CN114555812A

CN114555812A - 用于蛋白质产生的材料和方法

Info

Publication number: CN114555812A
Application number: CN202080041851.4A
Authority: CN
Inventors: M·A·霍伊特; 郭晓; S·尚卡尔
Original assignee: Impossible Foods Inc
Current assignee: Impossible Foods Inc
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2022-05-27
Also published as: MX2021012671A; WO2020215017A1; SG11202111468SA; IL287318A; US11427932B2; US20200332267A1; JP2022529021A; BR112021020727A2; US20220389616A1; CA3137100A1; EP3956454A1; AU2020257270A1; KR20210153106A

Abstract

本文件涉及用于产生蛋白质的材料和方法。一方面，本文件提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于对应于核苷酸位置668‑734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

Description

用于蛋白质产生的材料和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年4月17日提交的美国临时申请序列号62/835,338的优先权，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。

以电子方式提交的文本文件的说明

与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本，文件名：38767-0193WO1_SequenceListing.txt，记录日期：2020年4月17日，文件大小：约53千字节。

技术领域

本公开总体上涉及DNA构建体和使用此类DNA构建体对如酵母细胞或甲基营养型酵母细胞等细胞进行基因工程化的方法。

背景技术

产物的重组表达是用于产生所述产物的常用方法。在某些情况下，可以通过重组产生来产生蛋白质。本文提供了可以用于使一或多个产物(例如蛋白质)在如酵母细胞或甲基营养型酵母细胞等细胞中高效表达的构建体。

发明内容

本文件至少部分地基于对AOX1启动子中的点突变的鉴定，所述点突变可以使连接的编码序列的表达增加。例如，本文所描述的突变的AOX1启动子可以用于使可操作地连接的编码序列在毕赤酵母(Pichia)中高效表达。

在一个方面，本文提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施方案可以具有以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置673-729中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置678-724中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置683-719中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置688-714中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变。

在另一方面，本文提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施方案可以包含以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的两个或两个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于以下的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变：T688、A696、T702、A712和T714。

在另一方面，本文提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ IDNO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施方案可以包含以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的两个或两个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的三个或三个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的四个或四个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的五个或五个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

本文所述的核酸构建体中的任何核酸构建体的实施方案可以具有以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以是醇氧化酶1启动子元件。所述第一醇氧化酶启动子元件可以与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。所述第一醇氧化酶启动子元件可以与SEQ ID NO:28具有至少95％的序列同一性。所述核酸构建体可以进一步包含对第一蛋白质进行编码的核苷酸序列，其中对所述第一蛋白质进行编码的所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接。所述第一蛋白质对于甲基营养型酵母细胞可以是外源性的。所述第一蛋白质对于甲基营养型酵母细胞可以是异源性的。所述第一蛋白质可以选自由以下组成的组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子、细胞因子抑制剂和血红素结合蛋白。所述第一蛋白质可以是血红素结合蛋白。所述血红素结合蛋白可以选自由以下组成的组：珠蛋白、细胞色素、细胞色素c氧化酶、木质素酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。所述血红素结合蛋白可以选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白(androglobin)、血绿蛋白(chlorocruorin)、细胞珠蛋白、无脊血红蛋白(erythrocruorin)、黄素血红蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、组织珠蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、非共生血红蛋白、原珠蛋白和截短的血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以是非共生血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以是豆血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27中的任一个的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含转录因子的识别序列。

在另一方面，本文还提供了一种甲基营养型酵母细胞，所述甲基营养型酵母细胞包括第一核酸构建体，其中所述第一核酸构建体是本文所述的任何核酸构建体。

实施方案可以具有以下特征中的一或多个特征。所述甲基营养型酵母细胞可以是毕赤酵母细胞、假丝酵母(Candida)细胞、汉逊酵母(Hansenula)细胞或球拟酵母(Torulopsis)细胞。所述甲基营养型酵母细胞可以是甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)细胞、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)细胞或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞。所述甲基营养型酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母细胞。所述甲基营养型酵母细胞可以进一步包含第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含对第二蛋白质进行编码的核苷酸序列，其中对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件或与第二启动子元件可操作地连接。对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列可以与具有与所述第一醇氧化酶启动子元件相同的序列的第二启动子元件可操作地连接。所述第二蛋白质可以是转录因子。对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列可以与可以包含所述转录因子的识别序列的第二启动子元件可操作地连接。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含所述转录因子的识别序列。所述第二蛋白质可以是参与血红素生物合成的蛋白质。参与血红素生物合成的所述蛋白质可以选自由以下组成的组：氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、尿卟啉原III合酶(UPG3S)、尿卟啉原III脱羧酶(UPG3D)、粪卟啉原氧化酶(COPROX)、原卟啉原IX氧化酶(PROTOX)和亚铁螯合酶(FC)。

在另一方面，本文提供了一种在甲基营养型酵母细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包含：对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含对第一蛋白质进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置处的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施方案可以包含以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置673-729中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置678-724中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置683-719中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置688-714中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变。

在另一方面，本文还提供了一种在甲基营养型酵母细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包含：对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含对第一蛋白质进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施方案可以包含以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的两个或两个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的如相比于SEQ IDNO:28的四个或四个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含位于对应于以下的核苷酸位置处的如相比于SEQ ID NO:28的突变：T688、A696、T702、A712和T714。

在另一方面，本文提供了一种在甲基营养型酵母细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包含：对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含对第一蛋白质进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施方案可以包含以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的两个或两个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的三个或三个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的四个或四个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的五个或五个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

本文所述的方法中的任何方法的实施方案可以具有以下特征中的一或多个特征。所述第一醇氧化酶启动子元件可以是醇氧化酶1启动子元件。所述第一醇氧化酶启动子元件可以与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。所述第一醇氧化酶启动子元件可以与SEQ ID NO:28具有至少95％的序列同一性。所述第一蛋白质对于所述甲基营养型酵母细胞可以是外源性的。所述第一蛋白质对于所述甲基营养型酵母细胞可以是异源性的。所述第一蛋白质可以选自由以下组成的组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子和血红素结合蛋白。所述第一蛋白质可以是血红素结合蛋白。所述血红素结合蛋白可以选自由以下组成的组：珠蛋白、细胞色素、细胞色素c氧化酶、木质素酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。所述血红素结合蛋白可以选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白、血绿蛋白、细胞珠蛋白、无脊血红蛋白、黄素血红蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、组织珠蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、非共生血红蛋白、原珠蛋白和截短的血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以是非共生血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以是豆血红蛋白。所述血红素结合蛋白可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27中的任一个的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。所述第一醇氧化酶启动子元件可以含有转录因子的一或多个识别序列。所述方法可以进一步包含使第二核酸构建体进行表达，所述第二核酸构建体包含对第二蛋白质进行编码的核苷酸序列，其中对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件或与第二启动子元件可操作地连接。对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列可以与具有与所述第一醇氧化酶启动子元件相同的序列的第二启动子元件可操作地连接。所述第二蛋白质可以是转录因子。对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列可以与可以包含所述转录因子的识别序列的第二启动子元件可操作地连接。所述第一醇氧化酶启动子元件可以包含所述转录因子的识别序列。所述第二蛋白质可以是参与血红素生物合成的蛋白质。参与血红素生物合成的所述蛋白质可以选自由以下组成的组：ALAS、ALAD、PBGD、UPG3S、UPG3D、COPROX、PROTOX和FC。所述方法可以在不存在添加的甲醇的情况下执行。

在另一方面，本文提供了一种巴斯德毕赤酵母细胞，所述巴斯德毕赤酵母细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包括对第一醇氧化酶启动子元件进行编码的核苷酸序列，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，所述一或多个突变可以选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

在另一方面，本文还提供了一种产生豆血红蛋白的方法，所述方法包含：对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含对豆血红蛋白进行编码的核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，所述方法可以在不存在添加的甲醇的情况下执行。在一些实施例中，所述一或多个突变可以选自由对应于以下的相对于SEQID NO:28的突变组成的组：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

在另一方面，本文提供了一种巴斯德毕赤酵母细胞，所述巴斯德毕赤酵母细胞包含第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述第一核酸构建体包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，所述一或多个突变可以选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的方法和材料可以用于实践本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。

在下文的附图和描述中阐述本发明的一或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将根据说明书和附图，并且根据权利要求书而变得显而易见。根据专利法的标准惯例，权利要求中的词语“包括”可以由“基本上由……组成”或“由……组成”替代。

附图说明

图1提供了示例性血红素结合蛋白的序列(SEQ ID NO:1-27)。

图2提供了pAOX1野生型的序列和突变序列(SEQ ID NO:28-29)。

图3是示出了pMx0414转化体在YPD培养基上生长的图像。

图4是绘制GFP在菌株MxY0270和MxY0279中在不同生长条件下的相对表达的图。

图5是MxG0038和MxG0220的序列的一部分的比较。

图6是绘制GFP在菌株MxY0964、MxY965和MxY1039中的相对表达的图。

图7提供了SEQ ID NO:30-37的序列。

具体实施方式

本文件涉及用于蛋白质产生的材料和方法。例如，在一方面，本文件涉及用于使用经工程化的启动子在细胞(例如酵母(例如，甲基营养型酵母))中产生产物(例如，蛋白质(例如，植物蛋白))的材料和方法。

如巴斯德毕赤酵母等甲基营养型酵母通常用于产生重组产物(例如蛋白质)。毕赤酵母菌株通常能够在作为唯一碳源的甲醇上生长。应当理解，巴斯德毕赤酵母已经被重新分类为驹形氏酵母(Komagataella)物种，如法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、巴斯德驹形氏酵母(Komagataella pastoris)或假巴斯德驹形氏酵母(Komagataellapseudopastoris)，但是术语“巴斯德毕赤酵母”仍然在使用中并且可以指任何合适的驹形氏酵母物种。通常，巴斯德毕赤酵母的实验室菌株是法夫驹形氏酵母。

可以借助于通过醇氧化酶的作用将甲醇转化为甲醛来开始甲醇利用。巴斯德毕赤酵母含有两个醇氧化酶基因，AOX1和AOX2。与醇氧化酶活性未降低的菌株相比，醇氧化酶活性降低的菌株(“甲醇利用缓慢”或MutS菌株)通常产生由AOX1启动子表达的更多的重组产物(例如蛋白质)。醇氧化酶1(AOX1)基因的被称为pAOX1的巴斯德毕赤酵母启动子可以用于产生异源性产物(例如蛋白质(例如工业相关的蛋白质))。在甲醇——一种易燃且有毒的化合物——存在的情况下，可以诱导由此启动子进行的表达。在一些实施例中，本文所述的材料和方法可以允许重组产物(例如蛋白质)在不存在甲醇的情况下从此启动子或来自所述启动子的启动子元件以高水平进行表达。在一些实施例中，本文所述的材料和方法可以允许重组产物(例如蛋白质)在不存在添加的甲醇的情况下从此启动子或来自所述启动子的启动子元件以高水平进行表达。

在如葡萄糖或甘油等非诱导型碳源存在的情况下，通常不存在由pAOX1进行的表达所述表达或非常差。本文描述了在pAOX1中的突变，所述突变允许在不存在甲醇的情况下由pAOX1进行的显著表达。本文描述了在pAOX1中的突变，所述突变允许在不存在添加的甲醇的情况下由pAOX1进行的显著表达。参考pAOX1序列在SEQ ID NO:28(图2)中提供。如本文所述的在pAOX1中的示例性突变在SEQ ID NO:29(图2)中提供。这些突变可以单独存在或以任何组合的形式存在。当甲醇存在时，这些突变还可以提供由pAOX1进行的表达的另外的增加。

因此，本文提供了核酸构建体(有时也被称为核酸分子)，所述核酸构建体包含启动子元件，所述启动子元件具有包含相比于参考启动子序列的一或多个突变的序列。在一些实施例中，启动子元件可以是醇氧化酶启动子元件。在一些实施例中，启动子元件可以与醇氧化酶启动子元件具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)的序列同一性(例如，SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，启动子元件可以具有SEQ ID NO:29。在一些实施例中，启动子元件中可以存在单个突变。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于位于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)之一中的相对于SEQID NO:28的突变的单个突变。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变之一的单个突变：T146C；C154T；T303C；T426A；A433T；A435G；T530A；C572T；T596C；T617C；T688C；A696T；T702C；A709G；A712G；T714G；A790G；A841T；或T862A。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变之一的单个突变：146C；154T；303C；426A；433T；435G；530A；572T；596C；617C；688C；696T；702C；709G；712G；714G；790G；841T；或862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置之一中的位置处的相对于SEQ ID NO:28的单个突变：T146；C154；T303；T426；A433；A435；T530；C572；T596；T617；T688；A696；T702；A709；A712；T714；A790；A841；或T862。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置之一中的位置处的相对于SEQ ID NO:28的单个突变：146；154；303；426；433；435；530；572；596；617；688；696；702；709；712；714；790；841；或862。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变之一的单个突变：T688C；A696T；T702C；A712G；或T714G。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变之一的单个突变：688C；696T；702C；712G；或714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置之一中的位置处的相对于SEQID NO:28的单个突变：T688；A696；T702；A712；或T714。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置之一中的位置处的相对于SEQ ID NO:28的单个突变：688；696；702；712；或714。

本文还提供了包含启动子元件的核酸构建体，所述启动子元件具有与参考启动子序列相比包含多个(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)突变的序列。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于位于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)中的相对于SEQ ID NO:28的突变的至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、2个到5个、2个到10个、2个到15个、2个到20个、5个到10个、5个到15个、5个到20个、10个到15个、10个到20个或15个到20个)突变。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18或19)突变：T146C；C154T；T303C；T426A；A433T；A435G；T530A；C572T；T596C；T617C；T688C；A696T；T702C；A709G；A712G；T714G；A790G；A841T；或T862A。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQID NO:28的以下突变的至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18或19)突变：146C；154T；303C；426A；433T；435G；530A；572T；596C；617C；688C；696T；702C；709G；712G；714G；790G；841T；或862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18或19)突变：T146；C154；T303；T426；A433；A435；T530；C572；T596；T617；T688；A696；T702；A709；A712；T714；A790；A841；或T862。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18或19)突变：146；154；303；426；433；435；530；572；596；617；688；696；702；709；712；714；790；841；或862。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的至少2个(例如，至少3个、至少4个、2个、3个、4个或5个)突变：T688C；A696T；T702C；A712G；或T714G。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的至少2个(例如，至少3个、至少4个、2个、3个、4个或5个)突变：688C；696T；702C；712G；或714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于以下位置之一的相对于SEQ ID NO:28的至少2个(例如，至少3个、至少4个、2个、3个、4个或5个)突变：T688；A696；T702；A712；或T714。例如，在一些实施例中，启动子元件中可以存在对应于以下位置之一的相对于SEQ ID NO:28的至少2个(例如，至少3个、至少4个、2个、3个、4个或5个)突变：688；696；702；712；或714。

在一些实施例中，核酸中的突变可以是插入、缺失或取代。在一些实施例中，核酸中的突变可以是取代(例如鸟苷到胞嘧啶的突变)。在一些实施例中，核酸中的突变可以在非编码序列中。在一些实施例中，编码序列(例如，对蛋白质进行编码)中的取代可以是沉默突变(例如，对相同的氨基酸进行编码)。在一些实施例中，编码序列中的取代可以是无义突变(例如，错义突变或无义突变)。在一些实施例中，编码序列中的取代可以是错义突变(例如，对不同的氨基酸进行编码)。在一些实施例中，编码序列中的取代可以是无义突变(例如，对提前终止密码子进行编码)。应当理解，突变可以用于使用例如CRISPR、TALEN和/或锌指核酸酶来改变内源性核酸。

在一些实施例中，蛋白质序列中的突变可以是插入、缺失或取代。应当理解，对蛋白质进行编码的核酸中的突变可能引起蛋白质序列中的突变。在一些实施例中，蛋白质序列中的突变是取代(例如，半胱氨酸到丝氨酸的突变或半胱氨酸到丙氨酸的突变)。

如本文所使用的，不同于参考核酸序列的核酸序列中(例如，与如SEQ ID NO:28等参考pAOX核酸序列相比，pAOX1启动子的截短、延伸或突变的核酸序列中)的“对应”核酸位置(或取代)可以通过在所关注的核酸序列之间执行序列比对来鉴定。应当理解，在某些情况下，在核酸比对中可能存在间隙。类似地，不同于参考蛋白质序列的蛋白质序列中(例如，与如SEQ ID NO:18等参考肌红蛋白序列相比，不同的生物体的肌红蛋白序列中)的“对应”氨基酸位置(或取代)可以通过在所关注的核酸序列之间执行序列比对来鉴定。应当理解，在某些情况下，在蛋白质比对中可能存在间隙。如本文所使用的，“相对于”参考序列的核苷酸或氨基酸位置可以是参考序列中的对应核苷酸或氨基酸位置。

在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的分类等级。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的域。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自真核(Eukarya)域。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的界。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自真菌界。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的门。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自子囊菌(Ascomycota)门。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的纲。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自酵母菌(Saccharomycetes)纲。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的目。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自酵母菌(Saccharomycetales)目。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的科。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自酵母(Saccharomycetaceae)科。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的属。例如，在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自毕赤酵母属。在一些实施例中，参考序列可以来自与比较序列相同的物种。

在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自酵母。在一些实施例中，参考序列和比较序列两者均可以来自甲基营养型酵母。

