WO2011046218A1 - 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体 - Google Patents

抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2011046218A1
WO2011046218A1 PCT/JP2010/068206 JP2010068206W WO2011046218A1 WO 2011046218 A1 WO2011046218 A1 WO 2011046218A1 JP 2010068206 W JP2010068206 W JP 2010068206W WO 2011046218 A1 WO2011046218 A1 WO 2011046218A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
gene
partial
chain
expression vector
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/068206
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陶三 西山
博之 ▲高▼見
輝之 西
昌行 高野
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Priority to EP10823486.5A priority Critical patent/EP2489724A4/en
Priority to JP2011536200A priority patent/JPWO2011046218A1/ja
Publication of WO2011046218A1 publication Critical patent/WO2011046218A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to Hansenula polymorpha that produces antibodies, an antibody production method using the same, and antibodies obtained thereby.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Fab antibodies are low molecular weight antibodies that are attracting attention as next-generation protein drugs.
  • the Fab-type antibody is a full-length antibody obtained by removing the Fc region and the hinge site, and is an antibody composed of an Fd chain and an L chain.
  • Fab-type antibodies have been produced by digesting full-length antibodies by digestion with enzymes such as papain, and then purifying them.
  • enzymes such as papain
  • recombinant antibodies that directly produce only Fab-type antibodies have been used. The method is examined (nonpatent literature 2).
  • an appropriate host for the protein such as an animal cell, an insect such as a silkworm, an insect cell, an animal such as a chicken or a cow, a microorganism such as Escherichia coli or yeast, is used.
  • an appropriate host for the protein such as an animal cell, an insect such as a silkworm, an insect cell, an animal such as a chicken or a cow, a microorganism such as Escherichia coli or yeast.
  • CHO Choinese Hamster Ovary
  • Heterologous protein production by Escherichia coli which is most used as a biopharmaceutical production host, has the advantage that the growth rate of E. coli is high and the production cost is low, but there is no glycosylation and no folding. In many cases, there is a tendency that the protein is sufficient and accumulates as an inactive form in the cells. E. coli also has the disadvantage that the purification process becomes complicated because it is difficult to secrete and express heterologous proteins.
  • Non-patent Document 3 Yeast can be cultivated on a large scale with an inexpensive medium, and can produce a heterologous protein at low cost. By using a signal peptide, it can be secreted into the culture medium, facilitates the purification process, and since it is a eukaryote, posttranslational modifications such as glycosylation can be expected.
  • Hansenula polymorpha is known as a host for heterologous protein production, and examples of production include green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human epidermal growth factor, hirudin and the like.
  • Non-Patent Document 4 has not known an example in which an antibody is expressed with a practical expression level.
  • An object of the present invention is to secrete and express an antibody, particularly a partial antibody, particularly a Fab type antibody, using Hansenula polymorpha. It is another object of the present invention to provide a Hansenula polymorpha transformant that secretes and expresses antibodies, particularly partial antibodies, particularly Fab-type antibodies. Another object of the present invention is to provide a method for producing the transformant and a vector used for the method.
  • a transformant expressing an active antibody or a partial antibody was successfully produced by transforming Hansenula polymorpha using a linearized vector.
  • the transformant was cultured to successfully secrete and express antibodies and partial antibodies. Since it has been known that the expression of Fab-type antibodies by Hansenula polymorpha has failed in the circular expression vector, it was not expected to be successful just because the linear expression vector was used. Unfortunately, the use of a linear expression vector solved the problem and completed the present invention.
  • the present invention [1] A transformant of Hansenula polymorpha producing an antibody and / or a partial antibody; [2] The transformant according to the above [1], comprising an expression vector comprising an antibody and / or a partial antibody gene that is linearly integrated into a chromosome; [3] The above [2], wherein the expression vector has a base sequence encoding a promoter and a signal sequence on the 5 ′ side of the antibody and / or partial antibody gene, and a stop codon and / or terminator sequence on the 3 ′ side.
  • Transformant according to claim 1 [4] The trait according to [2] or [3] above, wherein the expression vector has a homologous base sequence having at least 50% sequence identity with a base sequence of at least 50 bp or more contained in the chromosome of Hansenula polymorpha. Convertible; [5] The above homologous base sequence is a promoter sequence present on the 5 ′ side of the antibody and / or partial antibody gene and / or a terminator sequence present on the 3 ′ side of the antibody and / or partial antibody gene.
  • the antibody and / or partial antibody is CD20, HER2, IL2R, CD33, CD52, EGFR, VEGF, CD3, CD25, TNF ⁇ , CD11, IgE, CD2, ⁇ 4integrin, CD80, CD86, IL6R, C5a, GPIIb / IIIa
  • the transformant according to any one of [13] to [15] above, wherein the partial antibody is a Fab type antibody;
  • the Fab type partial antibody derived from the antibody contained in HUMIRA registered trademark
  • the production amount of the Fab type partial antibody secreted in the culture supernatant is 1 mg / mL or more
  • the present invention has one or more of the following features.
  • One of the features of the present invention is a transformant of Hansenula polymorpha that produces an antibody and / or a partial antibody.
  • an expression vector containing an antibody and / or partial antibody gene is linearized, and the vector is integrated into a chromosome, and the antibody and / or partial antibody is secreted and produced. It is a transformant of Hansenula polymorpha.
  • One of the characteristics of the present invention is a transformant of Hansenula polymorpha that secretes and produces an antibody and / or a partial antibody, wherein the partial antibody is a Fab type antibody.
  • One of the characteristics of the present invention is a method for producing an antibody and / or partial antibody using a transformant of Hansenula polymorpha that produces the antibody and / or partial antibody.
  • One of the features of the present invention is an antibody and / or partial antibody produced by a method for producing an antibody and / or partial antibody using a transformant of Hansenula polymorpha that produces the antibody and / or partial antibody.
  • the present invention provides a transformant of Hansenula polymorpha that produces antibodies and partial antibodies, a method for producing antibodies and partial antibodies using the transformants, and antibodies and partial antibodies obtained therefrom.
  • Lane 1 is standard IgG
  • lanes 2-9 are elution fractions
  • lane 10 is standard IgG
  • lane 11 is an elution fraction confirmed to be detected in (A) (lane 6 sample in (A))
  • lane 12 is Standard IgG
  • lane 13 is the elution fraction (lane 6 sample of (A)) whose detection was confirmed in (A). It is a figure regarding Southern blotting (BY5242 strain) concerning Example 14 of the present invention.
  • the antibody of the present invention refers to a heterotetrameric protein constituted by disulfide bonds between two polypeptide chains of L chain and H chain, and has the ability to bind to a specific antigen. There is no particular limitation.
  • the partial antibody of the present invention is a binding fragment of the above antibody, and specifically includes Fab type antibody, F (ab ′) type 2 antibody, scFv type antibody, diabody type antibody, and derivatives thereof. It is not particularly limited as long as it has an ability to bind to a specific antigen.
  • the Fab-type antibody of the present invention refers to a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of an antibody are bound by an SS bond, and is not particularly limited as long as it has an ability to bind to a specific antigen.
  • the F (ab ′) type 2 antibody refers to a heterotetrameric protein in which the Fd chains of two Fab type antibodies are bound by an SS bond via a hinge part.
  • the scFv type antibody refers to a protein in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are linked with a linker peptide so as to become a single chain
  • a diabody type antibody refers to VH and VL. Is a dimerization by linking two fragments (for example, scFv etc.) linked by a linker or the like. Examples of these derivatives include those in which the molecule is modified with a molecule having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include human antibodies, humanized antibodies, mouse antibodies, dog antibodies, cat antibodies, horse antibodies, bovine antibodies, pig antibodies, chicken antibodies, and chimeric antibodies fused with these. It is done.
  • the type of the partial antibody (eg, Fab-type antibody) of the present invention is not particularly limited.
  • human antibody, humanized antibody, mouse antibody, dog antibody, cat antibody, horse antibody, bovine antibody, pig antibody, chicken antibody examples include partial antibodies (for example, Fab type antibodies) consisting of partial sequences of chimeric antibodies fused with these.
  • a Fab type antibody is particularly preferable.
  • the antigen to which the antibody of the present invention or a partial antibody (Fab type antibody or the like) binds is not particularly limited, but preferably CD20, HER2, IL2R, CD33, CD52, EGFR, VEGF, CD3, which are known as drug discovery targets, Antigens such as CD25, TNF ⁇ , CD11, IgE, CD2, ⁇ 4integrin, CD80, CD86, IL6R, C5a, GPIIb / IIIa, RSVF Protein, VEGF-A, GM-CSF and the like can be mentioned.
  • the gene encoding the antibody of the present invention is an L chain gene and an H chain gene (that is, a combination of an L chain gene and an H chain gene).
  • the gene encoding the Fab-type antibody may be an L chain gene and an Fd chain gene (that is, a combination of an L chain gene and an Fd chain gene), or an L chain Fd. It may be a chain fusion gene or an Fd chain L chain fusion gene.
  • the L chain Fd chain fusion gene is a gene in which an L chain gene and an Fd chain gene are arranged in order, and a linker sequence is included between them (ie, from upstream, L chain gene-linker sequence-Fd chain gene).
  • the chain fusion gene is a gene in which an Fd chain gene and an L chain gene are arranged in order, and a linker sequence is included between them (that is, from the upstream, Fd chain gene-linker sequence-L chain gene).
  • a method for preparing a gene such as an L chain gene, an H chain gene or an Fd chain gene used in the present invention is not particularly limited, and it may be prepared by PCR from various antibody producing cells, hybridomas or phage display libraries, and the base. The gene may be prepared by total synthesis based on the sequence.
  • the Hansenula polymorpha in the present invention is preferably a strain such as NCYC495 (ATCC14754), 8V (ATCC34438), DL-1 (ATCC26012). These strains can be obtained from the American Type Culture Collection. In addition, derivatives derived from this strain are also included. For example, in the case of a leucine-requiring strain, BY4329 derived from NCYC495, BY5242 derived from 8V, BY5243 derived from DL-1 and the like are sold from National BioResource Project. Is possible.
  • the transformant in the present invention is a transformant of Hansenula polymorpha that produces an antibody and / or a partial antibody (Fab type antibody or the like).
  • the transformant can be obtained by transforming host Hansenula polymorpha with an expression vector containing a linearized antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.) gene.
  • the linear state of the vector in the present invention refers to a state in which one or more of the circular expression vectors are cut and linearized.
  • the method for preparing the linear vector may be a linear vector obtained by cleaving a circular vector with a restriction enzyme or the like, or a PCR method using a circular vector as a template.
  • the expression vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing an antibody and / or a partial antibody in host Hansenula polymorpha.
  • Examples of expression vectors that can be used include pSH19, pSH15, and pUC19.
  • the expression vector used in the present invention contains the antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.) gene in such a manner that it can be expressed in a linear form when incorporated into the chromosome of the host Hansenula polymorpha. .
  • the expression vector of the Fab type antibody in the present invention includes a base sequence including an L chain gene and an Fd chain gene, a base sequence including an L chain Fd chain fusion gene, and / or a base sequence including an Fd chain L chain fusion gene.
  • the Fab-type antibody expression vector in the present invention may be used in the form of one type (single) vector in which the L chain gene and the Fd chain gene are present on the same vector as shown in Example 1. Alternatively, it may be used in the form of two types of vectors (that is, a combination of two types of expression vectors) in which the L chain gene and the Fd chain gene are present on different vectors as shown in Example 3. .
