JPWO2011046218A1 - 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを直鎖状にして、該ベクターを染色体に組み込んだハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、並びにハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いた抗体及び／又は部分抗体の製造方法を提供する。

Description

本発明は、抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体に関する。

近年、抗体は診断や治療等の医療分野において、抗原に対する高親和性を特徴として幅広く使用されている。最近、完全長型抗体の抗原結合部位以外の領域を一部もしくは全て除去することによって分子量を小さくした低分子化抗体が開発されつつある。低分子化抗体としては、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２などが挙げられる（非特許文献１）。低分子化抗体の特徴としては、例えば標的部位への高集積性が期待できる。

中でも次世代タンパク医薬品としての利用が注目されている低分子化抗体としてＦａｂ型抗体がある。Ｆａｂ型抗体とは、完全長型抗体からＦｃ領域とヒンジ部位を除去したものであり、Ｆｄ鎖とＬ鎖から成る抗体である。Ｆａｂ型抗体は、これまで、完全長型抗体をパパインなどの酵素によって消化して分解し、その後精製するという製造方法が用いられてきたが、現在ではＦａｂ型抗体のみを直接生産させる遺伝子組換え法が検討されている（非特許文献２）。

一般的に、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産するために、そのタンパク質に適切な宿主、例えば動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌、酵母などの微生物を選択する必要性がある。
抗体のような高度なヘテロマー構造を有するタンパク質においては、特定の種の酵母でしか発現が報告されていないことから（非特許文献３）、特に最適な種を選択する必要性がある。

現在、抗体医薬品は主にＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞等の動物細胞を用いて生産されているが、高価な培地や長時間の培養が必要とされ、生産コストが非常に高くなることが問題となっている。バイオ医薬品の生産宿主として最も使用されている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による異種タンパク質生産は、大腸菌の増殖速度が速く生産コストが低いという長所を有するものの、糖鎖修飾が行われないこと、フォールディングが不十分でタンパク質が不活性型として菌体内に蓄積することなどの傾向が見られる場合が多い。また、大腸菌は異種タンパク質を分泌発現させることが困難であるため、精製過程が煩雑となる短所も持つ。

そこで、代替宿主として酵母を用い、低コストで実用的かつ高生産の培養技術を確立するため、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）や、メタノール資化性酵母であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０株を用いて抗体を産生させる試みが複数報告されている（非特許文献３）。酵母は安価な培地で大規模高密度培養が可能であり、異種タンパク質を低コストで生産することができる。シグナルペプチドを利用すれば培養液中への分泌発現も可能で精製過程も容易となり、しかも真核生物であるため糖鎖付加などの翻訳後修飾も可能であるという長所が期待できる。

ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、異種タンパク質生産の宿主として知られており、その生産例として、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト上皮成長因子、ヒルジンなどが挙げられる（非特許文献４）が、実用的な発現量で抗体を発現させた例は知られていない。

マウス由来のＦａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖遺伝子を含んだ発現ベクターを環状の状態でハンゼヌラ・ポリモルファに導入し、抗体の産生を試みた例が報告されているが、培養上清に僅かにＬ鎖とＦｄ鎖がそれぞれ単独で分泌発現するにとどまり、発現タンパク質の大部分は菌体内に、しかもＬ鎖とＦｄ鎖がそれぞれ単独で蓄積されている状態であり、抗体の発現に成功していなかった（非特許文献５）。

Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９１） ９： ５４５−５５１ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２４０： １０４１−１０４３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ （２００７） ２９： ２０１-２１２ Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ， Ｇ． （Ｅｄ．）， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１０ ｐ１４７−１５５ （２００２），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ （Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ） Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００１） ５６：１５７−６４．

本発明は、ハンゼヌラ・ポリモルファを用いて、抗体、中でも部分抗体、特にはＦａｂ型抗体を分泌発現させることを課題とする。さらに、抗体、中でも部分抗体、特にはＦａｂ型抗体を分泌発現するハンゼヌラ・ポリモルファ形質転換体を提供することを課題とする。また、当該形質転換体を作製する方法、当該方法に用いるベクターをそれぞれ提供することを課題とする。

本発明においては、直鎖状にしたベクターを用いて、ハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換することで、活性型の抗体や部分抗体を発現する形質転換体を作製することに成功した。また、該形質転換体を培養して、抗体や部分抗体を分泌発現させることに成功した。環状の発現ベクターでハンゼヌラ・ポリモルファによるＦａｂ型抗体の分泌発現に失敗した例が知られている以上、直鎖状の発現ベクターを用いたからといって成功することは期待できなかったが、思いもよらぬことに、直鎖状の発現ベクターを用いることで、課題を解決し、本願発明を完成するに到った。

