AT501955B1 - Mutierte aox1-promotoren - Google Patents

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AT501955B1 AT0030405A AT3042005A AT501955B1 AT 501955 B1 AT501955 B1 AT 501955B1 AT 0030405 A AT0030405 A AT 0030405A AT 3042005 A AT3042005 A AT 3042005A AT 501955 B1 AT501955 B1 AT 501955B1
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Description

2 AT 501 955 B1
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Pichia pastoris AOX1-Promotor Mutanten. S. cerevisiae dominierte (und beherrscht bis heute) die wissenschaftliche und biotechnologische Nutzung als eukaryontischer Modellorganismus und als Produktionssystem. Im letzten 5 Jahrhundert erreichte eine andere Hefe ebenfalls sehr grosse Bedeutung: die Spalthefe Schi-zosaccharomyces pombe. Durch ihre Eigenschaft der Vermehrung mittels Spaltung fand S. pombe besondere Beachtung als Modellorganismus und sie ist bis heute, neben S. cerevisiae, die am intensivsten studierte Hefespezies in den Bereichen molekulare Genetik und Zellbiologie. Unter den über 700 verschiedenen bis heute bekannten Hefespezien können die beiden io oben erwähnten Hefen nur eine begrenzte Anzahl an interessanten Eigenschaften für technologische und wissenschaftliche Anwendungen bieten. Seit den 1970er bzw. 80er Jahren wurden mehr und mehr Hefe-Spezies für die Biotechnologie und die Forschung erforscht, mit herausragenden Eigenschaften. Diese sogenannten nicht-konventionellen (non-conventional yeasts, NCY) Hefen oder non-Saccharomyces Hefen (in diesem Fall beinhaltet der Terminus Saccha-15 romyces die Hefe Schizosaccharomyces pombe) wurden aus verschiedenen Gründen entwickelt: sie verfügen entweder über medizinische Bedeutung wie Candida albicans oder über technologische Relevanz wie Yarrowia lipolytica und Kluyveromyces lactis die die Fähigkeit besitzen, auf speziellen Substraten zu wachsen (z.B. N-Alkane, Laktose). Z.B. der am weitesten verbreitete humanpathogene Pilz C. albicans wurde genauestens studiert, um die Natur der für 20 die Pathogenität verantwortlichen Virulenzfaktoren aufzuzeigen, weshalb er zum Modellorganismus für pathogene Hefen wurde. Eine andere etablierte Gruppe von NCY sind die methy-lotrophen Hefen Pichia pastoris und Hansenula polymorpha (Pichia angusta) welche S. cerevisiae bei der Produktion von rekombinanten Proteinen und bei Studien zur peroxisomalen Biogenese überlegen sind. Dies sind nur die bekanntesten Mitglieder der nicht-konventionellen 25 Hefen, die entweder technologische oder wissenschaftliche Bedeutung erreicht haben. Bis dato sind noch mehrere andere Hefen von besonderem Interesse, wobei diese Gruppe in den nächsten Jahren weiter rapide wachsen wird.
Zucker sind die in der Natur am häufigsten vorkommende Molekülklasse und werden von allen 30 bekannten Hefen verwertet. Obwohl es große Unterschiede in der Substratakzeptanz von Spezies zu Spezies gibt (siehe Tabelle 1), ist die Umwandlung von Glukose-6-phosphat oder Fruk-tose-6-phosphat in Pyruvat ein gemeinsames Thema in ihrem Metabolismus. Nichtsdestoweniger variiert die enzymatische Ausstattung dieses glykolytischen Weges bei unterschiedlichen Hefen deutlich. Während in S. cerevisiae die meisten dieser Enzyme bekannt und zumindest 35 teilweise charakterisiert sind, sind nur sehr wenige Enzyme in NCY beschrieben. Manche der für die Glykolyse benötigten Funktionen werden in einigen Hefen von mehreren Genen bzw. Enzymen vermittelt, vor allem solche, die eine zusätzliche Rolle in der Kontrolle bzw. Regulation des Metabolismus spielen und/oder sich an einem Verzweigungspunkt befinden, wie z.B. Glu-kokinase/Hexokinase, Phosphofruktokinase und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. 40 Üblicherweise werden die Isoenzyme verschieden reguliert, was auf unterschiedliche Funktionen bei sich ändernden Milieubedingungen hinweist. Einige der Gene, die für glykolytische Enzyme codieren, sind konstitutiv und hoch exprimiert, z.B. das S. cerevisiae PGK1-(Phosphoglycerat-Kinase) oder das P. pastoris GAP-Gen (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydro-genase), während andere Enzyme streng reguliert sind, wie das EN01-Gen (Enolase) von S. 45 cerevisiae.
Tabelle 1: Ausgewählte Hefen von biotechnologischem Interesse mit relevanten kommerziellen
Substraten (außer Glukose unc Fruktose) Hefe Energiemetabolismus Ausgewählte Substrate S. cerevisiae Crabtree positiv Saccharose, Maltose, Raffinose, Ethanol S. pombe Crabtree positiv Saccharose, Maltose, Raffinose 55 3 AT 501 955 B1
Hefe Energiemetabolismus Ausgewählte Substrate Zygosaccharomyces bailii Crabtree positiv Essigsäure, Ethanol, Glycerin Yarrowia lipolytica Crabtree negativ N-Alkane, Fettsäuren, Ethanol Pichia stipitis Crabtree negativ Xylose Pichia pastoris Crabtree negativ Methanol, Glycerin Hansertula polymorpha Crabtree negativ Methanol, Glycerin Schwanninomyces occiden-talis Crabtree negativ Stärke, N-Alkane, Xylose, Saccharose, Raffinose, Trehalose, Laktose, Ethanol Kluyveromyces lactis Crabtree negativ Laktose, Saccharose, Maltose, Raffinose, Ethanol, Glycerin, Xylit, Laktat
Das metabolische Schicksal von Pyruvat variiert signifikant zwischen den einzelnen Hefespe-20 zies und den Kulturbedingungen. In S. cerevisiae und anderen sogenannten Crabtree positiven Hefen wird die Atmung durch Glukose und ähnlichen Zuckern inhibiert. Dies führt sogar unter Anwesenheit hoher Mengen Sauerstoff zu einer Umwandlung von Pyruvat durch die Pyruvat-Decarboxylase zu Ethanol und C02 und ist auch bekannt als Fermentation. In Crabtree negativen Hefen, wozu der Großteil der NCY gehört, vollzieht sich die Umwandlung von Pyruvat zu 25 Ethanol nur unter anaeroben Bedingungen. Unter aeroben Bedingungen wird Pyruvat durch die Pyruvat-Dehydrogenase und den Tricarbonsäurezyklus (TCA) zu C02 oxidiert. Der TCA-Zyklus ist von außerordentlicher Bedeutung für den Zellmetabolismus, weil es der einzige Weg ist, um Zucker zu C02 zu oxidieren. Die Oxidation zu C02 führt zur Produktion von NADH, welches für die Energieproduktion verwendet wird. Überdies sind die TCA-Zyklus-Zwischenprodukte die 30 Hauptquelle von Metaboliten für biosynthetische Zwecke. Aufgrund der Abfuhr von Zwischenprodukten muss der TCA-Zyklus wieder "aufgefüllt" werden, um ihn am Laufen zu erhalten. Die wichtigsten anaplerotischen Reaktionen in Hefen sind die Pyruvat-Carboxylase und der Glyoxy-latzyklus. Erstere ist der Hauptweg bei Wachstum auf Ammonium als alleinige Stickstoffquelle, während letzterer bei Wachstum auf Kohlenstoffquellen mit weniger als 3 Kohlenstoffatomen 35 benötigt wird. Im Gegensatz zu diesem immensen Interesse ist fast nichts über die beteiligten Gene oder Enzyme des TCA Zykluses in NCY bekannt. Das entweder im Cytosol oder in den Mitochondrien katabolisch erzeugte NADH, muss zu NAD+ reoxidiert werden, um die Reaktionen am Laufen zu erhalten. In Crabtree negativen Hefen (z.B. Pichia pastoris) wird NADH unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Atmungskette reoxidiert. In Crabtree positiven 40 Hefen wie S. cerevisiae, in denen Atmung und Fermentation nebeneinander existieren, stellt sich die Situation jedoch signifikant anders dar. Wachsen sie unter aeroben Bedingungen auf Glukose, ist die Atmung durch die Glukose unterdrückt und es findet Fermentation statt. Unter diesen Bedingungen wird NAD+ bei der Bildung von Ethanol (durch Glykolyse erzeugtes NADH) oder Glycerin regeneriert. Die Atmung in Hefen unterscheidet sich von dem in jedem Bioche-45 mielehrbuch beschriebenen Paradigma dieses Weges bei Tieren. Erstens fehlt einigen Hefen wie S. cerevisiae und Kluyveromyces lactis Komplex I der Atmungskette. In diesen Hefen wird NAD+ von externen und internen NADH-Dehydrogenasen regeneriert, ohne Protonen durch die innere Mitochondrienmembran zu pumpen. Der zweite große Unterschied, den man in Crabtree negativen Hefen, Pilzen und Pflanzen findet, ist ein alternativer Atmungsweg, der parallel zu so den Komplexen III und IV der Cytochrom-Kette verläuft. Diese alternative Atmung wird von einer sogenannten alternativen Oxidase vermittelt, welche Elektronen direkt vom Ubichinonpool auf Sauerstoffmoleküle überträgt, ohne Protonen durch die innere mitochondriale Membran zu pumpen. 55 NADPH für biosynthetische Zwecke wird im oxidativen Teil des Pentosephosphatweges (PPP) 4 AT 501 955 B1 produziert. Andere sehr wichtige Metaboliten, die durch diesen Weg bereitgestellt werden, sind Ribose-5-phosphat und Erythrose-4-phosphat, welche für die Synthese von Nukleinsäuren und Nukleotid-Cofaktoren bzw. für die Synthese von aromatischen Aminosäuren benötigt werden. Das Wissen über die Gene bzw. die korrespondierenden Enzyme des Pentosephosphatweges 5 in NCY ist nach wie vor sehr lückenhaft. Aus Candida utilis, S. pombe und K. lactis wurden einige Enzyme isoliert. Die Charakterisierung der Zusammensetzung und der Kinetik ergab mehrere Unterschiede bei diesen Enzymen. Aufgrund fehlender Informationen kann deren Einfluss auf den Pentosephosphatweg in diesen Hefen nicht abgeschätzt werden, aber es hat sich gezeigt, dass z. B. K. lactis Glukosephosphat-Isomerase-Mutanten, welche defizient in der io Glycolyse sind, im Unterschied zu S. cerevisiae auf Glukosemedien wachsen können. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Funktion des Pentosephosphatweges in K. lactis ausreicht, um auf Glukose als Kohlenstoffquelle zu wachsen. In methylotrophen Hefen konnte eine zusätzliche Transketolase (Dihydroxyacetonsynthase) gefunden werden. Dieses Enzym ist in den Peroxisomen lokalisiert und überträgt die Assimilation von Formaldehyd in den Zellmeta-15 bolismus durch Kondensation mit Xylulose-5-phosphat, wobei Dihydroxyaceton und Glyceral-dehyd-3-phosphat gebildet werden.
Hefen bieten als einzellige eukaryontische Organismen attraktive Expressionssysteme für die Produktion rekombinanter Proteine. Sie kombinieren die Vorteile von Bakterien, wie ausgereifte 20 genetische Manipulationstechniken, einfache, ungefährliche und billige (großtechnische) Kultivierungstechniken mit dem Hauptvorteil von eukaryontischen Exressionssystemen, nämlich der eukaryontischen Proteinprozessierung. Aufgrund der oben angeführten Gründe dominierte S. cerevisiae viele Jahre lang dieses Feld, was zu einer großen Anzahl an Proteinen (z.B. Insulin, HBsAg, HSA) führte, die in diesem Oranismus hergestellt wurden. S. cerevisiae besitzt jedoch 25 aufgrund der Hyperglykosylierung, des Steckenbleibens von sekretierten Proteinen im periplasmatischen Raum, der Plasmidinstabilität und der geringen Produktausbeute einige Limitationen. Um die Limitierungen dieses einzelnen Organismus zu überwinden, wurde eine kleine Gruppe von nicht-konventionellen Hefen als Wirt für die heterologe Proteinexpression entwickelt. Unter anderen wurden K. lactis, Y. lipolytica und die methylotrophen Hefen Candida boi-30 dinii, H. polymorphe und P. pastoris genutzt, aber vor allem die letzten beiden Arten erreichten große wirtschaftliche Bedeutung. Schizosaccharomyces pombe hat in einigen Charakteristika eine sehr große Ähnlichkeit zu höheren Eukaryonten vorzuweisen, welche diese Hefe zu einem sehr attraktiven Wirt für die heterologe Proteinproduktion macht: (1) der Mechanismus der Transkriptions-Initiation ist dem höherer Eukaryonten ähnlicher, (2) einige Säugetierpromotoren 35 funktionieren in S. pombe, (3) die Befähigung zum RNA-Spleißen, hervorgehoben durch die Tatsache, dass Komponenten des Splicosoms jenen der Säugetiere ähneln, (4) das Retentionssignal (KDEL) des endoplasmatischen Säuger-Retikulums kann erkannt werden, (5) die Existenz von Galaktoseresten in Glycoproteinen und (6) es werden einige andere posttranslati-onale Modifikationen, wie Acetylierung und Isoprenylierung von Proteinen, auf einem Weg 40 durchgeführt, der jenem von Säugerzellen ähnlicher ist als dem von Hefenzellen. Einige der oben angeführten Merkmale dürften in naher Zukunft die Bedeutung von S. pombe in der re-kombinanten Proteinproduktion hinsichtlich der Produktion authentischer heterologer Proteine und high-throughput-Anwendungen derselben, wie strukturelle und funktionelle Genomik, erhöhen. 45
Alle Mikroorganismen verfügen über Mechanismen zur Adaptierung ihres Metabolismus für die optimale Nutzung von in der Umgebung verfügbaren Nährstoffen. Eine schnelle und präzise Anpassung an diese Milieubeschränkungen ist der wichtigste Faktor, der für das Wachstum und andere physiologische Parameter aller Organismen maßgeblich ist. Wie für die meisten ande-50 ren Mikroorganismen ist Glucose die bevorzugte Kohlenstoff- und Energiequelle der Hefe. Daher ist es auch nicht überraschend, dass Glucose, das in der Natur am häufigsten vorkommende Monosaccharid, ein Hauptbotenstoff für die Zellen ist, der das Wachstum und die Entwicklung dieser Organismen durch Regulation der Genexpression beeinflusst, und zwar hauptsächlich, aber nicht nur, auf dem Level der Transkriptionskontrolle. Transkriptionsanalysen auf 55 Genomebene zeigten, dass eine beträchtliche Menge an Genen durch die umgebungsbedingte 5 AT 501 955 B1
Glukosekonzentration reguliert werden. Gene mit bekannten metabolischen Funktionen in der Glukoseverwertung, wie niedrig-affine Glukosetransporter und glykolytische Enzyme, als auch Gene, die für ribosomale Proteine codieren, werden durch Glukose induziert. Andererseits reprimiert Glukose eine große Gruppe von Genen, z. B. Gene, die bei der Verwertung alternati-5 ver Kohlenstoffquellen, der Glukoneogenese, dem Glyoxylatzyklus, den peroxisomalen Funktionen und der Atmung beteiligt sind. Die Reprimierung der Atmung (Crabtree Effekt) findet nur in wenigen Hefespezies (fermentative Hefen, Crabtree positive Hefen) wie Saccharomyces cere-visiae statt, während die Atmung bei den meisten anderen Hefearten durch Glukose nicht reprimiert wird (Crabtree negativ). Obwohl sich in den letzten 20 Jahren ein umfangreiches Wis-io sen über die Glukoserepressionsmaschinerie angesammelt hat, hauptsächlich basierend auf der Hefe Saccharomyces cerevisiae, ist der eigentliche Mechanismus, vor allem der flussaufwärts gelegene Teil der Glukose-Erkennung und der Signaltransduktion, nicht gänzlich verstanden. Nichtsdestoweniger werden für ein besseres Verständnis der vorliegenden Arbeit im Folgenden einige Hauptakteure der Kohlenstoff-Katabolitrepression bei S. cerevisiae kurz be-15 schrieben.
Das SNF1-Gen codiert für eine Ser/Thr Proteinkinase, welche in Hefezellen in hochmolekularen Masse-Komplexen gefunden wird. Sie wird durch Konformationsänderungen innerhalb des Komplexes reguliert, welche durch eine Phosphorylierung der regulatorischen Untereinheit von 20 Snflp hervorgerufen wird. Bis heute wurden 3 upstream-Kinasen (Paklp, Elmlp und Tos3p) identifiziert, welche Snflp phosphorylieren und dadurch aktivieren. Seine Aktivität ist für die Derepression einer großen Anzahl von Genen, welche durch Glukose reprimiert werden, unbedingt erforderlich. Daher ist es nicht überraschend, dass Snflp oder Homologe in Eukaryonten stark konserviert sind. 25
Das Zinkfingerprotein Miglp hat die Fähigkeit, an Promotorregionen einer großen Vielfalt von Glukose-reprimierten Genen zu binden. Sehr wahrscheinlich geschieht dies durch die Rekrutierung des allgemeinen Repressorkomplexes Ssn6(cyc8)-Tup1p. Die Funktion von Miglp wird durch die Proteinkinase Snf1 kontrolliert, wobei es noch keinen eindeutigen Beweis für eine 30 direkte Phosphorylierung gibt. Miglp ist in seiner nicht-phosphorylierten Form im Nukleus lokalisiert. Die Abnahme des Glukosespiegels verursacht die Phosphorylierung von Miglp, gefolgt von der Translokation ins Cytoplasma. Wird den Zellen Glukose zugeführt, kehrt Miglp sofort wieder in den Nukleus zurück und reprimiert die Transkription. 35 Adrlp gehört ebenfalls zu der Familie der Zinkfingerproteine und erwies sich als ein positiver Effektor peroxisomaler Proteine und des ADH2-Gens, das die durch Glukose reprimierte Alkoholdehydrogenase II kodiert. Die ADRf-Expression wird durch Glukose bei hohem cAMP-Spiegel über die cyclische AMP(cAMP)-abhängige Proteinkinase nach unten reguliert. Der wichtigste regulatorische Eingriff findet auf dem Level der mRNA-Translation statt, aber es 40 wurden auch, abhängig vom jeweils untersuchten S. cerevisiae-Stamm, regulatorische Einflüsse auf die Transkription und die mRNA-Stabilität beobachtet.
Bei einer großen Zahl von Genen, darunter auch viele Gene, die am Atmungsstoffwechsel beteiligt sind, wird die Transkription auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen durch den 45 Hap2/3/4/5-Komplex aktiviert. Für einige an der Atmung beteiligten Gene, wie CYC1 (codiert das lso-1-Cytochrom c) und COX6 (Cytochrom c-Oxidase-Untereinheit VI) wurde festgestellt, dass Snf1 für die Derepression nach dem Wachstum auf Glukose notwendig ist. Die Transkription von HAP4 ist bei Anwesenheit von Glukose reprimiert, trotzdem konnte keine direkte Beteiligung von Hap4p oder Snflp an der Derepression festgestellt werden. 50
Gcrlp ist ein bedeutendes Transkriptions-Aktivatorprotein glycolytischer Gene (z. B. Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase). Gemeinsam mit dem generellen Transkriptionsfaktor Raplp ist Gcrlp der wichtigste Faktor in der glycolytischen Genexpression hinsichtlich der Koordinierung der Transkription und ist für eine hohe Expression unbedingt erforderlich. 55 Das genomische Expressionsmuster eines S. cerevisiae Wildtyp-Stamms und einer 6 AT 501 955 B1 gcrf-Mutante bei Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen zeigte, dass 53 offene Leserahmen (ORFs), unter ihnen Gene der Glykolyse, Gcrlp abhängig sind.
Die Beschreibung einiger Transkriptionsfaktoren und des Snflp- und Miglp-Weges, sollte einen 5 kurzen Überblick über einige Akteure im Netzwerk der Glukoserepression liefern. Es sei aber anzumerken, dass es noch andere regulatorische Zyklen zur Glukoserepression als den Snflp-Weg gibt. Obwohl sich in den letzten 20 Jahren ein breites Wissen über das Glucose-Sensing und deren Signaltransduktion angesammelt hat, sind wichtige Fragen noch immer unbeantwortet: was ist das Wesen des Glukosesignals, und wie sind die bekannten Signalwege reguliert io und integriert.
Nur wenige Hefearten können auf Methanol als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Sie gehören zu einer der vier Genera Pichia, Hansenula, Candida und Torulopsis und besitzen einen allgemeinen Weg zur Methanolverwertung, welcher nach einer Derepression 15 oder einer Induktion durch Methanol exprimiert wird. Da die Ausgangsreaktionen dieses Pfades innerhalb der Peroxisomen kompartimentalisiert sind, werden diese Organellen ebenfalls induziert. Aufgrund der starken Induktion der Peroxisome wurden die Hefen Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris und Hansenula polymorpha häufig in der Zellbiologie zum Studium der peroxisomalen Biogenese und Funktion verwendet. 20
Wie bereits erwähnt, besitzen methylotrophe Hefen einen allgemeinen Methanolverwertungsweg. Der erste Schritt ist die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd und Wasserstoffperoxid, katalysiert von Alkoholoxidasen (AOX, EC 1.1.3.13). Das toxische Wasserstoffperoxid (H202) wird durch die Wirkung von Katalase in Sauerstoff und Wasser zerlegt. Beide Enzyme befinden 25 sich in den Peroxisomen. Das Formaldehyd wird entweder durch zwei aufeinander folgende Dehydrogenase Reaktionen oxidiert oder durch Kondensation mit Xylulose-5-Phosphat (Xu5P) im Zellmetabolismus assimiliert. Formaldehyd wird durch eine Glutathion (GSH)-abhängige Formaldehyd-Dehydrogenase und einer Formiat-Dehydrogenase, welche beide im Cytosol lokalisiert sind, zu Formiat und weiter zu Kohlenstoffdioxid oxidiert. Das in beiden Reaktionen 30 gebildete NADH wird verwendet, um Energie für das Wachstum auf Methanol zu produzieren. Die Kondensationsreaktion findet innerhalb der Peroxisomen statt und wird von der bereits oben erwähnten Transketolase Dihydroxyaceton-Synthase katalysiert. Die entstandenen C3-Verbindungen Dihydroxyaceton (DHA) und Glyeraldehyd-3-phosphat (GAP) werden anschließend im Cytosol weiter metabolisiert. Nach der Phosphorylierung von DHA entsteht durch eine 35 Aldolasereaktion aus Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und GAP Fruktose-1,6-biphosphat (FBP). FBP wird durch eine Phosphatase zu Fruktose-6-phosphat umgewandelt, und Xylulose-5-phosphat (Xu5P) wird im Pentosephosphatweg regeneriert. Ein Drittel des enstandenen GAP tritt in die Glukoneogenese zur Synthese von Zellbestandteilen ein. 40 Die Schlüsselenzyme des Methanolverwertungsweges, die Alkoholoxidase und die Formiatde-hydrogenase, werden nach der Induktion mit Methanol in sehr großen Mengen produziert. Die Alkoholoxidase kann mehr als 30% des gesamten löslichen Proteins ausmachen, die Dihydro-xyacetonsynthase und die Formiatdehydrogenase bis zu 20%. Die ebenfalls induzierten Peroxisomen können bis zu 80% des Zellvolumens ausmachen. Für die Produktion rekombinanter 45 Proteine wurden Promotorsequenzen von mehreren Genen aus der Methanolverwertung entwickelt. Unter anderem sind diese starken und induzierbaren Promotoren ein Hauptgrund für die breite Nutzung von Pichia pastoris und Hansenula polymorpha als Wirt für die Proteinproduktion. so In H. polymorpha und C. boidinii codiert ein Gen für eine Alkoholoxidase: MOX (Methanoloxidase, H. polymorpha) und AOD1 (Alkoholoxidase, C. boidinii). Jeweils 2 Gene wurden in den beiden Pichia-Men P. pastoris (AOX1 und AOX2) und P. methanolica (AUG1 und AUG2, alco-hol utilising gene, oder MODI und MOD2) gefunden, wobei Aoxlp bzw. Auglp die Haupt-Alkoholoxidasen sind. Vergleiche der codierenden Regionen zeigten unter den methylotrophen 55 Hefen eine Ähnlichkeit auf Aminosäureebene von 73-85% [1], Die Homologie zwischen den 7 AT 501 955 B1 P. pastoris AOX1 und AOX2 ORFs (openreading frames) beträgt auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzebene 92% bzw. 97% [2, 3]. Die Alkoholoxidase ist ein oktameres Flavoprotein, welches pro Untereinheit ein nicht-kovalent gebundenes FAD oder ein modifiziertes Analogon davon (mFAD) enthält. Die AOX-Translation vollzieht sich an freien Ribosomen mit anschlie-5 ßendem posttranslationalem Import in die Peroxisome. Das Targeting der Translokation in die Peroxisome erfolgt durch die PTS1-Sequenz (Typ 1 peroxisomales Targetingsignal) am äußersten C-Terminus. Erst nach dem Import in die peroxisomale Matrix formen sich Aox-Oligomere.
In C. boidinii und P. pastoris konnten keine Aox-Oligomere im Cytosol gefunden werden, wäh-io rend die Dihydroxyaceton-Synthase im Cytosol Dimere bildet, bevor sie in die peroxisomale Matrix transloziert wird. Nicht nur die Alkoholoxidase 1-Promotorsequenz von Pichia pastoris, sondern auch das Enzym selbst ist aufgrund des breiten Substratspektrums (ungesättigte und gesättigte primäre Alkohole mit kurzer bis mittlerer Kettenlänge) und einer hohen Stabilität unter verschiedenen Reaktionsbedingungen von biotechnologischem Interesse. Die Regulation aller 15 Alkoholoxidase-Gene findet auf der Transkriptionsebene statt, höchstwahrscheinlich noch während der Initiation der Transkription. Obwohl AOX1 und AOX2 ähnlich reguliert werden (die entsprechende mRNA ist, solange Glycerin oder Glukose vorhanden ist, nicht nachweisbar, aber während einer Kohlenstoffmangelphase detektierbar und in großen Mengen auf Methanol vorhanden), zeigen ihre 5'-flankierenden Regionen keine signifikanten Homologien [2,4]. 20
Jeder AOX-Locus weist eine mögliche RNA-Polymerase-Bindestelle (TATAAA; Goldberg-Hogness oder TATA-Box) an der Position -43 relativ zu der primären Initiationsstelle der Transkription auf. Beide P. pastoris AOX-mRNA-Leader-Sequenzen sind extrem reich an A-Resten und für Hefen ungewöhnlich lang (115 Nukleotide (nt) bei AOX1 und 160 nt bei AOX2). 25 Die Initiationsregionen der Translation um das ATG-Startcodon (Kozak Sequenz; AOX1: CGAT AACG ATG GCT, AOX2: GAGAAAA ATG GCC) sind konsistent mit früher beschriebenen Consensussequenzen von S. cerevisiae und höheren Eukaryonten. Die physiologische Rolle des zweiten Alkoholoxidase-Gens in P. pastoris und P. methanolica ist noch unklar. Eine Disruption von AOX1 oder AUG1 verursacht schwere Wachstumsdefekte in diesen Stämmen (sogenann-30 ter methanol utilisation slow (Muts) Phänotyp) während aox2- und aivgr2-Stämme mit dem Wildtyp-Stamm vergleichbare Wachstumsraten zeigen. In P. methanolica konnten 9 multiple Formen der Alkoholoxidase beobachtet werden, welche eine zufällige Oligomerisierung der beiden Genprodukte Auglp und Aug2p darstellen. AUG1 und AUG2 werden unterschiedlich reguliert: bei Kohlenstoffmangel und niedriger Methanolkonzentration konnte nur Auglp detektiert wer-35 den, während bei steigendem Methanolgehalt das Verhältnis von Aug2p zu Auglp ansteigt. Der Wechsel zu Octameren mit einem höheren Anteil von Aug2p ist abhängig von einer Erhöhung der AL/G2-Expression, welche auf der Transkriptionsebene reguliert wird. Die Km-Werte der beiden Homooctamere von Auglp und Aug2p für Methanol betragen ungefähr 0,56 bzw. 5,6 mM. Gemeinsam mit der Erkenntnis, dass eine Zerstörung von AUG1 einen Wachstumsde-40 fekt bei geringer Methanolkonzentration [5] verursacht, lassen diese Resultate vermuten, dass AUG2 für P. methanolica einen Vorteil bei einem Wachstum unter höheren Methanolkonzentrationen darstellt. In Pichia pastoris wurde weder die Rolle des AOX2-Gens genauer untersucht, noch wurden günstige Bedingungen für das Vorhandensein eines zweiten Alkoholoxidase-Gens gefunden. Da Laborbedingungen nur einen minimalen Ausschnitt an Bedingungen, denen 45 freilebende Mikroorganismen ausgesetzt sind, darstellen, sollte es in der Natur Situationen geben, in denen das AOX2-Gen von selektiver Bedeutung für P. pastoris ist.
