JP6073138B2 - 形質転換用酵母およびタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
(1) MPP1同族体の高発現により目的タンパク質の産生能力が向上していることを特徴とする、形質転換用酵母。
(2) MPP1同族体が、以下の(a)、(b)または(c)のいずれかのポリペプチド:
(a)配列番号38のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号38に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(c)配列番号38に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するポリペプチド;
または、以下の(d)、(e)または(f)のいずれかのポリペプチド:
(d)配列番号41のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(e)配列番号41に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(f)配列番号41に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するポリペプチド;
である、(1)に記載の形質転換用酵母。
(3) MPP1同族体が、以下の(g)、(h)または(i)のいずれかのポリペプチド:
(g)配列番号49のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(h)配列番号49に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(i)配列番号49に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するポリペプチド;
または、以下の(j)、(k)または(l)のいずれかのポリペプチド:
(j)配列番号50のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(k)配列番号50に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(l)配列番号50に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するポリペプチド;
を一部に含むポリペプチドである、(1)に記載の形質転換用酵母。
(4) さらに、転写因子が高発現されていることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の形質転換用酵母。
(5) 転写因子が、MPP1同族体と相加的または相乗的に働くことを特徴とする、(4)に記載の形質転換用酵母。
(6) 転写因子が、以下の(m)、(n)または(o)のいずれかのポリペプチド:
(m)配列番号46のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号46に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(o)配列番号46に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するポリペプチド;
である、(4)または(5)に記載の形質転換用酵母。
(7) 以下の(p)、(q)、(r)または(s)のいずれかの塩基配列:
(p)MPP1同族体をコードする塩基配列;
(q)配列番号10または11に記載の塩基配列;
(r)配列番号10または11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列;
(s)配列番号10または11に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列;
からなる遺伝子が高発現されていることを特徴とする、(1)〜(6)のいずれかに記載の形質転換用酵母。
(8) さらに、以下の(t)、(u)、(v)または(w)のいずれかの塩基配列:
(t)転写因子をコードする塩基配列;
(u)配列番号12に記載の塩基配列;
(v)配列番号12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列;
(w)配列番号12に記載の塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列;
からなる遺伝子が高発現されていることを特徴とする、(7)に記載の形質転換用酵母。
(9) 目的タンパク質の発現が、MPP1同族体によって活性化されるプロモーターによって制御されていることを特徴とする、(1)〜(8)のいずれかに記載の形質転換用酵母。
(10) プロモーターが、メタノール誘導性プロモーターであることを特徴とする、(9)に記載の形質転換用酵母。
(11) メタノール誘導性プロモーターが、AMOプロモーター、AOX1プロモーター、AOX2プロモーター、CATプロモーター、DAKプロモーター、DAOプロモーター、DHASプロモーター、FAOプロモーター、FDHプロモーター、FGHプロモーター、FMDプロモーター、GAPプロモーター、MOXプロモーター、MPP1プロモーター、Mut3プロモーター、Mxr1プロモーター、PER6プロモーター、PER10プロモーター、Pex3プロモーター、Pex5プロモーター、Pex8プロモーター、Pex10プロモーター、PHO1プロモーター、Prm1プロモーター、SNF1プロモーター、Swi1pプロモーター、Trm1プロモーター、Trm2プロモーター、YNA1プロモーター、及びYNA2プロモーターからなる群から選択される、(10)に記載の形質転換用酵母。
(12) メタノール誘導性プロモーターが、AOXプロモーター、DHASプロモーター、FMDプロモーター、及びMOXプロモーターからなる群から選択される、(10)に記載の形質転換用酵母。
(13) 形質転換用酵母が、メタノール資化性酵母の形質転換体である、(1)〜(12)のいずれかに記載の形質転換用酵母。
(14) メタノール資化性酵母が、ピキア(Pichia)属酵母、キャンディ(Candida)属酵母、及びトルロプシス(Torulopsis)属酵母からなる群から選択される、(13)に記載の形質転換用酵母。
(15) ピキア(Pichia)属酵母が、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、及びピキア・ミヌータ(Pichia minuta)からなる群から選択される、(14)に記載の形質転換用酵母。
(16) (1)〜(15)のいずれかに記載の形質転換用酵母を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
(17) (1)〜(15)のいずれかに記載の形質転換用酵母を培養することを特徴とする、(16)に記載の目的タンパク質の製造方法。
(18) 培養が、グルコース、及び/又はグリセロール、及び/又はメタノールを炭素源とすることを特徴とする、(17)に記載の目的タンパク質の製造方法。
(19) 培養が、グルコース、またはグリセロール、またはメタノールを炭素源とすることを特徴とする、(18)に記載の目的タンパク質の製造方法。
(20) (16)〜(19)に記載の製造方法で製造された、目的タンパク質。
1.形質転換用酵母
本発明の形質転換用酵母は、目的タンパク質をコードする遺伝子を転写・発現させるためのプロモーターを活性化する因子を酵母内で高発現させることによって、目的タンパク質の産生能力が向上していることを特徴する酵母である。本発明において、「プロモーターを活性化する因子」とは、「MPP1」及びその機能的相同体(以下、MPP1及びその機能的相同体を総称して「MPP1同族体」という)をいう。