在一些实施例中，参考序列和比较序列可以具有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或99％)的序列同一性。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的两个突变：T146C和C154T；T146C和T303C；T146C和T426A；T146C和A433T；T146C和A435G；T146C和T530A；T146C和C572T；T146C和T596C；T146C和T617C；T146C和T688C；T146C和A696T；T146C和T702C；T146C和A709G；T146C和A712G；T146C和T714G；T146C和A790G；T146C和A841T；T146C和T862A；C154T和T303C；C154T和T426A；C154T和A433T；C154T和A435G；C154T和T530A；C154T和C572T；C154T和T596C；C154T和T617C；C154T和T688C；C154T和A696T；C154T和T702C；C154T和A709G；C154T和A712G；C154T和T714G；C154T和A790G；C154T和A841T；C154T和T862A；T303C和T426A；T303C和A433T；T303C和A435G；T303C和T530A；T303C和C572T；T303C和T596C；T303C和T617C；T303C和T688C；T303C和A696T；T303C和T702C；T303C和A709G；T303C和A712G；T303C和T714G；T303C和A790G；T303C和A841T；T303C和T862A；T426A和A433T；T426A和A435G；T426A和T530A；T426A和C572T；T426A和T596C；T426A和T617C；T426A和T688C；T426A和A696T；T426A和T702C；T426A和A709G；T426A和A712G；T426A和T714G；T426A和A790G；T426A和A841T；T426A和T862A；A433T和A435G；A433T和T530A；A433T和C572T；A433T和T596C；A433T和T617C；A433T和T688C；A433T和A696T；A433T和T702C；A433T和A709G；A433T和A712G；A433T和T714G；A433T和A790G；A433T和A841T；A433T和T862A；A435G和T530A；A435G和C572T；A435G和T596C；A435G和T617C；A435G和T688C；A435G和A696T；A435G和T702C；A435G和A709G；A435G和A712G；A435G和T714G；A435G和A790G；A435G和A841T；A435G和T862A；T530A和C572T；T530A和T596C；T530A和T617C；T530A和T688C；T530A和A696T；T530A和T702C；T530A和A709G；T530A和A712G；T530A和T714G；T530A和A790G；T530A和A841T；T530A和T862A；C572T和T596C；C572T和T617C；C572T和T688C；C572T和A696T；C572T和T702C；C572T和A709G；C572T和A712G；C572T和T714G；C572T和A790G；C572T和A841T；C572T和T862A；T596C和T617C；T596C和T688C；T596C和A696T；T596C和T702C；T596C和A709G；T596C和A712G；T596C和T714G；T596C和A790G；T596C和A841T；T596C和T862A；T617C和T688C；T617C和A696T；T617C和T702C；T617C和A709G；T617C和A712G；T617C和T714G；T617C和A790G；T617C和A841T；T617C和T862A；T688C和A696T；T688C和T702C；T688C和A709G；T688C和A712G；T688C和T714G；T688C和A790G；T688C和A841T；T688C和T862A；A696T和T702C；A696T和A709G；A696T和A712G；A696T和T714G；A696T和A790G；A696T和A841T；A696T和T862A；T702C和A709G；T702C和A712G；T702C和T714G；T702C和A790G；T702C和A841T；T702C和T862A；A709G和A712G；A709G和T714G；A709G和A790G；A709G和A841T；A709G和T862A；A712G和T714G；A712G和A790G；A712G和A841T；A712G和T862A；T714G和A790G；T714G和A841T；T714G和T862A；A790G和A841T；A790G和T862A；或A841T和T862A。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的三个突变：T146C、C154T和T303C；T146C、C154T和T426A；T146C、C154T和A433T；T146C、C154T和A435G；T146C、C154T和T530A；T146C、C154T和C572T；T146C、C154T和T596C；T146C、C154T和T617C；T146C、C154T和T688C；T146C、C154T和A696T；T146C、C154T和T702C；T146C、C154T和A709G；T146C、C154T和A712G；T146C、C154T和T714G；T146C、C154T和A790G；T146C、C154T和A841T；T146C、C154T和T862A；T146C、T303C和T426A；T146C、T303C和A433T；T146C、T303C和A435G；T146C、T303C和T530A；T146C、T303C和C572T；T146C、T303C和T596C；T146C、T303C和T617C；T146C、T303C和T688C；T146C、T303C和A696T；T146C、T303C和T702C；T146C、T303C和A709G；T146C、T303C和A712G；T146C、T303C和T714G；T146C、T303C和A790G；T146C、T303C和A841T；T146C、T303C和T862A；T146C、T426A和A433T；T146C、T426A和A435G；T146C、T426A和T530A；T146C、T426A和C572T；T146C、T426A和T596C；T146C、T426A和T617C；T146C、T426A和T688C；T146C、T426A和A696T；T146C、T426A和T702C；T146C、T426A和A709G；T146C、T426A和A712G；T146C、T426A和T714G；T146C、T426A和A790G；T146C、T426A和A841T；T146C、T426A和T862A；T146C、A433T和A435G；T146C、A433T和T530A；T146C、A433T和C572T；T146C、A433T和T596C；T146C、A433T和T617C；T146C、A433T和T688C；T146C、A433T和A696T；T146C、A433T和T702C；T146C、A433T和A709G；T146C、A433T和A712G；T146C、A433T和T714G；T146C、A433T和A790G；T146C、A433T和A841T；T146C、A433T和T862A；T146C、A435G和T530A；T146C、A435G和C572T；T146C、A435G和T596C；T146C、A435G和T617C；T146C、A435G和T688C；T146C、A435G和A696T；T146C、A435G和T702C；T146C、A435G和A709G；T146C、A435G和A712G；T146C、A435G和T714G；T146C、A435G和A790G；T146C、A435G和A841T；T146C、A435G和T862A；T146C、T530A和C572T；T146C、T530A和T596C；T146C、T530A和T617C；T146C、T530A和T688C；T146C、T530A和A696T；T146C、T530A和T702C；T146C、T530A和A709G；T146C、T530A和A712G；T146C、T530A和T714G；T146C、T530A和A790G；T146C、T530A和A841T；T146C、T530A和T862A；T146C、C572T和T596C；T146C、C572T和T617C；T146C、C572T和T688C；T146C、C572T和A696T；T146C、C572T和T702C；T146C、C572T和A709G；T146C、C572T和A712G；T146C、C572T和T714G；T146C、C572T和A790G；T146C、C572T和A841T；T146C、C572T和T862A；T146C、T596C和T617C；T146C、T596C和T688C；T146C、T596C和A696T；T146C、T596C和T702C；T146C、T596C和A709G；T146C、T596C和A712G；T146C、T596C和T714G；T146C、T596C和A790G；T146C、T596C和A841T；T146C、T596C和T862A；T146C、T617C和T688C；T146C、T617C和A696T；T146C、T617C和T702C；T146C、T617C和A709G；T146C、T617C和A712G；T146C、T617C和T714G；T146C、T617C和A790G；T146C、T617C和A841T；T146C、T617C和T862A；T146C、T688C和A696T；T146C、T688C和T702C；T146C、T688C和A709G；T146C、T688C和A712G；T146C、T688C和T714G；T146C、T688C和A790G；T146C、T688C和A841T；T146C、T688C和T862A；T146C、A696T和T702C；T146C、A696T和A709G；T146C、A696T和A712G；T146C、A696T和T714G；T146C、A696T和A790G；T146C、A696T和A841T；T146C、A696T和T862A；T146C、T702C和A709G；T146C、T702C和A712G；T146C、T702C和T714G；T146C、T702C和A790G；T146C、T702C和A841T；T146C、T702C和T862A；T146C、A709G和A712G；T146C、A709G和T714G；T146C、A709G和A790G；T146C、A709G和A841T；T146C、A709G和T862A；T146C、A712G和T714G；T146C、A712G和A790G；T146C、A712G和A841T；T146C、A712G和T862A；T146C、T714G和A790G；T146C、T714G和A841T；T146C、T714G和T862A；T146C、A790G和A841T；T146C、A790G和T862A；T146C、A841T和T862A；C154T、T303C和T426A；C154T、T303C和A433T；C154T、T303C和A435G；C154T、T303C和T530A；C154T、T303C和C572T；C154T、T303C和T596C；C154T、T303C和T617C；C154T、T303C和T688C；C154T、T303C和A696T；C154T、T303C和T702C；C154T、T303C和A709G；C154T、T303C和A712G；C154T、T303C和T714G；C154T、T303C和A790G；C154T、T303C和A841T；C154T、T303C和T862A；C154T、T426A和A433T；C154T、T426A和A435G；C154T、T426A和T530A；C154T、T426A和C572T；C154T、T426A和T596C；C154T、T426A和T617C；C154T、T426A和T688C；C154T、T426A和A696T；C154T、T426A和T702C；C154T、T426A和A709G；C154T、T426A和A712G；C154T、T426A和T714G；C154T、T426A和A790G；C154T、T426A和A841T；C154T、T426A和T862A；C154T、A433T和A435G；C154T、A433T和T530A；C154T、A433T和C572T；C154T、A433T和T596C；C154T、A433T和T617C；C154T、A433T和T688C；C154T、A433T和A696T；C154T、A433T和T702C；C154T、A433T和A709G；C154T、A433T和A712G；C154T、A433T和T714G；C154T、A433T和A790G；C154T、A433T和A841T；C154T、A433T和T862A；C154T、A435G和T530A；C154T、A435G和C572T；C154T、A435G和T596C；C154T、A435G和T617C；C154T、A435G和T688C；C154T、A435G和A696T；C154T、A435G和T702C；C154T、A435G和A709G；C154T、A435G和A712G；C154T、A435G和T714G；C154T、A435G和A790G；C154T、A435G和A841T；C154T、A435G和T862A；C154T、T530A和C572T；C154T、T530A和T596C；C154T、T530A和T617C；C154T、T530A和T688C；C154T、T530A和A696T；C154T、T530A和T702C；C154T、T530A和A709G；C154T、T530A和A712G；C154T、T530A和T714G；C154T、T530A和A790G；C154T、T530A和A841T；C154T、T530A和T862A；C154T、C572T和T596C；C154T、C572T和T617C；C154T、C572T和T688C；C154T、C572T和A696T；C154T、C572T和T702C；C154T、C572T和A709G；C154T、C572T和A712G；C154T、C572T和T714G；C154T、C572T和A790G；C154T、C572T和A841T；C154T、C572T和T862A；C154T、T596C和T617C；C154T、T596C和T688C；C154T、T596C和A696T；C154T、T596C和T702C；C154T、T596C和A709G；C154T、T596C和A712G；C154T、T596C和T714G；C154T、T596C和A790G；C154T、T596C和A841T；C154T、T596C和T862A；C154T、T617C和T688C；C154T、T617C和A696T；C154T、T617C和T702C；C154T、T617C和A709G；C154T、T617C和A712G；C154T、T617C和T714G；C154T、T617C和A790G；C154T、T617C和A841T；C154T、T617C和T862A；C154T、T688C和A696T；C154T、T688C和T702C；C154T、T688C和A709G；C154T、T688C和A712G；C154T、T688C和T714G；C154T、T688C和A790G；C154T、T688C和A841T；C154T、T688C和T862A；C154T、A696T和T702C；C154T、A696T和A709G；C154T、A696T和A712G；C154T、A696T和T714G；C154T、A696T和A790G；C154T、A696T和A841T；C154T、A696T和T862A；C154T、T702C和A709G；C154T、T702C和A712G；C154T、T702C和T714G；C154T、T702C和A790G；C154T、T702C和A841T；C154T、T702C和T862A；C154T、A709G和A712G；C154T、A709G和T714G；C154T、A709G和A790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02C和A841T；T596C、T702C和T862A；T596C、A709G和A712G；T596C、A709G和T714G；T596C、A709G和A790G；T596C、A709G和A841T；T596C、A709G和T862A；T596C、A712G和T714G；T596C、A712G和A790G；T596C、A712G和A841T；T596C、A712G和T862A；T596C、T714G和A790G；T596C、T714G和A841T；T596C、T714G和T862A；T596C、A790G和A841T；T596C、A790G和T862A；T596C、A841T和T862A；T617C、T688C和A696T；T617C、T688C和T702C；T617C、T688C和A709G；T617C、T688C和A712G；T617C、T688C和T714G；T617C、T688C和A790G；T617C、T688C和A841T；T617C、T688C和T862A；T617C、A696T和T702C；T617C、A696T和A709G；T617C、A696T和A712G；T617C、A696T和T714G；T617C、A696T和A790G；T617C、A696T和A841T；T617C、A696T和T862A；T617C、T702C和A709G；T617C、T702C和A712G；T617C、T702C和T714G；T617C、T702C和A790G；T617C、T702C和A841T；T617C、T702C和T862A；T617C、A709G和A712G；T617C、A709G和T714G；T617C、A709G和A790G；T617C、A709G和A841T；T617C、A709G和T862A；T617C、A712G和T714G；T617C、A712G和A790G；T617C、A712G和A841T；T617C、A712G和T862A；T617C、T714G和A790G；T617C、T714G和A841T；T617C、T714G和T862A；T617C、A790G和A841T；T617C、A790G和T862A；T617C、A841T和T862A；T688C、A696T和T702C；T688C、A696T和A709G；T688C、A696T和A712G；T688C、A696T和T714G；T688C、A696T和A790G；T688C、A696T和A841T；T688C、A696T和T862A；T688C、T702C和A709G；T688C、T702C和A712G；T688C、T702C和T714G；T688C、T702C和A790G；T688C、T702C和A841T；T688C、T702C和T862A；T688C、A709G和A712G；T688C、A709G和T714G；T688C、A709G和A790G；T688C、A709G和A841T；T688C、A709G和T862A；T688C、A712G和T714G；T688C、A712G和A790G；T688C、A712G和A841T；T688C、A712G和T862A；T688C、T714G和A790G；T688C、T714G和A841T；T688C、T714G和T862A；T688C、A790G和A841T；T688C、A790G和T862A；T688C、A841T和T862A；A696T、T702C和A709G；A696T、T702C和A712G；A696T、T702C和T714G；A696T、T702C和A790G；A696T、T702C和A841T；A696T、T702C和T862A；A696T、A709G和A712G；A696T、A709G和T714G；A696T、A709G和A790G；A696T、A709G和A841T；A696T、A709G和T862A；A696T、A712G和T714G；A696T、A712G和A790G；A696T、A712G和A841T；A696T、A712G和T862A；A696T、T714G和A790G；A696T、T714G和A841T；A696T、T714G和T862A；A696T、A790G和A841T；A696T、A790G和T862A；A696T、A841T和T862A；T702C、A709G和A712G；T702C、A709G和T714G；T702C、A709G和A790G；T702C、A709G和A841T；T702C、A709G和T862A；T702C、A712G和T714G；T702C、A712G和A790G；T702C、A712G和A841T；T702C、A712G和T862A；T702C、T714G和A790G；T702C、T714G和A841T；T702C、T714G和T862A；T702C、A790G和A841T；T702C、A790G和T862A；T702C、A841T和T862A；A709G、A712G和T714G；A709G、A712G和A790G；A709G、A712G和A841T；A709G、A712G和T862A；A709G、T714G和A790G；A709G、T714G和A841T；A709G、T714G和T862A；A709G、A790G和A841T；A709G、A790G和T862A；A709G、A841T和T862A；A712G、T714G和A790G；A712G、T714G和A841T；A712G、T714G和T862A；A712G、A790G和A841T；A712G、A790G和T862A；A712G、A841T和T862A；T714G、A790G和A841T；T714G、A790G和T862A；T714G、A841T和T862A；或A790G、A841T和T862A。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的两个突变：T688C和A696T；T688C和T702C；T688C和A712G；T688C和T714G；A696T和T702C；A696T和A712G；A696T和T714G；T702C和A712G；T702C和T714G；或A712G和T714G。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的三个突变：T688C、A696T和T702C；T688C、A696T和A712G；T688C、A696T和T714G；T688C、T702C和A712G；T688C、T702C和T714G；T688C、A712G和T714G；A696T、T702C和A712G；A696T、T702C和T714G；A696T、A712G和T714G；或T702C、A712G和T714G。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的四个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的四个突变：T688C、A696T、T702C和A712G；T688C、A696T、T702C和T714G；T688C、A696T、A712G和T714G；T688C、T702C、A712G和T714G；或A696T、T702C、A712G和T714G。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的五个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的五个突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的两个突变：146C和154T；146C和303C；146C和426A；146C和433T；146C和435G；146C和530A；146C和572T；146C和596C；146C和617C；146C和688C；146C和696T；146C和702C；146C和709G；146C和712G；146C和714G；146C和790G；146C和A841T；146C和862A；154T和303C；154T和426A；154T和433T；154T和435G；154T和530A；154T和572T；154T和596C；154T和617C；154T和688C；154T和696T；154T和702C；154T和709G；154T和712G；154T和714G；154T和790G；154T和A841T；154T和862A；303C和426A；303C和433T；303C和435G；303C和530A；303C和572T；303C和596C；303C和617C；303C和688C；303C和696T；303C和702C；303C和709G；303C和712G；303C和714G；303C和790G；303C和A841T；303C和862A；426A和433T；426A和435G；426A和530A；426A和572T；426A和596C；426A和617C；426A和688C；426A和696T；426A和702C；426A和709G；426A和712G；426A和714G；426A和790G；426A和A841T；426A和862A；433T和435G；433T和530A；433T和572T；433T和596C；433T和617C；433T和688C；433T和696T；433T和702C；433T和709G；433T和712G；433T和714G；433T和790G；433T和A841T；433T和862A；435G和530A；435G和572T；435G和596C；435G和617C；435G和688C；435G和696T；435G和702C；435G和709G；435G和712G；435G和714G；435G和790G；435G和A841T；435G和862A；530A和572T；530A和596C；530A和617C；530A和688C；530A和696T；530A和702C；530A和709G；530A和712G；530A和714G；530A和790G；530A和A841T；530A和862A；572T和596C；572T和617C；572T和688C；572T和696T；572T和702C；572T和709G；572T和712G；572T和714G；572T和790G；572T和A841T；572T和862A；596C和617C；596C和688C；596C和696T；596C和702C；596C和709G；596C和712G；596C和714G；596C和790G；596C和A841T；596C和862A；617C和688C；617C和696T；617C和702C；617C和709G；617C和712G；617C和714G；617C和790G；617C和A841T；617C和862A；688C和696T；688C和702C；688C和709G；688C和712G；688C和714G；688C和790G；688C和A841T；688C和862A；696T和702C；696T和709G；696T和712G；696T和714G；696T和790G；696T和A841T；696T和862A；702C和709G；702C和712G；702C和714G；702C和790G；702C和A841T；702C和862A；709G和712G；709G和714G；709G和790G；709G和A841T；709G和862A；712G和714G；712G和790G；712G和A841T；712G和862A；714G和790G；714G和A841T；714G和862A；790G和A841T；790G和862A；或A841T和862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的三个突变：146C、154T和303C；146C、154T和426A；146C、154T和433T；146C、154T和435G；146C、154T和530A；146C、154T和572T；146C、154T和596C；146C、154T和617C；146C、154T和688C；146C、154T和696T；146C、154T和702C；146C、154T和709G；146C、154T和712G；146C、154T和714G；146C、154T和790G；146C、154T和A841T；146C、154T和862A；146C、303C和426A；146C、303C和433T；146C、303C和435G；146C、303C和530A；146C、303C和572T；146C、303C和596C；146C、303C和617C；146C、303C和688C；146C、303C和696T；146C、303C和702C；146C、303C和709G；146C、303C和712G；146C、303C和714G；146C、303C和790G；146C、303C和A841T；146C、303C和862A；146C、426A和433T；146C、426A和435G；146C、426A和530A；146C、426A和572T；146C、426A和596C；146C、426A和617C；146C、426A和688C；146C、426A和696T；146C、426A和702C；146C、426A和709G；146C、426A和712G；146C、426A和714G；146C、426A和790G；146C、426A和A841T；146C、426A和862A；146C、433T和435G；146C、433T和530A；146C、433T和572T；146C、433T和596C；146C、433T和617C；146C、433T和688C；146C、433T和696T；146C、433T和702C；146C、433T和709G；146C、433T和712G；146C、433T和714G；146C、433T和790G；146C、433T和A841T；146C、433T和862A；146C、435G和530A；146C、435G和572T；146C、435G和596C；146C、435G和617C；146C、435G和688C；146C、435G和696T；146C、435G和702C；146C、435G和709G；146C、435G和712G；146C、435G和714G；146C、435G和790G；146C、435G和A841T；146C、435G和862A；146C、530A和572T；146C、530A和596C；146C、530A和617C；146C、530A和688C；146C、530A和696T；146C、530A和702C；146C、530A和709G；146C、530A和712G；146C、530A和714G；146C、530A和790G；146C、530A和A841T；146C、530A和862A；146C、572T和596C；146C、572T和617C；146C、572T和688C；146C、572T和696T；146C、572T和702C；146C、572T和709G；146C、572T和712G；146C、572T和714G；146C、572T和790G；146C、572T和A841T；146C、572T和862A；146C、596C和617C；146C、596C和688C；146C、596C和696T；146C、596C和702C；146C、596C和709G；146C、596C和712G；146C、596C和714G；146C、596C和790G；146C、596C和A841T；146C、596C和862A；146C、617C和688C；146C、617C和696T；146C、617C和702C；146C、617C和709G；146C、617C和712G；146C、617C和714G；146C、617C和790G；146C、617C和A841T；146C、617C和862A；146C、688C和696T；146C、688C和702C；146C、688C和709G；146C、688C和712G；146C、688C和714G；146C、688C和790G；146C、688C和A841T；146C、688C和862A；146C、696T和702C；146C、696T和709G；146C、696T和712G；146C、696T和714G；146C、696T和790G；146C、696T和A841T；146C、696T和862A；146C、702C和709G；146C、702C和712G；146C、702C和714G；146C、702C和790G；146C、702C和A841T；146C、702C和862A；146C、709G和712G；146C、709G和714G；146C、709G和790G；146C、709G和A841T；146C、709G和862A；146C、712G和714G；146C、712G和790G；146C、712G和A841T；146C、712G和862A；146C、714G和790G；146C、714G和A841T；146C、714G和862A；146C、790G和A841T；146C、790G和862A；146C、A841T和862A；154T、303C和426A；154T、303C和433T；154T、303C和435G；154T、303C和530A；154T、303C和572T；154T、303C和596C；154T、303C和617C；154T、303C和688C；154T、303C和696T；154T、303C和702C；154T、303C和709G；154T、303C和712G；154T、303C和714G；154T、303C和790G；154T、303C和A841T；154T、303C和862A；154T、426A和433T；154T、426A和435G；154T、426A和530A；154T、426A和572T；154T、426A和596C；154T、426A和617C；154T、426A和688C；154T、426A和696T；154T、426A和702C；154T、426A和709G；154T、426A和712G；154T、426A和714G；154T、426A和790G；154T、426A和A841T；154T、426A和862A；154T、433T和435G；154T、433T和530A；154T、433T和572T；154T、433T和596C；154T、433T和617C；154T、433T和688C；154T、433T和696T；154T、433T和702C；154T、433T和709G；154T、433T和712G；154T、433T和714G；154T、433T和790G；154T、433T和A841T；154T、433T和862A；154T、435G和530A；154T、435G和572T；154T、435G和596C；154T、435G和617C；154T、435G和688C；154T、435G和696T；154T、435G和702C；154T、435G和709G；154T、435G和712G；154T、435G和714G；154T、435G和790G；154T、435G和A841T；154T、435G和862A；154T、530A和572T；154T、530A和596C；154T、530A和617C；154T、530A和688C；154T、530A和696T；154T、530A和702C；154T、530A和709G；154T、530A和712G；154T、530A和714G；154T、530A和790G；154T、530A和A841T；154T、530A和862A；154T、572T和596C；154T、572T和617C；154T、572T和688C；154T、572T和696T；154T、572T和702C；154T、572T和709G；154T、572T和712G；154T、572T和714G；154T、572T和790G；154T、572T和A841T；154T、572T和862A；154T、596C和617C；154T、596C和688C；154T、596C和696T；154T、596C和702C；154T、596C和709G；154T、596C和712G；154T、596C和714G；154T、596C和790G；154T、596C和A841T；154T、596C和862A；154T、617C和688C；154T、617C和696T；154T、617C和702C；154T、617C和709G；154T、617C和712G；154T、617C和714G；154T、617C和790G；154T、617C和A841T；154T、617C和862A；154T、688C和696T；154T、688C和702C；154T、688C和709G；154T、688C和712G；154T、688C和714G；154T、688C和790G；154T、688C和A841T；154T、688C和862A；154T、696T和702C；154T、696T和709G；154T、696T和712G；154T、696T和714G；154T、696T和790G；154T、696T和A841T；154T、696T和862A；154T、702C和709G；154T、702C和712G；154T、702C和714G；154T、702C和790G；154T、702C和A841T；154T、702C和862A；154T、709G和712G；154T、709G和714G；154T、709G和790G；154T、709G和A841T；154T、709G和862A；154T、712G和714G；154T、712G和790G；154T、712G和A841T；154T、712G和862A；154T、714G和790G；154T、714G和A841T；154T、714G和862A；154T、790G和A841T；154T、790G和862A；154T、A841T和862A；303C、426A和433T；303C、426A和435G；303C、426A和530A；303C、426A和572T；303C、426A和596C；303C、426A和617C；303C、426A和688C；303C、426A和696T；303C、426A和702C；303C、426A和709G；303C、426A和712G；303C、426A和714G；303C、426A和790G；303C、426A和A841T；303C、426A和862A；303C、433T和435G；303C、433T和530A；303C、433T和572T；303C、433T和596C；303C、433T和617C；303C、433T和688C；303C、433T和696T；303C、433T和702C；303C、433T和709G；303C、433T和712G；303C、433T和714G；303C、433T和790G；303C、433T和A841T；303C、433T和862A；303C、435G和530A；303C、435G和572T；303C、435G和596C；303C、435G和617C；303C、435G和688C；303C、435G和696T；303C、435G和702C；303C、435G和709G；303C、435G和712G；303C、435G和714G；303C、435G和790G；303C、435G和A841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、696T和A841T；435G、696T和862A；435G、702C和709G；435G、702C和712G；435G、702C和714G；435G、702C和790G；435G、702C和A841T；435G、702C和862A；435G、709G和712G；435G、709G和714G；435G、709G和790G；435G、709G和A841T；435G、709G和862A；435G、712G和714G；435G、712G和790G；435G、712G和A841T；435G、712G和862A；435G、714G和790G；435G、714G和A841T；435G、714G和862A；435G、790G和A841T；435G、790G和862A；435G、A841T和862A；530A、572T和596C；530A、572T和617C；530A、572T和688C；530A、572T和696T；530A、572T和702C；530A、572T和709G；530A、572T和712G；530A、572T和714G；530A、572T和790G；530A、572T和A841T；530A、572T和862A；530A、596C和617C；530A、596C和688C；530A、596C和696T；530A、596C和702C；530A、596C和709G；530A、596C和712G；530A、596C和714G；530A、596C和790G；530A、596C和A841T；530A、596C和862A；530A、617C和688C；530A、617C和696T；530A、617C和702C；530A、617C和709G；530A、617C和712G；530A、617C和714G；530A、617C和790G；530A、617C和A841T；530A、617C和862A；530A、688C和696T；530A、688C和702C；530A、688C和709G；530A、688C和712G；530A、688C和714G；530A、688C和790G；530A、688C和A841T；530A、688C和862A；530A、696T和702C；530A、696T和709G；530A、696T和712G；530A、696T和714G；530A、696T和790G；530A、696T和A841T；530A、696T和862A；530A、702C和709G；530A、702C和712G；530A、702C和714G；530A、702C和790G；530A、702C和A841T；530A、702C和862A；530A、709G和712G；530A、709G和714G；530A、709G和790G；530A、709G和A841T；530A、709G和862A；530A、712G和714G；530A、712G和790G；530A、712G和A841T；530A、712G和862A；530A、714G和790G；530A、714G和A841T；530A、714G和862A；530A、790G和A841T；530A、790G和862A；530A、A841T和862A；572T、596C和617C；572T、596C和688C；572T、596C和696T；572T、596C和702C；572T、596C和709G；572T、596C和712G；572T、596C和714G；572T、596C和790G；572T、596C和A841T；572T、596C和862A；572T、617C和688C；572T、617C和696T；572T、617C和702C；572T、617C和709G；572T、617C和712G；572T、617C和714G；572T、617C和790G；572T、617C和A841T；572T、617C和862A；572T、688C和696T；572T、688C和702C；572T、688C和709G；572T、688C和712G；572T、688C和714G；572T、688C和790G；572T、688C和A841T；572T、688C和862A；572T、696T和702C；572T、696T和709G；572T、696T和712G；572T、696T和714G；572T、696T和790G；572T、696T和A841T；572T、696T和862A；572T、702C和709G；572T、702C和712G；572T、702C和714G；572T、702C和790G；572T、702C和A841T；572T、702C和862A；572T、709G和712G；572T、709G和714G；572T、709G和790G；572T、709G和A841T；572T、709G和862A；572T、712G和714G；572T、712G和790G；572T、712G和A841T；572T、712G和862A；572T、714G和790G；572T、714G和A841T；572T、714G和862A；572T、790G和A841T；572T、790G和862A；572T、A841T和862A；596C、617C和688C；596C、617C和696T；596C、617C和702C；596C、617C和709G；596C、617C和712G；596C、617C和714G；596C、617C和790G；596C、617C和A841T；596C、617C和862A；596C、688C和696T；596C、688C和702C；596C、688C和709G；596C、688C和712G；596C、688C和714G；596C、688C和790G；596C、688C和A841T；596C、688C和862A；596C、696T和702C；596C、696T和709G；596C、696T和712G；596C、696T和714G；596C、696T和790G；596C、696T和A841T；596C、696T和862A；596C、702C和709G；596C、702C和712G；596C、702C和714G；596C、702C和790G；596C、702C和A841T；596C、702C和862A；596C、709G和712G；596C、709G和714G；596C、709G和790G；596C、709G和A841T；596C、709G和862A；596C、712G和714G；596C、712G和790G；596C、712G和A841T；596C、712G和862A；596C、714G和790G；596C、714G和A841T；596C、714G和862A；596C、790G和A841T；596C、790G和862A；596C、A841T和862A；617C、688C和696T；617C、688C和702C；617C、688C和709G；617C、688C和712G；617C、688C和714G；617C、688C和790G；617C、688C和A841T；617C、688C和862A；617C、696T和702C；617C、696T和709G；617C、696T和712G；617C、696T和714G；617C、696T和790G；617C、696T和A841T；617C、696T和862A；617C、702C和709G；617C、702C和712G；617C、702C和714G；617C、702C和790G；617C、702C和A841T；617C、702C和862A；617C、709G和712G；617C、709G和714G；617C、709G和790G；617C、709G和A841T；617C、709G和862A；617C、712G和714G；617C、712G和790G；617C、712G和A841T；617C、712G和862A；617C、714G和790G；617C、714G和A841T；617C、714G和862A；617C、790G和A841T；617C、790G和862A；617C、A841T和862A；688C、696T和702C；688C、696T和709G；688C、696T和712G；688C、696T和714G；688C、696T和790G；688C、696T和A841T；688C、696T和862A；688C、702C和709G；688C、702C和712G；688C、702C和714G；688C、702C和790G；688C、702C和A841T；688C、702C和862A；688C、709G和712G；688C、709G和714G；688C、709G和790G；688C、709G和A841T；688C、709G和862A；688C、712G和714G；688C、712G和790G；688C、712G和A841T；688C、712G和862A；688C、714G和790G；688C、714G和A841T；688C、714G和862A；688C、790G和A841T；688C、790G和862A；688C、A841T和862A；696T、702C和709G；696T、702C和712G；696T、702C和714G；696T、702C和790G；696T、702C和A841T；696T、702C和862A；696T、709G和712G；696T、709G和714G；696T、709G和790G；696T、709G和A841T；696T、709G和862A；696T、712G和714G；696T、712G和790G；696T、712G和A841T；696T、712G和862A；696T、714G和790G；696T、714G和A841T；696T、714G和862A；696T、790G和A841T；696T、790G和862A；696T、A841T和862A；702C、709G和712G；702C、709G和714G；702C、709G和790G；702C、709G和A841T；702C、709G和862A；702C、712G和714G；702C、712G和790G；702C、712G和A841T；702C、712G和862A；702C、714G和790G；702C、714G和A841T；702C、714G和862A；702C、790G和A841T；702C、790G和862A；702C、A841T和862A；709G、712G和714G；709G、712G和790G；709G、712G和A841T；709G、712G和862A；709G、714G和790G；709G、714G和A841T；709G、714G和862A；709G、790G和A841T；709G、790G和862A；709G、A841T和862A；712G、714G和790G；712G、714G和A841T；712G、714G和862A；712G、790G和A841T；712G、790G和862A；712G、A841T和862A；714G、790G和A841T；714G、790G和862A；714G、A841T和862A；或790G、A841T和862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的两个突变：688C和696T；688C和702C；688C和712G；688C和714G；696T和702C；696T和712G；696T和714G；702C和712G；702C和714G；或712G和714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的三个突变：688C、696T和702C；688C、696T和712G；688C、696T和714G；688C、702C和712G；688C、702C和714G；688C、712G和714G；696T、702C和712G；696T、702C和714G；696T、712G和714G；或702C、712G和714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的四个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的四个突变：688C、696T、702C和712G；688C、696T、702C和714G；688C、696T、712G和714G；688C、702C、712G和714G；或696T、702C、712G和714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的五个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在对应于相对于SEQ ID NO:28的以下突变的五个突变：688C、696T、702C、712G和714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个突变：T146和C154；T146和T303；T146和T426；T146和A433；T146和A435；T146和T530；T146和C572；T146和T596；T146和T617；T146和T688；T146和A696；T146和T702；T146和A709；T146和A712；T146和T714；T146和A790；T146和A841；T146和T862；C154和T303；C154和T426；C154和A433；C154和A435；C154和T530；C154和C572；C154和T596；C154和T617；C154和T688；C154和A696；C154和T702；C154和A709；C154和A712；C154和T714；C154和A790；C154和A841；C154和T862；T303和T426；T303和A433；T303和A435；T303和T530；T303和C572；T303和T596；T303和T617；T303和T688；T303和A696；T303和T702；T303和A709；T303和A712；T303和T714；T303和A790；T303和A841；T303和T862；T426和A433；T426和A435；T426和T530；T426和C572；T426和T596；T426和T617；T426和T688；T426和A696；T426和T702；T426和A709；T426和A712；T426和T714；T426和A790；T426和A841；T426和T862；A433和A435；A433和T530；A433和C572；A433和T596；A433和T617；A433和T688；A433和A696；A433和T702；A433和A709；A433和A712；A433和T714；A433和A790；A433和A841；A433和T862；A435和T530；A435和C572；A435和T596；A435和T617；A435和T688；A435和A696；A435和T702；A435和A709；A435和A712；A435和T714；A435和A790；A435和A841；A435和T862；T530和C572；T530和T596；T530和T617；T530和T688；T530和A696；T530和T702；T530和A709；T530和A712；T530和T714；T530和A790；T530和A841；T530和T862；C572和T596；C572和T617；C572和T688；C572和A696；C572和T702；C572和A709；C572和A712；C572和T714；C572和A790；C572和A841；C572和T862；T596和T617；T596和T688；T596和A696；T596和T702；T596和A709；T596和A712；T596和T714；T596和A790；T596和A841；T596和T862；T617和T688；T617和A696；T617和T702；T617和A709；T617和A712；T617和T714；T617和A790；T617和A841；T617和T862；T688和A696；T688和T702；T688和A709；T688和A712；T688和T714；T688和A790；T688和A841；T688和T862；A696和T702；A696和A709；A696和A712；A696和T714；A696和A790；A696和A841；A696和T862；T702和A709；T702和A712；T702和T714；T702和A790；T702和A841；T702和T862；A709和A712；A709和T714；A709和A790；A709和A841；A709和T862；A712和T714；A712和A790；A712和A841；A712和T862；T714和A790；T714和A841；T714和T862；A790和A841；A790和T862；或A841和T862。