAT AT GAC T GAC G G C AG AAT AAGAG AT AT TAAAGAAG GCT TAC T A A GTGCAG GA CTG GCA CA TA A AA CGTTTGTTA TGTCCTA CG CTGCAA A A TTCTCTGG TA A TTTGTA TGGCCCTTTCAGAGATGCTGCAGGTTCCTGTCCATCTCAAGGGGACAGAAAATGTTACCAGCTTC CTTCTGGAGGAAAAGGGTTGGCCCATCGTGCTCTGATTCGTGATATGAATGAAGGCACTGATGGA A TTA TTG TCA A A CCA TCTA CA TTCTA TTTG G A CA TTG TCG CTG A TG CTTA TCA G CTTTG TA A A G A CTATCCTATCTGCTGTTACCAGGTTTCTGGAGAGTACGCCATGCTACATGCAGCGGCAGAGAAGA A TA TTG TTGA TCTGA A ATCA A TCGCTTTTGA A GCTCA TCA AG GA TTCTTGCGGG CTGG A GCTCG T TTA A TCA TTA G TTA CTTTA CCCCTG A A TTCCTG G A G TG G TTA TCTG A A TG A

Enzima 3 de biosíntesis de hemo- porfobilinógeno desaminasa (Id. de sec. n.°:13)

AT GAAC CAAAT C GAACAGAGC G GAC C CAT T GAT T GCAGT T C C T T GAAAT T GGGGT C C CGAAAGT C CGCTCTGGCTATAATCCAGGCAGAAATCGTCCGCCAATTGATATTGAAAGAATACCCTGAATTGG AGACGAAGTTGGTCAGTGTGTCCACCCTGGGGGACCAAGTCCAGAATAAAGCACTTTTCACGTTT GGAGGAAAATCTTTGTGGACCAAAGAACTTGAGATGTTGTTGTTGGAGAGTGTGGGAGGATTTGA C C AAAT AG AC AT GAT T G T AC AC T C G T T GAAAGAC AT G C CAAC T CAT T T AC CAGAC GAAT T T GAG C TGGGTTGCATTATTGAAAGAGAAGACCCTAGAGACGCTTTGGTCGTGCAAGATGGTTTATCTTAC AAGTCATTGGCCGACCTTCCAGAGGGAGCTGTGGTCGGTACGTCTTCGGTTAGAAGATCGGCTCA AC T AC T GAAGAAT T T C C C T CAT C T GAAAT T CAAAT C T G T TAGAG G AAAC C T T CAGAC CAGAC T AA GAAAAT TAGA TG ATCCA GA TTCCGA G TA CTGCTG TCTCCTCCTTGCAG CA G CCG GTTTA A TCAG G ACAGGCT TACAACACAGAAT T T CAAT GT AT T T GAAC GAC GAT GT GAT GTAC CACT C C GT CGGACA AGGAGCAT TAGGAGTAGAGAT CAGAAAAGGT GAC CAAT T CAT GAAAAATAT C T GT GAAAAGAT T G G G C AT AGAAC C AC C AC C C TT C G TT G T C T T G C AG AGAG AG C AC T G C T GAGAT AT C T AGAG G GAG G C TGCTCGGTGCCAATTGGGGTCTCCACTATTTATAGCGAGGATACGAAGGAACTTACCAT GAACTC CCTAGTCGTCAGTTGTAACGGTCGTGACTCGGTAACAGAATCAATGACTGAAGTCGTGACTACTG AAG AG C AAG C T G AAG AT T T C G G T G AAAG G C T G G C C C AG AAG C T C AT AG AT C AAG G T G C G AAAC G C AT T C T T GAC GAGAT CAAC T T C AAC AAG AT C AAAGAG AT T AAG GAAG AG G G T T T AC AT T AA

Enzima 4 de biosíntesis de hemo- uroporfirinógeno III sintasa (Id. de sec. n.°:14)