  • the antibody and / or partial antibody gene contained in the expression vector has a base sequence encoding a promoter and a signal sequence on the 5 'side, and a stop codon and / or terminator sequence on the 3' side.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as expression can be induced in Hansenula polymorpha.
  • MOX methanol oxidase
  • GAP GAP
  • TEF TEF
  • FMD promoter etc. Is mentioned.
  • it is the MOX promoter or GAP promoter of Hansenula polymorpha (preferably Hansenula polymorpha which is the host).
  • the base sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as Hansenula polymorpha encodes a signal sequence capable of secreting and expressing the protein, but Saccharomyces cerevisiae's mating factor ⁇ (MF ⁇ ) prepro signal (eg, sequence) And a base sequence encoding No. 8).
  • Hansenula polymorpha encodes a signal sequence capable of secreting and expressing the protein, but Saccharomyces cerevisiae's mating factor ⁇ (MF ⁇ ) prepro signal (eg, sequence) And a base sequence encoding No. 8).
  • the base sequence encoding the signal sequence and the antibody and / or partial antibody gene (eg, L chain gene, Fd chain gene, H chain gene, L chain Fd chain fusion gene, Fd chain L chain fusion gene, etc.) May be linked by a base sequence encoding an appropriate linker sequence.
  • the base sequence encoding this linker sequence is not particularly limited, the signal sequence and the antibody and / or partial antibody gene product (L chain, Fd chain, H chain, L chain Fd chain fusion protein or Fd chain L chain fusion after secretory production) A base sequence that can be separated from proteins, etc.) is preferred.
  • a base sequence encoding the amino acid sequence of Lys-Arg that is recognized and cleaved by KEX2p of Hansenula polymorpha, which is a kind of protease can be used as a base sequence encoding a linker sequence.
  • the terminator sequence is not particularly limited as long as Hansenula polymorpha can terminate gene transcription.
  • the terminator of the MOX gene of Hansenula polymorpha can be used.
  • the expression vector used in the present invention is preferably at least 50 bp or more base sequence and preferably at least 50% (preferably 70% or more) contained in the chromosome of Hansenula polymorpha (preferably, Hansenula polymorpha of the host). More preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 100%).
  • identity refers to an optimal alignment when two base sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is used to align sequences for optimal alignment). It means the ratio (%) of the same base sequence to the entire base sequence that overlaps in one or both of them.
  • NCBI BLAST-2 National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool
  • a base sequence having at least 50% or more sequence identity with a base sequence of at least 50 bp contained in the chromosome of the Hansenula polymorpha is an antibody.
  • / or a promoter sequence present 5 ′ of the partial antibody gene and / or a terminator sequence present 3 ′ of the antibody and / or partial antibody gene is an antibody.
  • the expression vector used in the present invention has a Hansenula polymorpha (preferably a Hansenula polymorpha of the host) as a promoter sequence present on the 5 ′ side of the antibody and / or partial antibody gene.
  • the MOX gene of Hansenula polymorpha (preferably Hansenula polymorpha of host) is preferably used. It has a terminator sequence.
  • the first promoter and the second promoter may be the same or different.
  • the first and second promoters are preferably the MOX promoter or GAP promoter of Hansenula polymorpha (preferably the Hansenula polymorpha host).
  • the first signal sequence and the second signal sequence may be the same or different.
  • the first and second signal sequences are preferably Saccharomyces cerevisiae's Mating Factor ⁇ (MF ⁇ ) prepro signal.
  • the first terminator sequence and the second terminator sequence may be the same or different.
  • the first and second terminator sequences are preferably terminator sequences of the MOX gene of Hansenula polymorpha.
  • the expression vector used in the present invention preferably contains a selection marker such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene.
  • a selection marker such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene.
  • the transformant of the present invention can be obtained by selecting a transformant incorporating the expression vector using a selection marker.
  • the selectable marker is not particularly limited, but auxotrophic strains of uracil, leucine, adenine, and histidine are prototrophic phenotypes as long as they are auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, and HIS4 gene. You can choose by recovery.
  • drug resistance genes such as a G418 resistance gene, a zeocin resistance gene, and a hygromycin resistance gene can be selected based on resistance on a medium containing G418, zeocin, and hygromycin, respectively.
  • the position of the selectable marker in the expression vector is not particularly limited as long as it is possible to select a transformant incorporating the expression vector using the selectable marker.
  • the position of the antibody and / or partial antibody gene is selected. It is further 5 ′ of the promoter on the 5 ′ side.
  • the 5 ′ side of the first promoter is preferred.
  • it is preferable that a selection marker is present on the 5 'side of each of the first promoter and the second promoter.
  • Transformation of Hansenula polymorpha can be performed according to a known method (for example, electroporation). For example, Meth. Enzymol. , 194: 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), and the like.
  • an expression vector containing a linearized antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.) gene is incorporated on the chromosome of Hansenula polymorpha which is a host.
  • the number of copies of the expression vector per chromosome is 1 copy or 2 copies or more, and is not particularly limited, but 2 copies or more are preferable for high production.
  • the copy number of the expression vector per chromosome can be confirmed using, for example, the Southern blotting method. That is, genomic DNA is extracted from the transformant and treated with an appropriate restriction enzyme.
  • the treated genomic DNA is separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon membrane, and integrated into genomic DNA by hybridization using a probe having a base sequence complementary to an appropriate gene in the expression vector.
  • the copy number of the expressed expression vector can be confirmed.
  • Such a confirmation method can be analyzed by a technique as shown in Example 14, for example.
  • various selectable marker genes LEU2, URA3, ADE1 whose transcription amount is reduced by shortening the promoter region as a selectable marker. , HIS4).
  • a method of using a LEU2 gene, a URA3 gene or the like with a shortened promoter region as constructed in Example 3 as a selection marker can be mentioned.
  • a plurality may be integrated at the same position, or one copy may be integrated at different positions.
  • the method of integrating an expression vector containing an antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.) gene onto a chromosome may be non-specific integration without using a homologous region, or integration using one homologous region. However, double integration type integration using two homologous regions may be used.
  • the homologous region only needs to have a sequence identity of 50% or more by comparing the base sequence of the chromosome and the expression vector, and the length is not particularly limited, but is preferably 50 bp or more.
  • the sequence identity of the homologous region is more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 100%.
  • identity is determined as described above.
  • homologous recombination is suitably performed by increasing the sequence identity of the base sequence at the end of the homologous region, and those skilled in the art can select a homologous region having a suitable sequence identity.
  • the length of the homologous region is more preferably 100 bp or more, further preferably 500 bp or more, and still more preferably 1000 bp or more. Further, it is more preferably 10 kbp or less, further preferably 5 kbp or less, and further preferably 3 kbp or less. It is well known to those skilled in the art that if the length is too long, the vector size increases and the vector becomes difficult to enter, and the upper limit can be appropriately selected.
  • homologous recombination is suitably performed by increasing the length of the homologous region, and the lower limit can be appropriately selected.
  • One skilled in the art can select a homologous region of suitable length.
  • the homologous region of a plasmid vector can be cleaved at one or more sites with a restriction enzyme, and transformation can be performed so that the homologous region comes to the end of a linear expression vector. .
  • the expression vector used in the present invention contains at least 50 bp or more base sequence and preferably at least 50% (preferably 70% or more) contained in the chromosome of Hansenula polymorpha (preferably Hansenula polymorpha of the host). More preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, most preferably 100%), particularly the chromosome of Hansenula polymorpha (preferably the host Hansenula polymorpha).
  • the terminator sequence is present 3 'to the antibody gene The, is expected to be easily incorporated into the chromosome by homologous recombination.
  • the position where the expression vector containing the antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.) gene is incorporated is that the transformant is an antibody and / or partial antibody (Fab type antibody, etc.).
  • surroundings of a MOX gene are mentioned, More preferably, the MOX promoter area
  • an expression vector containing a MOX terminator is adopted as an expression vector, and the expression vector linearized by cutting at an EcoRV site present in one position in the sequence of the MOX terminator is used. By using it, it can be incorporated into the MOX terminator.
  • the base sequence of the promoter present on the 5 ′ side of the antibody and / or partial antibody gene and / or the base sequence of the terminator present on the 3 ′ side contained in the expression vector used in the present invention respectively, Hansenula polymorpha 50% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90%) of the MOX promoter region sequence (for example, SEQ ID NO: 1) and MOX terminator region sequence (SEQ ID NO: 2) on the chromosome of As described above, most preferably 100%) by adopting a base sequence having sequence identity, homologous recombination occurs in the MOX terminator region and / or the MOX promoter region, and the integration position is the MOX terminator region on the chromosome and / or Or a form that is a MOX promoter region It is possible to obtain a transformant.
  • the MOX promoter region sequence for example, SEQ ID NO: 1
  • MOX terminator region sequence for example, SEQ ID NO: 2
  • MOX gene deficiency refers to a state in which a part or all of the MOX gene on the chromosome has become nonfunctional due to deletion or destruction. MOX gene deficiency can be confirmed by the presence or absence of growth in a medium containing methanol as a single carbon source as in Example 6. Examples of a method for producing a strain deficient in the MOX gene include a method of inserting a Fab type antibody expression vector into the MOX gene as in Example 6.
  • a state in which a part or all of the MOX gene has become nonfunctional due to deletion or destruction is because there is a base deletion in the base sequence of the gene on the chromosomal DNA.
  • the promoter or operator of the MOX gene Transcriptional control does not function, MOX gene is not expressed, (2) Frame shift occurs, MOX protein is not expressed as an active protein, (3) Part or all of the structural gene in MOX gene is missing Therefore, the active protein may not be expressed.
  • the state (3) can be mentioned. For example, as described above, when an expression vector is incorporated into the MOX promoter region or MOX terminator region of the MOX gene, it is expected that the MOX gene is lost.
  • the culture of the transformant obtained as described above can be performed according to a known method.
  • a method for producing an antibody or a partial antibody (Fab type antibody or the like) using the transformant of the present invention a method of culturing the transformant of Hansenula polymorpha and accumulating it in the culture supernatant.
  • any medium can be used as long as it contains a nutrient source that can be assimilated by Hansenula polymorpha.
  • sugars such as glucose, sucrose and maltose
  • organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid and propionic acid
  • alcohols such as methanol, ethanol and glycerin
  • hydrocarbons such as paraffin
  • fats and oils such as soybean oil and rapeseed oil
  • nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, and other nutrient sources such as inorganic salts and vitamins as appropriate.
  • a normal medium mixed and blended can be used, and can be cultured by either batch culture or continuous culture. It is also possible to induce the expression of antibody genes and the like during the culture.
  • the culture of the present invention can be usually performed under general conditions, for example, by aerobically culturing for 10 hours to 10 days at a pH of 2.5 to 10.0 and a temperature range of 10 ° C. to 48 ° C. be able to.
  • the production amount of the Fab type antibody secreted in the culture supernatant is as follows.
  • the transformant having a concentration of 1 mg / L or more was obtained by transforming Hansenula polymorpha using the expression vector containing the Fab-type antibody gene shown in Example 1 by the method shown in Example 5.
  • the concentration of the Fab-type antibody was 1 mg / L or more. This refers to a transformant of Hansenula polymorpha.
  • the antibody and / or partial antibody (Fab type antibody etc.) produced using the transformant of the present invention may be in the state of a culture supernatant or may be isolated from it by any method. . Isolation of an antibody and / or a partial antibody (Fab type antibody or the like) from the culture supernatant can be carried out by appropriately combining known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows. First, the transformant is cultured in an appropriate medium, and the cells are removed from the culture supernatant by centrifugation of the culture solution or filtration.