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个突变：T146、C154和T303；T146、C154和T426；T146、C154和A433；T146、C154和A435；T146、C154和T530；T146、C154和C572；T146、C154和T596；T146、C154和T617；T146、C154和T688；T146、C154和A696；T146、C154和T702；T146、C154和A709；T146、C154和A712；T146、C154和T714；T146、C154和A790；T146、C154和A841；T146、C154和T862；T146、T303和T426；T146、T303和A433；T146、T303和A435；T146、T303和T530；T146、T303和C572；T146、T303和T596；T146、T303和T617；T146、T303和T688；T146、T303和A696；T146、T303和T702；T146、T303和A709；T146、T303和A712；T146、T303和T714；T146、T303和A790；T146、T303和A841；T146、T303和T862；T146、T426和A433；T146、T426和A435；T146、T426和T530；T146、T426和C572；T146、T426和T596；T146、T426和T617；T146、T426和T688；T146、T426和A696；T146、T426和T702；T146、T426和A709；T146、T426和A712；T146、T426和T714；T146、T426和A790；T146、T426和A841；T146、T426和T862；T146、A433和A435；T146、A433和T530；T146、A433和C572；T146、A433和T596；T146、A433和T617；T146、A433和T688；T146、A433和A696；T146、A433和T702；T146、A433和A709；T146、A433和A712；T146、A433和T714；T146、A433和A790；T146、A433和A841；T146、A433和T862；T146、A435和T530；T146、A435和C572；T146、A435和T596；T146、A435和T617；T146、A435和T688；T146、A435和A696；T146、A435和T702；T146、A435和A709；T146、A435和A712；T146、A435和T714；T146、A435和A790；T146、A435和A841；T146、A435和T862；T146、T530和C572；T146、T530和T596；T146、T530和T617；T146、T530和T688；T146、T530和A696；T146、T530和T702；T146、T530和A709；T146、T530和A712；T146、T530和T714；T146、T530和A790；T146、T530和A841；T146、T530和T862；T146、C572和T596；T146、C572和T617；T146、C572和T688；T146、C572和A696；T146、C572和T702；T146、C572和A709；T146、C572和A712；T146、C572和T714；T146、C572和A790；T146、C572和A841；T146、C572和T862；T146、T596和T617；T146、T596和T688；T146、T596和A696；T146、T596和T702；T146、T596和A709；T146、T596和A712；T146、T596和T714；T146、T596和A790；T146、T596和A841；T146、T596和T862；T146、T617和T688；T146、T617和A696；T146、T617和T702；T146、T617和A709；T146、T617和A712；T146、T617和T714；T146、T617和A790；T146、T617和A841；T146、T617和T862；T146、T688和A696；T146、T688和T702；T146、T688和A709；T146、T688和A712；T146、T688和T714；T146、T688和A790；T146、T688和A841；T146、T688和T862；T146、A696和T702；T146、A696和A709；T146、A696和A712；T146、A696和T714；T146、A696和A790；T146、A696和A841；T146、A696和T862；T146、T702和A709；T146、T702和A712；T146、T702和T714；T146、T702和A790；T146、T702和A841；T146、T702和T862；T146、A709和A712；T146、A709和T714；T146、A709和A790；T146、A709和A841；T146、A709和T862；T146、A712和T714；T146、A712和A790；T146、A712和A841；T146、A712和T862；T146、T714和A790；T146、T714和A841；T146、T714和T862；T146、A790和A841；T146、A790和T862；T146、A841和T862；C154、T303和T426；C154、T303和A433；C154、T303和A435；C154、T303和T530；C154、T303和C572；C154、T303和T596；C154、T303和T617；C154、T303和T688；C154、T303和A696；C154、T303和T702；C154、T303和A709；C154、T303和A712；C154、T303和T714；C154、T303和A790；C154、T303和A841；C154、T303和T862；C154、T426和A433；C154、T426和A435；C154、T426和T530；C154、T426和C572；C154、T426和T596；C154、T426和T617；C154、T426和T688；C154、T426和A696；C154、T426和T702；C154、T426和A709；C154、T426和A712；C154、T426和T714；C154、T426和A790；C154、T426和A841；C154、T426和T862；C154、A433和A435；C154、A433和T530；C154、A433和C572；C154、A433和T596；C154、A433和T617；C154、A433和T688；C154、A433和A696；C154、A433和T702；C154、A433和A709；C154、A433和A712；C154、A433和T714；C154、A433和A790；C154、A433和A841；C154、A433和T862；C154、A435和T530；C154、A435和C572；C154、A435和T596；C154、A435和T617；C154、A435和T688；C154、A435和A696；C154、A435和T702；C154、A435和A709；C154、A435和A712；C154、A435和T714；C154、A435和A790；C154、A435和A841；C154、A435和T862；C154、T530和C572；C154、T530和T596；C154、T530和T617；C154、T530和T688；C154、T530和A696；C154、T530和T702；C154、T530和A709；C154、T530和A712；C154、T530和T714；C154、T530和A790；C154、T530和A841；C154、T530和T862；C154、C572和T596；C154、C572和T617；C154、C572和T688；C154、C572和A696；C154、C572和T702；C154、C572和A709；C154、C572和A712；C154、C572和T714；C154、C572和A790；C154、C572和A841；C154、C572和T862；C154、T596和T617；C154、T596和T688；C154、T596和A696；C154、T596和T702；C154、T596和A709；C154、T596和A712；C154、T596和T714；C154、T596和A790；C154、T596和A841；C154、T596和T862；C154、T617和T688；C154、T617和A696；C154、T617和T702；C154、T617和A709；C154、T617和A712；C154、T617和T714；C154、T617和A790；C154、T617和A841；C154、T617和T862；C154、T688和A696；C154、T688和T702；C154、T688和A709；C154、T688和A712；C154、T688和T714；C154、T688和A790；C154、T688和A841；C154、T688和T862；C154、A696和T702；C154、A696和A709；C154、A696和A712；C154、A696和T714；C154、A696和A790；C154、A696和A841；C154、A696和T862；C154、T702和A709；C154、T702和A712；C154、T702和T714；C154、T702和A790；C154、T702和A841；C154、T702和T862；C154、A709和A712；C154、A709和T714；C154、A709和A790；C154、A709和A841；C154、A709和T862；C154、A712和T714；C154、A712和A790；C154、A712和A841；C154、A712和T862；C154、T714和A790；C154、T714和A841；C154、T714和T862；C154、A790和A841；C154、A790和T862；C154、A841和T862；T303、T426和A433；T303、T426和A435；T303、T426和T530；T303、T426和C572；T303、T426和T596；T303、T426和T617；T303、T426和T688；T303、T426和A696；T303、T426和T702；T303、T426和A709；T303、T426和A712；T303、T426和T714；T303、T426和A790；T303、T426和A841；T303、T426和T862；T303、A433和A435；T303、A433和T530；T303、A433和C572；T303、A433和T596；T303、A433和T617；T303、A433和T688；T303、A433和A696；T303、A433和T702；T303、A433和A709；T303、A433和A712；T303、A433和T714；T303、A433和A790；T303、A433和A841；T303、A433和T862；T303、A435和T530；T303、A435和C572；T303、A435和T596；T303、A435和T617；T303、A435和T688；T303、A435和A696；T303、A435和T702；T303、A435和A709；T303、A435和A712；T303、A435和T714；T303、A435和A790；T303、A435和A841；T303、A435和T862；T303、T530和C572；T303、T530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在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个突变：T688和A696；T688和T702；T688和A712；T688和T714；A696和T702；A696和A712；A696和T714；T702和A712；T702和T714；或A712和T714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个突变：T688、A696和T702；T688、A696和A712；T688、A696和T714；T688、T702和A712；T688、T702和T714；T688、A712和T714；A696、T702和A712；A696、T702和T714；A696、A712和T714；或T702、A712和T714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的四个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个突变：T688、A696、T702和A712；T688、A696、T702和T714；T688、A696、A712和T714；T688、T702、A712和T714；或A696、T702、A712和T714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的五个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个突变：T688、A696、T702、A712和T714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个突变：146和154；146和303；146和426；146和433；146和435；146和530；146和572；146和596；146和617；146和688；146和696；146和702；146和709；146和A712；146和714；146和790；146和841；146和862；154和303；154和426；154和433；154和435；154和530；154和572；154和596；154和617；154和688；154和696；154和702；154和709；154和A712；154和714；154和790；154和841；154和862；303和426；303和433；303和435；303和530；303和572；303和596；303和617；303和688；303和696；303和702；303和709；303和A712；303和714；303和790；303和841；303和862；426和433；426和435；426和530；426和572；426和596；426和617；426和688；426和696；426和702；426和709；426和A712；426和714；426和790；426和841；426和862；433和435；433和530；433和572；433和596；433和617；433和688；433和696；433和702；433和709；433和A712；433和714；433和790；433和841；433和862；435和530；435和572；435和596；435和617；435和688；435和696；435和702；435和709；435和A712；435和714；435和790；435和841；435和862；530和572；530和596；530和617；530和688；530和696；530和702；530和709；530和A712；530和714；530和790；530和841；530和862；572和596；572和617；572和688；572和696；572和702；572和709；572和A712；572和714；572和790；572和841；572和862；596和617；596和688；596和696；596和702；596和709；596和A712；596和714；596和790；596和841；596和862；617和688；617和696；617和702；617和709；617和A712；617和714；617和790；617和841；617和862；688和696；688和702；688和709；688和A712；688和714；688和790；688和841；688和862；696和702；696和709；696和A712；696和714；696和790；696和841；696和862；702和709；702和A712；702和714；702和790；702和841；702和862；709和A712；709和714；709和790；709和841；709和862；A712和714；A712和790；A712和841；A712和862；714和790；714和841；714和862；790和841；790和862；或841和862。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个突变：146、154和303；146、154和426；146、154和433；146、154和435；146、154和530；146、154和572；146、154和596；146、154和617；146、154和688；146、154和696；146、154和702；146、154和709；146、154和A712；146、154和714；146、154和790；146、154和841；146、154和862；146、303和426；146、303和433；146、303和435；146、303和530；146、303和572；146、303和596；146、303和617；146、303和688；146、303和696；146、303和702；146、303和709；146、303和A712；146、303和714；146、303和790；146、303和841；146、303和862；146、426和433；146、426和435；146、426和530；146、426和572；146、426和596；146、426和617；146、426和688；146、426和696；146、426和702；146、426和709；146、426和A712；146、426和714；146、426和790；146、426和841；146、426和862；146、433和435；146、433和530；146、433和572；146、433和596；146、433和617；146、433和688；146、433和696；146、433和702；146、433和709；146、433和A712；146、433和714；146、433和790；146、433和841；146、433和862；146、435和530；146、435和572；146、435和596；146、435和617；146、435和688；146、435和696；146、435和702；146、435和709；146、435和A712；146、435和714；146、435和790；146、435和841；146、435和862；146、530和572；146、530和596；146、530和617；146、530和688；146、530和696；146、530和702；146、530和709；146、530和A712；146、530和714；146、530和790；146、530和841；146、530和862；146、572和596；146、572和617；146、572和688；146、572和696；146、572和702；146、572和709；146、572和A712；146、572和714；146、572和790；146、572和841；146、572和862；146、596和617；146、596和688；146、596和696；146、596和702；146、596和709；146、596和A712；146、596和714；146、596和790；146、596和841；146、596和862；146、617和688；146、617和696；146、617和702；146、617和709；146、617和A712；146、617和714；146、617和790；146、617和841；146、617和862；146、688和696；146、688和702；146、688和709；146、688和A712；146、688和714；146、688和790；146、688和841；146、688和862；146、696和702；146、696和709；146、696和A712；146、696和714；146、696和790；146、696和841；146、696和862；146、702和709；146、702和A712；146、702和714；146、702和790；146、702和841；146、702和862；146、709和A712；146、709和714；146、709和790；146、709和841；146、709和862；146、A712和714；146、A712和790；146、A712和841；146、A712和862；146、714和790；146、714和841；146、714和862；146、790和841；146、790和862；146、841和862；154、303和426；154、303和433；154、303和435；154、303和530；154、303和572；154、303和596；154、303和617；154、303和688；154、303和696；154、303和702；154、303和709；154、303和A712；154、303和714；154、303和790；154、303和841；154、303和862；154、426和433；154、426和435；154、426和530；154、426和572；154、426和596；154、426和617；154、426和688；154、426和696；154、426和702；154、426和709；154、426和A712；154、426和714；154、426和790；154、426和841；154、426和862；154、433和435；154、433和530；154、433和572；154、433和596；154、433和617；154、433和688；154、433和696；154、433和702；154、433和709；154、433和A712；154、433和714；154、433和790；154、433和841；154、433和862；154、435和530；154、435和572；154、435和596；154、435和617；154、435和688；154、435和696；154、435和702；154、435和709；154、435和A712；154、435和714；154、435和790；154、435和841；154、435和862；154、530和572；154、530和596；154、530和617；154、530和688；154、530和696；154、530和702；154、530和709；154、530和A712；154、530和714；154、530和790；154、530和841；154、530和862；154、572和596；154、572和617；154、572和688；154、572和696；154、572和702；154、572和709；154、572和A712；154、572和714；154、572和790；154、572和841；154、572和862；154、596和617；154、596和688；154、596和696；154、596和702；154、596和709；154、596和A712；154、596和714；154、596和790；154、596和841；154、596和862；154、617和688；154、617和696；154、617和702；154、617和709；154、617和A712；154、617和714；154、617和790；154、617和841；154、617和862；154、688和696；154、688和702；154、688和709；154、688和A712；154、688和714；154、688和790；154、688和841；154、688和862；154、696和702；154、696和709；154、696和A712；154、696和714；154、696和790；154、696和841；154、696和862；154、702和709；154、702和A712；154、702和714；154、702和790；154、702和841；154、702和862；154、709和A712；154、709和714；154、709和790；154、709和841；154、709和862；154、A712和714；154、A712和790；154、A712和841；154、A712和862；154、714和790；154、714和841；154、714和862；154、790和841；154、790和862；154、841和862；303、426和433；303、426和435；303、426和530；303、426和572；303、426和596；303、426和617；303、426和688；303、426和696；303、426和702；303、426和709；303、426和A712；303、426和714；303、426和790；303、426和841；303、426和862；303、433和435；303、433和530；303、433和572；303、433和596；303、433和617；303、433和688；303、433和696；303、433和702；303、433和709；303、433和A712；303、433和714；303、433和790；303、433和841；303、433和862；303、435和530；303、435和572；303、435和596；303、435和617；303、435和688；303、435和696；303、435和702；303、435和709；303、435和A712；303、435和714；303、435和790；303、435和841；303、435和862；303、530和572；303、530和596；303、530和617；303、530和688；303、530和696；303、530和702；303、530和709；303、530和A712；303、530和714；303、530和790；303、530和841；303、530和862；303、572和596；303、572和617；303、572和688；303、572和696；303、572和702；303、572和709；303、572和A712；303、572和714；303、572和790；303、572和841；303、572和862；303、596和617；303、596和688；303、596和696；303、596和702；303、596和709；303、596和A712；303、596和714；303、596和790；303、596和841；303、596和862；303、617和688；303、617和696；303、617和702；303、617和709；303、617和A712；303、617和714；303、617和790；303、617和841；303、617和862；303、688和696；303、688和702；303、688和709；303、688和A712；303、688和714；303、688和790；303、688和841；303、688和862；303、696和702；303、696和709；303、696和A712；303、696和714；303、696和790；303、696和841；303、696和862；303、702和709；303、702和A712；303、702和714；303、702和790；303、702和841；303、702和862；303、709和A712；303、709和714；303、709和790；303、709和841；303、709和862；303、A712和714；303、A712和790；303、A712和841；303、A712和862；303、714和790；303、714和841；303、714和862；303、790和841；303、790和862；303、841和862；426、433和435；426、433和530；426、433和572；426、433和596；426、433和617；426、433和688；426、433和696；426、433和702；426、433和709；426、433和A712；426、433和714；426、433和790；426、433和841；426、433和862；426、435和530；426、435和572；426、435和596；426、435和617；426、435和688；426、435和696；426、435和702；426、435和709；426、435和A712；426、435和714；426、435和790；426、435和841；426、435和862；426、530和572；426、530和596；426、530和617；426、530和688；426、530和696；426、530和702；426、530和709；426、530和A712；426、530和714；426、530和790；426、530和841；426、530和862；426、572和596；426、572和617；426、572和688；426、572和696；426、572和702；426、572和709；426、572和A712；426、572和714；426、572和790；426、572和841；426、572和862；426、596和617；426、596和688；426、596和696；426、596和702；426、596和709；426、596和A712；426、596和714；426、596和790；426、596和841；426、596和862；426、617和688；426、617和696；426、617和702；426、617和709；426、617和A712；426、617和714；426、617和790；426、617和841；426、617和862；426、688和696；426、688和702；426、688和709；426、688和A712；426、688和714；426、688和790；426、688和841；426、688和862；426、696和702；426、696和709；426、696和A712；426、696和714；426、696和790；426、696和841；426、696和862；426、702和709；426、702和A712；426、702和714；426、702和790；426、702和841；426、702和862；426、709和A712；426、709和714；426、709和790；426、709和841；426、709和862；426、A712和714；426、A712和790；426、A712和841；426、A712和862；426、714和790；426、714和841；426、714和862；426、790和841；426、790和862；426、841和862；433、435和530；433、435和572；433、435和596；433、435和617；433、435和688；433、435和696；433、435和702；433、435和709；433、435和A712；433、435和714；433、435和790；433、435和841；433、435和862；433、530和572；433、530和596；433、530和617；433、530和688；433、530和696；433、530和702；433、530和709；433、530和A712；433、530和714；433、530和790；433、530和841；433、530和862；433、572和596；433、572和617；433、572和688；433、572和696；433、572和702；433、572和709；433、572和A712；433、572和714；433、572和790；433、572和841；433、572和862；433、596和617；433、596和688；433、596和696；433、596和702；433、596和709；433、596和A712；433、596和714；433、596和790；433、596和841；433、596和862；433、617和688；433、617和696；433、617和702；433、617和709；433、617和A712；433、617和714；433、617和790；433、617和841；433、617和862；433、688和696；433、688和702；433、688和709；433、688和A712；433、688和714；433、688和790；433、688和841；433、688和862；433、696和702；433、696和709；433、696和A712；433、696和714；433、696和790；433、696和841；433、696和862；433、702和709；433、702和A712；433、702和714；433、702和790；433、702和841；433、702和862；433、709和A712；433、709和714；433、709和790；433、709和841；433、709和862；433、A712和714；433、A712和790；433、A712和841；433、A712和862；433、714和790；433、714和841；433、714和862；433、790和841；433、790和862；433、841和862；435、530和572；435、530和596；435、530和617；435、530和688；435、530和696；435、530和702；435、530和709；435、530和A712；435、530和714；435、530和790；435、530和841；435、530和862；435、572和596；435、572和617；435、572和688；435、572和696；435、572和702；435、572和709；435、572和A712；435、572和714；435、572和790；435、572和841；435、572和862；435、596和617；435、596和688；435、596和696；435、596和702；435、596和709；435、596和A712；435、596和714；435、596和790；435、596和841；435、596和862；435、617和688；435、617和696；435、617和702；435、617和709；435、617和A712；435、617和714；435、617和790；435、617和841；435、617和862；435、688和696；435、688和702；435、688和709；435、688和A712；435、688和714；435、688和790；435、688和841；435、688和862；435、696和702；435、696和709；435、696和A712；435、696和714；435、696和790；435、696和841；435、696和862；435、702和709；435、702和A712；435、702和714；435、702和790；435、702和841；435、702和862；435、709和A712；435、709和714；435、709和790；435、709和841；435、709和862；435、A712和714；435、A712和790；435、A712和841；435、A712和862；435、714和790；435、714和841；435、714和862；435、790和841；435、790和862；435、841和862；530、572和596；530、572和617；530、572和688；530、572和696；530、572和702；530、572和709；530、572和A712；530、572和714；530、572和790；530、572和841；530、572和862；530、596和617；530、596和688；530、596和696；530、596和702；530、596和709；530、596和A712；530、596和714；530、596和790；530、596和841；530、596和862；530、617和688；530、617和696；530、617和702；530、617和709；530、617和A712；530、617和714；530、617和790；530、617和841；530、617和862；530、688和696；530、688和702；530、688和709；530、688和A712；530、688和714；530、688和790；530、688和841；530、688和862；530、696和702；530、696和709；530、696和A712；530、696和714；530、696和790；530、696和841；530、696和862；530、702和709；530、702和A712；530、702和714；530、702和790；530、702和841；530、702和862；530、709和A712；530、709和714；530、709和790；530、709和841；530、709和862；530、A712和714；530、A712和790；530、A712和841；530、A712和862；530、714和790；530、714和841；530、714和862；530、790和841；530、790和862；530、841和862；572、596和617；572、596和688；572、596和696；572、596和702；572、596和709；572、596和A712；572、596和714；572、596和790；572、596和841；572、596和862；572、617和688；572、617和696；572、617和702；572、617和709；572、617和A712；572、617和714；572、617和790；572、617和841；572、617和862；572、688和696；572、688和702；572、688和709；572、688和A712；572、688和714；572、688和790；572、688和841；572、688和862；572、696和702；572、696和709；572、696和A712；572、696和714；572、696和790；572、696和841；572、696和862；572、702和709；572、702和A712；572、702和714；572、702和790；572、702和841；572、702和862；572、709和A712；572、709和714；572、709和790；572、709和841；572、709和862；572、A712和714；572、A712和790；572、A712和841；572、A712和862；572、714和790；572、714和841；572、714和862；572、790和841；572、790和862；572、841和862；596、617和688；596、617和696；596、617和702；596、617和709；596、617和A712；596、617和714；596、617和790；596、617和841；596、617和862；596、688和696；596、688和702；596、688和709；596、688和A712；596、688和714；596、688和790；596、688和841；596、688和862；596、696和702；596、696和709；596、696和A712；596、696和714；596、696和790；596、696和841；596、696和862；596、702和709；596、702和A712；596、702和714；596、702和790；596、702和841；596、702和862；596、709和A712；596、709和714；596、709和790；596、709和841；596、709和862；596、A712和714；596、A712和790；596、A712和841；596、A712和862；596、714和790；596、714和841；596、714和862；596、790和841；596、790和862；596、841和862；617、688和696；617、688和702；617、688和709；617、688和A712；617、688和714；617、688和790；617、688和841；617、688和862；617、696和702；617、696和709；617、696和A712；617、696和714；617、696和790；617、696和841；617、696和862；617、702和709；617、702和A712；617、702和714；617、702和790；617、702和841；617、702和862；617、709和A712；617、709和714；617、709和790；617、709和841；617、709和862；617、A712和714；617、A712和790；617、A712和841；617、A712和862；617、714和790；617、714和841；617、714和862；617、790和841；617、790和862；617、841和862；688、696和702；688、696和709；688、696和A712；688、696和714；688、696和790；688、696和841；688、696和862；688、702和709；688、702和A712；688、702和714；688、702和790；688、702和841；688、702和862；688、709和A712；688、709和714；688、709和790；688、709和841；688、709和862；688、A712和714；688、A712和790；688、A712和841；688、A712和862；688、714和790；688、714和841；688、714和862；688、790和841；688、790和862；688、841和862；696、702和709；696、702和A712；696、702和714；696、702和790；696、702和841；696、702和862；696、709和A712；696、709和714；696、709和790；696、709和841；696、709和862；696、A712和714；696、A712和790；696、A712和841；696、A712和862；696、714和790；696、714和841；696、714和862；696、790和841；696、790和862；696、841和862；702、709和A712；702、709和714；702、709和790；702、709和841；702、709和862；702、A712和714；702、A712和790；702、A712和841；702、A712和862；702、714和790；702、714和841；702、714和862；702、790和841；702、790和862；702、841和862；709、A712和714；709、A712和790；709、A712和841；709、A712和862；709、714和790；709、714和841；709、714和862；709、790和841；709、790和862；709、841和862；A712、714和790；A712、714和841；A712、714和862；A712、790和841；A712、790和862；A712、841和862；714、790和841；714、790和862；714、841和862；或790、841和862。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的两个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个突变：688和696；688和702；688和A712；688和714；696和702；696和A712；696和714；702和A712；702和714；或A712和714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的三个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个突变：688、696和702；688、696和A712；688、696和714；688、702和A712；688、702和714；688、A712和714；696、702和A712；696、702和714；696、A712和714；或702、A712和714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的四个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个突变：688、696、702和A712；688、696、702和714；688、696、A712和714；688、702、A712和714；或696、702、A712和714。

