WO2014208584A1 - 新規ポリペプチド及びその用途 - Google Patents

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WO2014208584A1
WO2014208584A1 PCT/JP2014/066807 JP2014066807W WO2014208584A1 WO 2014208584 A1 WO2014208584 A1 WO 2014208584A1 JP 2014066807 W JP2014066807 W JP 2014066807W WO 2014208584 A1 WO2014208584 A1 WO 2014208584A1
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WO
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gene
polypeptide
seq
yeast
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/066807
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English (en)
French (fr)
Inventor
輝之 西
浅井 潔
萩原 央子
町田 雅之
Original Assignee
株式会社カネカ
独立行政法人産業技術総合研究所
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Filing date
Publication date
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide having an activity to improve the secretory productivity of a target protein in a host such as yeast, a gene encoding the polypeptide, and uses thereof.
  • suitable hosts for the proteins include animal cells such as CHO, insects and insect cells such as silkworms, animals such as chickens and cattle, E. coli and yeast Microorganisms are used.
  • yeast is capable of large-scale high-density culture with an inexpensive medium, and can produce proteins at low cost.
  • a signal peptide or the like is used, the protein can be purified easily because it can be secreted into the culture medium.
  • it since it is a eukaryote, it can be expected to have post-translational modifications such as glycosylation, and various studies have been conducted.
  • Non-Patent Document 1 reports a method for producing green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human epidermal growth factor, hirudin and the like using methanol-assimilating yeast.
  • Non-Patent Document 2 reports a method for producing a low molecular weight antibody by introducing a gene in which a base sequence encoding a low molecular weight antibody is linked downstream of an alcohol oxidase (AOX) promoter into yeast. Has been.
  • AOX alcohol oxidase
  • Non-Patent Document 3 a gene in which a base sequence encoding a soluble tag such as glutathione-S-transferase (GST) or maltose binding protein (MBP) is linked to a base sequence encoding a target protein is introduced into yeast. It has been reported that the productivity of the target protein has been improved.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • yeast when yeast is used as a host for protein production by genetic recombination, signal sequences and tags are added to the gene encoding the target protein, and a strong promoter is used to improve the productivity.
  • Various attempts have been made such as codon modification, co-expression of chaperone genes, and examination of host culture conditions.
  • the present invention is to provide a new means for efficiently secreting and producing a target protein in a host.
  • the present inventors have found a gene encoding a novel polypeptide having an activity of improving the secretion productivity of a target protein by comprehensive analysis of the base sequence of chromosomal DNA of Ogataair Angsta. It was. Furthermore, when the gene encoding the novel polypeptide was highly expressed in yeast together with the target protein gene to be expressed, it was confirmed that the secretory productivity of the target protein was improved, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • polypeptide (a), (b) or (c): (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33; (B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33; (C) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33.
  • genes (d), (e), (f) or (g) any of the following genes (d), (e), (f) or (g);
  • (D) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34;
  • (E) a gene comprising a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34 under stringent conditions;
  • (F) a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34;
  • G A gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33.
  • a method for producing a protein comprising culturing the transformant according to any one of (4) to (7) and recovering a target protein from the culture.
  • novel polypeptide involved in improving the secretory productivity of a target protein in a host and a gene encoding the polypeptide.
  • the novel polypeptide of the present invention can be efficiently secreted and produced by high expression in a host cell together with the target protein.
  • the secreted expression level and cell concentration (OD600) of the fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody by the transformant prepared in the examples are shown (1. Ogata Air Angsta fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression trait) 2. Transformant, BMGY medium, 2. Expression of novel polypeptide of Ogata Air Angsta (pUCPgapNP1TmG418 introduced) / Transformant expressing fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody, BMGY medium, 3. Ogata Air Angsta fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression transformant, BMGMY medium, 4. Ogataair Angsta novel polypeptide expression (pUCPgapNP1TmG418 introduced) / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression transformant, BMGMY medium).
  • polypeptide of the present invention is a novel polypeptide having an activity of improving the secretory productivity of a target protein in a host, and consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33.
  • polypeptide refers to a peptide in which two or more amino acids are bonded to each other, and includes those having a short chain length, usually called peptides or oligopeptides.
  • the “activity for improving the secretory productivity of the target protein” means an activity for increasing the secretory production amount of the target protein in the host cell and / or outside the host cell.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 is a polypeptide having a binding region with DNA.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 is the sequence site of amino acid residues 114 to 149 shown in SEQ ID NO: 32 and is expected to have a function of binding to DNA.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 33 is functionally linked to another polypeptide and the polypeptide is highly expressed in the host cell, the effect of improving the secretory productivity of the target protein can be obtained.
  • expression refers to transcription and translation of a base sequence that results in the production of a polypeptide that is the product of a gene. Moreover, the expression may be in a substantially constant state or may depend on external stimuli or growth conditions.
  • the promoter that drives expression is not particularly limited as long as it is a promoter that drives expression of a base sequence encoding a polypeptide.
  • “high expression” means that the amount of polypeptide in the host cell or the amount of mRNA in the host cell is increased compared to the normal amount. Measure using an antibody that recognizes peptide, or measure by RT-PCR method, Northern hybridization, hybridization using DNA array, etc., and compare with parent strain or unmodified strain such as wild type Can be confirmed.
  • the high expression of the polypeptide is not only the induction of the expression of the gene encoding the polypeptide on the chromosome and / or the vector (hereinafter also referred to as “polypeptide gene”), but also the polypeptide gene on the chromosome and / or the vector. It can be achieved by known methods such as modification (increase of copy number, insertion of promoter, codon modification, etc.), introduction of a polypeptide gene into a host cell, acquisition of a polypeptide gene high expression strain by introduction of mutation into the host cell, etc. .
  • the modification of the polypeptide gene on the chromosome can be carried out by using a method of gene insertion or site-directed mutagenesis using homologous recombination for the host chromosome. For example, in order to increase the copy number, it can be carried out by introducing the polypeptide gene into the chromosome, replacing the polypeptide upstream promoter with a stronger promoter, or changing the polypeptide gene to a codon suitable for the host cell.
  • Acquisition of a polypeptide high-expression strain by introducing a mutation into a host cell can be performed by a known method, for example, by selecting a strain in which the polypeptide is highly expressed after subjecting the host cell to mutation treatment with a drug or ultraviolet irradiation. .
  • the polypeptide of the present invention includes amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32
  • a polypeptide consisting of a sequence is included.
  • the term “plural amino acids” is not particularly limited as long as the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 retains the secretory productivity improving activity of the target protein, but is preferably 33 amino acids or less. More preferably, it is 30 amino acids or less, more preferably 20 amino acids or less, and most preferably 10, 5, 4, 3, or 2 or less.
  • the polypeptide of the present invention includes amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33
  • a polypeptide consisting of a sequence is included.
  • the term “plural amino acids” is not particularly limited as long as the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 retains the secretory productivity improving activity of the target protein, but is preferably 5 amino acids or less. More preferably, it is 4 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less, and most preferably 2 or less.
  • the polypeptide of the present invention is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33. More preferably, a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 97% or more, most preferably 99% or more is included.
  • the polypeptide of the present invention has a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32, and the sequence identity of the amino acid sequence site (amino acid residues 114 to 149) shown in SEQ ID NO: 33.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, and most preferably 99% or more is included.
  • sequence identity of amino acids can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like.
  • sequence analysis software for example, the BLAST algorithm blastp program and the FASTA algorithm fasta program may be used.
  • sequence identity of the amino acid sequences here is, for example, a value in which the amino acid sequence to be evaluated is compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33, and the frequency at which the same amino acid appears in the same site is expressed in%. is there.
  • the gene of the present invention is a gene whose structure and function were elucidated for the first time by comprehensive analysis of the base sequence of chromosomal DNA of Ogataair Angsta, and consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34.
  • the “base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34” means the above 1.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33 is a gene whose structure and function were elucidated for the first time by comprehensive analysis of the base sequence of chromosomal DNA of Ogataair Angsta, and consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34.
  • the “base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34” means the above 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 33 means the above 1.