AT G C CAAAAG C CAT T C T T C T GAAGAATAAAAC TAC AC C GAAG GAT C C T TAT C T G G AGAAC T T C G T AAG T AG T G GC TAC T C GAC C GAT T T C GT AC CAC T T T TAGAT CAT AT T C ACAT GGAGAAAT C T GAGA TCA TCG CA TTTCTCA A G A CTG A CTA CTTTTTG CA TA A A A CTTTG G CG TTTA TTA TTA CG TCCCA A AGAG C T GTAGAAAT G C T GAAT GAG T G T AT G C AAAT AC T GAG AC GTACTGATCCT GAAAT TAC ACA A A TCATCTA TA GTA A ACCTGTCTATACAGTTGGCCCTGCCACCTACAGAATACTTGCGGATGCTG GCTTCGTG GAT C TAC GAG G C G GAGAT AAG G C AG GAAAC G GAT C CAT T C T AG C C C AGAT AAT T T T G AAT GAT GAC AT T T AC AC T G GAAT T GAAGAT T C T GAC AAG CA TA TA A CG TTTTT CAC G G GAGAAAC AAG GAGAGAC AT AAT T C C CAAAT GT T T AC T C T C T AAC AAC T T T CAAC T T T AC GAAAAGAT T G T C T AC AAGAC T C T T C C T AG G GAT GAT AT C G T GAC TAGAT T C AAG TCTG CCG TT GAC AG CAT C GAC CAA TCGCAAAGAAGTTCCAGTTGGGTGGTCTTCTTTTCGCCTCAAGGAACAGAGGACATTGTAACGTA T C T T C AAC AC AC C AAAG AC CAAT T T AAT AT T G CAT CTATCGGGC CAAC C AC AGAAAAAT AC C T T C TAAGCAAAAACCTGAAACCAAAAGTTGTGGCACCTAAGCCAGAGCCTATCTCTTTACTATTGTCT ATACAAAAAG T G CAC T AA

Enzima 5 de biosíntesis de hemo- uroporfirinógeno III descarboxilasa (Id. de sec. n.°:15)

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Enzima 6 de biosíntesis de hemo- coproporfirinógeno III oxidasa (Id. de sec. n.°:16)

ATGGCCA TCGA CTCTG ATA TCA ATCTA AG CTCTCCCA A TG A TTCCATCCGTCA A A GG ATGTTCGA GCTTATCCAGCGGAAGCAACTCGAAATTGTCGCTGCATTGGAGGCAATTGAAGGAAACGATACCA AATTTCGTTCTGATTCTTGGGAAAGAGGAGCCGAAGGTGGAGGAGGAAGATCTATGCTTATTCAA GATGGAAGAGTGTTTGAAAAGGCTGGTGTAAATATTTCCAAGGTTCATGGCGTATTGCCTCCTCA AGCTGTGAGCCAGATGAGAAATGACCACTCCAAGCTAGATCTGCCTGCGGGAACCTCTCTGAAGT TCTTTG CCTG TG G G CTTTCG TTG G TC A TTCA TC CC CA TA A TCC CC A TG C TC CA A CTA CC CA TC TG AATTATCGCTACTTCGAAACTTGGGATGAAACTGGAAAGCCTCACACCTGGTGGTTTGGGGGCGG TGCTGATTTAACGCCTTCGTACCTGTATCCCGAGGATGCCAAGCAATTCCATCAAGCCCATAAGG AT G CC C T G GACAAACAC GAT GT TAGC T T GTACC C GAGAT T C AAAAAGT GG T GT GAT GAAT ACT T T CTGATCAAACATCGAAATGAAACTAGAGGTATTGGGGGTATTTTCTTTGAT GATTT TGACGAGTT TG A TG CTGA GA G GTCCCTGA A GTTG GTTG AA G ATTG TTTCA A TG CTTTCTTG GA A TCTTA TCCCG C TAT CAC T CGAAAAAGGAT GGACAC C C CT T CAAC T GAT GC T GAGAAGAAC T GGCAACAAAT T AGA AGAGGAAGATAT GT CGAAT T CAACT TAGTAT T GGAT AGAGGTACT CAAT T T GGT T T GAGAACGCC TGGA TCTCG TG TTGAAAGTATTTTGATGTCGTTGCCAAGAACAGCTGGTTGGGTCTATGATCATC AT C C AGAG CCTGGCTC C AGAGAAGAG GAG T TAT T G C AG G T AC T AC AAAAT C C TAT T GAAT G G G T A TGA

Enzima 7 de biosíntesis de hemo- protoporfirinógeno oxidasa (Id. de sec. n.°:17)

