JP7308160B2 - メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本開示は、メチロトローフ酵母（methylotrophic yeast）を遺伝子操作するための、Ｄ
ＮＡ構築物およびそのようなＤＮＡ構築物を使用する方法に一般的に関する。
本開示は、メチロトローフ酵母（methylotrophic yeast）を遺伝子操作するための、Ｄ
ＮＡ構築物およびそのようなＤＮＡ構築物を使用する方法に一般的に関する。
背景
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのメチロトローフ酵母は、組換えタンパ
ク質を発現するために一般的に使用される。メチロトローフ酵母中で１種または複数のポ
リペプチドを効率的に発現するために使用することができる構築物が、本明細書で提供さ
れる。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのメチロトローフ酵母は、組換えタンパ
ク質を発現するために一般的に使用される。メチロトローフ酵母中で１種または複数のポ
リペプチドを効率的に発現するために使用することができる構築物が、本明細書で提供さ
れる。
要旨
本開示は、１種または複数のタンパク質の組換え産生を有意に改善するＡＯＸ１プロモ
ーターからやはり発現される導入遺伝子の発現を増大させるために、ＡＯＸ１プロモータ
ーから転写活性化因子Ｍｘｒ１を過発現するＰ．パストリス（P. pastoris）株の使用を
記載する。それに加えて、ＡＯＸ１プロモーターからのＭｘｒ１の発現は、抑制炭素源が
消費し尽くされたときに、常態では真正の誘導物質であるメタノールの不在下で、ＡＯＸ
１プロモーターから他の導入遺伝子を発現することを可能にする正のフィードバックルー
プを創り出す。Ｍｘｒ１の発現は、産生されるタンパク質の量における有意の増大をもた
らす。
本開示は、１種または複数のタンパク質の組換え産生を有意に改善するＡＯＸ１プロモ
ーターからやはり発現される導入遺伝子の発現を増大させるために、ＡＯＸ１プロモータ
ーから転写活性化因子Ｍｘｒ１を過発現するＰ．パストリス（P. pastoris）株の使用を
記載する。それに加えて、ＡＯＸ１プロモーターからのＭｘｒ１の発現は、抑制炭素源が
消費し尽くされたときに、常態では真正の誘導物質であるメタノールの不在下で、ＡＯＸ
１プロモーターから他の導入遺伝子を発現することを可能にする正のフィードバックルー
プを創り出す。Ｍｘｒ１の発現は、産生されるタンパク質の量における有意の増大をもた
らす。
一態様において、組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞が提供される。組換え
核酸分子は、典型的には、少なくとも１つのメタノール誘導性プロモーター要素（エレメ
ント）と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む。代表的メ
チロトローフ酵母は、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（
Pichia）またはトルロプシス属（Toruplosis）であり得る。代表的メチロトローフ酵母は
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
核酸分子は、典型的には、少なくとも１つのメタノール誘導性プロモーター要素（エレメ
ント）と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む。代表的メ
チロトローフ酵母は、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（
Pichia）またはトルロプシス属（Toruplosis）であり得る。代表的メチロトローフ酵母は
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
幾つかの実施形態において、組換え核酸分子は、メチロトローフ酵母細胞のゲノム中に
安定に組み込まれる。幾つかの実施形態において、組換え核酸分子は、複製コンピテント
プラスミド（replication-competent plasmid）から染色体外で発現される（extrachromo
somally expressed）。
安定に組み込まれる。幾つかの実施形態において、組換え核酸分子は、複製コンピテント
プラスミド（replication-competent plasmid）から染色体外で発現される（extrachromo
somally expressed）。
幾つかの実施形態において、転写活性化因子をコードする外因性核酸は、ピキア・パス
トリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula
polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からの
Ｔｒｍ１配列、およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を
含む。転写活性化因子をコードする代表的核酸はＤＱ３９５１２４に示される。代表的転
写活性化因子はＡＢＤ５７３６５に示されるアミノ酸配列を有する。
トリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula
polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からの
Ｔｒｍ１配列、およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を
含む。転写活性化因子をコードする代表的核酸はＤＱ３９５１２４に示される。代表的転
写活性化因子はＡＢＤ５７３６５に示されるアミノ酸配列を有する。
幾つかの実施形態において、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素は、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）
プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモー
ター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモータ
ー要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パ
ストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、またはピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素である。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）
プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモー
ター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモータ
ー要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パ
ストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、またはピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素である。
幾つかの実施形態において、メチロトローフ酵母細胞は、少なくとも１種のメタノール
誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１
種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の異
種核酸が、ヘムなどの鉄共同因子（iron-cofactor）（例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬ
Ａデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（porphogilinogen）、ＵＰＧＩ
ＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシ
ダーゼ、および／またはフェロキラターゼ）の生合成に関与する１種または複数のポリペ
プチドをコードする。幾つかの実施形態において、鉄共同因子の生合成に関与する１種ま
たは複数のポリペプチドは、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と連結
している。
誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１
種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の異
種核酸が、ヘムなどの鉄共同因子（iron-cofactor）（例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬ
Ａデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（porphogilinogen）、ＵＰＧＩ
ＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシ
ダーゼ、および／またはフェロキラターゼ）の生合成に関与する１種または複数のポリペ
プチドをコードする。幾つかの実施形態において、鉄共同因子の生合成に関与する１種ま
たは複数のポリペプチドは、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と連結
している。
別の態様において、異種ポリペプチドを細胞で発現する方法が提供される。そのような
方法は、典型的には、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母細胞を提供すること；少
なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコールオキシダーゼ１（Ａ
ＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも
１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および
該細胞を該組換え核酸分子の発現に適当な条件下で培養して、それにより該異種ポリペプ
チドを発現することを含む。
方法は、典型的には、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母細胞を提供すること；少
なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）アルコールオキシダーゼ１（Ａ
ＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも
１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および
該細胞を該組換え核酸分子の発現に適当な条件下で培養して、それにより該異種ポリペプ
チドを発現することを含む。
幾つかの実施形態において、細胞が培養される条件は、鉄または薬学的にまたは代謝的
に許容されるそれらの塩の添加を含む。幾つかの実施形態において、該導入ステップは、
形質導入、電気穿孔法、微粒子銃送達（biolistic particle delivery）、または化学的
形質転換などの技法を含む。幾つかの実施形態において、培養ステップは、メタノールの
存在下で細胞を培養することを含む。
に許容されるそれらの塩の添加を含む。幾つかの実施形態において、該導入ステップは、
形質導入、電気穿孔法、微粒子銃送達（biolistic particle delivery）、または化学的
形質転換などの技法を含む。幾つかの実施形態において、培養ステップは、メタノールの
存在下で細胞を培養することを含む。
別の態様において、それが活性化するプロモーターと作動的に連結している転写活性化
因子を含む組換え生物体が提供される。幾つかの実施形態において、プロモーターと作動
的に連結しているポリペプチドを発現する組換え生物体が提供される。さらに別の態様に
おいて、誘導物質を添加せずに誘導性プロモーターからポリペプチドを発現する方法が、
本明細書に記載されたように提供される。
因子を含む組換え生物体が提供される。幾つかの実施形態において、プロモーターと作動
的に連結しているポリペプチドを発現する組換え生物体が提供される。さらに別の態様に
おいて、誘導物質を添加せずに誘導性プロモーターからポリペプチドを発現する方法が、
本明細書に記載されたように提供される。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、方法お
よび組成物が属する技術の当業者により共通して理解される意味と同じ意味を有する。本
明細書に記載される方法および材料と同様なまたは等価の方法および材料が、方法および
組成物の実行または試験で使用され得るが、適当な方法および材料は下に記載される。そ
れに加えて、材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定するものであることは意図さ
れない。本明細書で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、それ
らの全体で参照により本明細書に組み込まれる。
よび組成物が属する技術の当業者により共通して理解される意味と同じ意味を有する。本
明細書に記載される方法および材料と同様なまたは等価の方法および材料が、方法および
組成物の実行または試験で使用され得るが、適当な方法および材料は下に記載される。そ
れに加えて、材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定するものであることは意図さ
れない。本明細書で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、それ
らの全体で参照により本明細書に組み込まれる。
詳細な説明
ポリペプチドの組換え発現を増大させるために細胞を遺伝子操作することを可能にする
核酸構築物が、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、誘導する分子の不在
下で誘導性プロモーターからのポリペプチドの組換え発現を増大させるために、細胞を遺
伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。いかなる特定の機
構にも束縛されずに、本明細書に記載される方法は、転写活性化因子の低レベルの天然の
発現が、転写活性化因子と作動的に連結しているプロモーターを誘導する正のフィードバ
ックループを創り出す。このことは転写活性化因子ならびに同じ誘導性プロモーターと作
動的に連結している１種または複数の目標ポリペプチドの増大した発現をもたらす。
ポリペプチドの組換え発現を増大させるために細胞を遺伝子操作することを可能にする
核酸構築物が、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、誘導する分子の不在
下で誘導性プロモーターからのポリペプチドの組換え発現を増大させるために、細胞を遺
伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で提供される。いかなる特定の機
構にも束縛されずに、本明細書に記載される方法は、転写活性化因子の低レベルの天然の
発現が、転写活性化因子と作動的に連結しているプロモーターを誘導する正のフィードバ
ックループを創り出す。このことは転写活性化因子ならびに同じ誘導性プロモーターと作
動的に連結している１種または複数の目標ポリペプチドの増大した発現をもたらす。
メチロトローフ酵母細胞を遺伝子操作することを可能にする核酸構築物が、本明細書で
提供される。該方法は、本明細書ではピキア（Pichia）種（即ち、Ｐ．パストリス（P. p
astoris））を使用して例示されるが、ピキア属（Pichia genus）の他の種も、カンジダ
属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）, ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属
（Torulopsis）のいずれかからの種も使用することができる。
提供される。該方法は、本明細書ではピキア（Pichia）種（即ち、Ｐ．パストリス（P. p
astoris））を使用して例示されるが、ピキア属（Pichia genus）の他の種も、カンジダ
属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）, ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属
（Torulopsis）のいずれかからの種も使用することができる。
メチロトローフ酵母細胞の遺伝子操作は、典型的には、組換え核酸分子を細胞中に導入
することを含む。本明細書に記載されるように、組換え核酸分子は、典型的には少なくと
も１種の誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外
因性核酸を含む。
することを含む。本明細書に記載されるように、組換え核酸分子は、典型的には少なくと
も１種の誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外
因性核酸を含む。
本明細書に記載される方法で使用される組換え核酸分子は、典型的にはＤＮＡであるが
、ＲＮＡ分子も適当な状況下で使用することができる。本明細書において使用する「外因
性」とは、外部供給源から細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を指し、ここで、
外部供給源は、同じかもしくは異なる生物体または合成で生成した核酸であり得る。例え
ば、外因性核酸は、１種の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１つの属または種）か
らの核酸で、メチロトローフ酵母の異なった属または種に導入された核酸であり得るが、
しかしながら、外因性核酸は、メチロトローフ酵母からの核酸で、対応する天然の核酸配
列の存在にもかかわらず追加のコピーとしてメチロトローフ酵母中に組換えで導入された
核酸でもあり得る。例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）は、Ｍｘｒ１転写活性化因
子をコードする内因性の核酸を含有する。Ｐ．パストリス（P. pastoris）の追加のＭｘ
ｒ１核酸（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）中に組換えで導入された）または内
因性のＰ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸の改変は外因性と考えられる。
、ＲＮＡ分子も適当な状況下で使用することができる。本明細書において使用する「外因
性」とは、外部供給源から細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を指し、ここで、
外部供給源は、同じかもしくは異なる生物体または合成で生成した核酸であり得る。例え
ば、外因性核酸は、１種の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１つの属または種）か
らの核酸で、メチロトローフ酵母の異なった属または種に導入された核酸であり得るが、
しかしながら、外因性核酸は、メチロトローフ酵母からの核酸で、対応する天然の核酸配
列の存在にもかかわらず追加のコピーとしてメチロトローフ酵母中に組換えで導入された
核酸でもあり得る。例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）は、Ｍｘｒ１転写活性化因
子をコードする内因性の核酸を含有する。Ｐ．パストリス（P. pastoris）の追加のＭｘ
ｒ１核酸（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）中に組換えで導入された）または内
因性のＰ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸の改変は外因性と考えられる。
転写活性化因子、および転写活性化因子をコードする核酸（例えば、転写活性化因子を
コードする外因性核酸）が、当技術分野において知られている。例えば、ピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）からの転写活性化因子は、Ｍｘｒ１配列であるが、適当な転写
活性化因子は、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（Ａｄｒ１配列；例
えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＯＩ０２０００００５、塩基８５
８８７３から８６２３５２まで、およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号
ＥＳＸ０１２５３を参照されたい）およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）（
Ｔｒｍ１配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ３６５３５５、
およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＦ９９７００を参照されたい
；Ｔｒｍ２配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ５４８７６０
およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＪ０７６０８を参照されたい
）にも見出すことができる。代表的Ｐ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸配列は
、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４に見出され得るが、代表的Ｐ．パス
トリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
ＡＢＤ５７３６５に見出すことができる。
コードする外因性核酸）が、当技術分野において知られている。例えば、ピキア・パスト
リス（Pichia pastoris）からの転写活性化因子は、Ｍｘｒ１配列であるが、適当な転写
活性化因子は、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（Ａｄｒ１配列；例
えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＯＩ０２０００００５、塩基８５
８８７３から８６２３５２まで、およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号
ＥＳＸ０１２５３を参照されたい）およびカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）（
Ｔｒｍ１配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ３６５３５５、
およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＦ９９７００を参照されたい
；Ｔｒｍ２配列；例えば、核酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ５４８７６０
およびアミノ酸配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＪ０７６０８を参照されたい
）にも見出すことができる。代表的Ｐ．パストリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１核酸配列は
、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４に見出され得るが、代表的Ｐ．パス
トリス（P. pastoris）Ｍｘｒ１ポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
ＡＢＤ５７３６５に見出すことができる。
Ｍｘｒ１などの転写活性化因子は、常態では低レベルで発現され得る。それ故、外因性
核酸（即ち、転写活性化因子）を誘導性のプロモーターの制御下に置くことが望ましい。
本明細書において使用する「作動的に連結している」とは、プロモーターまたは他の発現
要素が、核酸の発現を指示または調節するように、配列をコードする核酸に対して位置（
例えば、インフレーム）することを意味する。
核酸（即ち、転写活性化因子）を誘導性のプロモーターの制御下に置くことが望ましい。
本明細書において使用する「作動的に連結している」とは、プロモーターまたは他の発現
要素が、核酸の発現を指示または調節するように、配列をコードする核酸に対して位置（
例えば、インフレーム）することを意味する。
メチロトローフ酵母を遺伝子操作するときに使用され得る多くの誘導性プロモーターが
ある。例えば、メタノール誘導性プロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を
使用することができる。メタノール誘導性プロモーターは当技術分野で知られている。例
えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの一般的に使用されるメタノール誘導性プロ
モーターは、メタノールに応答して強く転写されるアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１
）遺伝子からのプロモーター、またはそれらの一部である。しかしながら、他のメタノー
ル誘導性プロモーターまたはそれらからのプロモーター要素は、限定されないが、カンジ
ダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモ
ーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＳＡＡＯＤ１Ａを参照されたい）、ハンセヌ
ラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのアルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プ
ロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２４２５を参照されたい）、ピキア・
メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１またはＭＯＤ２プロモーター（例えば
、Raymond et al., 1998, Yeast, 14:11-23;およびNakagawa et al., 1999, Yeast, 15:
1223-30を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ７５２５５１を参照されたい）またはそれらから
のプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのホルムアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６
６０５４を参照されたい）、またはＰ．パストリス（P. pastoris）からのＰＥＸ８プロ