  • gene refers to the genetic information of an organism defined by the base sequence of DNA or RNA, and usually comprises a base sequence encoding a polypeptide. It can be identified from the chromosome sequence by using a gene search program, an annotation program, or the like.
  • the gene of the present invention may be a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34.
  • the “base sequence that hybridizes under stringent conditions” means, for example, 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. After hybridization, the filter is washed under a condition of 65 ° C. using a 2 ⁇ concentration SSC solution (the composition of the 1 ⁇ concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate).
  • the base sequence of DNA that can be obtained by: It is preferably washed with an SSC solution of 0.5 times concentration at 65 ° C., more preferably washed with an SSC solution of 0.2 times concentration at 65 ° C., and more preferably washed with an SSC solution of 0.1 times concentration at 65 ° C. It is the base sequence of DNA which can be acquired by this.
  • the gene of the present invention has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or 34 and a sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, most preferably 99% or more.
  • a gene comprising a base sequence having identity is also included.
  • sequence identity of base sequences can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like. For example, a BLAST algorithm blastn program and a FASTA algorithm fasta program can be used.
  • sequence identity of the base sequences here is a value expressed by comparing the base sequence to be evaluated against the base sequence described in SEQ ID NO: 9 or 34, and the frequency with which the same base appears at the same site in%. is there.
  • base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34 is not limited to those derived from Ogata Air Angsta, but may be prepared by PCR from other mammals, insects, fungi, bacteria, phage display libraries, It may be prepared by total synthesis based on the base sequence. For example, by synthesizing a DNA primer designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 34, and then performing PCR using the above-described DNA primer using a chromosomal DNA isolated from yeast or the like as a template, The target base sequence can be obtained.
  • Vector The vector of the present invention comprises: Containing the gene described in 1. and introduced into a host cell; It is used to highly express the polypeptide.
  • vector refers to a nucleic acid molecule having a function of expressing a target gene in a transformed host cell, and includes an expression cassette, an integration homologous region, an auxotrophic complementary gene, or a drug resistance gene. It has a selectable marker gene such as autonomously replicating sequence.
  • the transformed vector may be in a state of being integrated into a chromosome or in a state of existing as an autonomously replicating type.
  • autonomously replicating vectors include YEp vectors, YRp vectors, YCp vectors, and the like. In the case of yeasts belonging to the genus Ogataea, pPICHOLI, pHIP, pHRP, pHARS and the like can be mentioned, but not particularly limited thereto.
  • the above “expression cassette” is composed of a polypeptide gene and a promoter for expressing it, and may contain a terminator.
  • This expression cassette can be constructed on a plasmid such as pUC19 or can be prepared by PCR.
  • promoter refers to a base sequence region located upstream of a polypeptide gene.
  • various transcriptional regulatory factors involved in the promotion and repression of transcription bind to or act on the region.
  • Complementary RNA is synthesized (transcribed) by reading the base sequence of the gene as a template.
  • the promoter for expressing the polypeptide gene is not particularly limited as long as a promoter capable of causing expression in the selected carbon source is appropriately used.
  • examples of the promoter for expressing the polypeptide gene include, but are not limited to, MOX promoter, FMD promoter, DHAS promoter, AOX promoter, GAP promoter and the like.
  • promoters for expressing polypeptide genes include, but are not limited to, GAP promoter, TEF promoter, LEU2 promoter, URA3 promoter, ADE promoter, ADH1 promoter, PGK1 promoter, and the like.
  • Transformant The transformant of the present invention is 3. Obtained by transforming a host cell with the vector described in 1. above.
  • the “host cell” refers to a cell into which a vector is introduced, and is not particularly limited as long as the vector can be introduced into the cell.
  • host cells used for transformation include yeast, bacteria, fungi, insect cells, and animal cells.
  • yeast is preferable, and methanol-assimilating yeast is more preferable.
  • methanol-assimilating yeast is defined as yeast that can be cultured using methanol as the sole carbon source. However, the ability to assimilate methanol may be lost by artificial modification or mutation.
  • Examples of the methanol-assimilating yeast include yeasts belonging to the genus Pichia, the genus Ogataea, the genus Candida, the genus Torulopsis, the genus Komagataella, and the like.
  • Pichia ⁇ methanolica in the genus Ogataea, Ogataea polyusta, Ogataea polymorpha, Ogataea polypolymorpha, minauta
  • Preferred examples of the genus Candida include Candida boidinii, and those of the genus Komagataella include Komagataella pastoris and Komagataella phaffii.
  • Ogataea yeast or Komagataela yeast is particularly preferable.
  • Ogataea genus yeast As the Ogataea genus yeast, Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, and Ogataea parapolymorpha are preferable. These three are closely related species, also known as Hansenula polymorpha or Pichia angusta.
  • strains examples include strains such as Ogata Air Angsta NCYC495 (ATCC14754), Ogata Air Polymorph 8V (ATCC34438), Ogata Air Parapolymorph DL-1 (ATCC26012), and the like. These strains can be obtained from the American Type Culture Collection. In the present invention, derived strains from these strains can also be used.For example, in the case of leucine-requiring strains, NCYC495-derived BY4329, 8V-derived BY5242, DL-1-derived BY5243, etc. It can be sold from the National BioResource Project.
  • Komagataella pastoris As the yeast of the genus Komagataella, Komagataella pastoris and Komagataella phaffii are preferable.
  • strains such as Komagataela pastoris Y-11430 and Komagataela pastoris X-33. These strains can be obtained from Northern Regional Research Laboratory. In the present invention, derivatives derived from these strains can also be used.
  • the “transformant” refers to a host cell obtained by introducing the above vector into the host cell.
  • Methods for introducing a vector into a host cell include known information, for example, in the case of yeast, electroporation method, lithium acetate method, spheroplast method and the like, but are not particularly limited thereto.
  • a method for transforming Ogata Air Angsta the electroporation method described in Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. (Curr Genet 25: 305.310.) Is common.
  • a selection marker gene such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene.
  • the selection marker is not particularly limited, but in the case of yeast, auxotrophic strains of uracil, leucine, adenine, and histidine are used for auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, and HIS4 gene, respectively. Selection can be made by recovery of the vegetative strain phenotype.
  • a drug resistance gene such as a G418 resistance gene, a zeocin resistance gene, or a hygromycin resistance gene can be selected based on resistance on a medium containing G418, zeocin, or hygromycin, respectively.
  • the auxotrophic selection marker used when preparing the yeast host cannot be used when the selection marker is not destroyed. In this case, the selection marker may be recovered, and methods known to those skilled in the art can be used.
  • the vector When the vector is integrated into the host cell chromosome, it is preferably prepared as DNA having a homologous region of the host cell chromosome at the same time.
  • the method of integrating the vector onto the chromosome may be non-specific integration without using a homologous region, integration using one homologous region, or double integration type using two homologous regions. May be embedded.
  • the homologous region only needs to have a sequence identity of 50% or more by comparing the base sequence of the chromosome and the vector, and the length is not particularly limited, but is preferably 50 bp or more.
  • the sequence identity of the homologous region is more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 100%.
  • the homologous region of a plasmid vector can be cleaved at one or more sites with a restriction enzyme, and transformation can be performed so that the homologous region comes to the end of a linear vector.
  • a restriction enzyme for example, Ogata Air Angsta, if it is homologous integration into the MOX terminator, it is integrated into the MOX terminator by using a linear expression vector cut at the NruI site or EcoRV site existing in the MOX terminator sequence. be able to.
  • the number of copies of the expression cassette per chromosome is not particularly limited. Further, the position where the vector is integrated on the chromosome is not particularly limited as long as the polypeptide is produced in the microbial cells. In addition, about the integration position of the transformant in which two or more copies of the vector are integrated, a plurality may be integrated at the same position, or one copy may be integrated at different positions.
  • the protein production method of the present invention comprises: A step of culturing the transformant described in 1. and recovering the target protein from the culture.
  • “culture” means cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells in addition to the culture supernatant.
  • a method for producing the target protein using the transformant of the present invention includes a method of culturing the transformant and accumulating it in the microbial cell or the culture supernatant.
  • the method of culturing the transformant can be carried out according to a usual method used for culturing the host cell.