即ち、本発明は、
［１］抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体；
［２］直鎖状にして染色体に組み込まれた、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを含む上記［１］に記載の形質転換体；
［３］該発現ベクターが、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有する上記［２］に記載の形質転換体；
［４］該発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する相同塩基配列を有する上記［２］または［３］に記載の形質転換体；
［５］該相同塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である上記［４］に記載の形質転換体；
［６］染色体あたりの該発現ベクターのコピー数が２コピー以上である上記［２］〜［５］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［７］染色体における該発現ベクターの組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である上記［２］〜［６］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［８］染色体上のＭＯＸ遺伝子の機能が部分的又は完全に欠損している上記［２］〜［７］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［９］栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして利用して選抜されたものである上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１０］栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子が、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である上記［９］に記載の形質転換体；
［１１］該発現ベクターに含まれる部分抗体遺伝子がＦａｂ型抗体遺伝子である上記［２］〜［１０］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１２］Ｆａｂ型抗体遺伝子を含む発現ベクターが、Ｌ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである上記［１１］に記載の形質転換体；
［１３］抗体及び／又は部分抗体を分泌生産する上記［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１４］抗体及び／又は部分抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は、マウス抗体から選ばれる抗体及び／又はそれに由来する部分抗体である上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の形質転換体；
［１５］抗体及び／又は部分抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、及び、ＧＭ−ＣＳＦからなる群から選ばれる１以上の抗原に結合するものである上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の形質転換体；
［１６］部分抗体がＦａｂ型抗体である上記［１３］〜［１５］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１７］抗体及び／又は部分抗体としてＨＵＭＩＲＡ（登録商標）に含まれる抗体に由来するＦａｂ型部分抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型部分抗体分泌生産量が１ｍｇ／ｍＬ以上である上記［１３］〜［１６］のいずれか１項に記載の形質転換体；
［１８］上記［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法；
［１９］上記［１８］に記載の製造方法で製造された抗体及び／又は部分抗体
を提供する；

または、本発明は以下の１または複数の特徴を有する。

本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。

本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを直鎖状にして、該ベクターを染色体に組み込んだことを特徴とする、抗体及び／又は部分抗体を分泌生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。

本発明の特徴の一つは、部分抗体がＦａｂ型抗体であることを特徴とする、抗体及び／又は部分抗体を分泌生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。

本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法である。

本発明の特徴の一つは、抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法で製造された抗体及び／または部分抗体である。

本発明により、抗体や部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体、それを利用した抗体や部分抗体の製造方法、およびこれらより得られる抗体や部分抗体が提供される。

本発明の実施例８に係るウエスタンブロッティングに関する図である。 本発明の実施例１０に係るＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ＣＢＢ染色）に関する図である。 本発明の実施例１３に係るウエスタンブロッティングに関する図である。（Ａ）非還元条件でのＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出、（Ｂ）還元条件でのＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出、（Ｃ）還元条件でのＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）による溶出画分および標準ＩｇＧの検出を示す。サンプルは実施例１２に記載のように調製した。レーン１は標準ＩｇＧ、レーン２−９は溶出画分、レーン１０は標準ＩｇＧ、レーン１１は（Ａ）にて検出が確認された溶出画分（（Ａ）のレーン６サンプル）、レーン１２は標準ＩｇＧ、レーン１３は（Ａ）にて検出が確認された溶出画分（（Ａ）のレーン６サンプル）である。 本発明の実施例１４に係るサザンブロッティング（ＢＹ５２４２株）に関する図である。

以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明の抗体とは、Ｌ鎖とＨ鎖の各２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。

本発明の部分抗体とは、前記抗体の結合性断片であり、具体的にはＦａｂ型抗体、Ｆ（ａｂ’）_２型抗体、ｓｃＦｖ型抗体、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。

本発明のＦａｂ型抗体とは抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合で結合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。

Ｆ（ａｂ’）_２型抗体とは、２つのＦａｂ型抗体のＦｄ鎖がヒンジ部を介してＳ−Ｓ結合で結合したヘテロテトラマータンパク質を指す。さらに、ｓｃＦｖ型抗体とは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を一本鎖になるようにリンカーペプチドで連結されたタンパク質を指し、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体とは、ＶＨとＶＬをリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）を２つ結合させて二量体化させたもの指す。それらの誘導体としては、上記分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたものが挙げられる。

本発明の抗体の種類は、特に限定されないが、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ブタ抗体、ニワトリ抗体やこれらを融合したキメラ抗体が挙げられる。本発明の部分抗体（例、Ｆａｂ型抗体）の種類は、特に限定されないが、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ブタ抗体、ニワトリ抗体やこれらを融合したキメラ抗体の部分配列からなる部分抗体（例、Ｆａｂ型抗体）などが挙げられる。本発明の部分抗体としては、Ｆａｂ型抗体が特に好ましく挙げられる。

また、本発明の抗体や部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）が結合する抗原も特に限定されないが、好ましくは創薬のターゲットとして知られるＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＧＭ−ＣＳＦなどの抗原が挙げられる。

本発明の抗体をコードする遺伝子は、Ｌ鎖遺伝子及びＨ鎖遺伝子（即ち、Ｌ鎖遺伝子とＨ鎖遺伝子の組み合わせ）である。

本発明の部分抗体をコードする遺伝子のうち、Ｆａｂ型抗体をコードする遺伝子はＬ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子（即ち、Ｌ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子の組み合わせ）であっても良いし、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子又はＦｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子であっても良い。Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子はＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子が順に並び、かつ、その間にリンカー配列を含む遺伝子（即ち、上流から、Ｌ鎖遺伝子−リンカー配列−Ｆｄ鎖遺伝子）であり、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子はＦｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子が順に並び、かつ、その間にリンカー配列を含む遺伝子（即ち、上流から、Ｆｄ鎖遺伝子−リンカー配列−Ｌ鎖遺伝子）である。本発明に用いるＬ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子またはＦｄ鎖遺伝子等の遺伝子の調製方法は特に限定されず、各種抗体産生細胞、ハイブリドーマやファージディスプレイライブラリからＰＣＲなどで調製しても良いし、該塩基配列を元に遺伝子を全合成して調製しても良い。