モーター（例えば、Kranthi et al., 2010, Yeast, 27: 705-11を参照されたい）を含め
て使用することができる。幾つかの実施形態において、転写活性化因子は、ピキア・パス
トリス（Pichia pastoris）からのＭｉｔ１配列である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番
号ＣＡＹ７０８８７を参照されたい）。全てのこれらのプロモーターは、メタノールによ
り誘導されることが知られている。
ある。例えば、メタノール誘導性プロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を
使用することができる。メタノール誘導性プロモーターは当技術分野で知られている。例
えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの一般的に使用されるメタノール誘導性プロ
モーターは、メタノールに応答して強く転写されるアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１
）遺伝子からのプロモーター、またはそれらの一部である。しかしながら、他のメタノー
ル誘導性プロモーターまたはそれらからのプロモーター要素は、限定されないが、カンジ
ダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモ
ーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＳＡＡＯＤ１Ａを参照されたい）、ハンセヌ
ラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのアルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プ
ロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２４２５を参照されたい）、ピキア・
メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１またはＭＯＤ２プロモーター（例えば
、Raymond et al., 1998, Yeast, 14:11-23;およびNakagawa et al., 1999, Yeast, 15:
1223-30を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ７５２５５１を参照されたい）またはそれらから
のプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのホルムアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６
６０５４を参照されたい）、またはＰ．パストリス（P. pastoris）からのＰＥＸ８プロ
モーター（例えば、Kranthi et al., 2010, Yeast, 27: 705-11を参照されたい）を含め
て使用することができる。幾つかの実施形態において、転写活性化因子は、ピキア・パス
トリス（Pichia pastoris）からのＭｉｔ１配列である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番
号ＣＡＹ７０８８７を参照されたい）。全てのこれらのプロモーターは、メタノールによ
り誘導されることが知られている。
当業者は、本明細書に記載された組換え核酸分子がメチロトローフ酵母細胞のゲノムに
安定に組み込まれ得ること、または複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現され
得ることを理解するであろう。両方を達成する方法は、当技術分野で周知であり、日常的
に使用されている。
安定に組み込まれ得ること、または複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現され
得ることを理解するであろう。両方を達成する方法は、当技術分野で周知であり、日常的
に使用されている。
本明細書で示したように、ピキア（Pichia）中のメタノールに調節される転写活性化因
子は、ＡＯＸ１プロモーターに結合して、Ｍｘｒ１と協調してＡＯＸ１プロモーターから
の転写を活性化することができる。幾つかの実施形態では、メタノールに調節される２種
類の転写活性化因子（例えば、Ｍｘｒ１およびＭｉｔ１）が、メタノール誘導性プロモー
ター要素と作動的に連結することができる。
子は、ＡＯＸ１プロモーターに結合して、Ｍｘｒ１と協調してＡＯＸ１プロモーターから
の転写を活性化することができる。幾つかの実施形態では、メタノールに調節される２種
類の転写活性化因子（例えば、Ｍｘｒ１およびＭｉｔ１）が、メタノール誘導性プロモー
ター要素と作動的に連結することができる。
本明細書に記載される組換え核酸分子を含む株は、メチロトローフ酵母細胞中の第２の
組換え核酸分子を調節する（例えば、過発現する）ことに使用することができる。第２の
組換え核酸分子は、例えば、関心のある１種または複数のポリペプチドをコードする１種
または複数の異種核酸を含むことができる。転写活性化因子をコードする外因性核酸と同
様に、異種核酸は、生物体のゲノムにまたはゲノム中で生得（native）でない任意の核酸
配列を指す（例えば、異種核酸は、１種類の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１属
または種）からの核酸で、メチロトローフ酵母の異なる属または種中に導入された核酸で
あり得る）。
組換え核酸分子を調節する（例えば、過発現する）ことに使用することができる。第２の
組換え核酸分子は、例えば、関心のある１種または複数のポリペプチドをコードする１種
または複数の異種核酸を含むことができる。転写活性化因子をコードする外因性核酸と同
様に、異種核酸は、生物体のゲノムにまたはゲノム中で生得（native）でない任意の核酸
配列を指す（例えば、異種核酸は、１種類の微生物（例えば、メチロトローフ酵母の１属
または種）からの核酸で、メチロトローフ酵母の異なる属または種中に導入された核酸で
あり得る）。
単に例として、関心のある１種または複数のポリペプチドをコードする異種核酸は、ヘ
ム共同因子の生合成に関与する核酸であり得る。ここで例にするのは、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）ゲノムの配列から決定されて注記されるようなヘム生合成に関与
する８種の異なる酵素をコードする核酸である。例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒ
ドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩ
Ｉデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラタ
ーゼをコードする異種核酸は、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母株中で発現させ
ることができる。２種以上の異種核酸（例えば、導入遺伝子）を含有するようにメチロト
ローフ酵母を遺伝子操作するために、メタノール誘導性プロモーターと構成的プロモータ
ーの組合せまたはそれらからの要素を、そのような核酸の発現をさらに増大させるために
組み合わせることができる。
ム共同因子の生合成に関与する核酸であり得る。ここで例にするのは、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）ゲノムの配列から決定されて注記されるようなヘム生合成に関与
する８種の異なる酵素をコードする核酸である。例えば、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒ
ドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩ
Ｉデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラタ
ーゼをコードする異種核酸は、本明細書に記載されたメチロトローフ酵母株中で発現させ
ることができる。２種以上の異種核酸（例えば、導入遺伝子）を含有するようにメチロト
ローフ酵母を遺伝子操作するために、メタノール誘導性プロモーターと構成的プロモータ
ーの組合せまたはそれらからの要素を、そのような核酸の発現をさらに増大させるために
組み合わせることができる。
サッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）における以前の研究で、
ＡＬＡデヒドラターゼおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼがヘム生合成における律
速酵素として同定された（例えば、Hoffman et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 310 (4): 1247-53を参照されたい）。しかしながら、グリセルアルデヒド－３－ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ギャップ）プロモーターからのＰ．パストリス（P. pasto
ris）における個々のヘム酵素の異種発現は、ヘム共同因子を含有する組換えタンパク質
の発現と関連する制限を克服することに成功しなかった（Krainer et al., 2015, Microb
. Cell Fact., 13; 14: 4を参照されたい）。本明細書に記載されるように、Ｐ．パスト
リス（P. pastoris）中の組換えヘム含有タンパク質の高度に効率的な発現は、メタノー
ル誘導性プロモーターからの全ヘム生合成経路を共発現することにより達成されたが、ヘ
ム生合成経路に関与する１種または複数の遺伝子を、１種または複数の構成的プロモータ
ーから発現することができることが認識されるであろう。
ＡＬＡデヒドラターゼおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼがヘム生合成における律
速酵素として同定された（例えば、Hoffman et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 310 (4): 1247-53を参照されたい）。しかしながら、グリセルアルデヒド－３－ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ギャップ）プロモーターからのＰ．パストリス（P. pasto
ris）における個々のヘム酵素の異種発現は、ヘム共同因子を含有する組換えタンパク質
の発現と関連する制限を克服することに成功しなかった（Krainer et al., 2015, Microb
. Cell Fact., 13; 14: 4を参照されたい）。本明細書に記載されるように、Ｐ．パスト
リス（P. pastoris）中の組換えヘム含有タンパク質の高度に効率的な発現は、メタノー
ル誘導性プロモーターからの全ヘム生合成経路を共発現することにより達成されたが、ヘ
ム生合成経路に関与する１種または複数の遺伝子を、１種または複数の構成的プロモータ
ーから発現することができることが認識されるであろう。
鉄共同因子生合成に関与する酵素に加えて、植物ヘモグロビンを含むタンパク質のグロ
ビンファミリー（ＰｆａｍデータベースにおいてＰＦ０００４２）のメンバーをコードす
る核酸が存在し得ることが理解されるであろう。本明細書における例では、ダイズレグヘ
モグロビン（ＬｅｇＨ）をコードする核酸が存在する。ＬｅｇＨは鉄共同因子のヘムに結
合するタンパク質であり、それは４１５ｎｍに特徴的な吸収および明瞭な赤色を生じる。
ＬｅｇＨタンパク質（ＬＧＢ２としても知られる）は、天然でダイズの根粒に見出され（
例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２２３６を参照されたい）、そこで使用される
核酸配列は、Ｐ．パストリス（P. pastoris）における発現のために最適化されたコドン
であった。例えば、国際公開第２０１４／１１０５３９号パンフレットおよび国際公開第
２０１４／１１０５３２号パンフレットを参照されたい。
ビンファミリー（ＰｆａｍデータベースにおいてＰＦ０００４２）のメンバーをコードす
る核酸が存在し得ることが理解されるであろう。本明細書における例では、ダイズレグヘ
モグロビン（ＬｅｇＨ）をコードする核酸が存在する。ＬｅｇＨは鉄共同因子のヘムに結
合するタンパク質であり、それは４１５ｎｍに特徴的な吸収および明瞭な赤色を生じる。
ＬｅｇＨタンパク質（ＬＧＢ２としても知られる）は、天然でダイズの根粒に見出され（
例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２２３６を参照されたい）、そこで使用される
核酸配列は、Ｐ．パストリス（P. pastoris）における発現のために最適化されたコドン
であった。例えば、国際公開第２０１４／１１０５３９号パンフレットおよび国際公開第
２０１４／１１０５３２号パンフレットを参照されたい。
あるいは、関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は、例えば、デヒドリン、フ
ィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トラ
ンスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リア
ーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、または任意のそのようなポリペプチドに対する抗体であ
り得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種核酸は、エタノール、乳酸、
ブタノール、アジピン酸、またはコハク酸などの低分子の産生経路に関与する１種または
複数の酵素をコードすることができる。
ィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トラ
ンスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リア
ーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、または任意のそのようなポリペプチドに対する抗体であ
り得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、異種核酸は、エタノール、乳酸、
ブタノール、アジピン酸、またはコハク酸などの低分子の産生経路に関与する１種または
複数の酵素をコードすることができる。
転写活性化因子をコードする外因性核酸と同様に、関心のあるポリペプチドをコードす
る異種核酸は、誘導性プロモーター要素（例えば、メタノール誘導性プロモーター要素）
と作動的に連結することができ、または関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は
、構成的プロモーターまたは構成的プロモーター要素と作動的に連結することができる。
誘導性プロモーターおよびそれらからの要素は上で論じてある。構成的プロモーターおよ
び構成的プロモーター要素は当技術分野において知られている。例えば、Ｐ．パストリス
（P. pastoris）からの一般的に使用される構成的プロモーターは、構成的な様式で強く
転写される転写伸長因子ＥＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）からのプロモーター、またはそれ
らの一部である。しかしながら、他の構成的プロモーターまたは、それらからのプロモー
ター要素も使用することができて、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのグリセルアル
デヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢ
ａｎｋ受託番号Ｕ６２６４８．１を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）か
らの可能性のあるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）が固定されたタンパ
ク質からのプロモーターＧＣＷ１４ｐ（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１～４＿０５８６）、（例えば、
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００２４９０６７８を参照されたい）、またはＰ．パスト
リス（P. pastoris）からの３－ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）からの
プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８８２９６を参照されたい）が含
まれるが、これらに限定されない。
る異種核酸は、誘導性プロモーター要素（例えば、メタノール誘導性プロモーター要素）
と作動的に連結することができ、または関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸は
、構成的プロモーターまたは構成的プロモーター要素と作動的に連結することができる。
誘導性プロモーターおよびそれらからの要素は上で論じてある。構成的プロモーターおよ
び構成的プロモーター要素は当技術分野において知られている。例えば、Ｐ．パストリス
（P. pastoris）からの一般的に使用される構成的プロモーターは、構成的な様式で強く
転写される転写伸長因子ＥＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）からのプロモーター、またはそれ
らの一部である。しかしながら、他の構成的プロモーターまたは、それらからのプロモー
ター要素も使用することができて、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのグリセルアル
デヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター（例えば、ＧｅｎＢ
ａｎｋ受託番号Ｕ６２６４８．１を参照されたい）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）か
らの可能性のあるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）が固定されたタンパ
ク質からのプロモーターＧＣＷ１４ｐ（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１～４＿０５８６）、（例えば、
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００２４９０６７８を参照されたい）、またはＰ．パスト
リス（P. pastoris）からの３－ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）からの
プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８８２９６を参照されたい）が含
まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載された組換え核酸分子と同様に、第２の組換え核酸分子は、メチロトロ
ーフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、または複製コンピテントプラスミドか
ら染色体外で発現され得る。
ーフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、または複製コンピテントプラスミドか
ら染色体外で発現され得る。
誘導性プロモーター（例えば、メタノール誘導性）と構成的プロモーター（またはそれ
らからのプロモーター要素）の組合せが、組み合わされて、任意のそれらと作動的に連結
している核酸の発現をさらに増大させることができることは、当業者により理解されるで
あろう。
らからのプロモーター要素）の組合せが、組み合わされて、任意のそれらと作動的に連結
している核酸の発現をさらに増大させることができることは、当業者により理解されるで
あろう。
プロモーター要素と作動的に連結している関心のあるポリペプチドをコードする異種核
酸が、本明細書に記載された組換え核酸分子から分離され得ること、または本明細書に記
載された組換え核酸分子内に含有されるプロモーター要素と作動的に連結している転写活
性化因子をコードする外因性核酸と近接することができることは、当業者により認識され
るであろう。第２の核酸分子が本明細書に記載された組換え核酸分子と近接していれば、
単一のプロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を、両方のまたは全ての遺伝
子（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸ならびに関心のあるポリペプチドを
コードする１種または複数の異種核酸）の転写を推進するために使用することができるこ
とも当業者により認識されるであろう。
酸が、本明細書に記載された組換え核酸分子から分離され得ること、または本明細書に記
載された組換え核酸分子内に含有されるプロモーター要素と作動的に連結している転写活
性化因子をコードする外因性核酸と近接することができることは、当業者により認識され
るであろう。第２の核酸分子が本明細書に記載された組換え核酸分子と近接していれば、
単一のプロモーター、またはそれらからのプロモーター要素を、両方のまたは全ての遺伝
子（例えば、転写活性化因子をコードする外因性核酸ならびに関心のあるポリペプチドを
コードする１種または複数の異種核酸）の転写を推進するために使用することができるこ
とも当業者により認識されるであろう。
核酸をメチロトローフ酵母細胞に導入する方法は、当技術分野において知られており、
形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換を含むが、これらに限定され
ない。
形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換を含むが、これらに限定され
ない。
それに加えて、メチロトローフ酵母細胞を培養する方法も、当技術分野において知られ
ている。例えば、Pichia Protocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg, Ed.,
2007, 2ndEd., Humana Press, Inc.を参照されたい。幾つかの状況下で、メタノールを
培養培地に導入または添加することが望ましいこともあるが、本明細書で示したように、
メタノールは、１種または複数の関心のあるポリペプチドの高レベルにおける効率的な発
現を得るために必要とされない。幾つかの状況下で（例えば、鉄共同因子の生合成に関与
する酵素をコードする１種または複数の核酸が発現される場合）、培養培地に鉄または薬
学的にまたは代謝的に許容される（またはＧＲＡＳ）それらの塩を補完することが望まし
いこともある。
ている。例えば、Pichia Protocols, Methods In Molecular Biology, 389, Cregg, Ed.,
2007, 2ndEd., Humana Press, Inc.を参照されたい。幾つかの状況下で、メタノールを
培養培地に導入または添加することが望ましいこともあるが、本明細書で示したように、
メタノールは、１種または複数の関心のあるポリペプチドの高レベルにおける効率的な発
現を得るために必要とされない。幾つかの状況下で（例えば、鉄共同因子の生合成に関与
する酵素をコードする１種または複数の核酸が発現される場合）、培養培地に鉄または薬
学的にまたは代謝的に許容される（またはＧＲＡＳ）それらの塩を補完することが望まし
いこともある。
ピキア（Pichia）株は、メタノールを唯一の炭素源として成長することができる。メタ
ノールの利用は、アルコールオキシダーゼの作用によるメタノールのホルムアルデヒドへ
の変換により開始される。メチロトローフ酵母のピキア・パストリス（Pichia pastoris
）は、アルコールオキシダーゼのための２つの遺伝子、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２を含有す
る。アルコールオキシダーゼ活性が低下した株（「メタノール利用が遅い」、またはＭｕ
ｔＳ株）は、しばしば、ＡＯＸ１プロモーターから発現される組換えタンパク質を、アル
コールオキシダーゼ活性が低下していない株よりも多く産生する。両方のＡＯＸ遺伝子が
変異した株およびアルコールオキシダーゼ活性を完全に欠く株は、メタノールを代謝する
ことができないが、それでもＡＯＸ１プロモーターからの発現のためにメタノールにより
誘導され得る。これらの株は、成長のために他の炭素源を使用する能力を保持しているが
、それでもまだ、メタノールの添加でＡＯＸ１プロモーターから異種タンパク質を発現す
る。これらの株は、メタノールを代謝しない（「メタノール利用のない」またはＭｕｔ株
）ので、はるかに少ないメタノールしかタンパク質発現の誘導のために必要とせず、これ
らの変異を有する株は、大規模発酵におけるメタノール供給に関する問題を回避する。例
えば、Chiruvolu et al., 1997, Enzyme Microb. Technol., 21: 277-83を参照されたい
。Ｍｕｔ株におけるＡＯＸ１プロモーターからのＬｅｇＨの発現がＬｅｇＨ収率を大きく
改善したことが本明細書で判定された。したがって、ＡＯＸ１遺伝子およびＡＯＸ２遺伝
子の両方で変異を有するメチロトローフ酵母は、本明細書に記載される方法で使用するこ
とができる。
ノールの利用は、アルコールオキシダーゼの作用によるメタノールのホルムアルデヒドへ
の変換により開始される。メチロトローフ酵母のピキア・パストリス（Pichia pastoris
）は、アルコールオキシダーゼのための２つの遺伝子、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２を含有す
る。アルコールオキシダーゼ活性が低下した株（「メタノール利用が遅い」、またはＭｕ
ｔＳ株）は、しばしば、ＡＯＸ１プロモーターから発現される組換えタンパク質を、アル
コールオキシダーゼ活性が低下していない株よりも多く産生する。両方のＡＯＸ遺伝子が
変異した株およびアルコールオキシダーゼ活性を完全に欠く株は、メタノールを代謝する
ことができないが、それでもＡＯＸ１プロモーターからの発現のためにメタノールにより
誘導され得る。これらの株は、成長のために他の炭素源を使用する能力を保持しているが
、それでもまだ、メタノールの添加でＡＯＸ１プロモーターから異種タンパク質を発現す
る。これらの株は、メタノールを代謝しない（「メタノール利用のない」またはＭｕｔ株
）ので、はるかに少ないメタノールしかタンパク質発現の誘導のために必要とせず、これ
らの変異を有する株は、大規模発酵におけるメタノール供給に関する問題を回避する。例
えば、Chiruvolu et al., 1997, Enzyme Microb. Technol., 21: 277-83を参照されたい
。Ｍｕｔ株におけるＡＯＸ１プロモーターからのＬｅｇＨの発現がＬｅｇＨ収率を大きく
改善したことが本明細書で判定された。したがって、ＡＯＸ１遺伝子およびＡＯＸ２遺伝
子の両方で変異を有するメチロトローフ酵母は、本明細書に記載される方法で使用するこ
とができる。
関心のあるタンパク質、または１種または複数の関心のあるタンパク質を含む複合体（
例えば、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ
、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダク
ターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、また
は抗体）は、酵母細胞から精製することができる。ポリペプチドを精製する方法は当技術
分野において知られている。本明細書において使用する「精製された」ポリペプチドは、
天然でそれに伴った細胞の成分から分離または精製されたポリペプチドである。典型的に
は、ポリペプチドは、それが、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、それが天然で結合している
ポリペプチドおよび天然に生じる分子を含まない場合に、「精製された」とみなされる。
化学的に合成されたポリペプチドは、本来、天然でそれに伴う成分から分離されているの
で、合成ポリペプチドは「精製されている」。
例えば、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ
、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルタミナーゼ、オキシドレダク
ターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、また
は抗体）は、酵母細胞から精製することができる。ポリペプチドを精製する方法は当技術
分野において知られている。本明細書において使用する「精製された」ポリペプチドは、
天然でそれに伴った細胞の成分から分離または精製されたポリペプチドである。典型的に
は、ポリペプチドは、それが、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、それが天然で結合している
ポリペプチドおよび天然に生じる分子を含まない場合に、「精製された」とみなされる。
化学的に合成されたポリペプチドは、本来、天然でそれに伴う成分から分離されているの
で、合成ポリペプチドは「精製されている」。
本明細書において使用する核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、１種または
複数のヌクレオチドアナログまたは骨格改変を含有する核酸を含むことができる。核酸は
単鎖であることもまたは二重鎖であることもできて、それは通常その意図される使用に依
存する。所与の配列と異なる核酸およびポリペプチドも提供される。核酸およびポリペプ
チドは、所与の核酸またはポリペプチド配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性（
例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％
、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有
することができる。
複数のヌクレオチドアナログまたは骨格改変を含有する核酸を含むことができる。核酸は
単鎖であることもまたは二重鎖であることもできて、それは通常その意図される使用に依
存する。所与の配列と異なる核酸およびポリペプチドも提供される。核酸およびポリペプ
チドは、所与の核酸またはポリペプチド配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性（
例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％
、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有
することができる。
配列同一性のパーセントの計算では、２つの配列が整列されて、２つの配列間のヌクレ
オチドまたはアミノ酸残基が同一の一致数が決定される。同一の一致数を整列された領域
の長さ（即ち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）により除して１００倍
するとパーセントで配列同一性値になる。整列された領域の長さは、最短配列の全長サイ
ズまでの一方または両方の配列の一部であり得ることは認識されるであろう。単一の配列
が２種以上の他の配列と整列することができて、それゆえ、各整列された領域全体にわた
って異なるパーセントの配列同一性値を有することができることも認識されるであろう。
オチドまたはアミノ酸残基が同一の一致数が決定される。同一の一致数を整列された領域
の長さ（即ち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）により除して１００倍
するとパーセントで配列同一性値になる。整列された領域の長さは、最短配列の全長サイ
ズまでの一方または両方の配列の一部であり得ることは認識されるであろう。単一の配列
が２種以上の他の配列と整列することができて、それゆえ、各整列された領域全体にわた
って異なるパーセントの配列同一性値を有することができることも認識されるであろう。
配列同一性のパーセントを決定するための２つ以上の配列の整列は、コンピュータープ
ログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよび既定のパラメーターを使用して実施することができて、
それが、核酸またはポリペプチド配列の整列がそれらの全長（グローバルアライメント）
にわたって実施されることを可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 3
1 (13): 3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、検索配列と１種または複数の対象の配列間の最
良の一致を計算して、同一性、類似性および相違を決定できるように、それらを整列させ
る。１個または複数の残基のギャップが、検索配列、対象配列、または両方中に挿入され
て、配列の整列を最大にすることができる。核酸配列を迅速にペアをなす整列にするため
に、既定のパラメーターを使用することができる（即ち、ワードサイズ：２；ウィンドウ
サイズ：４；スコア付けの方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diag
onals）：４；およびギャップペナルティー：５）；複数の核酸配列を整列させるために
、以下のパラメーターを使用することができる：ギャップオープニングペナルティー：１
０．０；ギャップエクステンションペナルティー：５．０；およびウェイトの変更（weig
ht transition）：あり。ポリペプチド配列を迅速にペアをなす整列にするために、以下
のパラメーターを使用することができる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；ス
コア付け方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diagonals）：５；お
よびギャップペナルティー：３。複数のポリペプチド配列を整列させるために、以下のパ
ラメーターを使用することができる：ウェイトマトリックス：ブロスム（blosum）；ギャ
ップオープニングペナルティー：１０．０；ギャップエクステンションペナルティー：０
．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；および残基特異的ギャップペナルティー：オ
ン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Baylor College of Medicine Search Launcher websi
teでまたはWorld Wide WebのEuropean Bioinformatics Institute websiteで実行するこ
とができる。
ログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよび既定のパラメーターを使用して実施することができて、
それが、核酸またはポリペプチド配列の整列がそれらの全長（グローバルアライメント）
にわたって実施されることを可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 3
1 (13): 3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、検索配列と１種または複数の対象の配列間の最
良の一致を計算して、同一性、類似性および相違を決定できるように、それらを整列させ
る。１個または複数の残基のギャップが、検索配列、対象配列、または両方中に挿入され
て、配列の整列を最大にすることができる。核酸配列を迅速にペアをなす整列にするため
に、既定のパラメーターを使用することができる（即ち、ワードサイズ：２；ウィンドウ
サイズ：４；スコア付けの方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diag
onals）：４；およびギャップペナルティー：５）；複数の核酸配列を整列させるために
、以下のパラメーターを使用することができる：ギャップオープニングペナルティー：１
０．０；ギャップエクステンションペナルティー：５．０；およびウェイトの変更（weig
ht transition）：あり。ポリペプチド配列を迅速にペアをなす整列にするために、以下
のパラメーターを使用することができる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；ス
コア付け方法：パーセンテージ；頂点の対角線数（number of top diagonals）：５；お
よびギャップペナルティー：３。複数のポリペプチド配列を整列させるために、以下のパ
ラメーターを使用することができる：ウェイトマトリックス：ブロスム（blosum）；ギャ
ップオープニングペナルティー：１０．０；ギャップエクステンションペナルティー：０
．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；および残基特異的ギャップペナルティー：オ
ン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Baylor College of Medicine Search Launcher websi
teでまたはWorld Wide WebのEuropean Bioinformatics Institute websiteで実行するこ
とができる。
変化を核酸分子に導入して、それによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列に変
化を生じさせることができる。例えば、変化は、配列をコードする核酸に、突然変異生成
（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲに媒介される突然変異生成）を使用して、ま
たはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することにより、導入することがで
きる。そのような核酸変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／ま
たは非保存的アミノ酸置換を生じさせ得る。「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ
酸残基が同様な側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えられたものであり（例えば、
アミノ酸置換のための頻度表を提供するDayhoff et al.（1978, Atlas of Protein Seque
nce and Structure, 5 (Suppl. 3): 345-352）を参照されたい）、および非保存的置換は
、アミノ酸残基が同様な側鎖を有しないアミノ酸残基で置き換えられたものである。核酸
および／またはポリペプチド配列は、本明細書に記載されるように、改変されて、増大し
た発現（例えば、転写および／または翻訳）、より厳格な調節、脱制御、異化代謝産物抑
制の消失、改変された特異性、分泌、熱安定性、溶媒安定性、酸化的安定性、プロテアー
ゼ耐性、触媒活性、および／または色を含むが、これらに限定されない１種または複数の
性質が改善され得る。
化を生じさせることができる。例えば、変化は、配列をコードする核酸に、突然変異生成
（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲに媒介される突然変異生成）を使用して、ま
たはそのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することにより、導入することがで
きる。そのような核酸変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／ま
たは非保存的アミノ酸置換を生じさせ得る。「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ
酸残基が同様な側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えられたものであり（例えば、
アミノ酸置換のための頻度表を提供するDayhoff et al.（1978, Atlas of Protein Seque
nce and Structure, 5 (Suppl. 3): 345-352）を参照されたい）、および非保存的置換は
、アミノ酸残基が同様な側鎖を有しないアミノ酸残基で置き換えられたものである。核酸
および／またはポリペプチド配列は、本明細書に記載されるように、改変されて、増大し
た発現（例えば、転写および／または翻訳）、より厳格な調節、脱制御、異化代謝産物抑
制の消失、改変された特異性、分泌、熱安定性、溶媒安定性、酸化的安定性、プロテアー
ゼ耐性、触媒活性、および／または色を含むが、これらに限定されない１種または複数の
性質が改善され得る。
本明細書において使用する「単離された」核酸分子とは、単離された核酸がそこから誘
導された生物体のゲノム中の核酸の一端または両端に天然で側面に位置する配列（例えば
、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されたｃＤＮＡまたはゲノムのＤ
ＮＡフラグメント）を含まない核酸分子である。そのような単離された核酸分子は、操作
の便宜のために、または下でさらに詳細に論ずる融合核酸分子を発生させるために、ベク
ター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）中に一般的に導入される。
それに加えて、単離された核酸分子は、組換えまたは合成核酸分子などの操作された核酸
分子を含むことができる。
導された生物体のゲノム中の核酸の一端または両端に天然で側面に位置する配列（例えば
、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されたｃＤＮＡまたはゲノムのＤ
ＮＡフラグメント）を含まない核酸分子である。そのような単離された核酸分子は、操作
の便宜のために、または下でさらに詳細に論ずる融合核酸分子を発生させるために、ベク
ター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）中に一般的に導入される。
それに加えて、単離された核酸分子は、組換えまたは合成核酸分子などの操作された核酸
分子を含むことができる。
核酸は、当技術分野における日常的技法を使用して単離することができる。例えば、核
酸は、限定されないが、組換え核酸技法、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技法は、例えば、
PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1995.に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消
化および連結を含み、それらは核酸を単離するために使用することができる。単離された
核酸は、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化
学的に合成することもできる。
酸は、限定されないが、組換え核酸技法、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技法は、例えば、
PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 1995.に記載されている。組換え核酸技法は、例えば、制限酵素消
化および連結を含み、それらは核酸を単離するために使用することができる。単離された
核酸は、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化
学的に合成することもできる。
ポリペプチドは、天然資源（例えば、生物学的試料）からＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾
過、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの知られた方法により精製する
ことができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることにより精
製することもできる。それに加えて、精製されたポリペプチドは、化学的合成により得る
こともできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマ
トグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定す
ることができる。
過、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの知られた方法により精製する
ことができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることにより精
製することもできる。それに加えて、精製されたポリペプチドは、化学的合成により得る
こともできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマ
トグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定す
ることができる。
核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）を含有する構築物またはベクターも提
供される。発現構築物またはベクターを含む構築物またはベクターは、市販されているか
、または当技術分野における日常的組換えＤＮＡ技法により産生することができる。核酸
を含有する構築物またはベクターは、そのような核酸と作動的に連結している発現要素を
有することができて、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする
ものなどの配列をさらに含むことができる。核酸を含有する構築物またはベクターは、キ
メラまたは融合ポリペプチド（即ち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにあ
り得る異種ポリペプチドと作動的に連結しているポリペプチド）をコードすることができ
る。代表的異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製で使用することができ
るものである（例えば、６×Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ
））。
供される。発現構築物またはベクターを含む構築物またはベクターは、市販されているか
、または当技術分野における日常的組換えＤＮＡ技法により産生することができる。核酸
を含有する構築物またはベクターは、そのような核酸と作動的に連結している発現要素を
有することができて、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする
ものなどの配列をさらに含むことができる。核酸を含有する構築物またはベクターは、キ
メラまたは融合ポリペプチド（即ち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにあ
り得る異種ポリペプチドと作動的に連結しているポリペプチド）をコードすることができ
る。代表的異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製で使用することができ
るものである（例えば、６×Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ
））。
発現要素は、核酸をコードする配列の発現を指示および調節する核酸配列を含む。発現
要素の１例は、プロモーター配列である。発現要素は、イントロン、エンハンサー配列、
応答要素、または核酸の発現をモジュレートする誘導性要素も含むことができる。発現要
素は細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルスが起源であってもよく、ベクターは異
なる起源由来の要素の組合せを含有することができる。
要素の１例は、プロモーター配列である。発現要素は、イントロン、エンハンサー配列、
応答要素、または核酸の発現をモジュレートする誘導性要素も含むことができる。発現要
素は細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルスが起源であってもよく、ベクターは異
なる起源由来の要素の組合せを含有することができる。
本明細書に記載されるベクターは、宿主細胞に導入することができる。本明細書におい
て使用する「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を指し、ベクターを担持するそ
のような細胞の子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞の細胞であり得
る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）などの細菌の細胞中、または昆虫細胞中、酵母
または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など
）で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に知られている。インビボおよびインビ
トロの両方で核酸を宿主細胞に導入する多くの方法が、当業者に周知であり、電気穿孔、
リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、ヒートショック、
リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸移入を含むが、
これらに限定されない。
て使用する「宿主細胞」は、核酸が導入される特定の細胞を指し、ベクターを担持するそ
のような細胞の子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞の細胞であり得
る。例えば、核酸は、大腸菌（E. coli）などの細菌の細胞中、または昆虫細胞中、酵母
または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など
）で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に知られている。インビボおよびインビ
トロの両方で核酸を宿主細胞に導入する多くの方法が、当業者に周知であり、電気穿孔、
リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、ヒートショック、
リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸移入を含むが、
これらに限定されない。
核酸は、任意の数の増幅技法（例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Die
ffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb
or, NY；および米国特許第４，６８３，１９５号明細書；第４，６８３，２０２号明細書
；第４，８００，１５９号明細書；および第４，９６５，１８８号明細書を参照されたい
）をオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の適当な対と共に使用して検出すること
ができる。最初のＰＣＲへの多くの改変が開発されて、核酸を検出するために使用するこ
とができる。
ffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb
or, NY；および米国特許第４，６８３，１９５号明細書；第４，６８３，２０２号明細書
；第４，８００，１５９号明細書；および第４，９６５，１８８号明細書を参照されたい
）をオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の適当な対と共に使用して検出すること
ができる。最初のＰＣＲへの多くの改変が開発されて、核酸を検出するために使用するこ
とができる。
核酸は、ハイブリッド形成を使用して検出することもできる。核酸間のハイブリッド形
成は、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sections 7.37-7.57,
9.47-9.57, 11.7-11.8, and 11.45-11.57）に詳細に論じられている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ
らは、約１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブのために適当なサザンブ
ロット条件を開示している（Sections 11.45-11.46）。長さが１００ヌクレオチド未満の
配列と第２の配列との間のＴｍは、Section 11.46で提供された式を使用して計算するこ
とができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは、それに加えて、約１００ヌクレオチドを超えるオリ
ゴヌクレオチドプローブのためのサザンブロット条件も開示している（Sections 9.47-9.
54を参照されたい）。長さが１００ヌクレオチドを超える配列と第２の配列との間のＴｍ
は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのSections 9.50-9.51で提供された式を使用して計算することが
できる。
成は、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sections 7.37-7.57,
9.47-9.57, 11.7-11.8, and 11.45-11.57）に詳細に論じられている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ
らは、約１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブのために適当なサザンブ
ロット条件を開示している（Sections 11.45-11.46）。長さが１００ヌクレオチド未満の
配列と第２の配列との間のＴｍは、Section 11.46で提供された式を使用して計算するこ
とができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは、それに加えて、約１００ヌクレオチドを超えるオリ
ゴヌクレオチドプローブのためのサザンブロット条件も開示している（Sections 9.47-9.
