CN102105589A - 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) DAS启动子变体 - Google Patents
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) DAS启动子变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102105589A CN102105589A CN2009801269578A CN200980126957A CN102105589A CN 102105589 A CN102105589 A CN 102105589A CN 2009801269578 A CN2009801269578 A CN 2009801269578A CN 200980126957 A CN200980126957 A CN 200980126957A CN 102105589 A CN102105589 A CN 102105589A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polynucleotide
- seq
- promotor
- uas
- identity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 231
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 231
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 231
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims abstract description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 63
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 22
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 20
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 11
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 5
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 5
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150067325 DAS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100516268 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NDT80 gene Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 3
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 3
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 methane amide Chemical class 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101100028789 Arabidopsis thaliana PBS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100139907 Arabidopsis thaliana RAR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100494262 Caenorhabditis elegans best-12 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710093617 Dihydroxyacetone synthase Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101100028790 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PBS2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N ammonium heptamolybdate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo] QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M sodium [(1R,2R,4aR,8aS)-2-hydroxy-5-[(2E)-2-[(4S)-4-hydroxy-2-oxooxolan-3-ylidene]ethyl]-1,4a,6-trimethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl sulfate Chemical compound [Na+].C([C@@H]1[C@](C)(COS([O-])(=O)=O)[C@H](O)CC[C@]11C)CC(C)=C1C\C=C1/[C@H](O)COC1=O PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000580513 Citrobacter braakii Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001221837 Ogataea thermomethanolica Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100226950 Pichia angusta FMDH gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分离多核苷酸形式的启动子变体，包括i)由来自毕赤酵母的DAS启动子序列组成的核苷酸序列或其功能性部分，其中所述DAS启动子包含于SEQ ID NO：1；和ii)至少一种其他UAS，其中所述UAS包含于SEQID NO：2。
Description
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及包含毕赤酵母DAS启动子变体的分离的多核苷酸，包含可操作地连接于编码目标多肽的多核苷酸的所述启动子变体的DNA构建体，包含所述DNA构建体的表达载体，包含所述DNA构建体或表达载体的宿主细胞，产生目标多肽的方法，包含UAS的启动子和UAS用于增加转录的用途。
发明背景
真核生物广泛在产业上用作宿主细胞以供产生用于，例如，药物和工业应用的多肽。操纵基因转录和表达的能力给出了提供更高生产得率的基础。
常规地，基因在真核生物中的最大表达是通过在染色体中扩增表达盒来实现的，所述表达盒包含可操作地连接于编码目标多肽的基因的单一启动子，以及扩增物(amplifier)选择性标志物。
经常需要受控的表达。在甲基营养型酵母中，长期以来已知某些启动子依赖于生长培养基中甲醇的存在以供诱导转录。然而，此通过甲醇诱导需要其他因子的存在，并未阐明这些因子作用的确切机理。已知来自酵母的正因子(positive factor)的实例包括Mxr1p，其被描述为在巴斯德毕赤酵母中利用甲醇所需的关键正调节子(Lin-Cereghino等，2006，Mol Cell Biol 26(3)：883-897)。