  • the host cell is a microorganism such as yeast
  • the culture medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, vitamins and the like that can be assimilated by the microorganism, and the transformant can be cultured efficiently.
  • the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Any carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, sugars such as glucose, sucrose and maltose, organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid and propionic acid, and alcohols such as methanol, ethanol and glycerol.
  • Hydrocarbons such as paraffin, oils and fats such as soybean oil and rapeseed oil, or mixtures thereof, etc.
  • nitrogen sources include ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • the culture can be either batch culture or continuous culture.
  • the carbon source when methanol-assimilating yeast is used for the host cell, the carbon source may be one of glucose, glycerol and methanol, or two or more thereof. Moreover, these carbon sources may exist from the beginning of the culture, or may be added during the culture.
  • the transformant can be cultured under normal conditions.
  • the pH is 2.5 to 10.0
  • the temperature range is 10 ° C. to 48 ° C., aerobically 10 hours to 10 days. It can be performed by culturing.
  • the “target protein” refers to enzymes derived from microorganisms, proteins produced by animals and plants that are multicellular organisms, and the like. Examples include phytase, protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fluorescent protein, etc. It is not limited to. In particular, human and / or animal therapeutic proteins are preferred.
  • human and / or animal therapeutic proteins include hepatitis B virus surface antigen, hirudin, antibody, human antibody, partial antibody, human partial antibody, serum albumin, human serum albumin, epidermal growth factor, human epithelial growth Factor, insulin, growth hormone, erythropoietin, interferon, blood coagulation factor VIII, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), thrombopoietin, IL-1, IL-6, Examples include tissue plasminogen activator (TPA), urokinase, leptin, stem cell growth factor (SCF), and the like.
  • TPA tissue plasminogen activator
  • SCF stem cell growth factor
  • antibody refers to a heterotetrameric protein composed of disulfide bonds between two polypeptide chains, an L chain and an H chain, and has the ability to bind to a specific antigen. There is no particular limitation.
  • the “partial antibody” refers to a Fab type antibody, a (Fab) type 2 antibody, a scFv type antibody, a diabody type antibody, or a derivative thereof, and has the ability to bind to a specific antigen.
  • Fab-type antibody refers to a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are linked by SS bonds, or a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are associated without containing SS bonds. If it has the capability to couple
  • amino acids constituting the target protein may be natural, non-natural, or modified.
  • amino acid sequence of the protein may be artificially modified or may be designed by de-novo.
  • the target protein produced using the transformant of the present invention may be present in the culture supernatant, may be accumulated in the microbial cells, or any method therefrom.
  • the one collected in step 1 may be used.
  • the target protein can be collected from the culture supernatant or the microbial cells by appropriately combining known protein purification methods. For example, first, the transformant is cultured in an appropriate medium, and the cells are removed from the culture supernatant by centrifugation of the culture solution or filtration.
  • the obtained culture supernatant is subjected to salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography.
  • the target protein is recovered from the culture supernatant by using techniques such as chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and ultrafiltration alone or in combination.
  • the recovered target protein can be used as it is, but it can also be used after being modified with a pharmacological change such as PEGylation or a modification that adds a function such as an enzyme or an isotope. Various formulation treatments may also be used.
  • a base sequence encoding a signal sequence may be introduced at the 5 'end of the target protein gene.
  • the base sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as it encodes a signal sequence that can be secreted and expressed by yeast.
  • Saccharomyces cerevisiae MatingMFactor ⁇ MF ⁇
  • Ogata Air Angsta acid phosphatase PHO1
  • Komagataela pastoris acid phosphatase PHO1
  • Saccharomyces cerevisiae invertase SUC2
  • Saccharomyces cerevisiae PLB1 bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • nucleotide sequence encoding immunoglobulin signal sequence etc.
  • the promoter of the target protein in the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter that expresses the target protein in the transformant.
  • a methanol-inducible promoter is preferred.
  • the methanol-inducible promoter of the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter having transcription activity when the carbon source is methanol.
  • the AOX1 promoter, AOX2 promoter, CAT promoter, DHAS promoter, FDH promoter, FMD promoter, GAP Examples include promoters and MOX promoters.
  • plasmids used for yeast transformation were obtained by introducing the constructed antibody expression vector and the novel polypeptide expression vector into E. coli E.coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.), respectively.
  • the transformants were prepared by culturing and amplifying. Preparation of the plasmid from the plasmid-carrying strain was performed using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • MOX promoter SEQ ID NO: 1
  • MOX terminator SEQ ID NO: 2
  • LEU2 gene SEQ ID NO: 3
  • MF ⁇ Mating Factor ⁇ prepro signal gene
  • the antibody gene includes the L chain gene (SEQ ID NO: 5) and the Fd chain gene (SEQ ID NO: 6). It was prepared by PCR using a chemically synthesized product (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-082033) as a template.
  • the GAP promoter (SEQ ID NO: 7) used in the construction of the novel polypeptide expression vector and the G418 resistance gene (SEQ ID NO: 8) controlled by the GAP promoter were chromosomal DNA of Ogata Air Angsta strain NCYC495, an appropriate commercial vector, etc. as a template. And prepared by PCR.
  • a novel polypeptide (NP1) gene (SEQ ID NO: 9) uses the chromosomal DNA of Ogata Air Angsta NCYC495 as a template, and a SpeI recognition sequence on the 5 ′ end side and a BglII recognition sequence on the 3 ′ end side of the polypeptide gene.
  • the added gene fragment is prepared by PCR using primers 18 and 19 (SEQ ID NOS: 28 and 29), inserted into the XbaI / BamHI site of pUC19 after SpeI / BglII treatment, and a plasmid containing the polypeptide gene is constructed. It was prepared by.
  • PCR was performed using Prime STAR STAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) and the reaction conditions were as described in the attached manual. Chromosomal DNA was prepared from each strain using Gen Toru-kun (manufactured by Takara Bio Inc.) under the conditions described here.
  • Example 1 Construction of fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression vector Total synthesis of a gene fragment (SEQ ID NO: 10) having a multiple cloning site of HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRI This was inserted between the HindIII-EcoRI sites of pUC19 to prepare pUC-1.
  • a gene fragment in which HindIII recognition sequences were added to both sides of the LEU2 gene was prepared by PCR using primers 1 and 2 (SEQ ID NOs: 11 and 12), inserted into the HindIII site of pUC-1 after HindIII treatment, pUC-2 was prepared.
  • a gene fragment having a BamHI recognition sequence added to both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 3 and 4 (SEQ ID NOs: 13 and 14), and after BamHI treatment, inserted into the BamHI site of pUC-2.
  • PUC-Pmox was prepared.
  • a gene fragment having MunI recognition sequences added to both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 5 and 6 (SEQ ID NOs: 15 and 16), inserted into the MunI site of pUC-Pmox after MunI treatment, and pUC-PmoxPmox Was prepared.
  • a gene fragment having an XbaI recognition sequence added to both sides of the MOX terminator was prepared by PCR using primers 7 and 8 (SEQ ID NOS: 17 and 18), and after XbaI treatment, inserted into the XbaI site of pUC-PmoxPmox. PmoxPmoxTm was prepared.
  • a gene fragment having a SpeI recognition sequence added upstream of MF ⁇ was prepared by PCR using primers 9 and 10 (SEQ ID NOs: 19 and 20).
  • a gene fragment in which 19 bp of MF ⁇ was added upstream of the L chain and SpeI recognition sequence was added downstream was prepared by PCR using primers 11 and 12 (SEQ ID NOs: 21 and 22). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment in which SpeI recognition sequences were added to both sides of the fusion gene of MF ⁇ and L chain was prepared by PCR using primers 9 and 12. This gene fragment was treated with SpeI and then inserted into the SpeI site of pUC-PmoxPmoxTm to construct pUC-PmoxLPmoxTm.
  • a gene fragment having a BglII recognition sequence added upstream of MF ⁇ was prepared by PCR using primers 13 (SEQ ID NO: 23) and 10.