54を参照されたい）。長さが１００ヌクレオチドを超える配列と第２の配列との間のＴｍ
は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのSections 9.50-9.51で提供された式を使用して計算することが
できる。
核酸を含有する膜が、予備ハイブリッドおよびハイブリッドされる条件、ならびに核酸
を含有する膜が過剰のおよび非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄される条
件は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーにおいて有意義な役割を演じ得る。そのよ
うなハイブリッド形成および洗浄は、中程度のまたは高いストリンジェンシー条件下で、
必要に応じて実施することができる。例えば、洗浄条件を、洗浄溶液中の塩濃度を下げる
ことによりおよび／または洗浄が実施される温度を上げることにより、さらに厳格にする
ことができる。単に例として、高いストリンジェンシー条件は、典型的には、６５℃にお
ける０．２×ＳＳＣ中の膜の洗浄を含む。
を含有する膜が過剰のおよび非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄される条
件は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーにおいて有意義な役割を演じ得る。そのよ
うなハイブリッド形成および洗浄は、中程度のまたは高いストリンジェンシー条件下で、
必要に応じて実施することができる。例えば、洗浄条件を、洗浄溶液中の塩濃度を下げる
ことによりおよび／または洗浄が実施される温度を上げることにより、さらに厳格にする
ことができる。単に例として、高いストリンジェンシー条件は、典型的には、６５℃にお
ける０．２×ＳＳＣ中の膜の洗浄を含む。
それに加えて、ハイブリッド形成量の読み取りは、例えば、標識されたオリゴヌクレオ
チドプローブの特異的活性、プローブがハイブリッドしたテンプレート核酸上のプローブ
－結合部位の数により、およびオートラジオグラフの露出または他の検出媒体の量により
影響され得る。任意の数のハイブリッド形成および洗浄条件を、プローブの核酸分子の固
定化された目標核酸に対するハイブリッド形成を検査するために使用することができるが
、同一のハイブリッド形成、洗浄、および露出条件下でプローブの目標核酸に対するハイ
ブリッド形成を検査することがより重要であることは、当業者により容易に認識されるで
あろう。目標核酸は同じ膜上にあることが好ましい。
チドプローブの特異的活性、プローブがハイブリッドしたテンプレート核酸上のプローブ
－結合部位の数により、およびオートラジオグラフの露出または他の検出媒体の量により
影響され得る。任意の数のハイブリッド形成および洗浄条件を、プローブの核酸分子の固
定化された目標核酸に対するハイブリッド形成を検査するために使用することができるが
、同一のハイブリッド形成、洗浄、および露出条件下でプローブの目標核酸に対するハイ
ブリッド形成を検査することがより重要であることは、当業者により容易に認識されるで
あろう。目標核酸は同じ膜上にあることが好ましい。
核酸分子は、核酸に対するハイブリッド形成が、別の核酸に対するハイブリッド形成の
少なくとも５倍（例えば、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍
、または１００倍）を超えれば、ある核酸とハイブリッドを形成しているのであって別の
核酸とはハイブリッドを形成していないと考えられる。ハイブリッドの形成量は、膜上で
直接または、例えば、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒまたはＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用するオート
ラジオグラフから定量することができる。
少なくとも５倍（例えば、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍
、または１００倍）を超えれば、ある核酸とハイブリッドを形成しているのであって別の
核酸とはハイブリッドを形成していないと考えられる。ハイブリッドの形成量は、膜上で
直接または、例えば、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒまたはＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用するオート
ラジオグラフから定量することができる。
ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチド
を検出する技法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、
免疫沈殿法および免疫蛍光法が含まれる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル
であり得る。ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体は、当技術分野におい
て周知の方法を使用して生成させることができる。抗体は、当技術分野において知られた
方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体の支持体に付着させることができ
る。ポリペプチドの存在下で、抗体－ポリペプチド複合体が形成される。
を検出する技法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、
免疫沈殿法および免疫蛍光法が含まれる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル
であり得る。ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体は、当技術分野におい
て周知の方法を使用して生成させることができる。抗体は、当技術分野において知られた
方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体の支持体に付着させることができ
る。ポリペプチドの存在下で、抗体－ポリペプチド複合体が形成される。
検出（例えば、増幅生成物、ハイブリッド形成複合体、またはポリペプチドの検出）は
、通常、検出可能な標識を使用して達成される。用語「標識」は、直接標識ならびに間接
標識の使用を包含することが意図される。検出可能な標識には、酵素、補欠分子族、蛍光
性材料、発光性材料、生物発光材料、および放射性材料が含まれる。
、通常、検出可能な標識を使用して達成される。用語「標識」は、直接標識ならびに間接
標識の使用を包含することが意図される。検出可能な標識には、酵素、補欠分子族、蛍光
性材料、発光性材料、生物発光材料、および放射性材料が含まれる。
選択のための配列を欠く（即ち、選択可能なマーカーを欠く）株を発生させるために使
用することができる方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、環状のプラスミド
ＤＮＡベクターおよび線状ＤＮＡ配列の使用を含み；環状のプラスミドＤＮＡベクターは
、選択マーカーおよびＤＮＡの複製起点（自律的に複製する配列（ＡＲＳ）としても知ら
れる）を含有し、線状ＤＮＡ配列は、相同性組換えによりピキア（Pichia）のゲノム中に
組み込むための配列を含有する。それに加えて、線状ＤＮＡ分子は、１種または複数の関
心のあるタンパク質、例えば、限定されないが、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、
フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、ト
ランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、低分子、例えば、エタノール、乳酸、ブタノール、ア
ジピン酸またはコハク酸などの産生経路に関与する１種または複数の酵素、または任意の
そのようなタンパク質に対する抗体をコードする核酸配列を含むことができる。
用することができる方法が、本明細書に記載される。これらの方法は、環状のプラスミド
ＤＮＡベクターおよび線状ＤＮＡ配列の使用を含み；環状のプラスミドＤＮＡベクターは
、選択マーカーおよびＤＮＡの複製起点（自律的に複製する配列（ＡＲＳ）としても知ら
れる）を含有し、線状ＤＮＡ配列は、相同性組換えによりピキア（Pichia）のゲノム中に
組み込むための配列を含有する。それに加えて、線状ＤＮＡ分子は、１種または複数の関
心のあるタンパク質、例えば、限定されないが、ヘムが結合したＬｅｇＨ、デヒドリン、
フィターゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、ト
ランスグルタミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、低分子、例えば、エタノール、乳酸、ブタノール、ア
ジピン酸またはコハク酸などの産生経路に関与する１種または複数の酵素、または任意の
そのようなタンパク質に対する抗体をコードする核酸配列を含むことができる。
ピキア（Pichia）細胞は、ＤＮＡ分子および環状のプラスミド上の選択可能なマーカー
の存在により選択された形質転換体の両方により形質転換され得る。次に、線状ＤＮＡ分
子をゲノムに組み込むために、形質転換体を、例えばＰＣＲを使用して選別することがで
きる。マーカーを含まない線状ＤＮＡ分子が正しく組み込まれた形質転換体が同定された
ら、細胞は、環状のプラスミドのための選択の不在下で成長され得る。マーカーを担持す
るプラスミドは、選択の不在下では安定に維持されないので、該プラスミドは、選択が緩
和された後しばしば非常に速やかに消失する。生じた株は、選択のための異種配列の不在
下で組み込まれた線状ＤＮＡを担持する。それ故、この手法は、組換えタンパク質収率に
対する影響が殆どないし全くなしで、選択可能なマーカー（例えば、異種選択マーカー）
を欠くピキア（Pichia）株を構築するために使用することができる。
の存在により選択された形質転換体の両方により形質転換され得る。次に、線状ＤＮＡ分
子をゲノムに組み込むために、形質転換体を、例えばＰＣＲを使用して選別することがで
きる。マーカーを含まない線状ＤＮＡ分子が正しく組み込まれた形質転換体が同定された
ら、細胞は、環状のプラスミドのための選択の不在下で成長され得る。マーカーを担持す
るプラスミドは、選択の不在下では安定に維持されないので、該プラスミドは、選択が緩
和された後しばしば非常に速やかに消失する。生じた株は、選択のための異種配列の不在
下で組み込まれた線状ＤＮＡを担持する。それ故、この手法は、組換えタンパク質収率に
対する影響が殆どないし全くなしで、選択可能なマーカー（例えば、異種選択マーカー）
を欠くピキア（Pichia）株を構築するために使用することができる。
本発明により、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、生化学的技法および
組換えＤＮＡ技法が使用され得る。そのような技法は、文献で十分に説明されている。本
発明を、以下の例でさらに説明することにするが、これらの例は、請求項に記載された方
法および組成物の範囲を限定しない。
組換えＤＮＡ技法が使用され得る。そのような技法は、文献で十分に説明されている。本
発明を、以下の例でさらに説明することにするが、これらの例は、請求項に記載された方
法および組成物の範囲を限定しない。
パートＡ 材料および方法
実施例１ ポリメラーゼ連鎖反応
ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡテンプレートから関心のある遺伝子を、Ｐｈｕｓ
ｉｏｎ Ｈｉ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。簡単に説明すると、各々０．６μＭのフォワードおよ
びリバースプライマーを、１～２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、
１０～５０ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび４００μＭのヌクレオチドの混合物とインキ
ュベートする。反応条件は以下のようであった。
ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡテンプレートから関心のある遺伝子を、Ｐｈｕｓ
ｉｏｎ Ｈｉ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。簡単に説明すると、各々０．６μＭのフォワードおよ
びリバースプライマーを、１～２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、
１０～５０ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび４００μＭのヌクレオチドの混合物とインキ
ュベートする。反応条件は以下のようであった。
実施例２ 連結によるプラスミド構築
５０～１００ｎｇの制限酵素で消化されたプラスミドおよび３×モル過剰のＰＣＲで増
幅された挿入物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）
の存在下でインキュベートした。連結を１６℃で２時間を超える間実施した。２μｌの連
結反応物はＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）細胞に形質転換された
。
５０～１００ｎｇの制限酵素で消化されたプラスミドおよび３×モル過剰のＰＣＲで増
幅された挿入物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）
の存在下でインキュベートした。連結を１６℃で２時間を超える間実施した。２μｌの連
結反応物はＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）細胞に形質転換された
。
実施例３ 大腸菌（E. coli）ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性コ
ンピテント細胞への形質転換
１．５～２μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１
ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３－０１５
）に、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する電気穿
孔により、１ｍｍギャップキュベット（ＢｉｏＲａｄ、カタログ＃１６５－２０８９）を
使用して形質転換した。パルスの後１ｍｌのＳＯＣを細胞に加えて、細胞を３７℃で１時
間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシ
リンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬＢ寒天プレート上にプレートした。プレート
を終夜３７℃でインキュベートした。
ンピテント細胞への形質転換
１．５～２μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１
ファージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３－０１５
）に、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する電気穿
孔により、１ｍｍギャップキュベット（ＢｉｏＲａｄ、カタログ＃１６５－２０８９）を
使用して形質転換した。パルスの後１ｍｌのＳＯＣを細胞に加えて、細胞を３７℃で１時
間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシ
リンを１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬＢ寒天プレート上にプレートした。プレート
を終夜３７℃でインキュベートした。
実施例４ Ｐ．パストリス（P. pastoris）への形質転換のためのプラスミドＤＮＡの線
状化
プラスミドＤＮＡを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５６０Ｌ）で１～４時間
３７℃、または１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１２３Ｌ）で１～４時間５０℃の
いずれかで消化した。線状化されたプラスミドを、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏ
ｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００２
）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
状化
プラスミドＤＮＡを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５６０Ｌ）で１～４時間
３７℃、または１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中のＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１２３Ｌ）で１～４時間５０℃の
いずれかで消化した。線状化されたプラスミドを、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏ
ｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００２
）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
実施例５ Ｐ．パストリス（P. pastoris）形質転換コンピテント細胞の調製
Ｐ．パストリス（P. pastoris）の選択された株を、２５ｍｌのＹＰＤ培地中で中期指
数期の成長相（約２ＯＤ）に成長させた。細胞を９３０×ｇで１５分間の遠心分離により
収集した。細胞ペレットを８０％ＹＰＤおよび２００ｍＭ ＨＥＰＥＳの２ｍｌの溶液（
ｐＨ６．８）中に再懸濁させた。７５μｌの１Ｍ ＤＴＴを加えた。再懸濁された細胞ペ
レットを１００ｒｐｍ、３０℃で２５分間混合した。４０ｍｌの体積の氷冷滅菌水を懸濁
液に加えて、細胞を１１２５×ｇで１５分間遠心分離することにより収集して氷上に置い
た。細胞ペレットを、４０ｍｌの氷冷水中に再懸濁させて収集した後、２回の洗浄ステッ
プを追加した。次に、細胞ペレットを、２０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール中に再懸濁して
、前のように遠心分離により収集した。最終の細胞ペレットを、０．３ｍｌの氷冷、滅菌
ソルビトール中に懸濁させて等分し、－８０℃で凍結させた。
Ｐ．パストリス（P. pastoris）の選択された株を、２５ｍｌのＹＰＤ培地中で中期指
数期の成長相（約２ＯＤ）に成長させた。細胞を９３０×ｇで１５分間の遠心分離により
収集した。細胞ペレットを８０％ＹＰＤおよび２００ｍＭ ＨＥＰＥＳの２ｍｌの溶液（
ｐＨ６．８）中に再懸濁させた。７５μｌの１Ｍ ＤＴＴを加えた。再懸濁された細胞ペ
レットを１００ｒｐｍ、３０℃で２５分間混合した。４０ｍｌの体積の氷冷滅菌水を懸濁
液に加えて、細胞を１１２５×ｇで１５分間遠心分離することにより収集して氷上に置い
た。細胞ペレットを、４０ｍｌの氷冷水中に再懸濁させて収集した後、２回の洗浄ステッ
プを追加した。次に、細胞ペレットを、２０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトール中に再懸濁して
、前のように遠心分離により収集した。最終の細胞ペレットを、０．３ｍｌの氷冷、滅菌
ソルビトール中に懸濁させて等分し、－８０℃で凍結させた。
実施例６ Ｐ．パストリス（P. pastoris）への形質転換
３０～１００ｎｇの線状化されたプラスミドＤＮＡを、３０μｌのエレクトロコンピテ
ントＰ．パストリス（P. pastoris）細胞に、１ｍｍギャップのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキ
ュベット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して１．１５ｋＶに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂ
ｉｏＲａｄ）を用いて形質転換した。１ｍｌのＹＰＤ／１Ｍソルビトールを加えて細胞と
１：１比で混合した。細胞を３時間３０℃、１００ｒｐｍで振盪しながら回復させた。１
００μｌの回復混合物を、適当な抗生物質を含有するＹＰＤプレートにプレートして、細
胞の残りを適当な抗生物質を含むＹＰＤプレートにプレートした。プレートを、３０℃で
４８時間インキュベートした。最初の形質転換プレートを、適当な抗生物質を含むＹＰＤ
プレート上に画線して、プレートを４８時間３０℃でインキュベートした。個々のクロー
ンを抗生物質を含むＹＰＤプレート上にパッチ状に付けて、パッチを使用してコロニーＰ
ＣＲまたはゲノムＤＮＡ調製を行い、染色体への組込みを確認して、さらに分析するため
に該株を振盪フラスコ中で成長させた。
３０～１００ｎｇの線状化されたプラスミドＤＮＡを、３０μｌのエレクトロコンピテ
ントＰ．パストリス（P. pastoris）細胞に、１ｍｍギャップのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキ
ュベット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して１．１５ｋＶに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（Ｂ
ｉｏＲａｄ）を用いて形質転換した。１ｍｌのＹＰＤ／１Ｍソルビトールを加えて細胞と
１：１比で混合した。細胞を３時間３０℃、１００ｒｐｍで振盪しながら回復させた。１
００μｌの回復混合物を、適当な抗生物質を含有するＹＰＤプレートにプレートして、細
胞の残りを適当な抗生物質を含むＹＰＤプレートにプレートした。プレートを、３０℃で
４８時間インキュベートした。最初の形質転換プレートを、適当な抗生物質を含むＹＰＤ
プレート上に画線して、プレートを４８時間３０℃でインキュベートした。個々のクロー
ンを抗生物質を含むＹＰＤプレート上にパッチ状に付けて、パッチを使用してコロニーＰ
ＣＲまたはゲノムＤＮＡ調製を行い、染色体への組込みを確認して、さらに分析するため
に該株を振盪フラスコ中で成長させた。
実施例７ ＬｅｇＨの産生のための振盪フラスコ中における培養物の成長
新鮮パッチからの株を、成長培地ＢＭＧＹ（０．７５％グリセロールで補完されたＢＭ
Ｙ）に接種して、終夜３０℃、２００ｒｐｍで振盪して成長させた。翌日、ＬｅｇＨの発
現を、ＯＮ培養物を０．１ｍＭクエン酸アンモニウムＦｅ（ＩＩＩ）で補完されたＢＭＭ
Ｙ培地（ＢＭＹ＋１％メタノール）で希釈することによりメタノールで誘導した。培養物
をＯＤ６００が０．５～０．７になるまで成長させた。消泡剤を最終の濃度が０．０１％
になるまで加えた。培養物を合計で７２時間成長させ；培養物にメタノールを、２４時間
毎に振盪フラスコ体積の１／１０の１０×ＢＭＭＹ培地（ＢＭＹ＋１０％メタノール）を
加えることにより補完した。細胞を、誘導された成長の７２時間後に遠心分離により収穫
した。
新鮮パッチからの株を、成長培地ＢＭＧＹ（０．７５％グリセロールで補完されたＢＭ
Ｙ）に接種して、終夜３０℃、２００ｒｐｍで振盪して成長させた。翌日、ＬｅｇＨの発
現を、ＯＮ培養物を０．１ｍＭクエン酸アンモニウムＦｅ（ＩＩＩ）で補完されたＢＭＭ
Ｙ培地（ＢＭＹ＋１％メタノール）で希釈することによりメタノールで誘導した。培養物
をＯＤ６００が０．５～０．７になるまで成長させた。消泡剤を最終の濃度が０．０１％
になるまで加えた。培養物を合計で７２時間成長させ；培養物にメタノールを、２４時間
毎に振盪フラスコ体積の１／１０の１０×ＢＭＭＹ培地（ＢＭＹ＋１０％メタノール）を
加えることにより補完した。細胞を、誘導された成長の７２時間後に遠心分離により収穫
した。
実施例８ 振盪フラスコ培地
ＢＭＹ培地は、１０ｇの酵母抽出物および２０ｇのソイトンを７９０ｍｌの水に溶解す
ることにより調製した。該混合物をオートクレーブにより滅菌して、室温に冷却した。１
００ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および１００ｍｌのアミノ酸を含ま
ない１０×酵母窒素ベース（１００ｍＬ当たり１３．４ｇのＹＮＢ粉末；Ｓｉｇｍａ－Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径のＰＥＳ）該培地に加えた。ｐＨ調節の
必要はない
ＢＭＹ培地は、１０ｇの酵母抽出物および２０ｇのソイトンを７９０ｍｌの水に溶解す
ることにより調製した。該混合物をオートクレーブにより滅菌して、室温に冷却した。１
００ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および１００ｍｌのアミノ酸を含ま
ない１０×酵母窒素ベース（１００ｍＬ当たり１３．４ｇのＹＮＢ粉末；Ｓｉｇｍａ－Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径のＰＥＳ）該培地に加えた。ｐＨ調節の
必要はない
実施例９ 発酵培地および仕込み
下に示した成分を溶解して体積を水で調節した。成分はＦＣＣ食品規格であるかまたは
同等であった。培地をオートクレーブにより、その場でスチーム処理することにより、ま
たは同等の手段により滅菌した。
下に示した成分を溶解して体積を水で調節した。成分はＦＣＣ食品規格であるかまたは
同等であった。培地をオートクレーブにより、その場でスチーム処理することにより、ま
たは同等の手段により滅菌した。
カタログ番号４０５２－Ａ－Ｂ－１Ｌ）として入手できる。ポーチＡおよびポーチＢを９
５０ｍＬの水中で混合して、５ｍＬの硫酸を添加した。若干の沈殿が混合で予想され；混
合物を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径のＰＥＳ）、４℃で暗所に貯蔵した。
４０００を３２０ｍＬの水と混合して攪拌し溶解させることにより、グリセロール供給混
合物を調製した。水とＡｍｂｅｒｆｅｒｍの混合物を８５０ｇのグリセロールに加えて激