51365 C6 transcription factor [Aspergillus fumigatus Af293] 、又はXP_753541 C6 transcription factor (ArcA) [Aspergillus fumigatus Af293] 、又はXP_775527 hypothetical protein CNBE2410 [Cryptococcus neoformans var. neoformans B-3501A]などのポリペプチドが挙げられる。
本発明の形質転換用酵母を用いてタンパク質を生産する方法としては、上記の形質転換用酵母を培養し、その菌体中または培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。好ましい例としてメタノール資化性酵母の場合を例示するが、本例示に限定されるものではない。
Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトもつ遺伝子断片(配列番号13)を全合成し、これをpUC19のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を調製した。また、LEU2遺伝子の両側にHindIII認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー1および2(配列番号14および15)を用いたPCRにより調製し、HindIII処理後にpUC-1のHindIIIサイトに挿入して、pUC-2を調製した。次に、MOXプロモーターの両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー3および4(配列番号16および17)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-2のBamHIサイトに挿入して、pUC-Pmoxを調製した。また、AOXプロモーターの両側にEcoRI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー5および6(配列番号18および19)を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC-2のMunIサイトに挿入して、pUC-Paoxを調製した。
MOXターミネーターの両側にXbaI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー11および12を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後に実施例1にて調製したpUC-1のXbaIサイトに挿入して、pUCTmを調製した。
PpMPP1遺伝子の両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー25および26(配列番号39および40)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後に前記pUCPgapTmG418のBglIIサイトに挿入して、pUCPgapPpMPP1TmG418を構築した。
GAPプロモーターで制御されたG418耐性遺伝子の両側にEcoRI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー20および22を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後に前記pUCTmのEcoRIサイトに挿入して、pUCTmG418を調製した。次に、Mut3遺伝子の5’末端側にSpeI認識配列、3’末端側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー27および28(配列番号42および43)を用いたPCRにより調製し、SpeIとBamHI処理後にpUCTmG418のSpeI-BglIIサイト間に挿入して、pUCMut3TmG418を構築した。次に、GAPプロモーターの両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー29および30(配列番号44および45)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUCMut3TmG418のBamHIサイトに挿入して、pUCPgapMut3TmG418を構築した。
Mut3遺伝子の5’末端側にBamHI認識配列、3’末端側にSpeI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー31および32(配列番号47および48)を用いたPCRにより調製し、BamHIとSpeI処理後に実施例2で得られたpUCPgapPaMPP1TmG418のBamHI-SpeIサイトに挿入して、pUCMut3PgapPaMPP1TmG418を構築した。次に、GAPプロモーターの両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー29および30を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUCMut3PgapPaMPP1TmG418のBamHIサイトに挿入して、pUCPgapMut3PgapPaMPP1TmG418を構築した。
GAPプロモーターの5’末端側にNotI認識配列、PpMPP1遺伝子の3’末端側にEco52I認識配列を付加した遺伝子断片を、実施例3で得られたpUCPgapPpMPP1TmG418を鋳型としてプライマー33および34(配列番号51および52)を用いたPCRにより調製し、NotIとEco52I処理後に実施例5で得られたpUCPgapMut3PgapPaMPP1TmG418のNotIサイトに挿入して、pUCPgapPpMPP1PgapMut3PgapPaMPP1TmG418を構築した。
実施例2〜6で構築したpUCPgapPaMPP1TmG418、pUCPgapPpMPP1TmG418、pUCPgapMut3TmG418、pUCPgapMut3PgapPaMPP1TmG418、pUCPgapPpMPP1PgapMut3PgapPaMPP1TmG418を用いて大腸菌を形質転換して、得られた形質転換体のそれぞれを、5mlの2YT培地(1.6% tryptone bacto(Difco社製), 1.0% yeast extract bacto(Difco社製), 0.5% NaCl)で培養し、得られた菌体からQIAprep spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて、それぞれ、pUCPgapPaMPP1TmG418、pUCPgapPpMPP1TmG418、pUCPgapMut3TmG418、pUCPgapMut3PgapPaMPP1TmG418、pUCPgapPpMPP1PgapMut3PgapPaMPP1TmG418を取得した。
実施例1で構築したpUC-PmoxLPmoxFdTmおよびpUC-PaoxLPaoxFdTmを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体のそれぞれを5mlの2YT培地(1.6% tryptone bacto(Difco社製)、1.0% yeast extract bacto(Difco社製)、0.5% NaCl)で培養し、得られた菌体からQIAprep spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて、それぞれ、pUC-PmoxLPmoxFdTmおよびpUC-PaoxLPaoxFdTmを取得した。
実施例8で得られたMPP1同族体発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体と完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto、2% peptone、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)に接種し、これを37℃、120rpm、72時間振盪培養後、遠心分離(15,000rpm、1分、4℃)により培養上清を回収した。