这些甲醇依赖性启动子的实例描述于几种属于已知为甲基营养型酵母的酵母组中的酵母细胞。在这些生物中调控甲醇代谢中牵涉的酶的表达的启动子特别强，且这些启动子通常在酵母中用于调控蛋白质的异源表达。然而，用于培养这些宿主细胞的特定碳源对甲醇代谢启动子的调节具有巨大影响。甲醇和甘油被认为是对甲基营养型酵母表达系统的充分底物，而葡萄糖被认为不充分(EP 299108)。因此，如果能使已知由甲醇代谢启动子的表达对底物的依赖性减少是合意的。
发明内容
本发明提供了改进的毕赤酵母DAS启动子的变体以供增加目标多肽的表达。
在第一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含：i)由来自毕赤酵母属的DAS启动子序列或其功能性部分组成的核苷酸序列，其中所述DAS启动子包含于SEQ ID NO：1；和ii)至少一个其他的UAS，其中所述UAS包含于SEQ ID NO：2。
在第二个方面，本发明涉及包含本发明多核苷酸序列(修饰的DAS启动子)的DNA构建体，所述多核苷酸序列可操作地连接于编码目标多肽的结构基因和终止子。
在第三个方面，本发明涉及包含本发明DNA构建体的表达载体，还包含信号肽编码区。
在第四个方面，本发明涉及包含本发明表达载体的毕赤酵母属宿主细胞。
在第五个方面，本发明涉及产生目标多肽的方法，包括：
(a)在有益于产生目标多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
在第六个方面，本发明涉及包含选自下组的UAS的启动子：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
在第七个方面，本发明涉及UAS用于增加由启动子的转录的用途，其中所述UAS选自下组：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
附图简述
图1显示对SEQ ID NO：1所示的DAS启动子的缺失分析。
图2显示DAS启动子变体具有的内部缺失的位置，和所采用的引物的编号。
图3显示本发明具有多个UAS的DAS启动子变体。如图所示从NsiI位点开始并包括编码肌醇六磷酸酶N端的区域的pDAS wt2的DNA序列对应于SEQ ID NO：6。
图4显示所述DAS启动子在-255位左右具有内部缺失的另外的缺失变体。
定义
同一性：就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的任选参数是：缺口开启罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
杂交：就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于所述序列，例如，SEQ IDNO：7；其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严格性)，更优选在50℃(低严格性)，更优选在55℃(中严格性)，更优选在60℃(中-高严格性)，甚至更优选在65℃(高严格性)，并且最优选在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
亚序列：术语“亚序列”在本文中定义为从SEQ ID NO：1序列5’和/或3’端具有一个或多个(几个)核苷酸缺失的核苷酸序列；其中所述亚序列具有启动子活性(因此为其功能性部分)。在一个优选方面，亚序列包含SEQ ID NO：1的至少755个核苷酸，更优选SEQ ID NO：1的至少555个核苷酸，甚至更优选SEQ ID NO：1的至少455个核苷酸，且最优选SEQ ID NO：1的至少355个核苷酸，分别对应于SEQ ID NO：1的301-1055、501-1055、601-1055和701-1055位。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
外源：术语“外源”在本文中意指，根据本发明的上游激活序列(UAS)来源于不同的来源，其中“来源”可指基因或细胞。因此，举例而言，UAS通常见于巴斯德毕赤酵母DAS启动子的启动子区，然而，其可根据本发明用于不同的，天然地不含所述UAS的启动子。因此所述UAS可来源于来自相同细胞的不同基因，或其可来源于遗传上不同的细胞/物种的功能等同基因。
具体实施方式
本发明涉及多肽由甲醇诱导型启动子的受控表达。这些启动子的实例已经在属于已知为甲基营养型酵母的酵母组的几种酵母细胞中描述。在本发明的上下文中，将甲基营养型酵母定义为能够利用甲醇作为唯一碳源用于它们的生长的一组酵母。在这些生物中与甲醇代谢有关的酶的启动子是特别强的，并且这些启动子(甲醇代谢启动子)通常用于调控酵母中蛋白质的异源表达。
甲基营养型酵母宿主细胞的已知成员属于选自下组的属：毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)。根据本发明，在一个实施方案中，毕赤酵母属宿主细胞可以选自下组：巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、嗜热甲醇毕赤酵母(Pichia thermomethanolica)。汉逊酵母属或假丝酵母属宿主细胞可以选自下组：多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。
先前已经分离并在文献中描述了几种启动子，通过向生长培养基中添加甲醇，可以控制异源多肽由所述启动子的表达。这些启动子包括但不限于例如AOX1启动子(醇氧化酶启动子)、DHAS启动子(或DAS启动子)(二羟基丙酮合酶启动子)、FDH启动子(或FMDH启动子)(甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase)启动子)、MOX启动子(甲醇氧化酶启动子)、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子。具体地，与本发明相关的启动子是二羟基丙酮合酶(DAS或DHAS)启动子
通常地，所有上述启动子都要求存在甲醇用于它们的诱导。这种甲醇诱导要求存在其他因子(如转录因子)，然而，这些因子的确切作用机制尚未阐明。在酵母中，例如Mxr1p，已经被描述为巴斯德毕赤酵母中甲醇利用所需的关键正调节子(Lin-Cereghino等，2006，Mol Cell Biol 26(3)：883-897)。
本发明的发明人之前发现，由来自巴斯德毕赤酵母的Prm1基因编码的单一正因子的受控表达，如其它地方(共同未决的申请WO 2008/090211，优先权日2007年1月26日)所述，可足以在生长培养基中无需甲醇而诱导由几种甲醇诱导型启动子的转录。这已经使用Prm1蛋白质作为正活化子的模式蛋白(model protein)，和使用AOX1或DAS启动子用于报告子多肽(reporter polypeptide)的受控表达而证明。获得的结果显示，仅通过控制prm1基因的表达，且在生长培养基中不存在甲醇的情况下诱导AOX1或DAS启动子是可能的。
正调节子Prm1的作用机理并未阐明，但一个可能性是所述调节子结合甲醇诱导型启动子的启动子区，本发明的发明人已经在包含来自巴斯德毕赤酵母的DAS启动子的DNA序列中鉴定了一个可能包含Prm1结合区的上述区域。
如其它地方(WO 2008/090211/PCT/EP2008/050870)所述，可在1055bp的片段(SEQ ID NO：1)上获得包含来自巴斯德毕赤酵母DAS启动子的片段。