  • the obtained culture supernatant is subjected to salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography.
  • the antibodies of the present invention and / or partial antibodies can be isolated from the culture supernatant by using techniques such as chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and ultrafiltration alone or in combination. Release.
  • the isolated antibody and / or partial antibody can be used as it is, but after that, a modification that brings about a pharmacological change such as PEGylation, and a modification that adds a function such as an enzyme or an isotope Can also be used.
  • a modification that brings about a pharmacological change such as PEGylation
  • a modification that adds a function such as an enzyme or an isotope
  • Various preparation processes may be used.
  • MOX promoter SEQ ID NO: 1
  • MOX terminator SEQ ID NO: 2
  • LEU2 gene SEQ ID NO: 3
  • LEU2 gene SEQ ID NO: 4
  • URA3 gene sequence used in the construction of the antibody expression vector No. 5
  • URA3 gene SEQ ID NO: 6
  • GAP promoter SEQ ID NO: 7
  • MF ⁇ mating factor ⁇ prepro signal
  • the antibody gene was chemically synthesized from an L chain (SEQ ID NO: 9) and an H chain (SEQ ID NO: 10) based on the public sequence information of a fully humanized anti-TNF- ⁇ antibody (adalimumab; HUMIRA (registered trademark)) ( JP 2009-082033) was used as a template to prepare by PCR.
  • Prime STAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used, and the reaction conditions were as described in the attached manual. Genomic DNA was prepared from each strain using Gen Toru-kun (manufactured by Takara Bio Inc.) under the conditions described herein.
  • Each plasmid was prepared by transforming into E. coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.). Preparation of the plasmid from the plasmid-carrying strain was performed using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • Example 1 Construction of Fab Antibody Expression Vector 1 A gene fragment (SEQ ID NO: 11) having a HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRI site was fully synthesized and inserted into the HindIII-EcoRI site of pUC19 to prepare pUC-1. A gene fragment with a HindIII site on both sides of the LEU2 gene was prepared by PCR using primers 1 and 2 (SEQ ID NOs: 12 and 13) and inserted into the HindIII site of pUC-1 after HindIII treatment (pUC-2) .
  • a gene fragment with BamHI sites on both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 3 and 4 (SEQ ID NOs: 14 and 15), and inserted into the BamHI site of pUC-2 after treatment with BamHI (pUC -3).
  • a gene fragment having MunI sites attached to both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 5 and 6 (SEQ ID NOs: 16 and 17). After treatment with MunI, it was inserted into the Munc site of pUC-3 (pUC-4).
  • a gene fragment with an XbaI site on both sides of the MOX terminator was prepared by PCR using primers 7 and 8 (SEQ ID NOs: 18 and 19), and inserted into the XbaI site of pUC-4 after treatment with XbaI (pUC-PmPmTm) .
  • a gene fragment having a SpeI site upstream of MF ⁇ was prepared by PCR using primers 9 and 10 (SEQ ID NOs: 20 and 21).
  • a gene fragment in which the 3 ′ end 20 bp of MF ⁇ was added upstream of the L chain and the SpeI site was added downstream was prepared by PCR using primers 11 and 12 (SEQ ID NOs: 22 and 23). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment having SpeI sites on both sides of the fusion gene of MF ⁇ and L chain was prepared by PCR using primers 9 and 12. This gene fragment was treated with SpeI and then inserted into the SpeI site of pUC-PmPmTm to construct pUC-PMLPmTm.
  • a gene fragment with a BglII site upstream of MF ⁇ was prepared by PCR using primers 13 (SEQ ID NO: 24) and 10.
  • a gene fragment in which the 3 ′ end 20 bp of MF ⁇ was added upstream of the Fd chain and the BglII site was added downstream was prepared by PCR using primers 14 and 15 (SEQ ID NOs: 25 and 26). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment having BglII sites on both sides of the fusion gene of MF ⁇ and Fd chain was prepared by PCR using primers 13 and 15.
  • This gene fragment was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PMLPmTm to construct pUC-PMLPmFTm.
  • This expression vector is designed so that the L chain and Fd chain of the Fab-type antibody are expressed under the control of separate MOX promoters.
  • Example 2 Construction 2 of Fab Antibody Expression Vector An expression vector was constructed so as to express the L chain and Fd chain of the Fab-type antibody under the control of the GAP promoter. That is, a gene fragment having BamHI sites on both sides of the GAP promoter was prepared by PCR using primers 16 and 17 (SEQ ID NOs: 27 and 28), and after treatment with BamHI, the BamHI site of pUC-2 described in Example 1 was used. (PUC-5). A gene fragment having MunI sites on both sides of the GAP promoter was prepared by PCR using primers 18 and 19 (SEQ ID NOs: 29 and 30), and inserted into pUC-5 MunI site after treatment with MunI (pUC-6). ).
  • the gene fragment with XbaI sites attached to both sides of the MOX terminator prepared in Example 1 was inserted into the XbaI site of pUC-6 (pUC-PgPgTm).
  • a gene fragment having a SpeI site on both sides of the MF ⁇ and L chain fusion gene prepared in Example 1 was inserted into the SpeI site of pUC-PgPgTm to construct pUC-PgLPgTm.
  • a gene fragment with a BglII site on both sides of the MF ⁇ -Fd chain fusion gene prepared in Example 1 was inserted into the BglII site of pUC-PgLPgTm to construct pUC-PgLPgFTm.
  • This expression vector is designed so that the L chain and Fd chain of the Fab-type antibody are secreted and expressed under the control of separate GAP promoters.
  • Example 3 Construction of Fab-type antibody chain (L chain, Fd chain) expression vector Fragments with MunI sites attached to both sides of the MOX promoter prepared in Example 1 were prepared by PCR, treated with MunI, The pUC-1 MunI site constructed in 1 was inserted (pUC-7). A gene fragment with XbaI sites attached to both sides of the MOX terminator prepared in Example 1 was prepared by PCR and inserted into the XbaI site of pUC-7 (pUC-8).
  • the L-chain expression vector was obtained by PCR using primers 1 and 2, and primers 20 (SEQ ID NO: 31) and 2 for gene fragments with HindIII sites on both sides of the LEU2 gene and the LEU2 gene with a shortened promoter region. Each was prepared, treated with HindIII, and then inserted into the HindIII site of pUC-8 (pUC-PmTm-1, pUC-PmTm-2). A gene fragment having a BglII site upstream of MF ⁇ was prepared by PCR using primers 13 and 10. A gene fragment having a 3 ′ end 20 bp of MF ⁇ upstream of the L chain and a BglII site downstream was prepared by PCR using primers 11 and 21 (SEQ ID NO: 32).
  • the Fd chain expression vector comprises a URA3 gene, a gene fragment with EcoRI sites on both sides of the URA3 gene with a shortened promoter region, primers 22 and 23 (SEQ ID NOs: 33 and 34), primers 24 (SEQ ID NO: 35) and 23. It was prepared by the PCR used, treated with EcoRI, and inserted into the EcoRI site of pUC-8 (pUC-PmTm-3, pUC-PmTm-4).
  • the gene fragments having BglII sites attached to both sides of the fusion gene of MF ⁇ and Fd chain prepared in Example 1 were inserted into the BglII sites of pUC-PmTm-3 and pUC-PmTm-4, respectively, and pUC-PmFTm-1, pUC-PmFTm-2 was constructed.
  • These Fd chain expression vectors are designed so that the Fd chain gene of the Fab antibody is secreted and expressed under the control of the MOX promoter.
  • pUC-PmFTm-1 uses the URA3 gene
  • pUC-PmFTm-2 uses the URA3 gene with a shortened promoter region as a selection marker.
  • Example 4 Construction of full-length antibody expression vector A gene fragment having a BglII site upstream of MF ⁇ prepared in Example 1 was prepared by PCR. A gene fragment having a MF ⁇ 3 ′ end 20 bp upstream of the H chain and a BglII site downstream was prepared by PCR using primers 14 and 25 (SEQ ID NO: 36). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment with BglII sites attached to both sides of the fusion gene of MF ⁇ and H chain was prepared by PCR using primers 13 and 25.
  • This gene fragment was treated with BglII and then inserted into the BglII site of pUC-PMLPmTm prepared in Example 1 to construct pUC-PMLPmHTm.
  • This expression vector is designed so that the L chain and H chain of the Fab-type antibody are expressed under the control of separate MOX promoters.
  • Example 5 Acquisition of recombinant antibody expression strains by transformation of Hansenula polymorpha
  • the various antibody expression vectors constructed in Examples 1 to 4 were cleaved at EcoRV or NruI sites in the MOX terminator and linearized. did. This fragment was used to transform Hansenula polymorpha.
  • Transformation methods include Hansenula polymorpha BY4329 (from NCYC495, leu1-1), BY5242 (from 8V, leu1-1), BY5243 (from DL-1, leu1-1), BY4868 (from NCYC495, ura3 leu1-1)
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Difco), 2% tryptone bacto (Difco), 2% glucose
  • 500 ⁇ l of the obtained preculture solution was inoculated into 50 ml of YPD medium, and after shaking culture at 30 ° C.
  • the cells were collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.).
  • the cells were suspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 250 ⁇ l of 1M DTT (final concentration 25 mM), and the suspension was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After collecting the cells (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), the cells were resuspended in ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.5.
  • the cells After collection (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), the cells were resuspended in 25 ml of ice-cold STM buffer. After collecting the cells (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), the cells were suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to obtain a competent cell solution. Mix 60 ⁇ l of this competent cell solution and 3 ⁇ l of each linear plasmid solution (DNA amount 0.5-1 ⁇ g) and transfer to a cuvette for electroporation (dispos cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments). And 7.5 kV / cm, 10 ⁇ F, and 900 ⁇ .
  • the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the cells were collected (3000 ⁇ g, 5 minutes, room temperature), washed with 1 ml of YNB medium (0.67% yeast nitrogen base (Difco), 1% glucose), and collected again (3000 ⁇ g). 5 minutes, room temperature).
  • the cells were suspended in an appropriate amount of YNB medium, and then applied to a YNB selective agar plate. A strain that grew by stationary culture at 37 ° C. for 3 days was selected to obtain various recombinant antibody expression strains.
  • Example 6 Obtaining Fab-type antibody expression strain deficient in MOX gene on chromosome After obtaining Fab-type antibody expression strain by the method of Example 5, methanol was used as a single carbon source. By inoculating the culture medium (0.67% yeast nitrogen base (Difco), 1% methanol), shaking culture at 30 ° C. for 72 hours, and selecting a strain that does not grow, A Fab type antibody expression strain lacking the above MOX gene was obtained.
  • the culture medium 0.67% yeast nitrogen base (Difco), 1% methanol
  • Example 7 Antibody secretion into culture supernatant and measurement of antibody secretion by ELISA method Secretory expression levels of Fab antibody and full antibody to culture supernatant were analyzed by sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method. did.
  • the culture supernatant was prepared as follows. That is, each antibody expression strain obtained in Example 5 or 6 was treated with 2 ml of BMGMY medium (1% yeast extract bacto, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate. (PH 6.0), 1% Glycerol, 1% Methaneol), and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours, followed by centrifugation (15,000 rpm, 1 minute, 4 ° C.) to prepare a culture supernatant.