在一些实施例中，如本文提供的启动子元件的核苷酸序列可以包含相比于参考启动子元件的核苷酸序列的五个突变。例如，在一些实施例中，启动子序列中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个突变：688、696、702、A712和714。

本文所述的方法中使用的核酸分子通常是DNA，但在适当的情况下可以使用RNA。如本文所使用的，“外源性”是指从例如相同或不同的生物体或合成地产生的核酸引入到细胞中的任何核酸序列(例如经密码子优化的核酸序列)。例如，外源性核酸可以是来自一种微生物(例如，一个属或物种的甲基营养型酵母)的被引入到不同属或物种的甲基营养型酵母中的核酸；然而，外源性核酸也可以是来自甲基营养型酵母的尽管存在对应的天然核酸序列但仍以另外的拷贝的形式被重组地引入到甲基营养型酵母中的核酸，或者是来自甲基营养型酵母的被重组地引入到含有相比于对甲基营养型酵母天然的序列的一或多个突变、插入或缺失的甲基营养型酵母中的核酸。例如，巴斯德毕赤酵母含有对ALAS进行编码的内源性核酸；巴斯德毕赤酵母ALAS核酸的另外的拷贝(例如，重组地引入到巴斯德毕赤酵母中)被视为是外源性的。类似地，“外源性”蛋白质是由外源性核酸编码的蛋白质。

在某些情况下，外源性核酸可以是异源性核酸。如本文所使用的，“异源性”核酸是指对生物体非天然的任何核酸序列(例如，异源性核酸可以是来自一种微生物(例如，一个属或物种的甲基营养型酵母，无论其是否经过密码子优化)的被引入到不同属或物种的甲基营养型酵母中的核酸)。类似地，“异源性”蛋白质是由异源性核酸编码的蛋白质。

当核酸的任何部分(例如，启动子序列或经编码的蛋白质的序列)对宿主生物体是外源性的时，所述核酸分子被视为对宿主生物体是外源性的。当核酸的任何部分(例如，启动子序列或经编码的蛋白质的序列)对宿主生物体是异源性的时，所述核酸分子被视为对宿主生物体是异源性的。

本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化的核酸构建体。在一些实施例中，本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以产生RNA的核酸构建体。重组产生的RNA可以用于修饰细胞的功能，例如通过RNA干扰或作为用于DNA编辑的向导。在一些实施例中，本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以产生产物(例如，蛋白质)的核酸构建体。在一些实施例中，本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以产生外源性产物(例如，蛋白质)的核酸构建体。在一些实施例中，本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以产生异源性产物(例如，蛋白质)的核酸构建体。在一些实施例中，本文提供了允许在不存在甲醇的情况下对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以产生产物(例如，蛋白质)的核酸构建体。另外，本文提供了允许对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化以增加血红素结合蛋白的表达的核酸构建体。

本文还提供了包含本文所述的启动子元件中的任何启动子元件的细胞。细胞可以是任何合适的细胞。例如，细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)细胞)、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞可以是酵母细胞。酵母细胞的非限制性实例包含毕赤酵母(例如，甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母)、假丝酵母(例如，博伊丁假丝酵母)细胞、汉逊酵母(例如，多形汉逊酵母)细胞、球拟酵母细胞和酵母属(例如，酿酒酵母)细胞。在一些实施例中，细胞可以是甲基营养型酵母细胞。甲基营养型酵母细胞的非限制性实例包含毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、汉逊酵母细胞和球拟酵母细胞。在一些实施例中，细胞可以是毕赤酵母细胞或酵母属细胞。

在一些实施例中，本文件提供了含有核酸构建体(例如，第一核酸构建体、第二核酸构建体等)的细胞，所述核酸构建体包含与本文所述的启动子元件可操作地连接的核苷酸序列。包含核苷酸序列的核酸构建体可以包含任何合适的核苷酸序列。

如本文所使用的，“可操作地连接”意指启动子或其它表达元件以导引或调节编码序列的表达的方式相对于编码序列定位(例如，框内)。

应当理解，包含与本文所述的启动子元件中的任何启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体可以包含所关注的核苷酸序列。在一些实施例中，核苷酸序列的转录和/或翻译可能导致所关注的产物(例如，蛋白质、DNA、RNA或小分子)的产生。例如，在一些实施例中，包含核苷酸序列的核酸构建体可以是对蛋白质进行编码的核酸构建体。例如，在一些实施例中，包含核苷酸序列的核酸构建体可以是对RNA(例如，mRNA、tRNA、核酶、siRNA、miRNA或shRNA)进行编码的核酸构建体。例如，在一些实施例中，包含核苷酸序列的核酸构建体可以是对DNA进行编码的核酸构建体。例如，在一些实施例中，包含核苷酸序列的核酸构建体可以是其转录导致或有助于小分子(例如血红素、乙醇或药物活性剂)的产生的核酸构建体。

在一些实施例中，包含核苷酸序列的核酸构建体(例如，第一核酸构建体、第二核酸构建体等)可以是对蛋白质(例如，第一蛋白质、第二蛋白质等)进行编码的核酸构建体。

重组表达的蛋白质可以广泛用于许多应用，如用于食品、研究和医药。在一些实施例中，由包含与如本文所述的启动子元件中的任何启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体编码的蛋白质可以是脱水蛋白、植酸酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂肪酶、过氧化物酶、淀粉酶、转谷氨酰胺酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在一些实施例中，由与如本文所述的启动子元件中的任何启动子元件可操作地连接的核酸编码的蛋白质可以是抗体或其片段(例如阿达木单抗(adalimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)或兰尼单抗(ranibizumab))、酶(例如治疗性酶，如α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、阿法链道酶α(dornase alfa)、葡糖脑苷脂酶、组织型纤溶酶原激活剂、拉布立酶(rasburicase))、工业酶(例如过氧化氢酶、纤维素酶、漆酶、谷氨酰胺酶或糖苷酶)，或生物催化剂(例如转氨酶、细胞色素P450、激酶、磷酸化酶或异构酶)、调节蛋白(例如转录因子(如Mxr1、Adr1))、肽激素(如胰岛素、胰岛素样生长因子1、粒细胞菌落刺激因子、卵泡刺激激素或如人生长激素等生长激素)、凝血蛋白(如因子VII)、细胞因子(例如干扰素或促红细胞生成素)或细胞因子抑制剂(如依那西普(etanercept))。

在一些实施例中，蛋白质可以是血红素结合蛋白(例如，外源性或异源性血红素结合蛋白)。在一些实施例中，血红素结合蛋白可以选自由以下组成的组：珠蛋白(Pfam数据库中的PF00042)、细胞色素(例如细胞色素P450、细胞色素a、细胞色素b、细胞色素c)、细胞色素c氧化酶、木质素酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。在一些实施例中，珠蛋白可以选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白、血绿蛋白、细胞珠蛋白、无脊血红蛋白、黄素血红蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白(例如β血红蛋白、α血红蛋白)、组织珠蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、非共生血红蛋白、原珠蛋白和截短的血红蛋白(例如HbN、HbO、Glb3、氰基珠蛋白(cyanoglobin))。在一些实施例中，血红素结合蛋白可以是非共生血红蛋白。在一些实施例中，血红素结合蛋白可以是豆血红蛋白。在一些实施例中，血红素结合蛋白可以是大豆豆血红蛋白(LegH)。LegH的参考氨基酸序列在图1中以SEQ ID NO:4提供。LegH是与血红素结合的蛋白质，其在415nm处产生特性吸收并且产生明显的红色。LegH蛋白(也被称为LGB2)天然存在于大豆的根瘤中(参见例如，UniprotKB登录号P02236)。还参见WO 2014/110539和WO2014/110532，所述文献中的每个文献通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，血红素结合蛋白可以与SEQ ID NO:1-27(图1)中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。在一些实施例中，血红素结合蛋白是SEQ ID NO:1-27(图1)中的任一个中所示的氨基酸序列。

虽然本文例示的材料和方法使用了来自毕赤酵母物种(巴斯德毕赤酵母)的醇氧化酶启动子元件，但是也可以使用其它生物体。例如，可以使用来自不同甲基营养型酵母，如毕赤酵母属的其它物种或来自假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属中的任何属的物种的醇氧化酶启动子元件。甲基营养型酵母物种的非限制性实例包含甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母(也被称为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。在一些实施例中，启动子元件可以是来自假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属中的任何属的醇氧化酶启动子元件。在一些实施例中，启动子元件可以与来自假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属中的任何属的醇氧化酶启动子元件具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施例中，启动子元件可以是来自假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属中的任何属的醇氧化酶启动子元件。在一些实施例中，启动子元件可以是来自甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母或多形汉逊酵母的醇氧化酶启动子元件。在一些实施例中，启动子元件可以与来自甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母或多形汉逊酵母的醇氧化酶启动子元件具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施例中，启动子元件可以是来自甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母或多形汉逊酵母的醇氧化酶启动子元件。其它醇氧化酶启动子的非限制性实例包含来自巴斯德毕赤酵母的AOX2启动子(参见，例如，小日秀幸(Ohi,Hideyuki)等人,分子和普通遗传学MGG(Molecular and General Genetics MGG)243.5(1994):489-499，所述文献通过引用以其整体并入本文)、来自博伊丁假丝酵母的醇氧化酶(AOD1)启动子(参见，例如，基因库登录号YSAAOD1A)、来自多形汉逊酵母的醇氧化酶(MOX)启动子(参见，例如，基因库登录号X02425)，或者来自甲醇毕赤酵母的MOD1或MOD2启动子(参见，例如，雷蒙德(Raymond)等人,1998,酵母(Yeast),14:11-23；以及中川(Nakagawa)等人,1999,酵母,15:1223-30)。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以选自由来自以下的启动子元件组成的组：AOX1、AOX2、AOD1、MOX、MOD1和MOD2。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自AOX1的启动子元件。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自AOX2的启动子元件。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自AOD1的启动子元件。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自MOX的启动子元件。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自MOD1的启动子元件。在一些实施例中，醇氧化酶启动子元件可以是来自MOD2的启动子元件。

在一些实施例中，本文所述的细胞中的任何细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))可以包含第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含其转录和/或翻译可能导致与启动子元件可操作地连接的产物第二产物(例如蛋白质、RNA、DNA或小分子)的产生的核苷酸序列。在一些实施例中，第二核酸构建体的核苷酸序列可操作地连接的启动子元件与第一核酸构建体的核苷酸序列可操作地连接的启动子元件相同。在一些实施例中，第二核酸构建体的核苷酸序列可操作连接的启动子元件是第二启动子元件。在一些实施例中，第二启动子元件可以是本文所述的启动子元件中的任何启动子元件。在一些实施例中，第二启动子元件可以具有与第一启动子元件相同的序列。在一些实施例中，第二启动子元件可以包含对应于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变。在一些实施例中，第二启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，第二启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。在一些实施例中，第二启动子元件中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：T146；C154；T303；T426；A433；A435；T530；C572；T596；T617；T688；A696；T702；A709；A712；T714；A790；A841；或T862。在一些实施例中，第二启动子元件中可以存在位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：146；154；303；426；433；435；530；572；596；617；688；696；702；709；712；714；790；841；或862。在一些实施例中，第二启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：T688C、A696T、T702C、A712G或T714G。在一些实施例中，第二启动子元件可以包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：688C、696T、702C、712G或714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。在一些实施例中，第二启动子元件中可以存在对应于以下位置之一的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：T688；A696；T702；A712；或T714。在一些实施例中，第二启动子元件中可以存在对应于以下位置之一的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：688；696；702；712；或714。在一些实施例中，第二启动子元件可以是诱导型启动子元件(例如，甲醇诱导型启动子元件)或组成型启动子元件。

当对细胞(例如酵母(例如甲基营养型酵母))进行基因工程化时，通常可以使用许多诱导型启动子中的任何诱导型启动子。例如，可以使用甲醇诱导型启动子或来自甲醇诱导型启动子的启动子元件。合适的甲醇诱导型启动子包含如本文所述的pAOX1，以及其它甲醇诱导型启动子或来自甲醇诱导型启动子的启动子元件。这些包含，但不限于，来自巴斯德毕赤酵母的pAOX2启动子、来自博伊丁假丝酵母的醇氧化酶(AOD1)启动子(参见，例如，基因库登录号YSAAOD1A)、来自多形汉逊酵母的醇氧化酶(MOX)启动子(参见，例如，基因库登录号X02425)，来自甲醇毕赤酵母的MOD1或MOD2启动子(参见，例如，雷蒙德等人,1998,酵母,14:11-23；以及中川等人,1999,酵母,15:1223-30)、来自巴斯德毕赤酵母的DHAS启动子(参见，例如，基因库登录号FJ752551)或来自所述启动自的启动子元件、来自巴斯德毕赤酵母的甲醛脱氢酶(FLD1)启动子(参见，例如，基因库登录号AF066054)或来自巴斯德毕赤酵母的PEX8启动子(参见，例如，克兰蒂(Kranthi)等人,2010,酵母,27:705-11)。所有这些启动子已知是由甲醇诱导的。合适的组成型启动子和组成型启动子元件包含但不限于来自转录延伸因子EF-1α基因(TEF1)的以组成型方式强烈转录的巴斯德毕赤酵母启动子(或其一部分)。还可以使用其它合适的组成型启动子(或来自所述组成型启动子的启动子元件)，包含但不限于来自巴斯德毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子(参见，例如，基因库登录号U62648.1)、来自潜在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的启动子、来自巴斯德毕赤酵母的GCW14p(PAS_chr1-4_0586)(参见，例如，基因库登录号XM_002490678)和来自源自巴斯德毕赤酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子(参见，例如，基因库登录号AY288296)。进一步地，应注意，诱导型启动子(例如甲醇诱导型)和组成型启动子(或来自所述启动子的启动子元件)的组合可以进行组合以进一步增加与其可操作地连接的核酸中的任何核酸的表达。

在一些实施例中，第二蛋白质可以是上文所述的蛋白质中的任何蛋白质。在一些实施例中，第二蛋白质可以是转录因子(例如，Mxr1)。在一些实施例中，本文所述的任何启动子元件(例如，第一启动子元件或与第二启动子元件)可以含有转录因子的一或多个识别序列。因此，在一些实施例中，可以构建反馈回路，使得转录因子驱动所关注的蛋白质的表达并且还驱动转录因子的另外的拷贝的表达。在一些实施例中，转录因子可以是Mxr1。在一些实施例中，第二蛋白质可以是参与血红素生物合成的蛋白质(例如，选自由以下组成的组蛋白质：氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、尿卟啉原III合酶(UPG3S)、尿卟啉原III脱羧酶(UPG3D)、粪卟啉原氧化酶(COPROX)、原卟啉原IX氧化酶(PROTOX)和/或亚铁螯合酶(FC))。