しく攪拌することにより十分に混合した。該供給混合物をオートクレーブにより滅菌した
。
ールを使用して行なった。
実施例１０ 実験室規模の高酸素移動発酵のためのプロトコル
播種振盪フラスコのプロトコル
無菌バイオセーフティフード中で、低浸透圧モル濃度培地とＢＭＹを、９：１の低オス
モ：ＢＭＹ比で混合した。グリセロールを、１２．５ｇ／Ｌの濃度で培地に加えた。ＵＳ
Ｐ食品規格のグリセロール／グリセリン（５０％ｖ／ｖ（６３％ｗ／ｗ）グリセロール／
水溶液中９９．７％の純度）を使用して、オートクレーブ滅菌した。Ｓｉｇｍａ２０４ま
たは同等の消泡剤を培地に０．２５ｍＬ／Ｌの濃度で加えた。グリセロール播種バイアル
を取り出して、７０％ＩＰＡまたはエタノールで外側に噴霧し、バイオセーフティフード
内で約５分間室温で解凍した。遮壁板付き振盪フラスコにグリセロール播種バイアルで接
種した；１ｍＬの接種原バイアルを１Ｌの振盪フラスコ培地毎に使用した。培養物を３０
℃で２４時間振盪（１インチの振り（１”throw）で２００ＲＰＭ）しながら成長させた
。実際の培地体積：名目上の振盪フラスコ体積の比は１：１０と１：５の間を使用した。
名目上２．８Ｌの体積のフラスコに２５０から５００ｍＬの培地を入れて、定型的手順で
首尾よく使用した。２４時間成長させた後６００ｎｍにおけるＯＤを測定した。ＯＤが１
５以上であった場合に、培養物を発酵槽に接種するために使用した。ＯＤが１５未満であ
った場合には、培養物をさらに１～２時間成長させてからＯＤを再び決定した。１５のＯ
Ｄが１５から３０時間後に到達されなかった場合には、その播種フラスコは不成功であっ
たとみなした。
播種振盪フラスコのプロトコル
無菌バイオセーフティフード中で、低浸透圧モル濃度培地とＢＭＹを、９：１の低オス
モ：ＢＭＹ比で混合した。グリセロールを、１２．５ｇ／Ｌの濃度で培地に加えた。ＵＳ
Ｐ食品規格のグリセロール／グリセリン（５０％ｖ／ｖ（６３％ｗ／ｗ）グリセロール／
水溶液中９９．７％の純度）を使用して、オートクレーブ滅菌した。Ｓｉｇｍａ２０４ま
たは同等の消泡剤を培地に０．２５ｍＬ／Ｌの濃度で加えた。グリセロール播種バイアル
を取り出して、７０％ＩＰＡまたはエタノールで外側に噴霧し、バイオセーフティフード
内で約５分間室温で解凍した。遮壁板付き振盪フラスコにグリセロール播種バイアルで接
種した；１ｍＬの接種原バイアルを１Ｌの振盪フラスコ培地毎に使用した。培養物を３０
℃で２４時間振盪（１インチの振り（１”throw）で２００ＲＰＭ）しながら成長させた
。実際の培地体積：名目上の振盪フラスコ体積の比は１：１０と１：５の間を使用した。
名目上２．８Ｌの体積のフラスコに２５０から５００ｍＬの培地を入れて、定型的手順で
首尾よく使用した。２４時間成長させた後６００ｎｍにおけるＯＤを測定した。ＯＤが１
５以上であった場合に、培養物を発酵槽に接種するために使用した。ＯＤが１５未満であ
った場合には、培養物をさらに１～２時間成長させてからＯＤを再び決定した。１５のＯ
Ｄが１５から３０時間後に到達されなかった場合には、その播種フラスコは不成功であっ
たとみなした。
発酵のプロトコル
発酵培地および供給材料は、本明細書に記載したように調製した。初期体積は、最大発
酵槽体積の約４０％、例えば、発酵槽の最大実効体積が１０Ｌであれば４Ｌであるべきで
ある。これは、プロセスが発酵の終期までに最大実効体積に近づくであろうからである。
発酵槽は、振盪フラスコ播種で発酵槽に対して１０％接種原の比で接種され、例えば、４
Ｌの初期培地が発酵槽中に存在すれば、発酵槽は、約０．４Ｌの振盪フラスコ播種により
接種される。この時点における発酵槽中の合計体積をＴ０体積と称し、例えばこの代表的
例では４．４Ｌである。プロセス制御は以下の条件を含む：３０℃の温度；２０％飽和設
定点を維持するために攪拌－給気カスケードにより導かれる溶存酸素制御；および２８％
ＮＨ４ＯＨの添加により導かれるｐＨ制御、設定点は、プロセスの相に依存するであろう
。
発酵培地および供給材料は、本明細書に記載したように調製した。初期体積は、最大発
酵槽体積の約４０％、例えば、発酵槽の最大実効体積が１０Ｌであれば４Ｌであるべきで
ある。これは、プロセスが発酵の終期までに最大実効体積に近づくであろうからである。
発酵槽は、振盪フラスコ播種で発酵槽に対して１０％接種原の比で接種され、例えば、４
Ｌの初期培地が発酵槽中に存在すれば、発酵槽は、約０．４Ｌの振盪フラスコ播種により
接種される。この時点における発酵槽中の合計体積をＴ０体積と称し、例えばこの代表的
例では４．４Ｌである。プロセス制御は以下の条件を含む：３０℃の温度；２０％飽和設
定点を維持するために攪拌－給気カスケードにより導かれる溶存酸素制御；および２８％
ＮＨ４ＯＨの添加により導かれるｐＨ制御、設定点は、プロセスの相に依存するであろう
。
バッチ相（接種からグリセロールの消耗まで、ＤＯスパイクにより示される）：溶存酸
素のＰＩＤ制御の応答性に依存して、攪拌－給気速度における強いＤＯスパイクもしくは
急速な低下または両方の組合せは、細胞が培地中に存在するグリセロールを消費し尽くし
たときに観察され得る。供給されるバッチ相は、このことが起こるときに開始される。バ
ッチ相の持続時間は、約２０時間であるが、２４時間までが許容されると考えられる。ｐ
Ｈ設定点は５．０である。バッチ相の終期における湿潤細胞重量は、約２２０ｇ／Ｌであ
ろう。
素のＰＩＤ制御の応答性に依存して、攪拌－給気速度における強いＤＯスパイクもしくは
急速な低下または両方の組合せは、細胞が培地中に存在するグリセロールを消費し尽くし
たときに観察され得る。供給されるバッチ相は、このことが起こるときに開始される。バ
ッチ相の持続時間は、約２０時間であるが、２４時間までが許容されると考えられる。ｐ
Ｈ設定点は５．０である。バッチ相の終期における湿潤細胞重量は、約２２０ｇ／Ｌであ
ろう。
供給されるバッチ相：グリセロールの供給が開始されて、Ｔ０体積に基づいて１２～１
４ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに達する。供給速度（federate）は、約３５０ｇ
／Ｌ湿潤細胞重量に達するまで維持されて、それには、約７～１０時間を要するであろう
。ｐＨ設定点は５．０である。
４ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに達する。供給速度（federate）は、約３５０ｇ
／Ｌ湿潤細胞重量に達するまで維持されて、それには、約７～１０時間を要するであろう
。ｐＨ設定点は５．０である。
移行相：試料は、移行相を開始する前に採取される。メタノール供給は、開始されて、
発酵ブロス中でメタノール濃度が１～２ｇ／Ｌに達するまで、Ｔ０体積に基づいて無希釈
のメタノールの１ｇ／Ｌ／時間を達成した。発酵の残りの間、ブロス中で０．２５～１ｇ
／Ｌのメタノール濃度を維持するように、メタノール供給速度を調節した。グリセロール
供給速度（federate）は、２時間の過程を通じて、Ｔ０体積に基づいて１２～１４ｇ／Ｌ
／時間から８～９ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールに直線的に減少した。供給速度にお
ける２０分毎の段階的減少も同様に許容されるであろう。ｐＨ設定点は、３．５に変えら
れて、発酵は新しい設定点に自然に（即ち、酸の添加なしで）調節されることが可能にな
った。
発酵ブロス中でメタノール濃度が１～２ｇ／Ｌに達するまで、Ｔ０体積に基づいて無希釈
のメタノールの１ｇ／Ｌ／時間を達成した。発酵の残りの間、ブロス中で０．２５～１ｇ
／Ｌのメタノール濃度を維持するように、メタノール供給速度を調節した。グリセロール
供給速度（federate）は、２時間の過程を通じて、Ｔ０体積に基づいて１２～１４ｇ／Ｌ
／時間から８～９ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールに直線的に減少した。供給速度にお
ける２０分毎の段階的減少も同様に許容されるであろう。ｐＨ設定点は、３．５に変えら
れて、発酵は新しい設定点に自然に（即ち、酸の添加なしで）調節されることが可能にな
った。
産生相（グリセロール供給の削減の終わりから発酵の終わりまで）：ｐＨ設定点は３．
５であった。発酵ブロス中でメタノール濃度を０．２５～１ｇ／Ｌに維持した。グリセロ
ールの供給速度を、Ｔ０体積に基づいて８～９ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに維
持した。試料を約１２時間毎に採取した。試料を４℃で４０００から７０００ＲＣＦでス
ピンし、上清をデカントした。上清を分離管に取っておいた。各時点におけるペレットお
よび５ｍＬの上清の３つの試料を－８０℃で凍結した。容器のための最大給気および攪拌
速度でさえ、産生中１５～２０％ＤＯが維持できないならば、グリセロール供給速度をＴ
０体積に基づいて５ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールまで低下させることができる。発
酵は、接種後６０時間で終了した。１０００Ｌの規模では、収穫プロセスは、原料供給お
よび給気を停止すること、ブロスを８℃に冷却すること、シャープレスまたはディスクス
タック遠心分離機を使用してペーストを濃縮することからなった。収穫には、通常約５～
１０時間かかり、検出可能な生成物の品質低下を招かない。実験室規模については、３×
５ｍＬの試料に加えて、最後に追加の５０ｍＬ試料を収集すれば十分である。湿潤細胞重
量は＞４５０ｇ／Ｌであり、より白色に見えた予備的導入試料からスピンしたペレットに
対して、スピンしたペレットはピンクに見えた。白色からより顕著なピンクへのブロスの
色変化は、誘導の約６～１２時間の後で始まった。
５であった。発酵ブロス中でメタノール濃度を０．２５～１ｇ／Ｌに維持した。グリセロ
ールの供給速度を、Ｔ０体積に基づいて８～９ｇ／Ｌ／時間の無希釈のグリセロールに維
持した。試料を約１２時間毎に採取した。試料を４℃で４０００から７０００ＲＣＦでス
ピンし、上清をデカントした。上清を分離管に取っておいた。各時点におけるペレットお
よび５ｍＬの上清の３つの試料を－８０℃で凍結した。容器のための最大給気および攪拌
速度でさえ、産生中１５～２０％ＤＯが維持できないならば、グリセロール供給速度をＴ
０体積に基づいて５ｇ／Ｌ／時間の無希釈グリセロールまで低下させることができる。発
酵は、接種後６０時間で終了した。１０００Ｌの規模では、収穫プロセスは、原料供給お
よび給気を停止すること、ブロスを８℃に冷却すること、シャープレスまたはディスクス
タック遠心分離機を使用してペーストを濃縮することからなった。収穫には、通常約５～
１０時間かかり、検出可能な生成物の品質低下を招かない。実験室規模については、３×
５ｍＬの試料に加えて、最後に追加の５０ｍＬ試料を収集すれば十分である。湿潤細胞重
量は＞４５０ｇ／Ｌであり、より白色に見えた予備的導入試料からスピンしたペレットに
対して、スピンしたペレットはピンクに見えた。白色からより顕著なピンクへのブロスの
色変化は、誘導の約６～１２時間の後で始まった。
パートＢ 産生株の構築
産生株ＭＸＹ０１８３
実施例１１ ヘム生合成経路の各酵素のｐＧＡＮまたはｐＧＡＺ組込み型ベクターへのク
ローニング
ｐＧＡＮ（天然の選択マーカーを有する）およびｐＧＡＺ（ゼオシン選択マーカーを有
する）を、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入し
た。各遺伝子をＡＯＸ１プロモーターの制御下に置いて、ＦＤＨターミネーターを各遺伝
子の停止コドンの直後に置いた。ヘム生合成経路中の遺伝子を、野性型Ｐ．パストリス（
P. pastoris）株からＰＣＲで増幅させるかまたは前の構築物からサブクローニングした
。
産生株ＭＸＹ０１８３
実施例１１ ヘム生合成経路の各酵素のｐＧＡＮまたはｐＧＡＺ組込み型ベクターへのク
ローニング
ｐＧＡＮ（天然の選択マーカーを有する）およびｐＧＡＺ（ゼオシン選択マーカーを有
する）を、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入し
た。各遺伝子をＡＯＸ１プロモーターの制御下に置いて、ＦＤＨターミネーターを各遺伝
子の停止コドンの直後に置いた。ヘム生合成経路中の遺伝子を、野性型Ｐ．パストリス（
P. pastoris）株からＰＣＲで増幅させるかまたは前の構築物からサブクローニングした
。
ヘムの生合成に関与する酵素を含むヘム生合成経路を図１に示す。ヘムの生合成中に産
生される中間体を囲みの中に示し、酵素が触媒する各ステップを右に示す。Ｓ．セレビジ
アエ（S.cerevisiae）で示される律速の酵素ステップは、下線付きで示す。
生される中間体を囲みの中に示し、酵素が触媒する各ステップを右に示す。Ｓ．セレビジ
アエ（S.cerevisiae）で示される律速の酵素ステップは、下線付きで示す。
ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデ
カルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼおよびＰＰＧオキシダーゼ遺伝子を、制限エンド
ヌクレアーゼＢｓａＩによる認識のための部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増
幅した。オリゴヌクレオチドはＥｌｉｍＢｉｏｐｈａｒｍにより合成された。
カルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼおよびＰＰＧオキシダーゼ遺伝子を、制限エンド
ヌクレアーゼＢｓａＩによる認識のための部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増
幅した。オリゴヌクレオチドはＥｌｉｍＢｉｏｐｈａｒｍにより合成された。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、ゲノムＤＮＡからの遺伝子を
増大させるために使用した。ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔｏｒ－５（カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製され、ＤＮＡを２５μｌのＨ２
Ｏに溶出させた。ベクターＤＮＡ、ｐＧＡＺおよびｐＧＡＮ、およびＰＣＲ生成物を、Ｂ
ｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５３５Ｓ）を用いて
５０μｌの反応体積中、３７℃で消化した。
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、ゲノムＤＮＡからの遺伝子を
増大させるために使用した。ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔｏｒ－５（カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製され、ＤＮＡを２５μｌのＨ２
Ｏに溶出させた。ベクターＤＮＡ、ｐＧＡＺおよびｐＧＡＮ、およびＰＣＲ生成物を、Ｂ
ｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０５３５Ｓ）を用いて
５０μｌの反応体積中、３７℃で消化した。
線状化されたベクターおよび消化されたＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースゲルから
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈカタログ＃Ｄ４００２）を使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出さ
せた。連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、
カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して終夜１６℃で１０μｌ中で生じさせた。
Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈカタログ＃Ｄ４００２）を使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出さ
せた。連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、
カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して終夜１６℃で１０μｌ中で生じさせた。
ＰＢＤおよびフェロキラターゼ遺伝子を、前に構築されたプラスミドからサブクローニ
ングした。ｐＪＡＺ＿ＰＢＤは、ＢｓｔＢＩ（Ｂｓｐ１１９Ｉ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０１２４）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆ
Ｄ０５９６）を用いて、１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。
ｐＪＡＺ＿ Ｆｅｒｒｏｃｈは、ＭｆｅＩ（ＭｕｎＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ、ＦＤ０７５３）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０５９６
）を用いて１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。
ングした。ｐＪＡＺ＿ＰＢＤは、ＢｓｔＢＩ（Ｂｓｐ１１９Ｉ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０１２４）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆ
Ｄ０５９６）を用いて、１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。
ｐＪＡＺ＿ Ｆｅｒｒｏｃｈは、ＭｆｅＩ（ＭｕｎＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ、ＦＤ０７５３）およびＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＤ０５９６
）を用いて１×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液中５分間３７℃で消化した。
消化された生成物を、０．８％アガロースゲルからＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮ
Ａ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ＃Ｄ４００２）を
使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
Ａ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ＃Ｄ４００２）を
使用して精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
連結反応を、１６℃で終夜Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬ
ａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌの反応で生じさせた。
ａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌの反応で生じさせた。
１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファ
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３～０１５）に
１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔によ
り形質転換し、細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で
インキュベートした。１０μｌの回収された混合物を、アンピシリンを濃度１００μｇ／
ｍｌで含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベー
トした。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲによって選別した。遺伝子の
配列を確認した。
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３～０１５）に
１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔によ
り形質転換し、細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で
インキュベートした。１０μｌの回収された混合物を、アンピシリンを濃度１００μｇ／
ｍｌで含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベー
トした。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲによって選別した。遺伝子の
配列を確認した。
実施例１２ Ｐ．パストリス（P. pastoris）ｍｕｔＳゲノムに組み込むためのプラスミ
ドにおけるヘム生合成遺伝子の組み立て
全カセット「プロモーター遺伝子ターミネーター」を、ピキア（Pichia）ゲノムに組み
込むためのプラスミドを組み立てるために、制限エンドヌクレアーゼのための部位を含有
するプライマーでＰＣＲ増幅した。
ドにおけるヘム生合成遺伝子の組み立て
全カセット「プロモーター遺伝子ターミネーター」を、ピキア（Pichia）ゲノムに組み
込むためのプラスミドを組み立てるために、制限エンドヌクレアーゼのための部位を含有
するプライマーでＰＣＲ増幅した。
ｐＧＡＮプラスミド（ｐＭｘ３２７）におけるＰａｏｘ１＿ＵＰＳ＿ＦＤＨｔｅｒｍ－
Ｐａｏｘ１＿ＵＰＤ＿ＦＤＨｔｅｒｍ－Ｐａｏｘ１＿ＣＰＯ＿ＦＤＨｔｅｒｍの組み立て
ｐＧＡＮ－ＣＰＧオキシダーゼ（ｐＭｘ３１２）をＵＰＳおよびＵＰＤカセットをクロ
ーニングするためのベクターとして使用した。ＵＰＧＩＩＩシンターゼカセットを、ｐＭ
ｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＮｈｅＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含
有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣ
Ｒ増幅した。
Ｐａｏｘ１＿ＵＰＤ＿ＦＤＨｔｅｒｍ－Ｐａｏｘ１＿ＣＰＯ＿ＦＤＨｔｅｒｍの組み立て
ｐＧＡＮ－ＣＰＧオキシダーゼ（ｐＭｘ３１２）をＵＰＳおよびＵＰＤカセットをクロ
ーニングするためのベクターとして使用した。ＵＰＧＩＩＩシンターゼカセットを、ｐＭ
ｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応してＮｈｅＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含
有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣ
Ｒ増幅した。
ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットを、ｐＭｘ３１１から、制限エンドヌクレア
ーゼに対応してＳｐｈＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤ
Ｈ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ーゼに対応してＳｐｈＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤ
Ｈ１ターミネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を使用してプラスミドからＤＮＡ
を増幅した。
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を使用してプラスミドからＤＮＡ
を増幅した。
得られたＰＣＲ生成物を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（
Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し、ＤＮＡを２５
μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し、ＤＮＡを２５
μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ベクターとして指定されたｐＧＡＮ－ＣＰＧオキシダーゼ（ｐＭｘ３１２）を、１×Ｃ
ｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＮｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、
カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａ
ｂｓ、カタログ＃Ｒ３５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＮｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、
カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａ
ｂｓ、カタログ＃Ｒ３５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ＵＰＧＩＩＩシンターゼカセットのＰＣＲ生成物を１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中でＮ
ｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）お
よびＳｐｈＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２
Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１３１Ｓ）お
よびＳｐｈＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２
Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットＰＣＲ生成物を１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
中でＳｐｈＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２
Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３
５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
中でＳｐｈＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３１８２
Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３
５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
消化されたベクターおよびＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースからＺｙｍｏｃｌｅａ
ｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ
＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ
＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ＮｈｅＩ－ＳｐｈＩで消化されたＵＰＧＩＩＩシンターゼカセット、ＳｐｈＩ－Ａｇｅ
Ｉで消化されたＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットおよびＮｈｅＩ－ＡｇｅＩで消
化されたベクターの間の３方連結を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌ中に１６℃で終夜生じ
させた。
Ｉで消化されたＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼカセットおよびＮｈｅＩ－ＡｇｅＩで消
化されたベクターの間の３方連結を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、１０μｌ中に１６℃で終夜生じ
させた。
１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファ
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３－０１５）に
１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔によ
り形質転換し；細胞を３７℃で、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながら
インキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度
で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートし
た。コロニーを、挿入物の存在を求めてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿入
物間の接合部の配列を確認した。
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３－０１５）に
１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔によ
り形質転換し；細胞を３７℃で、１ｍｌのＳＯＣ中で１時間２００ｒｐｍで振盪しながら
インキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度
で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベートし
た。コロニーを、挿入物の存在を求めてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿入
物間の接合部の配列を確認した。
Ｐａｏｘ１＿ＡＬＡシンターゼ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ．－Ｐａｏｘ１＿ＰＰＧオキシダーゼ
＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ－Ｐａｏｘ１＿Ｆｃ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ．－Ｐａｏｘ１＿ＰＢＤ＿Ｆ
ＤＨ１ｔｅｒｍカセット（ｐＭｘ３３０）の組み立て
ａ．遺伝子カセットのＰＣＲ増幅
ＡＬＡシンターゼカセットを、ｐＭｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応して
ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネー
ターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ－Ｐａｏｘ１＿Ｆｃ＿ＦＤＨ１ｔｅｒｍ．－Ｐａｏｘ１＿ＰＢＤ＿Ｆ
ＤＨ１ｔｅｒｍカセット（ｐＭｘ３３０）の組み立て
ａ．遺伝子カセットのＰＣＲ増幅
ＡＬＡシンターゼカセットを、ｐＭｘ３１０から、制限エンドヌクレアーゼに対応して
ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネー
ターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＰＧオキシダーゼカセットを、ｐＭｘ３１３から、制限エンドヌクレアーゼに対応し
てＸｈｏＩおよびＡｆｌＩＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミ
ネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
てＸｈｏＩおよびＡｆｌＩＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミ
ネーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
フェロキラターゼカセットを、ｐＭｘ３２３から、制限エンドヌクレアーゼに対応して
ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネ
ーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ＡｆｌＩＩおよびＡｇｅＩ認識部位を含有するＡＯＸ１プロモーター／ＦＤＨ１ターミネ
ーターに対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
Ｇ４１８マーカーを、Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓから購入したｐＪＡＧプラスミドか
ら、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
ら、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、プラスミドからのＤＮＡを増幅
するために使用した。ＰＣＲ生成物を得て、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し
、ＤＮＡを２５μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０５３０Ｌ）を、プラスミドからのＤＮＡを増幅
するために使用した。ＰＣＲ生成物を得て、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃Ｄ４００４）を使用して精製し
、ＤＮＡを２５μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ｂ．ベクターの調製
ｐＧＡＺ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３２１）と称するベクターを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕ
ｆｆｅｒ中でＮｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ
３１３１Ｓ）およびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ
０１４６Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｐＧＡＺ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３２１）と称するベクターを、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕ
ｆｆｅｒ中でＮｈｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ
３１３１Ｓ）およびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ
０１４６Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｐＧＡＺ－ＡＬＡｓｙｎ．－ＰＢＤ（ｐＭｘ３２８）は、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１
中でＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１９８Ｓ）お
よびＢｂｖＣＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０６０１Ｓ）
を用いて終夜３７℃で消化した。
中でＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１９８Ｓ）お
よびＢｂｖＣＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０６０１Ｓ）
を用いて終夜３７℃で消化した。
ｐＧＡＧ－ＡＬＡｓｙｎ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３３２）は、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆ
ｆｅｒ中でＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１４６
Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３
５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｆｅｒ中でＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ０１４６
Ｓ）およびＡｇｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｒ３
５５２Ｓ）を用いて終夜３７℃で消化した。
ｃ．中間構築物の作製および最終のカセットの組み立て
消化されたベクターおよびＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースからＺｙｍｏｃｌｅａ
ｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ
＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
消化されたベクターおよびＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースからＺｙｍｏｃｌｅａ
ｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ
＃Ｄ４００２）を使用してゲル精製した。ＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに溶出させた。
ＮｈｅＩ－ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＧＡＺ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３
２１）ベクターを、同じ酵素で消化されたＡＬＡシンターゼカセットのＰＣＲ生成物と、
１６℃で終夜１０μｌの反応で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して連結し、ｐＧＡＺ－ＡＬＡｓｙｎ．－
ＰＢＤプラスミド（ｐＭｘ３２８）を得た。
２１）ベクターを、同じ酵素で消化されたＡＬＡシンターゼカセットのＰＣＲ生成物と、
１６℃で終夜１０μｌの反応で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して連結し、ｐＧＡＺ－ＡＬＡｓｙｎ．－
ＰＢＤプラスミド（ｐＭｘ３２８）を得た。
ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩ－ＨＦ制限エンドヌクレアーゼで消化されたｐＧＡＧ－ＡＬＡ
ｓｙｎ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３３２）を、ＸｈｏＩ、ＡｆｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ
－ＨＦ制限エンドヌクレアーゼで消化されたＰＰＧオキシダーゼカセットおよびフェロキ
ラターゼカセットＰＣＲ生成物と対応して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、３方連結反応で連結して
、ｐＧＡＧ－ＡＬＡシンターゼ＿ＰＰＧオキシダーゼ＿Ｆｃ＿ＰＢＤ（ｐＭｘ３３０）を
得た。
ｓｙｎ－ＰＢＤ（ｐＭｘ３３２）を、ＸｈｏＩ、ＡｆｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ
－ＨＦ制限エンドヌクレアーゼで消化されたＰＰＧオキシダーゼカセットおよびフェロキ
ラターゼカセットＰＣＲ生成物と対応して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ＃Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、３方連結反応で連結して
、ｐＧＡＧ－ＡＬＡシンターゼ＿ＰＰＧオキシダーゼ＿Ｆｃ＿ＰＢＤ（ｐＭｘ３３０）を
得た。
１．５μｌの連結混合物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファ
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３～０１５）に
、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔に
より形質転換して；細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中３７℃で１時間２００ｒｐｍで振盪しなが
らインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃
度で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベート
した。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿
入物間の接合部の配列を確認した。
ージ耐性コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１２０３３～０１５）に
、１．７ｋＶに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して電気穿孔に
より形質転換して；細胞を、１ｍｌのＳＯＣ中３７℃で１時間２００ｒｐｍで振盪しなが
らインキュベートした。１０μｌの回収混合物を、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃
度で含有するＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを終夜３７℃でインキュベート
した。コロニーを、挿入物の存在についてコロニーＰＣＲにより選別した。ベクターと挿
入物間の接合部の配列を確認した。
実施例１３ 遺伝子カセットを有する線状化されたプラスミドのＰ．パストリス（P. pas
toris）Ｂｇ１１ゲノムへの組込み
産生株ＭＸＹ０１８３を発生させるために使用されたプラスミドを、図２に示す。産生
株ＭＸＹ０１８３を導いた改変をするためにとられたステップを図３に描く。
toris）Ｂｇ１１ゲノムへの組込み
産生株ＭＸＹ０１８３を発生させるために使用されたプラスミドを、図２に示す。産生
株ＭＸＹ０１８３を導いた改変をするためにとられたステップを図３に描く。
Ｐ．パストリス（P. pastoris）のＢｇ１１ゲノムに導入されるべき第１の酵素はＡＬ
ＡＤであった。ｐＡＯＸ１に推進されるＡＬＡＤを含有するプラスミド（ｐＭＸ２２９、
図２ｉおよび図３）を、ＰｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）を
使用して線状化した。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロース
ゲルから精製して、天然のＡＯＸ１遺伝子座位における相同性組換えを使用して、Ｐ．パ
ストリス（P. pastoris）に形質転換し、株ＭＸＹ０９９を発生させた（図３）。
ＡＤであった。ｐＡＯＸ１に推進されるＡＬＡＤを含有するプラスミド（ｐＭＸ２２９、
図２ｉおよび図３）を、ＰｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）を
使用して線状化した。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロース
ゲルから精製して、天然のＡＯＸ１遺伝子座位における相同性組換えを使用して、Ｐ．パ
ストリス（P. pastoris）に形質転換し、株ＭＸＹ０９９を発生させた（図３）。
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下のダイズＬｅｇＨ遺伝子（Ｐ．パストリス（P. pasto
ris）のために最適化された配列；配列番号：３）の２つのコピーを含有するｐＭＸ２８
２と称するプラスミド（図２ｉｉおよび図３）を、ＳｆｉＩ制限酵素を使用して線状化し
た。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロースゲルから精製し、
ＡＬＡＤを含有するＰ．パストリス（P. pastoris）株に形質転換して、株ＭＸＹ０１１
８を発生させた（図３）。ｑＰＣＲを使用して、株ＭＸＹ０１１８は、恐らく組換え時に
おけるプラスミドｐＭＸ２８２のコンカテマー化（concatamerization）に基づいて、Ｌ
ｅｇＨ遺伝子の数個のコピーを含有することを決定した。
ris）のために最適化された配列；配列番号：３）の２つのコピーを含有するｐＭＸ２８
２と称するプラスミド（図２ｉｉおよび図３）を、ＳｆｉＩ制限酵素を使用して線状化し
た。線状化されたプラスミドを、記載されたように０．８％アガロースゲルから精製し、
ＡＬＡＤを含有するＰ．パストリス（P. pastoris）株に形質転換して、株ＭＸＹ０１１
８を発生させた（図３）。ｑＰＣＲを使用して、株ＭＸＹ０１１８は、恐らく組換え時に
おけるプラスミドｐＭＸ２８２のコンカテマー化（concatamerization）に基づいて、Ｌ
ｅｇＨ遺伝子の数個のコピーを含有することを決定した。
ＡＯＸ１プロモーターの制御下のウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ（ＵＰＳ）
、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＰＤ）およびコプロポルフィリ
ノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）（それぞれ、ステップ４、５および６を触媒する
酵素）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＸ３２７（図２ｉｉｉおよび図３）
を、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０１１８に導入して、株
ＭＸＹ０１７０を得た（図３）。
、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩデカルボキシラーゼ（ＵＰＤ）およびコプロポルフィリ
ノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯ）（それぞれ、ステップ４、５および６を触媒する
酵素）をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＸ３２７（図２ｉｉｉおよび図３）
を、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０１１８に導入して、株
ＭＸＹ０１７０を得た（図３）。
Ｐ．パストリス（P. pastoris）ゲノムからのＡＬＡシンターゼ（ＡＬＡＳ）、プロト
ポルフィリンＩＩＩオキシダーゼ（ＰＰＯ）、フェロキラターゼ（ＦＣ）およびポルフォ
ビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＤ）（それぞれ、ステップ１、７、８および３を触媒す
る酵素）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＭＸ３３０上で組み立てた（図２ｉｖおよ
び図３）。ｐＭＸ３３０をＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０
１７０に形質転換させて、株ＭＸＹ０１８３の発生に導いた（図３）。ＭＸＹ０１８３の
遺伝子型は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲを使用して確認した。
産生株ＭＸＹ０２０７
ポルフィリンＩＩＩオキシダーゼ（ＰＰＯ）、フェロキラターゼ（ＦＣ）およびポルフォ
ビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＤ）（それぞれ、ステップ１、７、８および３を触媒す
る酵素）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＭＸ３３０上で組み立てた（図２ｉｖおよ
び図３）。ｐＭＸ３３０をＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化し、ＭＸＹ０
１７０に形質転換させて、株ＭＸＹ０１８３の発生に導いた（図３）。ＭＸＹ０１８３の
遺伝子型は、ＰＣＲおよびｑＰＣＲを使用して確認した。
産生株ＭＸＹ０２０７
実施例１４ ｐＧＡＢ発現ベクターの構築
ｐＧＡＢ発現ベクター（図４Ａ）を、ｐＧＡＺベクター（ＢｉｏＧｒａｍｍａｔｉｃｓ
、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中のゼオシン耐性遺伝子のオープンリーディング
フレームを、抗生物質ブラスチシジンＳを有するプラスミドを担持する形質転換体の選択
を可能にする、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）からのブラスチシジ
ンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子からのオープンリーディングフレームで置き換えるこ
とにより構築した。
ｐＧＡＢ発現ベクター（図４Ａ）を、ｐＧＡＺベクター（ＢｉｏＧｒａｍｍａｔｉｃｓ
、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中のゼオシン耐性遺伝子のオープンリーディング
フレームを、抗生物質ブラスチシジンＳを有するプラスミドを担持する形質転換体の選択
を可能にする、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）からのブラスチシジ
ンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子からのオープンリーディングフレームで置き換えるこ
とにより構築した。
ＢＳＤオープンリーディングフレームを、商業的に合成されたＤＮＡ分子から、オリゴ
ヌクレオチドプライマーＭｘＯ０４７６およびＭｘＯ０４７７を使用して、本明細書に記
載した高い信頼性のあるポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。
ヌクレオチドプライマーＭｘＯ０４７６およびＭｘＯ０４７７を使用して、本明細書に記
載した高い信頼性のあるポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲルでゲル電気泳動によりにより精製し、
ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視化した。所望のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルか
ら切り取り、ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット
（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して回収した。
精製されたＢＳＤＰＣＲ生成物およびｐＧＡＺベクターを、各１０単位のＭｌｕＩおよ
びＢｂｖＣＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐ
ｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて、１時間３７℃で、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消化されたＤＮＡ生成物を、上記のようにゲル
電気泳動により回収した。
びＢｂｖＣＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐ
ｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて、１時間３７℃で、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消化されたＤＮＡ生成物を、上記のようにゲル
電気泳動により回収した。
精製された、ＭｌｕＩおよびＢｂｖＣＩで消化されたＢＳＤ生成物およびｐＧＡＺベク
ターを、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ
）と、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５）中２０μｌの反応で、
１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エレクトロコンピテント大腸菌（
E. coli）のＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換して、抗生物質耐性の形質転
換体を１００μｇ／μｌのアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天プレート上で選択した。
ターを、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ
）と、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５）中２０μｌの反応で、
１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エレクトロコンピテント大腸菌（
E. coli）のＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換して、抗生物質耐性の形質転
換体を１００μｇ／μｌのアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天プレート上で選択した。
実施例１５ Ｍｘｒ１発現ベクターの構築
Ｍｘｒ１発現ベクターｐＭｘ３５４を、Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをｐＧ
ＡＢベクターに導入することにより構築した（図４Ｂ）。該Ｍｘｒ１オープンリーディン
グフレームは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのメタノール誘導性アルコ
ールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの直ぐ下流で翻訳開始して、Ｐ．パストリ
ス（P. pastoris）ＦＤＨ１遺伝子からの転写ターミネーター配列が直ぐ続く翻訳停止シ
グナルを有する、ｐＧＡＢに挿入された。
Ｍｘｒ１発現ベクターｐＭｘ３５４を、Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをｐＧ
ＡＢベクターに導入することにより構築した（図４Ｂ）。該Ｍｘｒ１オープンリーディン
グフレームは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのメタノール誘導性アルコ
ールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの直ぐ下流で翻訳開始して、Ｐ．パストリ
ス（P. pastoris）ＦＤＨ１遺伝子からの転写ターミネーター配列が直ぐ続く翻訳停止シ
グナルを有する、ｐＧＡＢに挿入された。
Ｍｘｒ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、ＢｉｏＧｒａｍｍ
ａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得たピキア・パストリス（Pichia
pastoris）株Ｂｇ１１ＭｕｔＳから単離されたゲノムのＤＮＡから増幅した。Ｍｘｒ１
オープンリーディングフレームは、Ｐ．パストリス（P. pastoris）のゲノムのＤＮＡか
ら、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の側面に位置して付け加えられたプライマ
ーＭｘＯ０４９５（ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡ
ＣＴＴＴＴＧ（配列番号：４５））およびＭｘＯ０４９６（ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣ
ＴＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＧＧＴＴ（配列番号：４６））を用いて増幅し
た。増幅は本明細書に記載されたポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成した。
ａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得たピキア・パストリス（Pichia
pastoris）株Ｂｇ１１ＭｕｔＳから単離されたゲノムのＤＮＡから増幅した。Ｍｘｒ１
オープンリーディングフレームは、Ｐ．パストリス（P. pastoris）のゲノムのＤＮＡか
ら、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の側面に位置して付け加えられたプライマ
ーＭｘＯ０４９５（ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡ
ＣＴＴＴＴＧ（配列番号：４５））およびＭｘＯ０４９６（ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣ
ＴＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣＧＧＴＴ（配列番号：４６））を用いて増幅し
た。増幅は本明細書に記載されたポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成した。
増幅されたＭｘｒ１ＰＣＲ生成物およびｐＧＡＢベクターを、１０単位のＮｏｔＩ制限
エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７
℃、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消
化に続いて、ＮｏｔＩで消化されたｐＭｘ３５２ベクターを、５単位のＡｎｔａｒｃｔｉ
ｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により１５分間３７℃で
、１×Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭビス－トリス－プロパン－Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２５℃でｐＨ６）中において処理
した。
エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７
℃、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３．１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２５℃でｐＨ７．９）中で消化した。消
化に続いて、ＮｏｔＩで消化されたｐＭｘ３５２ベクターを、５単位のＡｎｔａｒｃｔｉ
ｃホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により１５分間３７℃で
、１×Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭビス－トリス－プロパン－Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２５℃でｐＨ６）中において処理
した。
ＮｏｔＩで消化されて増幅されたＭｘｒ１フラグメントおよびｐＭｘ３５２ベクターを
、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
）中の１％アガロースゲルで電気泳動により分離して、ＳＹＢＲ ＳＡＦＥ ＤＮＡゲル
染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視
化した。所望のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取って、該ＤＮＡを、Ｚｙ
ｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して回収した。
、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
）中の１％アガロースゲルで電気泳動により分離して、ＳＹＢＲ ＳＡＦＥ ＤＮＡゲル
染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視
化した。所望のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り取って、該ＤＮＡを、Ｚｙ
ｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して回収した。
Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームを含有するＮｏｔＩで消化されたフラグメント
を、ｐＧＡＢ中に、ＡＯＸ１プロモーターの直ぐ下流のＮｏｔＩ部位で連結することによ
り導入した。Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをコードする１３７ｎｇのＮｏｔＩ
で消化されたＤＮＡおよび６０ｎｇのＮｏｔＩで消化されてホスファターゼ処理されたｐ
Ｍｘ３５２を含有する混合物を、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭト
リスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ
７．５）中２０μｌの反応で、１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エ
レクトロコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換
して、抗生物質耐性形質転換体を１００μｇ／μｌアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天
プレート上で選択した。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入
物の存在についてプライマーＭｘＯ０４９５およびＭｘＯ０４９６を使用するＰＣＲによ
り選別した。最終のベクターの配列をＤＮＡ配列により確認した。
を、ｐＧＡＢ中に、ＡＯＸ１プロモーターの直ぐ下流のＮｏｔＩ部位で連結することによ
り導入した。Ｍｘｒ１オープンリーディングフレームをコードする１３７ｎｇのＮｏｔＩ
で消化されたＤＮＡおよび６０ｎｇのＮｏｔＩで消化されてホスファターゼ処理されたｐ
Ｍｘ３５２を含有する混合物を、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５０ｍＭト
リスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ
７．５）中２０μｌの反応で、１６℃で２時間２０μｌの反応でインキュベートした。エ
レクトロコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞を２μｌの連結反応で形質転換
して、抗生物質耐性形質転換体を１００μｇ／μｌアンピシリンで補完されたＬＳＢ寒天
プレート上で選択した。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。コロニーを、挿入
物の存在についてプライマーＭｘＯ０４９５およびＭｘＯ０４９６を使用するＰＣＲによ
り選別した。最終のベクターの配列をＤＮＡ配列により確認した。
クローニング中に、Ｍｘｒ１のＮ末端に６個の追加のアミノ酸を導入した。Ｍｘｒ１の
オープンリーディングフレームを「核酸配列」の項で示し、クローニングからの残留アミ
ノ酸は下線付きで示す。追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有するＭｘｒ１配列を含有する
ピキア（Pichia）産生株と野性型Ｍｘｒ１（即ち、追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有し
ない）を含有するピキア（Pichia）株は、発酵槽中で区別がつかなかった。
オープンリーディングフレームを「核酸配列」の項で示し、クローニングからの残留アミ
ノ酸は下線付きで示す。追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有するＭｘｒ１配列を含有する
ピキア（Pichia）産生株と野性型Ｍｘｒ１（即ち、追加の６個のアミノ酸をＮ末端に有し
ない）を含有するピキア（Pichia）株は、発酵槽中で区別がつかなかった。
実施例１６ 天然のＭｘｒ１発現ベクターの構築
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下にＭｘｒ１転写制御因子遺伝子を含有するｐＭＸ３５
４と称するプラスミドを、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＡＯＸ１プ
ロモーターの３’端部、ＬｅｇＨのオープンリーディングフレーム、およびＡＯＸ１ター
ミネーターを、ｐＭＸ３５４から、下に示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６
４７を使用して増幅した。ＡＯＸ１ターミネーター、リンカーおよびＡＯＸ１プロモータ
ーの５’端部を、ｐＭＸ３８２からプライマーＭｘＯ０６１８およびＭｘＯ０６４６を使
用して増幅した。
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下にＭｘｒ１転写制御因子遺伝子を含有するｐＭＸ３５
４と称するプラスミドを、ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＡＯＸ１プ
ロモーターの３’端部、ＬｅｇＨのオープンリーディングフレーム、およびＡＯＸ１ター
ミネーターを、ｐＭＸ３５４から、下に示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６
４７を使用して増幅した。ＡＯＸ１ターミネーター、リンカーおよびＡＯＸ１プロモータ
ーの５’端部を、ｐＭＸ３８２からプライマーＭｘＯ０６１８およびＭｘＯ０６４６を使
用して増幅した。
ＰＣＲ生成物を得て、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５を使用
して精製し、ＤＮＡを１２μｌのＨ２Ｏに溶出させた。次に、精製されたＰＣＲ生成物を
組み合わせて、プライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰＣＲ増幅の
次の回のためのテンプレートとして使用した。生じたＰＣＲ生成物は、ＡＯＸ１プロモー
ターの３’端部、それに続くＭｘｒ１オープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネ
ーター、短いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された。ＰＣ
Ｒ生成物は、本明細書に記載されるように得られて精製された。精製されたＰＣＲ生成物
を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｋ２８００－２０）を使用してｐＣＲ（商標）－Ｂ
ｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングして、ｐＭＸ４０２ベク
ターを創り出した。
して精製し、ＤＮＡを１２μｌのＨ２Ｏに溶出させた。次に、精製されたＰＣＲ生成物を
組み合わせて、プライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰＣＲ増幅の
次の回のためのテンプレートとして使用した。生じたＰＣＲ生成物は、ＡＯＸ１プロモー
ターの３’端部、それに続くＭｘｒ１オープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネ
ーター、短いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された。ＰＣ
Ｒ生成物は、本明細書に記載されるように得られて精製された。精製されたＰＣＲ生成物
を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｋ２８００－２０）を使用してｐＣＲ（商標）－Ｂ
ｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングして、ｐＭＸ４０２ベク
ターを創り出した。
実施例１７ Ｐ．パストリス（P. pastoris）株ＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７の
構築
ｐＭｘ３５４Ｍｘｒ１発現ベクター（図４Ｂ）を、ＤＮＡ形質転換によりＭＸＹ０１８
３株に導入した（図３）。
構築
ｐＭｘ３５４Ｍｘｒ１発現ベクター（図４Ｂ）を、ＤＮＡ形質転換によりＭＸＹ０１８
３株に導入した（図３）。
ｐＭｘ３５４ベクター（１．５μｇ）を、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（５０ｍＭ酢酸カリ
ウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐ
Ｈ７．９）中で２０単位のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７℃で消化することにより、ＡＯＸ１プロモーター
配列中における固有のＰｍｅＩ部位で線状化した。
ウム、２０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐ
Ｈ７．９）中で２０単位のＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、１時間３７℃で消化することにより、ＡＯＸ１プロモーター
配列中における固有のＰｍｅＩ部位で線状化した。
ＰｍｅＩで消化されたｐＭＸ３５４ベクターを、ゲル電気泳動により精製し、上記のＺ
ｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキットを使用して回収した。線状
化されたｐＭＸ３５４ベクターを、株ＭＸＹ０１８３に形質転換により導入して、ブラス
チシジン含有培地で選択した。２つの独立のクローンが形質転換から得られて、それらを
ＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７と命名した。これらの株中でＡＯＸ１プロモーター
の制御下にあるＭｘｒ１の追加のコピーの存在をＰＣＲにより確認した。
ｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキットを使用して回収した。線状
化されたｐＭＸ３５４ベクターを、株ＭＸＹ０１８３に形質転換により導入して、ブラス
チシジン含有培地で選択した。２つの独立のクローンが形質転換から得られて、それらを
ＭＸＹ０２０６およびＭＸＹ０２０７と命名した。これらの株中でＡＯＸ１プロモーター
の制御下にあるＭｘｒ１の追加のコピーの存在をＰＣＲにより確認した。
産生株ＭＸＹ０２９１
実施例１８ 株ＭＸＹ０２１３およびＭＸＹ０２６０の構築
図５は、ヘム生合成経路の７種の酵素を含有し、抗生物質マーカーを含まない株ＭＸＹ
０２１３を構築するためにとられるステップを示す。各端部にｐＡＯＸ１プロモーターに
相同性を有するｐＡＯＸ１下の変形体Ｍｘｒ１（Ｎ末端に６個の余分のアミノ酸）を含有
するＤＮＡの線状部分を、共形質転換を使用して導入した（図５および図６ｉ）。この線
状Ｍｘｒ１発現カセットを、ｐＩＬ７５プラスミドを用いて形質転換によりピキア（Pich
ia）株ＭＸＹ２１３中に同時に導入した。ｐＩＬ７５ベクターは、形質転換された細胞の
ゲノム中への組込みなしに、該プラスミドベクターを維持することを可能にするｐａｎＡ
ＲＳ自律的複製配列（Liachko & Dunham, 2014, FEMS Yeast Res., 14: 364-7）および抗
生物質Ｇ４１８による形質転換体の選択のためのｋａｎＭＸマーカーを担持する。形質転
換された細胞は、Ｇ４１８で補完された培地で、ｐＩＬ７５プラスミドにおけるｋａｎＭ
Ｘマーカーの存在について選択した。ピキア（Pichia）形質転換体を、ｐＩＬ７５プラス
ミドも取り込み、Ｍｘｒ１発現カセットも正しく組み込んだ形質転換体を求めてコロニー
ＰＣＲにより選別した。
実施例１８ 株ＭＸＹ０２１３およびＭＸＹ０２６０の構築
図５は、ヘム生合成経路の７種の酵素を含有し、抗生物質マーカーを含まない株ＭＸＹ
０２１３を構築するためにとられるステップを示す。各端部にｐＡＯＸ１プロモーターに
相同性を有するｐＡＯＸ１下の変形体Ｍｘｒ１（Ｎ末端に６個の余分のアミノ酸）を含有
するＤＮＡの線状部分を、共形質転換を使用して導入した（図５および図６ｉ）。この線
状Ｍｘｒ１発現カセットを、ｐＩＬ７５プラスミドを用いて形質転換によりピキア（Pich
ia）株ＭＸＹ２１３中に同時に導入した。ｐＩＬ７５ベクターは、形質転換された細胞の
ゲノム中への組込みなしに、該プラスミドベクターを維持することを可能にするｐａｎＡ
ＲＳ自律的複製配列（Liachko & Dunham, 2014, FEMS Yeast Res., 14: 364-7）および抗
生物質Ｇ４１８による形質転換体の選択のためのｋａｎＭＸマーカーを担持する。形質転
換された細胞は、Ｇ４１８で補完された培地で、ｐＩＬ７５プラスミドにおけるｋａｎＭ
Ｘマーカーの存在について選択した。ピキア（Pichia）形質転換体を、ｐＩＬ７５プラス
ミドも取り込み、Ｍｘｒ１発現カセットも正しく組み込んだ形質転換体を求めてコロニー
ＰＣＲにより選別した。
実施例１９ ＬｅｇＨ発現カセットをピキア（Pichia）に導入する共形質転換
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下の、ダイズＬｅｇＨ遺伝子の異なるピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）－コドンが最適化された変形体（変形体３；配列番号：５）を含
有するｐＭＸ３９９と称するプラスミドを、該遺伝子のＰＣＲ増幅のためのテンプレート
の供給源として使用した。ＴＯＰＯクローニングプラスミドｐＭＸ４０１からの骨格をＰ
ＣＲ増幅した。挿入物およびベクターをＧｉｂｓｏｎアセンブリー（ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏ
ｎアセンブリーキット）を使用して組み立ててプラスミドｐＭＸ４２２を発生させた。こ
のプラスミドを、下で示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰ
ＣＲ増幅の次の回のためのテンプレートとして使用した。
ｐＡＯＸ１プロモーターの制御下の、ダイズＬｅｇＨ遺伝子の異なるピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）－コドンが最適化された変形体（変形体３；配列番号：５）を含
有するｐＭＸ３９９と称するプラスミドを、該遺伝子のＰＣＲ増幅のためのテンプレート
の供給源として使用した。ＴＯＰＯクローニングプラスミドｐＭＸ４０１からの骨格をＰ
ＣＲ増幅した。挿入物およびベクターをＧｉｂｓｏｎアセンブリー（ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏ
ｎアセンブリーキット）を使用して組み立ててプラスミドｐＭＸ４２２を発生させた。こ
のプラスミドを、下で示すプライマーＭｘＯ０６１７およびＭｘＯ０６１８を使用するＰ
ＣＲ増幅の次の回のためのテンプレートとして使用した。
生じたＰＣＲ生成物は、５’から３’方向で、ＡＯＸ１プロモーターの３’端部、それ
に続くＬｅｇＨ変形体３のオープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネーター、短
いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された（図６ｉｉ）。Ｐ
ＣＲ生成物を得て、本明細書に記載されるようにアガロースゲル電気泳動により精製した
。
に続くＬｅｇＨ変形体３のオープンリーディングフレーム、ＡＯＸ１ターミネーター、短
いリンカー配列、およびＡＯＸ１プロモーターの５’端部で構成された（図６ｉｉ）。Ｐ
ＣＲ生成物を得て、本明細書に記載されるようにアガロースゲル電気泳動により精製した
。
ゲノム中に組み込まれたＬｅｇＨ発現カセットを有する形質転換体を、ＰＣＲによって
選別し、ｑＰＣＲを使用してＬｅｇＨ遺伝子コピー数について特徴づけた。
選別し、ｑＰＣＲを使用してＬｅｇＨ遺伝子コピー数について特徴づけた。
実施例２０ 選択マーカーを担持するプラスミドベクターの形質転換体のキュアリング
ダイズＬｅｇＨ発現カセットが、コロニーＰＣＲにより正しくおよびｑＰＣＲにより高
いコピー数で組み込まれたことが示されたクローンでは、Ｇ４１８で選択するために必要
なｐＩＬ７５プラスミドを、抗生物質に対する選択を緩和することにより排除した。形質
転換体をＧ４１８抗生物質を欠く培地で単一のコロニーを画線培養した。ｐａｎＡＲＳプ
ラスミドは選択の不在下では安定に維持されないので、ｐＩＬ７５は、この条件下では形
質転換された細胞から急速に消失した。生じたピキア（Pichia）株ＭＸＹ０２９１は、Ｍ
ＸＹ０２０７と同様なコピー数でＬｅｇＨを発現するための配列を含有するが、選択のた
めの異種配列を欠く。
ダイズＬｅｇＨ発現カセットが、コロニーＰＣＲにより正しくおよびｑＰＣＲにより高
いコピー数で組み込まれたことが示されたクローンでは、Ｇ４１８で選択するために必要
なｐＩＬ７５プラスミドを、抗生物質に対する選択を緩和することにより排除した。形質
転換体をＧ４１８抗生物質を欠く培地で単一のコロニーを画線培養した。ｐａｎＡＲＳプ