  • BMGMY medium 1% yeast extract bacto, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate. (PH 6.0), 1% Glycerol, 1% Methaneol
  • the sandwich ELISA is an Anti-Isolated Antigen Specific Anti-HUMAN IgG (Fab SPECIFIC) diluted 5000 times with an immobilization buffer (0.1N sodium bicarbonate solution, pH 9.6) on an ELISA plate (Maxisorp; manufactured by NUNC).
  • Antibody manufactured by SIGMA was added at 50 ⁇ l / well and incubated at 4 ° C. overnight. After the incubation, the solution in the wells was removed, and 5-fold diluted immunoblock (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was added at 250 ⁇ l / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking.
  • PBST PBS (manufactured by Takara Bio Inc.) + 0.1% Tween 20) and then serially diluted standard protein (Anti-Human IgG Fab; manufactured by Rockland) and a diluted solution of the culture supernatant were 50 ⁇ l / Added in wells and reacted for 1 hour at room temperature.
  • the solution in the well was removed, washed twice with PBST, and then diluted 8000 times with PBSTIB (PBST + 1/50 diluted immunoblock) solution (secondary antibody: Anti-Human IgG (Fab SPECIFIC) PEROXIDASE CONJUGATE).
  • Antibody developed in Goat Affinity Isolated, manufactured by SIGMA was added at 50 ⁇ l / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. The solution in the well was removed, and after washing 4 times with PBST, TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, SureBlue (manufactured by KPL) was added at 100 ⁇ l / well and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. TMB Stop Solution (manufactured by KPL) was added at 100 ⁇ l / well to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (BenchMark Plus; manufactured by Bio-Rad). The antibody in the culture supernatant was quantified using a standard protein calibration curve. By this method, accumulation of antibodies secreted and expressed in the culture supernatant was confirmed (Table 1).
  • Example 8 Detection of Fab antibody by Western blotting Detection of Fab antibody and full antibody was performed by Western blotting. That is, 10 ⁇ l of the culture supernatant and the cell fraction obtained in Example 5 were respectively added to 2 ⁇ sample buffer (10% SDS, 50% Glycerol, 0.3125 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.01% BPB). ) 10 ⁇ l of the mixture was subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions using 15% e-PAGE (manufactured by ATTO).
  • the membrane after the transfer was immersed in TBST (0.24% Tris, 0.8% NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20) containing 3% BSA for 1 hour for blocking. After washing the membrane with TBST for 15 minutes x 1 time, 5 minutes x 2 times, secondary antibody diluted 20000 times with TBST: Anti-Human IgG (Fab SPECIFIC) PEROXIDASE CONJUDE DEVELOPED IN GOATI ) The solution was reacted at room temperature for 1 hour. The membrane was washed with TBST for 15 minutes ⁇ 1 time, 5 minutes ⁇ 2 times, and then light-emitted using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by GE Biosciences). The emitted membrane was exposed for an appropriate time with an imager (ChemiDoc XRS; manufactured by Bio-Rad).
  • Example 9 Purification of Fab antibody from culture supernatant Purification of Fab antibody from the culture supernatant was performed by the method shown below.
  • the culture supernatant obtained in Example 7 was clarified with a 0.2 ⁇ m filter (DISMIC; manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), and then preliminarily equilibrated with an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0).
  • the purified Fab fraction was obtained from the eluted fraction by elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 3.0) using a protein G column (HiTrap Protein G Fast Flow; manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the concentrate was obtained by ultrafiltration using Microcon 3 (Millipore).
  • Example 10 Confirmation of Fab antibody
  • the Fab antibody obtained in Example 9 was analyzed by SDS-PAGE. That is, a mixture of 10 ⁇ l of the concentrated solution and an equal amount of 2 ⁇ sample buffer was mixed with 15% e-PAGEEL (manufactured by ATTO) under non-reducing and reducing conditions (DTT in 2 ⁇ sample buffer). The sample was subjected to PAGE electrophoresis. After electrophoresis, the gel was washed with water for 15 minutes, stained with a staining solution (Bio-Safe CBB G-250 stain; manufactured by Bio-Rad) for 30 minutes, and then decolorized with water.
  • a staining solution Bio-Safe CBB G-250 stain; manufactured by Bio-Rad
  • TNF- ⁇ The binding ability of Fab antibody secreted and expressed by Hansenula to antigen (TNF- ⁇ ) was evaluated by ELISA method. Specifically, TNF- ⁇ (manufactured by PEPROTECH) diluted with PBS was added to an ELISA plate (Maxisorp; manufactured by NUNC) at 50 ⁇ l / well and incubated at 4 ° C. overnight. After the incubation, the solution in the well was removed, and 5 times diluted immunoblock (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was added at 250 ⁇ l / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking.
  • TNF- ⁇ manufactured by PEPROTECH
  • PBS ELISA plate
  • 5 times diluted immunoblock manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • PBST PBS + 0.1% Tween 20
  • a secondary antibody solution (secondary antibody: Anti-Human IgG (Fab SPECIFIC) PEROXIDASE Integrated Development Affinity Affinity Affinity Affinity Affinity Affinity Affinity Affinity Affinity 50 ⁇ l of each well was added and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, SureBlue manufactured by KPL
  • TMB Stop Solution manufactured by Bio-Rad
  • Example 12 Purification of full-length antibody Purification of a full-length antibody was performed by the method shown below.
  • the culture supernatant of the full-length antibody-expressing strain prepared in Example 7 was clarified with a 0.2 ⁇ m filter (DISMIC; manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), and this was preliminarily equilibrated buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0).
  • DISMIC 0.2 ⁇ m filter
  • HiTrapr Protein A Fast Flow manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Example 13 Detection of fully humanized anti-TNF- ⁇ full-length antibody by Western blotting Detection of fully humanized anti-TNF- ⁇ full-length antibody was performed by the method described below. That is, the full-length antibody solution obtained in Example 12 and standard IgG (ImmunoPure Human IgG, whole Molecular (manufactured by Thermo scientific)) were combined with Anti-Human IgG-Fc HRP conjugate Antibody (Betyl Laboratories, Inc.). Detection was performed by Western blotting using Anti-Human IgG (Fab SPECIFIC) HRP conjugate Antibody (manufactured by SIGMA).
  • IgG ImmunoPure Human IgG, whole Molecular (manufactured by Thermo scientific)
  • sample buffer 10% SDS, 50% Glycerol, 0.3125M Tris-HCl, pH 6.8, 0.01% BPB
  • sample buffer 10% SDS, 50% Glycerol, 0.3125M Tris-HCl, pH 6.8, 0.01% BPB
  • the membrane was immersed in TBST (0.24% Tris, 0.8% NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20) containing 5% BSA for 1 hour for blocking.
  • TBST 0.24% Tris, 0.8% NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20
  • secondary antibody diluted 50000 times with TBST Anti-Human IgG-Fc HRP conjugate Antibody (Betyl Laboratories, Inc.) solution or TBST
  • the antibody was reacted for 1 hour at room temperature in a secondary antibody diluted 200,000 times: Anti-Human IgG (Fab SPECIFIC) HRP conjugate Antibody (manufactured by SIGMA).
  • the membrane was washed with TBST for 15 minutes ⁇ 1, 5 minutes ⁇ 2 times, and then light-emitted using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by GE Biosciences). The emitted membrane was exposed for an appropriate time with an imager (ChemiDoc XRS; manufactured by Bio-Rad). As a result, a band was observed at the same position as the standard IgG under non-reducing conditions. Furthermore, under the reducing conditions, when the anti-human IgG-Fc HRP conjugate antibody was used as the secondary antibody, the H chain (about 50 kDa) band was obtained when the anti-human IgG (Fab SPECIFIC) HRP conjugate antibody was used as the secondary antibody. A band of L chain (about 25 kDa) was observed (FIG. 3).
  • Example 14 Analysis of introduced copy number of antibody expression vector on chromosome by Southern blotting Southern blotting of genomic DNA was performed using DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit (Roche). For detection of each Fab type antibody expression vector and L chain expression vector described in Examples 1 to 4, the LEU2 gene was used as a probe. For detection of the Fd chain expression vector described in Example 3, the URA3 gene was used as a probe.
  • the genomic DNA of each antibody expression strain prepared in Example 5 was digested with a restriction enzyme (BglII) and then subjected to agarose gel electrophoresis. The gel was immersed in a hydrolysis solution (0.25M HCl) for 30 minutes and then washed with water.
  • a restriction enzyme BglII
  • the introduced copy number of the Fab type antibody expression vector and L chain expression vector using the LEU2 gene and the URA3 gene as a selection marker was 1 copy.