Die Expression von C. boidinii AOD1 und H. polymorpha MOX ist während einem Wachstum auf Glukose oder Ethanol als alleinige Kohlenstoffquelle gänzlich reprimiert, auf Glycerin de-50 reprimiert und auf Methanol stark induziert. Die Expression dieser beiden Enzyme ist auch bei Glukose- und Methanolanwesenheit im Medium reprimiert. Ist Glycerin anwesend, kann Methanol die Genexpression induzieren. Die Transkription von AOD1 und MOX ist ebenso bei Kohlenstoffmangel dereprimiert und bei Ethanolanwesenheit reprimiert [6-9]. Für die Repression des Methanolmetabolismus durch Ethanol oder Glukose sind zwei unterschiedliche regulatori-55 sehe Mechanismen verantwortlich [10,11], In Pichia pastoris ist die Situation eine signifikant 8 AT 501 955 B1 andere: AOX1 wird bei Anwesenheit von Glukose, Ethanol oder Glycerin im Medium (in nicht-wachstumslimitierenden Konzentrationen) reprimiert. Die Derepression bei Kohlenstoffmangel und die Induktion durch Methanol ist ähnlich zu AOD1 und MOX. Kohlenstoffquellen, durch welche die AOXf-Expression dereprimiert wird, sind z.B. Sorbit, Mannit, Trehalose und Alanin 5 [12].
Nach einem Wechsel von Methanol zu einer reprimierenden Kohlenstoffquelle wie Glukose oder Ethanol werden die Peroxisomen während der Anpassung an die neue Kohlenstoffquelle innerhalb von Stunden abgebaut. Der proteolytische Abbau in den Hefevakuolen folgt bei der io Anpassung an Glukose oder Ethanol zwei verschiedenen, als Mikro- bzw. Makroautophagie bezeichneten, Mechanismen.
Wie oben erwähnt, werden die methylotrophen Hefen Pichia pastoris und Hansenula poly-morpha weitgehend für die rekombinante Proteinproduktion verwendet. Bis heute wurden mehr 15 als 500 Proteine in P. pastoris produziert. Ihre Entwicklung wurde von einigen Eigenschaften vorangetrieben, welche ihnen gegenüber anderen Wirtsorganismen einen Vorteil für die rekombinante Expression bringen: 1) sie teilen die allgemeinen Vorteile der Hefen bezüglich genetischer Manipulation und Kultivierungstechnologie (Labor- und Industriemaßstab): 2) die Möglichkeit des Wachstums auf extrem hohe Zelldichten; und 3) die enorme Produktivität von re-20 kombinanten Proteinen (sekretiert oder intrazellulär). Die starken, induzierbaren Promotoren von Genen, die für Reaktionen des Methanolverwertungsweges codieren, wurden für die Produktion rekombinanter Proteine entwickelt. Die am meisten verwendeten Promotorregionen sind die der Alkoholoxidase-Gene AOX1 und MOX von P. pastoris bzw. H. polymorpha. Aber auch andere Promotorregionen der Gene des Methanolverwertungsweges wurden für die Produktion 25 rekombinanter Proteine verwendet: FMD-(Formiat-Dehydrogenase)- und DAS1-(Dihydroxy-aceton-Synthase)-Promotoren von H. polymorpha und C. boidinii und FLD1 (Formaldehyd-Dehydrogenase) von P. pastoris. Letzterer kann auch mit Methylamin als alleinige Stickstoffquelle und mit Glukose als Kohlenstoffquelle induziert werden. Ebenfalls erhältlich sind Promotoren für die konstitutive Expression fremder Gene: das GAP-(Glyceraldehyd-3-phosphat-30 Dehydrogenase)-Promotorelement von P. pastoris und der P/WA ί-Promotor (codiert für die H+-ATPase der Plasmamembran) von H. polymorpha. Es wurden mehrere auxotrophe Wirts-stamm/Markergen-Kombinationen für P. pastoris (z. B. HIS4) und H. polymorpha (z.B. LEU2 und URA3) entwickelt. Auch dominante Selektionsmarker (z. B. Zeocin™-, G418-Resistenz) sind verfügbar. Die Genintegration in methylotrophen Hefen basiert hauptsächlich (wenn nicht 35 gänzlich) durch homologe Integration. Vektoren mit einer ARS-Region (autonome Replikationssequenz) sind auch erhältlich, diese sind aber gewöhnlich ziemlich instabil, sobald der Selektionsdruck wegfällt, wodurch sie nur limitierte technologische Anwendung haben. Das Fremdgen ist in P. pastoris ortsgerichtet integriert, entweder in den AOX1- oder den HIS4-Locus. Andere mögliche Integrationsorte sind z. B. der GAP-Locus (zur GAP Expression) oder Loci von alter-40 nativen Selektionsmarkern (z. B. ADE1, URA3, ARG4 und LEU2). Die Expressionkassetten sind willkürlich (in H. polymorpha) in einer Kopf-zu-Schwanz-Anordnung integriert, was zu mitotisch stabilen Integranten mit hoher Kopienzahl (bis zu 100 Kopien) führt. Andererseits führt eine hohe Kopienzahl oft nicht zu einem hohen Expressionslevei. Weitere Faktoren mit großem Einfluss sind: die Struktur der Integrationkassette, die Natur und die Struktur des zu exprimie-45 renden Proteins und der Integrationsort. Vor allem die Struktur der Integrationskassette ist von großer Bedeutung für den Gen-Dosis-Effekt. Eine weitere Diskussion zur Optimierung der Expressionskassette und der Gen-Dosis findet man in [13,14]. Methylotrophe Hefen gehören zur Gruppe der Crabtree negativen Hefen, folglich findet während dem Wachstum unter aeroben Bedingungen nur sehr wenig Ethanolproduktion statt. Aus diesem Grund können diese Hefen in so Fermentationskulturen zu sehr hohen Zelldichten gezüchtet werden, was wiederum zu einer hohen Produktausbeute führt. Die AOX1 gesteuerte Proteinproduktion kann noch um das 3-5-Fache gesteigert werden, wenn sich die Methanolkonzentration im Bioreaktor im wachstumslimitierenden Bereich befindet. Die Tatsache, dass P. pastoris unter Standardbedingungen nur geringe Mengen an endogenen Proteinen sekretiert, führt dazu, dass jedes sekretorisch 55 produzierte rekombinante Protein das häufigste Protein im Medium ist. Die Sekretion kann als g ΑΤ 501 955 B1 erster wesentlicher Schritt im anschließenden Reinigungsprozess dienen. Für die Proteinsekretion in P. pastoris und H. polymorpha werden häufig die Prepro-Signalsequenz des S. cerevisi-ae MFa1 (mating factor a) und Sequenzen, die von der sauren Phosphatase (PH01) abgeleitet wurden, verwendet. In einigen Fällen konnte aber auch eine ausreichende Sekretion mit Pflan-5 zen-, Pilz- und Säugetier-Proteinen erreicht werden, die ihre natürlichen Sekretionssignale trugen.
Wie oben erwähnt, können Hefen postranslationale Modifikationen durchführen, wie z.B. Disul-fidbrückenbildung, Prozessierung von Signalsequenzen (z.B. Prepro-Signalsequenz von MFa1), io Lipid-Addition und N- bzw. O-verbundene Glykosylierung. Während in Säugetierzellen hochkomplexe N- und O-verbundene Oligosaccharid-Strukturen, die aus verschiedenen Zuckern (z. B. N-Acetyl-glucosamin, Galaktose und Sialinsäure) bestehen, gebildet werden, produzieren die meisten Hefen „high mannose type“ Strukturen, denen einige Zuckerarten fehlen, wie z. B. Galaktose oder Sialinsäure. Diese nicht-Säugetier-Strukturen können bei therapeutischen Anis Wendungen große Probleme hervorrufen, hauptsächlich wegen ihrer potentiellen Immunogeni-tät. Im Unterschied zu S. cerevisiae ist in H. polymorpha und P. pastoris die Hypermannosylie-rung weniger stark ausgeprägt und es werden keine hyperimmunogenen terminalen a-1,3-gebundene Mannosen in N-verbundene Oligosaccharide eingebaut. Um die Probleme der Immunogenität (und einige andere, wie z.B. geringe Stabilität im Blutkreislauf) zu umgehen, 20 gehen die Bemühungen in Richtung Humanisierung der von Hefen stammenden Oligosaccharid-Strukturen, und, wie aktuelle Publikationen belegen, vor allem in P. pastoris. Bis heute beziehen sich die große Mehrheit der Forschungsergebnisse und großtechnische Verfahren auf die gut untersuchte Hefe S. cerevisiae. Aufgrund des immer größeren Wissens über nichtkonventionelle Hefen, gepaart mit den offensichtlichen Vorteilen in Bezug auf großtechnische 25 Fermentation und Glykosylierung, sind H. polymorpha und P. pastoris dabei, rasch die Hefen der Wahl zu werden. Dies wird durch die Tatsache betont, dass in der Industrie bereits verschiedene Produktionsprozesse implementiert wurden.
Die EP 967 275 offenbart einen aus einer methylotrophen Hefe isolierten Promotor, mit einer 30 starken Transkriptions-Aktivität, welcher sich besonders durch Expression von heterologen Genen in einem Wirt eignet.
In der US 5 610 036 und in der EP 506 040 werden mutierte AOX2-Promotoren, die sich vom natürlichen AOX2-Promotoren durch eine Deletion, Insertion oder Substitution unterschieden, 35 beschrieben.
Die US 5 643 792 betrifft einen mutierten Pichia Pastoris Stamm, der ein rekombinantes Protein unter der Kontrolle eines AOX-Promotors heterolog zu expremieren vermag. Die Expression erfolgt dabei in Anwesenheit von Glukose, welches bei natürlichen AOX-Promotoren zur Ex-40 pressionsinhibition führen würde.
Die EP 931 837 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Phytase in Hefe unter der Kontrolle eines Promotors, der mittels Methanol induziert werden kann. 45 In der WO 00/056903 wird ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder Polypeptiden mit Hilfe von Pichia Pastoris beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zunächst Zellen in einem Medium umfassend unter anderem Glukose gezüchtet. Anschließend wird unter Zugabe von Methanol bei etwaiger Zugabe von geringen Mengen an Glukose die Expression der Peptide bzw. Polypeptide induziert. 50
In der US 6 699 691 werden isolierte Polynukleotide beschrieben, die AOX1 regulatorische Promotor-Fragmente zur heterologen Genexpression in Hefen aufweisen.
In der EP 1 431 387 werden hitzestabile Desoxyribonuklease I Varianten geoffenbart, die mit 55 Hilfe von Produktionsstämmen unter der regulatorischen Kontrolle eines AOX1-Promoter 1 0 AT 501 955 B1 hergestellt werden können.
Die US 5 641 661 betrifft Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Stärke, bei dem Hefezellen eingesetzt werden, die unter der Kontrolle der Promotoren der Pichia Pastoris Alkoholoxidase 5 ZZA1 und ZZA2 Stärke-abbauende Enzyme exprimieren.
Die EP 0 510 693 betrifft die Herstellung von humanem Serumalbumin in Pichia Pastoris unter der Kontrolle eines AOX1-Promotors. io In der WO 02/081650 ist die Identifizierung von AOXf-Promotorregionen geoffenbart, die zur Konstruktion von mutanten AOX1-Promotoren verwendet werden können. Weil die deletierten Sequenzregionen des darin beschriebenen AOXf-Promotors sehr lang sind, konnte nur der Gesamteffekt und nicht die einzelnen Effekte der verschiedenen regulatorischen Sequenzen des Promotors beobachtet werden. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine Entwicklung von stark 15 verbesserten Promotoren. Vor allem bei der Konstruktion neuer Promotoren mit verbesserten Merkmalen durch Deletion oder Duplikation von Teilen des Originalpromotors, ist das Wissen um den exakten regulatorischen Sequenzbereich erforderlich.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten AOX1-Promotor mit verbesserten 20 Eigenschaften vorzusehen, um das Downstream-Processing bei der Protein-Produktion zu erleichtern, die Zeit-Raum-Ausbeuten zu erhöhen und mitzuhelfen, die Produkt-Qualität zu verbessern.
Ein weiteres Ziel ist es, einen starken AOX1-Promotor in einem Vektor odereinem Wirts-Stamm 25 vorzusehen, der die Glucose-Repression teilweise oder vollständig vorwegnimmt. Es ist von Vorteil, einen Promotor zu haben, welcher zu einer starken Expression in Gegenwart hoher Glucose-Konzentrationen führt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen AOXf-Promotor vorzusehen, welcher 30 die Produktion eines Proteins unter Verwendung einer reduzierten Menge an Methanol oder ohne Methanol ermöglicht. Solche Promotoren hätten eine signifikante Auswirkung auf industrielle Produktionsverfahren. Aufgrund von Sicherheitsfragen wird für Produktionsanlagen, die Methanol als Induktor verwenden, eine spezielle Ausrüstung benötigt. Dies widerspricht den Pichia pastoris-Anwendungen in vielen weniger spezialisierten Produktionsanlagen. Außerdem 35 kann die Protein-Stabilität in Anwesenheit von Methanol eine auf Methanol basierende Induktion der Protein-Expression behindern. Dies ist für die Produktion robuster Industrie-Proteine weniger kritisch, wird aber beispielsweise für sezernierte therapeutische Proteine zu einem wichtigen Thema. 40 Die Konstruktion solcher Promotoren erfordert die Kenntnis spezifischer Teile (z.B. regulatorische Elemente, Transkriptions-Faktor-Bindungsstellen) des Wildtyp-P/c/i/a pastoris AOX1-Promotors, welche - wenn in irgendeiner Weise mutiert - eine Auswirkung auf das Expressionsverhalten zeigen. Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diese Teile zu identifizieren und daher die Mittel zur Schaffung von ΑΟΧί-Promotoren mit verbesserten Merkmalen vorzu-45 sehen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1 (AOXf)-Promotor des Wildtyp-P/ch/'a pastoris-AOXf-Promotors (SEQ ID Nr. 1), umfassend mindestens eine Mutation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 50 a) einer Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle (TFBS), b) den Nukleotiden 170 bis 235 (-784 bis -719), den Nukleotiden 170 bis 191 (-784 bis -763), den Nukleotiden 192 bis 213 (-762 bis -741), den Nukleotiden 192 bis 210 (-762 bis -744), den Nukleotiden 207 bis 209 (-747 bis -745), den Nukleotiden 214 bis 235 (-740 bis -719), den Nukleotiden 304 bis 350 (-650 bis -604), den Nukleotiden 364 bis 393 (-590 bis -561), den 55 1 1 AT 501 955 B1
Nukleotiden 434 bis 508 (-520 bis -446), den Nukleotiden 509 bis 551 (-445 bis -403), den
Nukleotiden 552 bis 560 (-402 bis -394), den Nukleotiden 585 bis 617 (-369 bis -337), den
Nukleotiden 621 bis 660 (-333 bis -294), den Nukleotiden 625 bis 683 (-329 bis -271), den
Nukleotiden 736 bis 741 (-218 bis -213), den Nukleotiden 737 bis 738 (-217 bis -216), den 5 Nukleotiden 726 bis 755 (-228 bis -199), den Nukleotiden 784 bis 800 (-170 bis -154) oder den Nukleotiden 823 bis 861 (-131 bis -93) der SEQ ID Nr. 1, und Kombinationen davon. In der gesamten Beschreibung zeigen die (negativen) Zahlen in Klammer die entsprechenden Positionen des Promotors im Verhältnis zum Translations-Start-Codon (z.B. ATG). Beispielsweise entspricht „A“ von „ATG“ in einer Nukleinsäuresequenz umfassend NxGAC7ATGNy der Position io +1, wogegen „T“ vor „A“ von „ATG“ der Position -1 entspricht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der mutierte AOX7-Promotor mindestens eine Mutation in einer Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle und/oder einem der Nukleinsäuresequenz-Bereiche, die oben angegeben sind. Es zeigte sich, dass besonders diese Regionen des AOX1-15 Promotors geeignet sind, um den Promotor zu modifizieren, um seine Merkmale zu verändern. Natürlich kann auch eine Kombination der oben angegebenen Mutationen eingeführt werden, um die charakteristischen Merkmale eines AOX7-Promotors zu verbessern (z.B. zwei aus a) ausgewählte TFBS-Mutationen, eine aus a) ausgewählte TFBS-Mutation und eine aus b) ausgewählte Mutation, eine aus a) ausgewählte Mutation und zwei aus b) ausgewählte Mutatio-20 nen). Beispielsweise kann eine Mutation einer TFBS mit einer Mutation in den Nukleotiden 737 bis 738 (-217 bis -216) und/oder in den Nukleotiden 207 bis 209 (-747 bis -745) der SEQ ID Nr. 1 kombiniert werden. Die Expression eines Proteins unter der Kontrolle eines AOX1-Promotors in Pichia pastoris wird im Allgemeinen durch die Zugabe von Methanol induziert und durch die Anwesenheit von Glucose im Medium inhibiert. Um die Wirkung dieser Medium-25 Zusätze auf die Protein-Expression zu verstärken oder zu verringern, wird der Promotor vorzugsweise in den Promotor-Regionen wie oben angegeben mutiert. Die Wirksamkeit der mutierten AOX7-Promotoren zur Erzeugung eines interessierenden Proteins ist je nach der Menge (d.h. Kopien) des in das Chromosom des Wirts integrierten Vektors verschieden. Es zeigte sich, dass insbesondere Multicopy-Stämme verbesserte Promotor-Wirkungen zeigen. Da die Antibio-30 tika-Resistenz von P/ch/ä-Stämmen von der Zahl der Antibiotika-Resistenz-Kassetten abhängt (in einen Wirt eingeführte Vektoren umfassen vorzugsweise eine Antibiotika-Resistenz-Kassette, die es dem Wirt ermöglicht, auf/in einem Medium, das ein Antibiotikum als selektiven Marker enthält, zu wachsen), die in das Chromosom des Wirts integriert sind, können Multicopy-Stämme erzeugt werden, indem man steigende Konzentrationen von Antibiotikum (im Bereich 35 von 10 pg/ml bis 10 mg/ml, vorzugsweise 50 pg/ml bis 1000 pg/ml; je nach dem verwendeten Antibiotikum; z.B. Geneticin: 0,1 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 0,2 bis 5 mg/ml, insbesondere 0,25 bis 4 mg/ml, Zeocin: 10 bis 5000 pg/ml, vorzugsweise 50 bis 3000 pg/ml, insbesondere 100 bis 2000 pg/ml) auf die selektiven Agar-Platten aufträgt, um den Selektionsdruck zu steigern (z.B. [14]; Scorer, C.A. et al. (1994) Bio/Technology 12:181-184). Man stellte jedoch fest, 40 dass das Wachstum von Zellen, die eine Vielzahl von Antibiotika-Resistenz-Kassetten beinhalten, nicht nur von der Konzentration des Antibiotikums abhängt, sondern auch zeitabhängig ist. Daher können Multicopy-Stämme auf einem Medium, das dieselbe Konzentration eines Antibiotikums enthält, in einer kürzeren Zeitspanne zu einer nachweisbaren Kolonie anwachsen als Singlecopy-Stämme. Dieses Verhalten ermöglicht es dem Fachmann, Multicopy-Stämme nach-45 zuweisen und zu isolieren, bevor Singlecopy-Stämme zu wachsen beginnen. Beispielsweise wächst ein Stamm, der eine einzige Kopie einer Antibiotika-Resistenz-Kassette beinhaltet, auf einer Agar-Platte in 72 h zu einer nachweisbaren Koloniegröße an, wogegen derselbe Stamm, der mehr als eine Kopie dieser Kassette beinhaltet, in 24 bis 48 h zur selben Größe anwächst. so Insbesondere Multicopy-Stämme, die einen AOXf-Promotor mit Mutationen in den Nukleotiden 694 bis 723 (-260 bis -231) und in den Nukleotiden 737 bis 738 (-217 bis -216) enthielten, zeigten überraschend verbesserte Expressionsraten.
Um die Protein-Expressions-Effizienz eines Wirts in Anwesenheit von Methanol zu steigern, 55 werden vorzugsweise die Nukleotide 170 bis 235 (-784 bis -719) des AOX7-Promotors 1 2 AT 501 955 B1 (SEQ ID Nr. 1) mutiert. Eine Mutation in dieser Region erhöht die Protein-Expression auf 120 bis 130% im Vergleich zum Wildtyp-AOXi-Promotor, mit der Maßgabe, dass das den mutierten AOX1-Promotor tragende Plasmid nur einmal in das Chromosom/Genom des Wirts integriert ist (Singlecopy-Mutante). Mutationen in allen anderen oben erwähnten Regionen reduzieren je-5 doch die Effizienz von Methanol zur Induktion der Protein-Expression oder haben keinen Einfluss auf sie. Dagegen führen Mutationen in den Promotor-Regionen des Wildtyp-AOXf-Promotors (wie oben angegeben) - je nach der Mutation - zu einer vermehrten oder verringerten Protein-Expression unter Derepressionsbedingungen (vgl. z.B. Tabelle 13, Beispiel 1). io Jedoch führen rekombinante Stämme, die mehr als eine Kopie mutierter AOX1-Promotoren beinhalten, zu Stämmen mit einer verstärkten Aktivität unter Derepressions- und Methanolinduzierten Bedingungen (Multicopy-Stämme, siehe z.B. Fig. 7, Beispiel 2). Im Einzelnen zeigen Multicopy-Stämme, die Mutationen in den Nukleotiden 694 und 723 der SEQ ID Nr. 1 (d6), in den Nukleotiden 694 und 723 (-260 und -231) der SEQ ID Nr. 1 (d6), in den Nukleotiden 694 15 und 723 (-260 und -231) und in den Nukleotiden 304 und 350 (-650 und -604) der SEQ ID Nr. 1 (d2d6) in TFBS, insbesondere in Rap1, Gcr1, QA-1F, Hsf_1, Adr1, Hsf_2, MatlMC, abaA und Hap2345, beinhalten, eine vermehrte Expression unter Derepressionsbedingungen und/oder unter Methanol-Induktion im Vergleich zur Expression von Proteinen unter der Kontrolle des Wildtyp-AOXi-Promotors. Unter Derepressionsbedingungen zeigen einige dieser Multicopy-20 Stämme Protein-Expressionen, die im Vergleich zu Expressionen unter der Kontrolle des Wild-typ-Promotors etwa 10 Mal höher sind. In Anwesenheit von Methanol als Induktor ist die Expressions-Effizienz mehr als 5 Mal verbessert, wenn ein Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Daher werden diese Mutationen, insbesondere, wenn sie im Wirt in einer Multicopy-Form vorhanden sind, vorzugsweise für die Expression von Proteinen verwen-25 det. Die Kombination von zwei oder mehreren der oben erwähnten Mutationen kann die Promotor-Stärke weiter verbessern (vgl. z.B. Fig. 7, Beispiel 2).
Die Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen können experimentell identifiziert werden (z.B. Mobilitäts-Verschiebung („mobility shift“) oder „footprinf-Analyse) oder durch Sequenz-Vergleich mit 30 bekannten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (z.B. durch Computer-Analyse, [15]).
Die Kenntnis von Promotor-Regionen, die die Stärke und die Charakteristika des Promotors beeinflussen, kann verwendet werden, um Promotoren mit bestimmten Eigenschaften zu entwerfen (hohe Proteinexpression unter Derepressionsbedingungen und/oder hohe Proteinex-35 pression in Anwesenheit von Methanol). Weiters können diese Eigenschaften verstärkt oder verändert werden, wenn diese mutierten Promotoren ein- oder mehrmals in das Genom des Wirts integriert werden (siehe z.B. Beispiele 1 bis 3).
In einigen Fällen sollte jedoch die Promotor-Aktivität verringert anstatt erhöht werden. Insbe-40 sondere muss die Co-Expression von regulatorischen Proteinen, wie Kinasen, Phosphorylasen und Helfer-Proteinen, wie z.B. Chaperonen, Protein- Disulfid-Isomerase, cis-trans-lsomerasen, Foldasen, Protein-Disulfid-Isomerasen und Proteasen, in vielen Fällen im Vergleich zum Hauptprodukt, welches von der Zelle unter dem Wildtyp-Promotor oder unter einem verstärkten Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden kann, gering sein. Besonders die 45 kombinierte Expression von zwei verschiedenen Produkten (z.B. einem Helfer-Protein und dem Hauptprodukt) unter der Kontrolle eines AOX1-Promotors mit (im Vergleich zur Wildtyp-Aktivität) verstärkter Aktivität bzw. eines AOX1-Promotors mit verringerter Aktivität erwies sich als vorteilhaft, weil die Expressionsrate des Haupt- und des Neben-Produkts noch unterschiedlicher ist, anstatt Wildtyp-AOX1-Promotoren zu verwenden. Eine verringerte Expression kann vorzugs-50 weise durch Deletion von Aktivator-Bindungsstellen, wie HSF oder HAP, oder durch Insertion von Repressor-Bindungsstellen in den Wildtyp-AOX1-Promotor erzielt werden. Folglich verhindert die Verwendung des AOX1-Promotors mit verringerter Aktivität die Überlastung der Protei-nexpressions-Maschinerie der Zelle, welche die Folge hätte, dass die Ausbeute des Hauptprodukts verringert wäre. Beispielsweise konnten Besserte P.H. et al. (PNAS USA (1999) 55 96:13703-13708) zeigen, dass die Expression eines aktiven Polypeptids durch Co-Expression 1 3 AT S01 955 B1 eines Thioredoxins signifikant erhöht werden konnte.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Promotor weiters eine Mutation in den Nukleotiden 694 bis 723 (-260 bis -231) und/oder in den Nukleotiden 729 bis 763 (-225 bis 5 -191) der SEQ ID Nr. 1.
Eine Mutation, die diese Nukleotid-Bereiche beeinflusst, in Kombination mit einer Mutation, wie oben angegeben, führt zu einer noch mehr verstärkten Promotor-Aktivität. Beispielsweise führt eine Doppelmutation, die die Nukleotide 694 bis 723 (-260 bis -231) und die Nukleotide 737 bis io 738 (-217 bis -216) der SEQ ID Nr. 1 beeinflusst, zu einem Promotor, der - im Vergleich zu den Expressionsmengen des Wildtyp-Promotors unter denselben Bedingungen - größere Expressionsmengen unter Derepression sowie unter induzierten Bedingungen zeigt. Die Wirkung dieser Doppelmutation kann verstärkt werden, wenn die Nukleinsäure, die den Promotor aufweist, in mehr als einer Kopie in die Zelle eingeführt wird (was einen Multicopy-Klon ergibt). 15
Die Mutation ist vorzugsweise eine Deletion, eine Substitution, eine Insertion, eine Inversion und/oder eine Multiplikation.