  • a gene fragment in which 19 bp of MF ⁇ was added upstream of the Fd chain and a BglII recognition sequence was added downstream was prepared by PCR using primers 14 and 15 (SEQ ID NOs: 24 and 25). These gene fragments were mixed into a template, and a gene fragment in which BglII recognition sequences were added to both sides of the fusion gene of MF ⁇ and Fd chain was prepared by PCR using primers 13 and 15.
  • This gene fragment was treated with BglII and then inserted into the BglII site of pUC-PmoxLPmoxTm to construct pUC-PmoxLPmoxFdTm.
  • This pUC-PmoxLPmoxFdTm is designed so that the L chain and Fd chain of the Fab antibody are expressed under the control of the MOX promoter.
  • Example 2 Construction of a novel polypeptide expression vector A gene fragment having XbaI recognition sequences added to both sides of the MOX terminator was prepared by PCR using primers 7 and 8, and pUC prepared in Example 1 after XbaI treatment. PUCTm was prepared by inserting into the XbaI site of -1.
  • a gene fragment having EcoRI recognition sequences added to both sides of the G418 resistance gene controlled by the GAP promoter was prepared by PCR using primers 16 and 17 (SEQ ID NOs: 26 and 27). After EcoRI treatment, EcoRI of pUCTm PUCTmG418 was prepared by inserting into the site.
  • primers 18 and 19 PUCNP1TmG418 was constructed by PCR using (SEQ ID NOs: 28 and 29) and inserted into the SpeI / BglII site of pUCTmG418 after treatment with SpeI / BglII.
  • a gene fragment having a BamHI recognition sequence added to both sides of the GAP promoter was prepared by PCR using primers 20 and 21 (SEQ ID NOs: 30 and 31), and after BamHI treatment, inserted into the BamHI site of pUCNP1TmG418 to obtain pUCPgapNP1TmG418.
  • This expression vector is designed so that the novel polypeptide (SEQ ID NO: 32) is expressed under the control of the GAP promoter.
  • Example 3 Obtaining a novel polypeptide-expressing yeast host cell
  • the pUCPgapNP1TmG418 constructed in Example 2 was used to transform Escherichia coli, and the resulting transformant was treated with 5 ml of 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Difco ), 1.0% yeast extract bacto (Difco), 0.5% NaCl), and pUCPgapNP1TmG418 was obtained from the obtained cells using a QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN).
  • QIAGEN QIAprep spin miniprep kit
  • This plasmid was linearized by cutting at the EcoRV site or NruI site in the MOX terminator gene or the NotI site in the multicloning site. Using this linear pUCPgapNP1TmG418, Ogata Air Angsta and Komagataela pastoris were transformed as follows.
  • Ogata Air Angsta NCYC495 leucine-requiring strain was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose), and cultured overnight at 37 ° C. Thus, a preculture solution was obtained. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture at 37 ° C. until OD600 reaches 1 to 1.5, collect cells (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and then add 250 ⁇ l of 1M DTT Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing (final concentration 25 mM).
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose
  • a preculture solution was obtained. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture
  • Komagataela pastoris Y-11430 leucine-requiring strain is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose), 30 °C And precultured overnight to obtain a preculture. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture at 30 ° C. until OD600 reaches 1 to 1.5, collect cells (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and then add 250 ⁇ l of 1M DTT Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing (final concentration 25 mM).
  • This suspension was incubated at 37 ° C for Ogata Air Angsta and 15 minutes at 30 ° C for Komagataela pastoris, and then collected (3000 xg, 10 minutes, 20 ° C) and pre-ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose) , 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.5). The washings were collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose
  • 10 mM Tris-HCl 1 mM magnesium chloride
  • Ogata Air Angsta is 7.5 kV / After subjecting to a pulse of 7.5 kV / cm, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ for cm, 10 ⁇ F, 900 ⁇ , and Komagataela pastoris, the cells are suspended in 1 ml of YPD medium. Ogata Air Angsta is 37 ° C., Komagataella pastoris is 30 ° C. Let stand for hours.
  • the cells After standing for 1 hour, the cells are collected (3000 ⁇ g, 5 minutes, room temperature) and suspended in 1 ml of YNBMSG medium (0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 0.1% glutamate sodium) Thereafter, the cells were collected again (3000 ⁇ g, 5 minutes, room temperature).
  • YNBMSG medium 0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 0.1% glutamate sodium
  • YNBMSGG418 selection agar plate (0.17% yeast nitro base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 0.1% sodium glutamate, 1.5% agarose, 2% glucose, 0.05 (G418 disulfate, 100 mg / L leucine), and Ogata Air Angsta selected a strain that grew by static culture at 37 ° C. for 3 days to obtain Ogata Air Angsta novel polypeptide-expressing yeast host cells.
  • Komagataela pastoris a strain that grew by static culture at 30 ° C. for 3 days was selected to obtain a yeast host cell expressing Komagataela pastoris novel polypeptide.
  • Example 4 Obtaining transformant expressing novel polypeptide expression / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody Transformant obtained by transforming Escherichia coli with pUC-PmoxLPmoxFdTm constructed in Example 1 Is cultured in 5 ml of 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Difco), 1.0% yeast extract bacto (Difco), 0.5% NaCl), and QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) was used to obtain pUC-PmoxLPmoxFdTm.
  • 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Difco), 1.0% yeast extract bacto (Difco), 0.5% NaCl
  • QIAprep spin miniprep kit QIAGEN
  • This plasmid was linearized by cutting at the EcoRV site in the MOX terminator gene. Using this linear pUC-PmoxLPmoxFdTm, Ogata Air Angsta and Komagataella pastoris were transformed as follows.
  • Ogata Air Angsta novel polypeptide-expressing yeast host cells or Ogata Air Angsta NCYC495 leucine auxotrophic strain obtained in Example 3 were used in 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) ), 2% glucose), and cultured overnight at 37 ° C. with shaking to obtain a precultured solution. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture at 37 ° C.
  • the Komagataela pastoris novel polypeptide-expressing yeast host cell or Komagataela pastoris Y-11430 leucine-requiring strain obtained in Example 3 was used in 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose), and cultured with shaking at 30 ° C. overnight to obtain a preculture solution.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose
  • This suspension was incubated at 37 ° C for Ogata Air Angsta and 15 minutes at 30 ° C for Komagataela pastoris, and then collected (3000 xg, 10 minutes, 20 ° C) and pre-ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose) , 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7.5). The washings were collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose
  • 10 mM Tris-HCl 1 mM magnesium chloride
  • Ogata Air Angsta is 7.5 kV / After applying to cm, 10 ⁇ F, 900 ⁇ , Komagataela pastoris 7.5kV / cm, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , the cells are suspended in 1ml of YPD medium. Ogata Air Angsta is 37 ° C, Komagataela pastoris is 30 ° C for 1 hour Left to stand.
  • the cells After standing for 1 hour, the cells are collected (3000 ⁇ g, 5 minutes, room temperature) and suspended in 1 ml of YNBMSG medium (0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 0.1% glutamate sodium) Thereafter, the cells were collected again (3000 ⁇ g, 5 minutes, room temperature).
  • YNBMSG medium 0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 0.1% glutamate sodium
  • the transformant of Ogata Air Angsta novel polypeptide-expressing yeast host cell is YNBMSGG418 selection agar plate (0.17% yeast nitro base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco) , 0.1% ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium glutamate, 1.5% agarose, 2% glucose, 0.05% G418 disulfate) and Ogata Air Angsta NCYC495 leucine auxotrophic transformants were transformed into YNB selective agar plates (0.67% nitrogen base Without Amino Acid ( Difco), 1.5% agarose, 2% glucose), and Ogata Air Angsta selects the strain that grows in static culture for 3 days at 37 ° C.
  • Ogata Air Angsta develops a new polypeptide / completely humanized An anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression transformant and an Ogata Air Angsta fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression transformant were obtained.
  • Komagataela pastoris was selected from strains that grew by static culture at 30 ° C for 3 days, and Komagataela pastoris novel polypeptide expression / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody transformant and Komagataela pastoris fully human A typed anti-TNF- ⁇ Fab antibody-expressing transformant was obtained.