  • the number of introduced copies of the L chain expression vector or Fd chain expression vector using the LEU2 gene or URA3 gene with a shortened promoter region as a selection marker was 2 to 3 copies.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを直鎖状にして、該ベクターを染色体に組み込んだハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、並びにハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いた抗体及び／又は部分抗体の製造方法を提供する。

Description

抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体
　本発明は、抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体に関する。
　近年、抗体は診断や治療等の医療分野において、抗原に対する高親和性を特徴として幅広く使用されている。最近、完全長型抗体の抗原結合部位以外の領域を一部もしくは全て除去することによって分子量を小さくした低分子化抗体が開発されつつある。低分子化抗体としては、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２などが挙げられる（非特許文献１）。低分子化抗体の特徴としては、例えば標的部位への高集積性が期待できる。
　中でも次世代タンパク医薬品としての利用が注目されている低分子化抗体としてＦａｂ型抗体がある。Ｆａｂ型抗体とは、完全長型抗体からＦｃ領域とヒンジ部位を除去したものであり、Ｆｄ鎖とＬ鎖から成る抗体である。Ｆａｂ型抗体は、これまで、完全長型抗体をパパインなどの酵素によって消化して分解し、その後精製するという製造方法が用いられてきたが、現在ではＦａｂ型抗体のみを直接生産させる遺伝子組換え法が検討されている（非特許文献２）。
　一般的に、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産するために、そのタンパク質に適切な宿主、例えば動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌、酵母などの微生物を選択する必要性がある。
　抗体のような高度なヘテロマー構造を有するタンパク質においては、特定の種の酵母でしか発現が報告されていないことから（非特許文献３）、特に最適な種を選択する必要性がある。
　現在、抗体医薬品は主にＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞等の動物細胞を用いて生産されているが、高価な培地や長時間の培養が必要とされ、生産コストが非常に高くなることが問題となっている。バイオ医薬品の生産宿主として最も使用されている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）による異種タンパク質生産は、大腸菌の増殖速度が速く生産コストが低いという長所を有するものの、糖鎖修飾が行われないこと、フォールディングが不十分でタンパク質が不活性型として菌体内に蓄積することなどの傾向が見られる場合が多い。また、大腸菌は異種タンパク質を分泌発現させることが困難であるため、精製過程が煩雑となる短所も持つ。
　そこで、代替宿主として酵母を用い、低コストで実用的かつ高生産の培養技術を確立するため、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）や、メタノール資化性酵母であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＮＲＲＬ　Ｙ－１１４３０株を用いて抗体を産生させる試みが複数報告されている（非特許文献３）。酵母は安価な培地で大規模高密度培養が可能であり、異種タンパク質を低コストで生産することができる。シグナルペプチドを利用すれば培養液中への分泌発現も可能で精製過程も容易となり、しかも真核生物であるため糖鎖付加などの翻訳後修飾も可能であるという長所が期待できる。
　ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、異種タンパク質生産の宿主として知られており、その生産例として、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト上皮成長因子、ヒルジンなどが挙げられる（非特許文献４）が、実用的な発現量で抗体を発現させた例は知られていない。
　マウス由来のＦａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖遺伝子を含んだ発現ベクターを環状の状態でハンゼヌラ・ポリモルファに導入し、抗体の産生を試みた例が報告されているが、培養上清に僅かにＬ鎖とＦｄ鎖がそれぞれ単独で分泌発現するにとどまり、発現タンパク質の大部分は菌体内に、しかもＬ鎖とＦｄ鎖がそれぞれ単独で蓄積されている状態であり、抗体の発現に成功していなかった（非特許文献５）。
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９１）　９：　５４５－５５１ Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４０：　１０４１－１０４３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｌｅｔｔ　（２００７）　２９：　２０１-２１２ Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，　Ｇ．　（Ｅｄ．），　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１０　ｐ１４７－１５５　（２００２），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ　（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，　Ｇｅｒｍａｎｙ） Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（２００１）　５６：１５７－６４．
　本発明は、ハンゼヌラ・ポリモルファを用いて、抗体、中でも部分抗体、特にはＦａｂ型抗体を分泌発現させることを課題とする。さらに、抗体、中でも部分抗体、特にはＦａｂ型抗体を分泌発現するハンゼヌラ・ポリモルファ形質転換体を提供することを課題とする。また、当該形質転換体を作製する方法、当該方法に用いるベクターをそれぞれ提供することを課題とする。
　本発明においては、直鎖状にしたベクターを用いて、ハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換することで、活性型の抗体や部分抗体を発現する形質転換体を作製することに成功した。また、該形質転換体を培養して、抗体や部分抗体を分泌発現させることに成功した。環状の発現ベクターでハンゼヌラ・ポリモルファによるＦａｂ型抗体の分泌発現に失敗した例が知られている以上、直鎖状の発現ベクターを用いたからといって成功することは期待できなかったが、思いもよらぬことに、直鎖状の発現ベクターを用いることで、課題を解決し、本願発明を完成するに到った。
　即ち、本発明は、
［１］抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体；
［２］直鎖状にして染色体に組み込まれた、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを含む上記［１］に記載の形質転換体；
［３］該発現ベクターが、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有する上記［２］に記載の形質転換体；
［４］該発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する相同塩基配列を有する上記［２］または［３］に記載の形質転換体；
［５］該相同塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である上記［４］に記載の形質転換体；
［６］染色体あたりの該発現ベクターのコピー数が２コピー以上である上記［２］～［５］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［７］染色体における該発現ベクターの組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である上記［２］～［６］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［８］染色体上のＭＯＸ遺伝子の機能が部分的又は完全に欠損している上記［２］～［７］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［９］栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして利用して選抜されたものである上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１０］栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子が、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である上記［９］に記載の形質転換体；
［１１］該発現ベクターに含まれる部分抗体遺伝子がＦａｂ型抗体遺伝子である上記［２］～［１０］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１２］Ｆａｂ型抗体遺伝子を含む発現ベクターが、Ｌ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである上記［１１］に記載の形質転換体；
［１３］抗体及び／又は部分抗体を分泌生産する上記［１］～［１２］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１４］抗体及び／又は部分抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は、マウス抗体から選ばれる抗体及び／又はそれに由来する部分抗体である上記［１］～［１３］のいずれかに記載の形質転換体；
［１５］抗体及び／又は部分抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ－Ａ、及び、ＧＭ－ＣＳＦからなる群から選ばれる１以上の抗原に結合するものである上記［１］～［１４］のいずれかに記載の形質転換体；
［１６］部分抗体がＦａｂ型抗体である上記［１３］～［１５］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１７］抗体及び／又は部分抗体としてＨＵＭＩＲＡ（登録商標）に含まれる抗体に由来するＦａｂ型部分抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型部分抗体分泌生産量が１ｍｇ／ｍＬ以上である上記［１３］～［１６］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１８］上記［１］～［１７］のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法；
［１９］上記［１８］に記載の製造方法で製造された抗体及び／又は部分抗体
を提供する；
または、本発明は以下の１または複数の特徴を有する。
　本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。
　本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを直鎖状にして、該ベクターを染色体に組み込んだことを特徴とする、抗体及び／又は部分抗体を分泌生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。
　本発明の特徴の一つは、部分抗体がＦａｂ型抗体であることを特徴とする、抗体及び／又は部分抗体を分泌生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。
　本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法である。
　本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法で製造された抗体及び／または部分抗体である。
　本発明により、抗体や部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、それを利用した抗体や部分抗体の製造方法、およびこれらより得られる抗体や部分抗体が提供される。
本発明の実施例８に係るウエスタンブロッティングに関する図である。 本発明の実施例１０に係るＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動（ＣＢＢ染色）に関する図である。 本発明の実施例１３に係るウエスタンブロッティングに関する図である。（Ａ）非還元条件でのＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ｆｃ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出、（Ｂ）還元条件でのＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ｆｃ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出、（Ｃ）還元条件でのＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出を示す。サンプルは実施例１２に記載のように調製した。レーン１は標準ＩｇＧ、レーン２－９は溶出画分、レーン１０は標準ＩｇＧ、レーン１１は（Ａ）にて検出が確認された溶出画分（（Ａ）のレーン６サンプル）、レーン１２は標準ＩｇＧ、レーン１３は（Ａ）にて検出が確認された溶出画分（（Ａ）のレーン６サンプル）である。 本発明の実施例１４に係るサザンブロッティング（ＢＹ５２４２株）に関する図である。
　以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明の抗体とは、Ｌ鎖とＨ鎖の各２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
　本発明の部分抗体とは、前記抗体の結合性断片であり、具体的にはＦａｂ型抗体、Ｆ（ａｂ’）２型抗体、ｓｃＦｖ型抗体、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
　本発明のＦａｂ型抗体とは抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ－Ｓ結合で結合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
　Ｆ（ａｂ’）２型抗体とは、２つのＦａｂ型抗体のＦｄ鎖がヒンジ部を介してＳ－Ｓ結合で結合したヘテロテトラマータンパク質を指す。さらに、ｓｃＦｖ型抗体とは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を一本鎖になるようにリンカーペプチドで連結されたタンパク質を指し、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体とは、ＶＨとＶＬをリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）を２つ結合させて二量体化させたもの指す。それらの誘導体としては、上記分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたものが挙げられる。
　本発明の抗体の種類は、特に限定されないが、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ブタ抗体、ニワトリ抗体やこれらを融合したキメラ抗体が挙げられる。本発明の部分抗体（例、Ｆａｂ型抗体）の種類は、特に限定されないが、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ブタ抗体、ニワトリ抗体やこれらを融合したキメラ抗体の部分配列からなる部分抗体（例、Ｆａｂ型抗体）などが挙げられる。本発明の部分抗体としては、Ｆａｂ型抗体が特に好ましく挙げられる。
　また、本発明の抗体や部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）が結合する抗原も特に限定されないが、好ましくは創薬のターゲットとして知られるＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＧＭ－ＣＳＦなどの抗原が挙げられる。
　本発明の抗体をコードする遺伝子は、Ｌ鎖遺伝子及びＨ鎖遺伝子（即ち、Ｌ鎖遺伝子とＨ鎖遺伝子の組み合わせ）である。
　本発明の部分抗体をコードする遺伝子のうち、Ｆａｂ型抗体をコードする遺伝子はＬ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子（即ち、Ｌ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子の組み合わせ）であっても良いし、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子又はＦｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子であっても良い。Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子はＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子が順に並び、かつ、その間にリンカー配列を含む遺伝子（即ち、上流から、Ｌ鎖遺伝子－リンカー配列－Ｆｄ鎖遺伝子）であり、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子はＦｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子が順に並び、かつ、その間にリンカー配列を含む遺伝子（即ち、上流から、Ｆｄ鎖遺伝子－リンカー配列－Ｌ鎖遺伝子）である。本発明に用いるＬ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子またはＦｄ鎖遺伝子等の遺伝子の調製方法は特に限定されず、各種抗体産生細胞、ハイブリドーマやファージディスプレイライブラリからＰＣＲなどで調製しても良いし、該塩基配列を元に遺伝子を全合成して調製しても良い。
　本発明におけるハンゼヌラ・ポリモルファは、好ましくはＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、ＤＬ－１（ＡＴＣＣ２６０１２）などの株が挙げられる。これらの菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる。また、該株からの誘導株なども含まれ、例えばロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ－１由来のＢＹ５２４３などが挙げられ、これらはＮａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能である。
　本発明における形質転換体とは、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。該形質転換体は、直鎖状にした、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターで宿主のハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換することにより得ることができる。ここで、本発明におけるベクターの直鎖状の状態とは、環状である発現ベクターの１ヶ所以上が切断されて、直鎖状になっている状態を指す。この直鎖状のベクターを調製する方法は、環状のベクターを制限酵素等で切断して直鎖状にしても良いし、環状のベクターをテンプレートにＰＣＲを行う方法でも良い。
　本発明において用いられる発現ベクターは、宿主ハンゼヌラ・ポリモルファにおいて、抗体及び／又は部分抗体を発現することが可能なベクターであれば、特に限定されない。用いることができる発現ベクターとして例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５またはｐＵＣ１９などが挙げられる。本発明において用いられる発現ベクターは、直鎖状にして、宿主ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に組み込まれた場合に発現可能な態様で前記抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含んでいる。
　本発明におけるＦａｂ型抗体の発現ベクターは、Ｌ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである。なお、本発明におけるＦａｂ型抗体の発現ベクターは、実施例１に示したようにＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子が同一のベクター上に存在する１種類（単一）のベクターの態様で用いても良いし、実施例３に示したようなＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子のそれぞれが別々のベクター上に存在する２種類のベクター（即ち、２種類の発現ベクターの組み合わせ）の態様で用いても良い。抗体の発現ベクターやＦａｂ型抗体以外の部分抗体の発現ベクターについても同様である。
　また、発現ベクターに含まれる抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有することが好ましい。ここで、本発明において用いられるプロモーターは、ハンゼヌラ・ポリモルファで発現誘導が起こりうるプロモーターであれば、特に限定されないが、例えばメタノールオキダーゼ（以下、ＭＯＸと略記する）、ＧＡＰ、ＴＥＦ、ＦＭＤプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸプロモーター又はＧＡＰプロモーターである。
　シグナル配列をコードする塩基配列としては、ハンゼヌラ・ポリモルファがタンパク質を分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　α（ＭＦα）プレプロシグナル（例、配列番号８）をコードする塩基配列などが挙げられる。
　また、シグナル配列をコードする塩基配列と抗体及び／又は部分抗体遺伝子（例、Ｌ鎖遺伝子、Ｆｄ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子等）との間が適切なリンカー配列をコードする塩基配列でつながれている状態でも良い。このリンカー配列をコードする塩基配列は特に限定されないが、分泌生産後にシグナル配列と抗体及び／又は部分抗体遺伝子産物（Ｌ鎖、Ｆｄ鎖、Ｈ鎖、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合タンパク又はＦｄ鎖Ｌ鎖融合タンパク等）とを分離できるような塩基配列が好ましい。例えばプロテアーゼの一種であるハンゼヌラ・ポリモルファのＫＥＸ２ｐによって認識切断されるＬｙｓ－Ａｒｇのアミノ酸配列をコードする塩基配列をリンカー配列をコードする塩基配列として用いることができる。
　ターミネーター配列としては、ハンゼヌラ・ポリモルファが遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定されない。例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファのＭＯＸ遺伝子のターミネーターを用いることが出来る。