Um die Charakteristika des Wildtyp-AOXf-Promotors von Pichia pastoris zu modifizieren, sind 20 mehrere Mutationstypen möglich. Die Promotor-Abschnitte, welche die oben erwähnten Regionen aufweisen (Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS), Nukleotide 170 bis 235 (-784 bis -719), 170 bis 191 (-784 bis -763), 192 bis 213 (-762 bis -741), 192 bis 210 (-762 bis -744), 207 bis 209 (-747 bis -745), 214 bis 235 (-740 bis -719), 304 bis 350 (-650 bis -604), 364 bis 393 (-590 bis -561), 434 bis 508 (-520 bis -446), 509 bis 551 (-445 bis -403), 552 bis 560 (-402 bis 25 -394), 585 bis 617 (-369 bis -337), 621 bis 660 (-333 bis -294), 625 bis 683 (-329 bis -271), 694 bis 723 (-260 bis -231), 729 bis 763 (-225 bis -191), 736 bis 741 (-218 bis -213), 737 bis 738 (-217 bis -216), 726 bis 755 (-228 bis -199), 784 bis 800 (-170 bis -154) oder 823 bis 861 (-131 bis -93) der SEQ ID Nr. 1) können teilweise oder vollständig deletiert, mit anderen Nukleotiden oder Nukleinsäuresequenzen teilweise oder vollständig substituiert, durch Insertion einzelner 30 Nukleotide oder Nukleinsäuresequenzen unterbrochen, teilweise oder vollständig invertiert oder multipliziert werden. Alle diese Mutationen führen zu einer Veränderung der Promotor-Aktivität, weil Strukturmerkmale und/oder Erkennungs-/Bindungsstellen beispielsweise für Transkriptionsfaktoren durch diese Mutationen beeinflusst werden. Diese Veränderungen können jedoch zu einer - im Vergleich zum Wildtyp-Promotor - erhöhten oder verringerten Aktivität des Promotors 35 führen.
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass die Multiplikation/Duplizierung von spezifischen Nukleinsäure-Abschnitten die Promotor-Aktivität erhöhen kann. Die Regulierung der Genexpression vieler eukaryontischer Promotoren, insbesondere von Hefe-Promotoren, involviert 40 multiple Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren, die in einem Promotor gebunden sind. Mehrere Stellen können für das Funktionieren selbst der kleinsten cis-agierenden Elemente notwendig sein. In Hefezellen sind stromaufwärts befindliche Aktivator-Sequenzen (upstream activator sequences, UAS) für die Transkription notwendig. Sie funktionieren in jeder Orientierung und bei verschiedener Distanz in Bezug auf die TATA-Box und Transkriptions-Start-Stelle, 45 doch im Gegensatz zu Enhancern in höheren Eukaryonten müssen sie stromaufwärts von diesen grundlegenden Elementen sein. UAS sind Ziele für mehrere Transkriptionsaktivatoren.
Die meisten Repressions-Phänomene bei Hefezellen ergeben sich aus der Inaktivierung oder dem Fehlen von Transkriptionsfaktoren. Es konnten jedoch auch einige negativ-regulierende so Stellen (stromaufwärts befindliche Repressionssequenzen, (upstream repression sequences, URS)) identifiziert werden.
Aufgrund der Deletions-Analyse des P. pastoris AOX2-Promotors wurden drei regulatorische Regionen gefunden, zwei negativ wirkende Regionen (URS1 und URS2) und eine positiv wir-55 kende Domäne (UAS) [3], Für den H. polymorpha MOX-Promotor wurden auch zwei stromauf- 14 AT 501 955 B1 wärts befindliche aktivierende Sequenzen (UAS1 und UAS2) und eine Repressor-Bindungsstelle (URS1) beschrieben [8]. Entsprechende Sequenzen konnten auch an AOX1-Promotoren identifiziert werden (die Nukleotide 585 bis 614 (-369 bis -340) und 725 bis 756 (-229 bis -198), die Ähnlichkeiten mit AOX2 UAS [3] zeigten, sowie die Nukleotide 622 bis 656 5 (-332 bis -298) [8]). Die Multiplikation (2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Mal UAS) dieser Nukleinsäure-
Abschnitte kann einen Promotor mit verbesserter Stärke ergeben, was zu einer noch stärkeren Protein-Expression führt. Daher fällt auch die Konstruktion von Promotoren, die mehrere UAS aufweisen, welche vorzugsweise die oben erwähnten Sequenz-Regionen ähnlich den AOX2-und MOX-UAS beinhalten, oder andere Mehrfach-Sequenz-Abschnitte (z.B. die oben angege-io benen Nukleinsäuresequenz-Bereiche) in den Bereich der vorliegenden Erfindung und wird als bevorzugte Ausführungsform angesehen. Eine Aktivierungssequenz befindet sich üblicherweise innerhalb einiger hundert Basenpaare eines Promotors. Beispielsweise befinden sich die meisten Aktivierungssequenzen innerhalb von etwa 200 bis 400 Basenpaaren des Promotors, der verstärkt ist. Weiter stromaufwärts enthält der Promotor gewöhnlich weitere Enhancer und 15 Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen.
Mindestens eine Mutation des AOX1-Promotors kann mittels Standardmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, eingeführt werden (z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (dritte Ausgabe). J. Sambrook und D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 20
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle (TFBS) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hap1, Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rap1, Adr1, MatlMC, Gcr1 und QA-1F. 25 Die Mutation mindestens einer dieser TFBS führt zu mutierten Promotoren mit verschiedenen Charakteristika (vgl. Beispiel 2).
Vorzugsweise umfasst die Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle (TFBS) Hap1 die Nukleotide 54 (-900) bis 58 (-896) der SEQ ID Nr.1, Hsf die Nukleotide 142 (-812) bis 149 (-805) und 517 30 (-437) bis 524 (-430) der SEQ ID Nr. 1, Hap234 die Nukleotide 196 (-758) bis 200 (-754), 206 (-748) bis 210 (-744) und 668 (-286) bis 672 (-282) der SEQ ID Nr. 1, abaA die Nukleotide 219 (-735) bis 224 (-730) der SEQ ID Nr. 1, Stre die Nukleotide 281 (-673) bis 285 (-669) der SEQ ID Nr. 1, Rap1 die Nukleotide 335 (-619) bis 339 (-615) der SEQ ID Nr. 1, Adr1 die Nukleotide 371 (-583) bis 377 (-577) der SEQ ID Nr. 1, MatlMC die Nukleotide 683 (-271) bis 687 (-267) 35 der SEQ ID Nr. 1, Gcr1 die Nukleotide 702 (-252) bis 706 (-248) der SEQ ID Nr. 1 und QA-1F die Nukleotide 747 (-207) bis 761 (-193) der SEQ ID Nr. 1.
Diese TFBS können experimentell oder durch Vergleich mit bekannten TFBS anderer Promotoren (z.B. Promotoren von Eukaryonten) mit Hilfe von Computer-Programmen identifiziert wer-40 den (siehe z.B. Beispiel 1).
Eine Zusammenfassung des Einflusses mutierter AOX1-Promotoren auf die Expression von Proteinen, Peptiden oder funktionellen Nukleinsäuren ist in Tabelle 2 (im Vergleich zur Wildtyp-Aktivität) vorgesehen.
Tabelle 2: Einfluss von Mutationen des Wildtyp-AOX1-Promotors auf die Expression von Prote-inen, Peptiden oder funktionellen Nukleinsäuren: _
Mutation Singlecopy-Klon Multico py-Klon Derepressions- Bedingung1 Methanol-induzierte Bedingung1 Derepressions- Bedingung1 Methanol-induzierte Bedingung1 AHap1 + AHsf_1 - + + + 55 AT 501 955 B1 1 5
Mutation Singlecopy-Klon Multico p y-Klon Derepressions- Bedingung1 Methanolinduzierte Bedingung1 Derepressions- Bedingung1 Methanolinduzierte Bedingung1 Δ1 + + AHap2345_1 + + AHap2345_2 - + + AabaA - + + AStre + + Δ2 - ARap1 - + + A3 - - AAdrl - - + + A4 - - AHsf_2 Δ5 - - AHap2345_3 + + AMatlMC Δ6 + + + + Δ6* + - + + AGcrl - + + + Δ7 - - AQA-1F + + + AQA-1 Fzus + - AHsf 2 dHa Ρ2345 1 + + + AHsf_2_dHa p2345 1zus + AHsf 2 MatlMC - + + Δ8 - - Δ9 - - Δ2Δ6 - + + Δ736-41 - Δ737-38 AlnD-d4m AD-d4 Δ1-1 Δ1-2 Δ1-3 A1-Sacl 1 Expressionsrate im Vergleich zum Wildtyp-AOX1-Promotor: - verringert, + erhöht 16 AT 501 955 B1
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Molekül, umfassend einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1 (AOXI)-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure, die für ein Protein, Peptid oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, wobei der Promotor und die Nukleinsäure operativ miteinander verbunden sind. 5
Der mutierte AOX1-Promotor kann mit einem Gen verbunden sein, das für ein Protein (z.B. Enzym), ein Peptid (z.B. Hormon) oder eine funktionelle Nukleinsäure (z.B. siRNA) codiert. Das resultierende Nukleinsäure-Fragment kann verwendet werden, um beispielsweise ein Protein zu exprimieren, wenn es in einen Organismus, vorzugsweise eine Hefe, insbesondere einen Pichia io pastoris-Stamm, eingeführt wird. Die Konstruktion dieses Nukleinsäure-Moleküls ist dem Fachmann wohl bekannt und kann mittels molekularbiologischer Standardmethoden durchgeführt werden (z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (dritte Ausgabe), J. Sambrook und D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Handbuch „Pichia Expression Kit“, Invitro-gen Corp). 15 „Operativ verbunden“ bezieht sich auf (eine) erste Sequenz(en), die ausreichend proximal zu (einer) zweiten Sequenz(en) positioniert ist, so dass die erste(n) Sequenz(en) einen Einfluss auf die zweite(n) Sequenz(en) oder auf einen Bereich unter der Kontrolle dieser zweiten Sequenz ausüben kann (können). Beispielsweise kann ein Promotor operativ mit einem Gen verbunden 20 sein, so dass das Gen unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird, was typischerweise 5’ zum Gen sein würde. Üblicherweise wäre ein Kern-Promotor innerhalb von ein paar hundert Basenpaaren von der Start-Stelle der Translation. Etwa 30 bp stromabwärts befindet sich üblicherweise ein stromabwärts befindliches („downstream“) Promotor-Element. 25 Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, umfassend einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1 (AOXf)-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Nukleinsäure-Molekül, wie oben angegeben.
Um den mutierten Promotor, gegebenenfalls operativ verbunden mit einer für ein Protein, Pep-30 tid oder eine funktionelle Nukleinsäure codierenden Nukleinsäure, in einen Wirt, vorzugsweise in einen methylotrophen Hefestamm (z.B. einen Pichia pastoris-Stamm) einzuführen, muss der Promotor in einem Vektor vorgesehen werden, welcher für die Transformation des Wirts verwendet werden kann. Diese Vektoren können beispielsweise episomale Hefe-Plasmide (yeast episomal plasmids, YEp), integrative Hefe-Plasmide (yeast integrative plasmids, YIP) oder 35 künstliche Hefe-Chromosomen sein. Solche Vektoren umfassen üblicherweise einen Replikationsursprung (wenn eine Amplifikation in mikrobiellen Wirten notwendig ist) und einen Selektionsmarker für die Vermehrung des Vektors in E. coli, Promotoren und Terminatoren für die rekombinante Protein-Expression in Hefe und Selektionsmarker für Hefe. Nicht-integrative Vektoren umfassen weiters eine autonome Replikations-Sequenz (ARS), welche die Stabilität 40 des Vektors in der Zelle gewährleistet (z.B. Myers, A.M. et al. (1986) Gene 45:299-310). Integrative Vektoren, die keine AR-Sequenzen beinhalten, umfassen Sequenz-Regionen, die mit Regionen des Genoms homolog sind. Alternativ kann eine lineare DNA, beispielsweise aus PCR stammend, für die Transformation verwendet werden. 45 Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zelle, umfassend mindestens einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1 (AOXi)-Promotor, mindestens ein Nukleinsäure-Fragment oder mindestens einen Vektor, wie hierin geoffenbart. Die Einführung eines Nukleinsäure-Moleküls, das einen mutierten AOXI-Promotor (z.B. einen Vektor, wobei der Promotor operativ mit einer für ein Protein codierenden Nukleinsäure verbunden ist) beinhaltet, in einen so Wirt kann beispielsweise mittels Elektroporation erfolgen. Dieses Nukleinsäure-Molekül wird in das Chromosom integriert, nachdem es in den Wirt in einer Einzelkopie oder in Mehrfach-Kopien eingeführt ist oder in der Zelle als autonom replizierendes Singlecopy- oder Multicopy-Plasmid vorhanden ist. Wenn mehrere mutierte Promotoren verwendet werden, können sie alle mit einem einzelnen Gen (das für ein Protein oder für eine funktionelle Nukleinsäure codiert 55 (z.B. Ribozym, antisense-RNA usw.), mit einem identischen Protein oder mit verschiedenen 17 AT 501 955 B1
Proteinen (z.B. 1 Promotor-Variante ist mit einem Selektionsmarker verbunden und ein anderer mutierter Promotor ist mit einem anderen Protein verbunden, welches exprimiert werden sollte) verbunden sein. Daher werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Singlecopy-Stämme, umfassend eine Kopie des AOX1-Promotors, operativ verbunden mit einer Nukleinsäure, die für 5 ein Protein, ein Peptid oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, sowie Multicopy-Stämme, umfassend mehr als eine, vorzugsweise mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15 oder 20 Kopien des AOX1-Promotors, operativ verbunden mit einer Nukleinsäure, die für ein Protein, ein Peptid oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, vorzugsweise hergestellt. io Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle.
Vorzugsweise ist die methylotrophe Hefezelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis, insbesondere eine Pichia pastoris-Zelle. 15 AOX1-Promotoren sowie mutierte Varianten davon können in eine sehr große Anzahl verschiedener Hefezellen funktionell eingeführt werden, einschließlich methylotropher (z.B. Pichia pastoris) und nicht-methylotropher (z.B. Saccharomyces cerevisiae) Zellen. Die Transferierbarkeit von Promotoren in andere Organismen, insbesondere der AOX1- und /WOX-Promotoren, ist 20 dem Fachmann bekannt. Obwohl die Substrat-Spezifität und einige regulatorische Merkmale bei verschiedenen Hefen (z.B. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha und Saccharomyces cerevisiae) verschieden sind, wurde eine Erkennung fremder Promotoren nachgewiesen (z.B. Raschke, W.C., et al., Gene, 1996, 177:163-7; Pereira, G.G. und C.P. Hollenberg, Eur. J. Bio-chem., 1996, 238:181-91). Beispielsweise wird der H. polymorpha MOX-Promotor in S. cerevi-25 siae erkannt und ist in Anwesenheit von Glukose reprimiert und unter einer beschränkten Kohlenstoffquelle dereprimiert. In ähnlicher Weise kann der AOXf-Promotor in H. polymorpha verwendet werden und wird auf dieselbe Weise reguliert wie der AfOX-Promotor. Der ZZA1-Promotor, welcher mit dem AOXf-Promotor eng verwandt ist, konnte ebenfalls erfolgreich in S. cerevisiae verwendet werden. 30
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Expression eines ausgewählten Proteins oder die Transkription in eine funktionelle RNA, umfassend i) einen Vektor, wie voranstehend definiert, und 35 ii) eine Zelle, die dieses Protein oder die funktionelle RNA unter der Kontrolle eines Promotors gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren kann.
Der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem Set zur Expression eines ausgewählten Proteins oder zur Transkription einer funktionellen RNA (z.B. Ribozym, antisense-RNA, 40 RNAi) verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle. 45 Vorzugsweise ist die methylotrophe Hefezelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis, insbesondere eine Pichia pastoris-Zelle.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines rekombinanten Proteins, Peptids oder einer funktionellen Nukleinsäure in einer Zelle, umfas-50 send die folgenden Schritte: - Vorsehen eines Vektors oder eines Nukleinsäure-Moleküls, umfassend einen AOX1-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure, die für ein Protein, Peptid, oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, wobei der Promotor operativ mit der Nukleinsäure 55 verbunden ist, 1 8 AT 501 955 B1 - Transformieren der Zelle mit dem Vektor oder dem Nukleinsäure-Molekül, - Züchten der transformierten Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, - gegebenenfalls Induzieren der Expression des Proteins, Peptids oder der funktionelle Nukleinsäure, und 5 - Isolieren des exprimierten Proteins, Peptids oder der funktionellen Nukleinsäure.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle. io Vorzugsweise ist die methylotrophe Hefezelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis, insbesondere eine Pichia pastoris-Zelle. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäure-Moleküls, eines Vektors oder einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung zur Expression eines Proteins, Peptids oder einer funktionellen Nukleinsäure. 15
Wenn ein Nukleinsäure-Molekül, ein Vektor oder eine Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung für die Expression eines Proteins, Peptids oder einer funktionellen Nukleinsäure verwendet wird, ist es vorteilhaft, einen geeigneten AOX1-Promotor zu wählen, welcher die für die Expression gestellten Anforderungen erfüllt (z.B. hohe oder konstitutive Expression unter Derepressi-20 onsbedingungen (= ohne die Zugabe von Glukose zum Medium) oder unter Methanolinduzierten Bedingungen). Geeignete mutierte AOX1-Promotoren können mit Hilfe der Tabelle 2 ausgewählt werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Supe-25 rexpressions-Klonen oder von Klonen, die eine konstitutive Expression vermitteln, umfassend die Schritte: a) Einführen eines Nukleinsäure-Moleküls oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung in eine Zelle, 30 b) Transferieren der Zelle aus Schritt a) in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker, Sorbit und Methanol aufweist, zum selektiven Wachstum von Superexpressions-Klonen unter induzierenden Bedingungen, oder in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker und Sorbit ohne Methanol enthält, zum selektiven Wachstum von Superexpressions-Klonen unter dereprimierenden Bedingungen, oder in ein Medium, das einen geeigneten selektiven 35 Marker und Glukose zusammen mit Methanol umfasst, zum selektiven Wachstum von Zellen, deren Methanol-induzierbare Promotor-Variante dereprimierte und induzierte Expression in Anwesenheit von Glukose vermittelt, oder in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker und Glukose ohne Methanol umfasst, zum selektiven Wachstum von Zellen, deren Methanol-induzierbare Promotor-Variante eine konstitutive Expression in Anwesenheit von 40 Glukose vermittelt, c) Inkubieren der Zelle aus Schritt b) auf dem Medium, d) Isolieren einer Kolonie der aus Schritt c) erhaltenen Zelle, und e) Detektieren superexprimierender Klone oder von Klonen, die eine konstitutive Expression vermitteln, durch Bestimmen der Expressionsrate der Zelle. 45
Die Konstruktion von Super- oder Hochexpressions-Klonen, die einen Vektor oder eine Nukleinsäure mit einem mutierten Methanol-induzierbaren Promotor beinhalten, erfordert Verfahren, die es dem Fachmann ermöglichen, diese Klone zu isolieren. Ein solches Verfahren ist hierin vorgesehen. Der erste Schritt des Verfahrens ist das Einführen der den Promotor aufweisenden so Nukleinsäure (z.B. des Vektors) in eine geeignete Zelle, die den Promotor regulieren kann. Der Promotor selbst kann mittels Gentechnik oder mittels chemischer (z.B. Bisulfit, Nitrit, Fumarsäure, Hydrazin) oder physikalischer (z.B. Bestrahlung, insbesondere UV-Bestrahlung) Mutagenese mutiert sein. In einem weiteren Schritt werden die Zellen, die den mutierten Promotor enthalten, auf ein Medium übertragen, vorzugsweise auf ein festes Medium direkt oder über ein flüssiges 55 Medium, welches ein Antibiotikum (z.B. Zeocin) und Sorbit (oder eine andere nicht- 19 AT 501 955 B1 reprimierende Kohlenstoffquelle) für das Wachstum von Hochexpressionklonen unter Derepres-sionsbedingungen umfasst und welches weiters Methanol umfasst, wenn Hochexpressionsklo-ne unter induzierten Bedingungen entdeckt werden sollten. Durch das Inkludieren von Glukose in den Medien zusammen mit Methanol könnten Glukose-nicht-reprimierte und Methanol-5 induzierte Transformanten isoliert werden (um die Methanol-Verflüchtigung zu verhindern, kann das Medium während der Inkubation in einer mit Methanol gesättigten oder Methanol aufweisenden Atmosphäre gelagert werden). Nach der Züchtung der Zellen in oder auf einem geeigneten Medium werden diese Zellen aus dem Medium isoliert und können zur weiteren Analyse (z.B. Bestimmung der exakten Expressionsrate, Isolierung des Promotors, um die Veränderun-io gen in der Nukleinsäure-Sequenz des Promotors im Vergleich zum Wildtyp-Promotor zu analysieren) verwendet werden.
Die Expressionsrate wird vorzugsweise mit Methoden, wie Gel-Elektrophorese (z.B. SDS-PAGE), Antikörper-Bindung (z.B. ELISA), quantitative (reverse Transkriptase) PCR (z.B. Echt-15 zeit RT-PCR), enzymatische Aktivität (z.B. wenn das exprimierte Protein ein Enzym ist) oder fluorometrisch (Protein mit einem charakteristischen Emissions-Spektrum wie grün fluoreszierendes Protein) bestimmt.
Promotoren (Transformanten), die eine erhöhte Expression in Abwesenheit andernfalls repri-20 mierender C-Quellen zeigen (im Fall von AOX1-Promotor Glukose) werden durch selektives Wachstum transformierter Zellen in/auf Medien, die eine nicht-reprimierende Kohlenstoff-Quelle enthalten, selektiert. Promotoren (Transformanten), die eine erhöhte Expression in Abwesenheit andernfalls reprimierender C-Quellen (im Fall von AOX1-Promotor Glukose) in Anwesenheit eines Induktors (z.B. Methanol) zeigen, werden durch selektives Wachstum transformierter 25 Zellen in/auf Medien, die eine nicht-reprimierende Kohlenstoffquelle und den Induktor (z.B. Methanol) enthalten, selektiert. Der Induktor kann auch eine nicht-reprimierende Kohlenstoffquelle sein. Superexprimierende Klone werden durch Kombinieren einer Multicopy, die zu einer höheren Resistenz gegen Antibiotika führt (z.B. Zeocin) oder höheren Produktivität einer wesentlichen Medien-Komponente (z.B. Leu, His, Arg, Lira) führt, mit der oben beschriebenen 30 regulatorischen Selektion selektiert.
Die bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Medien-Zusammensetzungen können direkt von den Herstellern oder Vertreibem von Sets, Zellen und Vektoren, die Pichia pastoris betreffen (z.B. Invitrogen) erhalten werden. Die Methanol-35 Konzentration im Medium kann vorzugsweise 0,05 bis 15%, mehr bevorzugt 0,1 bis 10%, insbesondere 0,3 bis 5% sein. In der wissenschaftlichen Literatur sind verschiedene Methanol-Konzentrationen für verschiedene Kultivierungsbedingungen beschrieben. Beispielsweise können Schüttelkolben 1% Methanol oder weniger enthalten (Guama NM et al. (1997) Biotech. Bioeng. 56:279-286), Fermentationsprozesse können 0,5% Methanol enthalten (Damasceno 40 LM, et al. (2004) Protein Expr. Purif. 37:18-26; Hellwig S., et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 74:344-352; Hellwig S., et al. (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 30:267-275).
Die verbesserte Expression von Multicopy-Klonen kann nicht nur von der Anwesenheit von mehr als einer Kopie eines mutierten Promotors in der Zelle abhängen, sondern auch darauf 45 zurückzuführen sein, dass mehrere Transkriptionsfaktoren fehlen, weil diese Faktoren an die große Zahl der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dieser Zelle gebunden sein können. Dies konnte durch einen Vergleich der Expressionsrate unter Methanol-induzierenden Bedingungen mit der Expressionsrate unter Derepressionsbedingungen gezeigt werden, wobei man feststellen konnte, dass die erhöhte Expressionsrate nicht nur eine Auswirkung der Kopienzahl des so mutierten AOX1-Promotors in der Zelle ist (keine lineare Wirkung). Beispielsweise zeigt der Stamm d6*F10 solche Merkmale.
Das zum Isolieren von Superexpressionsklonen verwendete Medium kann weitere Medien-Komponenten enthalten, wie Leucin, Uracil, Arginin, Histidin und/oder Adenin, und Sorbit kann 55 durch Glukose ausgetauscht werden, um Promotor-Varianten zu identifizieren, die eine verrin- 20 AT 501 955 B1 gerte Repression in Gegenwart von Glukose im Vergleich zu Wildtyp-Promotor-Varianten zeigen.
Bei Verwendung auxotropher Stämme kann die Zelle in ein Medium transferiert werden, das 5 Sorbit (oder andere nicht-reprimierende Kohlenstoffquellen) umfasst und individuelle Medien-Komponenten (z.B. Leucin, Uracil, Arginin, Histidin und Adenin) für das selektive Wachstum von Superexpressionsklonen unter dereprimierenden Bedingungen unter Verwendung von Auxotrophie-Markern enthält (Schritt b). io Der allgemein verwendete P(TEF)-Zeo-Resistenz-Marker in AOX1-Promotor-aufweisenden Vektoren führt zur konstitutiven Expression des Zeocin-Resistenz-Proteins und ermöglicht daher die Isolierung von Multicopy-Klonen durch Resistenz gegen höhere Konzentrationen des Antibiotikums. Das beschriebene neue Verfahren ermöglicht die Kombination dieser Wirkung mit regulatorischen Merkmalen zur Detektion von Promotoren und Multicopy-Klonen, die zu 15 höherer Expression unter bestimmten kontrollierbaren regulatorischen Umständen führen (z.B. dereprimierte Expression, induzierte Expression usw.). Dies ermöglicht die Detektion neuer Promotoren mit veränderten regulatorischen Eigenschaften und auch von Klonen, wo Multico-py-Klone zu einer verbesserten Expression unter solchen speziellen regulatorischen Bedingungen führen. 20 „Superexpressionsklone“ sind Expressionsklone, die unter der Kontrolle des mutierten Promotors mehr von einem Protein oder mehr von einer funktionellen Nukleinsäure exprimieren als unter der Kontrolle des Wildtyp-Promotors, oder mehr von einem Protein oder von einer funktioneilen Nukleinsäure als bei Anwendung von Vektoren mit üblicherweise verwendeten Promotor-25 Selektions-Marker-Kombinationen, wie P(TEF)-Zeo. Die Expressionsrate der „Superexpressionsklone“ gemäß der vorliegenden Erfindung kann mindestens um 20%, vorzugsweise mindestens um 50%, mehr bevorzugt mindestens um 100%, insbesondere mindestens um 500% gesteigert sein im Vergleich zur Expressionsrate desselben Proteins oder Peptids oder der funktionellen Nukleinsäure unter der Kontrolle des Wildtyp-Promotors (Mittelwert plus zwei oder 30 drei Mal Standardabweichung). „Superexpressionsklone“ können vorzugsweise mehr als eine Kopie des mutierten Promotors oder des Nukleinsäure-Moleküls gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen. Alternativ können „Superexpressionsklone“ auch als „Hochexpressionsklone“ bezeichnet werden. 35 Gemäß der vorliegenden Erfindung sind „Methanol-induzierbare Promotoren“ Promotoren, deren Aktivität durch die Anwesenheit von Methanol im Kulturmedium reguliert wird. Solche Promotoren sind vorzugsweise AOX1- (von Pichia pastoris) oder MOX- (von Hansenula poly-morpha) Promotoren oder jeder andere Methanol-induzierbare und Glukose-reprimierte Promotor, der von methylotrophen Hefen stammt, wie z.B. FMD, FLD; DAS (vgl. z.B. Tabelle 6, Bei-40 spiel 1).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der selektive Marker ein Antibiotikum, vorzugsweise Zeocin. 45 Der im Medium zu verwendende selektive Marker hängt davon ab, welches molekulare Charakteristikum der Zelle verwendet werden kann, um eine Zelle, die die Nukleinsäure oder den Vektor mit einem mutierten oder Wildtyp-Methanol-induzierbaren Promotor beinhaltet, von einer Zelle, die diese Nukleinsäure oder den Vektor nicht beinhaltet, zu unterscheiden. Selektive Marker können daher Antibiotika sein (die Gene für eine Antibiotika-Resistenz kann man im so Vektor oder in der Nukleinsäure, der (die) in die Zelle eingeführt ist, finden). Um die Auxotrophie bestimmter Stämme zu kompensieren, kann der selektive Marker im Medium eine Substanz, wie Leucin, Uracil, Arginin, Histidin und Adenin sein, je nach der Art der Auxotrophie. Vorzugsweise ist die Zelle eine Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung. 55 Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Nukleinsäure- 21 AT 501 955 B1
Molekül oder der Vektor in die Zelle eingeführt durch Transformation mittels dem Fachmann bekannter Standardmethoden, vorzugsweise Elektroporation, chemische Transformation, Pro-toplasten-Fusion oder durch Partikel-Beschuss (vgl. z.B. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, herausgegeben von: Fred M. Ausubel et al.,; Molecular Cloning: A Labora-5 tory Manual (dritte Ausgabe) J. Sambrook und D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren und Beispiele erklärt, ohne darauf beschränkt zu sein. 10
Fig. 1 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von GFP-Zeo exprimie-renden P. pastoris Stämmen in Mikromaßstab, vor der Induktion mit Methanol (A) bzw. 24 (B) und 72 (C) Stunden nach der Induktion. Die Proben wurden wie in Beispiel 1 h) beschrieben hergestellt. Spur 1 ist X-33 (negativ Kontrolle), die Spuren 2-4 sind X-33 GFP-Zeo Stämme Muts 15 A9, D2 und E2, Spur 5 ist X-33 d6*F10. Bei 42 kDa ist bei allen GFP-Zeo Klonen eine starke
Bande vorhanden.
