JP6943841B2 - メタノール資化性酵母由来新規タンパク質及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)(a)配列番号113、108〜112、及び114〜120のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)前記(a)に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(c)前記(a)に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
(d)前記(a)に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列
を含む、ベクター。
(2)前記(a)〜(d)に記載の塩基配列が、それぞれ、
(a')配列番号75、65、67、69、71、73、77、79、81、83、85、87、及び89のいずれかに示す塩基配列、
(b')前記(a')に示す塩基配列において、1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、及び/又は付加した塩基配列、
(c')前記(a')に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列、及び
(d')前記(a')に示す塩基配列に対して相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列
である、(1)に記載のベクター。
(3)(e)配列番号100、95〜99、及び101〜107のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(f)前記(e)に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(g)前記(e)に示すアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
(h)前記(e)に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列
を含む、ベクター。
(4)前記(e)〜(h)に記載の塩基配列が、それぞれ、
(e')配列番号39、24、27、30、33、36、42、45、48、51、54、57、及び60のいずれかに示す塩基配列、
(f')前記(e')に示す塩基配列において、1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、及び/又は付加した塩基配列、
(g')前記(e')に示す塩基配列と85%以上の配列同一性を有する塩基配列、及び
(h')前記(e')に示す塩基配列に対して相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列
である、(3)に記載のベクター。
(5)宿主細胞のタンパク質の分泌量を増加させる、(1)〜(4)のいずれかに記載のベクター。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載のベクターからなる、タンパク質分泌増強剤。
(7)(1)〜(4)のいずれかに規定される塩基配列を含む遺伝子の発現が野生型株に比べて増加し、タンパク質の分泌量が野生型株に比べて増加している、変異株細胞。
(8)(1)〜(5)のいずれかに記載のベクターを含む、細胞。
(9)酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、又は植物細胞である、(7)又は(8)に記載の細胞。
(10)酵母が、メタノール資化性酵母、分裂酵母、又は出芽酵母である、(9)に記載の細胞。
(11)メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、(10)に記載の細胞。
(12)宿主細胞に、(1)〜(5)のいずれかに記載のベクター又は(6)に記載のタンパク質分泌増強剤を導入する工程を含む、タンパク質の分泌量が導入前の宿主細胞に比べて増加している変異株を作製する方法。
(13)(7)〜(11)のいずれかに記載の細胞を培養する工程、及び
培養液から目的タンパク質を回収する工程
を含む、目的タンパク質の生産方法。
(14)目的タンパク質が異種タンパク質である、(13)に記載の方法。
(15)培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いる、(13)又は(14)に記載の方法。
1.用語の定義
本発明において、2つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、核酸Xを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃で核酸Yとハイブリダイゼーションを行った後、2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、核酸Yがフィルター上に結合した核酸として取得できる場合に、核酸Yを「核酸Xとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」と言うことができる。或いは核酸Xと核酸Yとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。核酸Yは好ましくは65℃で0.5倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは65℃で0.1倍濃度のSSC溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。基準となる核酸Xは、コロニー又はプラーク由来の核酸Xであってよい。
一態様において、本発明は、(a)配列番号113、108〜112、及び114〜120、好ましくは配列番号113、108〜112、117、及び120のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、(b)前記(a)に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、(c)前記(a)に示すアミノ酸配列と85%以上、例えば90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は(d)前記(a)に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含むベクターに関する。
配列番号95で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA36173で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号24で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号96で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA37695で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号27で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号97で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA41161で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号30で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号98で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA41167で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号33で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号99で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA37701で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号36で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号100で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA40175で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号39で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;、
配列番号101で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA37509で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号42で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;、
配列番号102で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA38967で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号45で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;、
配列番号103で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CCA37504で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号48で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;、
配列番号104で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CAY67126で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号51で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号105で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CAY68445で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号54で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
配列番号106で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CAY68608で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号57で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド;並びに