本発明におけるハンゼヌラ・ポリモルファは、好ましくはＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、ＤＬ−１（ＡＴＣＣ２６０１２）などの株が挙げられる。これらの菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる。また、該株からの誘導株なども含まれ、例えばロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ−１由来のＢＹ５２４３などが挙げられ、これらはＮａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能である。

本発明における形質転換体とは、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体である。該形質転換体は、直鎖状にした、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターで宿主のハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換することにより得ることができる。ここで、本発明におけるベクターの直鎖状の状態とは、環状である発現ベクターの１ヶ所以上が切断されて、直鎖状になっている状態を指す。この直鎖状のベクターを調製する方法は、環状のベクターを制限酵素等で切断して直鎖状にしても良いし、環状のベクターをテンプレートにＰＣＲを行う方法でも良い。

本発明において用いられる発現ベクターは、宿主ハンゼヌラ・ポリモルファにおいて、抗体及び／又は部分抗体を発現することが可能なベクターであれば、特に限定されない。用いることができる発現ベクターとして例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５またはｐＵＣ１９などが挙げられる。本発明において用いられる発現ベクターは、直鎖状にして、宿主ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に組み込まれた場合に発現可能な態様で前記抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含んでいる。

本発明におけるＦａｂ型抗体の発現ベクターは、Ｌ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである。なお、本発明におけるＦａｂ型抗体の発現ベクターは、実施例１に示したようにＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子が同一のベクター上に存在する１種類（単一）のベクターの態様で用いても良いし、実施例３に示したようなＬ鎖遺伝子とＦｄ鎖遺伝子のそれぞれが別々のベクター上に存在する２種類のベクター（即ち、２種類の発現ベクターの組み合わせ）の態様で用いても良い。抗体の発現ベクターやＦａｂ型抗体以外の部分抗体の発現ベクターについても同様である。

また、発現ベクターに含まれる抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有することが好ましい。ここで、本発明において用いられるプロモーターは、ハンゼヌラ・ポリモルファで発現誘導が起こりうるプロモーターであれば、特に限定されないが、例えばメタノールオキダーゼ（以下、ＭＯＸと略記する）、ＧＡＰ、ＴＥＦ、ＦＭＤプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸプロモーター又はＧＡＰプロモーターである。

シグナル配列をコードする塩基配列としては、ハンゼヌラ・ポリモルファがタンパク質を分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）プレプロシグナル（例、配列番号８）をコードする塩基配列などが挙げられる。

また、シグナル配列をコードする塩基配列と抗体及び／又は部分抗体遺伝子（例、Ｌ鎖遺伝子、Ｆｄ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子等）との間が適切なリンカー配列をコードする塩基配列でつながれている状態でも良い。このリンカー配列をコードする塩基配列は特に限定されないが、分泌生産後にシグナル配列と抗体及び／又は部分抗体遺伝子産物（Ｌ鎖、Ｆｄ鎖、Ｈ鎖、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合タンパク又はＦｄ鎖Ｌ鎖融合タンパク等）とを分離できるような塩基配列が好ましい。例えばプロテアーゼの一種であるハンゼヌラ・ポリモルファのＫＥＸ２ｐによって認識切断されるＬｙｓ−Ａｒｇのアミノ酸配列をコードする塩基配列をリンカー配列をコードする塩基配列として用いることができる。

ターミネーター配列としては、ハンゼヌラ・ポリモルファが遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定されない。例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファのＭＯＸ遺伝子のターミネーターを用いることが出来る。

さらには、本発明において用いられる発現ベクターは、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を有する。

ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全塩基配列に対する、同一塩基配列の割合（％）を意味する。本明細書における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５；ギャップエクステンション＝２；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ））にて計算することができる。塩基配列の同一性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７ （１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４４−４５３ （１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ， ４： １１−１７ （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５： ２４４４−２４４８ （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。

該発現ベクターにおいては、好ましくは、前記ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である。このような観点から、好ましい態様において、本発明に用いる発現ベクターは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列として、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸ遺伝子またはＧＡＰ遺伝子のプロモーター配列を有し、且つ／或いは抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列として、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸ遺伝子のターミネーター配列を有する。

本発明において用いられるＦａｂ型抗体の発現ベクター及び抗体の発現ベクターに含まれる各構成要素の５’側から３’側への並び方の好適な例を以下に挙げる。
（１）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−ターミネーター配列
（２）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−ターミネーター配列
（３）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｈ鎖遺伝子−ターミネーター配列
（４）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｈ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−ターミネーター配列
（５）（第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第１のターミネーター配列）を含む発現ベクターと、（第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−第２のターミネーター配列）を含む発現ベクターとの組み合わせ
（６）（第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第１のターミネーター配列）を含む発現ベクターと、（第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｈ鎖遺伝子−第２のターミネーター配列）を含む発現ベクターとの組み合わせ

（１）〜（６）において、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のプロモーターは、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸプロモーター又はＧＡＰプロモーターである。

（１）〜（６）において、第１のシグナル配列と第２のシグナル配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のシグナル配列は、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）プレプロシグナルである。

（５）及び（６）において、第１のターミネーター配列と第２のターミネーター配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のターミネーター配列は、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファのＭＯＸ遺伝子のターミネーター配列である。

本発明に用いる発現ベクターは、好ましくは、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。宿主のハンゼヌラ・ポリモルファを上記発現ベクターで形質転換した後、選択マーカーを利用して、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を選抜することにより、本発明の形質転換体を取得可能である。選択マーカーは特に限定されないが、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。また、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。