Fig. 2 zeigt einen Überblick über Sequenzdeletionen innerhalb der AOX1-Promotorregion und einiger Transkriptionsfaktor-Bindestellen. Die Regionen delta1-9 wurden mittels Overlap-20 Extension-PCR deletiert.
Fig. 3 zeigt ein Balkendiagramm von den Fluoreszenzintensitäten der AOXi-Promotorvarianten im Mikromaßstab nach der Derepression (Kohlenstoffmangel). Die Zellen wuchsen auf 1% Glukose im Mikromaßstab. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SA (Standardabwei-25 chung) von 4 unabhängigen Messungen. RFE: relative Fluoreszenzeinheiten; WT: P. pastoris Stamm GFP-Zeo D2 mit GFP-Zeo unter der Kontrolle des Wildtyp-AOXf-Promotors; D1-D9: P. pastoris Stämme mit den Deletionskonstrukten ΑΟΧ1Δ1-Δ9 vor dem GFP-Zeo-Gen; EX: Anregungswellenlänge; EM: Emissionswellenlänge. 30 Fig. 4 zeigt ein Balkendiagramm der Fluoreszenzintensitäten der AOXf-Promotorvarianten im Mikromaßstab nach der Methanolinduktion. Die Zellen wuchsen auf 1% Glukose im Mikromaßstab. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SA (Standardabweichung) von 4 unabhängigen Messungen. RFE: relative Fluoreszenzeinheiten; WT: P. pastoris Stamm GFP-Zeo D2 mit GFP-Zeo unter der Kontrolle des Wildtyp-AOXf-Promotors; D1-D9: P. pastoris Stämme mit den 35 Deletionskonstrukten ΑΟΧ1Δ1-Δ9 vor dem GFP-Zeo-Gen; EX: Anregungswellenlänge; EM: Emissionswellenlänge.
Fig. 5 zeigt ein Balkendiagramm der Fluoreszenzintensität ausgewählter AOXf-Promotor-varianten im Mikromaßstab. Es werden die Expressionsleveis von Singlecopy- und Multicopy-40 Stämmen mit Wildtyp- und A6-Promotorvarianten unter dereprimierenden wie auch unter induzierenden Bedingungen dargestellt. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SA (Standardabweichung) von 4 unabhängigen Messungen. WT: Singlecopy-GFP-Zeo-Stamm mit Wildtyp-AOX1-Promotor (GFP-Zeo D2), D6: Singlecopy-AOX1A6*-Klon; WT_E2: Multicopy-GFP-Zeo-Klon mit dem AOX7-Wildtyppromotor; D6* F10: Multicopy-AOX1A6*Klon(X-33 d6F10). 45
Fig. 6 zeigt das Resultat eines Tüpfeltests von P. pastoris-Stämmen auf MD- und MDM-Agarplatten mit unterschiedlichen Zeocin™-Konzentrationen. Die Zellen wurden auf BMD (1%)-Medium bis zu einer OD595 = 1,5 angezüchtet, dann in 10er Schritten bis zu einer Verdünnung von 105 verdünnt und mit Hilfe eines 48-Nadel-Stempels („pin replicator“) auf die Agarplatten so aufgebracht. Die Zahlen oberhalb des Bildes bezeichnen die Verdünnungsfaktoren, die für alle Platten dieselben sind. Das MD-Medium wurde wie oben beschrieben hergestellt. Methanol in den MDM-Zeo-Platten wurde auf eine Endkonzentration von etwa 0,5% zugegeben. Zeocin™ wurde auf Endkonzentrationen von 100, 200 bzw. 500 pg/ml zugegeben. X-33: P. pastoris X-33, A9: P. pastoris GFP-Zeo Muts A9, D2: P. pastoris GFP-Zeo D2, E2: P. pastoris GFP-Zeo E2. 55 22 AT 501 955 B1
Fig. 7 zeigt den Expressionslevei verschiedener Multicopy-Stämme im Vergleich zu Referenzstämmen; a) Aktivität unter dereprimierenden Bedingungen; b) Aktivität nach Methanolinduktion. 5 Fig. 8 zeigt den Expressionslevei von Δ6* Multicopy-Stämmen unter dereprimierenden und induzierenden Bedingungen im Vergleich zu Referenzstämmen.
Beispiele: io Beispiel 1:
Material und Methoden: a) DNA Präparations-/Reinigungs-Sets: 15
Es wurden mehrere kommerziell erhältliche DNA-Präparations- bzw. Reinigungs-Sets entsprechend der mitgelieferten Manuals verwendet (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3: DNA-Präparations- bzw. Reinigungs-Sets
Set Hersteller Easy-DNA™-Set Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA QIAprep® Spin Miniprep-Set QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega GmbH, Mannheim, Deutschland GenElute™ High Performance (HP) Plasmid Midiprep-Set, Deutschland Sigma-Aldrich Handels GmbH, Wien, Österreich QIAquick® Gel Extraction-Set QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland Quantum Prep™ Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Bio-Rad Laboratories GmbH, Wien, Österreich QIAquick® PCR Purification-Set QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland b) TOPO® Klonierung:
Die TOPO® Klonierung wurde entsprechend des mitgelieferten Manuals (für die Klonierung in 40 pCR®4Blunt-TOPO® und für die Klonierung in pCR®-Blunt ll-TOPO®) durchgeführt. Immer jeweils 4 pl des PCR-Produktes wurden für die Klonierung verwendet. 2 und 4 μΙ von jeder Klonierungsreaktion wurden entsprechend der oben erwähnten Protokolle in One Shot® chemisch kompetenten E. coli TOPIOF'-Zellen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) transformiert. 45 c) E. coli Transformation:
Die Transformation der Ligationsreaktionen und der Plasmide in E. coli wurde entsprechend dem SEM (simple and efficient method)-Protokoll [16] durchgeführt. Chemisch kompetente E. coli TOPIOF'-Zellen wurden für die Transformation verwendet. 50 d) Pichia pastoris Transformation:
Präparation der kompetenten Pichia pastoris Zellen: zur Inokulation von 50 ml YPD (2% Glukose) in einem 300 ml Weithals-Erlenmeyer-Schikanenkolben wurde eine Einzelkolonie des ge-55 wünschten Pichia pastoris-Wirtsstammes verwendet. Nach der Inkubation über Nacht bei 30°C, 23 AT 501 955 B1 60% Luftfeuchtigkeit und 130 UpM (Pilot Shake® RC-2 TE), wurde ein definiertes Volumen dieser Vorkultur zur Inokulation von 200 ml YPD (2% Glukose) in einem 2 I Weithals-Erlenmeyer-Schikanenkolben auf eine optische Dichte von etwa 0,1 bei 595 nm (OD595) verwendet. Die Kultur wurde unter denselben Bedingungen wie die Vorkultur bis zu einer optischen 5 Dichte von 1,0 - 1,5 gezüchtet. Die Zellen wurden bei 4°C und 4000 UpM für 10 Minuten pelletiert und in 200 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert. Dieser Schritt wurde 3 mal wiederholt, wobei die Zellen in 100 ml Wasser, 10 ml 1 M Sorbit bzw. 0,5 ml 1 M Sorbit resuspendiert wurden. io 10 pg des gewünschten Plasmids wurden mit ßg/ll und Λ/ofl (je 50 E) über Nacht in einem Endvolumen von 300 μΙ linearisiert. Nach dem Restriktionsverdau wurde die DNA in EtOH und 0,3 M Natriumacetat entsprechend eines Standardprotokolls [16] präzipitiert. Die DNA wurde in 11 μΙ sterilem ddH20 gelöst und mit Hilfe von MF-Millipore™ Membran-Filter (siehe Tabelle 12) für 1-2 h entsalzt. Wurde ein PCR-Produkt für die Transformation verwendet, wurden 4-5 μg 15 DNA, wie oben beschrieben mit Start bei der EtOH-Präzipitation, behandelt. Für jeden Transformationsansatz wurden 80 μΙ der vorbereiteten Zellen mit 10 μg der oben beschriebenen DNA vermischt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Mischung wurde in eisgekühlte Elektrotransformationsküvetten (Bio-Rad) transferiert und bei 200 Ω, 25 pF und 2,5 kV 20 gepulst. Anschließend wurde sofort 1 ml eiskaltes 1 M Sorbit hinzugefügt. Die Suspension wurde in ein steriles 12 ml PP-Röhrchen (Greiner, Frickenhausen, Deutschland, #184261) überführt und für 2 Stunden bei 30°C ohne Schütteln inkubiert. Nach dieser Regenerationsphase wurden Aliquote auf Selektionsplatten ausplattiert. Zur Selektion von Transformanten mit einer hohen Expression unter induzierenden Bedingungen, wurden die Zellen auf MSM-Zeo-25 Platten, enthaltend Minimalmedium mit Sorbit (oder einer anderen nicht-reprimierenden Kohlenstoffquelle), Methanol und Zeocin, ausplattiert. Für die Selektion von Klonen, welche eine hohe Expression unter dereprimierenden Bedingungen zeigen, können die Zellen auf Minimal-Sorbit-Zeocin-Platten ohne Methanol ausplattiert werden. Die Zugabe von Glukose zu methanolhälti-gen Selektionsplatten erlaubt die Detektion von Expressionsklonen und ihrer Promotoren, die 30 nicht durch Glukose reprimiert werden. e) Kolonie-PCR:
Eine Einzelkolonie des gewünschten P/c/7/a-Stammes wurde in 100 μΙ ddH20 in einem 100 μΙ 35 Mikroröhrchen resuspendiert und bei 95°C für 5 bis 10 Minuten erhitzt. Nach der Zentrifugation bei 13.200 UpM für 1 Minute, wurden 10 μΙ des Überstandes als Template für die PCR-Reaktion eingesetzt. 5 μΙ dieser ersten PCR-Runde wurden als Template für eine zweite verwendet. 5 μΙ der zweiten PCR-Runde wurden für ein Kontrollgel verwendet. Die PCR-Ansätze mit einem Endvolumen von 50 μΙ enthielten je 10 pmol der Primer (AOX1_col und GFPrev), je 200 μΜ von 40 jedem dNTP und 2,5 Einheiten von der Hot Star Taq® DNA-Polymerase (QIAGEN) oder TaqDNA-Polymerase (Promega) bei den in mitgelieferten Manuals beschriebenen Pufferbedingungen. Für die Sequenzierung wurde das zweite PCR-Produkt mit Hilfe des QIAquick® PCR Purification Kits gereinigt. 45 Tabelle 4: Temperaturprogramm für die Kolonie-PCR:
Temperatur Taq Hot Star Taq® Zyklen 95°C 5 min 15 min 1 95°C 30 sec 30 sec 57°C 30 sec 30 sec 72°C 1 min 30 sec 1 min 30 sec 30 72°C 10 min 10 min 1 55 24 AT 501 955 B1 f) Genomische DNA-Isolierung aus Pichia pastoris:
Der gewünschte P. pastoris-Stamm wurde über Nacht in 5 ml YPD in einem sterilen 12 ml PP-Röhrchen in einer Rotationstrommel bei 30°C auf eine endgültige OD595 von 5-10 angezüchtet. 5 1,5 ml der Kultur wurden für die DNA-Isolierung mittels Easy-DNA™ Kit, entsprechend dem dazugehörigen Protokoll, verwendet. g) Protein-Bestimmung: io Lange Zeit wurde in der Biochemie die Messung der Proteinkonzentration in Lösung verwendet. Eine der Hauptanwendungen ist die Normalisierung einer breiten Palette von biochemischen Methoden auf die Gesamtproteinmenge, wie im vorliegenden Fall für die Sauerstoffverbrauchsraten. Die am meisten genützten Wege, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, sind die Methoden nach Bradford, Lowry und BCA™. Diese Methoden zeigen aber spezifische Limitie-15 rungen bezüglich der Sensitivität, des dynamischen Bereichs und der Kompatibilität mit bestimmten Reagenzien. Unter diesen 3 Assays sind jene von Bradford und Lowry zuverlässiger und reproduzierbarer als der mit BCA™. Andererseits zeigen Lowry und Bradford starke Limitierungen, wenn Detergenzien und/oder reduzierende Mittel anwesend sind, die meist in hohen Leerwerten resultieren. Deswegen ist nach einer chemischen Lyse der BCA™ Assay die Me-20 thode der Wahl. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels BCA™-Assay, nach der chemischen Zelllyse mit Y-Per® und BSA als Standard entsprechend den mitgelieferten Manuals (Pierce Biotechnology Inc.) bestimmt. Deswegen werden nachstehend nur kurz die wichtigsten Schritte beschrieben. 200 pl der Kulturen wurden bei 4000 UpM und 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet in 100 μΙ 25 Y-Per® durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Suspension wurde für 20 Minuten in 1,5 ml Mikroröhrchen in einem Thermomixer bei Raumtemperatur und 600 UpM inkubiert. Nach dem Pelletieren der Zellbruchstücke bei 13.200 UpM, Raumtemperatur für 10 Minuten, wurde der Überstand in ein neues Mikroröhrchen transferiert und bei 4°C für den BCA™ Assay oder für eine SDS-PAGE gelagert. 25 μΙ der Probe wurden in einer Mikrotiterplatte gut mit 200 μΙ 30 BCA™ Arbeits-Reagenz (Reagenz A:Reagenz B = 50:1) gemischt, für 30 Sekunden gründlich aufgeschüttelt und dann gut mit „Plate Sealers“ (Promega) abgedeckt. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37°C und dem Abkühlen auf Raumtemperatur, wurde die Absorption bei 562 nm mit Hilfe eines Spectramax Plus 384 Plate Readers bestimmt. Wenn nötig, wurden die Proben vor dem BCA-Assay mit ddH20 verdünnt. 35 h) SDS-PAGE:
Die Proben für die SDS-PAGE wurden wie im Abschnitt oberhalb beschrieben mittels chemischer Zelllyse (mit Y-Per® als Reagenz) präpariert. 10 μΙ des Lysats wurden mit 10 μΙ 2x SSB 40 (sigma sample buffer) gemischt und bei 95°C für 5-10 Minuten inkubiert, und 15 μΙ dieser Mischung wurden auf das Proteingel aufgetragen. Die Elektrophorese lief mit 180 V für ungefähr eine Stunde, und die Proteinbanden wurden mittels Coomassie™ blue-Färbung sichtbar gemacht.
Tabelle 5: Gelzubereitung für die SDS-PAGE
Sammelgel (4%) Trenngel (12%) ddH20 3,05 ml 3,35 ml 30% Acrylamid/bis 650 ul 4 ml 0,5 M Tris-HCI pH 6,8 1,25 ml 1,5 M Tris-HCI pH 8,8 2,5 ml 10% (w/v) SDS 50 μΙ 100 μΙ 55 25 AT 501 955 B1
Sammelgel (4%) Trenngel (12%) TEMED 5 μΙ 10 μΙ 10% APS 25 μΙ 50 μΙ i) Glukose-Assay:
Die Glukosekonzentrationen wurden mittels der Glukose-UV-Hexokinase-Methode ohne Deproteinisierung bestimmt (DIPRO med Handels GmbH, Weigelsdorf, Österreich, Prod. Nr. D590522). 50 μΙ der P/cft/'a-Kulturen wurden in eine PCR-Mikrotiterplatte transferiert und für 5 Minuten bei 4000 UpM zentrifugiert. Zu 190 μΙ Hexokinasereagenz in einer UV-Star-Mikrotiterplatte wurden 10 μΙ des Uberstandes hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Absorption bei 340 nm mit Hilfe des Spectramax Plus 384 Plate Readers bestimmt. j) Tüpfeltests: P. pastoris-Stämme wurden in BMD (1%) auf eine endgültige OD595 von 1,5 angezüchtet und in 10er Schritten auf eine Verdünnungsrate von 105 verdünnt. Der Transfer auf die Agarplatten erfolgte mit einem 48-Nadel-Stempel. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert, bis Kolonien sichtbar wurden (üblicherweise 2 Tage auf MD-Platten). k) Sequenzvergleiche:
Alle Sequenzvergleiche wurden mit Hilfe des MultAlin-Programmes auf der INRA-Homepage (Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich) (prodes.toulouse.inra.fr/ multalin/multalin.html) [17] oder mittels ClustalW des European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.ch/clustalw) [18] durchgeführt. Für den Sequenzvergleich mit MultAlin wurde immer die DNA-Sequenz-Ähnlichkeits-Matrix genutzt.
Gene des Methanol-Verwertungsweges und die meisten peroxisomalen Gene sind bezüglich Glukoserepression, Derepression bei Kohlenstoffmangel und Induktion durch Methanol in ähnlicher Weise reguliert. Für dieses Regulationsmuster sollte eine ähnliche transkriptionelle Regulation mit einem bestimmten Satz an Transkriptionsfaktoren (sowohl Repressoren als auch Induktoren) verantwortlich sein. Transkriptionsfaktorbindestellen innerhalb dieser Promotorregionen sollten einige konservierte Regionen aufweisen. Multiple Sequenzvergleiche zwischen Promotorregionen von co-regulierten Genen sollten die konservierten Bindestellen, der in der Regulation der entsprechenden Gene involvierten Transkriptionsfaktoren, aufzeigen. Mehrere Gene der methylotrophen Hefen P. pastoris, H. polymorpha und C. boidinii wurden als co-reguliert beschrieben und ihre Promotorsequenzen wurden isoliert (Tabelle 6).
Tabelle 6: Co-regulierte Gene des Methanol-Verwertungsweges bzw. peroxisomale Gene der methylotrophen Hefen P. pastoris, H. polymorpha und C. boidinii. Hefe Gen Enzym Genbank Acc. No. Literatur P. pastoris AOX1 Alkoholoxidase www.invitrogen.com AOX2 Alkoholoxidase X79871 ZZA1 Alkoholoxidase S62281 FLD1 Formaldehyd-Dehydrogenase AF066054 H. polymorpha MOX Methanoloxidase A11156 26 AT 501 955 B1
Hefe Gen Enzym Genbank Acc. No. Literatur DAS Dihydroxyaceton-Synthase A11168 CAT Katalase X56501 C. boidinii AOD1 Alkoholoxidase M81702 FLD1 Formaldehyd-Dehydrogenase AB085186 FDH1 Formiat-Dehydroqenase AB035095 DAS1 Dihydroxyaceton-Synthase AB035094 PMP20 peroxisomales Membranprotein AB035096 PMP47 peroxisomales Membranprotein AB035097 CTA1 Katalase AB064338 l) Transkriptionsfaktor-Analyse: 20 Die Transkriptionsfaktor-Analyse wurde mit dem Programm Mat-Inspector Release Professional 6.1 Jan. 2003 innerhalb der GenomatixSuite 1.6.1 am Genomatix Software GmbH Server [15] durchgeführt. Für die Suche nach Transkriptionsfaktor-Bindestellen wurde die PAOX1-Promotorsequenz aus pPICZ B und die Matrix Family Library Version 3.1.1 April 2003 und die Gruppe ALL fungi.lib (www.genomatix.de) verwendet. 25 m) Primer:
Tabelle 7: Liste der für die beschriebenen Beispiele verwendeten Primer (synthetisiert von MWG Biotech AG, Ebersberc , Deutschland) SEQ ID Nr. Name Sequenz Temp [°C] 2 P(AOX1 )forw AAGGTACCAG AT CTAACAT CCAAAG ACG AAAG 70 3 P(AOX1 )rev CTAGCCAT GGTT G AATT CTTT CG AATAAT -TAGTT GTTTTTTG 67 4 GFPZeo forw GAAAGAATTCAACCATGGCTAGCAAAGGAG 70 5 GFPZeo rev GAT GAT GGT CTAGAACGT GT CAGT CCTGCT CCT C 70 6 AOX1TT forw G ACACGTT CTAGACCAT CAT CAT CAT CAT CATT G 67 7 AOX1TT rev ATAGCGGCCGCACAAACGAAGGT CT C 72 8 AOX1A1forw CAACACCCACTTTAGGCTACTAACACCAT GACTTTAT -TAG 71 9 AOX1A1rev GTTAGTAGCCTAAAGT GGGT GTT G AGG AG AAG AG 70 10 AOX1A2forw GTT CAT GTTT GTAGAT GAGGGCTTT CT GAGT G 67 11 AOX1Ä2rev GCCCT CAT CTACAAACAT GAACCT CGCCAG 71 12 AOX1A3forw GAGGGCTTTCCCAAATGGCCCAAAACT G 70 13 AOX1A3rev CCATTT GGGAAAGCCCT CAT CT GGAGT G 70 14 AOX1A4forw CGGCCAGTT GTT GGTATT GATT GACG AATGC 69 15 AOX1A4rev CAATACCAACAACTGGCCGTTAGCATTT C 71 16 AOX1A5forw GCTT CT GAACCTT GT CT CCACATT GT AT GCTT C 68 17 AOX1A5rev GT GGAGACAAGGTT CAGAAGCGATAGAGAGAC 68 27 AT 501 955 B1 SEQ ID Nr. Name Sequenz Temp rq 18 AOX1A6forw GTCT CCACACT GCTG ATAG CCTAACGTT C 66 19 AOX1A6rev GGCTAT CAGCAGT GTGGAGACAAT GCATAAT CAT C 71 20 AOX1A7forw GG AATACT GCT CTAACCCCTACTT G ACAGC 65 21 AOX1Ä7rev GTAGGGGTTAGAGCAGTATT CCCACCAG AAT C 67 22 AOX1A8forw CTT GACAGCAAGCTGCCCT GTCTTAAACC 66 23 AOX1A8rev GGGCAGCTT GCT GT CAAGTAGGGGTTAG 68 24 AOX1A9forw CT GTCTTAAACCTTACT GGTT CCAATT GACAAGC 68 25 AOX1A9rev GGAACCAGTAAGGTTTAAGACAGGGCAGC 69 26 423forw GATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAG-GACCTCCACTCC 87* 27 1372forw GT GAAGGT GAT GCTACATACGGAAAGCTTACCCTTA-AATTTATTT GC 81* 28 2325forw CGTGGCCGAGGAGCAGGACT GACACGTT CTAGAC-CATCATC * CO 00 29 AOX1 col TCCAAAGACGAAAGGTT GAAT G 72 30 GFPrev CCGTATGTAGCAT CACCTT CACC 74 * Temp. wurde mittels Gleic hung 2 aus dem QuikChange® multi site-directed mutagenesis kit 25 berechnet
Beispiel 1.1: Klonierung des Reporterkonstrukts
Als Reporter für die Genexpression wurde GFP-Zeo unter der Kontrolle von AOX1-30 Promotorvarianten verwendet. Um die Minimalerfordernisse der Kozak-Konsensussequenz für hoch exprimierte Gene in Hefen zu erfüllen, wurden Sequenzen um das ATG-Startcodon konstruiert. Für den Austausch der Promotorregionen vor dem GFP-Zeo-Gen wurde mittels Over-lap-Extension-PCR eine EcoRI Restriktionsstelle eingefügt (Tabelle 8). 35 Tabelle 8: Vergleich der Translations-Initiationsstelle und ihrer umgebenden Sequenzen zwischen der in diesem Beispiel verwendeten AOXf-Sequenz (von pPICZ abgeleitet) und der AOXf-Sequenz des P. pastoris-Stammes NRRL Y-11430 (Genbank AN: U96967, [2]). Die EcoRI-Schnittstelle ist unterstrichen und die minimalen Kozak-Erfordernisse an Position -3 und +4 sind fett gedruckt. P(AOX1 )-GFP AAAACAACTA ATTATTgaAa -3 gaattcAACc +1 +4 ATGGCTAgCa AOX1 (U96967) AAAACAACTA ATTATTcgA- ------AACg ATGGCTAtCc 40 _ 45 PCR-basierende Produktion der Reportersystem-Komponenten: P(AOX1) wurde mit 10 ng des Vektors pPICZ-B ARS1 als Template amplifiziert. Der Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 50 pl enthielt außerdem 10 pmol von jedem Primer so (P(AOXf)forw bzw. P(AOXf)rev), 200 μΜ jedes dNTP's und 2,5 E Synergy™ Polymerase in den geeigneten Pufferbedingungen.
Der AOXf-TT wurde ähnlich dem AOXf-Promotor amplifiziert. Als Primer wurden AOXITTforw und AOXITtrev für diese Reaktion verwendet. Beide PCR-Reaktionen wurden in einem Ther-mocycler für 30 Zyklen (95°C, 1 min; 55°C, 30 s; 68°C, 2 min 30 s) durchgeführt, mit einem 55 28 AT 501 955 B1 ersten Denaturierungsschritt für 5 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt von 10 min bei 68°C. 2 μΙ der ersten PCR-Runde wurden für die Amplifikation in einer zweiten Runde unter den selben Bedingungen wie oben verwendet. Der einzige Unterschied war eine Erhöhung der Extensions-Temperatur auf 72°C. 5 GFP-Zeo [19] wurde unter Verwendung von 25 ng des Vektors pTracer™-CMV2 als Template amplifiziert. Der Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 50 μΙ enthielt außerdem 10 pmol von jedem Primer (GFP-Zeo forw bzw. GFP-Zeo rev), 200 μΜ jedes dNTP's und 2,5 E Synergy™ Polymerase in geeigneten Pufferbedingungen. Die PCR wurde in einem Thermocycler io (siehe Tabelle 8) 30 Zyklen lang (95°C, 1 min; 55°C, 30 s; 72°C, 2 min 30 s) durchgeführt, mit einem ersten Denaturierungsschritt für 5 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt von 10 min bei 72°C.