ATG CTGA A A AG TCTTGCA CCAA A TTCCTCA ATTGCCGTTTTAG GTTCA GGG A TA TCTGGA TTG A C TTTCA GCTTTTTTTTG A A TCG G TTG CG TCCCG A TG TTA A G A TCCA TA TCTTTG A A A A A TCCA A G C AGG T T G GAG GAT GGAT CAGAT C AGAAGAGCAT GAAAC T T T T CAT T T T GAAAAGGGAC CCAGAAC T T T G AG AG G C AC AAAT AC GGGTACCTT GAT G TTG TTG G A TC TTCTT AC C AAG AT AG GAG C AAAT G A CA A GG TCCTGGGACTGCACAAAGATTCTCTTGCTAATAAAAAGTATCTGTTGTCCCCGTTCTCAG A TG TTCA CGGAAACAACGCAAAGCTTCTTCAAGTGCCACAGGATTTCAGCTCTTTTGTAAAGTTC ATGTTTGACCCGTTGTCTAA G GA TCTCA TTCTCG GTCTTTTG AA A GA A CCA TG GCAA CCA A A ATT AAAGT AT T CAGAT GAGT C GGT T GAC CAT T T T T T CAACAGAAGAT T T GC TAC CAAAC TAT CAGAGA ATATCGTCAGCGCAATTGTGCATGGAATCTATGCGGGCGACGTGAAGAAGTTAAGTGTGAAAGCC ATCTTCCCTAGGCTCCCTGAGATGGAACAGGAAAGTGGCTCTATTATAAGGTATATGATCGCCCA AT ACAG GACAAAAAAGAAC GT C AAACAAAAAGT T GAC C C T T T T T T G GC AGAT TAT GAAAAAT T G A TCGG TA C A TCTTTG A G TTTC A A A A A TA TTTCTTTG TTTCTG A A A A A C TTTC CC A TG CTG A G TTTT CAG GGT GGAC TAC AGAAAC T T C C CAT C T CAT T GAAGAAC CAT T TAT CACAGAT T GAAAACAT CAA GT T T CAT T T T GAC AG C AAAAT CAAAAACAT TGCTT T GGAGAGCGGT AAGGT GGCAT T GAC T GAC C AT GAT CAG GT T TAT C T T GT T GAC CAT G T GAGAT C TAC CAT T AAT AC CAAC GAAT T GGCCAAAAT C A TTTCA CCCGTTGTTCCAAGTTCTACTAAGAAAAAATCCGTTTTCAAATCCAAAGCGAATGGCCC AGGGCTGGT CAAAT G T T T GAG C T G G C T AC AC T AT AC AAAT AT AC T AAT G T G C AAC AT T T AT AT AC CTAAGCACGTCTCAAAATCTAT CA CCG GA TTTG GA TACTTGG TTCCTCGA TCA A TG TCTTCTCA G G C AT C CAAAC TTCTCGGTGT C AT AT T T GAC T C AGAC AT C GAGAC T G CAAT GAC T C C T AAT T T T AC AGAG G C C AAC AT TAC G G C GAT AAAC AG T AAC T C T G CAT C T C C C AAG CAAC T C C AAAAG T T T T C T G AC CAAT T C GT CAAT AAT GAT C T C CC TAAATACAC CAAGT T GAC GC T AAT GC T T GGAGGT CAT TAT CTCAAGTCGGAGGCAGACATGCCCGGTTCCGCAGAGAGTAAACATGCTGTCAAGGCGATTCTGTC AAAT CAC C T GAAT AT T GAT C T AGAT GAG T T T G CAT C T T T G C C AGAC T T CAAGAT G GAAAT CAC C A AGAT C C C CAAC T G CAT T C C C CAAT AT GAAG T T G G G TAT C T T GAT C T CAAGAGAAAG G T T CAGAAT GCAGCCTCCAAAGAGTTCAACGACCAAATAAGTTTTGGAGGCATGGCATTTGGTGATGGTGTGGG GA TCCCTGACTGTGTCCAGAATGCATTCAAAGATTCGGCTACCCTCAGTGGCATTTAA

Enzima 8 de biosíntesis de hemo- ferroquelatasa (Id. de sec. n.°:18)