  • Example 5 Culture of transformant expressing novel polypeptide expression / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody Expression of novel polypeptide / expressing fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody obtained in Example 4 Transformants and transformants expressing fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody in 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 2% Glycerol), and BMGMY medium (1% yeast extract bacto (Difco) 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (Difco), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg / l Biotin, 100
  • Example 6 Measurement of secreted amount of fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody by ELISA method
  • Anti-TNF to culture supernatant of transformant expressing novel polypeptide expression / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody - ⁇ Fab antibody secretion expression level was determined by the sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method as shown below.
  • Goat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody manufactured by SIGMA
  • an immobilization buffer 0.1N sodium bicarbonate solution, pH 9.6
  • an ELISA plate Maxisorp; manufactured by NUNC
  • a novel polypeptide expression (pUCPgapNP1TmG418 introduction) / fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody expression transformant is clearly a fully humanized anti-TNF- ⁇ Fab antibody into which no novel polypeptide gene has been introduced.
  • the secretion expression level was higher than that of the expression transformant. Since a high secretory expression level is exhibited even in a medium containing methanol (BMGMY medium), the expression of the novel polypeptide of the present invention enables the activation of the target protein with methanol-inducible promoter activation that could not be achieved by the prior art, and It is thought that the morphological change that enables efficient secretory production occurred simultaneously.
  • the present invention can be used in the field of producing human and / or animal therapeutic proteins.

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Abstract

 本発明は、宿主において目的タンパク質を効率的に分泌生産させる新たな手段を提供することを課題とする。 本発明は、目的タンパク質の分泌生産性を向上させる活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターにより宿主細胞に形質転換して得られる形質転換体、及び該形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法に関する。

Description

新規ポリペプチド及びその用途
 本発明は、酵母などの宿主における目的タンパク質の分泌生産性を向上させる活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれらの用途に関する。
 近年、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産するために、そのタンパク質に適切な宿主として、例えばCHO等の動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌や酵母などの微生物が用いられている。特に、酵母は安価な培地で大規模高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なためタンパク質の精製過程も容易となる。しかも、真核生物であるため糖鎖付加などの翻訳後修飾も可能であるという長所が期待でき、様々な研究が行われている。
 例えば、非特許文献1には、メタノール資化性酵母を用いて、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト上皮成長因子、ヒルジンなどを生産する方法が報告されている。
 また、非特許文献2には、アルコールオキシダーゼ(Alcohol oxidase、AOX)プロモーターの下流に低分子化抗体をコードする塩基配列を連結した遺伝子を酵母に導入し、低分子化抗体を生産する方法が報告されている。
 さらに、非特許文献3には、可溶性タグであるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)やマルトース結合タンパク質(MBP)をコードする塩基配列を目的タンパク質をコードする塩基配列と連結した遺伝子を酵母に導入し、目的タンパク質の生産性を向上させたことが報告されている。
 このように、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産する宿主として酵母を使用した場合、その生産性の向上のために、目的タンパク質をコードする遺伝子へのシグナル配列やタグの付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、宿主の培養条件の検討など様々な試みがなされている。
Appl Microbiol Biotechnol. 2000 Dec;54(6):741-50. J Biochem. 2003 Dec;134(6):813-7. PLos ONE.2010 vol5 e14404
 本発明は、宿主において目的タンパク質を効率的に分泌生産させる新たな手段を提供することにある。
 本発明者らは、上記課題を解決すべく、オガタエア・アングスタの染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、目的タンパク質の分泌生産性を向上させる活性を有する新規なポリペプチドをコードする遺伝子を見出した。さらに、当該新規ポリペプチドをコードする遺伝子を発現対象となる目的タンパク質遺伝子と共に酵母において高発現させたところ、目的タンパク質の分泌生産性が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
 すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)以下の(a)、(b)または(c)のいずれかのポリペプチド;
 (a)配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド;
 (b)配列番号32または33に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
 (c)配列番号32または33に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2)以下の(d)、(e)、(f)または(g)のいずれかの遺伝子;
 (d)配列番号9または34に示す塩基配列からなる遺伝子;
 (e)配列番号9または34に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子;
 (f)配列番号9または34に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子;
 (g)配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子。
(3)(2)に記載の遺伝子を含有するベクター。 
(4)(3)に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
(5)宿主細胞が、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、または動物細胞である、(4)に記載の形質転換体。
(6)酵母がメタノール資化性酵母である、(5)に記載の形質転換体。
(7)メタノール資化性酵母がオガタエア属酵母又はコマガタエラ属酵母である、(6)に記載の形質転換体。
(8)(4)~(7)のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
(9)培養が、グルコース、及び/又はグリセロール、及び/又はメタノールを炭素源とすることを特徴とする、(8)に記載のタンパク質の製造方法。
 本願は、2013年6月26日に出願された日本国特許出願2013-134037号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
 本発明によれば、宿主における目的タンパク質の分泌生産性向上に関与する新規ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子が提供される。本発明の新規ポリペプチドは、目的タンパク質とともに宿主細胞で高発現させることにより、該目的タンパク質を効率的に分泌生産させることができる。
実施例で作製した形質転換体による完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体の分泌発現量と菌体濃度(OD600)を示す(1.オガタエア・アングスタ完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体、BMGY培地、2.オガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現(pUCPgapNP1TmG418導入)/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体、BMGY培地、3.オガタエア・アングスタ完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体、BMGMY培地、4.オガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現(pUCPgapNP1TmG418導入)/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体、BMGMY培地)。
 以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
1.ポリペプチド
 本発明のポリペプチドは、宿主において目的タンパク質の分泌生産性を向上させる活性を有する新規なポリペプチドであって、配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなる。
 本発明において、「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、通常ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものも含まれる。
 本発明において、「目的タンパク質の分泌生産性を向上させる活性」とは、宿主細胞内及び/又は宿主細胞外における目的タンパク質の分泌生産量を増大させる活性をいう。
 配列番号32に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、DNAとの結合領域を有しているポリペプチドであり、当該ポリペプチドを宿主細胞内において高発現させると目的タンパク質の分泌生産性が向上する。また、配列番号33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号32に示すアミノ酸残基114~149の配列部位であり、DNAに結合する機能が期待される。これにより、配列番号33のポリペプチドと他のポリペプチドを機能的に連結させ、宿主細胞においてそのポリペプチドを高発現させれば、目的タンパク質の分泌生産性を向上させる効果を得ることができる。
 本発明において、「発現」とは、遺伝子の産物であるポリペプチドの生成をもたらす塩基配列の転写及び翻訳を指す。また、その発現は外部刺激や生育条件などに依存せずにほぼ一定の状態でもよいし、依存してもよい。発現を駆動するプロモーターは、ポリペプチドをコードする塩基配列の発現を駆動するプロモーターであれば特に限定されない。
 本発明において、「高発現」とは、宿主細胞内のポリペプチドの量、もしくは、宿主細胞内のmRNAの量が、通常の量に比較して増加していることを意味し、例えば、ポリペプチドを認識する抗体を利用して測定し、あるいは、例えば、RT-PCR法やノーザンハイブリダイゼーション、DNAアレイを使用するハイブリダイゼーション等によって測定し、親株又は野生型のような非改変株と比較することによって確認することができる。
 ポリペプチドの高発現は、染色体上及び/又はベクター上のポリペプチドをコードする遺伝子(以下、「ポリペプチド遺伝子」ともいう)の発現誘導の他、染色体上及び/又はベクター上のポリペプチド遺伝子の改変(コピー数の増加やプロモーターの挿入、コドン改変等)、ポリペプチド遺伝子の宿主細胞への導入、宿主細胞への変異導入によるポリペプチド遺伝子高発現株の取得等、公知の手法により達成し得る。
 染色体上のポリペプチド遺伝子の改変は、宿主染色体について相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、コピー数増加のためポリペプチド遺伝子の染色体への導入や、ポリペプチド上流プロモーターのより強力なプロモーターへの置換、ポリペプチド遺伝子の宿主細胞に適したコドンへの改変等によって実施できる。