Alle PCR-Produkte wurden vor der Overlap-Extensions-PCR mittels Agarose-Gelelektrophorese 15 gereinigt. Der Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 50 μΙ enthielt 10 ng P(AOX1), 5 ng AOX1TT und 50 ng GFP-Zeo als Templates, wie oben beschrieben hergestellt, 200 μΜ jedes dNTP's und 2,5 E Synergy™ Polymerase in geeigneten Pufferbedingungen. Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Thermocycler (siehe Tabelle 8) für 30 Zyklen (95°C, 1 min; 53°C, 50 s; 68°C, 3 min 30 s), mit einem ersten Denaturierungsschritt für 5 min bei 95°C und einem 20 letzten Verlängerungsschritt von 10 min bei 68°C. Nach 10 Zyklen wurden 10 μΙ eines Gemisches von je 10 pmol der Außenprimer P(AOX1)forw und AOXITTrev, wiederum 200 μΜ jedes dNTP's und 2,5 E Synergy™ Polymerase in geeigneten Pufferbedingungen zugesetzt. Nach dieser Zugabe wurde die PCR, wie ursprünglich programmiert, fortgesetzt. Das erhaltene PCR-Produkt, mit einer erwarteten Größe von etwa 2,4 kb, wurde über ein Agarosegel aufgereinigt. 25 Das gereinigte Produkt wurde in einen pCR®4Blunt-TOPO® Vektor kloniert und sequenziert. Die Sequenzierung ergab 4 Mutationen und 1 Deletion innerhalb des Reporterkonstrukts.
Die Basenpaar-Deletionsstelle befand sich an Position -15 der ursprünglichen Promotorsequenz. Weil sich diese Stelle innerhalb der Multiple-Cloning-Site aller pPICZ-Vektoren (A, B und 30 C; innerhalb der Sft/I-Restriktionsstelle) befindet, sollte die Deletion keinen Einfluss auf die Promotoraktivität haben und wurde deshalb nicht korrigiert. Die erste Mutation (T-->C) wurde an Position -828 in der Promotorregion gefunden. Die anderen 3 Mutationen fand man innerhalb der GFP-Zeo kodierenden Sequenz an Position +122, +507 bzw. +1075. 35 Die G-->A Konversion an der Position +122 verändert das GGA-Codon von Gly in ein GAA-Codon, wodurch ein G41A-Aminosäurenaustausch entsteht. Die T-->C Konversion an Position +507 ist eine stille Mutation, die nur ein Codon von R169 ändert. Die letzte Mutation (T-->C) an Position +1075 ändert das TGA-Stopcodon in das Arginincodon CGA. Die Mutationen -828, +122 und +1075 wurden mittels QuikChange® multi site-directed mutagenesis Kit nach der 40 Konstruktion des pAOX-Vektors repariert. Die stille Mutation an Position +507 und die Mutation im Polylinker wurden nicht verändert, weil kein seltenes Codon eingeführt wurde. pAOX wurde konstruiert, indem mit Kpn\ und Λ/ofl das PAoxi-GFP-Zeo-AOX1TT-Fragment aus dem pCR®4Blunt- TOPO® Vektor herausgeschnitten, und in den pBlueScript® SK-Vektor 45 zwischen die Kpn\ und Λ/ofl-Stelle eingefügt wurde.
Die gefundenen Mutationen im AOX1-Promotor und in der GFP-Zeo-Sequenz wurden mit Hilfe des QuikChange® multi site-directed mutagenesis Kits (Stratagene, Amsterdam, Holland) korrigiert. Die PCR-Reaktion wurde entsprechend dem mitgelieferten Manual durchgeführt, enthielt so in einem Endvolumen von 25 μΙ 100 ng pAOX, je 100 ng der Mutagenese-Primer (423forw, 1372forw bzw. 2325forw) und 1 μΙ QuikChange® Multi-Enzym-Gemisch in entsprechenden Pufferbedingungen. Die Durchführung erfolgte in einem Thermocycler für 30 Zyklen (95°C, 1 min; 55°C, 1 min; 65°C, 10 min 30 s), mit einem ersten Denaturierungschritt für 1 min bei 95°C. Der Dpnl-Verdau und die chemische Transformation in E. coli XL10-GOLD® (Invitrogen 55 Corp.)-Zellen wurde entsprechend dem mitgelieferten Manual durchgeführt. Die Korrektur aller 29 AT 501 955 B1 3 Mutationen wurde mittels Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 1.2: Konstruktion der AOXf-Promotordeletionen 5 Die linken Arme des AOXf-Promotors wurden mit Hilfe des Forward-Primers P(AOX1)forw und der Reverse-Primer ΑΟΧΔη rev (n=1...9) synthetisiert. Die rechten Arme wurden mit 10 pmol ΑΟΧΔη forw (n=1...9) als Forward-Primer und P(AOX1)rev als Reverse-Primer synthetisiert. Alle Arme wurden unter Verwendung von 12 ng des Vektors pAOX als Template und 10 pg jedes Primers synthetisiert. Die Reaktion enthielt in einem Endvolumen von 50 pl außerdem io 10 pmol jedes Primers, 200 μΜ von jedem dNTP und 0,6 E Pwo DNA-Polymerase im entsprechenden Pufferbedingungen. Die PCR wurde in einem Thermocycler für 30 Zyklen (95°C, 1 min; 55° C, 1 min; 68°C, 1 min 30 s) durchgeführt, mit einem ersten Denaturierungsschritt für 5 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt für 10 min bei 68°C. Alle Arme wurden vor der Verwendung als Template für die Overlap-Extensions-PCR über ein Agarosegel aufge-15 reinigt.
Tabelle 9: Overlap-Primer-Paare und Armlängen für die Promotordeletionen
Konstrukt Linker Arm Rechter Arm Interner Primer Armlänge [bp] Interner Primer Armlänge [bp] ΡΑΟΧ1Δ1 ΑΟΧΔ1 rev 184 ΑΟΧΔ1 forw 738 ΡΑΟΧ1Δ2 ΑΟΧΔ2 rev 315 ΑΟΧΔ2 forw 624 ΡΑΟΧ1Δ3 ΑΟΧΔ3 rev 374 ΑΟΧΔ3 forw 578 ΡΑΟΧ1Δ4 ΑΟΧΔ4 rev 519 ΑΟΧΔ4 forw 421 ΡΑΟΧ1Δ5 ΑΟΧΔ5 rev 636 ΑΟΧΔ5 forw 290 ΡΑΟΧ1Δ6 ΑΟΧΔ6 rev 708 ΑΟΧΔ6 forw 247 ΡΑΟΧ1Δ7 ΑΟΧΔ7 rev 742 ΑΟΧΔ7 forw 209 ΡΑΟΧ1Δ8 ΑΟΧΔ8 rev 794 ΑΟΧΔ8 forw 171 ΡΑΟΧ1Δ9 ΑΟΧΔ9 rev 833 ΑΟΧΔ9 forw 115 40 45
Die Reaktion enthielt in einem Endvolumen von 50 μΙ 10 ng von jedem Arm, deren Präparation oben beschrieben wurde, als Template, 200 μΜ von jedem dNTP und 0,6 E Pwo DNA-Polymerase in entsprechenden Pufferbedingungen. Die PCR wurde in einem Thermocycler für 30 Zyklen (95°C, 45 s; 60°C, 45 s; 68°C, 2 min) durchgeführt, mit einem ersten Denaturierungsschritt für 5 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt für 10 min bei 68 °C. Nach 10 Zyklen wurden 20 μΙ eines Gemisches von 10 pmol der Außenprimer P(AOX1)forw und P(AOX1 )rev, wiederum 200 μΜ jedes dNTP's und 0,6 E Pwo DNA Polymerase in den geeigneten Pufferbedingungen zugesetzt. Nach Zugabe der Mischung wurde die PCR, wie ursprünglich programmiert, fortgesetzt.
Die erhaltenen PCR-Produkte mit einer erwarteten Größe von etwa 898-947 bp wurden über ein Agarosegel gereinigt und in den Vektor pCR®4Blunt-TOPO® (Δ2, Δ4, Δ5, Δ7 und Δ8) oder in den Vektor pCR®-Blunt ll-TOPO® (Δ1, Δ3, Δ6 und Δ9) kloniert und sequenziert. 50
Die ρΑΟΧΔ-Vektoren wurden konstruiert, indem die PAoxi Δ-Frag mente aus den TOPO®-Vektoren mit BglW und EcoRI herausgeschnitten wurden und in den pAOX-Vektor zwischen die BglW- und EcoRI-Stelle anstelle des Wildtyp-AOX1-Promotors eingefügt wurden. Die entstandenen Vektoren wurden wieder durch Sequenzierung verifiziert. 55 30 AT 501 955 B1
Beispiel 1.3: Pichia pastoris Transformation und Analyse der Transformanten
Die Pichia pastoris-Transformation wurde wie bereits früher beschrieben durchgeführt. Die Selektion auf Integration von PAoxi(oder PAoxiA)-GFP-Zeo-AOX1 TT wurde durchgeführt, indem 5 die transformierten und regenerierten Pichia-Zellen in Aliquots auf MSM-Zeo-Platten ausplattiert wurden.
Die Pichia pastoris-Stämme wurden in Deepwell-Platten, welche 300 pl BMD (1%) pro Well enthielten, bei 28°C, 320 UpM und 80% Luftfeuchtigkeit für 60 Stunden bei Raumtemperatur io kultiviert. Nach dieser Zeit, wurden 50 μΙ für die Bestimmung der GFP-Fluoreszenz entnommen. Die Induktion wurde durch die Zugabe von 250 μΙ BMM2/Well und anschließender weiterer Inkubation für 72 h durchgeführt. Nach 10, 24 und 48 Stunden wurde Methanol durch Zugabe von 50 μΙ BMM10 wieder aufgefüllt. Nach 72 h Methanolinduktion wurde wiederum die GFP-Fluoreszenz gemessen. 15
Analyse der Reporterenzym-Expression: die Expression von GFP-Zeo in Pichia pastoris wurde durch Fluoreszenzdetektion des GFP's im Spectramax Gemini XS Plate Reader mit einer Anregung bei 395 nm und einer Emission bei 507 nm analysiert. 50 μΙ der P. pastoris-Kulturen, die in Deepwell-Platten, wie oben beschrieben, kultiviert worden waren, wurden 1+3 mit ddH20 in FIA-20 Mikrotiterplatten verdünnt. Wegen der limitierten Probenmenge wurden nur Einzelmessungen durchgeführt. Alle beschriebenen Mittelwerte ± Standardabweichungen wurden von zumindest 3 unterschiedlichen Kulturen (Wells) kalkuliert.
Wenn die Integrationskassette im AOXf-Locus integriert ist, ohne das AOX1-Gen zu ersetzen, 25 ist der rekombinante Pichia-Stamm fähig, auf Methanol mit einer Wildtyp-Wachstumsrate zu wachsen, während ein Ersatz des AOXf-Gens durch ein doppeltes Crossover-Ereignis zu einer viel niedrigeren Wachstumsrate auf Methanol führt. Diese beiden Wachstums-Phänotypen werden Methanol-Verwertung plus (methanol utilisation plus, Mut+) bzw. Methanol-Verwertung slow (methanol utilisation slow, Muts) genannt. Für die Analyse des Methanol-Verwertungs-30 Phänotyp, wurden Pichia pastoris Mikrokulturen auf MM- und MD-Agarplatten mit Hilfe eines 96-Nadel-Stempels übertragen und bei 30°C 2 Tage lang inkubiert. Nach 2 Tagen werden auf beiden Platten Kolonien sichtbar, wenn der Pichia-Stamm den Mut+-Phänotyp hat, während bei Stämmen mit Muts-Phänotyp nur auf MD-Platten Kolonien erscheinen. 35 Es wurden alle Pichia-Stämme, welche durch Transformation von pAOX oder von einem der ρΑΟΧΔ-Plasmide entstanden sind, mittels Kolonie-PCR analysiert, und die Deletionskonstrukte wurden außerdem noch sequenziert, um die Promotorsequenz vor dem Reportergen (GFP-Zeo) abzusichern. 40 Beispiel 1.4: Gelenkte Evolution des AOX1-Promotors Während die PCR-Mutagenese an codierenden Regionen der Gene weit entwickelt und etabliert ist, ist nichts bekannt über die Mutagenese an Promotorregionen. Aufgrund des fehlenden Wissens wurden mehrere Mutagenesebedingungen ausgetestet: um eine Bevorzugung im 45 Mutations-Spektrum zu minimieren, wurden 2 verschiedene Polymerasen verwendet, eine Taq-DNA-Polymerase und die Mutazyme® DNA Polymerase (Stratagene Inc.). Weil ein Wissen über die Mutationsfrequenz zur Evolution von Promotorsequenzen komplett fehlt, wurden mehrere Mutationsfrequenzen (theoretisch 1 bis ~14/kb) ausgetestet. 50 Mutagenese mit Hilfe der Hot Star Taq® DNA Polymerase: Die mutagene PCR wurde an der Promotorsequenz in einem Reaktionsvolumen von 100 μΙ, wie in [20] beschrieben, durchgeführt. Der Reaktionsansatz enthielt 12 ng pAOX, 40 pmol von jedem Primer ((P (AOXI)forw und P(AOX1)rev), dNTP's (200 μΜ dGTP, 200 μΜ dATP, 1 mM dTTP, 1mM dCTP) und 5 E Hot Star Taq® DNA-Polymerase in geeigneten Pufferbedingungen. Die MgCI2-Konzentration wurde auf 55 7 mM (normalerweise 3 mM) erhöht, um die Fehlerhäufigkeit der Polymerase zu verändern. Die 31 AT 501 955 B1 PCR wurde in einem Thermocycler für 30 Zyklen (95°C, 45 s; 55°C, 45 s; 72°C, 1 min 30 s) durchgeführt, mit einem ersten Denaturierungsschritt für 15 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt für 10 min bei 72°C. 5 Der GeneMorph® Random-Mutagenese-Kit wurde entsprechend dem mitgelieferten Manual auf die Promotorsequenz in einem Endvolumen von 50 pl angewendet. Verschiedene Mengen des Vektors pAOX wurden als Template verwendet (siehe Tabelle 10). Es wurden 12,5 pmol von jedem Primer, P(AOX1)forw und P(AOX1)rev, verwendet. Die PCR wurde in einem Thermocycler für 30 Zyklen (95°C, 30 s; 55°C, 30 s; 68°C, 1 min 30 s) durchgeführt, mit einem ersten io Denaturierungsschritt für 1 min bei 95°C und einem letzten Verlängerungsschritt für 10 min bei 68°C.
Tabelle 10: Verwendete Template-Menge in der GeneMorph® PCR Reaktion
Nr. Mutationsfrequenz Menge an pAOX Erwartete Mutationen/kb 1 Niedrig-Mittel 12 ng -3 oder weniger 2 Mittel 1,2 ng 3-7 3 Mittel-Hoch 120 pg ~7 oder mehr
Eine erste Mutageneserunde wurde nach den oben beschriebenen Bedingungen (Taq, 3x GeneMorph®) durchgeführt. Um eine höhere Mutationsfrequenz zu erreichen, wurde die Ge-neMorph®-Reaktion #3 als Template für eine zweite PCR-Runde verwendet. Die Taq- und 25 GeneMorph®-Bedingungen #2 und #3 wurden verwendet.
Vor der Transformation in Pichia pastoris X-33 GFP-Zeo Muts A9-Zellen wurden alle PCR-Reaktionen, wie früher beschrieben, ausgefällt und entsalzt. Die Transformation und Regeneration fand laut Standardprotokoll statt. Die Selektion der in Glukosemedium induzierten Promoto-30 ren erfolgte, indem 150 pl Aliquots der transformierten Zellsuspension auf MD-Agarplatten, welche 100-500 pg/ml Zeocin™ enthielten, verteilt und bei 30°Cfür2 Tage inkubiert wurden.
Beispiel 1.5: Ergebnisse und Diskussion 35 I) Charakterisierung des Reportersystems
Bis heute sind in der Molekularbiologie eine große Vielfalt von GFP-Varianten in Verwendung. Obwohl sie sich nur durch einige Punktmutationen unterscheiden, weichen ihre Eigenschaften enorm voneinander ab. Abgesehen von verbesserten Faltungseigenschaften, unterscheiden 40 sich ihre Fluoreszenzspektren wie auch ihre Quantenausbeuten und die damit verbundenen Intensitäten beträchtlich. Grün-fluoreszierende Proteine können in zwei Hauptgruppen, abhängig von ihrem Anregungsmaximum, eingeteilt werden: Wildtyp-GFP-Varianten mit einem Anregungsmaximum bei 395 nm und einem kleineren Maximum bei 470 nm, und ins Rote verschobene GFP-Varianten mit einem Anregungsmaximum bei 480-490 nm. Entsprechend seiner 45 Aminosäuresequenz gehört das „cycle-3-GFP“ zu der Gruppe der Wildtyp-GFP-Varianten mit einem Anregungsmaximum bei 395 nm.
Um bei Expression in Pichia pastoris die Spektraleigenschaften zu kontrollieren, wurden die Fluoreszenzspektren bestimmt. Das Gesamt-Anregungsmaximum des cycle-3-GFP in GFP-Zeo so liegt bei 395 nm, während das zweite Maximum bei 478 nm verschwindend klein ist. Das Emissionsspektrum zeigt ein Emissionsmaximum bei 510 nm. Von den zwei im Manual empfohlenen Anregungswellenlängen wurde 395 nm bevorzugt und für alle weiteren Messungen verwendet.
Die Eigenabsorption ist ein sehr häufiges Phänomen in der Fluoreszenzspektroskopie. Bei 55 höheren Fluorophor-Konzentrationen, können die emittierten Photonen in einer das Absorpti- 32 AT 501 955 B1 ons-(Anregungs-)Spektrum überlappenden Region, absorbiert werden (Strahlungsenergietransfer). Eine geringere Fluoreszenzintensität wird beobachtet, wenn eine Eigen-Absorption („emis-sion inner filter effect“) passiert. Dies führt zu einer Unterschätzung der Promotoraktivitäten. Ohne „inner filter effect“ steigt die Fluoreszenzintensität linear an, entsprechend der Zunahme 5 an Fluorophor. So wurden zunehmende Mengen von GFP-Zeo exprimierenden Pichia pastoris-Zellen auf ihre Fluoreszenzaktivität getestet.
Bei Werten bis zu 3000 RFE konnte auf Zellebene kein "emission inner filter effect" beobachtet werden. Die durch Akkumulation des GFP's verursachte Eigen-Absorption innerhalb der Zellen io konnte nicht bewertet werden. Über die ganze 72-stündigee Induktionsphase wurde ein linearer Anstieg der Fluoreszenz nachgewiesen. Aus diesem Grund scheint ein "inner filter effect" innerhalb der Zellen nicht sehr wahrscheinlich. Folglich stellt die Akkumulation von GFP-Zeo innerhalb des Nukleus kein Problem für seine Quantifizierung dar. Es gibt keinen "inner filter effect" im Rahmen der Single-Copy-Promotoraktivitäten, welche in dieser Studie bestimmt wurden. 15 Wegen der fehlenden Eigen-Absorption ist eine Unterschätzung der Promotoraktivitäten unwahrscheinlich. Der von anderen beobachtete "inner filter effect" wird höchstwahrscheinlich durch die Verwendung einer anderen GFP-Variante, mit viel kleinerem "Stokes shift" und der damit verbundenen überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren, verursacht. Beim Vergleich der Resultate von GFP-Experimenten muss man vorsichtig sein. Die Verwendung mehre-20 rer GFP-Varianten mit verschiedenen Spektraleigenschaften, aber auch mit optimierten Codon-Verwendungen und den dadurch entstehenden unterschiedlichen Expressionsleveis in verschiedenen Expressionswirten, verkompliziert die Vergleichbarkeit der Resultate verschiedener Labors. 25 II) AOXf-Promotoraktivität im Mikromaßstab
Die Kultivierung mikrobieller Zellen (z.B. Hefe, Bakterien) in kleinem Maßstab passiert üblicherweise in Schüttelkolben-Kulturen. Die Inokulation und Kultivierung in Schüttelkolben von großen mikrobiellen Bibliotheken ist arbeits- und zeitintensiv und führt zu hohen Kosten. In den letzten 30 Jahren wurden „Microscale“ (Mikrokultur)-Kultivierungssysteme unter der Verwendung von Deepwell-Mikrotiterplatten als Alternative entwickelt. Wegen der Möglichkeit der gleichzeitigen Bearbeitung von z.B. 96 oder 384 Stämmen/Kulturen und dem geringeren Materialverbrauch sind Mikrotiter-Systeme den Schüttelkolben in Bezug auf die Arbeits-, Zeit- und daher Kostenintensität überlegen. Aus mehreren Gründen sind die größten Nachteile der Mikrotiter-Systeme, 35 wie kleine Probenvolumina und geringe Durchlüftungseffizienz, weniger relevant: (1) die technischen Fortschritte bei analytischen Systemen führen zu geringeren Detektionslimits vieler Verbindungen, weshalb nur mehr sehr geringe Probenvolumina notwendig sind; (2) die Methoden und Geräte für die Kultivierung in Deepwell-Mikrotiter-Platten wurden ebenfalls verbessert. Es hat sich in einigen Studien gezeigt, dass die Belüftungsraten und die damit verbundenen 40 Wachstumsbedingungen in Mikrotiterplatten den Bedingungen in Schüttelkolben ähnlich sind. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Real-Time-Studien des GAL1-Promotors in S. cere-visiae mit cycle-3-GFP als Reporterprotein mit Schüttelkolbenstudien sehr gut übereinstimmen.
Die vom AOXf-Promotor angetriebene GFP-Zeo-Expression wurde wie oben beschrieben in 45 Deepwell-Platten untersucht. Nach dem Zellwachstum auf Glukose, folgte eine Induktionsphase mit Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Induktion des AOX1-Promotors mit Methanol in Pichia pastoris-Zellen, welche die PAOX1-GFP-Zeo-AOX1 TT-Expressionskassette tragen, führte zu einem schnellen Anstieg der GFP-Fluoreszenz. Bis zu 72 h stieg die GFP-Fluoreszenz linear an. Die Expression des GFP-Zeo würde nach weiterer Methanolzugabe so fortgesetzt werden. Wenn nicht, verringert sich die Methanolkonzentration durch Verdunstung und Verbrauch innerhalb von 24 h und die GFP-Zeo-Expression vermindert sich auf eine de-reprimierte Ebene.
Der Anstieg der GFP-Zeo-Fluoreszenz stimmte mit dem Anstieg des GFP-Zeo-Proteins überein, 55 wie durch eine SDS-PAGE gezeigt werden konnte. Nach der Methanolinduktion schien eine 33 AT 501 955 B1
Proteinbande bei etwa 42 kDa auf, welche bei steigender Fluoreszenz stärker wurde. Die starke Bande bei 42 kDa wurde in allen GFP-Zeo-Klonen gefunden, während bei der Negativkontrolle (X-33 Wildtyp) keine Bande aufschien. In der Probe des Stammes X-33 d6*F10 konnte nach 72 Stunden Methanolinduktion ebenfalls eine starke Bande gefunden werden (Fig. 1C, Spur 5). 5 Obwohl nicht normalisiert, ist eine eindeutige Korrelation zwischen den Intensitäten der 42 kDa-Banden und den entsprechenden Fluoreszenzleveis abschätzbar. III) Transkriptionsfaktor-Bindestellen io Wie bereits früher beschrieben, sind die Consensussequenzen der Bindestellen von mehreren Transkriptionsfaktoren bekannt. Die Sequenzanalyse der AOXI-Promotorsequenz offenbarte mehrere mögliche Transkriptionsfaktor-Bindestellen, mit einigen Treffern von besonderem Interesse. Neben dem Hitzeschock-Faktor- und dem Stress-Response-Element-Motiv wurden Bindestellen einiger Transkriptionsfaktoren gefunden, die bekanntermaßen an der Glukoseregu-15 lation beteiligt sind. Die interessantesten Bindestellen wurden in Tabelle 11 und Fig. 2 zusammengefasst. 20
Tabelle 11: Transkriptionsfaktor (TF)-Bindestellen, die innerhalb der AOXf-Promotorsequenz gefunden wurden. Basenpaare in Großbuchstaben bezeichnen die Kernsequenz (die 4 am höchsten konservierten, aufeinander folgenden Reste der Matrix), unterstrichene Basenpaare 25 30 35 40 45 50 TF Matrix Position (5)* Dele tionsva riante Kern- Ähnlichkeit Matrix- Ähnlichkeit Sequenz Seq ID Nr. HAP1.01 52-66 (-902 bis -888) 1,000 0,802 ctgfggafgt- CGGAt 31 HSF.01 135 bis 155 (-819 bis -799) 1,000 0,784 AGAAgag- gagtggaggt cctg 32 HAP234.01 193 bis 205 (-761 bis -749) Δ1 1,000 0,895 caagcC- CAAtaac 33 HAP234.01 203 bis 215 (-751 bis -739) Δ1 1,000 0,923 gagctC- CAAtcaa 34 ABAA.01 213 bis 227 (-741 bis -727) Δ1 1,000 0,949 ctcgct- CATTccaat 35 STRE.01 279 bis 287 (-675 bis -667) 1,000 1,000 ccAGGGgg 9 36 RAP1.01 332 bis 346 (-622 bis -608) Δ2 1,000 0,845 tacACCC-gaacatca 37 ADR1.01 371 bis 377 (-583 bis -577) Δ3 1,000 1,000 tGGGGtc 38 HSF.03 516 bis 536 (-438 bis -418) Δ4 1,000 0,862 AGAAacttc- caa- aagtcggc 39 HAP234.01 665 bis 677 (-289 bis -277) Δ5 1,000 0,883 atcatCCAA- aaag 40 55 5 34 AT 501 955 B1 10 TF Matrix Position (5)* Dele tionsva riante Kern- Ähnlichkeit Matrix- Ähnlichkeit Sequenz Seq ID Nr. MAT1MC.01 680 bis 690 (-274 bis -264) 1,000 0,901 tflf- caTTGTctc 41 GCR1.02 699 bis 713 (-255 bis -241) Δ6 1,000 0,872 a tgCTT-Ccaagattc 42 QA-1F.01 743 bis 763 (-211 bis Z19Ü_ Δ7 0,785 0,775 acagt- faaatttT- GATcatga 43
Die angegebene Position ist in Bezug auf den Translationsstartpunkt (ATG) des GFP-Zeo-Gens markiert; die Kernsequenzen von möglichen Transkriptionsfaktor-Bindestellen sind in Großbuchstaben dargestellt c bedeutet Homologie zum komplementären Strang 15 IV) Regulatorische Sequenzen in Methanol-regulierten Genen 20 In der Literatur sind mehrere Sequenzen beschrieben, die an der Regulation von methanolindu-zierbaren Genen beteiligt sind. Basierend auf Deletionsanalysen des P. pastoris AOX2-Promotors wurden drei regulatorische Regionen beschrieben, zwei negativ wirkende Regionen (URS1 und URS2, upstream repression sequences) und eine positiv wirkende Domäne (UAS, upstream activation sequence) [3]. Für den H. polymorpha MOX-Promotor wurden ebenfalls 25 zwei Upstream-Aktivator-Sequenzen (UAS1 und UAS2) und eine Repressorbindestelle (URS1) beschrieben [8]. V) Deletionskonstrukte des AOXf-Promotors 30 Basierend auf der Transkriptionsfaktor-Analyse und auf den multiplen Sequenzvergleichen, wurden 9 Promotorregionen für eine Deletion mittels Overlap-Extension-PCR (siehe oben) ausgewählt. Die AOXf-Promotor-Deletionskonstrukte wurden in der Weise in den Vektor pAOX kloniert, dass der Wildtyp-AOX1-Promoter 5 für das Reporter-Gen GFP-Zeo ausgetauscht wurde. Die Plasmide wurden linearisiert und in das Pichia pastoris Genom integriert. 35
Tabelle 12: Deletierte Sequenzen in AQXf-Promotorkonstrukten 40 45 50
Konstrukt Posi tion* Sequenz Seq ID Nr. 5' Ende 3'Ende ΡΑΟΧ1Δ1 170 -784 235 -719 tttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattg- gagctcgctcattccaattccttcta 44 ΡΑΟΧ1Δ2 304 (-650) 350 (-604) ttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacat- cactcc 45 ΡΑΟΧ1Δ3 364 (-590) 393 (-561) ctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttc 46 ΡΑΟΧ1Δ4 509 (-445) 551 (-403) gtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgt 47 ΡΑΟΧ1Δ5 625 (-329) 683 (-271) ccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaa- cacccgctttttggatgattatgca 48 ΡΑΟΧ1Δ6 694 (-260) 723 (-231) attgtatgcttccaagattctggtgggaat 49 ΡΑΟΧ1Δ7 729 (-225) 763 (-191) tgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgt 50 55 35 AT 501 955 B1
Konstrukt Posi tion* Sequenz Seq ID Nr. 5' Ende 3'Ende ΡΑΟΧ1Δ8 784 (-170) 800 (-154) aatatataaacagaagg 51 ΡΑΟΧ1Δ9 823 (-131) 861 (-93) tttttttatcatcattattagcttactttcataattgcg 52 * Die angegebenen Positionen sind in Bezug auf die Seq ID Nr. 1 markiert 10
Die Integranten wurden wie oben beschrieben auf GFP-Zeo-Expression und auf die Integration der korrekten Promotorsequenz vor dem GFP-Zeo-Gen analysiert. Single-Copy-Integranten wurden genauer in Bezug auf ihr GFP-Zeo-Expressionslevel in verschiedenen Kohlenstoffquel-15 len im Mikromaßstab analysiert. Bei allen Konstrukten (Deletion und Wildtyp) konnte keine GFP-Fluoreszenz festgestellt werden, solange sich Glukose oder Glycerin im Medium befand (mit und ohne Methanol). Auf Kohlenstoffmangel, welcher dereprimierende Bedingungen vertritt, konnte eine geringe Erhöhung der GFP-Fluoreszenz gemessen werden. Verglichen mit dem Wildtyp zeigten einige Promotorvarianten auffallende Unterschiede (Fig. 3). Eine signifikant 20 geringere Promotoraktivität unter dereprimierenden Bedingungen fand man in 6 Konstrukten (Δ3, Δ4, Δ5, Δ7, Δ8 und Δ9, siehe Fig. 3). Δ1 zeigte Wildtypaktivität, während die Konstrukte Δ2 und Δ6* zu einer signifikant höheren GFP-Zeo-Expression führten. Der Expressionslevei des letzteren war auffallend höher als der Wildtyp-Level. 25 Nach der Methanolinduktion zeigten alle Varianten mit nur einer Ausnahme eine signifikant geringere Promotoraktivität: Δ1 zeigte eine rund 20% höhere Aktivität als der Wildtyp. Wie in Fig. 4 ersichtlich, ist die Verringerung der Aktivität aller anderen Varianten sehr signifikant.