発現ベクターにおける選択マーカーの位置は、選択マーカーを利用して、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を選抜することが可能である限り特に限定されないが、好ましくは、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にあるプロモーターの更に５’側である。上記（１）〜（４）の態様においては、第１のプロモーターの５’側が好ましい。（５）及び（６）の態様においては、第１のプロモーター及び第２のプロモーターのそれぞれの５’側に選択マーカーが存在することが好ましい。

ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換は、公知の方法（例えば、エレクトロポレーション等）に従って実施することができる。例えば、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４： １８２−１８７ （１９９１）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７５： １９２９ （１９７８） などに記載の方法に従って形質転換することができる。

本発明における形質転換体においては、好ましくは、宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上に、直鎖状にした抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれている。染色体あたりの発現ベクターのコピー数は、１コピー又は２コピー以上であり、特に限定されないが、高生産するためには２コピー以上が好ましい。染色体あたりの発現ベクターのコピー数は、例えば、サザンブロッティング法を用いて確認することができる。即ち、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素で処理する。その後、処理済ゲノムＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブレンに転写し、発現ベクター内の適当な遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことでゲノムＤＮＡに組み込まれた発現ベクターのコピー数を確認することができる。そのような確認方法は、例えば実施例１４に示すような手法で解析できる。染色体あたりの発現ベクターのコピー数が２コピー以上の形質転換体を効率的に得る方法として、選択マーカーとしてプロモーター領域を短くすることで転写量を低下させた各種選択マーカー遺伝子（ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４）を用いることが挙げられる。具体的には、実施例３で構築したようなプロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子などを選択マーカーに用いる方法が挙げられる。なお、２コピー以上の発現ベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でも良いし、異なる位置に１コピーずつ組み込まれている状態でも良い。

染色体上への抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでも良いし、１箇所の相同領域を利用した組み込みでも良いし、２箇所の相同領域を利用したダブルインテグレート型の組み込みでも良い。なお、相同領域とは染色体と発現ベクターの塩基配列を比較して、５０％以上の配列同一性があれば良く、その長さも特に限定されないが、５０ｂｐ以上が好ましい。相同領域の配列同一性は、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましく、最も好ましくは１００％である。ここで「同一性」とは、前記の通りに決定される。

相同領域の末端部分の塩基配列の配列同一性を高くすれば相同組換えが好適に行われることは公知であり、当業者は好適な配列同一性を有する相同領域を選択することが出来る。相同領域の長さは、１００ｂｐ以上であることがより好ましく、５００ｂｐ以上であることがさらに好ましく、１０００ｂｐ以上であることがさらにより好ましい。また、１０ｋｂｐ以下がより好ましく、５ｋｂｐ以下であることがさらに好ましく、３ｋｂｐ以下であることがさらにより好ましい。長すぎるとベクターサイズが大きくなりベクターが入り難くなることは当業者にとって周知のことであり、上限は適切に選択しうる。相同領域の長さを長くすれば相同組換えが好適に行われることは公知であり、下限を適切に選択しうる。当業者は好適な長さの相同領域を選択することが出来る。相同領域を利用した組み込みの場合、例えば、プラスミドベクターの相同領域を制限酵素で１箇所以上を切断し、直鎖状の発現ベクターの末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。

従って、上述のように、本発明に用いる発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を有する場合、特に、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは、宿主のハンゼヌラ・ポリモルファ）の染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である場合には、相同組換により染色体上に組み込まれやすくなることが期待される。

また、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上において、抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれる位置は、形質転換体が抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産するのであれば特に限定されないが、好ましくはＭＯＸ遺伝子の周辺が挙げられ、より好ましくはＭＯＸ遺伝子のＭＯＸプロモーター領域、ＭＯＸターミネーター領域が挙げられる。例えば、ＭＯＸターミネーターへの相同組込みであれば、発現ベクターとしてＭＯＸターミネーターを含む発現ベクターを採用し、ＭＯＸターミネーターの配列中に１箇所存在するＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした該発現ベクターを用いることでＭＯＸターミネーターへ組み込むことができる。

ＭＯＸ遺伝子の周辺に組み込むことにより、抗体遺伝子が発現しやすく生産量が増えるという効果が期待される。

本発明において用いられる発現ベクターに含まれる、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーターの塩基配列、並びに／或いは３’側に存在するターミネーターの塩基配列として、それぞれ、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体上のＭＯＸプロモーター領域配列（例えば、配列番号１）及びＭＯＸターミネーター領域配列（配列番号２）とそれぞれ、５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の配列同一性を有する塩基配列を採用することにより、ＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域において相同的組換えが生じ、組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である形質転換体を得ることが可能である。

ＭＯＸ遺伝子欠損とは、染色体上のＭＯＸ遺伝子の一部または全体が欠損や破壊などにより機能しなくなった状態を指す。ＭＯＸ遺伝子欠損の確認は、実施例６のようにメタノールを単一炭素源とする培地での生育の有無でできる。ＭＯＸ遺伝子が欠損した株の作製方法としては、実施例６のようにＦａｂ型抗体発現ベクターをＭＯＸ遺伝子内に挿入する方法などが挙げられる。