　さらには、本発明において用いられる発現ベクターは、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を有する。
　ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全塩基配列に対する、同一塩基配列の割合（％）を意味する。本明細書における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ－２（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５；ギャップエクステンション＝２；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ））にて計算することができる。塩基配列の同一性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：　５８７３－５８７７　（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２５：　３３８９－３４０２　（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　４８：　４４４－４５３　（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，　ＣＡＢＩＯＳ，　４：　１１－１７　（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５：　２４４４－２４４８　（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
　該発現ベクターにおいては、好ましくは、前記ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である。このような観点から、好ましい態様において、本発明に用いる発現ベクターは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列として、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸ遺伝子またはＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列を有し、且つ／或いは抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列として、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸ遺伝子のターミネーター配列を有する。
　本発明において用いられるＦａｂ型抗体の発現ベクター及び抗体の発現ベクターに含まれる各構成要素の５’側から３’側への並び方の好適な例を以下に挙げる。
（１）第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｆｄ鎖遺伝子－ターミネーター配列
（２）第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｆｄ鎖遺伝子－第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－ターミネーター配列
（３）第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｈ鎖遺伝子－ターミネーター配列
（４）第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｈ鎖遺伝子－第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－ターミネーター配列
（５）（第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－第１のターミネーター配列）を含む発現ベクターと、（第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｆｄ鎖遺伝子－第２のターミネーター配列）を含む発現ベクターとの組み合わせ
（６）（第１のプロモーター配列－第１のシグナル配列－Ｌ鎖遺伝子－第１のターミネーター配列）を含む発現ベクターと、（第２のプロモーター配列－第２のシグナル配列－Ｈ鎖遺伝子－第２のターミネーター配列）を含む発現ベクターとの組み合わせ
　（１）～（６）において、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のプロモーターは、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸプロモーター又はＧＡＰプロモーターである。
　（１）～（６）において、第１のシグナル配列と第２のシグナル配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のシグナル配列は、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　α（ＭＦα）プレプロシグナルである。
　（５）及び（６）において、第１のターミネーター配列と第２のターミネーター配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のターミネーター配列は、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファのＭＯＸ遺伝子のターミネーター配列である。
　本発明に用いる発現ベクターは、好ましくは、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。宿主のハンゼヌラ・ポリモルファを上記発現ベクターで形質転換した後、選択マーカーを利用して、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を選抜することにより、本発明の形質転換体を取得可能である。選択マーカーは特に限定されないが、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。また、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。
　発現ベクターにおける選択マーカーの位置は、選択マーカーを利用して、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を選抜することが可能である限り特に限定されないが、好ましくは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にあるプロモーターの更に５’側である。上記（１）～（４）の態様においては、第１のプロモーターの５’側が好ましい。（５）及び（６）の態様においては、第１のプロモーター及び第２のプロモーターのそれぞれの５’側に選択マーカーが存在することが好ましい。
　ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換は、公知の方法（例えば、エレクトロポレーション等）に従って実施することができる。例えば、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４：　１８２－１８７　（１９９１），　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７５：　１９２９　（１９７８）　などに記載の方法に従って形質転換することができる。
　本発明における形質転換体においては、好ましくは、宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上に、直鎖状にした抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれている。染色体あたりの発現ベクターのコピー数は、１コピー又は２コピー以上であり、特に限定されないが、高生産するためには２コピー以上が好ましい。染色体あたりの発現ベクターのコピー数は、例えば、サザンブロッティング法を用いて確認することができる。即ち、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素で処理する。その後、処理済ゲノムＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブレンに転写し、発現ベクター内の適当な遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことでゲノムＤＮＡに組み込まれた発現ベクターのコピー数を確認することができる。そのような確認方法は、例えば実施例１４に示すような手法で解析できる。染色体あたりの発現ベクターのコピー数が２コピー以上の形質転換体を効率的に得る方法として、選択マーカーとしてプロモーター領域を短くすることで転写量を低下させた各種選択マーカー遺伝子（ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４）を用いることが挙げられる。具体的には、実施例３で構築したようなプロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子などを選択マーカーに用いる方法が挙げられる。なお、２コピー以上の発現ベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でも良いし、異なる位置に１コピーずつ組み込まれている状態でも良い。
　染色体上への抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでも良いし、１箇所の相同領域を利用した組み込みでも良いし、２箇所の相同領域を利用したダブルインテグレート型の組み込みでも良い。なお、相同領域とは染色体と発現ベクターの塩基配列を比較して、５０％以上の配列同一性があれば良く、その長さも特に限定されないが、５０ｂｐ以上が好ましい。相同領域の配列同一性は、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましく、最も好ましくは１００％である。ここで「同一性」とは、前記の通りに決定される。
　相同領域の末端部分の塩基配列の配列同一性を高くすれば相同組換えが好適に行われることは公知であり、当業者は好適な配列同一性を有する相同領域を選択することが出来る。相同領域の長さは、１００ｂｐ以上であることがより好ましく、５００ｂｐ以上であることがさらに好ましく、１０００ｂｐ以上であることがさらにより好ましい。また、１０ｋｂｐ以下がより好ましく、５ｋｂｐ以下であることがさらに好ましく、３ｋｂｐ以下であることがさらにより好ましい。長すぎるとベクターサイズが大きくなりベクターが入り難くなることは当業者にとって周知のことであり、上限は適切に選択しうる。相同領域の長さを長くすれば相同組換えが好適に行われることは公知であり、下限を適切に選択しうる。当業者は好適な長さの相同領域を選択することが出来る。相同領域を利用した組み込みの場合、例えば、プラスミドベクターの相同領域を制限酵素で１箇所以上を切断し、直鎖状の発現ベクターの末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。
　従って、上述のように、本発明に用いる発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を有する場合、特に、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である場合には、相同組換により染色体上に組み込まれやすくなることが期待される。
　また、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上において、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれる位置は、形質転換体が抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産するのであれば特に限定されないが、好ましくはＭＯＸ遺伝子の周辺が挙げられ、より好ましくはＭＯＸ遺伝子のＭＯＸプロモーター領域、ＭＯＸターミネーター領域が挙げられる。例えば、ＭＯＸターミネーターへの相同組込みであれば、発現ベクターとしてＭＯＸターミネーターを含む発現ベクターを採用し、ＭＯＸターミネーターの配列中に１箇所存在するＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした該発現ベクターを用いることでＭＯＸターミネーターへ組み込むことができる。
　ＭＯＸ遺伝子の周辺に組み込むことにより、抗体遺伝子が発現しやすく生産量が増えるという効果が期待される。
　本発明において用いられる発現ベクターに含まれる、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーターの塩基配列、並びに／或いは３’側に存在するターミネーターの塩基配列として、それぞれ、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上のＭＯＸプロモーター領域配列（例えば、配列番号１）及びＭＯＸターミネーター領域配列（配列番号２）とそれぞれ、５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を採用することにより、ＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域において相同的組換えが生じ、組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である形質転換体を得ることが可能である。
　ＭＯＸ遺伝子欠損とは、染色体上のＭＯＸ遺伝子の一部または全体が欠損や破壊などにより機能しなくなった状態を指す。ＭＯＸ遺伝子欠損の確認は、実施例６のようにメタノールを単一炭素源とする培地での生育の有無でできる。ＭＯＸ遺伝子が欠損した株の作製方法としては、実施例６のようにＦａｂ型抗体発現ベクターをＭＯＸ遺伝子内に挿入する方法などが挙げられる。
　ＭＯＸ遺伝子の一部または全部が欠損や破壊などにより機能しなくなった状態とは、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠損があるため、（１）ＭＯＸ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、ＭＯＸ遺伝子が発現しない状態、（２）フレームシフトが生じ、ＭＯＸタンパク質が活性あるタンパク質として発現しない状態、（３）ＭＯＸ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性あるタンパク質を発現しない状態、などを挙げることができる。相同組換えによってＭＯＸ遺伝子が欠損する場合、（３）の状態を挙げることができる。例えば、上述のように、ＭＯＸ遺伝子のＭＯＸプロモーター領域やＭＯＸターミネーター領域に発現ベクターが組み込まれた場合には、ＭＯＸ遺伝子欠損となることが期待される。
　ＭＯＸ遺伝子欠損であることにより、形質転換体のメタノール代謝が低下し、効率的なメタノール誘導が可能になるという効果が期待される。
　また、前記の通り得られた形質転換体の培養は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、本発明の形質転換体を用いて抗体、部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産する方法としては、上記ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を培養し、その培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。なお、形質転換体の培養は、通常ハンゼヌラ・ポリモルファが資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来、バッチ培養や連続培養のいずれでも培養可能である。また、培養中に抗体遺伝子等の発現誘導を行うことも可能であり、ＭＯＸプロモーターで抗体遺伝子等を発現誘導する場合は例えばメタノールなどを培養中に添加することで実施できる。本発明の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５～１０．０、温度範囲１０℃～４８℃の範囲で、好気的に１０時間～１０日間培養することにより行うことができる。
　本発明のＨＵＭＩＲＡ（登録商標）のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ－Ｓ結合で結合したＦａｂ型抗体を試験管培養にて分泌生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が１ｍｇ／Ｌ以上である形質転換体とは、実施例１に示したＦａｂ型抗体の遺伝子を含む発現ベクターを用い、それを実施例５に示す方法でハンゼヌラ・ポリモルファに形質転換し、得られた形質転換体を、実施例７に示す方法で試験管培養して、得られた培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量を解析した場合に、そのＦａｂ型抗体の濃度が１ｍｇ／Ｌ以上になるハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を指す。
　本発明の形質転換体を用いて生産された抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）は、培養上清の状態であっても良いし、そこから任意の方法で単離したものでも良い。培養上清からの抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）の単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該形質転換体を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から本発明の抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を単離する。
　単離された抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用しても良い。
　以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
　抗体発現ベクターの構築において利用した、ＭＯＸプロモーター（配列番号１）、ＭＯＸターミネーター（配列番号２）、ＬＥＵ２遺伝子（配列番号３）、プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子（配列番号４）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号５）、プロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子（配列番号６）及びＧＡＰプロモーター（配列番号７）はハンゼヌラ・ポリモルファ　８Ｖ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。Ｍａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル（ＭＦα、配列番号８）は、サッカロマイセス・セレビシアエＳ２８８ｃ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗ＴＮＦ－α　抗体（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖（配列番号９）、Ｈ鎖（配列番号１０）を化学合成した（特開２００９－０８２０３３）ものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
　ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。ゲノムＤＮＡの調製は、各菌株からＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）を用いて、これに記載の条件で実施した。
　各プラスミドの調製は、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換することで行った。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、行った。
（実施例１）Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築１
　ＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｏｔＩ－ＢａｍＨＩ－ＳｐｅＩ－ＭｕｎＩ－ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩのサイトをもつ遺伝子断片（配列番号１１）を全合成し、これをｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイトに挿入してｐＵＣ－１を調製した。ＬＥＵ２遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１および２（配列番号１２および１３）を用いたＰＣＲにより調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後にｐＵＣ－１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－２）。次に、ＭＯＸプロモーターの両側にＢａｍＨＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー３および４（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ－２のＢａｍＨＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ－３）。ＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー５および６（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲにより調製・ＭｕｎＩ処理後にｐＵＣ－３のＭｕｎＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ－４）。ＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー７および８（配列番号１８および１９）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ－４のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－ＰｍＰｍＴｍ）。
　ＭＦαの上流にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー９および１０（配列番号２０および２１）を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１１および１２（配列番号２２および２３）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー９および１２を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＳｐｅＩ処理後、ｐＵＣ－ＰｍＰｍＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｍＬＰｍＴｍを構築した。ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー１３（配列番号２４）および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｆｄ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１４および１５（配列番号２５および２６）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および１５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ－ＰｍＬＰｍＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｍＬＰｍＦＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。