 宿主細胞への変異導入によるポリペプチド高発現株の取得は、公知の方法、例えば宿主細胞を薬剤や紫外線照射による変異処理をした後にポリペプチドが高発現されている株を選抜することによって実施できる。
 本発明のポリペプチドには、配列番号32に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号32に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。ここで「複数個のアミノ酸」とは、配列番号32に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する目的タンパク質の分泌生産性向上活性を保持する限り、その個数は特に制限されないが、好ましくは33アミノ酸以下であり、より好ましくは30アミノ酸以下、さらに好ましくは20アミノ酸以下、最も好ましくは10、5、4、3、または2個以下である。
 本発明のポリペプチドには、配列番号33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号33に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。ここで「複数個のアミノ酸」とは、配列番号33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する目的タンパク質の分泌生産性向上活性を保持する限り、その個数は特に制限されないが、好ましくは5アミノ酸以下であり、より好ましくは4アミノ酸以下、さらに好ましくは3アミノ酸以下、最も好ましくは2個以下である。
 本発明のポリペプチドには、配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号32または33に示すアミノ酸配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
 本発明のポリペプチドには、配列番号32に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、且つ、配列番号33に示すアミノ酸配列部位(アミノ酸残基114~149)の配列同一性が85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
 アミノ酸の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、BLASTアルゴリズムのblastpプログラムやFASTAアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。ここでのアミノ酸配列の配列同一性は、例えば配列番号32または33に示すアミノ酸配列に対して評価対象のアミノ酸配列を比較し、同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を%で表示した値である。
2.遺伝子
 本発明の遺伝子は、オガタエア・アングスタの染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、構造および機能が初めて解明された遺伝子であり、配列番号9または34に示す塩基配列からなる。ここで、「配列番号9または34に示す塩基配列」とは、上記1.の配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
 本発明において、「遺伝子」とは、DNAやRNAの塩基配列によって規定された生物の遺伝情報を指し、通常ポリペプチドをコードする塩基配列からなる。染色体配列から遺伝子探索プログラムやアノテーションプログラム等を用いることによって同定することが出来る。
 本発明の遺伝子は、配列番号9または34に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、コロニーまたはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7~1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるDNAの塩基配列を挙げることができる。好ましくは65℃で0.5倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは65℃で0.1倍濃度のSSC溶液で洗浄することにより取得できるDNAの塩基配列である。
 本発明の遺伝子には、配列番号9または34に記載の塩基配列と85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も含まれる。
 塩基配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、BLASTアルゴリズムのblastnプログラムやFASTAアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。ここでの塩基配列の配列同一性は、配列番号9または34に記載の塩基配列に対して評価対象の塩基配列を比較し、同一部位に同一の塩基が出現する頻度を%で表示した値である。
 上記の「配列番号9または34に示す塩基配列」は、オガタエア・アングスタ由来に限定はされず、他の哺乳動物、昆虫、真菌、細菌、ファージディスプレイライブラリからPCRなどで調製してもよいし、該塩基配列を元に全合成して調製してもよい。例えば、配列番号9または34に示す塩基配列に基づいて設計したDNAプライマーを合成し、次に、酵母等から単離した染色体DNAを鋳型に、上記のDNAプライマーを用いてPCRを行うことで、目的塩基配列を取得できる。
3.ベクター
 本発明のベクターは、2.に記載の遺伝子を含有し、宿主細胞に導入して1.のポリペプチドを高発現させるのに用いる。
 本発明において、「ベクター」とは、形質転換後の宿主細胞にて目的遺伝子が発現する機能を持った核酸分子のことを指し、発現カセット、組み込み相同領域、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、自律複製配列などを有する。形質転換後のベクターは、染色体に組み込まれている状態でもよいし、自律複製型として存在している状態でもよい。自律複製型ベクターの例としては、YEpベクター、YRpベクター、YCpベクターなどが挙げられる。オガタエア属酵母の場合はpPICHOLI、pHIP、pHRP、pHARSなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
 上記の「発現カセット」は、ポリペプチド遺伝子と、これを発現させるためのプロモーターにより構成され、ターミネーターを含んでもよい。本発現カセットは、例えばpUC19等のプラスミド上に構築することもできるし、PCR法によっても作成することができる。
 ここで、「プロモーター」とは、ポリペプチド遺伝子の上流に位置する塩基配列領域をいい、RNAポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合または作用することによって鋳型である遺伝子の塩基配列を読み取って相補的なRNAを合成(転写)する。
 ポリペプチド遺伝子を発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。
 炭素源がメタノールの場合、ポリペプチド遺伝子を発現させるプロモーターは、MOXプロモーター、FMDプロモーター、DHASプロモーター、AOXプロモーター、GAPプロモーターなどが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
 炭素源がグルコースやグリセロールの場合、ポリペプチド遺伝子を発現させるプロモーターは、GAPプロモーター、TEFプロモーター、LEU2プロモーター、URA3プロモーター、ADEプロモーター、ADH1プロモーター、PGK1プロモーターなどが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
4.形質転換体
 本発明の形質転換体は、3.に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる。
 本発明において、「宿主細胞」とは、ベクターが導入される細胞のことを指し、ベクターを導入することの出来る細胞であれば特に限定されない。
 形質転換に用いる宿主細胞としては、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、または動物細胞などが挙げられ、酵母が好ましく、メタノール資化性酵母がより好ましい。
 一般に、メタノール資化性酵母は、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失していてもよい。
 メタノール資化性酵母としては、ピキア(Pichia)属、オガタエア(Ogataea)属、キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属、コマガタエラ(Komagataella)属などに属する酵母が挙げられる。ピキア(Pichia)属ではピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、オガタエア(Ogataea)属ではオガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)、オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、キャンディダ(Candida)属ではキャンディダ・ボイディニ(Candida boidinii)、コマガタエラ(Komagataella)属ではコマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)などが好ましい例として挙げられる。
 上記のメタノール資化性酵母のなかでも、オガタエア属酵母又はコマガタエラ属酵母が特に好ましい。
 オガタエア(Ogataea)属酵母としては、オガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)が好ましい。これら3つは近縁種であり、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ(hansenula polymorpha)、または別名ピキア・アングスタ(Pichia angusta)でも表される。
 具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタNCYC495(ATCC14754)、オガタエア・ポリモルファ8V(ATCC34438)、オガタエア・パラポリモルファDL-1(ATCC26012)などの菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。また、本発明においては、これらの菌株からの誘導株も使用でき、例えばロイシン要求性株であれば、NCYC495由来のBY4329、8V由来のBY5242、DL-1由来のBY5243などが挙げられ、これらはNational BioResource Projectから分譲可能である。
 また、コマガタエラ(Komagataella)属酵母としては、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)が好ましい。
 具体的に使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスY-11430、コマガタエラ・パストリスX-33などの株が挙げられる。これらの菌株は、Northern Regional Research Laboratory等から入手することができる。本発明においては、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。
 本発明において、「形質転換体」とは、上記ベクターを宿主細胞に導入することによって得られる宿主細胞のことを指す。ベクターを宿主細胞へ導入する方法は公知の情報、例えば酵母の場合、エレクトロポレーション法や酢酸リチウム法、スフェロプラスト法などが挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、オガタエア・アングスタの形質転換法としては、Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha.(Curr Genet 25: 305.310.)に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
 ベクターを宿主細胞に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、酵母であれば、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。また、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれG418、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、酵母宿主を作成するときに用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを回復させればよく、方法は当業者には公知の方法を用いることができる。
 ベクターを宿主細胞の染色体に組み込む場合、宿主細胞の染色体の相同領域を同時に有するDNAとして作成することが好ましい。染色体上へのベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでもよいし、1箇所の相同領域を利用した組み込みでもよいし、2箇所の相同領域を利用したダブルインテグレート型の組み込みでもよい。
 なお、相同領域とは、染色体とベクターの塩基配列を比較して、50%以上の配列同一性があればよく、その長さも特に限定されないが、50bp以上が好ましい。相同領域の配列同一性は、70%以上であることがより好ましく、80%以上であることがさらに好ましく、90%以上であることがさらにより好ましく、最も好ましくは100%である。
 相同領域を利用した組み込みの場合、例えば、プラスミドベクターの相同領域を制限酵素で1箇所以上を切断し、直鎖状のベクターの末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。例えばオガタエア・アングスタの場合、MOXターミネーターへの相同組込みであれば、MOXターミネーターの配列に1箇所存在するNruIサイトやEcoRVサイトで切断して直鎖状にした発現ベクターを用いることでMOXターミネーターへ組み込むことができる。
 染色体あたりの発現カセットのコピー数は特に限定されない。また、染色体上にベクターが組み込まれている位置は、ポリペプチドが菌体内で産生される限り、特に限定されない。なお、2コピー以上のベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でもよいし、異なる位置に1コピーずつ組み込まれている状態でもよい。
5.タンパク質の製造方法
 本発明のタンパク質の製造方法は、4.に記載の形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物を意味する。
 よって、本発明の形質転換体を用いて目的タンパク質を生産する方法としては、上記の形質転換体を培養し、その菌体中または培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。
 形質転換体を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。宿主細胞が酵母などの微生物の場合は、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等が挙げられ、窒素源としては、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