为了测试启动子活性以供分析经修饰的启动子变体，所述启动子需要可操作地连接于报道子基因。可使用其表达可方便地确定的任何基因。合适的报道子基因可为布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)肌醇六磷酸酶基因，所述基因经密码子优化以供在毕赤酵母属中表达，并与来自酿酒酵母的α因子信号肽在框内融合。编码所述信号肽的核酸序列还可有利地经密码子优化以供毕赤酵母属表达。上述报道子基因构建体的完整DNA序列示于SEQ ID NO：4(关于如何构建该报道子基因构建体的细节，参见共同未决的申请WO2008/090211)。所述α因子信号肽编码SEQ ID NO：4的1-255位。然后所述报道子基因可与包含DAS启动子的片段(SEQ ID NO：1)融合。一种上述构建体示于SEQ ID NO：5，其包含所述启动子和所述肌醇六磷酸酶基因的起始。信号肽的起始密码子可见于SEQ ID NO：5的1065位。
使用插入合适表达载体(任何支持在毕赤酵母属中表达的载体)的上述构建体进行缺失分析。根据这些分析，如在实施例中详细解释的，可得出结论所述1055bp DAS启动子片段(SEQ ID NO：1)包含似为上游激活序列(Upstream Activating Sequence，UAS)的区域。该UAS序列似包含于100bp片段(SEQ ID NO：1中的701-800位)。当该片段以1、2或3个拷贝添加至所述1055bp片段的亚序列时，可观察到启动子活性的显著增加。因此巴斯德毕赤酵母DAS启动子包含于1055bp片段，而UAS包含于100bp片段。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含：
i)由来自毕赤酵母属的DAS启动子序列组成的核苷酸序列，或其功能性亚序列，其中所述DAS启动子包含于SEQ ID NO：1；和
ii)至少一个其他UAS，其中所述UAS包含于SEQ ID NO：2。
根据进行的分析可见，在另一个实施方案中，DAS启动子包含于对应SEQ ID NO：1的201-1055位的855bp亚序列，特别是包含于对应SEQ ID NO：1的301-1055位的755bp亚序列，更特别是包含于对应SEQ ID NO：1的401-1055位的655bp亚序列，更特别是包含于对应SEQ ID NO：1的501-1055位的555bp亚序列，更特别是包含于对应SEQ ID NO：1的601-1055位的455bp亚序列，更特别是包含于对应SEQ ID NO：1的701-1055位的355bp亚序列。
通过分析所述启动子序列，揭示了另外3个可能的TATA盒，分别在SEQID NO：1的882、955和1002位。在一个实施方案中，启动子至少包含在882位的TATA盒。在另一个实施方案中，启动子至少包含在955位的TATA盒。还在另一个实施方案中，启动子至少包含在1002位的TATA盒。
UAS包含于对应SEQ ID NO：1的701-800位的100bp亚序列。然而，所述UAS可小于100bp。在所述100bp亚序列内，在SEQ ID NO：1中767-788位的大约20bp似对正常功能是必需的。
因此，在另一个实施方案中，所述UAS至少包含SEQ ID NO：1中767-788位的亚序列。
添加更多其他的UAS会更增加启动子活性。添加三个其他的UAS时观察到最高活性。因此，在一个实施方案中，根据本发明的启动子包含至少两个其他的UAS，特别是至少三个其他的UAS，更特别是至少四个其他的UAS，且甚至更特别是至少五个其他的UAS。
然而，可预见这些数字不会无限增加，当其他的UAS数目变得过高时，也会增加正活化子Prm1的表达，或者可增加Mxr1正活化子的水平。
在一个实施方案中，根据本发明的经修饰的DAS启动子包含一个其他的UAS，其位于SEQ ID NO：1855bp亚序列的上游。因此，一个实施方案涉及本发明的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位或其全长互补链杂交。
在另一个实施方案中，根据本发明经修饰的DAS启动子包含两个其他UAS，其位于SEQ ID NO：1的855bp亚序列的上游。因此，一个实施方案涉及本发明的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位或其全长互补链杂交。
在另一个实施方案中，根据本发明经修饰的DAS启动子包含三个其他UAS，位于SEQ ID NO：1的855bp亚序列的上游。因此，一个实施方案涉及本发明的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位或其全长互补链杂交。
所述经修饰的本发明DAS启动子对在毕赤酵母属，且例如在多形汉逊酵母和博伊丁假丝酵母或其他甲基营养型酵母中表达任何目标多肽是有用的。因此，在另一个方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸序列(经修饰的DAS启动子)的DNA构建体，所述多核苷酸序列可操作地连接于编码目标多肽的结构基因和终止子。
所述经修饰的本发明DAS启动子还可有利地用于任何合适的毕赤酵母属表达质粒。本领域技术人员会知道如何将所述启动子克隆入上述构建体。因此在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的DNA构建体的表达载体，其进一步包含信号肽编码区。
还在另一个方面，本发明涉及毕赤酵母属宿主细胞，其包含本发明的表达载体。具体而言所述毕赤酵母属宿主细胞是巴斯德毕赤酵母属宿主细胞。
在甚至另一个方面，本发明涉及产生目标多肽的方法，包括：
(a)在有益于产生目标多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
在所述产生方法中，正调节子Prm1会由宿主细胞产生，因为prm1基因对巴斯德毕赤酵母而言是内源的。然而，过量产生Prm1可进一步增加启动子活性，特别是当UAS以多拷贝存在时。甚至过表达Mxr1蛋白可对经修饰的DAS启动子活性具有作用。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明产生目标多肽的方法，其中正调节子Prm1在宿主细胞中的表达通过调控Prm1的表达或通过增加Prm1编码基因的拷贝数而增加。在又一个实施方案中，正调节子Mxr1的表达通过调控Mxr1的表达或通过增加Mxr1编码基因的拷贝数而增加。在一个其他的实施方案中，调节子Prm1和Mxr1两者的表达水平均增加。
在本发明的一个实施方案中，从合适的启动子组成型表达正调节子。优选地，启动子不是天然启动子，意思是调控正调节子表达的启动子与通常调控表达的启动子不同。在本发明的上下文中，将这些优选的启动子称为“非天然的”。启动子可以对宿主生物仍然是天然的，但是在所研究基因(例如prm1基因)的语境中是外源的。在一个具体实施方案中，启动子选自下组：GAP启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子)、TEF1启动子(翻译延长因子EF-1α启动子)和PGK启动子(磷酸甘油酸激酶启动子)。除了由如上所述的非天然启动子调控的表达之外，根据本发明的宿主细胞通常从存在于染色体上的内源基因表达正调节子。在另一个实施方案中，可将编码正调节子的基因的内源拷贝失活，例如通过缺失失活，或者控制基因的内源拷贝的正常启动子可以被所选的非天然启动子代替。
在另一个的实施方案中，正调节子的表达受控于(is controlled from)并非甲醇诱导型的诱导型启动子。
如上所述，根据本发明的正调节子还可为从其他酵母细胞分离的Prm1功能性同源物。根据本发明的一个实施方案，一个这样的候选者可为由来自多形汉逊酵母(同种异名安格斯毕赤酵母)的mut3基因编码的Mut3。在本文提供的实施例中，Prm1或Mxr1在巴斯德毕赤酵母中过量产生。然而可能的是相同的作用可通过在毕赤酵母属中过量产生Mut3或在汉逊酵母属中过量产生Prm1或在汉逊酵母属中过量产生Mut3来获得。这些未经测试。
因此，在本发明另一个实施方案中，所述正调节子是Mut3.