对参与血红素生物合成的八种不同的酶中的一或多种酶进行编码的核酸(如由巴斯德毕赤酵母基因组的序列确定和注释的)可以如本文所描述的那样进行表达。例如，对ALA合酶、ALA脱水酶、胆色素原脱氨酶、UPG III合酶、UPG III脱羧酶、CPG氧化酶、PPG氧化酶和亚铁螯合酶进行编码的异源性核酸分子可以在本文所描的菌株(例如酵母菌株(例如甲基营养型酵母菌株))中表达。对于对细胞(例如酵母(例如甲基营养型酵母))进行基因工程化以含有一种以上异源性核酸(例如转基因)，可以对甲醇诱导型启动子和组成型启动子或来自所述启动子的元件的组合进行组合以进一步增加此类核酸的表达。

应当理解，本文所述的细胞中的任何细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))可以包含另外的核酸构建体作为第三、第四、第五等核酸构建体，并且在一些实施例中，此类构建体可以如上文所描述的那样用于第二核酸构建体。

先前在酿酒酵母方面的研究将ALAD和胆色素原脱氨酶鉴定为血红素生物合成中的限速酶(参见例如，霍夫曼(Hoffman)等人,2003,生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.),310(4):1247-53)。然而，单独血红素酶在来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的巴斯德毕赤酵母中的异源性表达未能克服与含有血红素的重组蛋白的表达相关联的限制(参见，克赖纳(Krainer)等人,2015,微生物细胞工厂(Microb.Cell Fact.),13；14:4)。含重组血红素的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中表达可以通过由甲醇诱导型启动子共表达整个血红素生物合成途径来实现，但是应当理解，血红素生物合成途径中涉及的基因中的一或多个基因可以由一或多个组成型启动子表达(参见，例如，美国专利第9,938,327号，所述专利通过引用以其整体并入)。

本文还提供了使用本文所述的任何核酸构建体和/或细胞产生产物(例如蛋白质)的方法。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)。在一些实施例中，第一启动子元件可以是本文所述的任何启动子元件。在一些实施例中，第一启动子元件包含对应于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述第一启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述第一启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述启动子元件包含位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：T146；C154；T303；T426；A433；A435；T530；C572；T596；T617；T688；A696；T702；A709；A712；T714；A790；A841；或T862。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述启动子元件包含位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个)突变：146；154；303；426；433；435；530；572；596；617；688；696；702；709；712；714；790；841；或862。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述第一启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述第一启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：688C、696T、702C、712G和714G，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述启动子元件包含位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：T688；A696；T702；A712；或T714。在一些实施例中，本文提供的方法可以包含对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)，其中所述启动子元件包含位于对应于以下位置的位置处的相对于SEQ IDNO:28的一或多个(例如，2个、3个、4个或5个)突变：688；696；702；712；或714。在本文所述的方法中的任何方法的一些实施例中，所述方法可以在不存在添加的甲醇的情况下执行。在一些实施例中，甲基营养型酵母细胞的主要碳源可以是右旋糖、蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、糖醇、乙醇、醋酸盐或甘油。在一些实施例中，主要碳源可以选自由以下组成的组：葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甲醇和甘油。在一些实施例中，主要碳源可以选自由以下组成的组：葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘油。在一些实施例中，主要碳源可以是寡糖或多糖(例如淀粉、果胶、纤维素或半纤维素)。在一些实施例中，甲基营养型酵母细胞的主要碳源可以是糖的混合物(例如，源自纤维素生物质或淀粉)。

在一些实施例中，本文提供的方法允许产物(例如蛋白质)的滴度增加。在一些实施例中，与缺乏如本文所述的核酸构建体的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)。在一些实施例中，与包含使对与第一启动子元件可操作地连接的第一产物(例如蛋白质)进行编码的核酸进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的任何突变。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A，条件是所指示的核碱基与对应天然存在的核碱基不同。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于以下核苷酸位置的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的任何突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于以下核苷酸位置的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的任何突变146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变：688C、696T、702C、712G和714G。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于以下核苷酸位置的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的任何突变：T688、A696、T702、A712和T714。在一些实施例中，与包含使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的对应方法相比，产物(例如，蛋白质)的滴度可以增加至少5％(例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多)，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于以下核苷酸位置的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的任何突变：688、696、702、712和714。

通常，“滴度”是对溶液中的物质的量的度量。如本文所使用的，除非另有说明，否则血红素结合蛋白的“滴度”是指多肽的总量，无论所述多肽是否与血红素结合都是如此。产物(例如蛋白质)的滴度可以通过任何合适的方法来测量，如高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或紫外线和/或可见光光谱。

如本文所使用的，“对应方法”是除了所鉴定的差异之外，在所有方面都与参考方法基本上相同的方法。例如，除了对应方法将使包含与缺乏位于对应于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏对应于位于对应于核苷酸位置668-734(例如，核苷酸位置673-729、核苷酸位置678-724、核苷酸位置683-719或核苷酸位置688-714)的核苷酸位置中的相对于SEQ ID NO:28的突变中的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏位于对应于核苷酸位置T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏位于对应于核苷酸位置146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。

例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于T688C、A696T、T702C、A712G和T714G的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于T688C、A696T、T702C、A712G和T714G的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于688C、696T、702C、712G和714G的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏选自由对应于688C、696T、702C、712G和714G的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于T688、A696、T702、A712和T714的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置T688、A696、T702、A712和T714的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。例如，除了对应方法将使包含与缺乏由对应于688、696、702、712和714的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组中包含的突变中的任何突变的第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达之外，用于使包含与第一启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的核酸构建体进行表达的，其中所述第一启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置688、696、702、712和714的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变的对应方法在所有方面(例如细胞的基因组成、培养的温度和时间等)与参考方法基本上相同。

对细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))进行基因工程化通常包含将重组核酸分子(也被称为核酸构建体)引入到细胞中。如本文所描述的，重组核酸分子通常包含对与至少一个启动子元件(例如，诱导型或组成型启动子元件)可操作地连接的产物(例如，蛋白质(例如，参与血红素生物合成的蛋白质、血红素结合蛋白质或转录因子))的外源性核酸。在一些实施例中，重组核酸分子可以包含与同一或单独的启动子元件可操作地连接的两个或两个以上蛋白质编码序列的线性序列(例如，与包含核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的第一核酸构建体可操作地连接的第一启动子以及与包含核苷酸序列(例如，对第二蛋白质进行编码)的第二核酸构建体可操作地连接的第二启动子，或者与包含核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的第一核酸构建体和包含核苷酸序列(例如，对第二蛋白质进行编码)的第二核酸构建体可操作地连接的启动子)。在一些情况下，包含与核苷酸序列(例如，对蛋白质进行编码)可操作地连接的至少一个启动子的重组核酸分子可以被称为盒。

重组核酸可以包含表达元件。表达元件包含导引并调节核酸编码序列的表达的核酸序列。表达元件的一个实例是启动子序列。表达元件还可以包含调节核酸的表达的内含子、增强子序列、应答元件或诱导型元件。表达元件可以是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或病毒来源，并且载体可以含有来自不同来源的元件的组合。

核酸可以使用任何数量的扩增技术(参见例如，PCR引物：实验室手册(PCR Primer:A Laboratory Manual),1995,迪芬巴赫和德夫克勒(Dieffenbach&Dveksler)编辑,纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor,NY)；以及美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；以及第4,965,188号)利用合适的寡核苷酸对(例如引物)来检测。对原始PCR方法进行了许多修改，并且可以使用所述方法来对所选核酸进行检测。

合适的转录因子和对转录因子进行编码的核酸(例如，对转录因子进行编码的外源性核酸)包含，例如，来自巴斯德毕赤酵母的Mxr1。代表性巴斯德毕赤酵母Mxr1核酸序列可以在例如基因库登录号DQ395124中找到，而代表性巴斯德毕赤酵母Mxr1多肽序列可以在例如基因库登录号ABD57365中找到。在一些实施例中，转录因子可以是来自巴斯德毕赤酵母的Mit1序列(参见例如，基因库登录号CAY70887)。合适的转录因子还可以在多形汉逊酵母(例如，Adr1；参见，例如，核酸序列的基因库登录号AEOI02000005，碱基858873到862352，和氨基酸序列的基因库登录号ESX01253)和博伊丁假丝酵母(例如，Trm1；参见，例如，核酸序列的基因库登录号AB365355和氨基酸序列的基因库登录号BAF99700；以及Trm2；参见，例如，核酸序列的基因库登录号AB548760和氨基酸序列的基因库登录号BAJ07608)中找到。

如Mxr1等转录因子通常可以以低水平进行表达。在一些实施例中，令人期望的是将外源性核酸(例如，转录因子)置于诱导型的启动子的控制下。

在一些实施例中，转录因子可以与如本文所述的启动子元件结合，并激活由所述启动子元件进行的转录。在一些实施例中，当对转录因子进行编码的核酸序列与其所结合的启动子元件可操作地连接时，可以创建正反馈回路以帮助驱动与启动子可操作地连接的其它核酸序列(例如，蛋白质编码的核酸序列)的表达。可以与AOX1启动子(例如，突变的AOX1启动子)一起使用的转录因子的非限制性实例包含Mxr1、Mit1、Adr1、Trm1、Trm2和其组合。在一些实施例中，可以与AOX1启动子一起使用的转录因子可以包含Mxr1。可以与MOX启动子(例如，突变的MOX启动子)一起使用的转录因子的非限制性实例是Adr1。可以与AOD1启动子(例如，突变的AOD1启动子)一起使用的转录因子的非限制性实例包含Trm1、Trm2或其组合。在一些实施例中，两个经甲醇调节的转录因子(例如，Mxr1和Mit1)可以与甲醇诱导型启动子元件(例如，pAOX1)可操作地连接。

本文所述的重组核酸分子可以稳定地整合到细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))的基因组中，或者可以从有复制能力的质粒中进行染色体外表达。实现两者的方法在本领域中是众所周知的并且是常规使用的。

另外，应当注意，包含与启动子元件(例如，本文所述的启动子元件)可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质(例如，血红素结合蛋白质)进行编码)的第一核酸构建体可以与包含与启动子元件(例如，本文所述的启动子元件)可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第二蛋白质(例如，转录因子)进行编码)的第二核酸构建体物理分离(即，第一核酸构建体和第二核酸构建体可以是完全分离的分子)。可替代地，包含与启动子元件(例如，本文所述的启动子元件)可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的第一核酸构建体和包含与启动子元件(例如，本文所述的启动子元件)可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第二蛋白质进行编码)的第二核酸构建体可以包含在同一核酸构建体中。在一些实施例中，包含与启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码)的第一核酸构建体可以与包含与启动子元件可操作地连接的核苷酸序列(例如，对第二蛋白质进行编码)的第二核酸构建体是相连的。本领域的技术人员将理解，如果包含核苷酸序列(例如，对第二蛋白质进行编码)的第二核酸构建体与包含核苷酸序列(例如，对所关注的蛋白质进行编码)的第一核酸构建体是相连的，则可以使用单个启动子或来自所述启动子的启动子元件来驱动核苷酸序列(例如，对第一蛋白质进行编码并且对第二蛋白质进行编码的核酸)中的两个核苷酸序列或所有核苷酸序列的转录。

将核酸引入到细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))中的方法是本领域已知的，并且包含但不限于转导、电穿孔、生物弹道粒子递送和化学转化。培养细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞))的方法也是本领域已知的。参见，例如，“毕赤酵母方案(Pichia Protocols)”,分子生物学方法(Methods In Molecular Biology),389,克莱格(Cregg)编辑,2007,第2版,胡马纳出版社公司(The Humana Press Inc)。在某些情况下，可能期望的是将甲醇引入或添加到培养基中，但是如本文所证明的，不需要甲醇获得在所关注的一或多个产物(例如，蛋白质)的高水平下的高效表达。在某些情况下(例如，当对参与血红素生物合成的酶进行编码的一或多个核酸进行表达时)，可能期望的是用铁或其药学上或代谢上可接受的(或GRAS)盐来补充培养基。

本文提供的方法还可以包含对所表达蛋白质进行纯化。如本文所使用的，“富集的”蛋白质是占产生细胞的质量的至少5干重％(例如，至少6干重％、7干重％、8干重％、9干重％、10干重％、15干重％、20干重％、25干重％、30干重％、35干重％、40干重％、45干重％、50干重％、55干重％、60干重％或更多)或占产生细胞裂解物的质量(例如，不包含细胞壁或膜材料)的至少10干重％(例如，至少15干重％、20干重％、25干重％、30干重％、35干重％、40干重％、45干重％、50干重％、55干重％、60干重％、65干重％、70干重％、75干重％、80干重％、90干重％、95干重％或99干重％)的蛋白质。如本文所使用的，“经纯化的”蛋白质是已经与天然伴随其的细胞组分分离的蛋白质。通常，当蛋白质为至少70干重％(例如，至少75干重％、80干重％、85干重％、90干重％、95干重％或99干重％)时，其被视为是“经纯化的”，不含其它蛋白质和其所天然相关的天然存在的分子。

如本文所使用的，核酸可以包含DNA和RNA，并且包含含有一或多个核苷酸类似物或主链修饰的核酸。核酸可以是单链或双链的，这通常取决于其预期用途。还提供了与给定序列不同的核酸和多肽。核酸和多肽可以与给定核酸或多肽序列具有至少50％的序列同一性(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)。在一些实施例中，核酸或多肽可以与给定核酸或多肽序列具有100％的序列同一性。

在计算序列同一性百分比时，将两个序列进行比对，并且确定两个序列之间核苷酸或氨基酸残基的相同匹配的数量。将相同匹配的数量除以所比对区域的长度(即所比对核苷酸或氨基酸残基的数量)并乘以100以得出序列同一性百分比值。应当理解，所比对区域的长度可以是一或两个序列的一部分直到最短序列的全长尺寸。还应当理解，单个序列可以与一个以上其它序列进行比对，并且因此在每个所比对区域上可以具有不同的序列同一性百分比值。

两个或两个以上序列进行比对以确定序列同一性百分比可以使用允许跨核酸或多肽序列的整个长度执行对核酸或多肽序列的比对(全局比对)的计算机程序ClustalW和默认参数来执行。契钠(Chenna)等人,2003,核酸研究(Nucleic Acids Res),31(13):3497-500。ClustalW计算查询与一或多个目标序列之间的最佳匹配，并且将其进行比对使得可以确定同一性、相似性和差异。可以将一或多个残基的间隙插入到查询序列、目标序列或两者中以最大化序列比对。对于核酸序列的快速成对比对，可以使用默认参数(即，字长：2；窗口大小：4；评分方法：百分比；顶部对角线的数量：4；以及空位罚分：5)；对于多个核酸序列的比对，可以使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转换(weighttransition)：是。对于多肽序列的快速成对比对，可以使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：百分比；顶部对角线的数量：5；和空位罚分：3。对于多肽序列的多重比对，可以使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；以及残基特异性空位罚分：开。例如，ClustalW可以在万维网上在贝勒医学院(Baylor College of Medicine)搜索启动器网站或欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)网站上运行。

可以将变化引入到核酸分子中，从而引起经编码的多肽的氨基酸序列发生变化。例如，可以使用诱变(例如，定点诱变、PCR介导的诱变、转位子诱变、化学诱变、UV诱变或辐射诱导的诱变)或通过化学合成具有变化的核酸分子来将此类变化引入到核酸编码序列中。此类核酸变化可能导致一或多个氨基酸残基处的保守和/或非保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有相似侧链的不同氨基酸残基取代(参见例如，戴霍夫(Dayhoff)等人,1978,蛋白序列和结构图谱(Atlas of Protein Sequence andStructure),5(增刊3):345-352，其提供了氨基酸取代的频率表)，而非保守取代是一个氨基酸残基被不具有相似侧链的氨基酸残基取代。可以如本文所述的对核酸和/或多肽序列进行修饰以改善一或多个性质，如但不限于增加表达(例如，转录和/或翻译)、更严格的调节、去调节、分解代谢物阻遏丧失、修饰特异性、分泌、热稳定性、溶剂稳定性、氧化稳定性、蛋白酶抗性、催化活性和/或颜色。

如本文所使用的，“分离的”核酸分子是不含天然侧接分离的核酸分子所源自的生物体的基因组中的核酸的一端或两端的序列(例如，通过PCR或限制内切酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)的核酸分子。此类分离的核酸分子通常被引入到载体(例如，克隆载体或表达载体)中，以便于操纵或产生在下文更详细地讨论的融合核酸分子。另外，分离的核酸分子可以包含如重组或合成核酸分子等经工程化的核酸分子。

如本文所述的载体可以被引入到宿主细胞中。如本文所使用的，“宿主细胞”是指核酸所引入的特定细胞，并且还包含携带载体的此类细胞的子代。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，核酸可以在如大肠杆菌等细菌细胞中表达，或者可以在昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域的技术人员已知的。用于在体内和体外两者将核酸引入到宿主细胞中的许多方法是本领域的技术人员熟知的，并且包含但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)转化、热休克、脂质转染、微注射和病毒介导的核酸传递。

核酸可以使用本领域常规的技术进行分离。例如，核酸可以使用任何方法进行分离，所述方法包含但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)。一般的PCR技术描述于例如PCR引物：实验室手册,迪芬巴赫和德夫克勒编辑,冷泉港实验室出版社,1995中。重组核酸技术包含例如可以用于分离核酸的限制酶消化和连接。分离的核酸还可以是经化学合成的，呈单个核酸分子的形式或者呈一系列寡核苷酸的形式。

多肽可以从天然来源(例如生物样品)中通过如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石色谱等已知方法进行纯化。多肽还可以通过例如使核酸在表达载体中表达来进行纯化。另外，经纯化的多肽可以通过化学合成获得。多肽的纯度的程度可以使用任何合适的方法来测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。

还提供了含有如本文所述的核酸构建体(例如，对与如本文所述的启动子元件可操作地连接的多肽进行编码的核苷酸序列)的构建体或载体。包含表达构建体或载体的构建体或载体是可商购获得的，或者可以通过本领域常规的重组DNA技术产生。含有核酸的构建体或载体可以具有与此类核酸可操作地连接的表达元件，并且进一步地可以包含如对可选择标志物(例如抗生素抗性基因)进行编码的那些等序列。含有核酸的构建体或载体可以对嵌合多肽或融合多肽(即与异源性多肽可操作地连接的可以位于多肽的N末端或C末端的多肽)进行编码。代表性异源性多肽是可以用于对经编码的多肽进行纯化的那些(例如，6xHis标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST))。

核酸还可以使用杂交来进行检测。核酸之间的杂交在萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,第7.37-7.57节、第9.47-9.57节、第11.7-11.8节和第11.45-11.57节)中进行了讨论。萨姆布鲁克等人公开了针对少于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的合适的蛋白质印迹条件(第11.45-11.46节)。长度小于100个核苷酸的序列与第二序列之间的Tm可以使用第11.46节中提供的公式计算。萨姆布鲁克等人另外公开了针对大于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的蛋白质印迹条件(第9.47-9.54节)。长度大于100个核苷酸的序列与第二序列之间的Tm可以使用Sambrook等人的第9.50-9.51节中提供的公式计算。

含有核酸的膜进行预杂交和杂交的条件，以及含有核酸的膜进行洗涤以去除过量且非特异性结合的探针的条件在杂交的严格性中可以发挥重要作用。此类杂交和洗涤可以在适当时在适中严格或高严格的条件下执行。例如，通过降低洗涤溶液中的盐浓度和/或通过提高执行洗涤的温度可以使洗涤条件更加严格。简单地通过举例的方式，高严格条件通常包含在0.2X SSC中在65℃下对膜进行洗涤。

另外，对杂交量的翻译可能受例如标记的寡核苷酸探针的比活性的影响、受探针杂交的模板核酸上的探针结合位点的数量的影响并且受放射自显影或其它检测培养基的暴露的量的影响。本领域的普通技术人员将容易理解的是，尽管可以使用任何数量的杂交和洗涤条件来检查探针核酸分子与所固定靶核酸的杂交，但是更重要的是检查探针与靶核酸在相同的杂交、洗涤和暴露条件下的杂交。优选地，靶核酸在同一膜上。

如果与核酸的杂交比与另一核酸的杂交大至少5倍(例如，至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍)，则核酸分子被视为与核酸杂交，而不是与另一核酸杂交。杂交的量可以直接在膜上或由使用例如PhosphorImager或Densitometer(分子动力学,加利福尼亚州森尼维尔(Sunnyvale,CA))的放射自显影来定量。

可以使用抗体检测多肽。用于使用抗体检测多肽的技术包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。抗体可以是多克隆或单克隆的。对多肽具有特异性结合亲和力的抗体可以使用本领域众所周知的方法产生。可以使用本领域已知的方法将抗体与如微量滴定板等固体支撑物连接。在多肽存在的情况下，形成抗体-多肽复合物。

检测(例如扩增产物、杂交复合物或多肽)通常是使用可检测标记完成的。术语“标记”旨在涵盖直接标记和间接标记的使用。可检测标记包含酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。

本文描述了可以用于产生缺乏供选择的序列(即缺乏可选择标志物)的菌株的方法。这些方法包含使用环形质粒DNA载体和线性DNA序列；所述环形质粒DNA载体含有选择标志物和DNA复制的起点(也被称为自主复制序列(ARS))，并且线性DNA序列含有用于通过同源重组整合到毕赤酵母基因组中的序列。线性DNA分子另外可以包含对一或多个所关注的蛋白质进行编码的核酸序列，如但不限于血红素结合的LegH、脱水蛋白、植酸酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂肪酶、过氧化物酶、淀粉酶、转谷氨酰胺酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、如乙醇、乳酸、丁醇、己二酸或琥珀酸等涉及用于产生小分子的途径的一或多种酶或针对任何此类蛋白质的抗体。

细胞(例如，酵母细胞(例如，甲基营养型酵母细胞(例如毕赤酵母)))可以用DNA分子和通过在环形质粒上存在可选择标志物而选择的转化体两者进行转化。然后可以使用例如PCR对转化体进行筛选，以将线性DNA分子整合到基因组中。一旦鉴定出具有无标志物线性DNA分子正确整合的转化体，细胞就可以在不存在选择环形质粒的情况下生长。因为在不存在选择的情况下不能稳定地维持标志物携带质粒，所以在选择放松后质粒通常会很快丢失。在不存在供选择的异源性序列的情况下，所得菌株携带经整合的线性DNA。因此，此方法可以用于构建缺乏对重组产物(例如蛋白质)产率影响很小或无影响的可选标志物(例如异源性选择标志物)的菌株(例如毕赤酵母菌株)。

根据本公开，在本领域的技术范围内，可以采用常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。此类技术在文献中进行了充分解释。本公开的材料和方法将在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的方法和物质组合物的范围。