（実施例２）Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築２
　ＧＡＰプロモーター制御下でＦａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖を発現するようにした発現ベクターを構築した。即ち、ＧＡＰプロモーターの両側にＢａｍＨＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１６および１７（配列番号２７および２８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後、実施例１記載のｐＵＣ－２のＢａｍＨＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ－５）。ＧＡＰプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１８および１９（配列番号２９および３０）を用いたＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後に、ｐＵＣ－５のＭｕｎＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－６）。実施例１で調製したＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ－６のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－ＰｇＰｇＴｍ）。実施例１で調製したＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片をｐＵＣ－ＰｇＰｇＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｇＬＰｇＴｍを構築した。そして、実施例１で調製したＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ－ＰｇＬＰｇＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｇＬＰｇＦＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＧＡＰプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。
（実施例３）Ｆａｂ型抗体各鎖（Ｌ鎖、Ｆｄ鎖）発現ベクターの構築
　実施例１で調製したＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた断片をＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後、実施例１で構築したｐＵＣ－１のＭｕｎＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－７）。実施例１で調製したＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片をＰＣＲにより調製し、ｐＵＣ－７のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－８）。
　Ｌ鎖発現ベクターは、ＬＥＵ２遺伝子、プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子それぞれの両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１および２、プライマー２０（配列番号３１）および２を用いたＰＣＲでぞれぞれ調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後、ｐＵＣ－８のＨｉｎｄＩＩＩサイトへそれぞれ挿入した（ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－１、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－２）。ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー１３および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１１および２１（配列番号３２）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー１３および２１を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－１、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－２のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｍＬＴｍ－１、ｐＵＣ－ＰｍＬＴｍ－２を構築した。このＬ鎖発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖遺伝子がＭＯＸプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。また、ｐＵＣ－ＰｍＬＴｍ－１はＬＥＵ２遺伝子を、ｐＵＣ－ＰｍＬＴｍ－２はプロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子を、それぞれ選択マーカーにしている。
　Ｆｄ鎖発現ベクターは、ＵＲＡ３遺伝子、プロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー２２および２３（配列番号３３および３４）、プライマー２４（配列番号３５）および２３を用いたＰＣＲで調製し、ＥｃｏＲＩ処理後、ｐＵＣ－８のＥｃｏＲＩサイトに挿入した（ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－３、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－４）。実施例１で調製したＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－３、ｐＵＣ－ＰｍＴｍ－４のＢｇｌＩＩサイトへそれぞれ挿入し、ｐＵＣ－ＰｍＦＴｍ－１、ｐＵＣ－ＰｍＦＴｍ－２を構築した。これらのＦｄ鎖発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＦｄ鎖遺伝子がＭＯＸプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。また、ｐＵＣ－ＰｍＦＴｍ－１はＵＲＡ３遺伝子を、ｐＵＣ－ＰｍＦＴｍ－２はプロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしている。
（実施例４）完全長抗体発現ベクターの構築
　実施例１で調製したＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をＰＣＲにより調製した。Ｈ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１４および２５（配列番号３６）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および２５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＨ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、実施例１で調製したｐＵＣ－ＰｍＬＰｍＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＰｍＬＰｍＨＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＨ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。
（実施例５）ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換による組換え抗体発現株の取得
　実施例１～４で構築した各種の抗体発現ベクターを、ＭＯＸターミネーター内のＥｃｏＲＶまたはＮｒｕＩサイトで切断して直鎖状にした。本断片を用いてハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換した。形質転換方法は、ハンゼヌラ・ポリモルファ　ＢＹ４３２９（ＮＣＹＣ４９５由来、ｌｅｕ１－１）、ＢＹ５２４２（８Ｖ由来、ｌｅｕ１－１）、ＢＹ５２４３（ＤＬ－１由来、ｌｅｕ１－１）、ＢＹ４８６８（ＮＣＹＣ４９５由来、ｕｒａ３　ｌｅｕ１－１）を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％　ｔｒｙｐｔｏｎｅ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％　ｇｌｕｃｏｓｅ）にそれぞれ接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１～１．５になるまで３０℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）した。菌体を２５０μｌの１Ｍ　ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，　ｐＨ７．５に懸濁し、懸濁液を３７℃で１５分インキュベートした。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した後、氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース，　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，　１ｍＭ塩化マグネシウム，　ｐＨ７．５）で菌体を再懸濁した。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）後、菌体を２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再懸濁した。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した後、菌体を２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状の各プラスミド溶液３μｌ（ＤＮＡ量０．５～１μｇ）を混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製），１％　ｇｌｕｃｏｓｅ）で菌体を洗浄し、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレートに塗布し、３７℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、各種組換え抗体発現株を取得した。
（実施例６）染色体上のＭＯＸ遺伝子が欠損したＦａｂ型抗体発現株の取得
　実施例５の方法でＦａｂ型抗体発現株を取得した後、得られた形質転換株を、メタノールを単一炭素源とする培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製），１％　ｍｅｔｈａｎｏｌ）に植菌して、３０℃で７２時間振とう培養を行い、生育してこない株を選抜することにより、染色体上のＭＯＸ遺伝子が欠損したＦａｂ型抗体発現株を取得した。
（実施例７）培養上清への抗体分泌および、ＥＬＩＳＡ法による抗体分泌量の測定
　Ｆａｂ抗体およびフル抗体の培養上清への分泌発現量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法により解析した。
　培養上清の調製は以下のように実施した。即ち、実施例５または６で得られた各抗体発現株を２ｍｌのＢＭＧＭＹ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ，２％　ｐｅｐｔｏｎｅ，１．３４％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ，０．４ｍｇ／ｌ　Ｂｉｏｔｉｎ，１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０），１％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　１％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に植菌し、３０℃で７２時間振とう培養後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分、４℃）により培養上清を調製した。
　サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）に固定化バッファー（０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液，ｐＨ９．６）にて５０００倍希釈したＡＮＴＩ－ＨＵＭＡＮ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｌ／ウェルで添加し、終夜で４℃インキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、５倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）を２５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ（タカラバイオ社製）＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、系列希釈した標準タンパク質（Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆａｂ；ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）と培養上清の希釈液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応した。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳＴで２回洗浄後、ＰＢＳＴＩＢ（ＰＢＳＴ＋１／５０希釈イムノブロック）溶液にて８０００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ　ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ｇｏａｔ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳＴで４回洗浄後、ＴＭＢ　１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２０分静置した。ＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／ウェルで添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ　Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中の抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った。この方法で、培養上清に分泌発現している抗体の蓄積を確認した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例８）ウエスタンブロッティングによるＦａｂ抗体の検出
　Ｆａｂ抗体およびフル抗体の検出はウエスタンブロッティング法で行った。即ち、実施例５で得られた培養上清と菌体画分１０μｌを、それぞれ２×サンプルバッファー（１０％　ＳＤＳ，５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．３１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．０１％　ＢＰＢ）１０μｌを混合したものを１５％　ｅ－ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いた非還元条件にてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。続いて、セミドライブロッティング装置（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ－Ｇｒａｐｈｉｔｅ　ＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒＩ；ミリポア社製）上に、陽極バッファー１（０．３Ｍ　Ｔｒｉｓ，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、陽極バッファー２（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙１枚とＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ；ミリポア社製）１枚、陰極バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ　グリシン，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ９．４）に１５分間浸した電気泳動後のゲルと濾紙３枚を順に静置し、１２０ｍＡの定電流で９０分間通電させることで、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写させた。転写後のメンブレンを、３％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．２４％　Ｔｒｉｓ，０．８％　ＮａＣｌ，ｐＨ７．６，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）に１時間浸漬し、ブロッキングした。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＴＢＳＴで２００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ　ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ｇｏａｔ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液にて室温で１時間反応させた。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥバイオサイエンス社製）用いて発光させた。発光したメンブレンをイメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。
　その結果、Ｆａｂ型抗体の推定分子量（約５０ｋＤａ）付近にバンドが認められ、Ｆａｂ抗体の殆どは培養上清に分泌発現していることが確認した（図１）
（実施例９）培養上清からのＦａｂ抗体の精製
　培養上清からのＦａｂ抗体の精製は以下に示す方法で行った。実施例７で得られた培養上清を０．２μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ；東洋濾紙社製）で清澄化後、これを予め平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　リン酸ナトリウム，　ｐＨ７．０）にて平衡化したプロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＧ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供し、溶出ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ，　ｐＨ３．０）により溶出画分から精製Ｆａｂ画分を取得した。さらにマイクロコン３（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により、濃縮液を得た。
（実施例１０）Ｆａｂ抗体の確認
　実施例９で得られたＦａｂ抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した。即ち、１０μｌの濃縮液と等量の２×サンプルバッファーを混合したものを、１５％　ｅ－ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いて非還元及び還元条件（ＤＴＴ　ｉｎ　２×サンプルバッファー）にてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、非還元条件でＦａｂ抗体の分子量付近（約５０ｋＤａ）に１本のバンド、還元条件でＬ鎖およびＦｄ鎖の分子量付近（約２５ｋＤａ）に２本のバンドを確認できた（図２）。
（実施例１１）ＥＬＩＳＡ法によるＦａｂ型抗体の抗原結合能の確認
　ハンゼヌラで分泌発現させたＦａｂ抗体の抗原（ＴＮＦ－α）に対する結合能の評価を、ＥＬＩＳＡ法で行った。即ち、ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）にＰＢＳにて希釈したＴＮＦ－α（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を５０μｌ／ウェルで加え、終夜４℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、５倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）２５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。ウェル中の溶液を除去後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、実施例９で得られた濃縮液の希釈液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間反応した。ＰＢＳＴで２回洗浄後、ＰＢＳＴＩＢ（ＰＢＳＴ＋１／５０希釈イムノブロック）溶液にて７５００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ　ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ｇｏａｔ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＩＧＭＡ社製）を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで４回洗浄後、１００μｌのＴＭＢ　１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、室温で２０分静置した。１００μｌのＴＭＢ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ　Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、濃縮液の添加量に応じた吸光度の増加が認められ、ハンゼヌラで分泌発現させたＦａｂ抗体は抗原結合能を有していることが確認された。
（実施例１２）完全長抗体の精製
　完全長抗体の精製は以下に示す方法で行った。実施例７で調製した完全長抗体発現株の培養上清を０．２μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ；東洋濾紙社製）で清澄化後、これを予め平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　リン酸ナトリウム，　ｐＨ７．０）にて平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ　ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した後、溶出ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ　クエン酸ナトリウム，　ｐＨ３．０）により溶出させ、完全長抗体を精製した。
（実施例１３）ウエスタンブロッティングによる完全ヒト型化抗ＴＮＦ－α完全長抗体の検出