存在于宿主细胞中正调节子水平的增加还可简单地通过在宿主细胞中存在编码所述调节子的基因的多重拷贝来提供。
本发明的另一个方面涉及包含于SEQ ID NO：2的UAS，或至少包含SEQ ID NO：3的UAS。
因此，本发明涉及选自下组的分离的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交。
在另一个实施方案中，本发明涉及选自下组的分离的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交。
根据本发明UAS可用于像激活DAS启动子一样激活外源启动子。在此情况下，根据本发明的UAS的一个或多个拷贝与在其天然形式中不含有如本文所解释的UAS的启动子组合。因此，在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的UAS的启动子，其中所述UAS对所述启动子是外源的，或其中所述UAS以多于一个拷贝存在。
在另一个实施方案中，本发明涉及UAS用于增加由启动子的转录的用途。所述启动子可为外源启动子，在此情况下，其尚未包含UAS的拷贝，或其可为DAS启动子，在此情况下，可如上所述添加其他的拷贝。
因此，在另一个实施方案中本发明涉及包含选自下组的UAS的启动子：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
在又一个方面，本发明涉及UAS用于增加由启动子的转录的用途，其中所述UAS选自下组：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
适于上述激活的启动子可具体而言是由甲醇诱导的启动子。
在本发明的产生方法中，使用本领域公知方法将细胞在适于产生多肽的营养培养基中培养。举例而言，所述细胞可通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明产生的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
在一个具体实施方案中，由宿主细胞产生的多肽对宿主细胞是异源的。在另一个实施方案中，所述多肽对所述宿主细胞是同源的。
实施例
材料和方法
菌株
大肠杆菌TOP10(invitorgen)和DH5alpha(TOYOBO)用于质粒构建。LB(1％Tripton(Difco)，0.5％酵母提取物(Difco)，0.5％NaCl)在补充相关抗生素之后用作基础培养基。
巴斯德毕赤酵母his4突变体，GS115用于表达测试。
巴斯德毕赤酵母COls702(Muts)是AOX1基因破坏的毕赤酵母NRRLY-15851菌株，并描述于实施例5。
供其生长所用的培养基如下所述：
YPD(2％蛋白胨(Difco)，1％酵母提取物(Difco)，2％葡萄糖)
RD琼脂；1M山梨醇，2％葡萄糖，1.34％酵母氮基(Yeast nitrogen base)(Difco)，4X10-5％生物素，0.005％氨基酸(L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸)，2％Agar Noble(Difco)
MD琼脂；1.34％酵母氮基，4X10-5％生物素，2％葡萄糖
巴斯德毕赤酵母的转化
巴斯德毕赤酵母菌株通过电穿孔来转化。新鲜转化态细胞通过下述方法制备。将宿主菌株接种入100ml的YPD，并生长至OD660为1.2～1.4。细胞用冰水洗涤两次(100ml和50ml)，并用4ml冰冷的1M山梨醇洗涤。然后将细胞悬于0.2ml冰冷的1M山梨醇。将线性化的(linearized)的质粒DNA(1～2μg)与80μl新鲜感受态细胞混合，并在冰上储存5分钟。将细胞转移至冰冷的0.2cm电穿孔小杯(cuvette)中。转化使用BioRadTM GenePulser II进行。使用的参数为1500V、25μF和200Ω。在脉冲之后紧接着将细胞悬于1ml冰冷的1M山梨醇。将混合物铺于相关的选择平板上。
筛选His4位点整合的菌落PCR
用经灭菌的牙签将细胞挑取到0.2ml试管中，然后在微波烤炉中烘烤。将经干燥的细胞悬于50μl灭菌水中，并对其使用Expand High Fidelity Plus (Roche)进行PCR。反应混合物为20μl，包含2mM dNTP，每种引物10μM，1单位Expand High Fidelity Plus(Roche)，1X Expand High Fidelity Plus缓冲液(Roche)以及1μl如上所述的细胞悬液。PCR引物为引物139：5’-ctgctctagccagtttgctg-3’(SEQ ID NO：10)(在基因组中His4标志物上游)和S98：5’-gccgcccagtcctgctcgct-3’(SEQ ID NO：11)(在表达载体中His4标志物和AOX终止子之间)。PCR程序如下所示：
表达盒整合在His4位点的菌株显示约2.9kb的条带。
甲醇诱导的摇瓶评价
将在MD琼脂上培养3日的细胞接种于在500ml摇瓶中的100ml YPD中，并在30℃振荡培养。然后将1ml种子培养物接种至100ml YPD，并在30℃培养2日。在培养过程中，在第2日添加5ml 40％甲醇以供诱导。取样在第3日进行。
肌醇六磷酸酶测定方法
将溶解于乙酸盐缓冲液pH 5.5的7.5mM植酸钠与1/2体积在含有0.01％Tween20的相同乙酸盐缓冲液中的酶试样溶液混合。在37℃温育30分钟后，添加含20mM七钼酸铵(ammonium heptamolybdate)和溶解于10.8％硝酸的0.06％钒酸铵的终止试剂以生成与释放的无机磷酸盐的黄色络合物。释放的磷酸盐的量用分光光度法作为在405nm的吸光度测量。一个肌醇六磷酸酶单位定义为每分钟释放1μmol无机磷酸盐的酶量。
表1引物和引物组合
| 引物 | 序列 | 方向 | 质粒 |
| 引物126 | 5’gaaaagtgccacctgagtccgttactcaaaaagtc 3’ | 正向 | pDd-2 |
| 引物127 | 5’gaaaagtgccacctgcggtatctgaaacacaagac 3’ | 正向 | pDd-3 |
| 引物128 | 5’gaaaagtgccacctgtgaaaattactggtaacttc 3’ | 正向 | pDd-4 |
| 引物129 | 5’gaaaagtgccacctgctataagaaacgaaggattt 3’ | 正向 | pDd-5 |
| 引物130 | 5’gaaaagtgccacctgaaagaaattcggacaaatag 3’ | 正向 | pDd-6 |
| 引物132 | 5’gaaaagtgccacctgttctccacattcagtcatag 3’ | 正向 | pDd-8 |
| 引物133 | 5’gaaaagtgccacctgcagtttaaagtttttctttc 3’ | 正向 | pDd-9 |
| 引物134 | 5’gaaaagtgccacctgttataacccctctaaacact 3’ | 正向 | pDd-10 |
| 引物135 | 5’aaccagcccagtgggacgtcccattgtggccactgatctgggg 3’ | 反向 | pDd-2～20 |
| 引物144 | 5’ccccgaaaagtgccacctgacgtc 3’ | 正向 | pDd-11～20 |