示例性实施例

实施例1是一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例2是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置673-729中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例3是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置678-724中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例4是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置683-719中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例5是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置688-714中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例6是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的两个或两个以上突变。

实施例7是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的三个或三个以上突变。

实施例8是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的四个或四个以上突变。

实施例9是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ IDNO:28的五个或五个以上突变。

实施例10是根据实施例1所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子具有SEQ ID NO:29的序列。

实施例11是一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例12是根据实施例11所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例13是根据实施例11所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例14是根据实施例11所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例15是根据实施例11所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例16是根据实施例11到15中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例17是根据实施例11到15中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例18是根据实施例11到15中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例19是根据实施例11到15中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例20是根据实施例11到15中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于以下的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例21是一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例22是根据实施例21所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例23是根据实施例21所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例24是根据实施例21所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例25是根据实施例21所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例26是根据实施例21到25中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：688、696、702、712和714。

实施例27是根据实施例21到25中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例28是根据实施例21到25中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例29是根据实施例21到25中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例30是根据实施例21到25中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于以下的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变：688、696、702、712和714。

实施例31一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例32是根据实施例31所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的两个或两个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例33是根据实施例31所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的三个或三个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例34是根据实施例31所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的四个或四个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例35是根据实施例31所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的五个或五个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例36是根据实施例1到35中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例37是根据实施例1到35中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例38是根据实施例1到35中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例39是根据实施例1到35中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例40是根据实施例1到35中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例41是一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例42是根据实施例41所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的两个或两个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例43是根据实施例41所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的三个或三个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例44是根据实施例41所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的四个或四个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例45是根据实施例41所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的五个或五个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例46是根据实施例1到45中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例47是根据实施例1到45中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例48是根据实施例1到45中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例49是根据实施例1到45中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例50是根据实施例1到45中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变688C、696T、702C、712G和714G。

实施例51是根据实施例1到50中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是来自启动子的醇氧化酶启动子，所述启动子选自由以下组成的组：AOX1、AOX2、AOD1、MOX、MOD1和MOD2。

实施例52是根据实施例1到51中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是醇氧化酶1(AOX1)启动子元件。

实施例53是根据实施例1到52中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。

实施例54是根据实施例1到52中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少95％的序列同一性。

实施例55是根据实施例1到54中任一实施例所述的核酸构建体，其进一步包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接。

实施例56是根据实施例55所述的核酸构建体，其中所述核苷酸序列对第一蛋白质进行编码。

实施例57是根据实施例56所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质对甲基营养型酵母细胞是外源性的。

实施例58是根据实施例56或实施例57所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质对甲基营养型酵母细胞是异源性的。

实施例59是根据实施例56到58中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质选自由以下组成的组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子、细胞因子抑制剂和血红素结合蛋白。

实施例60是根据实施例56到59中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质是血红素结合蛋白。

实施例61是根据实施例60所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白选自由以下组成的组：珠蛋白、细胞色素、细胞色素c氧化酶、木质素酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。

实施例62是根据实施例60所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白、血绿蛋白、细胞珠蛋白、无脊血红蛋白、黄素血红蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、组织珠蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、非共生血红蛋白、原珠蛋白和截短的血红蛋白。

实施例63是根据实施例60所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白是非共生血红蛋白。

实施例64是根据实施例60所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白是豆血红蛋白。

实施例65是根据实施例60所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27中的任一个的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

实施例66是根据实施例1到65中任一实施例所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括转录因子的识别序列。

实施例67是一种细胞，所述细胞包括第一核酸构建体，其中所述第一核酸构建体是根据实施例1到66中任一实施例所述的核酸构建体。

实施例68是根据实施例67所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。

实施例69是根据实施例68所述的细胞，其中所述酵母细胞是甲基营养型酵母细胞。

实施例70是根据实施例69所述的细胞，其中所述甲基营养型酵母细胞是毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、汉逊酵母细胞或球拟酵母细胞。

实施例71是根据实施例69或实施例70所述的细胞，其中所述甲基营养型酵母细胞是甲醇毕赤酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、博伊丁假丝酵母细胞或多形汉逊酵母细胞。

实施例72是根据实施例69到71中任一实施例所述的细胞，其中所述甲基营养型酵母细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。

实施例73是根据实施例67到72中任一实施例所述的的细胞，其进一步包括第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件或与第二启动子元件可操作地连接。

实施例74是根据实施例73所述的细胞，其中所述第二核酸构建体的所述核苷酸序列与具有与所述第一醇氧化酶启动子元件相同的序列的第二启动子元件可操作地连接。

实施例75是根据实施例73到74中任一实施例所述的细胞，其中所述第二核酸构建体的所述核苷酸序列对第二蛋白质进行编码。

实施例76是根据实施例75所述的细胞，其中所述第二蛋白质是转录因子。

实施例77是根据实施例76所述的细胞，其中对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列与包括所述转录因子的识别序列的第二启动子元件可操作地连接。

实施例78是根据实施例76或实施例77所述的细胞，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括所述转录因子的识别序列。

实施例79是根据实施例75到78中任一实施例所述的细胞，其中所述第二蛋白质是参与血红素生物合成的蛋白质。

实施例80是根据实施例79所述的细胞，其中参与血红素生物合成的所述蛋白质选自由以下组成的组：氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、尿卟啉原III合酶(UPG3S)、尿卟啉原III脱羧酶(UPG3D)、粪卟啉原氧化酶(COPROX)、原卟啉原IX氧化酶(PROTOX)和亚铁螯合酶(FC)。

实施例81是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

实施例82是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置673-729中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的突变。

实施例83是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置678-724中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的突变。

实施例84是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置683-719中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的突变。

实施例85是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置688-714中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的突变。

实施例86是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变。

实施例87是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变。

实施例88是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变。

实施例89是根据实施例81所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变。

实施例90是根据实施例81到89中任一实施例所述的方法，其中通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变的产物的滴度大于通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件缺乏位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的任何突变的产物的滴度。

实施例91是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例92是根据实施例91所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例93是根据实施例91所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例94是根据实施例91所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例95是根据实施例91所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

实施例96是根据实施例91到95中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例97是根据实施例91到95中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例98根据实施例91到95中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的三个或三个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例99是根据实施例91到95中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688、A696、T702、A712和T714。

实施例100是根据实施例91到95中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于对应于T688、A696、T702、A712和T714的核苷酸位置处的如相比于SEQ ID NO:28的突变。

实施例101是根据实施例91到100中任一实施例所述的方法，其中通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变的产物的滴度大于通过使包括对与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的第一蛋白质进行编码的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件缺乏位于选自由对应于T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的任何突变的产物的滴度。

实施例102是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例103是根据实施例102所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例104是根据实施例102所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例105是根据实施例102所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例106是根据实施例102所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的五个或五个以上突变：146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862。

实施例107是根据实施例102到106中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：688、696、702、712和714。

实施例108是根据实施例102到106中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例109根据实施例102到106中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例110是根据实施例102到106中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：688、696、702、712和714。

实施例111是根据实施例102到106中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于对应于以下的核苷酸位置处的如相比于SEQ ID NO:28的突变：688、696、702、712和714。

实施例112是根据实施例102到111中任一实施例所述的方法，其中通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变的产物的滴度大于通过使包括对与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的第一蛋白质进行编码的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件缺乏位于选自由对应于146、154、303、426、433、435、530、572、596、617、688、696、702、709、712、714、790、841和862的核苷酸位置组成的组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的任何突变的产物的滴度。

实施例113是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例114是根据实施例113所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的两个或两个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A成、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例115是根据实施例113所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的三个或三个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例116是根据实施例113所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的四个或四个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例117是根据实施例113所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的五个或五个以上突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

实施例118是根据实施例113到117中任一实施例所述的方法，其中通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的一或多个突变的产物的滴度大于通过使包括对与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的第一蛋白质进行编码的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件缺乏选自由对应于T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变的产物的滴度。

实施例119是根据实施例81到118中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例120是根据实施例81到118中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例121是根据实施例81到118中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例122是根据实施例81到118中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

实施例123是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28突变组成的组的一或多个突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例124是根据实施例123所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28突变组成的组的两个或两个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例125是根据实施例123所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28突变组成的组的三个或三个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例126是根据实施例123所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28突变组成的组的四个或四个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例127是根据实施例123所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28突变组成的组的五个或五个以上突变：146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A。

实施例128是根据实施例123到127中任一实施例所述的方法，其中通过使包括与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A的相对于SEQ IDNO:28的突变组成的组的一或多个突变的产物的滴度大于通过使包括对与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的第一蛋白质进行编码的核苷酸序列的核酸构建体进行表达产生的，其中所述第一醇氧化酶启动子元件缺乏选自由对应于146C、154T、303C、426A、433T、435G、530A、572T、596C、617C、688C、696T、702C、709G、712G、714G、790G、841T和862A的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的组的任何突变的产物的滴度。

实施例129是根据实施例81到128中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例130是根据实施例81到128中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例131是根据实施例81到128中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：688C、696T、702C、712G和714G。

实施例132是根据实施例81到128中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变688C、696T、702C、712G和714G。

实施例133是一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是根据实施例1到54中任一实施例所述的核酸构建体。

实施例134是根据实施例81到133中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是来自启动子的醇氧化酶启动子元件，所述启动子选自由以下组成的组：AOX1、AOX2、AOD1、MOX、MOD1和MOD2。

实施例135是根据实施例81到134中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是醇氧化酶1(AOX1)启动子元件。

实施例136是根据实施例81到135中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。

实施例137是根据实施例55到135中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少95％的序列同一性。

实施例138是根据实施例81到137中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件具有SEQ ID NO:29。

实施例139是根据实施例81到138中任一实施例所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

实施例140是根据实施例139所述的方法，其中所述酵母细胞是甲基营养型酵母细胞。

实施例141是根据实施例81到140中任一实施例所述的方法，其中所述与所述第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的核苷酸序列对第一蛋白质进行编码。

实施例142是根据实施例141所述的方法，其中所述第一蛋白质对所述细胞是外源性的。

实施例143是根据实施例141到142中任一实施例所述的方法，其中所述第一蛋白质对所述细胞是异源性的。

实施例144是根据实施例141到143中任一实施例所述的方法，其中所述第一蛋白质选自由以下组成的组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子和血红素结合蛋白。

实施例145是根据实施例141到144中任一实施例所述的方法，其中所述第一蛋白质是血红素结合蛋白。

实施例146是根据实施例145所述的方法，其中所述血红素结合蛋白选自由以下组成的组：珠蛋白、细胞色素、细胞色素c氧化酶、木质素酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。

实施例147是根据实施例145所述的方法，其中所述血红素结合蛋白选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白、血绿蛋白、细胞珠蛋白、无脊血红蛋白、黄素血红蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、组织珠蛋白、豆血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白、非共生血红蛋白、原珠蛋白和截短的血红蛋白。

实施例148是根据实施例145所述的方法，其中所述血红素结合蛋白是非共生血红蛋白。

实施例149是根据实施例145所述的方法，其中所述血红素结合蛋白是豆血红蛋白。

实施例150是根据实施例145所述的方法，其中所述血红素结合蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27具有至少90％的序列同一性。

实施例151是根据实施例81到150中任一实施例所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件含有个转录因子的一或多识别序列。

实施例152是根据实施例81到151中任一实施例所述的方法，其进一步包括对第二核酸构建体进行表达，所述第二核酸构建体包括核苷酸序列，其中所述第二核酸构建体的所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件或与第二启动子元件可操作地连接。

实施例153是根据实施例152所述的方法，其中所述第二核酸构建体的所述核苷酸序列与具有与所述第一醇氧化酶启动子元件相同的序列的第二启动子元件可操作地连接。

实施例154是根据实施例152到153中任一实施例所述的方法，其中所述第二核酸构建体的所述核苷酸序列对第二蛋白质进行编码。

实施例155是根据实施例154所述的方法，其中所述第二蛋白质是转录因子。

实施例156是根据实施例155所述的方法，其中对所述第二蛋白质进行编码的所述核苷酸序列与包括所述转录因子的识别序列的第二启动子元件可操作地连接。

实施例157是根据实施例155所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括所述转录因子的识别序列。

实施例158是根据实施例154所述的方法，其中所述第二蛋白质是参与血红素生物合成的蛋白质。

实施例159是根据实施例158所述的方法，其中参与血红素生物合成的所述蛋白质选自由以下组成的组：ALAS、ALAD、PBGD、UPG3S、UPG3D、COPROX、PROTOX和FC。

实施例160根据实施例81到159中任一实施例所述的方法，其中所述方法是在不存在添加的甲醇的情况下执行的。

本公开的材料和方法将在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求书的范围。

实例

实例1

聚合酶链反应

使用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))由基因组DNA或质粒DNA模板中对所关注的基因进行扩增。简而言之，在1-2 U的Phusion DNA聚合酶存在的情况下，将0.6μM的正向引物和反向引物中的每种引物与10-50ng的模板DNA和400μM核苷酸混合物一起温育。反应条件如下：

实例2

通过连接构建质粒

将50-100ng的经限制酶消化的质粒和3X摩尔过量的经PCR扩增的插入物在T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室)存在的情况下一起温育。在16℃下执行连接，持续超过2小时。将2μl的连接反应转化到DH10B电感受态大肠杆菌细胞中。

实例3

转化到大肠杆菌ElectroMax DH10B T1抗噬菌体感受态细胞中

使用设定为1.7kV的MicroPulser(伯乐公司(BioRad))，使用1mm间隙比色皿(伯乐公司，目录号165-2089)通过电穿孔将1.5-2μl的连接混合物(实例2)转化到20μl的ElectroMax DH10B T1抗噬菌体感受态细胞中(英杰公司(Invitrogen)，目录号12033-015)；脉冲后，将1ml SOC(在分解代谢物阻遏的情况下的超最优肉汤)添加到细胞中，并且在37℃下以200rpm振荡对细胞进行培育持续1小时。将10μl的回收混合物铺板在含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(ampicillin)的LB(溶原性肉汤)琼脂平板上。在37℃下过夜对平板进行培育。使用来自马歇雷-纳格尔公司(Macherey-Nagel)的

质粒试剂盒根据制造商的说明将质粒分离并对其进行纯化。

实例4

制备巴斯德毕赤酵母转化感受态细胞

使所选巴斯德毕赤酵母菌株在25ml YPD(酵母提取物-蛋白胨-右旋糖)培养基中生长到指数生长中期(约2OD)。通过以930×g离心15分钟来收集细胞。将细胞团粒重悬在2ml的80％YPD和200mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，pH 6.8的溶液中。添加75μl的1M DTT(二硫苏糖醇)。将经重悬的细胞团粒在30℃下以100rpm混合25分钟。将40ml体积的冰冷无菌水添加到悬浮液中，并且通过以1125×g离心15分钟收集细胞并将细胞置于冰上。将细胞团粒重悬在40ml冰冷水中，并且如前所述来收集细胞以进行两个另外的洗涤步骤。然后将细胞团粒重悬在20ml的冰冷的1M山梨醇中，并且如前所述通过离心来收集细胞团粒。将最终的细胞团粒悬浮在0.3ml冰冷无菌的1M山梨醇中，等分并且在-80℃下冷冻。

实例5

转化到巴斯德毕赤酵母中

使用1mm间隙GenePulser比色皿(伯乐公司)利用设定为1.15kV的GenePulser(伯乐公司)将50-100ng的质粒DNA转化到30μl电感受态巴斯德毕赤酵母细胞中。以1:1比率将1ml的YPD/1M山梨醇添加到细胞中并且进行混合。在30℃下在以100rpm振荡的情况下回收细胞，持续3小时。将100μl的回收混合物铺板在含有适当抗生素的YPD板(一级转化板)上，并且将所转化的细胞的其余部分铺板在具有适当抗生素的第二YPD板上。将板在30℃下培育48小时。将主要转化板划线到具有适当抗生素的另外的YPD板上，并将板在30℃下培育48小时。将单独的克隆贴到具有抗生素的YPD板上，并且使用所述贴片来使菌株在摇瓶中生长以供进一步分析。

实例6

构建AOX1启动子-绿色荧光蛋白报告载体

使用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告蛋白构建了用于监测由AOX1启动子和突变的变体进行的表达的载体。将GFP开放阅读框插入到pGAB载体(参见，例如，美国专利第9,938,327号，所述美国专利通过引用以其整体并入)，其中翻译紧邻着来自巴斯德毕赤酵母的甲醇诱导型醇氧化酶1(AOX1)启动子的下游开始，并且翻译停止信号紧接着来自巴斯德毕赤酵母FDH1基因的转录终止子序列开始。

通过PCR由从DNA2.0公司(加利福尼亚州纽瓦克(Newark,Calif))获得的pJ1214-03c质粒载体使对Dasher GFP变体蛋白进行编码的开放阅读框扩增。由pJ1214-03c用引物MxO0560(GAGGGTCTCGGATGACAGCTTTAACTGAAGGGGCC；SEQ ID NO:30)和MxO0561(GAGGGTCTCGATTATTGGTAAGTGTCGAGATCAACTGCC；SEQ ID NO:31)对Dasher GFP开放阅读框进行扩增，所述引物附有侧接的Eco31I/BsaI限制核酸内切酶识别位点。如实例1中所述的，使用PCR完成扩增。

在37℃下在1×FastDigest缓冲液(赛默飞世尔科学有限公司(ThermoFisherScientific))中用10个单位的FastDigest Eco31I限制核酸内切酶(赛默飞世尔科学有限公司)使经扩增的Dasher GFP PCR产物和pGAB载体消化1小时。在含1％琼脂糖凝胶的1×TBE缓冲液(89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH 8.3)中通过电泳将经Eco31I消化的经扩增的Dasher GFP片段和pGAB载体分离，并且使用SYBR安全DNA凝胶染色剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,Calif))进行可视化。从琼脂糖凝胶上切除期望的DNA片段，并且使用ZYMOCLEAN^TM凝胶DNA回收试剂盒(加利福尼亚州尔湾市齐莫研究公司(Zymo Research,Irvine,Calif))回收DNA。

在紧邻AOX1启动子下游的Eco31I位点处通过连接将含有Dasher GFP开放阅读框的经Eco31I消化的片段引入到pGAB。在16℃下在20μl反应中将含有对Dasher GFP开放阅读框进行编码的72ng的经Eco31I消化的DNA和35ng的经Eco31I消化的pGAB的混合物与400个单位的T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)在1×T4 DNA连接酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM ATP、10mM DTT、在25℃下pH 7.5@)中培育2小时。用2μl的连接反应转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，并且在补充有100μg/μl氨苄青霉素的LSB(李斯特菌专用肉汤)琼脂板上选择抗生素抗性转化体。在37℃下将板培育过夜。使用引物MxO0560和MxO0561通过PCR针对插入物的存在对菌落进行筛选。通过DNA测序确认最终载体的序列。

所得载体pMx0369包含巴斯德毕赤酵母AOX1启动子，随后连续地是Dasher GFP开放阅读框和巴斯德毕赤酵母FDH1终止子。由pMx0369 DNA利用引物MxO0513(GTGCTAGGATCCAACATCCAAAGACG；SEQ ID NO:32)和MxO0514(TTTTTCTAGAACCTTATCAAGATAGCTAGAAATAGAAATGGTTGC；SEQ ID NO:33)使用如实例1所描述的聚合酶链式反应对这些元件进行扩增。引物将BamHI和XbaI限制位点分别引入到经扩增的AOX1启动子-Dasher GFP-FDH1终止子DNA片段的5'端和3'端处。这些限制位点用于将Dasher GFP和其表达所需的序列克隆到pIL75游离型载体中。pIL75载体携带允许在不整合到所转化的细胞的基因组中的情况下维持质粒载体的panARS自主复制序列(利亚奇科(Liachko)和邓纳姆(Dunham),2014,FEMS酵母研究(FEMS Yeast Research),14:364-7)和用于选择具有抗生素G418的转化体的kanMX标志物。在37℃下利用10个单位的BamHI和10个单位的XbaI限制核酸内切酶(新英格兰生物实验室)在1×CutSmart缓冲液(新英格兰生物实验室)中将经扩增的DasherGFP表达DNA片段和pIL75载体DNA两者消化1小时。通过在含1％琼脂糖凝胶的1×TBE缓冲液上进行电泳分离经BamHI-XbaI消化的DNA片段，使用SYBR安全DNA凝胶染色剂进行可视化，并且从琼脂糖凝胶中切除期望的DNA片段，并且使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒回收DNA。

通过连接将含有巴斯德毕赤酵母AOX1启动子、Dasher GFP开放阅读框和巴斯德毕赤酵母FDH1终止子的DNA片段引入到经类似消化的pIL75载体中。在16℃下在20μl反应中将含有48ng的含有用于Dasher GFP的表达的序列的经BamHI-XbaI消化的DNA片段和15ng的经BamHI-XbaI消化的pIL75 DNA的混合物与400个单位的T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室)在1×T4 DNA连接酶反应缓冲液中培育2小时。利用2μl的连接反应转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，并且在补充有100μg/μl氨苄青霉素的LSB琼脂板上选择抗生素抗性转化体。在37℃下将板培育过夜。使用引物MxO0513和MxO0514通过PCR针对插入物的存在对菌落进行筛选。通过DNA测序确认最终载体的序列。含有对Dasher GFP变体进行编码的序列的其表达受AOX1启动子控制的所得游离型载体被命名为pMx0379。

实例7

构建菌株MxY0270

通过转化将受AOX1启动子控制的携带Dasher GFP报告子的pMx0379载体引入到巴斯德毕赤酵母宿主菌株MxY0051中。MxY0051菌株是MutS菌株，但不含有其它修饰。通过在含有抗生素G418的培养基上生长来选择转化体并维持质粒。将板在30℃下培育48小时。将单独的克隆贴到具有G418抗生素的YPD板上，并且在随后的实验中使用所述贴片来接种培养物。

实例8

AOX1启动子的易错诱变

使用pMx0369载体作为用于对AOX1启动子进行易错PCR扩增的模板。如麦卡勒姆(McCullum)等人(2010,分子生物学方法,634:103-9)中所述的执行易错PCR。在1X反应缓冲液(英杰公司)中使用引物MxO0569(TCCTGCAGCCCGGGGGATCCAACATCCAAAGA；SEQ ID NO:34)和MxO0570(CTTCAGTTAAAGCTGTCATCGTTTCGAATAATTAGT；SEQ ID NO:35)在含有1μM的每种引物、50ng的模板DNA、1mM dCTP和dTTP、0.2mM dATP和dGTP、5.5mM MgCl₂和0.5mM MnCl₂以及5U Taq DNA聚合酶的反应中对pAOX1启动子进行扩增。易错扩增的反应条件如下：

在如实例1所述的标准PCR扩增条件下使用引物MxO0571(AACAACTAATTATTCGAAACGATGACAGCTTTAACT；SEQ ID NO:36)和MxO0572(ACCTTTCGTCTTTGGATGTTGGATCCCCCGGG；SEQID NO:37)对不包含pAOX1启动子序列的pMx0379载体进行扩增。