ＭＯＸ遺伝子の一部または全部が欠損や破壊などにより機能しなくなった状態とは、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠損があるため、（１）ＭＯＸ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、ＭＯＸ遺伝子が発現しない状態、（２）フレームシフトが生じ、ＭＯＸタンパク質が活性あるタンパク質として発現しない状態、（３）ＭＯＸ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性あるタンパク質を発現しない状態、などを挙げることができる。相同組換えによってＭＯＸ遺伝子が欠損する場合、（３）の状態を挙げることができる。例えば、上述のように、ＭＯＸ遺伝子のＭＯＸプロモーター領域やＭＯＸターミネーター領域に発現ベクターが組み込まれた場合には、ＭＯＸ遺伝子欠損となることが期待される。

ＭＯＸ遺伝子欠損であることにより、形質転換体のメタノール代謝が低下し、効率的なメタノール誘導が可能になるという効果が期待される。

また、前記の通り得られた形質転換体の培養は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、本発明の形質転換体を用いて抗体、部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を生産する方法としては、上記ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を培養し、その培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。なお、形質転換体の培養は、通常ハンゼヌラ・ポリモルファが資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来、バッチ培養や連続培養のいずれでも培養可能である。また、培養中に抗体遺伝子等の発現誘導を行うことも可能であり、ＭＯＸプロモーターで抗体遺伝子等を発現誘導する場合は例えばメタノールなどを培養中に添加することで実施できる。本発明の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５〜１０．０、温度範囲１０℃〜４８℃の範囲で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。

本発明のＨＵＭＩＲＡ（登録商標）のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合で結合したＦａｂ型抗体を試験管培養にて分泌生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が１ｍｇ／Ｌ以上である形質転換体とは、実施例１に示したＦａｂ型抗体の遺伝子を含む発現ベクターを用い、それを実施例５に示す方法でハンゼヌラ・ポリモルファに形質転換し、得られた形質転換体を、実施例７に示す方法で試験管培養して、得られた培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量を解析した場合に、そのＦａｂ型抗体の濃度が１ｍｇ／Ｌ以上になるハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を指す。

本発明の形質転換体を用いて生産された抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）は、培養上清の状態であっても良いし、そこから任意の方法で単離したものでも良い。培養上清からの抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）の単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該形質転換体を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から本発明の抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）を単離する。

単離された抗体及び／又は部分抗体（Ｆａｂ型抗体等）は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用しても良い。

以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。

抗体発現ベクターの構築において利用した、ＭＯＸプロモーター（配列番号１）、ＭＯＸターミネーター（配列番号２）、ＬＥＵ２遺伝子（配列番号３）、プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子（配列番号４）、ＵＲＡ３遺伝子（配列番号５）、プロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子（配列番号６）及びＧＡＰプロモーター（配列番号７）はハンゼヌラ・ポリモルファ ８Ｖ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル（ＭＦα、配列番号８）は、サッカロマイセス・セレビシアエＳ２８８ｃ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α 抗体（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖（配列番号９）、Ｈ鎖（配列番号１０）を化学合成した（特開２００９−０８２０３３）ものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。

ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。ゲノムＤＮＡの調製は、各菌株からＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）を用いて、これに記載の条件で実施した。

各プラスミドの調製は、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換することで行った。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、行った。

（実施例１）Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築１
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのサイトをもつ遺伝子断片（配列番号１１）を全合成し、これをｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入してｐＵＣ−１を調製した。ＬＥＵ２遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１および２（配列番号１２および１３）を用いたＰＣＲにより調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後にｐＵＣ−１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−２）。次に、ＭＯＸプロモーターの両側にＢａｍＨＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー３および４（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−２のＢａｍＨＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ−３）。ＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー５および６（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲにより調製・ＭｕｎＩ処理後にｐＵＣ−３のＭｕｎＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ−４）。ＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー７および８（配列番号１８および１９）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−４のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−ＰｍＰｍＴｍ）。

ＭＦαの上流にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー９および１０（配列番号２０および２１）を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１１および１２（配列番号２２および２３）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー９および１２を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＳｐｅＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍＰｍＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｍＬＰｍＴｍを構築した。ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー１３（配列番号２４）および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｆｄ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１４および１５（配列番号２５および２６）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および１５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍＬＰｍＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｍＬＰｍＦＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。

（実施例２）Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築２
ＧＡＰプロモーター制御下でＦａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖を発現するようにした発現ベクターを構築した。即ち、ＧＡＰプロモーターの両側にＢａｍＨＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１６および１７（配列番号２７および２８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後、実施例１記載のｐＵＣ−２のＢａｍＨＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ−５）。ＧＡＰプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１８および１９（配列番号２９および３０）を用いたＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後に、ｐＵＣ−５のＭｕｎＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−６）。実施例１で調製したＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ−６のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−ＰｇＰｇＴｍ）。実施例１で調製したＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩサイトをつけた遺伝子断片をｐＵＣ−ＰｇＰｇＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｇＬＰｇＴｍを構築した。そして、実施例１で調製したＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ−ＰｇＬＰｇＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｇＬＰｇＦＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＧＡＰプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。

（実施例３）Ｆａｂ型抗体各鎖（Ｌ鎖、Ｆｄ鎖）発現ベクターの構築
実施例１で調製したＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩサイトをつけた断片をＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後、実施例１で構築したｐＵＣ−１のＭｕｎＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−７）。実施例１で調製したＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片をＰＣＲにより調製し、ｐＵＣ−７のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−８）。