| 引物152 | 5’actgaatgtggagaacgatggtgttgctcaacaaagggatg 3’ | 反向 | pDd-14，pDd-20 |
| 引物153 | 5’ttgagcaacaccatcgttctccacattcagtcatagatggg 3’ | 正向 | pDd-14，20 |
| 引物154 | 5’aacagataatagaaattctccacattcagtcatagatggg 3’ | 正向 | pDd-15 |
| 引物155 | 5’actgaatgtggagaatttctattatctgttcgtttgggcg 3’ | 反向 | pDd-15 |
| 引物156 | 5’ttagtatacttgcccttctccacattcagtcatagatggg 3’ | 正向 | pDd-16 |
| 引物157 | 5’actgaatgtggagaagggcaagtatactaaatctcggaac 3’ | 反向 | pDd-16 |
| 引物158 | 5’aacagataatagaaattagccagtacgaaagaggaaactt 3’ | 正向 | oDd-17 |
| 引物159 | 5’tttcgtactggctaatttctattatctgttcgtttgggcg 3’ | 反向 | pDd-17 |
| 引物160 | 5’ttagtatacttgcccttagccagtacgaaagaggaaactt 3’ | 正向 | pDd-18 |
| 引物161 | 5’tttcgtactggctaagggcaagtatactaaatctcggaac 3’ | 反向 | pDd-18 |
| 引物162 | 5’ttagtatacttgcccaaagaaattcggacaaatagaacac 3’ | 正向 | pDd-19，20 |
| 引物163 | 5’tgtccgaatttctttgggcaagtatactaaatctcggaaca 3’ | 反向 | pDd-19，20 |
| 引物174 | 5’taggctaaactcattcgcgctcggttaagtttcctctttcg 3’ | 反向 | pDd32 |
| 引物175 | 5’gcgcgaatgagtttagcctagatatcctt 3’ | 正向 | pDd32 |
| 引物176 | 5’aagtatcggaacaactaaactcattcgcgccttagatttc 3’ | 反向 | pDd33 |
| 引物177 | 5’gtttagttgttccgatacttctccacattc 3’ | 正向 | pDd33 |
| 引物196 | 5’aagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtca 3’ | 正向 | pDd32，33 |
| 引物201 | 5’ttccccgaaaagtgccacctgacgtcgttggcgcgccaaggactagt 3’ | 正向 | pDd26，27，28 |
| 引物202 | 5’agacaagttctccaccacgtggagtcaaccagcccagtgggacgtc 3’ | 反向 | pDd26，27，28 |
表2制备启动子变体pDd2～20、pDd32和pDd33的引物组合
实施例1：DAS1启动子变体的构建和表达评价
巴斯德毕赤酵母DAS启动子的克隆如前所述(WO 2008/090211)。将由来自巴斯德毕赤酵母的野生型(wt)DAS启动子组成的、调控肌醇六磷酸酶基因表达并经优化供在毕赤酵母属中表达的表达盒用于构建启动子变体(缺失变体)。启动子片段的完整序列示于SEQ ID NO：1，报道子基因示于SEQ IDNO：4而融合构建体(表达盒)示于SEQ ID NO：5(DAS野生型启动子和包含经密码子优化的α因子信号肽编码序列的肌醇六磷酸酶编码序列5’端)。不同长度的启动子变体(如图1所示，其中-1位对应SEQ ID NO：1中的1055位，而-1055位对应SEQ ID NO：中的1位)使用表1所示的引物和表2所示的引物组合组(combination set)通过PCR制备。模板DNA为野生型DAS启动子。所述表达盒可插入具有合适选择标志物的任何合适的毕赤酵母属表达质粒。优选选择标志物为HIS4。一种这样的构建体是pDAS1wt。
PCR使用包含2mM dNTP，每种引物10μM，2.8单位的Expand HighFidelity Plus(Roche)，1X Expand High Fidelity Plus缓冲液(Roche)，和2ng模板质粒DNA的50μL反应物进行。PCR程序如下所示。
经扩增的DNA片段通过凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)(Qiagen)来纯化，并用于构建肌醇六磷酸酶表达质粒。
为了制备表达质粒，将经扩增的片段通过In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)亚克隆至经AatII限制酶消化的模板肌醇六磷酸酶表达载体(pDAS1wt)中。
将所得的表达质粒(pDd-2至pDd-10)通过用SalI消化而线性化，并转化入巴斯德毕赤酵母his4菌株。表达盒整合在HIS4位点的菌株通过菌落PCR来筛选。将所选的菌株在液体培养基中培养，用甲醇诱导，并测定在培养液中的肌醇六磷酸酶活性。结果示于表3。
表3
| 菌株(系列) | 质粒 | 启动子长度(bp) | 相对活性(％) |
| DASwt | pDAS1wt | 1050 | 100 |
| 2 | pDd-2 | 854 | 155 |
| 3 | pDd-3 | 754 | 102 |
| 4 | pDd-4 | 654 | 128 |
| 5 | pDd-5 | 554 | 102 |
| 6 | pDd-6 | 454 | 78 |
| 8 | pDd-8 | 254 | 24 |
| 9 | pDd-9 | 154 | 13 |
| 10 | pDd-10 | 54 | 14 |
实施例2：DAS1启动子变体的构建和表达评估(2)
具有如图2所示内部缺失的DAS启动子变体通过SOE PCR来构建。第一PCR使用包含20mM dNTP，每种示于表2的引物10μM，2.8单位Expand High Fidelity Plus(Roche)，1X Expand High Fidelity Plus缓冲液(Roche)和2ngpDAS1wt质粒DNA的50μL的反应物进行。PCR程序如下所示。
对来自第一PCR的纯化片段使用包含2mM dNTP，10μM引物144和引物135，2.8单位Expand High Fidelity Plus(Roche)，1X Expand High FidelityPlus缓冲液(Roche)，和经纯化的第一次运行的PCR产物的50μL的反应物进行第二PCR。PCR程序如下所示。
每个启动子变体和使用的引物的结构示于图2。对应于图1所示的pDAS1wt片段的序列示于SEQ ID NO：1(启动子)和SEQ ID NO：5(启动子+α前导序列+N-端肌醇六磷酸酶)。生成了携带DAS1启动子变体(pDd-14至pDd20)肌醇六磷酸酶表达质粒，并如前所示分离巴斯德毕赤酵母的转化体。所选的菌株在YPD培养基中培养，用甲醇诱导。测定培养液中的肌醇六磷酸酶活性，结果示于表4。