 本発明の好ましい態様として、宿主細胞にメタノール資化性酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールの1種でもよく、または2種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。
 形質転換体の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、酵母の場合、pH2.5~10.0、温度範囲10℃~48℃の範囲で、好気的に10時間~10日間培養することにより行うことができる。
 本発明における「目的タンパク質」とは、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等である。例えば、フィターゼ、プロテインA、プロテインG、プロテインL、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ 、トリプシン 、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ヒト及び/又は動物治療用タンパク質が好ましい。
 ヒト及び/又は動物治療用タンパク質として、具体的には、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、トロンボポエチン、IL-1、IL-6、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、ウロキナーゼ、レプチン、幹細胞成長因子(SCF)、などが挙げられる。
 ここで「抗体」とは、L鎖とH鎖の各2本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
 ここで「部分抗体」とは、Fab型抗体、(Fab)2型抗体、scFv型抗体、diabody型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Fab型抗体とは、抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合で結合したヘテロマータンパク質、または抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
 上記目的タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変が施されていてもよいし、de-novoで設計されたものでもよい。
 本発明の形質転換体を用いて生産された目的タンパク質は、培養上清に存在する状態であってもよいし、菌体内に蓄積している状態であってもよいし、そこから任意の方法で回収したものでもよい。培養上清や菌体内からの目的タンパク質の回収は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、まず、当該形質転換体を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析(硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など)、溶媒沈殿(アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法)、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から目的タンパク質を回収する。
 回収された目的タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後PEG化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
 目的タンパク質を菌体外に分泌させる場合には、該目的タンパク質遺伝子の5’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのMating Factor α(MFα)やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ(PHO1)、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ(PHO1)、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ(SUC2)、サッカロマイセス・セレビシエのPLB1、牛血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列などが挙げられる。
 本発明における目的タンパク質のプロモーターは、形質転換体内において目的タンパク質を発現させるプロモーターであれば特に限定されない。好ましくはメタノール誘導性プロモーターである。
 本発明のメタノール誘導性プロモーターは、炭素源がメタノールの際に転写活性を有するプロモーターであれば特に制限されないが、好ましくはAOX1プロモーター、AOX2プロモーター、CATプロモーター、DHASプロモーター、FDHプロモーター、FMDプロモーター、GAPプロモーター、MOXプロモーターなどが挙げられる。
 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えDNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている:
Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocolsin Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
 また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築した抗体発現ベクターおよび新規ポリペプチド発現ベクターを大腸菌E. coli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)にそれぞれ導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、QIAprep spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて行った。
 抗体発現ベクターの構築において利用したMOXプロモーター(配列番号1)、MOXターミネーター(配列番号2)、LEU2遺伝子(配列番号3)は、オガタエア・ポリモルファ 8V株の染色体DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。Mating Factorαプレプロシグナル遺伝子(MFα、配列番号4)は、サッカロマイセス・セレビシエS288c株の染色体DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
 抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗TNF-α 抗体の配列(adalimumab;HUMIRA(登録商標))の公開配列情報に基づいて、L鎖遺伝子(配列番号5)、Fd鎖遺伝子(配列番号6)を化学合成した(特開2009-082033)ものをテンプレートにしてPCRで調製した。
 新規ポリペプチド発現ベクターの構築において利用したGAPプロモーター(配列番号7)、GAPプロモーターで制御されたG418耐性遺伝子(配列番号8)はオガタエア・アングスタNCYC495株の染色体DNA、適当な市販ベクター等をテンプレートにしてPCRで調製した。
 新規ポリペプチド(NP1)遺伝子(配列番号9)は、オガタエア・アングスタNCYC495株の染色体DNAをテンプレートにして、当該ポリペプチド遺伝子の5’末端側にSpeI認識配列、3’末端側にBglII認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー18および19(配列番号28および29)を用いたPCRにより調製し、SpeI・BglII処理後にpUC19のXbaI・BamHIサイトに挿入して、当該ポリペプチド遺伝子を含むプラスミドを構築することによって調製した。
 PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体DNAの調製は、各菌株からGenとるくん(タカラバイオ社製)を用いて、これに記載の条件で実施した。
(実施例1)完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現ベクターの構築
 HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片(配列番号10)を全合成し、これをpUC19のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を調製した。また、LEU2遺伝子の両側にHindIII認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー1および2(配列番号11および12)を用いたPCRにより調製し、HindIII処理後にpUC-1のHindIIIサイトに挿入して、pUC-2を調製した。次に、MOXプロモーターの両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー3および4(配列番号13および14)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-2のBamHIサイトに挿入して、pUC-Pmoxを調製した。
 MOXプロモーターの両側にMunI認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー5および6(配列番号15および16)を用いたPCRにより調製し、MunI処理後にpUC-PmoxのMunIサイトに挿入して、pUC-PmoxPmoxを調製した。MOXターミネーターの両側にXbaI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー7および8(配列番号17および18)を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC-PmoxPmoxのXbaIサイトに挿入して、pUC-PmoxPmoxTmを調製した。
 MFαの上流にSpeI認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー9および10(配列番号19および20)を用いたPCRにより調製した。L鎖の上流にMFαの3’末端19bpを付加し、下流にSpeI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー11および12(配列番号21および22)を用いたPCRにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー9および12を用いたPCRにより、MFαとL鎖の融合遺伝子の両側にSpeI認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をSpeI処理後、pUC-PmoxPmoxTmのSpeIサイトに挿入して、pUC-PmoxLPmoxTmを構築した。
 一方、MFαの上流にBglII認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー13(配列番号23)および10を用いたPCRにより調製した。Fd鎖の上流にMFαの3’末端19bpを付加し、下流にBglII認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー14および15(配列番号24および25)を用いたPCRにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー13および15を用いたPCRにより、MFαとFd鎖の融合遺伝子の両側にBglII認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をBglII処理後、pUC-PmoxLPmoxTmのBglIIサイトに挿入して、pUC-PmoxLPmoxFdTmを構築した。このpUC-PmoxLPmoxFdTmは、Fab型抗体のL鎖およびFd鎖がMOXプロモーター制御下で発現するように設計されている。
(実施例2)新規ポリペプチド発現ベクターの構築
 MOXターミネーターの両側にXbaI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー7および8を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後に実施例1にて調製したpUC-1のXbaIサイトに挿入して、pUCTmを調製した。
 次に、GAPプロモーターで制御されたG418耐性遺伝子の両側にEcoRI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー16および17(配列番号26および27)を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUCTmのEcoRIサイトに挿入して、pUCTmG418を調製した。次に、新規ポリペプチド遺伝子(NP1)を含むプラスミドをテンプレートとして、新規ポリペプチド遺伝子の5’末端側にSpeI認識配列、3’末端側にBglII認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー18および19(配列番号28および29)を用いたPCRにより調製し、SpeI・BglII処理後にpUCTmG418のSpeI・BglIIサイトに挿入して、pUCNP1TmG418を構築した。次に、GAPプロモーターの両側にBamHI認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー20および21(配列番号30および31)を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUCNP1TmG418のBamHIサイトに挿入して、pUCPgapNP1TmG418を調製した。本発現ベクターは、新規ポリペプチド(配列番号32)がGAPプロモーター制御下で発現するように設計されている。
(実施例3)新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞の取得
 実施例2で構築したpUCPgapNP1TmG418を用いて大腸菌を形質転換して、得られた形質転換体を、5mlの2YT培地(1.6% tryptone bacto(Difco社製)、1.0% yeast extract bacto(Difco社製)、0.5% NaCl)で培養し、得られた菌体からQIAprep spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて、pUCPgapNP1TmG418を取得した。
 本プラスミドをMOXターミネーター遺伝子内のEcoRVサイトやNruIサイト、もしくはマルチクローニングサイト内のNotIサイトなどで切断して直鎖状にした。この直鎖状のpUCPgapNP1TmG418を用いて、以下のようにオガタエア・アングスタ及びコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