Ｌ鎖発現ベクターは、ＬＥＵ２遺伝子、プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子それぞれの両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１および２、プライマー２０（配列番号３１）および２を用いたＰＣＲでぞれぞれ調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後、ｐＵＣ−８のＨｉｎｄＩＩＩサイトへそれぞれ挿入した（ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−１、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−２）。ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をプライマー１３および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１１および２１（配列番号３２）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー１３および２１を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−１、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−２のＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｍＬＴｍ−１、ｐＵＣ−ＰｍＬＴｍ−２を構築した。このＬ鎖発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖遺伝子がＭＯＸプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。また、ｐＵＣ−ＰｍＬＴｍ−１はＬＥＵ２遺伝子を、ｐＵＣ−ＰｍＬＴｍ−２はプロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子を、それぞれ選択マーカーにしている。

Ｆｄ鎖発現ベクターは、ＵＲＡ３遺伝子、プロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー２２および２３（配列番号３３および３４）、プライマー２４（配列番号３５）および２３を用いたＰＣＲで調製し、ＥｃｏＲＩ処理後、ｐＵＣ−８のＥｃｏＲＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−３、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−４）。実施例１で調製したＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−３、ｐＵＣ−ＰｍＴｍ−４のＢｇｌＩＩサイトへそれぞれ挿入し、ｐＵＣ−ＰｍＦＴｍ−１、ｐＵＣ−ＰｍＦＴｍ−２を構築した。これらのＦｄ鎖発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＦｄ鎖遺伝子がＭＯＸプロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。また、ｐＵＣ−ＰｍＦＴｍ−１はＵＲＡ３遺伝子を、ｐＵＣ−ＰｍＦＴｍ−２はプロモーター領域を短くしたＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしている。

（実施例４）完全長抗体発現ベクターの構築
実施例１で調製したＭＦαの上流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片をＰＣＲにより調製した。Ｈ鎖の上流にＭＦαの３’末端２０ｂｐをつけ、下流にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１４および２５（配列番号３６）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および２５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＨ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、実施例１で調製したｐＵＣ−ＰｍＬＰｍＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＰｍＬＰｍＨＴｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＨ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。

（実施例５）ハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換による組換え抗体発現株の取得
実施例１〜４で構築した各種の抗体発現ベクターを、ＭＯＸターミネーター内のＥｃｏＲＶまたはＮｒｕＩサイトで切断して直鎖状にした。本断片を用いてハンゼヌラ・ポリモルファを形質転換した。形質転換方法は、ハンゼヌラ・ポリモルファ ＢＹ４３２９（ＮＣＹＣ４９５由来、ｌｅｕ１−１）、ＢＹ５２４２（８Ｖ由来、ｌｅｕ１−１）、ＢＹ５２４３（ＤＬ−１由来、ｌｅｕ１−１）、ＢＹ４８６８（ＮＣＹＣ４９５由来、ｕｒａ３ ｌｅｕ１−１）を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）にそれぞれ接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３０℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）した。菌体を２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー， ｐＨ７．５に懸濁し、懸濁液を３７℃で１５分インキュベートした。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した後、氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ塩化マグネシウム， ｐＨ７．５）で菌体を再懸濁した。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）後、菌体を２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再懸濁した。集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した後、菌体を２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状の各プラスミド溶液３μｌ（ＤＮＡ量０．５〜１μｇ）を混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製），１％ ｇｌｕｃｏｓｅ）で菌体を洗浄し、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレートに塗布し、３７℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、各種組換え抗体発現株を取得した。

（実施例６）染色体上のＭＯＸ遺伝子が欠損したＦａｂ型抗体発現株の取得
実施例５の方法でＦａｂ型抗体発現株を取得した後、得られた形質転換株を、メタノールを単一炭素源とする培地（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製），１％ ｍｅｔｈａｎｏｌ）に植菌して、３０℃で７２時間振とう培養を行い、生育してこない株を選抜することにより、染色体上のＭＯＸ遺伝子が欠損したＦａｂ型抗体発現株を取得した。

（実施例７）培養上清への抗体分泌および、ＥＬＩＳＡ法による抗体分泌量の測定
Ｆａｂ抗体およびフル抗体の培養上清への分泌発現量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により解析した。

培養上清の調製は以下のように実施した。即ち、実施例５または６で得られた各抗体発現株を２ｍｌのＢＭＧＭＹ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ，２％ ｐｅｐｔｏｎｅ，１．３４％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ，０．４ｍｇ／ｌ Ｂｉｏｔｉｎ，１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０），１％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ， １％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に植菌し、３０℃で７２時間振とう培養後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分、４℃）により培養上清を調製した。

サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）に固定化バッファー（０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液，ｐＨ９．６）にて５０００倍希釈したＡＮＴＩ−ＨＵＭＡＮ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｌ／ウェルで添加し、終夜で４℃インキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、５倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）を２５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。各ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ（タカラバイオ社製）＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、系列希釈した標準タンパク質（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆａｂ；ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）と培養上清の希釈液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応した。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳＴで２回洗浄後、ＰＢＳＴＩＢ（ＰＢＳＴ＋１／５０希釈イムノブロック）溶液にて８０００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ Ｇｏａｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＩＧＭＡ社製）を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ウェル中の溶液を除去し、ＰＢＳＴで４回洗浄後、ＴＭＢ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２０分静置した。ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／ウェルで添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中の抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った。この方法で、培養上清に分泌発現している抗体の蓄積を確認した（表１）。