表4
发现-355至-255之间的缺失(包含于pDd-14、16、20)极大地减少表达水平。因此，认为该区域是DAS wt启动子的上游激活区(UAS)。
实施例3：扩增DAS启动子中的UAS
构建了UAS数目扩增的DAS启动子变体。所得的构建体在图3中阐明。UAS通过PCR扩增，且构建体是基于在图中示为pDAS wt2的野生型DAS启动子，且自NsiI位点并包含编码N端的肌醇六磷酸酶基因的完整序列示于SEQ ID NO：6。扩增得到如示于图3的具有UAS多重拷贝的构建体，且通过使用引物201和202，将这些构建体亚克隆入pDAS1wt。
启动子区和肌醇六磷酸酶基因的部分使用引物201和引物202用包含2mM dNTP，每种引物10μM，2.8单位Expand High Fidelity Plus(Rosche)，1X Expand High Fidelity Plus缓冲液(Rosche)和2ng模板DNA的质粒的50μL反应混合物通过PCR扩增。PCR程序如下所示。
将经扩增的DNA片段纯化并使用In-fusion克隆试剂盒亚克隆入经PmlI和AatII消化的pDAS1wt。扩增得到pDd-26、pDd-27和pDd-28，对应于由引物201和202标志的区域的完整序列分别示于SEQ ID NO：7、8和9。然后可将这些启动子盒用于所选的合适表达质粒。
将每个表达质粒整合在巴斯德毕赤酵母的HIS4位点，并在YPD培养基中评价甲醇诱导的表达水平。结果示于表5。
表5
| 菌株(系列) | 质粒 | 其他UAS的数目 | 相对活性(％) |
| 2 | pDd-2 | 0 | 100 |
| 26 | pDd-26 | 1 | 108 |
| 27 | pDd-27 | 2 | 139 |
| 28 | pDd-28 | 3 | 181 |
从结果可见增加UAS的数目会导致启动子活性的增加。
实施例4：DAS1启动子变体的构建和表达评价(3)
为了缩小UAS中必需区域的范围，构建了进一步的缺失变体(图4)。预计两个区域-306至-324(PBS1)和-289至-268(PBS2)，分别对应SEQ ID NO：1中的732-750位和767-788位，为潜在的转录因子结合位点，且缺失这些区域的变体如实施例2所述通过SOE-PCR构建。将经扩增的DNA片段通过凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，并用于构建肌醇六磷酸酶表达质粒。
为了制备表达质粒，将经扩增的片段通过In-Fusion PCR克隆试剂盒(Clontech)亚克隆入经SacI和SnaBI限制位点消化的模板肌醇六磷酸酶表达载体pDAS1wt。引物示于表1和2。
将每个表达质粒整合入巴斯德毕赤酵母的HIS4位点，并在YPD培养基中评价用甲醇诱导的表达水平。结果示于表6。
表6SF评价的结果(pDd-32和pDd-33)
| 菌株(系列) | 质粒 | 缺失 | 相对活性(％) |
| DP3 | pNo-DP3 | 无 | 100 |
| 32 | pDd-32 | PBS1 | 75 |
| 33 | pDd-33 | PBS2 | 24 |
实施例5：从具有Prm1和/或Mxr1过表达的经修饰的DAS启动子表达特异腐质霉(Humicula insolens)角质酶(cutinase)
该实验的目的是为了检查可否通过转录因子(如巴斯德毕赤酵母中的Prm1和/或Mxr1)的共表达来改进目标蛋白质的表达，所述目标蛋白质可通过特异腐质霉角质酶基因例示，其受根据本发明改进的DAS启动子调控，并具有4个UAS的重复。所用的宿主菌株为Cols702(MutS)。
COLs702由巴斯德毕赤酵母NRRL Y-15851构建，其在his4基因中具有突变使得所述基因失活。以标准方式用pCOls693(SEQ ID NO：41)转化NRRLY-15851。aox1缺失的菌株COLs702使用常规方法通过用标志基因SUC2转化获得，所述SUC2侧翼为位点特异性缺失片段。质粒pCOls693具有来自酿酒酵母的SUC2基因作为标志基因，且侧翼序列来自aox1基因。使用蔗糖作为唯一碳源分离转化体。由于亲本株的his4阴性基因型，将组氨酸补充至选择琼脂糖培养基。分离选择平板上的快速生长转化体。
通过PCR研究分离的转化体以确证目标的SUC2基因插入AOX1位点。所得的菌株具有由该事件破坏的AOX1基因。所述菌株之一命名为巴斯德毕赤酵母COLs702以供进一步使用。
对包含pNori58-HIC(由改进的DAS启动子调控的野生型特异腐质霉角质酶)、pNori58-RSII0014(由改进的DAS启动子调控的特异腐质霉角质酶变体)或pNori58-RSII0007(由改进的DAS启动子调控的特异腐质霉角质酶变体)的低表达的特异腐质霉角质酶转化体的重新转化用携带Prm1(pGPrm，SEQ ID NO：42)或Mxr1(pGMxr，SEQ ID NO：43)或两者的质粒进行，并分析它们的表达。两个质粒均具有博莱霉素(zeocin)抗性基因作为选择标志基因，且调节子基因由GAP启动子调控。预期在pNori58和pGPrm/pGMxr各载体的GAP启动子区发生同源重组事件。pGPrm包含在1-483位具有GAP启动子，在490-3549位具有Prm1CDS，在3487-3827位具有终止子的表达盒(SEQID NO：44)。pGMxr包含在1-483位具有GAP启动子，在493-3957具有Mxr1CDS，在4028-4368位具有终止子的表达盒(SEQ ID NO：45)。
为了进行转化，用AvrII对质粒DNA(pGMxr和pGPrm)进行线性化，并用Biorad Clean-up试剂盒进行清理(clean up)。
在42℃热休克之后，收获细胞并将其重悬于不含博莱霉素的1ml YPDS中，并在30℃以200rpm振荡温育3小时。然后收获细胞，将其重悬于100μl上清中，并铺于含100μg/ml博莱霉素的YPDS平板上。
从在小规模显示表达的上述转化中的每一个选择一个转化体供大规模表达：用在500ml带挡板烧瓶中的150ml Buffered Sorbitol Complex培养基(BSCM)进行摇瓶接种。在～24h生长后，以终浓度1％用100％甲醇诱导培养物。一旦诱导起始，用四层纱布+1层Cheese布取代棉塞(cotton plug)。诱导在22℃，150rpm每24小时进行，诱导3日，不诱导2.5日(跨越周末进行)。对培养物的等分试样(500μl)通过在13000rpm离心5分钟来沉淀，并在12％SDS-PAGE上以考马斯染色分析上清(12μl)的蛋白质表达。
根据凝胶数据，可见下述表达水平：
| 酶表达质粒 | Prm1/Mxr1质粒 | 表达水平 |
| pNori 58-HIC | 无 | +++ |
| pGPrm | +++ | |
| pGMxr/pGPrm | +++ | |
| pNori58-RSII0007 | 无 | - |
| pGMxr | + | |
| pGMxr/pGPrm | - | |
| pNori58-RSII0014 | 无 | ++ |
| pGMxr | +++ | |
| pGPrm | ++ | |
| pGMxr/pGPrm | +++ |
所得的数据指示当Mxr蛋白质过表达时测试蛋白质的表达得到改进。