 オガタエア・アングスタNCYC495ロイシン要求性株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、37℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで37℃で振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。同様に、コマガタエラ・パストリスY-11430ロイシン要求性株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで30℃で振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
 この懸濁液をオガタエア・アングスタは37℃、コマガタエラ・パストリスは30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース, 10mM Tris-HCl, 1mM塩化マグネシウム, pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25mlの氷冷STMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
 このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUCPgapNP1TmG418溶液のそれぞれ3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極,電極間隔2mm;ビーエム機器社製)に移し入れ、オガタエア・アングスタは7.5kV/cm、10μF、900Ω、コマガタエラ・パストリスは7.5kV/cm、25μF、200Ωのパルスに供した後、菌体をYPD培地1mlで懸濁し、オガタエア・アングスタは37℃、コマガタエラ・パストリスは30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、室温)し、1mlのYNBMSG培地(0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム)に懸濁後、再度集菌(3000×g、5分、室温)した。菌体を適当量のYNBMSG培地で再懸濁後、YNBMSGG418選択寒天プレート(0.17% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム、1.5%アガロース、2%グルコース、0.05%G418二硫酸塩、100mg/Lロイシン)に塗布し、オガタエア・アングスタは37℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、オガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞を取得した。コマガタエラ・パストリスは30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、コマガタエラ・パストリス新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞を取得した。
(実施例4)新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体の取得
 実施例1で構築したpUC-PmoxLPmoxFdTmを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlの2YT培地(1.6% tryptone bacto(Difco社製)、1.0% yeast extract bacto(Difco社製)、0.5% NaCl)で培養し、得られた菌体からQIAprep spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて、pUC-PmoxLPmoxFdTmを取得した。
 本プラスミドをMOXターミネーター遺伝子内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。この直鎖状のpUC-PmoxLPmoxFdTmを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタ及びコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
 実施例3で取得したオガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞またはオガタエア・アングスタNCYC495ロイシン要求性株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、37℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで37℃で振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー,pH7.5に再懸濁した。同様に、実施例3で取得したコマガタエラ・パストリス新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞またはコマガタエラ・パストリスY-11430ロイシン要求性株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1~1.5になるまで30℃で振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー,pH7.5に再懸濁した。
 この懸濁液をオガタエア・アングスタは37℃、コマガタエラ・パストリスは30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース, 10mM Tris-HCl, 1mM塩化マグネシウム, pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25mlの氷冷STMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
 このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-PmoxLPmoxFdTm 溶液3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極,電極間隔2mm;ビーエム機器社製)に移し入れ、オガタエア・アングスタは7.5kV/cm、10μF、900Ω、コマガタエラ・パストリスは7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、オガタエア・アングスタは37℃、コマガタエラ・パストリスは30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、室温)し、1mlのYNBMSG培地(0.17% Yeast Nitrogen Base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム)に懸濁後、再度集菌(3000×g、5分、室温)した。菌体を適当量のYNBMSG培地で再懸濁後、オガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現酵母宿主細胞の形質転換体はYNBMSGG418選択寒天プレート(0.17% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム、1.5%アガロース、2%グルコース、0.05%G418二硫酸塩)に、オガタエア・アングスタNCYC495ロイシン要求性株の形質転換体はYNB選択寒天プレート(0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid(Difco社製)、1.5%アガロース、2%グルコース)に塗布し、オガタエア・アングスタは37℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、オガタエア・アングスタ新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体と、オガタエア・アングスタ完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体を取得した。コマガタエラ・パストリスは30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、コマガタエラ・パストリス新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体と、コマガタエラ・パストリス完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体を取得した。
(実施例5)新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体の培養
 実施例4で得られた新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体と完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体を2mlのBMGY培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2%polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、2% Glycerol)、また、BMGMY培地(1% yeast extract bacto(Difco社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Difco社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1% Glycerol、2% Methanol)に接種し、これを30℃、120rpm、72時間振盪培養後、遠心分離(12,000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。菌体濃度はOD600にて測定した。
(実施例6)ELISA法による完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体の分泌量の測定
 新規ポリペプチド発現/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体の培養上清への抗TNF-α Fab抗体分泌発現量は、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法により以下に示す方法で行った。ELISA用プレート(マキシソープ;NUNC社製)に固定化バッファー(0.1N重炭酸ナトリウム溶液,pH9.6)にて2500倍希釈したGoat Anti-Human IgG (Fab Specific) Antibody(SIGMA社製)を各ウェル50μlずつ添加し、終夜4℃でインキュベートした。
 インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック(大日本住友製薬社製)250μlでブロッキングし、室温で1時間静置した。PBSTバッファー(8g/L塩化ナトリウム、0.2g/L塩化カリウム、1.15g/Lリン酸一水素ナトリウム(無水)、0.2g/Lリン酸二水素カリウム(無水)、0.1% Tween20)で3回洗浄後、系列希釈した標準Fab抗体(Anti-Human IgG Fab;rockland社製)と希釈した培養上清を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応した。
 PBSTバッファーで4回洗浄後、PBSTバッファーにて8000倍希釈した二次抗体溶液(二次抗体:Anti-Human IgG(Fab Specific)HRP conjugate Antibody(SIGMA社製))を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応させた。PBSTバッファーで4回洗浄後、50μlのTMB-1 Component Microwell Peroxidase Substrate SureBlue(KPL社製)を添加し、室温で20分静置した。50μlのTMB Stop Solution(KPL社製)を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(BenchMark Plus;Bio-Rad社製)で450nmの吸光度を測定した。培養上清中のFab抗体の定量は、標準Fab抗体の検量線を用いて行った。この方法により得られた抗TNF-α Fab抗体分泌発現量と各々の菌体濃度(OD600)を図1に示した。
 その結果、新規ポリペプチド発現(pUCPgapNP1TmG418導入)/完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体は、明らかに、新規ポリペプチド遺伝子を導入していない完全ヒト型化抗TNF-α Fab抗体発現形質転換体より高い分泌発現量を示した。メタノールを含む培地(BMGMY培地)においても高い分泌発現量を示すことから、本発明の新規ポリペプチド発現により、従来技術では成し得なかった目的タンパク質のメタノール誘導性プロモーター活性化と、目的タンパク質が効率的に分泌生産できる菌形態変化が同時に起こったことが考えられる。
 本発明は、ヒト及び/又は動物治療用タンパク質の製造分野に利用できる。
 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims (9)

  1.  以下の(a)、(b)または(c)のいずれかのポリペプチド;
     (a)配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド;
     (b)配列番号32または33に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド;
     (c)配列番号32または33に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2.  以下の(d)、(e)、(f)または(g)のいずれかの遺伝子;
     (d)配列番号9または34に示す塩基配列からなる遺伝子;
     (e)配列番号9または34に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子;
     (f)配列番号9または34に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子;
     (g)配列番号32または33に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子。
  3.  請求項2に記載の遺伝子を含有するベクター。 
  4.  請求項3に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  5.  宿主細胞が、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、または動物細胞である、請求項4に記載の形質転換体。
  6.  酵母がメタノール資化性酵母である、請求項5に記載の形質転換体。
  7.  メタノール資化性酵母がオガタエア属酵母又はコマガタエラ属酵母である、請求項6に記載の形質転換体。
  8.  請求項4~7のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  9.  培養が、グルコース、及び/又はグリセロール、及び/又はメタノールを炭素源とすることを特徴とする、請求項8に記載のタンパク質の製造方法。
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