（実施例８）ウエスタンブロッティングによるＦａｂ抗体の検出
Ｆａｂ抗体およびフル抗体の検出はウエスタンブロッティング法で行った。即ち、実施例５で得られた培養上清と菌体画分１０μｌを、それぞれ２×サンプルバッファー（１０％ ＳＤＳ，５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．３１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．０１％ ＢＰＢ）１０μｌを混合したものを１５％ ｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いた非還元条件にてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。続いて、セミドライブロッティング装置（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ−Ｇｒａｐｈｉｔｅ ＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒＩ；ミリポア社製）上に、陽極バッファー１（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、陽極バッファー２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙１枚とＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ミリポア社製）１枚、陰極バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ グリシン，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ９．４）に１５分間浸した電気泳動後のゲルと濾紙３枚を順に静置し、１２０ｍＡの定電流で９０分間通電させることで、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写させた。転写後のメンブレンを、３％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．２４％ Ｔｒｉｓ，０．８％ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に１時間浸漬し、ブロッキングした。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＴＢＳＴで２００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ Ｇｏａｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液にて室温で１時間反応させた。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥバイオサイエンス社製）用いて発光させた。発光したメンブレンをイメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。

その結果、Ｆａｂ型抗体の推定分子量（約５０ｋＤａ）付近にバンドが認められ、Ｆａｂ抗体の殆どは培養上清に分泌発現していることが確認した（図１）

（実施例９）培養上清からのＦａｂ抗体の精製
培養上清からのＦａｂ抗体の精製は以下に示す方法で行った。実施例７で得られた培養上清を０．２μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ；東洋濾紙社製）で清澄化後、これを予め平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム， ｐＨ７．０）にて平衡化したプロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供し、溶出ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ， ｐＨ３．０）により溶出画分から精製Ｆａｂ画分を取得した。さらにマイクロコン３（ミリポア社製）を用いた限外ろ過により、濃縮液を得た。

（実施例１０）Ｆａｂ抗体の確認
実施例９で得られたＦａｂ抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。即ち、１０μｌの濃縮液と等量の２×サンプルバッファーを混合したものを、１５％ ｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いて非還元及び還元条件（ＤＴＴ ｉｎ ２×サンプルバッファー）にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、非還元条件でＦａｂ抗体の分子量付近（約５０ｋＤａ）に１本のバンド、還元条件でＬ鎖およびＦｄ鎖の分子量付近（約２５ｋＤａ）に２本のバンドを確認できた（図２）。

（実施例１１）ＥＬＩＳＡ法によるＦａｂ型抗体の抗原結合能の確認
ハンゼヌラで分泌発現させたＦａｂ抗体の抗原（ＴＮＦ−α）に対する結合能の評価を、ＥＬＩＳＡ法で行った。即ち、ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）にＰＢＳにて希釈したＴＮＦ−α（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を５０μｌ／ウェルで加え、終夜４℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、５倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）２５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。ウェル中の溶液を除去後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、実施例９で得られた濃縮液の希釈液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間反応した。ＰＢＳＴで２回洗浄後、ＰＢＳＴＩＢ（ＰＢＳＴ＋１／５０希釈イムノブロック）溶液にて７５００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ Ｇｏａｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＩＧＭＡ社製）を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで４回洗浄後、１００μｌのＴＭＢ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、室温で２０分静置した。１００μｌのＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、濃縮液の添加量に応じた吸光度の増加が認められ、ハンゼヌラで分泌発現させたＦａｂ抗体は抗原結合能を有していることが確認された。

（実施例１２）完全長抗体の精製
完全長抗体の精製は以下に示す方法で行った。実施例７で調製した完全長抗体発現株の培養上清を０．２μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ；東洋濾紙社製）で清澄化後、これを予め平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム， ｐＨ７．０）にて平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した後、溶出ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム， ｐＨ３．０）により溶出させ、完全長抗体を精製した。

（実施例１３）ウエスタンブロッティングによる完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α完全長抗体の検出
完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α完全長抗体の検出は以下に示す方法で行った。即ち、実施例１２で得られた完全長抗体溶液と標準ＩｇＧ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， ｗｈｏｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製））をＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）やＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。まず、１０μｌのサンプルと等量の２×サンプルバッファー（１０％ ＳＤＳ，５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．３１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．０１％ ＢＰＢ）を混合したものを、１５％ ｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いた非還元、及び還元条件（上述の２×サンプルバッファーにＤＴＴを５０ｍＭで添加した条件）にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。続いて、セミドライブロッティング装置（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ−Ｇｒａｐｈｉｔｅ ＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒＩ；ミリポア社製）上に、陽極バッファー１（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、陽極バッファー２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ１０．４）に浸した濾紙１枚とＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ミリポア社製）１枚、陰極バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ グリシン，１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ９．４）に１５分間浸した電気泳動後のゲルと濾紙３枚を順に静置し、１２０ｍＡの定電流で９０分間通電させることで、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写させた。転写後、メンブレンを５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．２４％ Ｔｒｉｓ，０．８％ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に１時間浸漬し、ブロッキングした。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＴＢＳＴで５００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）溶液もしくはＴＢＳＴで２００００倍希釈した二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液にて室温で１時間反応させた。メンブレンをＴＢＳＴにて１５分×１回、５分×２回洗浄後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥバイオサイエンス社製）を用いて発光させた。発光したメンブレンをイメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。その結果、非還元条件において標準ＩｇＧと同じ位置にバンドが認められた。さらに、還元条件では、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ｆｃ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙを二次抗体にした時にＨ鎖（約５０ｋＤａ）のバンドが、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ ＳＰＥＣＩＦＩＣ）ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙを二次抗体にした時にＬ鎖（約２５ｋＤａ）のバンドが認められた（図３）。