通过在含1％琼脂糖凝胶的1×TBE缓冲液上的进行电泳将通过易错扩增产生的pAOX1启动子和经扩增的pMx0379载体DNA各自分离，并且使用SYBR安全DNA凝胶染色剂进行可视化。从琼脂糖凝胶上切除期望的DNA片段，并且如本文所描述的使用ZYMOCLEAN^TM凝胶DNA回收试剂盒回收DNA。使用Gibson组装反应(新英格兰生物实验室)组装pAOX1启动子序列(600ng)和载体DNA(200ng)。组装反应用于转化如实例3所述的ElectroMax DH10B感受态细胞。在具有氨苄青霉素的LB琼脂板上过夜生长后，将转化体池化在含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的50ml LB液体培养基中，并且在37℃下在以250rpm振荡的情况下生长4小时。长出之后，使用QIAGEN质粒Midi试剂盒(凯杰公司(Qiagen Inc))回收质粒DNA。所得DNA由含有多种突变的pAOX1启动子序列的pMx0379载体组成。

实例9

对pAOX1突变文库进行筛选

通过转化将由驱动GFP报告子的表达的易错PCR产生的pAOX1启动子组成的pAOX1启动子文库引入到菌株MxY0051中。选择转化体并且通过在含有抗生素G418的YPD板上生长来维持所述转化体。在30℃下将板培育72小时，并且使用Li-Cor Odyssey Fc成像系统(内布拉斯加州林肯的Li-Cor生物科学公司(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE))针对荧光对菌落进行筛选。鉴定了在YPD上显示出显著荧光的菌落。将此菌落与作为野生型pAOX1参考的菌株MxY0270一起继代培养到新鲜的YPD板上，并证实了相对于参考显示出增加的GFP表达。此菌株被命名为MxY0279。

实例10

从MxY0279回收突变的质粒

通过将MxY0279菌落重悬在100μl体积的裂解缓冲液(200mM醋酸锂，1％SDS)中并将悬浮液加热到70℃持续5分钟来从所转化的巴斯德毕赤酵母细胞中回收质粒DNA。通过添加300μl的100％乙醇从裂解物中沉淀DNA，然后以15,000x g离心3分钟。用1ml体积的70％乙醇洗涤所回收材料，然后进行离心。将沉淀的DNA溶解在100μl体积的DNA洗脱缓冲液(5mMTris/HCl，pH 8.5)中。使用2μl体积的所回收DNA溶液转化如实例3所述的ElectroMaxDH10B感受态细胞，并且通过铺板在含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB板上来回收细菌转化体。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒将质粒DNA与细菌转化体分离，并且通过使用MxO0569和MxO0570引物对质粒DNA进行测序来确定突变的启动子的序列。含有驱动GFP表达的突变pAOX1启动子的所回收质粒载体被命名为pMx0414。所述序列在如图2所示的SEQID NO:29中示出，其中19个突变位点加双下划线。

实例11

确认MxY0279中的改善的GFP表达起因于pMx0414

如实例3所述的，将所回收pMx0414质粒转化到巴斯德毕赤酵母的MxY0051菌株中。将转化体和MxY0270对照菌株划线到YPD琼脂板上，并且在30℃下培育3天。使用如实例9所述的Li-Cor Odyssey Fc成像系统测量来自这些细胞的荧光。转化体示出在缺乏诱导物甲醇的YPD培养基上由突变pAOX1启动子进行的显著表达，而携带具有由野生型pAOX1启动子驱动的GFP的质粒的MxY0270对照菌株显示出极大减少的荧光或无荧光(图3)。这些结果证实了在原始MxY0279菌株中观察到改善的GFP表达是由于pMx0414质粒中的突变，而不是由于宿主菌株的基因组。

实例12

转化体的摇瓶培养和GFP表达的测量

将如本文所述的携带pMx0379和pMx0414 GFP表达质粒的MxY0270和MxY0279菌株接种到含有抗生素G418的生长培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，补充有1％甘油)中，以维持质粒，并且使其在30℃下在200rpm振荡的情况下生长过夜。第二天，用补充有1％右旋糖、1％甘油、1％甲醇或1％肉汤和1％右旋糖的YP培养基将过夜培养物稀释到0.5-0.7的OD600。所有培养基均含有G418抗生素。

在表达报告蛋白的培养物中使用SpectraMax M2酶标仪和SoftMax Pro 6.1软件(加利福尼亚州圣何塞的分子装置公司(Molecular Devices,San Jose,Calif))在485nm的激发波长和525nm的发射波长下测量GFP荧光。在稀释到相关碳源中之后的48小时测量摇瓶培养物中的荧光。相对于培养物的OD对以相对荧光单位(RFU)计的GFP荧光进行归一化。(参见图4)。

实例13

对一组突变的评估

含有存在于在pAOX1中具有全部19个突变的质粒中的突变的组合启动子文库(启动子命名为MxG0038，参见，例如，SEQ ID NO:29)，其中在MxG0038中突变的位置中的每个位置是野生型核苷酸或突变核苷酸。鉴定到一组来自MxG0038突变体的赋予了改善的表达表型的五个突变。含有突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G的突变AOX1启动子被命名为MxG0220。在图5中对MxG0038和MxG0020的序列的一部分进行了比较。

使用野生型pAOX1启动子、含有全部19个突变的pAOX1启动子(在菌株MxY965中命名为MxG0038的启动子)、含有所选5个突变的pAOX1启动子(命名为MxG0220的启动子)进行的GFP的相对表达在图6中示出。

其它实施例

应理解，虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求书的范围内。

序列表

<110> 非凡食品有限公司(Impossible Foods Inc.)

<120> 用于蛋白质产生的材料和方法

<130> 38767-0193WO1

<150> US 62/835,338

<151> 2019-04-17

<160> 37

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 161

<212> PRT

<213> 绿豆(Vigna radiata)

<400> 1

Met Thr Thr Thr Leu Glu Arg Gly Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu

1 5 10 15

Val Val Lys Ser Trp Asn Val Met Lys Lys Asn Ser Gly Glu Leu Gly

20 25 30

Leu Lys Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys

35 40 45

Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Thr Val Pro Leu Glu Gln Asn Pro

50 55 60

Lys Leu Lys Pro His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Asp Ser

65 70 75 80

Ala Val Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Asn

85 90 95

Leu Lys Lys Leu Gly Ala Thr His Phe Arg Thr Gly Val Ala Asn Glu

100 105 110

His Phe Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala

115 120 125

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Ala Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala

130 135 140

Tyr Asp Gln Leu Val Asp Ala Ile Lys Tyr Glu Met Lys Pro Pro Ser

145 150 155 160

Ser

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 极端嗜酸甲烷氧化细菌(Methylacidiphilum infernorum)

<400> 2

Met Ile Asp Gln Lys Glu Lys Glu Leu Ile Lys Glu Ser Trp Lys Arg

1 5 10 15

Ile Glu Pro Asn Lys Asn Glu Ile Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Asn Leu

20 25 30

Phe Lys Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Leu Phe Gln Asn Pro Ile Ser

35 40 45

Ser Gln Ser Arg Lys Leu Met Gln Val Leu Gly Ile Leu Val Gln Gly

50 55 60

Ile Asp Asn Leu Glu Gly Leu Ile Pro Thr Leu Gln Asp Leu Gly Arg

65 70 75 80

Arg His Lys Gln Tyr Gly Val Val Asp Ser His Tyr Pro Leu Val Gly

85 90 95

Asp Cys Leu Leu Lys Ser Ile Gln Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Phe Thr

100 105 110

Glu Glu Ala Lys Ala Ala Trp Thr Lys Val Tyr Gly Ile Ala Ala Gln

115 120 125

Val Met Thr Ala Glu

130

<210> 3

<211> 139

<212> PRT

<213> 超嗜热菌(Aquifex aeolicus)

<400> 3

Met Leu Ser Glu Glu Thr Ile Arg Val Ile Lys Ser Thr Val Pro Leu

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Thr Glu Ile Thr Ala Arg Met Tyr Glu Leu Leu

20 25 30

Phe Ser Lys Tyr Pro Lys Thr Lys Glu Leu Phe Ala Gly Ala Ser Glu

35 40 45

Glu Gln Pro Lys Lys Leu Ala Asn Ala Ile Ile Ala Tyr Ala Thr Tyr

50 55 60

Ile Asp Arg Leu Glu Glu Leu Asp Asn Ala Ile Ser Thr Ile Ala Arg

65 70 75 80

Ser His Val Arg Arg Asn Val Lys Pro Glu His Tyr Pro Leu Val Lys

85 90 95

Glu Cys Leu Leu Gln Ala Ile Glu Glu Val Leu Asn Pro Gly Glu Glu

100 105 110

Val Leu Lys Ala Trp Glu Glu Ala Tyr Asp Phe Leu Ala Lys Thr Leu

115 120 125

Ile Thr Leu Glu Lys Lys Leu Tyr Ser Gln Pro

130 135

<210> 4

<211> 145

<212> PRT

<213> 橹豆(Glycine max)

<400> 4

Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn

65 70 75 80

Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser

115 120 125

Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala

130 135 140

Phe

145

<210> 5

<211> 162

<212> PRT

<213> 大麦(Hordeum vulgare)

<400> 5

Met Ser Ala Ala Glu Gly Ala Val Val Phe Ser Glu Glu Lys Glu Ala

1 5 10 15

Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Ile Met Lys Lys Asp Ser Ala Asn Leu

20 25 30

Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Arg

35 40 45

Gln Met Phe Pro Phe Leu Arg Asp Ser Asp Val Pro Leu Glu Thr Asn

50 55 60

Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ile Thr Val Arg Glu Thr

85 90 95

Thr Leu Lys Arg Leu Gly Gly Thr His Leu Lys Tyr Gly Val Ala Asp

100 105 110

Gly His Phe Glu Val Thr Arg Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu

115 120 125

Ala Leu Pro Ala Asp Met Trp Gly Pro Glu Met Arg Asn Ala Trp Gly

130 135 140

Glu Ala Tyr Asp Gln Leu Val Ala Ala Ile Lys Gln Glu Met Lys Pro

145 150 155 160

Ala Glu

<210> 6

<211> 1153

<212> PRT

<213> 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)

<400> 6

Met Asp Gly Ala Val Arg Leu Asp Trp Thr Gly Leu Asp Leu Thr Gly

1 5 10 15

His Glu Ile His Asp Gly Val Pro Ile Ala Ser Arg Val Gln Val Met

20 25 30

Val Ser Phe Pro Leu Phe Lys Asp Gln His Ile Ile Met Ser Ser Lys

35 40 45

Glu Ser Pro Ser Arg Lys Ser Ser Thr Ile Gly Gln Ser Thr Arg Asn

50 55 60

Gly Ser Cys Gln Ala Asp Thr Gln Lys Gly Gln Leu Pro Pro Val Gly

65 70 75 80

Glu Lys Pro Lys Pro Val Lys Glu Asn Pro Met Lys Lys Leu Lys Glu

85 90 95

Met Ser Gln Arg Pro Leu Pro Thr Gln His Gly Asp Gly Thr Tyr Pro

100 105 110

Thr Glu Lys Lys Leu Thr Gly Ile Gly Glu Asp Leu Lys His Ile Arg

115 120 125

Gly Tyr Asp Val Lys Thr Leu Leu Ala Met Val Lys Ser Lys Leu Lys

130 135 140

Gly Glu Lys Leu Lys Asp Asp Lys Thr Met Leu Met Glu Arg Val Met

145 150 155 160

Gln Leu Val Ala Arg Leu Pro Thr Glu Ser Lys Lys Arg Ala Glu Leu

165 170 175

Thr Asp Ser Leu Ile Asn Glu Leu Trp Glu Ser Leu Asp His Pro Pro

180 185 190

Leu Asn Tyr Leu Gly Pro Glu His Ser Tyr Arg Thr Pro Asp Gly Ser

195 200 205

Tyr Asn His Pro Phe Asn Pro Gln Leu Gly Ala Ala Gly Ser Arg Tyr

210 215 220

Ala Arg Ser Val Ile Pro Thr Val Thr Pro Pro Gly Ala Leu Pro Asp

225 230 235 240

Pro Gly Leu Ile Phe Asp Ser Ile Met Gly Arg Thr Pro Asn Ser Tyr

245 250 255

Arg Lys His Pro Asn Asn Val Ser Ser Ile Leu Trp Tyr Trp Ala Thr

260 265 270

Ile Ile Ile His Asp Ile Phe Trp Thr Asp Pro Arg Asp Ile Asn Thr

275 280 285

Asn Lys Ser Ser Ser Tyr Leu Asp Leu Ala Pro Leu Tyr Gly Asn Ser

290 295 300

Gln Glu Met Gln Asp Ser Ile Arg Thr Phe Lys Asp Gly Arg Met Lys

305 310 315 320

Pro Asp Cys Tyr Ala Asp Lys Arg Leu Ala Gly Met Pro Pro Gly Val

325 330 335

Ser Val Leu Leu Ile Met Phe Asn Arg Phe His Asn His Val Ala Glu

340 345 350

Asn Leu Ala Leu Ile Asn Glu Gly Gly Arg Phe Asn Lys Pro Ser Asp

355 360 365

Leu Leu Glu Gly Glu Ala Arg Glu Ala Ala Trp Lys Lys Tyr Asp Asn

370 375 380

Asp Leu Phe Gln Val Ala Arg Leu Val Thr Ser Gly Leu Tyr Ile Asn

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Ile Thr Leu Val Asp Tyr Val Arg Asn Ile Val Asn Leu Asn Arg Val

405 410 415

Asp Thr Thr Trp Thr Leu Asp Pro Arg Gln Asp Ala Gly Ala His Val

420 425 430

Gly Thr Ala Asp Gly Ala Glu Arg Gly Thr Gly Asn Ala Val Ser Ala

435 440 445

Glu Phe Asn Leu Cys Tyr Arg Trp His Ser Cys Ile Ser Glu Lys Asp

450 455 460

Ser Lys Phe Val Glu Ala Gln Phe Gln Asn Ile Phe Gly Lys Pro Ala

465 470 475 480

Ser Glu Val Arg Pro Asp Glu Met Trp Lys Gly Phe Ala Lys Met Glu

485 490 495

Gln Asn Thr Pro Ala Asp Pro Gly Gln Arg Thr Phe Gly Gly Phe Lys

500 505 510

Arg Gly Pro Asp Gly Lys Phe Asp Asp Asp Asp Leu Val Arg Cys Ile

515 520 525

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530 535 540

Pro Gln Ala Met Lys Val Val Glu Thr Met Gly Ile Ile Gln Gly Arg

545 550 555 560

Lys Trp Asn Val Ala Gly Leu Asn Glu Phe Arg Lys His Phe His Leu

565 570 575

Lys Pro Tyr Ser Thr Phe Glu Asp Ile Asn Ser Asp Pro Gly Val Ala

580 585 590

Glu Ala Leu Arg Arg Leu Tyr Asp His Pro Asp Asn Val Glu Leu Tyr

595 600 605

Pro Gly Leu Val Ala Glu Glu Asp Lys Gln Pro Met Val Pro Gly Val

610 615 620

Gly Ile Ala Pro Thr Tyr Thr Ile Ser Arg Val Val Leu Ser Asp Ala

625 630 635 640

Val Cys Leu Val Arg Gly Asp Arg Phe Tyr Thr Thr Asp Phe Thr Pro

645 650 655

Arg Asn Leu Thr Asn Trp Gly Tyr Lys Glu Val Asp Tyr Asp Leu Ser

660 665 670

Val Asn His Gly Cys Val Phe Tyr Lys Leu Phe Ile Arg Ala Phe Pro

675 680 685

Asn His Phe Lys Gln Asn Ser Val Tyr Ala His Tyr Pro Met Val Val

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Pro Ser Glu Asn Lys Arg Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Ala Asp Leu

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Phe Asp Phe Glu Ala Pro Lys Tyr Ile Pro Pro Arg Val Asn Ile Thr

725 730 735

Ser Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr Ile Leu Glu Thr Gln Glu Lys Tyr Lys

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Val Thr Trp His Glu Gly Leu Gly Phe Leu Met Gly Glu Gly Gly Leu

755 760 765

Lys Phe Met Leu Ser Gly Asp Asp Pro Leu His Ala Gln Gln Arg Lys

770 775 780

Cys Met Ala Ala Gln Leu Tyr Lys Asp Gly Trp Thr Glu Ala Val Lys

785 790 795 800

Ala Phe Tyr Ala Gly Met Met Glu Glu Leu Leu Val Ser Lys Ser Tyr

805 810 815

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Gly Asn Met Val His Val His Phe Ala Ser Gln Val Phe Gly Leu Pro

835 840 845

Leu Lys Thr Ala Lys Asn Pro Thr Gly Val Phe Thr Glu Gln Glu Met

850 855 860

Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ile Phe Thr Thr Ile Phe Phe Asp Leu Asp

865 870 875 880

Pro Ser Lys Ser Phe Pro Leu Arg Thr Lys Thr Arg Glu Val Cys Gln

885 890 895

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Pro Trp Ser Arg Gly Met Phe Val Gly Lys Pro Ala Lys Asp Glu Pro

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Leu Ser Ile Tyr Gly Lys Thr Met Ile Lys Gly Leu Lys Ala His Gly

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Ala Met Val Pro Asn Gln Ala Gln Val Phe Ala Gln Ala Val Asp Tyr

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Ala Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Thr Asp Ala Leu Leu Leu Gly Tyr

995 1000 1005

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1010 1015 1020

Glu Ala Ala Val Asp Asp Val Val Lys Glu Asp Asn Gly Arg Gln

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Ala Ala Arg Asp Pro Lys His Phe Pro Asp Pro Glu Val Val Asn

1055 1060 1065

Pro Arg Arg Pro Ala Lys Lys Tyr Ile His Tyr Gly Val Gly Pro

1070 1075 1080

His Ala Cys Leu Gly Arg Asp Ala Ser Gln Ile Ala Ile Thr Glu

1085 1090 1095

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1100 1105 1110

Gly Pro Gln Gly Glu Leu Lys Lys Val Pro Arg Pro Gly Gly Phe

1115 1120 1125

Tyr Val Tyr Met Arg Glu Asp Trp Gly Gly Leu Phe Pro Phe Pro

1130 1135 1140

Val Thr Met Arg Val Met Trp Asp Asp Glu

1145 1150

<210> 7

<211> 530

<212> PRT

<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

<400> 7

Met Lys Gly Ser Ala Thr Leu Ala Phe Ala Leu Val Gln Phe Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gln Leu Val Trp Pro Ser Lys Trp Asp Glu Val Glu Asp Leu

20 25 30

Leu Tyr Met Gln Gly Gly Phe Asn Lys Arg Gly Phe Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Cys Glu Phe Gly Ser Asn Val Pro Gly Thr Gln Asn Thr Ala

50 55 60

Glu Trp Leu Arg Thr Ala Phe His Asp Ala Ile Thr His Asp Ala Lys

65 70 75 80

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Gly Phe His Asn Pro Arg Ala Thr Ala Ser Asp Leu Thr Ala Leu Gly

115 120 125

Thr Val Leu Ala Val Gly Ala Cys Asn Gly Pro Arg Ile Pro Phe Arg

130 135 140

Ala Gly Arg Ile Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Pro Ala Gly Val Pro Glu

145 150 155 160

Pro Ser Thr Asn Leu Lys Asp Thr Phe Ala Ala Phe Thr Lys Ala Gly

165 170 175

Phe Thr Lys Glu Glu Met Thr Ala Met Val Ala Cys Gly His Ala Ile

180 185 190

Gly Gly Val His Ser Val Asp Phe Pro Glu Ile Val Gly Ile Lys Ala

195 200 205

Asp Pro Asn Asn Asp Thr Asn Val Pro Phe Gln Lys Asp Val Ser Ser

210 215 220

Phe His Asn Gly Ile Val Thr Glu Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Lys Asn

225 230 235 240

Pro Leu Val Ala Ser Lys Asn Ala Thr Phe His Ser Asp Lys Arg Ile

245 250 255

Phe Asp Asn Asp Lys Ala Thr Met Lys Lys Leu Ser Thr Lys Ala Gly

260 265 270

Phe Asn Ser Met Cys Ala Asp Ile Leu Thr Arg Met Ile Asp Thr Val

275 280 285

Pro Lys Ser Val Gln Leu Thr Pro Val Leu Glu Ala Tyr Asp Val Arg

290 295 300

Pro Tyr Ile Thr Glu Leu Ser Leu Asn Asn Lys Asn Lys Ile His Phe

305 310 315 320

Thr Gly Ser Val Arg Val Arg Ile Thr Asn Asn Ile Arg Asp Asn Asn

325 330 335

Asp Leu Ala Ile Asn Leu Ile Tyr Val Gly Arg Asp Gly Lys Lys Val

340 345 350

Thr Val Pro Thr Gln Gln Val Thr Phe Gln Gly Gly Thr Ser Phe Gly

355 360 365

Ala Gly Glu Val Phe Ala Asn Phe Glu Phe Asp Thr Thr Met Asp Ala

370 375 380

Lys Asn Gly Ile Thr Lys Phe Phe Ile Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr

385 390 395 400

Lys Ala Thr Val Thr His Asp Asn Gln Lys Thr Gly Gly Tyr Lys Val

405 410 415

Asp Asp Thr Val Leu Tyr Gln Leu Gln Gln Ser Cys Ala Val Leu Glu

420 425 430

Lys Leu Pro Asn Ala Pro Leu Val Val Thr Ala Met Val Arg Asp Ala

435 440 445

Arg Ala Lys Asp Ala Leu Thr Leu Arg Val Ala His Lys Lys Pro Val

450 455 460

Lys Gly Ser Ile Val Pro Arg Phe Gln Thr Ala Ile Thr Asn Phe Lys

465 470 475 480

Ala Thr Gly Lys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Lys Thr

485 490 495

Met Phe Glu Glu Gln Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Val Leu Gly Gly Ser

500 505 510

Pro Ala Ser Gly Val Gln Phe Leu Thr Ser Gln Ala Met Pro Ser Gln

515 520 525

Cys Ser

530

<210> 8

<211> 358

<212> PRT

<213> 禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)

<400> 8

Met Ala Ser Ala Thr Arg Gln Phe Ala Arg Ala Ala Thr Arg Ala Thr

1 5 10 15

Arg Asn Gly Phe Ala Ile Ala Pro Arg Gln Val Ile Arg Gln Gln Gly

20 25 30

Arg Arg Tyr Tyr Ser Ser Glu Pro Ala Gln Lys Ser Ser Ser Ala Trp

35 40 45

Ile Trp Leu Thr Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Phe

50 55 60

Tyr Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Lys Val Phe Asn Pro Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Tyr Gln Lys Val Tyr Asn Glu Ile Ala Ala Arg Leu Glu