　完全ヒト型化抗ＴＮＦ－α完全長抗体の検出は以下に示す方法で行った。即ち、実施例１２で得られた完全長抗体溶液と標準ＩｇＧ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ，　ｗｈｏｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　社製））をＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ｆｃ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）やＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。まず、１０μｌのサンプルと等量の２×サンプルバッファー（１０％　ＳＤＳ，５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．３１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．０１％　ＢＰＢ）を混合したものを、１５％　ｅ－ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いた非還元、及び還元条件（上述の２×サンプルバッファーにＤＴＴを５０ｍＭで添加した条件）にてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。続いて、セミドライブロッティング装置（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ－Ｇｒａｐｈｉｔｅ　ＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒＩ；ミリポア社製）上に、陽極バッファー１（０．３Ｍ　Ｔｒｉｓ，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、陽極バッファー２（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙１枚とＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ；ミリポア社製）１枚、陰極バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ　グリシン，１０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ９．４）に１５分間浸した電気泳動後のゲルと濾紙３枚を順に静置し、１２０ｍＡの定電流で９０分間通電させることで、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写させた。転写後、メンブレンを５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．２４％　Ｔｒｉｓ，０．８％　ＮａＣｌ，ｐＨ７．６，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）に１時間浸漬し、ブロッキングした。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＴＢＳＴで５００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ｆｃ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）溶液もしくはＴＢＳＴで２００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液にて室温で１時間反応させた。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥバイオサイエンス社製）を用いて発光させた。発光したメンブレンをイメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。その結果、非還元条件において標準ＩｇＧと同じ位置にバンドが認められた。さらに、還元条件では、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ｆｃ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙを二次抗体にした時にＨ鎖（約５０ｋＤａ）のバンドが、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆａｂ　ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙを二次抗体にした時にＬ鎖（約２５ｋＤａ）のバンドが認められた（図３）。
（実施例１４）サザンブロッティングによる染色体上の抗体発現ベクターの導入コピー数の解析
　ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングは、ＤＩＧ－Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて行った。実施例１～４記載の各Ｆａｂ型抗体発現ベクターやＬ鎖発現ベクターの検出には、プローブにＬＥＵ２遺伝子を使用した。実施例３記載のＦｄ鎖発現ベクターの検出には、プローブにＵＲＡ３遺伝子を使用した。実施例５で調製した各抗体発現株のゲノムＤＮＡを制限酵素（ＢｇｌＩＩ）で消化後、アガロースゲル電気泳動した。ゲルを加水分解液（０．２５Ｍ　ＨＣｌ）にて３０分浸漬した後、水洗した。次に、変性溶液（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．５Ｍ　ＮａＯＨ）にて３０分浸漬した後、水洗した。次に、中和溶液（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ）にて３０分浸漬した。このゲルを１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）を展開液として用いて、中和したゲルからゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｎｙｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｈａｒｇｅｄ；ロシュ社製）に、終夜転写させた。メンブレンを６×ＳＳＣで洗浄後、２０分室温で乾燥した後、８０℃で２時間ベーキング処理を行った。その後のメンブレン処理（プローブ調製、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、プローブ検出）は、上述のキットに記載の条件で行った。プローブの発光後のメンブレンについては、イメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。ハンゼヌラ・ポリモルファ染色体上のＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子（染色体上に１コピー存在）のバンド強度に対する、ベクター由来のＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子のバンドの本数や強度の相対値を算出することにより、各Ｆ発現ベクターの導入コピー数を算出した。その結果、ＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしたＦａｂ型抗体発現ベクター、Ｌ鎖発現ベクターの導入コピー数は、１コピーであった。プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしたＬ鎖発現ベクターやＦｄ鎖発現ベクターの導入コピー数は、２～３コピーであった。
　本発明のハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いることによって、従来の動物細胞を培養することによる抗体生産法と比較して、安価かつ簡便に所望の抗体医薬品を生産することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２００９－２３９４７１（出願日：平成２１年１０月１６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (19)

  1. 抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体。
  2. 直鎖状にして染色体に組み込まれた、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを含む請求項１に記載の形質転換体。
  3. 該発現ベクターが、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有する請求項２に記載の形質転換体。
  4. 該発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する相同塩基配列を有する請求項２または３に記載の形質転換体。
  5. 該相同塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である請求項４に記載の形質転換体。
  6. 染色体あたりの該発現ベクターのコピー数が２コピー以上である請求項２～５のいずれか１項に記載の形質転換体。
  7. 染色体における該発現ベクターの組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である請求項２～６のいずれか１項に記載の形質転換体。
  8. 染色体上のＭＯＸ遺伝子の機能が部分的又は完全に欠損している請求項２～７のいずれか１項に記載の形質転換体。
  9. 栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして利用して選抜されたものである請求項１～８のいずれか１項に記載の形質転換体。
  10. 栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子が、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である請求項９に記載の形質転換体。
  11. 該発現ベクターに含まれる部分抗体遺伝子がＦａｂ型抗体遺伝子である請求項２～１０のいずれか１項に記載の形質転換体。
  12. Ｆａｂ型抗体遺伝子を含む発現ベクターが、Ｌ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 抗体及び／又は部分抗体を分泌生産する請求項１～１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
  14. 抗体及び／又は部分抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は、マウス抗体から選ばれる抗体及び／又はそれに由来する部分抗体である請求項１～１３のいずれかに記載の形質転換体。
  15. 抗体及び／又は部分抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ－Ａ、及び、ＧＭ－ＣＳＦからなる群から選ばれる１以上の抗原に結合するものである請求項１～１４のいずれかに記載の形質転換体。
  16. 部分抗体がＦａｂ型抗体である請求項１３～１５のいずれか１項に記載の形質転換体。
  17. 抗体及び／又は部分抗体としてＨＵＭＩＲＡ（登録商標）に含まれる抗体に由来するＦａｂ型部分抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型部分抗体分泌生産量が１ｍｇ／ｍＬ以上である請求項１３～１６のいずれか１項に記載の形質転換体。
  18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法。
  19. 請求項１８に記載の製造方法で製造された抗体及び／又は部分抗体。
PCT/JP2010/068206 2009-10-16 2010-10-15 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体 WO2011046218A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10823486.5A EP2489724A4 (en) 2009-10-16 2010-10-15 HANSENULA POLYMORPHA SUITABLE FOR ANTIBODY PRODUCTION, ANTIBODY MANUFACTURING METHODS THEREFOR AND ANTIBODIES MANUFACTURED IN THIS PROCEDURE
JP2011536200A JPWO2011046218A1 (ja) 2009-10-16 2010-10-15 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-239471 2009-10-16
JP2009239471 2009-10-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011046218A1 true WO2011046218A1 (ja) 2011-04-21

Family

ID=43876267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/068206 WO2011046218A1 (ja) 2009-10-16 2010-10-15 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2489724A4 (ja)
JP (1) JPWO2011046218A1 (ja)
WO (1) WO2011046218A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014208584A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 株式会社カネカ 新規ポリペプチド及びその用途
WO2014208583A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 株式会社カネカ 新規ポリペプチド及びその用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012102171A1 (ja) * 2011-01-27 2012-08-02 株式会社カネカ 形質転換用酵母およびタンパク質の製造方法
JP6465794B2 (ja) 2013-04-25 2019-02-06 株式会社カネカ Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるＦｄ鎖遺伝子又はＬ鎖遺伝子
WO2019055535A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-21 Amyris, Inc. METHODS OF GENOMIC INTEGRATION FOR HOST CELLS COMPRISING HANSENULA AND ARXULA

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009082033A (ja) 2007-09-28 2009-04-23 Kaneka Corp 完全ヒト型抗体生産法
JP2009239471A (ja) 2008-03-26 2009-10-15 Panasonic Corp Ｍｏｓ集積回路、及びそれを備えた電子機器

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG48175A1 (en) * 1989-07-25 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Novel antigens and method for their preparation
ES2162863T3 (es) * 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
WO1999023221A2 (en) * 1997-10-27 1999-05-14 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009082033A (ja) 2007-09-28 2009-04-23 Kaneka Corp 完全ヒト型抗体生産法
JP2009239471A (ja) 2008-03-26 2009-10-15 Panasonic Corp Ｍｏｓ集積回路、及びそれを備えた電子機器

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", GREENE PUBLISHING ASSOCIATES AND WILEY-INTERSCIENCE
"Hansenula polymorpha Biology and Applications", 2002, WILEY-VCH, pages: 147 - 155
"Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ABDEL-SALAM, H. A. ET AL.: "Expression of mouse anticreatine kinase (MAK33) monoclonal antibody in the yeast Hansenula polymorpha.", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 56, 2001, pages 157 - 164, XP008156029 *
ALTSCHUL ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 56, 2001, pages 157 - 64
BIO/TECHNOLOGY, vol. 9, 1991, pages 545 - 551
BIOTECHNOL LETT, vol. 29, 2007, pages 201 - 212
GASSER, B. ET AL.: "Engineering of Pichia pastoris for Improved Production of Antibody Fragments.", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 94, no. 2, 2006, pages 353 - 361, XP002499994 *
KARLIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
METH. ENZYMOL., vol. 194, 1991, pages 182 - 187
MYERS; MILLER, CABIOS, vol. 4, 1988, pages 11 - 17
NEEDLEMAN ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 444 - 453
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929
RAHBARIZADEH, F. ET AL.: "Over expression of anti-MUC1 single-domain antibody fragments in the yeast Pichia pastoris.", MOL. IMMUNOL., vol. 43, no. 5, 2006, pages 426 - 435, XP005199516 *
SANDBORN, W. J. ET AL.: "Adalimumab for maintenance treatment of Crohn's disease: results of the CLASSIC II trial.", GUT, vol. 56, 2007, pages 1232 - 1239, XP008156030 *
SCIENCE, vol. 240, 1988, pages 1041 - 1043
See also references of EP2489724A4 *
SONG, H. ET AL.: "Development of a set of expression vectors in Hansenula polymorpha.", BIOTECHNOL. LETT., vol. 25, 2003, pages 1999 - 2006, XP008156031 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014208584A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 株式会社カネカ 新規ポリペプチド及びその用途
WO2014208583A1 (ja) * 2013-06-26 2014-12-31 株式会社カネカ 新規ポリペプチド及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2011046218A1 (ja) 2013-03-07
EP2489724A4 (en) 2013-05-01
EP2489724A1 (en) 2012-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011046218A1 (ja) 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体
JP5932766B2 (ja) Ｖｐｓ遺伝子が破壊されている酵母を用いる異種タンパク質の製造方法
CN107108692A (zh) 蛋白质制造
CN102459330B (zh) 控制抗体的o-联糖基化的方法
JP6465794B2 (ja) Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるＦｄ鎖遺伝子又はＬ鎖遺伝子
CN101413002A (zh) 表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用
Pleckaityte et al. Production in yeast of pseudotype virus-like particles harboring functionally active antibody fragments neutralizing the cytolytic activity of vaginolysin
US11485979B2 (en) Cell and method for producing target protein using same
EP1678308B1 (en) Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment
JP2016146789A (ja) 新規オガタエア属酵母及びそれを用いた異種タンパク質の製造方法。
WO2017170468A1 (ja) メタノール資化性酵母由来新規タンパク質及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法
CN117120618A (zh) 用于增加蛋白质分泌的信号肽
EP3015548B1 (en) Novel polypeptide, and use thereof
EP3015549B1 (en) Novel polypeptide, and use thereof
WO2021156890A2 (en) Recombinant expression platform, constructs and methods for expression of difficult to express proteins (dte-ps)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10823486

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011536200

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010823486

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010823486

Country of ref document: EP