A TG CTTA A CCGTCGTTTCCAATCTACCGTGTCCTCGAGTCTGAACAAGGGCACTGGAATAGTGTT CA TG A A TA TG G G TG G TCCCTCCA CTG TCA A G G A A A CCTA TG A CTTTTTA TTTCG TCTTTTCTCG G ACGGAGATTTAATCCCGTTTGGCAGATTTCAGAACATCCTGGCCCGCTTCATTGCAAGTAGAAGA ACACCCAAAATTGAATCCTACTACAAAGCTATCGGAGGTGGGTCTCCTATCCGAAAGTGGTCTGA AT AC CAGAGT T C TAAAC T AT G T GAAAAAT TAGACAT T AT C AG T C C AC AAT CGGCTCCT C AT AAG C CT T A T G T TG C C TT C AGAT AC G C T AAT C C T C T C AC T GAAGAT AC T T T AC AAAAGAT GAAAAAT GAT GGAAT TAC T AAG GC CAT T GCC T T T T C T CAAT AT C C G CAAT T T AGT T AT T CAAC CAC C GGAT CAT C GAT TAAC GAAC T T T AC AG G CAAT C GAAAAT TTTGGACCCT GAT CAAT C T AT TAAAT G GAC AG T T A TAGAT CGCTGGCCTGAC CACC CAGC C T TAGT TAAAACT T T C GCAGCT CATAT CAAAGATAC T C TA AACAGAT T CAAAAC T GAAAAT G GAC T GAC T GACACAAAAGAC G TCG TCCTC CAAT T CAGT GC T CA TTCTTTACCAATGGATATTGTCAATAAAGGAGATTCGTATCCTGCAGAAGTCGCAGCGAGTGTCT TTGCCATTATGAAAGAACTTAACTTCTCAAATCCTTATAAATTAACCTGGCAATCACAGGTTGGC CCAAAGCCTTGGCTGGGTGCTCAAACTGAAAAAATTACCAAGCAGCTAGCATCCAGTGATGTTCC TG G A G TC G TTTTG G TTCCTA TTG CCTTTA CCTCTG A TCA TA TTG A A A CTCTCCA TG A A CTG G A TA T T GAAC T GAT T CAAGAAC TAC C T AAT C C T T CAAAAG T AAAG C GAG T T GAAT C G T T GAAC G GAGAC CA A A CTTTCA TTG ACTCCTTGGCAGAACTAGTGAAGAGTCACATTGATTCGAAGGTTGTATTTTC CAACCAGTTGC CAT T GGAT TCCATGCTGGGAGTAGTGTCAGATAATTCCCTCACAGATCCAAAAG A G TTTTTCA G A G CCCA TTG A

Parte C. Resultados y discusión

Ejemplo 24— Caracterización de la cepa MXY0183

Las condiciones de crecimiento óptimas para la cepa MXY0183 incluyen un pH objetivo de 3,0 a 6,0 y temperaturas de 28-35 °C. Para producir la proteína LegH, la cepa MXY0183 debe estar viva y crecer en condiciones aerobias durante un periodo de 6 días.

La expresión de los genes asociados con la cepa MXY0183 dio como resultado cambios fenotípicos en la cepa. La figura 8 muestra fotografías de matraces de agitación al inicio de la inducción (0 h) y 72 h tras la inducción. Los matraces designados como n.° 1 contienen la cepa huésped, MXY0051. Los matraces designados como n.° 2 y n.° 3 contienen una de las cepas intermedias (es decir, MXY0118, que contienen > 10 copias del gen LegH y la ALA deshidratasa de la ruta de biosíntesis de hemo) y la cepa de producción (es decir, MXY0183, que contiene > 10 copias del gen LegH y las 8 enzimas de la ruta de biosíntesis de hemo), respectivamente. El color rojo característico en el matraz n.° 3 después de 72 horas demuestra la producción de LegH unida a hemo.

Después de crecer en matraces de agitación, se lisaron las cepas de P. pastoris indicadas anteriormente, MXY0051, MXY0118 y MXY0183 y se procesaron las proteínas en un gel de SDS (figura 9A). La flecha muestra la posición de la proteína LegH. En la figura 9B se muestra una comparación de la producción de LegH en la cepa MXY0183 y en la cepa MXY0118, que demuestra la eficiencia de la carga de hemo de la proteína LegH por la cepa MXY0183.

Ejemplo 25— Caracterización de la cepa MXY0207

A continuación, se realizaron experimentos para determinar los beneficios de sobreexpresar el activador transcripcional, Mxr1, en presencia de los genes que codifican para las 8 enzimas implicadas en la biosíntesis de hemo. Se hicieron crecer la cepa MXY0183, que contiene > 10 copias de la secuencia de LegH y los genes que codifican para las 8 enzimas implicadas en la biosíntesis de hemo, y las cepas hermanas MXY0206 y MXY0207, que contienen > 10 copias de la secuencia de LegH, los genes que codifican para 8 enzimas implicadas en la biosíntesis de hemo, y el activador transcripcional Mxr1, en cultivos en matraz de agitación en presencia de glicerol, que es una fuente de carbono de represión para estas cepas. Las fotografías de los cultivos en matraz de agitación después de 48 h se muestran en la figura 10A, y las fotografías de los sedimentos de células hechas crecer en medio BMY durante 48 horas sin fuente adicional de carbono se muestran en la figura 10B; estos experimentos demostraron que la expresión significativa de transgenes (por ejemplo, enzimas de hemo) bajo el control del promotor de AOX1 se produce en ausencia de una fuente de carbono de inducción cuando se consume una fuente de carbono de represión en el medio de crecimiento de una cepa en la que también se expresa Mxr1 a partir del promotor de AOX1. El rendimiento relativo de LegH cargada con hemo, cuando se hicieron crecer cultivos en matraz de agitación en ausencia de agente de inducción, se muestra en la figura 10C. Estos experimentos demostraron que la producción significativa de una proteína recombinante cargada con hemo se logra a partir de transgenes dirigidos por el promotor de AOX1 en ausencia de inducción por metanol en cepas de Pichia en las que la expresión de Mxr1 también está dirigida por el promotor de AOX1.