Claims (19)
1.一种分离的多核苷酸，其包含：
i)由来自毕赤酵母属(Pichia)的DAS启动子序列或其功能性部分组成的核苷酸序列，其中所述DAS启动子包含于SEQ ID NO：1；和
ii)至少一个其他的UAS，其中所述UAS包含于SEQ ID NO：2。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述UAS至少包含示于SEQ IDNO：3的序列。
3.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述DAS启动子包含于SEQID NO：1中的501-1055位。
4.前述权利要求中任一项的分离的多核苷酸，其中所述DAS启动子包含于SEQ ID NO：1中的601-1055位。
5.前述权利要求中任一项的分离的多核苷酸，包含至少两个其他UAS。
6.前述权利要求中任一项的分离的多核苷酸，包含至少三个其他UAS。
7.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：7的77-828位，特别是77-901位，更特别是77-948位或其全长互补链杂交。
8.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：8的60-920位，特别是60-993位，更特别是60-1040位或其全长互补链杂交。
9.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自下组：
a)包含SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位的多核苷酸，或由SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位组成的多核苷酸；
b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；
c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：9的48-1015位，特别是48-1088位，更特别是48-1135位或其全长互补链杂交。
10.一种DNA构建体，其包含权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接于编码目标多肽的结构基因和终止子。
11.一种表达载体，其包含权利要求10的DNA构建体，进一步包含信号肽编码区。
12.毕赤酵母属宿主细胞，其包含权利要求10的表达载体。
13.一种产生目标多肽的方法，包括：
(a)在有益于产生目标多肽的条件下培养权利要求12的宿主细胞；和
(b)回收所述多肽。
14.权利要求13的方法，其中通过调控Prm1的表达或通过增加编码Prm1的基因的拷贝数而增加正调节子Prm1的表达。
15.权利要求13的方法，其中通过调控Mxr1的表达或通过增加编码Mxr1的基因的拷贝数而增加正调节子Mxr1的表达。
16.权利要求13的方法，其中通过调控Prm1和Mxr1的表达或通过增加各自基因的拷贝数而同时增加正调节子Prm1和Mxr1的表达。
17.一种启动子，其包含选自下组的UAS：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
18.UAS在增加由启动子的转录中的用途，其中所述UAS选自下组：
i)(a)包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：2或其全长互补链杂交；或
ii)(a)包含SEQ ID NO：3，或由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸；或
(b)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性，优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％同一性；或
(c)包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与SEQ ID NO：3或其全长互补链杂交；和
其中根据(i)或(ii)的UAS对所述启动子是外源的，或以多于一个拷贝存在。
19.权利要求18的用途，其中所述启动子由甲醇诱导。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08160226 | 2008-07-11 | ||
| EP08160226.0 | 2008-07-11 | ||
| PCT/EP2009/058859 WO2010004042A2 (en) | 2008-07-11 | 2009-07-10 | Pichia pastoris das promoter variants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102105589A true CN102105589A (zh) | 2011-06-22 |
Family
ID=39737635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009801269578A Pending CN102105589A (zh) | 2008-07-11 | 2009-07-10 | 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) DAS启动子变体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110129874A1 (zh) |
| EP (1) | EP2300615A2 (zh) |
| CN (1) | CN102105589A (zh) |
| WO (1) | WO2010004042A2 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108603213A (zh) * | 2015-12-22 | 2018-09-28 | 合成生物制品公司 | 酵母细胞 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2669375B1 (en) * | 2011-01-27 | 2018-10-17 | Kaneka Corporation | Yeast of the genus pichia modified to express high levels of a mpp1 homolog and process for producing protein |
| DK3594351T3 (da) | 2013-03-08 | 2022-01-03 | Keck Graduate Inst Of Applied Life Sciences | Gærpromotorer fra pichia pastoris |
| EP3839055B1 (en) * | 2013-03-08 | 2023-08-23 | Biogrammatics, Inc. | Yeast promoters for protein expression |