配列番号107で示されるアミノ酸配列を含むACCESSION No. CAY71233で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号60で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
配列番号95〜107のいずれかに示すアミノ酸配列のC末端領域の約120〜約200をそれぞれ欠失させた、配列番号108〜120のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
及び該ポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、及び89のいずれかに示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
一態様において、本発明は、上記(a)〜(h)及び(a')〜(h')のいずれかに示す塩基配列を含む遺伝子の発現が増加し、タンパク質の分泌量が増加している、変異株細胞に関する。本発明の変異株細胞は上記の(a)〜(h)に示す塩基配列を含む遺伝子の発現が、2以上組み合わせて増加していてもよい。組み合わせの数の例として、例えば3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、又は10以上が挙げられる。例えば、本発明の変異株細胞は、上記(a)の配列、すなわち配列番号113、108〜112、及び114〜120のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はこれらのいずれかと等価な配列を含む遺伝子の発現が、2以上組み合わせて増加していてもよい。したがって、本発明の変異株細胞は、上記(a)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、上記(b)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、上記(c)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、又は上記(d)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせの発現が増加したものであってよい。同様に、本発明の変異株細胞は、上記(e)の配列、すなわち配列番号100、95〜99、及び101〜107のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はこれらのいずれかと等価な配列を含む遺伝子の発現が2以上組み合わせて増加していてもよい。したがって、本発明の変異株細胞は、上記(e)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、上記(f)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、上記(g)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせ、又は上記(h)に示す配列を含む遺伝子の2以上の組み合わせの発現が増加したものであってよい。本発明の変異株細胞は、例えば配列番号113、108、及び109のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はこれらのいずれかと等価な配列を含む遺伝子の発現が2以上組み合わせて増加していてよい。本発明の変異株細胞は、好ましくは、配列番号100、95、96のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はこれらのいずれかと等価な配列を含む遺伝子の発現が2以上組み合わせて増加している。
一態様において、本発明は、上記3に記載の細胞を培養する工程、培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の生産方法に関する。
以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている:Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片(配列番号1)を全合成し、これをpUC19(タカラバイオ社製、Code No. 3219)のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を構築した。
HindIII-BamHI-SpeI-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片(配列番号14)を全合成し、これをpUC19(タカラバイオ社製、Code No.3219)のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-2を構築した。
実施例2で構築した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxHIS4及び実施例3で構築したポリペプチド発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
C末端が欠損したポリペプチドをコードする塩基配列を、実施例3で構築したポリペプチド発現ベクターをテンプレートにしてPCRで調製した。図1に、新規ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント、及び欠損させた比較的相同性の高いC末端領域を示す。C末端欠損ポリペプチドの名称、ポリペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする塩基配列、核酸断片の増幅に用いたプライマーの配列、テンプレートを以下の表2に示す。
実施例4で取得した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1〜1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
コマガタエラ・パストリスATCC76273株、実施例4及び実施例6で得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、ポリペプチド発現酵母、抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体及びポリペプチド発現酵母、抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体及びC末端欠損ポリペプチド発現酵母を2mlのBMMY培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% polypeptone(日本製薬社製)、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、2% Methanol)に接種し、これを30℃、170rpm、72時間振盪培養後、遠心分離(12000rpm、5分、4℃)により培養上清を回収した。菌体濃度はOD600にて測定した。
実施例7の培養上清への分泌タンパク質発現量は、Bradford法により以下に示す方法で行った。
実施例7で得られた培養上清への抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体分泌発現量は、サンドイッチELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法により以下に示す方法で行った。
Claims (12)
- コマガタエラ属酵母細胞におけるタンパク質分泌増強剤であって、
(a)配列番号113、108〜112、及び114〜120のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(b)前記(a)に示すアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
(c)前記(a)に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含み、コマガタエラ属酵母細胞のタンパク質の分泌量を増加させるベクターからなる、タンパク質分泌増強剤。 - 前記(a)〜(c)に記載の塩基配列が、それぞれ、
(a')配列番号75、65、67、69、71、73、77、79、81、83、85、87、及び89のいずれかに示す塩基配列、
(b')前記(a')に示す塩基配列において、1〜7個の塩基が置換、欠失、及び/又は付加した塩基配列、及び
(c')前記(a')に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列
である、請求項1に記載のタンパク質分泌増強剤。 - コマガタエラ属酵母細胞におけるタンパク質分泌増強剤であって、
(e)配列番号100、95〜99、及び101〜107のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(f)前記(e)に示すアミノ酸配列において、1〜4個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
(g)前記(e)に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含み、コマガタエラ属酵母細胞のタンパク質の分泌量を増加させるベクターからなる、タンパク質分泌増強剤。 - 前記(e)〜(g)に記載の塩基配列が、それぞれ、
(e')配列番号39、24、27、30、33、36、42、45、48、51、54、57、及び60のいずれかに示す塩基配列、
(f')前記(e')に示す塩基配列において、1〜10個の塩基が置換、欠失、及び/又は付加した塩基配列、及び
(g')前記(e')に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列
である、請求項3に記載のタンパク質分泌増強剤。 - 請求項1〜4のいずれか一項に規定される塩基配列を含む遺伝子の発現が野生型株に比べて増加し、タンパク質の分泌量が野生型株に比べて増加している、コマガタエラ属酵母の変異株細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質分泌増強剤を含むものである、請求項5に記載の細胞。
- 目的タンパク質を発現するコマガタエラ属酵母細胞において請求項1〜4のいずれか一項に規定される塩基配列を含む遺伝子の発現を増強する工程を含む、コマガタエラ属酵母細胞における目的タンパク質の分泌量を増加させる方法。
- 前記遺伝子の発現を増強する工程が、前記コマガタエラ属酵母細胞に請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質分泌増強剤を導入することを含む、請求項7に記載の方法。
- コマガタエラ属酵母の宿主細胞に、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質分泌増強剤を導入する工程を含む、タンパク質の分泌量が導入前の宿主細胞に比べて増加しているコマガタエラ属酵母の変異株を作製する方法。
- 請求項5又は6に記載の細胞を培養する工程、及び
培養液から目的タンパク質を回収する工程
を含む、目的タンパク質の生産方法。 - 目的タンパク質が異種タンパク質である、請求項10に記載の方法。
- 培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いる、請求項10又は11に記載の方法。
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