Die Promotoraktivität aller Varianten und der Wildtyp-Konstrukte, normalisiert auf die methanol-30 induzierte Wildtyp-Aktivität, ist in Tabelle 13 zusammengefasst.
Tabelle 13: Fluoreszenzintensität der AOXf-Promotorvarianten im Mikromaßstab. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von 4 unabhängigen Messungen. Die Fluores-35 zenzintensität nach 72 h Methanolinduktion des WT-Promotors (100%) beträgt 987±81. Solan- ge sich Glukose im Medium bei and, konnte keine Fluoreszenz festgestellt werden. Konstrukt Relative Fluoreszenzintensität [%] Derepression Methanol PAOX1 2,8 ±0,1 100 ΡΑΟΧ1Δ1 3,0 ± 0,5 120 ±12 ΡΑΟΧ1Δ2 4,4 ± 0,8 40 ±3 ΡΑΟΧ1Δ3 0,7 ± 0,2 68 ±8 ΡΑΟΧ1Δ4 1,9 ±0,1 72 ±4 ΡΑΟΧ1Δ5 0,23 ± 0,04 30 ±4 ΡΑΟΧ1Δ6* 9,1 ±0,6 42 ±2 ΡΑΟΧ1Δ7 2,2 ± 0,4 31,3 ±0,5 ΡΑΟΧ1Δ8 0,3 ± 0,2 17,1 ±0,7 ΡΑΟΧ1Δ9 1,3 ±0,1 61 ±3 55 36 AT 501 955 B1
Die Deletion der TATA-Box im Konstrukt Δ8 führte zu einer massiven Zerstörung des Promotors mit einer starken Verringerung der Aktivität, unter dereprimierenden und induzierenden Bedingungen von ungefähr 90% bzw. 80%. Durch die Entfernung des experimentell ermittelten (Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:1111-1121) Transkriptions-Initiations-Startes (Δ9), konnte 5 kein so starker Effekt auf das Expressionslevel beobachtet werden. Es ist sogar eines der besten Deletionskonstrukte nach Methanolinduktion. Wie erwartet, hat die TATA-Box einen großen Einfluss auf das Transkriptionsniveau. Im Gegensatz dazu, scheint der Transkriptions-Initiations-Start nicht so wichtig wie die TATA-Box zu sein. Es dürfte, nach der Deletion des Originals, eine andere Region innerhalb eines bestimmten Abstandes zur TATA-Box als io Transkriptionsstart wirken. Weil das 5'-Ende der mRNA durch die Deletion verändert wird, kann man über die Auswirkung dieser Deletion auf mehrere Stufen im Expressionsprozeß (z. B. Transkriptionsinitiation, mRNA-Stabilität, Translationsinitiation) spekulieren.
Nur zwei Konstrukte, Δ2 und Δ6*, zeigen eine signifikant höhere Expression unter dereprimie-15 renden Bedingungen. In der deletierten Sequenz sind mögliche Transkriptionsfaktor-Bindestellen von Raplp und Gcrlp enthalten. Zusätzlich befindet sich die vermeintliche Transkriptionsfaktor-Bindestelle für QA-1F sehr nahe an den deletierten Sequenzen von Δ6*. Beachtenswert ist, dass Raplp- und Gcrlp-Bindestellen dafür bekannt sind, bei Anwesenheit in der Promotorsequenz, in synergistischer Art und Weise zu wirken [21]. Der allgemeine 20 Transkriptionsfaktor Raplp hat in Abhängigkeit des Sequenzkontextes um seine Bindestelle und den dazugehörigen Transkriptionsfaktoren diverse zelluläre Funktionen (z. B. Telomerstruktur, Mating, Translation, Glykolyse) [22-24]. Wie oben erwähnt, ist Gcrlp ein sehr bedeutender Faktor der Regulation und Koordination von glykolytischen Genen und ist unbedingt notwendig für eine hohe Expression dieser Gene in S. cerevisiae. Die Bindestellen von Raplp und Gcrlp 25 befinden sich in nächster Umgebung der Core-Region der Upstream-Aktivator-Sequenz (UAS) glycolytischer Gene und die Gcr1 p-Bindung wird durch Biegen der DNA durch Raplp geschwächt. Andererseits ist eine angrenzende Raplp-Bindestelle nicht unbedingt erforderlich für eine Gcrlp-abhängige Aktivierung von Genen. Es scheint, dass Gcrlp die Bindung an seine Bindestelle erleichtert, wenn größere Mengen an CT-Boxen anwesend sind. Obwohl eine ein-30 deutige Interaktion von Raplp mit Gcrlp sowie von Gcrlp mit Gcrlp beschrieben ist, sind noch andere Faktoren in Verdacht, mit Gcrlp und/oder Raplp zu interagieren und so die Aktivität des Komplexes zu modulieren. In den letzten 30 Jahren konnte bereits ein breites Wissen über den Induktionsmechanismus angelegt werden. 35 Die oben beschriebene notwendige Nähe der Gcrlp- und Raplp-Bindestellen in funktionellen UAS konnte in der AOX1-Promotorsequenz nicht gefunden werden. Im Gegenteil, die zwei Bindestellen sind 367 bp voneinander entfernt. Neben der mutmaßlichen Gcrlp-Bindestelle kommt seine Kernsequenz CTTCC 2 mal innerhalb der AOXf-Promotorsequenz vor, aber keine von ihnen befindet sich unmittelbar angrenzend an die Raplp-Bindestelle oder ein anderes 40 CTTCC-Motiv. Darum scheint ein synergistischer Effekt dieser beiden Bindestellen, wie er in vielen glykolytischen Genen gefunden wird, nicht wahrscheinlich zu sein. Aufgrund der Tatsache, dass Raplp und Gcrlp vermutlich als Repressorproteine für AOX1 unter dereprimierenden Bedingungen wirken, ist eine neue Art der (Inter)aktion der zwei Proteine in dieser vermuteten neuen Zellfunktion möglich. 45
Eine Beteiligung der A6*-Deletion (einschließlich der mutmaßlichen Gcrlp-Bindestelle) an der Repression nach Kohlenstoffmangel wird durch die Beobachtung von Multicopy-Stämmen mit sehr hoher GFP-Zeo-Expression ohne Methanolinduktion unterstrichen. Die GFP-Zeo-Expression des besten Klons der Δ1 - Δ9 Serie, P. pastoris X-33 d6*F10 genannt, ist in Fig. 5 50 dargestellt. Die GFP-Zeo-Expression ist in diesem A6*-Multicopy-Stamm nach der Derepression um ca. 10% höher (60 h im Mikromaßstab), als in einem Singlecopy-Wildtyp-Promotor-Stamm (X-33 GFP-Zeo D2) nach der Methanolinduktion. Der Expressionslevel nach der Methanolinduktion von P. pastoris X-33 d6*F10 ist ebenfalls viel höher als der eines Multicopy-Stammes mit Wildtyp-Promotor (X-33 GFP-Zeo E2). 55 37 AT 501 955 B1
Die P. pastoris AOX1- und DAS1- und H. polymorpha MOX-Promotorregionen treiben die Expression des Reporterenzyms beta-Galaktosidase (lacZ von E. coli) in S. cerevisiae an [9]. Das Regulationsmuster dieser Gene ist in S. cerevisiae ähnlich wie in ihrem natürlichen Wirt: Glukose reprimiert die Genexpression. Unter Kohlenstoff-Mangelbedingungen ist die Expression 5 schwach dereprimiert und Glycerol als Kohlenstoffquelle induziert die Expression. Die beta-Galaktosidase-Expressionslevel unter der Kontrolle der AOX1- und der DASf-regulatorischen Region in S. cerevisiae sind vergleichbar mit jenen, die durch die starken S. cerevisiae CYC1-(konstitutiv) und GAL2- (induzierbar)Promotoren erreicht werden [9]. Es wurde gezeigt, dass die vom MOX-Promotor angetriebene Expression in S. cerevisiae sowohl von Ethanol, Methanol als io auch von Ölsäure induziert wird. Eine andere wichtige Entdeckung ist die Beteiligung von Adr1 p an der Derepression/Induktion des Promotors. Adr1 p, ein positiver Effektor von ADH2 (Alkoholdehydrogenase 2) und einiger peroxisomaler Proteine in S. cerevisiae [25], ist außerdem ein positiver Effektor des MOX-Promotors bei fehlender Glukose im Medium. 15 Wie bereits erwähnt, sind die Regulationsschemen der AOX1- und der AfOX-Gene, aufgrund der Derepression von MOX bei Glycerinanwesenheit, in ihrem natürlichen Wirt signifikant verschieden. Die Verwendung der AOXf-Promotorregion in H. polymorpha zeigte, dass der AOX1-Promotor in diesem heterologen Wirt durch Glycerin nicht reprimiert wird [26]. Der heterologe AOXf-Promotor scheint ähnlich wie der homologe AfOX-Promotor reguliert zu werden. Diese 20 Tatsache lässt vermuten, dass die signifikanten Unterschiede im Regulationsmuster zwischen P. pastoris und H. polymorpha aufgrund einer generell anderen Transkriptionsantwort dieser beiden Hefen auf verschiedenen C-Quellen basieren. Das bedeutet, während die Glycerin- und Glukose-Repressions-Maschinerie in P. pastoris (teilweise) ident ist, unterscheidet sich die Situation in H. polymorpha (wie in S. cerevisiae), wo auf Glycerin nicht die Glukose-25 Repressions-Maschinerie verwendet wird.
Zwei der drei in der AOXf-Promotorsequenz gefundenen mutmaßlichen HAP2/3/4/5-Bindestellen befinden sich innerhalb des Δ1-Deletionskonstruktes und die dritte in Δ5. Die Sequenzdeletion von Δ1 resultiert in einer Erhöhung der Promotoraktivität nach der Methanol-30 Induktion, während kein Effekt auf das Derepressions-Promotor-Level beobachtet werden konnte. Im Gegensatz dazu führt die Deletion von Δ5 zu einer starken Verringerung der Promotoraktivität, sowohl unter dereprimierenden als auch unter induzierenden Bedingungen. In der Δ1 Deletion wurde eine mutmaßliche Aspergillus niduians abaA Bindestelle entdeckt. Das abaA-Genprodukt ist ein transkriptionaler Aktivator, welcher an der Entwicklung der Konidiophoren 35 (asexueller Reproduktionsapparat) in A. niduians beteiligt ist [27]. Da alle mutmaßlichen Bindestellen mögliche Aktivatorsequenzen darstellen [27], sollte ihre Deletion einen negativen Effekt auf den Expressionslevel, wie im Δδ-Konstrukt sichtbar, haben. Aufgrund der Tatsache, dass beide Deletionen sehr lang sind, dürfte eine andere Bindestelle für den beobachteten Effekt verantwortlich sein. Der Umstand, dass die Deletion von Δ1 den gegenteiligen Effekt auf den 40 Expressionslevel hat, lässt vermuten, dass eine der mutmaßlichen Bindestellen ein Repressormotiv ist, oder dass eine andere Bindestelle existiert, welche die Effekte der Deletion der möglichen HAP- und abaA-Bindestellen übertrifft und dadurch den Expressionslevel erhöht.
Nichtsdestoweniger ist der HAP-Komplex bekannterweise für die Hochregulierung von Genen 45 des Atmungs- und Energiemetabolismus in S. cerevisiae verantwortlich. Die Regulation der Atmung wird sowohl durch den Sauerstoffgehalt, als auch durch die im Medium präsente Kohlenstoffquelle gesteuert, und beides wird durch den Hap-Komplex vermittelt. In der fermentativen Hefe S. cerevisiae werden mehrere Gene und dadurch die Funktionen der Atmungskette, als auch des Citratzykluses, durch Glukose reprimiert. Die Glukoserepression der Atmung wird so teilweise vom Hap-Komplex vermittelt, und zwar durch das Fehlen von Hap4p, solange Glukose vorhanden ist. In Gegensatz dazu, scheint die sauerstoffabhängige Regulation von Haplp reguliert zu werden [28]. Homologe zu den Hap-Komplex-Genen wurden aus der respiratorischen Hefe K. lactis isoliert. In respiratorischen Hefen werden in der Atmung involvierte Gene konstitutiv exprimiert, auch in Anwesenheit von Glukose. Bis heute zeigte sich, dass fast jedes 55 Gen der Atmungskette in K. lactis unabhängig vom Hap-Komplex reguliert wird [29]. Die Aufga- 38 AT 501 955 B1 be des Hap-Komplexes scheint die Koordination der Kohlenstoff- und Stickstoffassimilation zu sein, wie bereits in S. cerevisiae [30] und Aspergillus nidulans [29] gefunden wurde.
Der erste Schritt in der Methanolverwertung, in P. pastoris hauptsächlich vom AOX1-5 Genprodukt katalysiert, benötigt Sauerstoff. Die meisten der im Energiemetabolismus involvierten Gene und fast jedes Gen, das für Sauerstoff verbrauchende Enzyme codiert, wird durch Sauerstoff reguliert, hauptsächlich von Haplp und/oder Hap2/3/4/5p [28]. Bei Wachstum auf Methanol als alleinige Energie- und Kohlenstoffquelle, führt der Methanolverwertungsweg zur Kohlenstoffassimilation und zur Energieproduktion. Eine Beteiligung des Hap-Komplex-io Erkennungsmotivs TTCCAA an der Regulation des AOX1-Promotors macht daher unmittelbar Sinn.
Das A4-Konstrukt, welches eine zweite mutmaßliche HSF-Bindestelle beinhaltet, führte zu einer 30%igen Verringerung der Promotoraktivität nach der Derepression und Induktion. Deshalb ist 15 HSF ein allgemeiner verstärkender Faktor der AOXf-Genexpression unter sowohl dereprimie-renden, als auch induzierenden Bedingungen. In S. cerevisiae führten etliche Stressbedingungen, wie Hitzeschock, oxidativer Stress und Glukosemangel, zu einer Aktivierung von HSF. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Proteinkinase Snflp, einer der "metabolischen Hauptschalter" bei der Phosphorylierung und deshalb bei der Aktivierung von HSF nach einem Koh-20 lenstoffmangel, beteiligt ist [31]. HSF ist daher an der vollständigen Aktivierung von AOX1 nach einem Glukosemangel (mit oder ohne Induktion) beteiligt.
Expressionsstudien des AOXf-Promotors, mit verkürzten („truncated“) Versionen wie auch mit Varianten mit deletierten Sequenzen, sind im Stand der Technik geoffenbart [32, 33].
Tabelle 14: Resultate der Promotorstudien von Inan etal. [32, 33]; die Induktion wurde mit 0,5% Methanol als Kohlenstoffquelle durchgeführt, die Repression mit 0,5% Methanol und 0,5% Ethanol; die Startpositionen bezeichnen das 5'-Ende der Sequenz im AOXf-Promotor in 30 35 40 45 50 Promotorfragment Deletion bezogen auf die SEQ ID Nr. 1 Relative Aktivität f%] Induziert Reprimiert InanABCDEF _ 100 3,1 ±0,3 lnan_BCDEF 7 bis 152 (-947 bis -802) 76 ±5 1,9 ±0,2 Inan_CDEF 1 bis 292 (-947 bis -661) 49 ±4 2,2 ±0,5 Inan_DEF 1 bis 432 (-947 bis -521) 14 ± 3 1,3 ±0 Inan EF 1 bis 559 (-947 bis -394) 24 ±7 1,8 ±0 Inan F 1 bis 798 (-947 bis -245) 7 ± 2 1,8 ±0,2 InanACDEF 153 bis 292 (-801 bis -661) 63 ±3 2,1 ±0,2 lnanAB_DEF 293 bis 432 (-660 bis -521) 109 ±12 3,8 ± 0,4 InanABCJEF 433 bis 559 (-520 bis -394) 128 ±6 5,0 ± 0,6 lnanABCD_F 560 bis 798 (-393 bis -245) 16 ± 1 0,8 ± 0,2 55 39 AT 501 955 B1
Das Konstrukt lnan_BCDEF, mit Beginn an 153 (-801) (Tabelle 14) offenbarte eine Bindestelle von mindestens einem Aktivatorprotein stromaufwärts von 153 (-801). Anwärter für diese Aktivator-Bindestelle sind die Bindestellen von Haplp (52 bis 66, -902 bis -888) und HSF (135 und 155, -819 bis -799) am Komplementärstrang, welche mittels Matlnspector gefunden wurden. Eine Verkürzung an der Sacl-Restriktionsstelle (210-215 (-744 bis -739)) führt zu einem Promotor, der annähernd Wildtyp-Promotoraktivität erreicht (Geoff Lin Cereghino, Poster, Sixth Meeting on "Current Topics in Gene expression and Proteomics", San Diego, October 19-22, 2003). Um den Wildtyp-Promotorlevel mit dem Sacl-verkürzten Promotorkonstrukt erreichen zu können (pHWGO, Geoff Lin Cereghino, Poster), dürfte eine zweite Bindestelle für ein Repressorprotein stromaufwärts von 210 (-744) liegen, dessen Deletion dieselbe Auswirkung auf die Promotoraktivität hat, aber in der umgekehrten Richtung. Das Repressorprotein ist zwischen 169 (-784) und 210 (-744), da das Δ1-Konstrukt (Δ 169 (-784) bis 234 (-719)) eine Repressor-Bindestelle beinhaltet. Die Deletion von Δ1 führt zu einer 20%igen Steigerung der Promotoraktivität (Tabelle 14), was im Bereich einer Verringerung durch Deletion einer Aktivator-Bindestelle liegt.
Im Vergleich mit Δ4 (Δ 508 (-445) bis 550 (-403)), kann der Ort der Repressor-Bindestelle weiter auf eine Sequenz zwischen 433 (-520) und 508 (-445) begrenzt werden, weil die A4-Deletion einen positiv wirkenden Transkriptionsfaktor, und zwar HSF bei 516 bis 536 (-438 bis -418), enthält. Befindet sich der positiv wirkende HSF (wenn es HSF ist) innerhalb der vermuteten Region, könnte die Repressor-Bindestelle zwischen 433 und 508 (-520 und -445) eine stärkere Wirkung haben als vermutet. Ist die Bindestelle für HSF in der Region zwischen 508 und 536 (-445 und -418) lokalisiert, ist eine weitere Aktivator-Bindestelle zwischen 536 und 560 (-418 und -393). Wenn nicht, ist es möglicherweise dieselbe Bindestelle. So wie die lnanABCD_F (Δ 560 bis 709 (-393 bis -245)) Variante mit nur 16% der Wildtyp-Aktivität, führt auch das Δ5-Konstrukt (624 bis 682 (-329 bis -271)) zu einer Verringerung des Wildtyp-Levels um ca. 70%. Wie erwartet, führt die Deletion des Inan B-Fragments aus dem Gesamtpromotor (ergibt lnanA_CDEF), sowie aus lnan_BCDEF (führt zu Inan_CDEF) zu einer auf 63 bzw. 64% her abgesetzten Aktivität des längeren Fragments. Im Gegensatz dazu führt die Deletion des C-Fragments aus dem Gesamtpromotor zu einer um 10% erhöhten Promotoraktivität, während die
Deletion aus dem verkürzten Inan_CDEF-Fragments zu einer Verringerung von 49% auf 14% (Tabelle 14) führt. Die Erklärung dazu ist eine synergistische Bindung von Transkriptionsfaktoren, abhängig vom Kontext ihrer Bindestellen. Zwischen 713 und 760 (-241 bis -194) befindet sich eine letzte Aktivator-Protein-Bindestelle (Geoff Lin Cereghino, Poster, San Diego). Wiederum konnte durch das A7-Konstrukt (Δ 729 bis 763, -225 bis -191) der Ort des Aktivators auf stromabwärts von 729 (-225) eingeengt werden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mehrere Regionen gefunden wurden, die einen starken Einfluss auf den Expressionslevel des AOXf-Promotors hatten. Kombiniert man alle bekannten Regulatorstellen des hier dargestellten Beispiels und jenen anderer Autoren, mit Ausnahme der die TATA-Box und die Transkriptionsinitiationsstelle enthaltenden Regionen, existieren mindestens 10 Regulatorstellen auf der P^oxr Promotorsequenz.
Die hier gezeigten Daten zeigten die orchestrale Regulation des AOXf-Promotors: mehrere Faktoren müssen an die DNA binden um den Expressionslevel zu maximieren. Unter induzierenden Bedingungen binden mehrere positiv wirkende Transkriptionsfaktoren (Aktivatoren) an die DNA, während die meisten Repressorproteine nicht binden, was zu einem hohen Expressionslevel führt. Während der Derepression erreichte die Promotoraktivität nur einen kleinen Prozentsatz (-3%) des induzierten Levels. Das kommt höchstwahrscheinlich daher, dass weniger Aktivator- und mehr Repressor-Proteine an die Promotorregion binden. Unter reprimieren-den Bedingungen kann man vermuten, dass keine Aktivatoren und mehrere Repressoren an die DNA gebunden sind, mit einer weiteren Erhöhung des Repressor/Aktivator-Verhältnisses unter reprimierenden Bedingungen. Für den durch Glukose reprimierten ADH2 (Alkoholdehydrogenase 2)-Promotor von S. cerevisi-ae konnte gezeigt werden, dass eine Bindung von Aktivatorproteinen (z. B. Adrlp) gleich an- 40 AT 501 955 B1 grenzend an die Nukleosomen zu einer Destabilisierung und deswegen zu einer Umordnung des Chromatins nach der Derepression führt. Diese Umordnung findet in der Region der TATA-Box und der Transkriptions-Initiations-Stelle statt, wobei deren Zugänglichkeit erleichtert wird. Wegen der besseren Zugänglichkeit bildet sich ein stabiler Prä-Initiationskomplex, weshalb die 5 Promotoraktivität auf ein Grundniveau erhöht wird. Neben der Bindung mehrerer Transkriptionsfaktoren zur Steigerung der vom PAoxi angetriebenen Expression, wird, zumindest für die Derepression, ein ähnlicher Mechanismus angenommen. Nimmt man alle Daten und Annahmen zusammen, ist die Regulation des AOX7-Promotors höchst komplex und die mutmaßlichen Bindestellen mehrerer (positiv und negativ wirkenden) Tanskriptionsfaktoren weisen auf eine io hoch-koordinierte Maschinerie hin, welche fähig ist eine breite Palette von Signalen für die Regulation des AOX7-Promotors zu integrieren. VI) PCR-Mutagenese des AOX1-Promotors 15 Hier wurde gezeigt, dass spezifische Mutationen innerhalb der Kernsequenzen der Transkriptionsfaktor-Bindestellen zu signifikanten Änderungen ihrer Effektorkraft führen. Es wird angenommen, dass einige Aktivator- und Repressorproteine auf den AOX1-Promotor wirken und damit seine starke Regulation bedingen (beinahe keine Aktivität unter Glukose, sehr hohe Aktivität in Methanol). Daher sollte die Random-Mutagenese des AOXf-Promotors zu mehreren 20 Promotorvarianten mit zerstörter oder reduzierter Repressor-Bindestellenaktivität führen. Eine Reihe von PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen Mutationsraten wurde durchgeführt. Die entstandenen Promotorvarianten wurden in P. pastoris GFP-Zeo Muts A9-Stamm, in dem das AOX1-Gen durch den GFP-Zeo-Stamm ersetzt wurde, transformiert. Der Ersatz des Wildtyp-AOXf-Promotors durch die mutagenisierten Promotorvarianten sollte mit einer bestimmten Rate 25 vonstatten gehen. Das Screening auf Promotorvarianten mit höherer Expressionsrate bei Anwesenheit von Glukose im Medium, wurde auf MD-Zeo-Agarplatten durchgeführt.
Das Ausplattieren auf MD-Agarplatten mit 100 pg/ml Zeocin™ führte zu Platten, welche übersät waren mit Pichia pastoris-Zellen, wobei keine Einzelkolonien mehr erkennbar waren. Es scheint, 30 dass der Selektionsdruck nicht hoch genug war, um das Wachstum des Wildtyp-Stammes zu unterdrücken. Obwohl, solange Glukose anwesend war, keine Fluoreszenz im P. pastoris-Stamm GFP-Zeo Muts A9 detektierbar war, dürften einige GFP-Zeo-Proteine in der Zelle expri-miert worden sein, welche ihr die Zeocin™-Resistenz verliehen. Um höhere Zeocin™-Konzentrationen für die Wachstumsinhibierung des Stammes GFP-Zeo Muts A9 auszutesten, 35 wurden Tüpfeltests, wie bereits beschrieben, durchgeführt.