| WO2020068018A1 (en) | 2018-09-24 | 2020-04-02 | Orta Dogu Teknik Universitesi | Modified aox1 promoter variants |
| JP2022531140A (ja) | 2019-04-25 | 2022-07-06 | インポッシブル フーズ インコーポレイテッド | ヘム含有タンパク質の作製のための株および方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8314961D0 (en) * | 1983-05-31 | 1983-07-06 | Kingsman A J | Dna sequence |
| CA1324969C (en) * | 1988-05-06 | 1993-12-07 | Jeffrey R. Shuster | High level expression of proteins in yeast |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| AT501955B1 (de) * | 2005-02-23 | 2007-08-15 | Univ Graz Tech | Mutierte aox1-promotoren |
-
2009
- 2009-07-10 EP EP09780460A patent/EP2300615A2/en not_active Withdrawn
- 2009-07-10 US US13/002,631 patent/US20110129874A1/en not_active Abandoned
- 2009-07-10 CN CN2009801269578A patent/CN102105589A/zh active Pending
- 2009-07-10 WO PCT/EP2009/058859 patent/WO2010004042A2/en active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108603213A (zh) * | 2015-12-22 | 2018-09-28 | 合成生物制品公司 | 酵母细胞 |
| CN108603213B (zh) * | 2015-12-22 | 2022-05-03 | 合成生物制品有限责任公司 | 酵母细胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010004042A3 (en) | 2010-04-01 |
| WO2010004042A2 (en) | 2010-01-14 |
| US20110129874A1 (en) | 2011-06-02 |
| EP2300615A2 (en) | 2011-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101589146A (zh) | 在毕赤酵母属中由甲醇诱导型启动子进行不依赖甲醇的诱导的方法 | |
| CN109477115B (zh) | 用于真核生物的表达系统 | |
| Mackenzie et al. | Isolation and use of a homologous histone H4 promoter and a ribosomal DNA region in a transformation vector for the oil-producing fungus Mortierella alpina | |
| CN105543270A (zh) | 双抗性CRISPR/Cas9载体及应用 | |
| CN102105589A (zh) | 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) DAS启动子变体 | |
| CN103517916B (zh) | 具有粘度改变表型的丝状真菌 | |
| CN101914147B (zh) | 植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN101463354A (zh) | 水稻抗褐飞虱基因及其应用 | |
| CN106318947A (zh) | 基因组编辑系统及其用途 | |
| Karim et al. | Heterologous, expression, and characterization of thermostable glucoamylase derived from Aspergillus flavus NSH9 in Pichia pastoris | |
| CN102712929B (zh) | 植物根特异表达启动子的鉴定和应用 | |
| DK2576792T3 (en) | PROCEDURE FOR PROTEIN PRODUCTION IN FILAMENTOUS FUNGI | |
| CN102459609B (zh) | 包含表达增强子的真核宿主细胞 | |
| CN101585870B (zh) | 与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN103288943B (zh) | bHLH13蛋白及其编码基因和其应用 | |
| CN103725677B (zh) | 组织特异性启动子及其用途 | |
| CN113481316A (zh) | 玉米抗旱标记dresh8及其应用 | |
| CN103290014B (zh) | 一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用 | |
| CN101415824A (zh) | 获自毕赤酵母的自动诱导型磷酸钠协同转运体启动子和利用该启动子制造重组蛋白的方法 | |
| CN109082434A (zh) | 一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株 | |
| CN103172717B (zh) | 植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用 | |
| CN105274135A (zh) | 一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体及其应用 | |
| CN103146716A (zh) | 源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11及用途 | |
| Lightfoot et al. | Identification and characterisation of cotton boll wall-specific gene promoters for future transgenic cotton varieties | |
| CN102533780A (zh) | 棉花的一种bHLH转录因子及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110622 |