MPP1同族体発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体の培養上清への抗TNF-α Fab抗体分泌発現量は、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法により以下に示す方法で行った。ELISA用プレート(マキシソープ;NUNC社製)に固定化バッファー(0.1N重炭酸ナトリウム溶液,pH9.6)にて2500倍希釈したGoat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody(SIGMA社製)を各ウェル50μlずつ添加し、終夜4℃でインキュベートした。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
Claims (13)
- MPP1同族体の高発現により目的タンパク質の産生能力が向上していることを特徴とする、形質転換用ピキア(Pichia)属酵母であって、
MPP1同族体が、以下の(d)、(e)、または(f)のいずれかのポリペプチド:
(d)配列番号41のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(e)配列番号41に記載のアミノ酸配列において、10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチド;
(f)配列番号41に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチド;
である、形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。 - 以下の(q)、(r)または(s)のいずれかの塩基配列:
(q)配列番号11に記載の塩基配列;
(r)配列番号11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
(s)配列番号11に記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有し、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
からなる遺伝子が高発現されていることを特徴とする、請求項1に記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。 - MPP1同族体及び転写因子の高発現により目的タンパク質の産生能力が向上していることを特徴とする、形質転換用ピキア(Pichia)属酵母であって、
MPP1同族体が、以下の(a)、(b)、または(c)のいずれかのポリペプチド:
(a)配列番号38のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号38に記載のアミノ酸配列において、10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチド;
(c)配列番号38に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチド;
であり、
転写因子が、以下の(m)、(n)または(o)のいずれかのポリペプチド:
(m)配列番号46のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(n)配列番号46に記載のアミノ酸配列において、10個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ転写因子活性を有するポリペプチド;
(o)配列番号46に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するポリペプチド;
である、形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。 - 以下の(q)、(r)または(s)のいずれかの塩基配列:
(q)配列番号10に記載の塩基配列;
(r)配列番号10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
(s)配列番号10に記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有し、かつメタノール誘導性プロモーターを活性化する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
からなる遺伝子と、
以下の(u)、(v)または(w)のいずれかの塩基配列:
(u)配列番号12に記載の塩基配列;
(v)配列番号12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
(w)配列番号12に記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列;
からなる遺伝子が高発現されていることを特徴とする、請求項3に記載の形質転換用ピキ
ア(Pichia)属酵母。 - 転写因子が、MPP1同族体と相加的または相乗的に働くことを特徴とする、請求項3または4に記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。
- 目的タンパク質の発現が、メタノール誘導性プロモーターによって制御されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。
- メタノール誘導性プロモーターが、AMOプロモーター、AOX1プロモーター、AOX2プロモーター、CATプロモーター、DAKプロモーター、DAOプロモーター、DHASプロモーター、FAOプロモーター、FDHプロモーター、FGHプロモーター、FMDプロモーター、GAPプロモーター、MOXプロモーター、MPP1プロモーター、Mut3プロモーター、Mxr1プロモーター、PER6プロモーター、PER10プロモーター、Pex3プロモーター、Pex5プロモーター、Pex8プロモーター、Pex10プロモーター、PHO1プロモーター、Prm1プロモーター、SNF1プロモーター、Swi1pプロモーター、Trm1プロモーター、Trm2プロモーター、YNA1プロモーター、及びYNA2プロモーターからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。
- メタノール誘導性プロモーターが、AOXプロモーター、DHASプロモーター、FMDプロモーター、及びYNA2プロモーターからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。
- ピキア(Pichia)属酵母が、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、及びピキア・
ミヌータ(Pichia minuta)からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母。 - 請求項1〜9のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の形質転換用ピキア(Pichia)属酵母を培養することを特徴とする、請求項10に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 培養が、グルコース、及び/又はグリセロール、及び/又はメタノールを炭素源とすることを特徴とする、請求項11に記載の目的タンパク質の製造方法。
- 培養が、グルコース、またはグリセロール、またはメタノールを炭素源とすることを特徴とする、請求項11に記載の目的タンパク質の製造方法。
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