Se hicieron crecer cepas seleccionadas en tanques de fermentador de 2 l, y se determinó el rendimiento relativo de LegH y LegH cargada con hemo (figura 11). En comparación con la cepa MXY0183, la cepa MXY0207 produjo incluso más cantidad de LegH y fue capaz de producir suficiente hemo para carga con hemo de la proteína LegH muy eficazmente.

Ejemplo 26— Caracterización de la cepa MXY0291

Como se ha descrito anteriormente en los ejemplos 18-20, se construyó la cepa MXY0291 para recapitular la capacidad de producción de LegH de MXY0207, mientras estaba libre de genes de resistencia a antibióticos. Se determinó que la cepa MXY0291 contenía ~ 16 copias de var3 de LegH, Mxr1 y 7 de las 8 enzimas de biosíntesis de hemo. Cuando se hizo crecer en tanques de fermentador de 2 l, esta cepa mostró un rendimiento de LegH mejorado en comparación con MXY0207. Esta mejora se observó tanto en medio de inducción que contenía metanol/glicerol como metanol/dextrosa (D-glucosa) (figura 11).

Ejemplo 27— Caracterización de las cepas promotoras híbridas

Se expresaron copias adicionales de leghemoglobina de soja (LegH) en tres promotores constitutivos diferentes, pGAP, pGCW14 y pTEF1, en una cepa que ya contiene varias copias de LegH, todas las enzimas de biosíntesis de hemo, y el factor transcripcional Mxr1 bajo el control del promotor, pAOX1 (denominado anteriormente MXY0291). Cuando se induce por metanol en presencia de dextrosa (es decir, D-glucosa), los promotores constitutivos y pAOX1 dirigen la expresión de LegH mientras que sólo el promotor pAOX1 dirige la expresión de las enzimas de hemo. Esto conduce a una mejora adicional en el rendimiento de LegH en comparación con la cepa MXY0291 anterior (figura 11).

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   i. Una célula de levadura Pichia metilotrófica que comprende:

   a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica para un activador transcripcional Mxr1 operativamente unido a al menos un elemento promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1); y

   b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de las globinas PF00042 operativamente unido a al menos un elemento de AOX1; y

   c) una molécula recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de hemo seleccionado del grupo que consiste en ALA sintasa, ALA deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, UPG III sintasa, UPG III descarboxilasa, CPG oxidasa, PPG oxidasa, y ferroquelatasa, operativamente unido a al menos un elemento promotor inducible por metanol.
2. 2. La célula de levadura de la reivindicación 1, en donde la célula de levadura metilotrófica es una célula de Pichia pastoris.
3. 3. La célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las moléculas de ácido nucleico recombinante se integran de manera estable en el genoma de la célula de levadura metilotrófica.
4. 4. La célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las moléculas de ácido nucleico recombinante se expresan de manera extracromosómica a partir de un plásmido competente para la replicación.
5. 5. La célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de Mxr1 es de Pichia pastoris.
6. 6. La célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el activador transcripcional comprende una secuencia mostrada en el n.° de registro de GenBank ABD57365, o el activador transcripcional está codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en el n.° de registro de GenBank DQ395124.
7. 7. La célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el elemento promotor de AOX1 es de Pichia pastoris.
8. 8. Un método para expresar un miembro de la familia de las globinas PF00042 en una célula, comprendiendo el método:

   proporcionar la célula de levadura de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y

   cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión de las moléculas de ácido nucleico recombinante,

   expresando de este modo el miembro de la familia de las globinas PF00042.
9. 9. El método de la reivindicación 8, en donde el miembro de la familia de las globinas PF00042 es una hemoglobina vegetal, preferiblemente leghemoglobina, con la máxima preferencia una leghemoglobina que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en Id. de sec. n.°:4 e Id. de sec. n.°:6.
10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde las condiciones en las que se cultivan las células comprenden la adición de hierro o una sal farmacéuticamente aceptable o metabólicamente aceptable del mismo.
11. 11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la etapa de cultivo comprende cultivar la célula en presencia de metanol.