Wie man in Fig. 6 klar erkennen kann, verringerte die Erhöhung auf 200 pg/ml die Lebensfähigkeit der Zellen des P. pastoris-Stammes mit dem GFP-Zeo-Gen unter der Kontrolle des AOX1-Promotors (verglichen mit 100 pg/ml) nicht, eine Erhöhung auf 500 pg/ml jedoch schon. Da 40 erwartet wurde, dass die Mutagenese des Promotors nur in einer schwachen Erhöhung des Expressionslevels resultiert, erschien ein Selektionsdruck von 500 pg/ml Zeocin™ zu hoch. Letztlich wurden 350 pg/ml für alle weiteren Screenings der Mutagenese-Promotorvarianten gewählt. 45 Aufgrund der sehr komplexen transkriptionellen Regulation, mit vielen beteiligten Promotorregionen, ist ein Random-Mutagenese-Ansatz mit einer hohen Mutageneserate vorteilhaft.
Beispiel 2: Erzeugung der Promotordeletionen so Basierend auf den Ergebnissen von Beispiel 1 wurde eine zweite Generation von Deletionsvarianten hergestellt. Im Unterschied zur ersten Serie wurden in diesen neuen Deletionskonstrukten nur kurze und spezifische Sequenzabschnitte der mutmaßlichen Transkriptionsfaktor-Bindestellen (5-15 bp) deletiert (Tabelle 15). 55 Tabelle 15: Effekte der Deletion spezifischer Transkriptionsfaktor-Bindestellen auf den Expres- 41 AT 501 955 Bi sionslevel nach der Derepression (Glukosemangel) und Methanolinduktion. Die Mutationen Δ1-Δ9 sowie Kombinationen von Einzelmutationen werden auch angegeben. Alle Zahlen sind relative Promotoraktivitäten verglichen mit der Wildtyp-Promotoraktivität unter gleichen Bedingungen. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 cn tn Deletion
Bereich in Seq Region ID Nr. 1
Deletion (fett gedruckt, unterstrichen) und die angrenzenden 5 Nukleotide (5' und 3' )_ positiver Effekt 4^ ΙΌ AHapl AHsf 1 Δ1
AHap2345_l AHap2345_2 AabaA A$tre Δ2 ARapl A3 -900 bis -896 -812 bis -805 -784 bis -719 -758 bis -754 -748 bis -744 -735 bis -730 -673 bis -669 -650 bis -604 -619 bis -615 -590 bis -561
Inan A
Inan A
Inan B
Inan B, Al Inan B, Al Inan B, Al Inan B Inan C Inan C, Δ2 Inan C
GCCATCCGACATCCA
GGACCTCCACTCCTCTTC
CCACTTTTGCCATCGAAAAAC-CAGCCCAGTTATTGGGCTT-GATTGGAGCTCGCTCATTCCAATT CCTTCTAT TAGG CAGTTATTGGGCTTG
Erhöhte Expression unter Induktionsbedingungen Produktion von Multicopy-Stämmen, Erhöhte Expression unter Induktionsbedingungen Erhöhte Expression unter Induk-t i onsbedingungen
GCTTGATTGGAGCTC
TCGCTCATTCCAATTC
TGGCCCCCCTGGCGA
TTTGTTTATTTCCGAATGCAA-CAAGCTCCGCATTACACCCGAA- CATCACTCGAGATG ATTACACCCGAACAT GCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAA-
TAGTTTCATGTTCCCCAA
Produktion von Multicopy-Stämmen Produktion von Multicopy-Stämmen Produktion von Multicopy-Stämmen Erhöhte Expression unter Induktionsbedingungen Erhöhte Expression unter dere-primierenden Bedingungen Produktion von Multicopy-Stämmen AT 501 955 B1
Ol Ol Ol O ^ w co io ho -k -k OOlOOlOOlOOl
AAdrl A4 AHsf_2 Δ5 AHap2345_3 AMatlMC Δ6 Δ6* AGcr 1 Δ7 Δζ)Α-1F AQA-lFzus -583 bis Inan c, -577 Δ3 GAGT GTGGGGTCAAATA -445 bis AGTTGACAAGACAAACGGTATGC- -403 Inan D CGACTTTTGGAAGTTTCTTTTT- GAGTTGGT -437 bis Inan D, -430 Δ4 AAAAAGAAACTTCCAAAA GAACCCCGGTGCACCTGTGCC— -329 bis Inan GAAACGCAAATGGGGAAACACC— -271 E CGCTTTTTGGATGATTATGCATTG TC -286 bis -282 Inan Δ5 E, CGCTTTTTGGATGAT -271 bis Inan E , -267 Δ5 ° TATGCATTGTCTCCA -260 bis Inan E TCCACATTGTATGCTTC— -231 & F CAAGATTCTGGTGGGAATACTGC -260 bis -231 Inan E TCCACATTGTATGCTTC- -217 bis & F CAAGATTCTGGTGGGAATACTGC -216 Inan F TAGCCTAACGTT -252 bis Inan E, -248 Δ6 GTATGCTTCCAAGAT -225 bis Inan F ACTGCTGATAGCCTAACGTTCAT- - 191 GATCAAAATTTAACTGTTCTAA -207 bis Inan F, TTCATGATCAAAATT— -193 Δ7 TAACTGTTCT -218 bis -213 Inan F, ATAGCCTAACGT TCATGAT— -207 bis Δ7 CAAAATTTAACTGTTCT -193
Produktion von Multicopy-Stäramen ω
Produktion von Multicopy-Stäramen
Erhöhte Expression unter dere-primierenden Bedingungen, Produktion von Superklonen mit hoher Expression unter dereprimierenden Bedingungen Produktion von Multicopy-Stämmen
Produktion von Multicopy-Stämmen, Erhöhte Aktivität unter dereprimierenden Bedingungen Erhöhte Aktivität unter dereprimierenden Bedingungen AT 501 955 B1 £> cn
Ca) cn CO ίΟ hO o cn o cn o cji -758 bis Inan ΔΗ s f_2_dH ap2 34 5 -754 Δ1 _1 -437 bis Inan -430 Δ4 -758 bis Inan -754 Δ1 ΔΗ s f_2_dH ap2 3 4 5 -747 bis Inan _1 zus -745 Δ1 -437 bis Inan -430 Δ4 -437 bis Inan -430 Δ4 AHsf 2 MatlMC -271 bis Inan Δ8 -267 -170 bis Δ5 ° -154 -131 bis Inan Δ9 -93 -650 bis -604 Inan Inan Δ2Δ6 -260 bis -231 Inan & F -218 bis Inan Δ736-41 -213 Δ7 -217 bis Inan Δ7 37 — 38 AInD-d4m -216 -402 bis AI -394 Inan
B, CAGTTATTGGGCTTG D, AAAAAGAAACTTCCAAAA B, B, C AGT TATTGGGC T T GATTGGAGC T AAAAAGAAACTTCCAAAA D, D, AAAAAGAAACTTCCAAAA E, TATGCATTGTCTCCA ACAGCAATATATAAA- F - CAGAAGGAAGCT ACCTTTTTTTTTATCATCATTAT— F TAGCTTACTTTCATAATTG- CGACTGG TTTGTTTATTTCCGAATGCAA— C CAAGCTCCGCATTACACCCGAA-E CATCACTCCAGATG TCCACATTGTATGCTTC- CAAGATTCTGGTGGGAATACTGCF, ATAGCCTAACGTTCAT F, TAGCCTAACGTT D CTTGTTTGGTATTGATTGA
Produktion von Multicopy-Stämmen
Produktion von Multicopy-Stämmen
Produktion von Multicopy-Stämmen -p». AT 501 955 cn cn -U -f*. co co ro ro —* cn o ui o cn o cn CTTGGAACCIAATATGACAAAAG-
AD-d4 -520 bis -446 Inan D CGTGATCTCATCCAAGATGAAC- TAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTA ACGGCCAGTTGCTTGG Δ1-1 -784 bis -763 Inan Δ1 B, CCACTTTTGCCATCGAAAAAC- CAGCCCAGTTA Δ1-2 -762 bis -741 Inan Δ1 B, AGCCCAGTTATTGGGCTT-GATTGGAGCTCGCT' Δ1-3 -740 bis -719 Inan Δ1 B, GGAGCTCGCTCATTCCAATT- CCTTCTATTAGG Δΐ-Sacl -762 bis -744 Inan Δ1 B, CCACTTTTGCCATCGAAAAAC- CAGCCCAGTTATTGGGCTT- GATTGGAGCTC Ohi, et al, -228 bis Inan F, AATACTGCTGATAGCCTAACGTT- Δ0Χ2 ÜAS -199 Δ7 CATGATCAAAATAATAC Ohi, et al, A0X2 ÜAS -369 bis -337 Inan E TAATCTCATTAATGCTTAGCG- CAGTCTCTCTATCGCTTTAATC Ohi, et al, A0X2 URS2 -333 bis -294 Inan E TTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGC CGAAACGCAAATGGGGAAACACCC
GC AT 501 955 B1 46 AT 501 955 B1
Materialien und Methoden: a) Mutagenese: 5 Alle Deletionen wurden gemäß dem zwei-Stufen Site-Directed-Mutagenesis-Protokoll nach Wang et al. [34] eingeführt. In einem ersten Schritt wurden zwei separate Reaktionen (eine für den Forward- und eine für den Reverse-Primer) bewertet (100 ng pAOX Template, 15 pmol Primer, je 200 μΜ dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 2,5 E Pfuilltra™ Polymerase, in einem Gesamtvolumen von 50 μΙ und in entsprechenden Pufferbedingungen). Je 25 μΙ dieser beiden io PCR-Reaktionen wurden gemischt und anschließend ein 2. PCR-Reaktionsschritt durchgeführt. 1 μΙ Dpnl-Restriktionsenzym (10 Ε/μΙ) wurden zu 30 μΙ des zweiten PCR-Reaktionsschrittes gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. 1-5 μΙ der Dpnl-verdauten PCR-Reaktion wurden in elektrokompetente E. coli-Zellen [16] transformiert und nach 1 h Regeneration im SOC-Medium 15 auf LB-Amp-Platten ausplattiert.
Tabelle 16: Primer für die ortsgerichtete Mutagenese der Transkriptionsfaktor-Bindestellen-Deletionen
£.\J Deletion Name Sequenz (5'-->3') SEQ ID Nr. Hap1 G AAT GAAACCTTTTT GCCAT AT CCA- 53 Haplfw CAGGT CCATT CT CAC GAATGGACCTGTGGATATGG- 54 25 Haplrv CAAAAAG GTTT CATT CAACC Hsf_1 Hsf 1fw CCGTT GCAAACGCAGG ACCT CTT CT -CCT CAACACCCAC 55 GTGTTGAGGAGAA- 56 Hsf 1rv G AGGT CCTG CGTTT GCAACGGT CT G 30 Hap2345_1 Hap2345 1fw CG AAAAACCAGCCCAGTT GCTT-GATT GGAGCT CGCT CATT CC 57 GAGCGAGCT CCAAT CAAGCAACT GG- 58 Hap2345 1rv GCTGGTTTTTCGATG 35 Hap2345_2 Hap2345 2fw CAGCCCAGTTATT GGGCTT GAGCT -CGCT CATT CCAATT CC 59 GGAATTGGAAT GAGCGAGCT CAAGCC- 60 Hap2345 2rv CAATAACT GGGCT G 40 ABAA ABAAfw GGCTT GATT GGAGCT CGCTAATT -CCTTCTATTAGGCTAC 61 ABAArv GTAGCCTAATAG AAGG AATTAGC-GAGCT CCAAT CAAGCC 62 Stre_1 Stre 1fw GCCTGTCTATCCTGGCCGGCGAGGTT-CAT GTTT GTTTΑΊΓΤΤ C 63 45 CAAACATGAACCT CGCCGGCCAGGA- 64 Stre_ 1rv TAGACAGGCTAATAAAG Rap1 Raplfw GCAACAAGCT CCGCATTACAACAT -CACT CCAGATGAGG 65 CCT CAT CT G G AGT GAT GTTG- 66 50 Raplrv TAATGCGGAGCTTGTTGC Adri Adrlfw CCAGAT G AGGGCTTT CT G AGT GAAA-TAGTTTCATGTTCCC 67 G GG AACAT G AAACTATTT CACT - 68 Adrlrv C AG AAAG CCCT CAT CTG G 55 47 AT 501 955 B1
Deletion Name Sequenz (5'-->3‘) SEQ ID Nr. Hsf_2 Hsf 2fw G CCAGTT G GT C AAAAACAAAAGT CG G-CATACCGTTT GTC 69 5 Hsf 2rv CGGTATGCCGACTTI IGTTTTTGAC-CAACTGGCCGTTAGC 70 Hap2345_3 Hap2345 3fw CAAAT GGGGAAACACCCGCTTAT -GATTAT GCATT GT CT CCAC 71 G AG ACAAT GCATAAT CATAAG- 72 10 Hap2345 3rv CGGGT GTTT CCCCATTT GCG Mat1 MC Mat1 MCfw GCTTTTT GG AT GATTATGCCT CCA-CATT GTAT GCTT CCAAG 73 CTT GGAAGCATACAAT GT GGAGGCA- 74 Mat1 MCrv TAAT CAT CCAAAAAGC 15 Gcr1 Gcrlfw CATT GT CT CCAC ATT GTAT -GAAGATT CT GGTGGGAATACT GC 75 GTATT CCCACC AG AAT CTT CATA- 76 Gcrlrv CAATGTGGAGACAATGC QA-1F GCTGATAGCCTAACGTT CAT GTT CTAA- 77 20 QA-1 Ffw CCCCTACTT G ACAGC GT CAAGTAGGGGTTAG AACAT - 78 QA-1 Frv G AACGTTAGGCTAT CAGCAG 25 736-741 d736-41fw G G AATACT G CTG ATAGCTT CAT G AT-CAAAATTTAACT GTT C 79 d736-41rv GTTAAATTTTGATCATGAAGCTAT-CAG CAGTATT CCCACC 80 737-738 d737-38fw G G AATACT GCT GATAGCCACGTT CAT -GAT CAAAATTTAACT G 81 30 d737-38rv GTT AAATTTT GAT CAT GAACGT GGC-TATCAGCAGTATTCC 82 b) Pichia pastoris-Transformation und Charakterisierung der Klone: 35 Die wie oben beschrieben konstruierten Plasmide, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vorbereitet und in Pichia pastoris transformiert.
Ergebnisse und Diskussion: 40 Wie bereits in Beispiel 1 für die größeren Deletionen beschrieben, wo alle Mutationen einen signifikanten, entweder positiven oder negativen, Effekt auf die Promotoraktivität haben, konnte mit den kurzen Deletionen aus Beispiel 2 ebenfalls ein starker Effekt auf das Expressionsniveau erreicht werden. Kurze Deletionen von spezifischen Transkriptionsfaktor-Bindestellen zeigen einen starken Einfluss auf die Promotoraktivität und geben einen genaueren Aufschluss über 45 regulatorische Eigenschaften einzelner regulatorischer Stellen (z. B. Transkriptionsfaktor-Bindestellen). Gcr1 ist von besonderem Interesse, weil seine Bindestelle in der A6-Deletion inbegriffen ist. Die Sequenzierung der Promotorregion einer pAOXA6*-Deletionsmutante und des Kolonie-PCR-Produkts aus genomischer DNA der Pichia pastoris-Klone offenbarte eine weitere Deletion in der Promotorregion (Deletion der Nukleotide 737 bis 738 (-217 bis -216) der 50 SEQ ID Nr. 1). Aufgrund der Tatsache, dass diese Promotorvariante zu einer Erhöhung der Promotoraktivität führt, was infolgedessen in einer höheren Expressionsrate unter dereprimie-renden Bedingungen resultiert, kann diese zusätzliche Mutation in einen Promotor, entsprechend der vorliegenden Erfindung, eingefügt werden, um die Proteinexpression unter diesen Bedingungen zu erhöhen. 55 48 AT 501 955 B1
Die Promotoraktivität der QA-1 F-Klone mit einer zusätzlichen Deletion (Deletion der Nukleotide 736 bis 741 (-218 bis -213) der SEQ ID Nr. 1) ist, verglichen mit dem ΔΟΑ-1 F-Promotor ohne dieser zusätzlichen Deletion, bedeutend anders: die Aktivität ändert sich von -30% (Derepres-sion) bzw. -100% (Induktion) der Wildtyp-Aktivität (AOX1AQA-1F, siehe Tabelle 15) auf -140% 5 bzw. -70% (AOX1AQA-1Fzus, siehe Tabelle 15). Die zusätzliche Deletion dieser 6 Nukleotide scheint einen dramatischen Einfluss auf die Promotoraktivität zu haben. Deshalb wurde eine neue Promotorvariante, die diese Mutation (Δ736-741) trägt, mittels der ortsgerichteten Muta-genese, wie oben beschrieben, eingeführt. Beide Mutationen, welche zufällig und unabhängig voneinander zweimal in dieser Region aufkamen, brachten eine Erhöhung der Promotoraktivität io unter dereprimierenden Bedingungen mit sich. Es ist beachtenswert, dass es zu einer Erhöhung der Promotoraktivität kommt, obwohl in beiden Konstrukten eine zweite, höchstwahrscheinlich negativ beeinflussende Mutation, vorkommt.
Eine Kombination von Δ2 und Δ6 (Δ2Δ6) wurde auf ähnliche Weise wie die Einzelmutationen 15 durch Overlap-Extension-PCR hergestellt. In Tabelle 17 ist deutlich gezeigt, dass eine Deletion beider Fragmente, sowohl unter dereprimierenden als auch unter induzierenden Bedingungen, zu einer sehr starken Verminderung der Promotoraktivität führt. Weil es, wie zuvor erwähnt, in diesem Konstrukt, verglichen mit dem A6*-Konstrukt, keine zusätzliche TA-Deletion gibt, unterstützt dieses Ergebnis auch die Vermutung, dass die zufällig aufgetretene zusätzliche Mutation 20 (Δ737-38) für die Erhöhung der Promotoraktivität unter Kohlenstoffmangel verantwortlich ist.
Etliche Deletionen führen zu einer dramatischen Verringerung der Promotoraktivität (z. B. Hsf, aber auch Hap1 und Hap2345_1). Diese mutmaßlichen Bindestellen sind hervorragende Ziele für eine Sequenzduplikation, welche zu einer Steigerung der Promotoraktivität führen sollte. 25
Interessanterweise wurde in 2 von 4 Klonen der Δ736-741-Variante, welche durch ortsgerichtete Mutagenese hergestellt wurde, eine neue Deletion von 9 Nukleotiden (TTGGTATTG) an der Position 552 bis 560 (-402 bis -394) gefunden. Der Effekt, dass Deletionen in einer bestimmten Region gefunden wurden, wurde ebenfalls in AHsf_2-Konstrukten gefunden. Es wird vermutet, 30 dass dieser Effekt auf lokalen Sequenzhomologien beruht. Folglich sind solche zusätzlich dele-tierten Regionen (Δ552-560, Δ737-38 und Δ736-41) und die angrenzenden Sequenzen (5 bp stromaufwärts und stromabwärts) ebenfalls mutmaßliche Transkriptionsfaktor-Bindestellen und deshalb höchst interessante Ziele für Deletionen und Duplikationen. Die Deletionsvariante Δ736-41 führt zu einer starken Reduktion des Expressionsleveis unter methanolinduzierenden 35 Bedingungen.
Multicopy-Stämme:
In den meisten Fällen resultiert die Erzeugung von Multicopy-Stämmen in GFP-Zeo-40 Superexpressions-Stämmen. In vielen Fällen haben diese Stämme ein höheres Expressionsle-vel als die d6*F10-Stämme, hauptsächlich unter methanolinduzierenden Bedingungen. Die Erzeugung von Multicopy-Stämmen konnte mit mehreren Konstrukten erreicht werden, insbesondere mit dem A6*-Konstrukt, der Doppeldeletion d2d6 und Konstrukten, die die Δ1-, Δ2- und A6*-Deletionen sowie z. B. Gcr1, Rap1, abaA, Hap2345_1-Deletionen, aber auch z. B. QA-1F, 45 Adr1, Hsf_2_Mat1MC und Hsf_2_Hap2345_1 (siehe Fig. 7) enthalten. Verglichen mit dem d6*F10-Stamm konnte in diesen Stämmen eine höhere Expressionsrate unter induzierenden Bedingungen festgestellt werden. Demgegenüber ist der d6*F10-Stamm fähig, unter dereprimierenden Bedingungen mehr GFP-Zeo als jeder andere, bis dato hergestellte Stamm zu erzeugen. Eine Wiederholung der Transformation des A6*-Konstruktes in Pichia pastoris führte zu so einer hohen Zahl an Multicopy-Stämmen mit vergleichbarer Aktivität zu dem d6*F10-Stamm, besonders unter dereprimierenden Bedingungen (Fig. 8).
Bei Verwendung des Wildtyp-Promotorkonstruktes wurde eine viel geringere Häufigkeit an Multicopy-Stämmen (z. B. E2-Stamm) beobachtet, als bei der Verwendung von Promotorvarian-55 ten. Obwohl 2-4 mal mehr Transformanten analysiert wurden, ist der Expressionslevel der 49 AT 501 955 B1 besten Transformante E2 nur doppelt so hoch wie Singlecopy-Transformanten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Transformation von Promotorvarianten zu einer höheren Häufigkeit an Multicopy-Stämmen führt und dass diese Stämme um ein Vielfaches produktiver sind, als Multicopy-Wildtyp-Promotor-Stämme. 5
Beispiel 3: Alternative Reporterproteine
Um die Umsetzbarkeit aller GFP-Zeo-Resultate auf andere, hauptsächlich gut exprimierte und industriell relevante Proteine (z. B. Enzyme) zu testen, wurden einige Promotorvarianten vor io solche Reporter-Enzyme einkloniert (z. B. PaHNL5a und HRP).
Klonierung:
Die Promotorvarianten wurden in die Vektoren pPICZaB-HRP-WT [35] und pGAPZ A-PaHNL5a 15 einkloniert. Für den Promotoraustausch in pPICZaB-HRP-WT wurde eine Λ/ctel-Restriktions-stelle am 5'-Ende des Promotors mittels ortsgerichteter Mutagenese eingeführt (100 ng Vektor als Template, Primer NdelPICZfor und NdelPICZrev - siehe Tabelle 18). Der entstandene Vektor wurde pPICZaB-A/cfel-HRP-WT genannt.
Tabelle 18: Primer für die ortsgerichtete Mutagenese zur Einführung einer NdeI-Restriktionststelle in pPICZaB-HRP-WT und für den Promotoraustausch_ 25 30 Name Sequenz (5'—>3*) Seq ID Nr. NdelPICZfor G AG AT CAG AT CTAACATAT GCCAAAGACGA-AAGGTTG 83 NdelPICZrev CAACCTTT CGT CTTT GGCATAT GTTAG AT CT-GATCTC 84 AOX1NDE1 AAACATAT G AG AT CTAACAT CCAAAG ACG A-AAGG 85 AOX1 rev T GGTT G AATT CTTT CAATAATT AGTT G 86 20 Für den pGAPZ A-PaHNL5a-Expressionsklon wurde zuerst das PaHNL5a-Gen aus einem pHIL-D2 Vektor (Glieder, A., et al. Angew. Chemie Int. Ed. 2003) in einen pGAPZ A Vektor 35 kloniert, wodurch das Plasmid pGAPZA-PaHNL5a entstand. Die Klonierung der Promotorvarianten in pGAPZ A-PaHNL5a konnte direkt nach dem Verdau mit EcoRUBglH von pGAPZ A-PaHNL5a- und ρΑΟΧΔ-Plasmiden erfolgen. Für den Austausch in pPICZaB-A/ctel-HRP-WT wurden die Promotorvarianten mittels PCR, unter der Verwendung der Primer AOX1NDE1 und AOXIrev (siehe Tabelle 18, 10 ng ρΑΟΧΔ, 10 pmol Primer AOX1NDE1 und AOXIrev, je 40 200 μΜ aller dNTP, 0,6 E Phusion™ Polymerase in den entsprechenden Pufferbedingungen und einem Gesamtvolumen von 50 μΙ), amplifiziert. Die PCR-Produkte und das Plasmid pPICZaB-A/del-HRP-WT wurden unter Verwendung der A/del/H/ndlll-Restriktionsstellen kloniert.