85 90 95

Glu Lys Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Pro Val Leu Val Arg

100 105 110

Leu Ala Trp His Ala Ser Gly Thr Tyr Asp Lys Glu Thr Gly Thr Gly

115 120 125

Gly Ser Asn Gly Ala Thr Met Arg Phe Ala Pro Glu Ser Asp His Gly

130 135 140

Ala Asn Ala Gly Leu Ala Ala Ala Arg Asp Phe Leu Gln Pro Val Lys

145 150 155 160

Glu Lys Phe Pro Trp Ile Thr Tyr Ser Asp Leu Trp Ile Leu Ala Gly

165 170 175

Val Cys Ala Ile Gln Glu Met Leu Gly Pro Ala Ile Pro Tyr Arg Pro

180 185 190

Gly Arg Ser Asp Arg Asp Val Ser Gly Cys Thr Pro Asp Gly Arg Leu

195 200 205

Pro Asp Ala Ser Lys Arg Gln Asp His Leu Arg Gly Ile Phe Gly Arg

210 215 220

Met Gly Phe Asn Asp Gln Glu Ile Val Ala Leu Ser Gly Ala His Ala

225 230 235 240

Leu Gly Arg Cys His Thr Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Pro Trp Thr

245 250 255

Phe Ser Pro Thr Val Leu Thr Asn Asp Tyr Phe Arg Leu Leu Val Glu

260 265 270

Glu Lys Trp Gln Trp Lys Lys Trp Asn Gly Pro Ala Gln Tyr Glu Asp

275 280 285

Lys Ser Thr Lys Ser Leu Met Met Leu Pro Ser Asp Ile Ala Leu Ile

290 295 300

Glu Asp Lys Lys Phe Lys Pro Trp Val Glu Lys Tyr Ala Lys Asp Asn

305 310 315 320

Asp Ala Phe Phe Lys Asp Phe Ser Asn Val Val Leu Arg Leu Phe Glu

325 330 335

Leu Gly Val Pro Phe Ala Gln Gly Thr Glu Asn Gln Arg Trp Thr Phe

340 345 350

Lys Pro Thr His Gln Glu

355

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 衣滴虫(Chlamydomonas eugametos)

<400> 9

Met Ser Leu Phe Ala Lys Leu Gly Gly Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asp Lys Phe Tyr Asn Lys Ile Val Ala Asp Pro Thr Val Ser Thr

20 25 30

Tyr Phe Ser Asn Thr Asp Met Lys Val Gln Arg Ser Lys Gln Phe Ala

35 40 45

Phe Leu Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ser Glu Trp Lys Gly Lys Asp

50 55 60

Met Arg Thr Ala His Lys Asp Leu Val Pro His Leu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Phe Gln Ala Val Ala Arg His Leu Ser Asp Thr Leu Thr Glu Leu Gly

85 90 95

Val Pro Pro Glu Asp Ile Thr Asp Ala Met Ala Val Val Ala Ser Thr

100 105 110

Arg Thr Glu Val Leu Asn Met Pro Gln Gln

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)

<400> 10

Met Asn Lys Pro Gln Thr Ile Tyr Glu Lys Leu Gly Gly Glu Asn Ala

1 5 10 15

Met Lys Ala Ala Val Pro Leu Phe Tyr Lys Lys Val Leu Ala Asp Glu

20 25 30

Arg Val Lys His Phe Phe Lys Asn Thr Asp Met Asp His Gln Thr Lys

35 40 45

Gln Gln Thr Asp Phe Leu Thr Met Leu Leu Gly Gly Pro Asn His Tyr

50 55 60

Lys Gly Lys Asn Met Thr Glu Ala His Lys Gly Met Asn Leu Gln Asn

65 70 75 80

Leu His Phe Asp Ala Ile Ile Glu Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Glu

85 90 95

Leu Gly Val Thr Asp Ala Val Ile Asn Glu Ala Ala Lys Val Ile Glu

100 105 110

His Thr Arg Lys Asp Met Leu Gly Lys

115 120

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 尾草履虫(Paramecium caudatum)

<400> 11

Met Ser Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gly Gln Ala Ala Val Gln Ala Val

1 5 10 15

Thr Ala Gln Phe Tyr Ala Asn Ile Gln Ala Asp Ala Thr Val Ala Thr

20 25 30

Phe Phe Asn Gly Ile Asp Met Pro Asn Gln Thr Asn Lys Thr Ala Ala

35 40 45

Phe Leu Cys Ala Ala Leu Gly Gly Pro Asn Ala Trp Thr Gly Arg Asn

50 55 60

Leu Lys Glu Val His Ala Asn Met Gly Val Ser Asn Ala Gln Phe Thr

65 70 75 80

Thr Val Ile Gly His Leu Arg Ser Ala Leu Thr Gly Ala Gly Val Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Val Glu Gln Thr Val Ala Val Ala Glu Thr Val Arg Gly

100 105 110

Asp Val Val Thr Val

115

<210> 12

<211> 147

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 12

Met Pro Leu Thr Pro Glu Gln Ile Lys Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro

1 5 10 15

Val Leu Gln Glu Tyr Gly Thr Lys Ile Thr Thr Ala Phe Tyr Met Asn

20 25 30

Met Ser Thr Val His Pro Glu Leu Asn Ala Val Phe Asn Thr Ala Asn

35 40 45

Gln Val Lys Gly His Gln Ala Arg Ala Leu Ala Gly Ala Leu Phe Ala

50 55 60

Tyr Ala Ser His Ile Asp Asp Leu Gly Ala Leu Gly Pro Ala Val Glu

65 70 75 80

Leu Ile Cys Asn Lys His Ala Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Asp Glu Tyr

85 90 95

Lys Ile Val Gly Lys Tyr Leu Leu Glu Ala Met Lys Glu Val Leu Gly

100 105 110

Asp Ala Cys Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Ala Ala Tyr Trp

115 120 125

Ala Leu Ala Asp Ile Met Ile Asn Arg Glu Ala Ala Leu Tyr Lys Gln

130 135 140

Ser Gln Gly

145

<210> 13

<211> 165

<212> PRT

<213> 玉蜀黍(Zea mays)

<400> 13

Met Ala Leu Ala Glu Ala Asp Asp Gly Ala Val Val Phe Gly Glu Glu

1 5 10 15

Gln Glu Ala Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Val Met Lys Lys Asp Ala

20 25 30

Ala Asn Leu Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Val Phe Glu Ile Ala Pro

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Asp Val Pro Leu

50 55 60

Glu Lys Asn Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Met Ser Val Phe Val Met

65 70 75 80

Thr Cys Glu Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val

85 90 95

Arg Glu Thr Thr Leu Lys Arg Leu Gly Ala Thr His Leu Arg Tyr Gly

100 105 110

Val Ala Asp Gly His Phe Glu Val Thr Gly Phe Ala Leu Leu Glu Thr

115 120 125

Ile Lys Glu Ala Leu Pro Ala Asp Met Trp Ser Leu Glu Met Lys Lys

130 135 140

Ala Trp Ala Glu Ala Tyr Ser Gln Leu Val Ala Ala Ile Lys Arg Glu

145 150 155 160

Met Lys Pro Asp Ala

165

<210> 14

<211> 169

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 14

Met Ala Leu Val Glu Gly Asn Asn Gly Val Ser Gly Gly Ala Val Ser

1 5 10 15

Phe Ser Glu Glu Gln Glu Ala Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Ile Met

20 25 30

Lys Lys Asp Ser Ala Asn Ile Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Ile Phe

35 40 45

Glu Val Ala Pro Ser Ala Ser Gln Met Phe Ser Phe Leu Arg Asn Ser

50 55 60

Asp Val Pro Leu Glu Lys Asn Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Met Ser

65 70 75 80

Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly

85 90 95

Lys Val Thr Val Arg Asp Thr Thr Leu Lys Arg Leu Gly Ala Thr His

100 105 110

Phe Lys Tyr Gly Val Gly Asp Ala His Phe Glu Val Thr Arg Phe Ala

115 120 125

Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala Val Pro Val Asp Met Trp Ser Pro

130 135 140

Ala Met Lys Ser Ala Trp Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Leu Val Ala Ala

145 150 155 160

Ile Lys Gln Glu Met Lys Pro Ala Glu

165

<210> 15

<211> 160

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu

1 5 10 15

Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly

20 25 30

Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys

35 40 45

Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro

50 55 60

Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser

65 70 75 80

Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr

85 90 95

Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu

100 105 110

His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala

115 120 125

Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala

130 135 140

Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn

145 150 155 160

<210> 16

<211> 147

<212> PRT

<213> 豌豆(Pisum sativum)

<400> 16

Met Gly Phe Thr Asp Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Ser Ser Trp Glu

1 5 10 15

Ser Phe Lys Gln Asn Leu Ser Gly Asn Ser Ile Leu Phe Tyr Thr Ile

20 25 30

Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser Phe Leu Lys

35 40 45

Asp Thr Ala Gly Val Glu Asp Ser Pro Lys Leu Gln Ala His Ala Glu

50 55 60

Gln Val Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Val Val Leu Gly Asn Ala Thr Leu Gly Ala Ile His Val Gln

85 90 95

Arg Gly Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu

100 105 110

Gln Thr Ile Lys Lys Ala Ser Gly Asn Asn Trp Ser Glu Glu Leu Asn

115 120 125

Thr Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys

130 135 140

Ala Met Thr

145

<210> 17

<211> 145

<212> PRT

<213> 豇豆(Vigna unguiculata)

<400> 17

Met Val Ala Phe Ser Asp Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Lys Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Thr Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asn Leu Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Ala Asn Gly Val Asp Ala Thr Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Ala Ser

65 70 75 80

Gly Gly Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ala Val His Ser Gln Lys

85 90 95

Ala Val Asn Asp Ala Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Val Lys

100 105 110

Thr Leu Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Gly Thr

115 120 125

Ala Val Glu Leu Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala

130 135 140

Tyr

145

<210> 18

<211> 154

<212> PRT

<213> 家牛(Bos taurus)

<400> 18

Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg

20 25 30

Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys

35 40 45

His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys

50 55 60

His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys

65 70 75 80

Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn

85 90 95

Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile

100 105 110

Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala

115 120 125

Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala

130 135 140

Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly

145 150

<210> 19

<211> 154

<212> PRT

<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 19

Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg

20 25 30

Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys

35 40 45

His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys

50 55 60

His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys

65 70 75 80

Gly His His Glu Ala Glu Leu Thr Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr

85 90 95

Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Ala Ile

100 105 110

Ile Gln Val Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala

130 135 140

Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly

145 150

<210> 20

<211> 154

<212> PRT

<213> 家马(Equus caballus)

<400> 20

Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Gln Val Leu Asn Val Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg

20 25 30

Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys

35 40 45

His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys

50 55 60

His Gly Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys

65 70 75 80

Gly His His Glu Ala Glu Leu Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr

85 90 95

Lys His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile

100 105 110

Ile His Val Leu His Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Ala Met Thr Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala

130 135 140

Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly

145 150

<210> 21

<211> 152

<212> PRT

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 21

Met Ser Ser Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu Val Val Lys Ser Trp

1 5 10 15

Asp Ser Met Lys Lys Asn Ala Gly Glu Trp Gly Leu Lys Leu Phe Leu

20 25 30

Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Lys Lys Leu Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Lys Asp Ser Asn Val Pro Leu Glu Gln Asn Ala Lys Leu Lys Pro His

50 55 60

Ser Lys Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ala Ala Val Gln Leu Arg

65 70 75 80

Lys Ala Gly Lys Val Val Val Arg Asp Ser Thr Leu Lys Lys Leu Gly

85 90 95

Ala Thr His Phe Lys Tyr Gly Val Ala Asp Glu His Phe Glu Val Thr

100 105 110

Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala Val Pro Glu Met Trp

115 120 125

Ser Val Asp Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala Phe Asp Gln Leu Val

130 135 140

Asn Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys

145 150

<210> 22

<211> 132

<212> PRT

<213> 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 22

Met Gly Gln Ser Phe Asn Ala Pro Tyr Glu Ala Ile Gly Glu Glu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Gln Leu Val Asp Thr Phe Tyr Glu Arg Val Ala Ser His Pro

20 25 30

Leu Leu Lys Pro Ile Phe Pro Ser Asp Leu Thr Glu Thr Ala Arg Lys

35 40 45

Gln Lys Gln Phe Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Gly Pro Pro Leu Tyr Thr

50 55 60

Glu Glu His Gly His Pro Met Leu Arg Ala Arg His Leu Pro Phe Pro

65 70 75 80

Ile Thr Asn Glu Arg Ala Asp Ala Trp Leu Ser Cys Met Lys Asp Ala

85 90 95

Met Asp His Val Gly Leu Glu Gly Glu Ile Arg Glu Phe Leu Phe Gly

100 105 110

Arg Leu Glu Leu Thr Ala Arg His Met Val Asn Gln Thr Glu Ala Glu

115 120 125

Asp Arg Ser Ser

130

<210> 23

<211> 131

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 23

Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu Thr

1 5 10 15

Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp Asp

20 25 30

Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu Gln

35 40 45

Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp Tyr

50 55 60

Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn Tyr

65 70 75 80

Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser Asn

85 90 95

Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile Trp

100 105 110

Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro Asp

115 120 125

Pro His Ala

130

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)

<400> 24

Met Ser Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Gly Thr Thr Ala Val Asp Leu

1 5 10 15

Ala Val Asp Lys Phe Tyr Glu Arg Val Leu Gln Asp Asp Arg Ile Lys

20 25 30

His Phe Phe Ala Asp Val Asp Met Ala Lys Gln Arg Ala His Gln Lys

35 40 45

Ala Phe Leu Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Thr Asp Lys Tyr Asp Gly Arg

50 55 60

Tyr Met Arg Glu Ala His Lys Glu Leu Val Glu Asn His Gly Leu Asn

65 70 75 80

Gly Glu His Phe Asp Ala Val Ala Glu Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys

85 90 95

Glu Met Gly Val Pro Glu Asp Leu Ile Ala Glu Val Ala Ala Val Ala

100 105 110

Gly Ala Pro Ala His Lys Arg Asp Val Leu Asn Gln

115 120

<210> 25

<211> 183

<212> PRT

<213> 聚球藻(Synechococcus sp.)

<400> 25

Met Asp Val Ala Leu Leu Glu Lys Ser Phe Glu Gln Ile Ser Pro Arg

1 5 10 15

Ala Ile Glu Phe Ser Ala Ser Phe Tyr Gln Asn Leu Phe His His His

20 25 30

Pro Glu Leu Lys Pro Leu Phe Ala Glu Thr Ser Gln Thr Ile Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Leu Ile Phe Ser Leu Ala Ala Ile Ile Glu Asn Leu Arg Asn

50 55 60

Pro Asp Ile Leu Gln Pro Ala Leu Lys Ser Leu Gly Ala Arg His Ala

65 70 75 80

Glu Val Gly Thr Ile Lys Ser His Tyr Pro Leu Val Gly Gln Ala Leu

85 90 95

Ile Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Leu Ala Ala Asp Trp Thr Glu Gln Leu

100 105 110

Ala Thr Ala Trp Val Glu Ala Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Met Ile

115 120 125

Glu Gly Ala Asp Asn Pro Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Glu Leu Thr Phe

130 135 140

Tyr Glu Trp Leu Asp Leu Tyr Gly Glu Glu Ser Pro Lys Val Arg Asn

145 150 155 160

Ala Ile Ala Thr Leu Thr His Phe His Tyr Gly Glu Asp Pro Gln Asp

165 170 175

Val Gln Arg Asp Ser Arg Gly

180

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 地木耳(Nostoc commune)

<400> 26

Met Ser Thr Leu Tyr Asp Asn Ile Gly Gly Gln Pro Ala Ile Glu Gln

1 5 10 15

Val Val Asp Glu Leu His Lys Arg Ile Ala Thr Asp Ser Leu Leu Ala

20 25 30

Pro Val Phe Ala Gly Thr Asp Met Val Lys Gln Arg Asn His Leu Val

35 40 45

Ala Phe Leu Ala Gln Ile Phe Glu Gly Pro Lys Gln Tyr Gly Gly Arg

50 55 60

Pro Met Asp Lys Thr His Ala Gly Leu Asn Leu Gln Gln Pro His Phe

65 70 75 80

Asp Ala Ile Ala Lys His Leu Gly Glu Arg Met Ala Val Arg Gly Val

85 90 95

Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Ala Leu Asp Arg Val Thr Asn Met Lys

100 105 110

Gly Ala Ile Leu Asn Lys

115

<210> 27

<211> 136

<212> PRT

<213> 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 27

Met Arg Glu Lys Ile His Ser Pro Tyr Glu Leu Leu Gly Gly Glu His

1 5 10 15

Thr Ile Ser Lys Leu Val Asp Ala Phe Tyr Thr Arg Val Gly Gln His

20 25 30

Pro Glu Leu Ala Pro Ile Phe Pro Asp Asn Leu Thr Glu Thr Ala Arg

35 40 45

Lys Gln Lys Gln Phe Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Gly Pro Ser Leu Tyr

50 55 60

Thr Glu Glu His Gly His Pro Met Leu Arg Ala Arg His Leu Pro Phe

65 70 75 80

Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ala Lys Ala Trp Leu Thr Cys Met His Glu

85 90 95

Ala Met Asp Glu Ile Asn Leu Glu Gly Pro Glu Arg Asp Glu Leu Tyr

100 105 110

His Arg Leu Ile Leu Thr Ala Gln His Met Ile Asn Ser Pro Glu Gln

115 120 125

Thr Asp Glu Lys Gly Phe Ser His

130 135

<210> 28

<211> 933

<212> DNA

<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)

<400> 28

aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac ctttttgcca tccgacatcc acaggtccat 60

tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga ggggatacac tagcagcaga ccgttgcaaa 120

cgcaggacct ccactcctct tctcctcaac acccactttt gccatcgaaa aaccagccca 180

gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt ccaattcctt ctattaggct actaacacca 240

tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc cctggcgagg ttcatgtttg tttatttccg 300

aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt tctgagtgtg 360

gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg 420

gaacctaata tgacaaaagc gtgatctcat ccaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa 480

tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact tccaaaagtc ggcataccgt ttgtcttgtt 540

tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa tctcattaat gcttagcgca gtctctctat 600

cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga aacgcaaatg gggaaacacc cgctttttgg 660

atgattatgc attgtctcca cattgtatgc ttccaagatt ctggtgggaa tactgctgat 720

agcctaacgt tcatgatcaa aatttaactg ttctaacccc tacttgacag caatatataa 780

acagaaggaa gctgccctgt cttaaacctt tttttttatc atcattatta gcttactttc 840

ataattgcga ctggttccaa ttgacaagct tttgatttta acgactttta acgacaactt 900

gagaagatca aaaaacaact aattattcga aac 933

<210> 29

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变的序列

<400> 29

aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac ctttttgcca tccgacatcc acaggtccat 60

tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga ggggatacac tagcagcaga ccgttgcaaa 120

cgcaggacct ccactcctct tctccccaac acctactttt gccatcgaaa aaccagccca 180

gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt ccaattcctt ctattaggct actaacacca 240

tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc cctggcgagg ttcatgtttg tttatttccg 300

aacgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt tctgagtgtg 360

gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg 420

gaaccaaata tgtcgaaagc gtgatctcat ccaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa 480

tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact tccaaaagtc ggcataccga ttgtcttgtt 540

tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa tttcattaat gcttagcgca gtctccctat 600

cgcttctgaa ccccggcgca cctgtgccga aacgcaaatg gggaaacacc cgctttttgg 660

atgattatgc attgtctcca cattgtacgc ttccatgatt ccggtgggga tgcggctgat 720

agcctaacgt tcatgatcaa aatttaactg ttctaacccc tacttgacag caatatataa 780

acagaaggag gctgccctgt cttaaacctt tttttttatc atcattatta gcttactttc 840

ttaattgcga ctggttccaa tagacaagct tttgatttta acgactttta acgacaactt 900

gagaagatca aaaaacaact aattattcga aac 933

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 30

gagggtctcg gatgacagct ttaactgaag gggcc 35

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 31

gagggtctcg attattggta agtgtcgaga tcaactgcc 39

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 32

gtgctaggat ccaacatcca aagacg 26

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 33

tttttctaga accttatcaa gatagctaga aatagaaatg gttgc 45

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 34

tcctgcagcc cgggggatcc aacatccaaa ga 32

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 35

cttcagttaa agctgtcatc gtttcgaata attagt 36

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 36

aacaactaat tattcgaaac gatgacagct ttaact 36

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 37

acctttcgtc tttggatgtt ggatcccccg gg 32

Claims

1.一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于核苷酸位置668-734中的任何核苷酸位置的一或多个核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变。

2.一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的群组的核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的群组的核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。

4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于对应于以下的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的突变：T688、A696、T702、A712和T714。

5.一种核酸构建体，其包括第一醇氧化酶启动子元件，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的群组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

7.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

8.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

9.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

10.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是醇氧化酶1(AOX1)启动子元件。

12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。

13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的核酸构建体，其进一步包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与所述第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接。

14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中所述核苷酸序列对第一蛋白质进行编码。

15.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质选自由以下组成的群组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子、细胞因子抑制剂和血红素结合蛋白。

16.根据权利要求13到14中任一权利要求所述的核酸构建体，其中所述第一蛋白质是血红素结合蛋白。

17.根据权利要求16所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白是豆血红蛋白。

18.根据权利要求17所述的核酸构建体，其中所述血红素结合蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27中的任一个的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

19.一种细胞，其包括第一核酸构建体，其中所述第一核酸构建体是根据权利要求1到18中任一权利要求所述的核酸构建体。

20.根据权利要求19所述的细胞，其进一步包括第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件或与第二启动子元件可操作地连接。

21.一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

22.一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的群组的核苷酸位置处的相对于SEQ ID NO:28的一或多个突变：T146、C154、T303、T426、A433、A435、T530、C572、T596、T617、T688、A696、T702、A709、A712、T714、A790、A841和T862。

23.根据权利要求21到22中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含位于选自由对应于以下的核苷酸位置组成的群组的核苷酸位置处的相对于SEQID NO:28的一或多个突变：T688、A696、T702、A712和T714。

24.一种在细胞中产生产物的方法，所述方法包括：

对核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列与第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包含选自由对应于以下的相对于SEQ ID NO:28的突变组成的群组的一或多个突变：T146C、C154T、T303C、T426A、A433T、A435G、T530A、C572T、T596C、T617C、T688C、A696T、T702C、A709G、A712G、T714G、A790G、A841T和T862A。

25.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的两个或两个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

26.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的三个或三个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

27.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括选自由以下组成的群组的相对于SEQ ID NO:28的四个或四个以上突变：T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

28.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件包括相对于SEQ ID NO:28的突变T688C、A696T、T702C、A712G和T714G。

29.根据权利要求21到28中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件是醇氧化酶1(AOX1)启动子元件。

30.根据权利要求21到29中任一权利要求所述的方法，其中所述第一醇氧化酶启动子元件与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性。

31.根据权利要求21到30中任一权利要求所述的方法，其中与所述第一醇氧化酶启动子元件可操作地连接的所述核苷酸序列对第一蛋白质进行编码。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一蛋白质选自由以下组成的群组：抗体或其片段、酶、调节蛋白、肽激素、凝血蛋白、细胞因子和血红素结合蛋白。

33.根据权利要求31到32中任一权利要求所述的方法，其中所述第一蛋白质是血红素结合蛋白。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述血红素结合蛋白是豆血红蛋白。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述血红素结合蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-27中的任一个的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

36.根据权利要求21到35中任一权利要求所述的方法，其中所述方法是在不存在添加的甲醇的情况下执行的。