（実施例１４）サザンブロッティングによる染色体上の抗体発現ベクターの導入コピー数の解析
ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングは、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて行った。実施例１〜４記載の各Ｆａｂ型抗体発現ベクターやＬ鎖発現ベクターの検出には、プローブにＬＥＵ２遺伝子を使用した。実施例３記載のＦｄ鎖発現ベクターの検出には、プローブにＵＲＡ３遺伝子を使用した。実施例５で調製した各抗体発現株のゲノムＤＮＡを制限酵素（ＢｇｌＩＩ）で消化後、アガロースゲル電気泳動した。ゲルを加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ）にて３０分浸漬した後、水洗した。次に、変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ）にて３０分浸漬した後、水洗した。次に、中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）にて３０分浸漬した。このゲルを１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）を展開液として用いて、中和したゲルからゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ；ロシュ社製）に、終夜転写させた。メンブレンを６×ＳＳＣで洗浄後、２０分室温で乾燥した後、８０℃で２時間ベーキング処理を行った。その後のメンブレン処理（プローブ調製、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、プローブ検出）は、上述のキットに記載の条件で行った。プローブの発光後のメンブレンについては、イメージャー（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて適当な時間露光した。ハンゼヌラ・ポリモルファ染色体上のＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子（染色体上に１コピー存在）のバンド強度に対する、ベクター由来のＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子のバンドの本数や強度の相対値を算出することにより、各Ｆ発現ベクターの導入コピー数を算出した。その結果、ＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしたＦａｂ型抗体発現ベクター、Ｌ鎖発現ベクターの導入コピー数は、１コピーであった。プロモーター領域を短くしたＬＥＵ２遺伝子やＵＲＡ３遺伝子を選択マーカーにしたＬ鎖発現ベクターやＦｄ鎖発現ベクターの導入コピー数は、２〜３コピーであった。

本発明のハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体を用いることによって、従来の動物細胞を培養することによる抗体生産法と比較して、安価かつ簡便に所望の抗体医薬品を生産することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００９−２３９４７１（出願日：平成２１年１０月１６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (19)

1. 抗体及び／又は部分抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファの形質転換体。
2. 直鎖状にして染色体に組み込まれた、抗体及び／又は部分抗体遺伝子を含む発現ベクターを含む請求項１に記載の形質転換体。
3. 該発現ベクターが、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側にプロモーター及びシグナル配列をコードする塩基配列を有し、３’側に停止コドン及び／又はターミネーター配列を有する請求項２に記載の形質転換体。
4. 該発現ベクターが、ハンゼヌラ・ポリモルファの染色体に含まれる少なくとも５０ｂｐ以上の塩基配列と少なくとも５０％以上の配列同一性を有する相同塩基配列を有する請求項２または３に記載の形質転換体。
5. 該相同塩基配列が、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の５’側に存在するプロモーター配列、及び／又は、抗体及び／又は部分抗体遺伝子の３’側に存在するターミネーター配列である請求項４に記載の形質転換体。
6. 染色体あたりの該発現ベクターのコピー数が２コピー以上である請求項２〜５のいずれか１項に記載の形質転換体。
7. 染色体における該発現ベクターの組み込み位置が染色体上のＭＯＸターミネーター領域及び／又はＭＯＸプロモーター領域である請求項２〜６のいずれか１項に記載の形質転換体。
8. 染色体上のＭＯＸ遺伝子の機能が部分的又は完全に欠損している請求項２〜７のいずれか１項に記載の形質転換体。
9. 栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして利用して選抜されたものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換体。
10. 栄養要求性相補遺伝子および／または薬剤耐性遺伝子が、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、ＨＩＳ４、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群から選ばれる１以上の遺伝子である請求項９に記載の形質転換体。
11. 該発現ベクターに含まれる部分抗体遺伝子がＦａｂ型抗体遺伝子である請求項２〜１０のいずれか１項に記載の形質転換体。
12. Ｆａｂ型抗体遺伝子を含む発現ベクターが、Ｌ鎖遺伝子及びＦｄ鎖遺伝子を含む塩基配列、Ｌ鎖Ｆｄ鎖融合遺伝子を含む塩基配列、及び／又は、Ｆｄ鎖Ｌ鎖融合遺伝子を含む塩基配列を含む発現ベクターである請求項１１に記載の形質転換体。
13. 抗体及び／又は部分抗体を分泌生産する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
14. 抗体及び／又は部分抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は、マウス抗体から選ばれる抗体及び／又はそれに由来する部分抗体である請求項１〜１３のいずれかに記載の形質転換体。
15. 抗体及び／又は部分抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、及び、ＧＭ−ＣＳＦからなる群から選ばれる１以上の抗原に結合するものである請求項１〜１４のいずれかに記載の形質転換体。
16. 部分抗体がＦａｂ型抗体である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体。
17. 抗体及び／又は部分抗体としてＨＵＭＩＲＡ（登録商標）に含まれる抗体に由来するＦａｂ型部分抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型部分抗体分泌生産量が１ｍｇ／ｍＬ以上である請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の形質転換体。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、抗体及び／又は部分抗体の製造方法。
19. 請求項１８に記載の製造方法で製造された抗体及び／又は部分抗体。