Transformation, Wachstum und Enzym-Assays: 45 Für die Pichia pastoris Transformation wurden alle HRP-Vektoren mit Nde\ linearisiert und alle PaHNL5a Plasmide mit BglW. Die Transformation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Kultivierung der P. pastoris-Stämme ging ebenfalls, mit einigen wenigen Ausnahmen, wie in Beispiel 1 beschrieben vonstatten. Die Anfangsmenge BMD (1%) wurde auf 350 μΙ so erhöht und nach 60 Stunden wurden 100 μΙ der Kultur für die Zentrifugation (4000 UpM, 4°C, 10 min) entnommen. Die Methanolinduktion wurde exakt wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. 50 μΙ (Derepression) bzw. 10 μΙ (Induktion) des Überstandes der Zentrifugation wurden für den 55 HNL-Assay und 15 μΙ beider Bedingungen für den HRP-Assay eingesetzt. 50 AT 501 955 B1 HRP-Assay (gemäß [35]): 15 μΙ des Überstandes wurden zu 150 μΙ 1 mM ABTS/2,9 mM H202 in 50 mM NaOAc Puffer pH 4,5 in PS-Mikrotiter-Platten zugegeben. Die Absorption wurde 5 Minuten lang bei 405 nm im 5 Spectramax Plus384 Platereader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) verfolgt. HNL-Assay (gemäß [36]): 50 μΙ bzw. 10 μΙ des Überstandes wurden zu 100 bzw. 140 μΙ 0.05M Phosphat-Citrat-Puffer io pH 5.0 in einer UV-Star-Mikrotiterplatte zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μΙ 0.06 M Mandelonitril-Lösung (in 0.003 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 3.5) gestartet und 5 Minuten bei 280 nm im Spectramax Plus384 Platereader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) verfolgt. 15 Ergebnisse und Diskussion:
Die Resultate, bei Verwendung der alternativen Reporterproteine PaHNL5a und HRP, zeigen eindeutig die Übertragbarkeit der beobachteten Promotoraktivität bei Verwendung von GFP-Zeo (Tabelle 17). 20
Aufgrund der geringeren Sensitivität des HRP-Assays war der Expressionslevel unter derepri-mierenden Bedingungen unterhalb der Detektionsgrenze. Deshalb konnte unter dereprimieren-den Bedingungen die HRP-Expression nicht bestimmt werden. GFP-Zeo PaHNL5a HRP Promoter Derepr. Methanol Derepr. [mE/minl Methanol [mE/min] Derepr. rmE/min] Methanol [mE/min] P(AOX1) 27,3 (100%) 987 (100%) 2,58 (100%) 69,5 (100%) n.d. 20,9 (100%) P(AOX1) 29,5 1188 2,37 100 n.d. 23,9 Δ1 (108%) (120%) (92%) (144%) (115%) P(AOX1) 43,0 399 n.d. 91,7 n.d. 17,1 Δ2 (157%) (40%) (132%) (82%) P(AOX1) 89,9 422 8,65 51,7 - - Δ6* (329%) (42%) (335%) (74%) P(AOX1) 9,9 336 1,29 37,5 - - Δ2Δ6 (36%) (34%) (50%) (54%) n.d. nicht detektierbar 25 Tabelle 17: Promotoraktivitäten mehrerer AOX7-Promotorvarianten mit alternativen Reporterenzymen (in Klammer ist die relative Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Promotor unter glei-chen Bedingungen angegeben (Derepression bzw. Induktion)_
Um die Multicopy-Selektion auf die alternativen Reportersysteme zu übernehmen, wurden AOX7-Promotorvarianten in die entsprechenden HRP- und PaHNL5a-Plasmide vor das Zeocin-Resistenzgen kloniert, und ersetzten so den TEF1-Promotor. 50
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Sequenz des Promotors:
Seq ID Nr. 1: AOX1 Promotor von Pichia pastoris 40 ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgc caaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgcc atcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctg tctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgaggg ctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaa 45 gcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcatac cgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacc tgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatact gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaa acctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgaga 50 agatcaaaaaacaactaattattgaaagaattcaacc
Sequenzprotokoll <110> Technische Universität Graz 55 <120> Mutierte AOX1-Promotoren 52 AT 501 955 B1 <130 R 44824 <140 ATA 304/2005 <141 > 2005-02-23 5 <160> 137 <170> Patentin Version 3.3 10 <210> 1 <211> 953 <212> DNA <213> Pichia pastoris 15 <220> <223> AOX1 Promoter <400> 1 ggtaccagat ctaacatcca aagacgaaag 20 ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca 25 tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg 30 cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc aatactgctg atagcctaac gttcatgatc agcaatatat aaacagaagg aagctgccct tagcttactt tcataattgc gactggttcc 35 taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa <210> 2 <211> 32 <212> DNA 40 <213> Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 2 aaggtaccag atctaacatc caaagacgaa <210> 3 <211> 42 50 <212> DNA <213> Artificial gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 60 aacgcaacag gaggggatac actagcagca 120 cttctcctca acacccactt ttgccatcga 180 agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 240 tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 300 ttacacccga acatcactcc agatgagggc 360 ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 420 gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 480 caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 540 gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 600 cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca 660 cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg 720 aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac 780 gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat 840 aattgacaag cttttgattt taacgacttt 900 ctaattattg aaagaattca acc 953 ag 32 <220 <223> Primer 55 53 AT 501 955 B1 <400> 3 ctagccatgg ttgaattctt tcgaataatt agttgttttt tg 42 <210> 4 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> io <223> Primer <400> 4 gaaagaattc aaccatggct agcaaaggag 30 15 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 5 gatgatggtc tagaacgtgt cagtcctgct cctc 34 25 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial 30 <220> <223> Primer <400> 6 35 gacacgttct agaccatcat catcatcatc attg 34 <210> 7 <211> 26 <212> DNA 40 <213> Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 7 atagcggccg cacaaacgaa ggtctc 26
<210> 8 <211> 40 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 55 54 AT 501 955 B1 <400> 8 caacacccac tttaggctac taacaccatg actttattag 40 <210> 9 5 <211> <212> <213> 34 DNA Artificial <220> 10 <223> Primer <400> 9 gttagtagcc taaagtgggt gttgaggaga agag 34 15 <210> <211> <212> <213> 10 32 DNA Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 10 gttcatgttt gtagatgagg gctttctgag tg 32 <210> 11 <211 > <212> <213> 30 DNA Artificial 30 <220> <223> Primer <400> 11 35 gccctcatct acaaacatga acctcgccag 30 <210> 12 <211> <212> 40 <213> 28 DNA Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 12 gagggctttc ccaaatggcc caaaactg 28 <210> 13 <211 > so <212> <213> 28 DNA Artificial <220> <223> 55 Primer 55 AT 501 955 B1 <400> 13 ccatttggga aagccctcat ctggagtg 28 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 cggccagttg ttggtattga ttgacgaatg c 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 caataccaac aactggccgt tagcatttc 29 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 gcttctgaac cttgtctcca cattgtatgc ttc 33 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 gtggagacaa ggttcagaag cgatagagag ac 32 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 56 AT 501 955 B1 <400> 18 gtctccacac tgctgatagc ctaacgttc <210> 19 5 <211 > 35 <212> DNA <213> Artificial <220> 10 <223> Primer <400> 19 ggctatcagc agtgtggaga caatgcataa tcatc 15 <210> 20 <211 > 30 <212> DNA <213> Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 20 ggaatactgc tctaacccct acttgacagc 25 <210> 21 <211 > 32 <212> DNA <213> Artificial 30 <220> <223> Primer <400> 21 35 gtaggggtta gagcagtatt cccaccagaa tc <210> 22 <211 > 29 <212> DNA 40 <213> Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 22 cttgacagca agctgccctg tcttaaacc <210> 23 <211 > 28 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 29 35 30 32 29 55 57 AT 501 955 B1 <400> 23 gggcagcttg ctgtcaagta ggggttag 28 <210> 24 5 <211> <212> <213> 34 DNA Artificial <220> 10 <223> Primer <400> 24 ctgtcttaaa ccttactggt tccaattgac aagc 34 15 <210> <211> <212> <213> 25 29 DNA Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 25 ggaaccagta aggtttaaga cagggcagc 29 25 <210> 26 <211> <212> <213> 44 DNA Artificial 30 <220> <223> Primer <400> 26 35 gatacactag cagcagaccg ttgcaaacgc aggacctcca ctcc 44 <210> 27 <211> <212> 40 <213> 47 DNA Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 27 gtgaaggtga tgctacatac ggaaagctta cccttaaatt tatttgc 47 <210> 28 <211> 50 <212> <2 3> 41 DNA Artificial <220> <223>
Primer 55 58 AT 501 955 B1 <400> 28 cgtggccgag gagcaggact gacacgttct agaccatcat c 41 <210> 29 5 <211> <212> <213> 22 DNA Artificial <220 io <223> Primer <400 29 tccaaagacg aaaggttgaa tg 22 15 <210> <211> <212> <213> 30 23 DNA Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 30 ccgtatgtag catcaccttc acc 23 25 <210> 31 <211 > <212> <213> 15 DNA Artificial 30 <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 31 35 ctgtggatgt cggat 15 <210> 32 <211 > <212> 40 <213> 21 DNA Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 45 <400> 32 agaagaggag tggaggtcct g 21 <210> 33 <211 > 50 <212> <213> 13 DNA Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 55 59 AT 501 955 B1 <400> 33 caagcccaat aac 13 <210> 34 5 <211> <212> <213> 13 DNA Artificial <220> 10 <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 34 gagctccaat caa 13 15 <210> <211 > <212> <213> 35 15 DNA Artificial 20 <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 35 ctcgctcatt ccaat 15 25 <210> 36 <211> <212> <213> 9 DNA Artificial 30 <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 36 35 ccagggggg 9 <210> 37 <211 > <212> 40 <213> 15 DNA Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 45 <400> 37 tacacccgaa catca 15 <210> 38 <211> 50 <212> <213> 7 DNA Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 55 60 <400> 38 tggggtc <210> 39 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> io <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 39 agaaacttcc aaaagtcggc 15 <210> 40 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial 20 <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 40 atcatccaaa aag 25 <210> 41 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial 30 <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 <400> 41 35 tgcattgtct c <210> 42 <211> 15 <212> DNA 40 <213> Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 45 <400> 42 atgcttccaa gatte
<210> 43 <211> 21 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Transcription factor binding site of AOX1 55 61 AT 501 955 B1 <400> 43 acagttaaat tttgatcatg a 21 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 Promoter <400> 44 tttgccatcg aaaaaccagc ccagttattg ggcttgattg gagctcgctc attccaattc 60 cttcta 66 <210> 45 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 Promoter <400> 45 ttatttccga atgcaacaag ctccgcatta cacccgaaca tcactcc 47 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 Promoter <400> 46 ctgagtgtgg ggtcaaatag tttcatgttc 30 <210> 47 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 Promoter <400> 47 gtcaaaaaga aacttccaaa agtcggcata ccgtttgtct tgt 43 <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> 5 5 62 AT 501 955 B1 <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 promoter <400> 48 ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgca 59 <210> 49 <211> <212> <213> 30 DNA Artificial 10 <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 promoter <400> 49 15 attgtatgct tccaagattc tggtgggaat 30 <210> 50 <211> <212> 20 <213> 35 DNA Artificial <220> <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 promoter 25 <400> 50 tgatagccta acgttcatga tcaaaattta actgt 35 <210> 51 <211> 30 <212> <213> 17 DNA Artificial <220> <223> 35 Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 promoter <400> 51 aatatataaa cagaagg 17 <210> 52 40 <211 > <212> <213> 39 DNA Artificial <220> 45 <223> Nucleic acid fragment deleted from the AOX1 promoter <400> 52 tttttttatc atcattatta gcttactttc ataattgcg 39 so <210> <211> <212> <213> 55 <220> 53 40 DNA Artificial 5 5 63 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 53 gaatgaaacc tttttgccat atccacaggt ccattctcac 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 54 15 gaatggacct gtggatatgg caaaaaggtt tcattcaacc 40 <210> 55 <211> 38 <212> DNA 20 <213> Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 55 ccgttgcaaa cgcaggacct cttctcctca acacccac 38
<210> 56 <211> 38 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 35 <400> 56 gtgttgagga gaagaggtcc tgcgtttgca acggtctg 38 <210> 57 40 <211 > 42 <212> DNA <213> Artificial <220> 45 <223> Primer <400> 57 cgaaaaacca gcccagttgc ttgattggag ctcgctcatt cc 42 so <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 55 <220> 5 5 64 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 58 gagcgagctc caatcaagca actgggctgg tttttcgatg 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 59 15 cagcccagtt attgggcttg agctcgctca ttccaattcc 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA 20 <213> Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 60 ggaattggaa tgagcgagct caagcccaat aactgggctg 40 <210> 61 <211> 39
30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 35 <400> 61 ggcttgattg gagctcgcta attccttcta ttaggctac 39 <210> 62 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> 45 <223> Primer <400> 62 gtagcctaat agaaggaatt agcgagctcc aatcaagcc 39 so <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial 55 <220> 5 65 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 63 42 gcctgtctat cctggccggc gaggttcatg tttgtttatt tc <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 64 42 15 caaacatgaa cctcgccggc caggatagac aggctaataa ag <210> 65 <211> 38 <212> DNA 20 <213> Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 65 gcaacaagct ccgcattaca acatcactcc agatgagg 38 <210> 66 <211> 38
so <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 35 <400> 66 cctcatctgg agtgatgttg taatgcggag cttgttgc 38 <210> 67 40 <211 > 40 <212> DNA <213> Artificial <220> 45 <223> Primer <400> 67 ccagatgagg gctttctgag tgaaatagtt tcatgttccc so <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 55 <220> 40 66 <223> Primer <400> 68 gggaacatga aactatttca 5 <210> 69 <211 > 39 <212> DNA <213> Artificial 10 <220 <223> Primer <400 69 15 gccagttggt caaaaacaaa <210> 70 <211> 40 <212> DNA 20 <213> Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 70 cggtatgccg acttttgttt <210 71 <211> 42 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 35 <400 71 caaatgggga aacacccgct <210 72 40 <211 > 41 <212> DNA <213> Artificial <220 45 <223> Primer <400> 72 gagacaatgc ataatcataa 50 <210> 73 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial 55 <220> ctcagaaagc cctcatctgg agtcggcata ccgtttgtc ttgaccaact ggccgttagc tatgattatg cattgtctcc ac gcgggtgttt ccccatttgc g 5 5 67 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 73 gctttttgga tgattatgcc tccacattgt atgcttccaa g 41 <210> 74 <211 > <212> <213> 41 DNA Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 74 15 cttggaagca tacaatgtgg aggcataatc atccaaaaag c 41 <210> 75 <211> <212> 20 <213> 42 DNA Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 75 cattgtctcc acattgtatg aagattctgg tgggaatact gc 42 <210> 76 <211 > 30 <212> <213> 40 DNA Artificial <220> <223> Primer 35 <400> 76 gtattcccac cagaatcttc atacaatgtg gagacaatgc 40 <210> 77 40 <211 > <212> <213> 42 DNA Artificial <220> 45 <223> Primer <400> 77 gctgatagcc taacgttcat gttctaaccc ctacttgaca gc 42 so <210> <211 > <212> <213> 78 41 DNA Artificial 55 <220> 68 68 <223> Primer <400> 78 gtcaagtagg ggttagaaca 5 <210> 79 <211 > 41 <212> DNA <213> Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 79 15 ggaatactgc tgatagcttc <210> 80 <211> 40 <212> DNA 20 <213> Artificial <220 <223> Primer 25 <400> 80 gttaaatttl t gatcatgaag <210 81 <211> 42 30 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> Primer 35 <400> 81 ggaatactgc tgatagccac <210> 82 40 <211 > 40 <212> DNA <213> Artificial <220 45 <223> Primer <400> 82 gttaaatttl t gatcatgaac 50 <210 83 <211 > 37 <212> DNA <213> Artificial 55 <220 tgaacgttag gctatcagca g atgatcaaaa tttaactgtt c ctatcagcag tattcccacc gttcatgatc aaaatttaac tg gtggctatca gcagtattcc 69 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 83 gagatcagat ctaacatatg ccaaagacga aaggttg 37 <210> 84 <211 > <212> <213> 37 DNA Artificial 10 <220> <223> Primer <400> 84 15 caacctttcg tctttggcat atgttagatc tgatctc 37 <210> 85 <211> <212> 20 <213> 34 DNA Artificial <220> <223> Primer 25 <400> 85 aaacatatga gatctaacat ccaaagacga aagg 34 <210> 86 <211 > 30 <212> <213> 27 DNA Artificial <220> <223> Primer 35 <400> 86 tggttgaatt ctttcaataa ttagttg 27 <210> 87 40 <211 > <212> <213> 46 DNA Artificial <220> 45 <223> Primer <400> 87 cgccacaaca ttgaagatgg ttccgttcaa ctagcagacc attatc 46 50 <210 <211 > <212> <213> 88 49 DNA Artificial 55 <220> 70 AT 501 955 B1 <223> Primer <400> 88 ggaaacattc tcggacacaa acttgagtac aactataact cacacaatg 49 <210> 89 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 89 atctcgagtt acttgtacaa ttcatccatg ccatgtgtaa tccc 44 <210> 90 <211> 178 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 Promoter fragment <400> 90 cttaaggaca gcaatatata aacagaagga agctgccctg tcttaaacct ttttttttat 60 catcattatt agcttacttt cataattgcg actggttcca attgacaagc ttttgatttt 120 aacgactttt aacgacaact tgagaagatc aaaaaacaac taattattga aagaattc 178 <210> 91 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment <400> 91 cttaagtgtt ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct 60 taaacctttt tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt 120 gacaagcttt tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa 180 ttattgaaag aattc 195 <210> 92 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> AOX1 promoter fragment <223> 71 <400> 92 tagcctaacg tt <210> 93 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> ίο <223> AOX1 promoter fragment <400> 93 catgatcaaa attt 15 <210> 94 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 94 tttgaattct ttcaataatt agttgttttt tg 25 <210> 95 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial 30 <220> <223> Primer <400> 95 35 ttagatctcg acttaaggac agcaatatat aaacagaagg aag <210> 96 <211> 39 <212> DNA 40 <213> Artificial <220> <223> Primer 45 <400> 96 ttagatctcg acttaagtgt tctaacccct acttgacag <210> 97 <211> 52
50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 55 72 AT 501 955 B1 <400> 97 aaagatctta gcctaacgtt cttaaggaca gcaatatata aacagaagga ag 52 <210> 98 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 98 aaagatctca tgatcaaaat ttcttaagga cagcaatata taaacagaag gaag 54 <210> 99 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 99 gatctcgact taagcaatcg tcttactttc taacttttct taccttttac atttcag 57 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 100 caatatatat atatatttca aggatatacc g 31 <210> 101 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 101 aattcggtat atccttgaaa tatatatata tattgctgaa atgtaaaag 4g <210> 102 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 73 AT 501 955 B1 <400 102 gtaagaaaag ttagaaagta agacgattgc ttaagtcga 39 <210> 103 5 <211> <212> <213> 22 DNA Artificial <220 io <223> Primer <400> 103 ggttgaattc ggtatatcct tg 22 15 <210> <211 > <212> <213> 104 46 DNA Artificial 20 <220> <223> Primer <400> 104 aaagatctta gcctaacgtt cttaagcaat cgtcttactt tctaac 46 <210> 105 <211> <212> <213> 15 DNA Artificial 30 <220 <223> A0X1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 105 35 gccatccgac atcca 15 <210> 106 <211> <212> 40 <213> 18 DNA Artificial <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 45 <400> 106 ggacctccac tcctcttc 18 <210> 107 <211 > 50 <212> <213> 76 DNA Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 55 74 AT 501 955 B1 <400> 107 ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc 60 aattccttct attagg 76 <210> <211> <212> <213> 108 15 DNA Artificial 10 <220> <223> AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 108 15 cagttattgg gcttg 15 <210> <211> <212> 20 <213> 109 15 DNA Artificial <220> <223> AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 25 <400> 109 gcttgattgg agctc 15 <210> <211> 30 <212> <213> 110 16 DNA Artificial <220> <223> 35 AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 110 tcgctcattc caattc 16 <210> 111 40 <211 > <212> <213> 15 DNA Artificial <220> 45 <223> AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 111 tggcccccct ggcga 15 50 <210> <211> <212> <213> 55 <220> 112 57 DNA Artificial 5 5 75 AT 501 955 B1 <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 112 tttgtttatt tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatg 57 <210> 113 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial 10 <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 113 15 attacacccg aacat 15 <210> 114 <211> 40 <212> DNA 20 <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 25 <400> 114 gctttctgag tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa 40 <210> 115 <211> 17
30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 115 gagtgtgggg tcaaata 17 <210> 116 40 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> 45 <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 116 agttgacaag acaaacggta tgccgacttt tggaagtttc tttttgactt ggt 53 50 <210> 117 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial 55 <220> 76 AT 501 955 B1 <223> AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 117 aaaaagaaac ttccaaaa 18 <210> 118 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400 118 gaaccccggt gcacctgtgc cgaaacgcaa atggggaaac acccgctttt tggatgatta 60 tgcattgtc 69 <210> 119 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 119 cgctttttgg atgat 15 <210> 120 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 120 tatgcattgt ctcca 15 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 121 tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc 40 <210> 122 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <220> 77 AT 501 955 B1 <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 122 5 tagcctaacg tt 12 <210> 123 <211> <212> 10 <213> 15 DNA Artificial <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 15 <400 123 gtatgcttcc aagat 15 <210> 124 <211> 20 <212> <213> 45 DNA Artificial <220> <223> 25 AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 124 actgctgata gcctaacgtt catgatcaaa atttaactgt tctaa 45 <210> 125 30 <211 > <212> <213> 25 DNA Artificial <220> 35 <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 125 ttcatgatca aaatttaact gttct 25 40 <210> <211 > <212> <213> 126 36 DNA Artificial 45 <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 126 atagcctaac gttcatgatc aaaatttaac tgttct 36 50 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial 55 <220 <220 78 AT 501 955 B1 <223> A0X1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400 127 5 acagcaatat ataaacagaa ggaagct 27 <210> <211 > <212> 10 <213> 128 49 DNA Artificial <220> <223> A0X1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 15 <400> 128 accttttttt ttatcatcat tattagctta ctttcataat tgcgactgg 49 <210> <211 > 20 <212> <213> 129 16 DNA Artificial <220> <223> 25 A0X1 Promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 129 atagcctaac gttcat 16 <210> 130 30 <211 > <212> <213> 85 DNA Artificial <220 35 <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 130 cttggaacct aatatgacaa aagcgtgatc tcatccaaga tgaactaagt ttggttcgtt 60 40 gaaatgctaa cggccagttg cttgg 85 <210> 131 <211 > <212> 45 <213> 32 DNA Artificial <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted 50 <400> 131 ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt ta 32 <210> 132 <211> 32
<212> DNA 55 5 5 79 AT 501 955 B1 <213> Artificial <220 <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400 132 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ct 32 <210> 133 io <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220 15 <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 133 ggagctcgct cattccaatt ccttctatta gg 32 20 <210> 134 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial 25 <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 134 ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct c 51 30 <210> 135 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial 35 <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 135 40 aatactgctg atagcctaac gttcatgatc aaaataatac 40 <210 136 <211> 43 <212> DNA 45 <213> Artificial <220> <223> A0X1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted so <400> 136 taatctcatt aatgcttagc gcagtctctc tatcgcttta atc <210> 137 <211> 50
55 <212> DNA 43

Claims (27)

  1. 80 AT 501 955 B1 <213> Artificial <220> <223> AOX1 promoter fragment containing transcription factor binding site to be deleted <400> 137 ttctgaaccc cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc 50 io Patentansprüche: 1. Mutierter Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1(AOX1)-Promotor vom Wildtyp-Pichia pastoris-AOX1-Promotor (SEQ ID Nr. 1), umfassend mindestens eine Mutation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 15 a) einer Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle (TFBS), b) den Nukleotiden 170 bis 235 (-784 bis -719), den Nukleotiden 170 bis 191 (-784 bis -763), den Nukleotiden 192 bis 213 (-762 bis -741), den Nukleotiden 192 bis 210 (-762 bis -744), den Nukleotiden 207 bis 209 (-747 bis -745), den Nukleotiden 214 bis 235 (-740 bis -719), den Nukleotiden 304 bis 350 (-650 bis -604), den Nukleotiden 364 bis 393 (-590 bis 20 -561), den Nukleotiden 434 bis 508 (-520 bis -446), den Nukleotiden 509 bis 551 (-445 bis -403), den Nukleotiden 552 bis 560 (-402 bis -394), den Nukleotiden 585 bis 617 (-369 bis -337), den Nukleotiden 621 bis 660 (-333 bis -294), den Nukleotiden 625 bis 683 (-329 bis -271), den Nukleotiden 736 bis 741 (-218 bis -213), den Nukleotiden 737 bis 738 (-217 bis -216), den Nukleotiden 726 bis 755 (-228 bis -199), den Nukleotiden 784 bis 800 (-170 bis 25 -154) oder den Nukleotiden 823 bis 861 (-131 bis -93) der SEQ ID Nr. 1, und Kombinatio nen davon.
  2. 2. Promotor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor weiters eine Mutation der Nukleotide 694 bis 723 (-260 bis -231) und/oder der Nukleotide 729 bis 763 30 (-225 bis -191) der SEQ ID Nr. 1 umfasst.
  3. 3. Promotor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation eine Deletion, eine Substitution, eine Insertion, eine Inversion und/oder eine Multiplikation ist.
  4. 4. Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkrip tionsfaktor-Bindungsstelle (TFBS) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hap1, Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rap1, Adr1, MatlMC, Gcr1 und QA-1F.
  5. 5. Promotor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkriptionsfaktor- 40 Bindungsstelle (TFBS) Hap1 die Nukleotide 54 bis 58 der SEQ ID Nr.1, Hsf die Nukleotide 142 bis 149 und 517 bis 524 der SEQ ID Nr. 1, Hap234 die Nukleotide 196 bis 200, 206 bis 210 und 668 bis 672 der SEQ ID Nr. 1, abaA die Nukleotide 219 bis 224 der SEQ ID Nr. 1, Stre die Nukleotide 281 bis 285 der SEQ ID Nr. 1, Rap1 die Nukleotide 335 bis 339 der SEQ ID Nr. 1, Adr1 die Nukleotide 371 bis 377 der SEQ ID Nr. 1, MatlMC die Nukleotide 45 683 bis 687 der SEQ ID Nr. 1, Gcr1 die Nukleotide 702 bis 706 der SEQ ID Nr. 1 und QA- 1F die Nukleotide 747 bis 761 der SEQ ID Nr. 1 umfasst.
  6. 6. Nukleinsäure-Molekül, umfassend mindestens einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1 (AOX1)-Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und mindestens eine Nuk- 50 leinsäure, die für ein Protein (Peptid) oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor und die Nukleinsäure operativ miteinander verbunden sind, wobei sie eine Single- oder Multicopy-Expressionskassette bilden.
  7. 7. Vektor, umfassend einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1(AOX1)-Promotor 55 nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 6. 81 AT 501 955 B1
  8. 8. Zelle, umfassend mindestens einen mutierten Pichia pastoris-Alkohol-Oxidase 1(AOX1)-Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mindestens ein Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 6 oder mindestens einen Vektor nach Anspruch 7.
  9. 9. Zelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Escherichia coli-Zelle ist.
  10. 10. Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle, ist. 10
  11. 11. Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die methylotrophe Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis.
  12. 12. Zelle nach Anspruch 8, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pichia 15 pasfor/s-Zelle ist.
  13. 13. Set zur Expression eines ausgewählten Proteins, umfassend i) einen Vektor nach Anspruch 7 und ii) eine Zelle, die dieses Protein unter der Kontrolle eines Promotors nach einem der An- 20 Sprüche 1 bis 5 exprimieren kann.
  14. 14. Set nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle, ist.
  15. 15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die methylotrophe Hefezelle ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis.
  16. 16. Set nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pichia pastoris-Zelle ist. 30
  17. 17. Verfahren zur Expression eines rekombinanten Proteins, Peptids oder einer funktionellen Nukleinsäure in einer Zelle, umfassend die folgenden Schritte: - Vorsehen eines Nukleinsäure-Moleküls nach Anspruch 6 oder eines Vektors nach Anspruch 7, umfassend einen AOX1-Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und eine 35 Nukleinsäure, die für ein Protein, Peptid, oder eine funktionelle Nukleinsäure codiert, wobei der Promotor operativ mit der Nukleinsäure verbunden ist, - Transformieren der Zelle mit dem Vektor oder dem Nukleinsäure-Molekül, - Züchten der transformierten Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, - gegebenenfalls Induzieren der Expression des Proteins, Peptids oder der funktionellen 40 Nukleinsäure, und - Isolieren des exprimierten Proteins, Peptids oder der funktionellen Nukleinsäure.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Hefezelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle, ist. 45
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die methylotrophe Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis.
  20. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle so eine Pichia pastoris-Zelle ist.
  21. 21. Verwendung eines Nukleinsäure-Moleküls nach Anspruch 6, eines Vektors nach Anspruch 7 oder einer Zelle nach Anspruch 8, 10, 11 oder 12 zur Expression eines Proteins, Peptids oder einer funktionellen Nukleinsäure. 55 82 AT 501 955 B1
  22. 22. Verfahren zur Isolierung von Superexpressionsklonen oder von Klonen, die eine konstitutive Expression vermitteln, umfassend die Schritte: a) Einführen eines Nukleinsäure-Moleküls nach Anspruch 6 oder eines Vektors nach Anspruch 7 in eine Zelle, 5 b) Transferieren der Zelle aus Schritt a) in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker, Sorbit und Methanol aufweist, zum selektiven Wachstum von Superexpressions-Klonen unter induzierenden Bedingungen, oder in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker und Sorbit ohne Methanol enthält, zum selektiven Wachstum von Supe-rexpressions-Klonen unter dereprimierenden Bedingungen, oder in ein Medium, das einen io geeigneten selektiven Marker und Glukose zusammen mit Methanol umfasst, zum selekti ven Wachstum von Zellen, deren Methanol-induzierbare Promotor-Variante dereprimierte und induzierte Expression in Anwesenheit von Glukose vermittelt, oder in ein Medium, das einen geeigneten selektiven Marker und Glukose ohne Methanol umfasst, zum selektiven Wachstum von Zellen, deren Methanol-induzierbare Promotor-Variante eine konstitutive 15 Expression in Anwesenheit von Glukose vermittelt, und c) Inkubieren der Zelle aus Schritt b) auf dem Medium, d) Isolieren einer Kolonie der aus Schritt c) erhaltenen Zelle, und e) Detektieren superexprimierender Klone oder Klone, die eine konstitutive Expression vermitteln, durch Bestimmen der Expressionsrate der Zelle. 20
  23. 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der selektive Marker ein Antibiotikum, vorzugsweise Zeocin oder Geniticin, ist.
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Hefe- 25 zelle, vorzugsweise eine methylotrophe Hefezelle, ist.
  25. 25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die methylotrophe Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Candida, Hansenula, Pichia und Toruplosis.
  26. 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pichia pastoris-Zelle ist.
  27. 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäure-Molekül oder der Vektor in die Zelle durch Transformation, vorzugsweise 35 Elektroporation oder chemische Transformation, oder durch Protoplasten-Fusion oder durch Partikel-Beschuss eingeführt wird. Hiezu 8 Blatt Zeichnungen 40 45 50 55
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