ラスミドは選択の不在下では安定に維持されないので、ｐＩＬ７５は、この条件下では形
質転換された細胞から急速に消失した。生じたピキア（Pichia）株ＭＸＹ０２９１は、Ｍ
ＸＹ０２０７と同様なコピー数でＬｅｇＨを発現するための配列を含有するが、選択のた
めの異種配列を欠く。
産生株ＭＸＹ０３３０、ＭＸＹ０３３３、およびＭＸＹ０３３８
実施例２１ 株ＭＸＹ０３０６の構築
株ＭＸＹ０２９１の遺伝子型のＰＣＲにより、ＣＰＧオキシダーゼをコードする配列の
一部が、この株の構築中に欠失されたことが明らかになった。全長ＣＰＧオキシダーゼを
コードする領域は、トランケートされたコピーの置き換えにより回復された。簡単に説明
すると、下に示すプライマーＭｘＯ０８６６およびＭｘＯ０８６７を使用して、ｐＡＯＸ
１プロモーターおよび全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域を含有する線状ＤＮＡフ
ラグメントを、プラスミドｐＭＸ３１２からＰＣＲ増幅により発生させた。
実施例２１ 株ＭＸＹ０３０６の構築
株ＭＸＹ０２９１の遺伝子型のＰＣＲにより、ＣＰＧオキシダーゼをコードする配列の
一部が、この株の構築中に欠失されたことが明らかになった。全長ＣＰＧオキシダーゼを
コードする領域は、トランケートされたコピーの置き換えにより回復された。簡単に説明
すると、下に示すプライマーＭｘＯ０８６６およびＭｘＯ０８６７を使用して、ｐＡＯＸ
１プロモーターおよび全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域を含有する線状ＤＮＡフ
ラグメントを、プラスミドｐＭＸ３１２からＰＣＲ増幅により発生させた。
線状ｐＡＯＸ１－ＣＰＧオキシダーゼＤＮＡフラグメントは、ｐＩＬ７５プラスミドと
の共形質転換により、株ＭＸＹ０２９１中に導入された。形質転換体は、Ｇ４１８を含有
する培地で選択して、全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域の存在についてＰＣＲに
より選別した。全長ＣＰＧオキシダーゼを含有する単離物を同定して、その後上記のよう
にＧ４１８に基づく選択のために必要なプラスミドベクターは排除された。この株をＭＸ
Ｙ０３０６と命名した（図５を参照されたい）。
の共形質転換により、株ＭＸＹ０２９１中に導入された。形質転換体は、Ｇ４１８を含有
する培地で選択して、全長ＣＰＧオキシダーゼをコードする領域の存在についてＰＣＲに
より選別した。全長ＣＰＧオキシダーゼを含有する単離物を同定して、その後上記のよう
にＧ４１８に基づく選択のために必要なプラスミドベクターは排除された。この株をＭＸ
Ｙ０３０６と命名した（図５を参照されたい）。
実施例２２ ハイブリッドプロモーター株のための線状構築物
ＬｅｇＨ変形体３を、本明細書で示した３種の天然のピキア・パストリス（Pichia pas
toris）の構成的プロモーターの各々の指示下で発現させた。線状構築物は図７に示され
、プロモーターの３’側半分、それに続くＬｅｇＨ変形体３、それに続くＦＤＨ１転写タ
ーミネーターを含有した。これに直ぐ、アシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossypii）か
らのｐＴＥＦプロモーター、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）か
らのアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）およびアシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossy
pii）からのＴＥＦターミネーターを含有する抗生物質耐性カセットが続く。最終的に、
該構築物はプロモーターの５’側半分を含有した。この線状カセットを、下の表にリスト
を挙げたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅して、５’および３’端部に、天
然のピキア（Pichia）ゲノムのそれぞれのプロモーターに相同性の数百塩基対を含有する
構築物を発生させた。
ＬｅｇＨ変形体３を、本明細書で示した３種の天然のピキア・パストリス（Pichia pas
toris）の構成的プロモーターの各々の指示下で発現させた。線状構築物は図７に示され
、プロモーターの３’側半分、それに続くＬｅｇＨ変形体３、それに続くＦＤＨ１転写タ
ーミネーターを含有した。これに直ぐ、アシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossypii）か
らのｐＴＥＦプロモーター、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）か
らのアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）およびアシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossy
pii）からのＴＥＦターミネーターを含有する抗生物質耐性カセットが続く。最終的に、
該構築物はプロモーターの５’側半分を含有した。この線状カセットを、下の表にリスト
を挙げたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅して、５’および３’端部に、天
然のピキア（Pichia）ゲノムのそれぞれのプロモーターに相同性の数百塩基対を含有する
構築物を発生させた。
コンピテントＭＸＹ０３０６細胞を、線状カセットの各々で形質転換して、ａｍｄＳ選
択カセットを含有する形質転換体を、アセトアミドを唯一の窒素供給源として含有する寒
天プレート上で成長するそれらの能力に基づいて選択した。これらの株を、精製し単離し
て、構成的プロモーターの制御下にあるＬｅｇＨの存在をＰＣＲにより検証した（図５）
。
択カセットを含有する形質転換体を、アセトアミドを唯一の窒素供給源として含有する寒
天プレート上で成長するそれらの能力に基づいて選択した。これらの株を、精製し単離し
て、構成的プロモーターの制御下にあるＬｅｇＨの存在をＰＣＲにより検証した（図５）
。
実施例２３ 核酸配列
Ｍｘｒ１の核酸配列（下線付きのヌクレオチドは、クローニング中に導入されたＮ末端
における６個のアミノ酸をコードする）（配列番号：１）
Ｍｘｒ１の核酸配列（下線付きのヌクレオチドは、クローニング中に導入されたＮ末端
における６個のアミノ酸をコードする）（配列番号：１）
に導入された）（配列番号：２）
配列番号：３）
列（配列番号：４）
核酸配列（配列番号：５）
アミノ酸配列（配列番号：６）
）
）
５）
パートＣ．結果および考察
実施例２４ 株ＭＸＹ０１８３の特性評価
株ＭＸＹ０１８３のための最適成長条件は、３．０から６．０の目標ｐＨおよび２８～
３５℃の温度を含む。ＬｅｇＨタンパク質を産生するために、株ＭＸＹ０１８３は、生き
ていて６日間好気的に成長していなければならない。
実施例２４ 株ＭＸＹ０１８３の特性評価
株ＭＸＹ０１８３のための最適成長条件は、３．０から６．０の目標ｐＨおよび２８～
３５℃の温度を含む。ＬｅｇＨタンパク質を産生するために、株ＭＸＹ０１８３は、生き
ていて６日間好気的に成長していなければならない。
株ＭＸＹ０１８３と関連する遺伝子の発現は、株に表現型の変化を生じさせた。図８は
、誘導開始時（０時間）および誘導７２時間後における振盪フラスコの写真を示す。＃１
としたフラスコは宿主株ＭＸＹ００５１を含有する。＃２および＃３としたフラスコは、
中間株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝子およびヘム生合成経路からのＡＬＡデヒド
ラターゼを含有するＭＸＹ０１１８）および産生株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝
子およびヘム生合成経路からの８種の酵素を含有するＭＸＹ０１８３）の１つを、それぞ
れ含有する。７２時間後のフラスコ＃３における特徴的な赤色は、ヘムが結合したＬｅｇ
Ｈの産生を示す。
、誘導開始時（０時間）および誘導７２時間後における振盪フラスコの写真を示す。＃１
としたフラスコは宿主株ＭＸＹ００５１を含有する。＃２および＃３としたフラスコは、
中間株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝子およびヘム生合成経路からのＡＬＡデヒド
ラターゼを含有するＭＸＹ０１１８）および産生株（即ち、＞１０コピーのＬｅｇＨ遺伝
子およびヘム生合成経路からの８種の酵素を含有するＭＸＹ０１８３）の１つを、それぞ
れ含有する。７２時間後のフラスコ＃３における特徴的な赤色は、ヘムが結合したＬｅｇ
Ｈの産生を示す。
振盪フラスコ中で成長させた後、上で示したＰ．パストリス（P. pastoris）株ＭＸＹ
００５１、ＭＸＹ０１１８、およびＭＸＹ０１８３を溶解してタンパク質をＳＤＳゲルに
通した（図９Ａ）。矢印は、ＬｅｇＨタンパク質の位置を示す。株ＭＸＹ０１８３と株Ｍ
ＸＹ０１１８におけるＬｅｇＨ産生の比較を図９Ｂに示すが、それはＭＸＹ０１８３株に
よるＬｅｇＨタンパク質のヘム搭載の有効性を示す。
００５１、ＭＸＹ０１１８、およびＭＸＹ０１８３を溶解してタンパク質をＳＤＳゲルに
通した（図９Ａ）。矢印は、ＬｅｇＨタンパク質の位置を示す。株ＭＸＹ０１８３と株Ｍ
ＸＹ０１１８におけるＬｅｇＨ産生の比較を図９Ｂに示すが、それはＭＸＹ０１８３株に
よるＬｅｇＨタンパク質のヘム搭載の有効性を示す。
実施例２５ 株ＭＸＹ０２０７の特性評価
次に、ヘムの生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子の存在下に転写活性化因
子Ｍｘｒ１を過発現することの利益を決定するために、実験を実施した。＞１０コピーの
ＬｅｇＨ配列およびヘム生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子を含有する株Ｍ
ＸＹ０１８３、および＞１０コピーのＬｅｇＨ配列、ヘム生合成に関与する８種の酵素を
コードする遺伝子、およびＭｘｒ１転写活性化因子を含有する姉妹株ＭＸＹ０２０６およ
びＭＸＹ０２０７を、これらの株にとって抑制炭素源であるグリセロールの存在下に振盪
フラスコ培養中で成長させた。４８時間後における振盪フラスコ培養の写真を図１０Ａに
示し、ＢＭＹ培地で追加の炭素源なしで４８時間成長させた細胞からのペレットの写真を
図１０Ｂに示す。これらの実験は、抑制炭素源が、Ｍｘｒ１もその中でＡＯＸ１プロモー
ターから発現する株の成長培地中で消費し尽くされたときに、ＡＯＸ１プロモーターの制
御下にある導入遺伝子の有意の発現（例えばヘム酵素）が、誘導炭素源の不在下で起こる
ことを示す。振盪フラスコ培養物が誘導剤の不在下で成長した場合のヘム搭載ＬｅｇＨの
相対収率を、図１０Ｃに示す。これらの実験は、Ｍｘｒ１発現もその中でＡＯＸ１プロモ
ーターによって推進されるピキア（Pichia）株中において、メタノール誘導の不在下で、
組換えヘム搭載タンパク質の有意の産生が、ＡＯＸ１プロモーターに推進される導入遺伝
子から達成されることを示す。
次に、ヘムの生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子の存在下に転写活性化因
子Ｍｘｒ１を過発現することの利益を決定するために、実験を実施した。＞１０コピーの
ＬｅｇＨ配列およびヘム生合成に関与する８種の酵素をコードする遺伝子を含有する株Ｍ
ＸＹ０１８３、および＞１０コピーのＬｅｇＨ配列、ヘム生合成に関与する８種の酵素を
コードする遺伝子、およびＭｘｒ１転写活性化因子を含有する姉妹株ＭＸＹ０２０６およ
びＭＸＹ０２０７を、これらの株にとって抑制炭素源であるグリセロールの存在下に振盪
フラスコ培養中で成長させた。４８時間後における振盪フラスコ培養の写真を図１０Ａに
示し、ＢＭＹ培地で追加の炭素源なしで４８時間成長させた細胞からのペレットの写真を
図１０Ｂに示す。これらの実験は、抑制炭素源が、Ｍｘｒ１もその中でＡＯＸ１プロモー
ターから発現する株の成長培地中で消費し尽くされたときに、ＡＯＸ１プロモーターの制
御下にある導入遺伝子の有意の発現（例えばヘム酵素）が、誘導炭素源の不在下で起こる
ことを示す。振盪フラスコ培養物が誘導剤の不在下で成長した場合のヘム搭載ＬｅｇＨの
相対収率を、図１０Ｃに示す。これらの実験は、Ｍｘｒ１発現もその中でＡＯＸ１プロモ
ーターによって推進されるピキア（Pichia）株中において、メタノール誘導の不在下で、
組換えヘム搭載タンパク質の有意の産生が、ＡＯＸ１プロモーターに推進される導入遺伝
子から達成されることを示す。
選択株を２Ｌ発酵槽中で成長させて、ＬｅｇＨおよびヘム搭載ＬｅｇＨの相対収率を決
定した（図１１）。株ＭＸＹ０１８３と比較して、ＭＸＹ０２０７株は、いっそう多くの
ＬｅｇＨを産生し、ＬｅｇＨタンパク質にヘムを搭載させるのに十分なヘムを非常に効果
的に産生することができた。
定した（図１１）。株ＭＸＹ０１８３と比較して、ＭＸＹ０２０７株は、いっそう多くの
ＬｅｇＨを産生し、ＬｅｇＨタンパク質にヘムを搭載させるのに十分なヘムを非常に効果
的に産生することができた。
実施例２６ 株ＭＸＹ０２９１の特性評価
実施例１８～２０で上記したように、株ＭＸＹ０２９１を構築してＭＸＹ０２０７のＬ
ｅｇＨ産生能力を再現したが、抗生物質耐性遺伝子は含まなかった。株ＭＸＹ０２９１は
約１６コピーのＬｅｇＨ変形体３、Ｍｘｒ１および８種のヘム生合成酵素のうち７種を含
有することが決定された。２Ｌの発酵槽で成長させた場合、この株は、ＭＸＹ０２０７と
比較して改善されたＬｅｇＨ収率を示した。この改善は、メタノール／グリセロールおよ
びメタノール／デキストロ－ス（Ｄ－グルコース）を含有する誘導培地の両方で見られた
（図１１）。
実施例１８～２０で上記したように、株ＭＸＹ０２９１を構築してＭＸＹ０２０７のＬ
ｅｇＨ産生能力を再現したが、抗生物質耐性遺伝子は含まなかった。株ＭＸＹ０２９１は
約１６コピーのＬｅｇＨ変形体３、Ｍｘｒ１および８種のヘム生合成酵素のうち７種を含
有することが決定された。２Ｌの発酵槽で成長させた場合、この株は、ＭＸＹ０２０７と
比較して改善されたＬｅｇＨ収率を示した。この改善は、メタノール／グリセロールおよ
びメタノール／デキストロ－ス（Ｄ－グルコース）を含有する誘導培地の両方で見られた
（図１１）。
実施例２７ ハイブリッドプロモーター株の特性評価
ダイズレグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）の追加のコピーが、すでにＬｅｇＨの数個のコピ
ー、全てのヘム生合成酵素、およびプロモーターｐＡＯＸ１（上でＭＸＹ０２９１と称し
た）の制御下にある転写因子Ｍｘｒ１を含有する株で、３種の異なる構成的プロモーター
、ｐＧＡＰ、ｐＧＣＷ１４およびｐＴＥＦ１の下で発現された。デキストロ－ス（即ち、
Ｄ－グルコース）の存在下でメタノールにより誘導される場合、構成的プロモーターおよ
びｐＡＯＸ１が、ＬｅｇＨの発現を推進するが、ｐＡＯＸ１プロモーターのみがヘム酵素
の発現を推進する。これはＬｅｇＨ収率において前の株ＭＸＹ０２９１と比較してさらな
る改善をもたらす（図１１）。
ダイズレグヘモグロビン（ＬｅｇＨ）の追加のコピーが、すでにＬｅｇＨの数個のコピ
ー、全てのヘム生合成酵素、およびプロモーターｐＡＯＸ１（上でＭＸＹ０２９１と称し
た）の制御下にある転写因子Ｍｘｒ１を含有する株で、３種の異なる構成的プロモーター
、ｐＧＡＰ、ｐＧＣＷ１４およびｐＴＥＦ１の下で発現された。デキストロ－ス（即ち、
Ｄ－グルコース）の存在下でメタノールにより誘導される場合、構成的プロモーターおよ
びｐＡＯＸ１が、ＬｅｇＨの発現を推進するが、ｐＡＯＸ１プロモーターのみがヘム酵素
の発現を推進する。これはＬｅｇＨ収率において前の株ＭＸＹ０２９１と比較してさらな
る改善をもたらす（図１１）。
本明細書で、方法および組成物を多くの異なる態様に関連して記載してきたが、様々な
態様の前述の記載は、例示を意図しており、方法および組成物の範囲を限定することは意
図しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の
範囲内である。
態様の前述の記載は、例示を意図しており、方法および組成物の範囲を限定することは意
図しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の
範囲内である。
開示された方法および組成物のために使用することができて、それらと関連して使用することができ、それらの調製に使用することができるかまたはそれらの生成物である方法および組成物が開示される。本明細書ではこれらのおよび他の材料が開示されて、これらの方法および組成物の組合せ、部分集合、相互作用、群その他が開示されることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法の各々の様々な個々のおよび集合的組合せおよび入れ替えへの特定の言及は、明示的に開示されない場合があるが、各々は、特定的に企図されて本明細書で説明されている。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示されおよび論じられ、および多くの組成物または方法が論じられていれば、特に反対のことが示されていない限り、組成物および方法の各々および全ての組合せおよび入れ替えが特定的に企図されている。同様に、これらの任意の部分集合または組合せも特定的に企図されて開示されている。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む、酵母細胞。
［２］
前記メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属（Torulopsis）からなる群から選択された酵母である、上記［１］に記載の酵母細胞。
［３］
前記メチロトローフ酵母細胞がピキア（Pichia）酵母である、上記［１］または［２］に記載の酵母細胞。
［４］
前記細胞がピキア（Pichia）細胞である、上記［１］または［２］に記載の酵母細胞。
［５］
前記細胞がピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、上記［１］から［４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［６］
前記組換え核酸分子が、前記メチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれている、上記［１］から［５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［７］
前記組換え核酸分子が、複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現されている、上記［１］から［５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［８］
前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ１配列、またはカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の酵母細胞。
［９］
前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列を含む、上記［１］から［８］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１０］
前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ５７３６５で示される配列を含む、上記［１］から［９］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１１］
前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４で示される核酸配列によりコードされる、上記［１０］に記載の酵母細胞。
［１２］
前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモーター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモーター要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素からなる群から選択される、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１３］
前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１４］
少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１５］
前記異種核酸が、鉄共同因子の生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、上記［１４］に記載の酵母細胞。
［１６］
前記鉄共同因子がヘムである、上記［１５］に記載の酵母細胞。
［１７］
前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される、上記［１６］に記載の酵母細胞。
［１８］
前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される２種以上のポリペプチドを含む、上記［１６］に記載の酵母細胞。
［１９］
前記酵母細胞が選択のための異種配列を欠く、上記［１］から［１８］のいずれかに記載の酵母細胞。
［２０］
細胞中で異種ポリペプチドを発現する方法であって、
先行する項目のいずれかに記載の酵母細胞を提供すること；
少なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および
前記組換え核酸分子の発現のために適当な条件下で前記細胞を培養して、それにより異種ポリペプチドを発現すること
を含む、方法。
［２１］
前記異種ポリペプチドが、グロビンファミリーＰＦ０００４２のメンバーである、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
前記異種ポリペプチドが植物ヘモグロビンである、上記［２０］に記載の方法。
［２３］
前記植物ヘモグロビンがレグヘモグロビンである、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
前記レグヘモグロビンが、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される配列を有する、上記［２３］に記載の方法。
［２５］
前記導入ステップが、形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換からなる群から選択される技法を含む、上記［２０］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記細胞が培養される前記条件が、鉄または薬学的にもしくは代謝的に許容されるそれらの塩の添加を含む、上記［２０］から［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］
前記培養ステップが、メタノールの存在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
前記培養ステップが、メタノールの不在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２９］
前記培養ステップが、選択の不在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］
組換え核酸分子を含むメチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、
Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＭｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸；
グロビンファミリー（ＰＦ０００４２）のメンバーをコードする核酸；および
ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸
を含む、メチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞。
［３１］
前記Ｍｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター
要素と作動的に連結している、上記［３０］に記載の酵母細胞。
［３２］
前記グロビンファミリーのメンバーがレグヘモグロビンである、上記［３０］に記載の方法。
［３３］
前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３４］
前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３５］
前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３６］
前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３７］
前記メタノール誘導性プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、上記［３０］、［３１］、［３３］、または［３５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３８］
前記構成的プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの転写伸長因子ＥＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）プロモーター要素である、上記［３０］、［３４］または［３６］のいずれかに記載の酵母細胞。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
組換え核酸分子を含むメチロトローフ酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする外因性核酸を含む、酵母細胞。
［２］
前記メチロトローフ酵母細胞が、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ピキア属（Pichia）およびトルロプシス属（Torulopsis）からなる群から選択された酵母である、上記［１］に記載の酵母細胞。
［３］
前記メチロトローフ酵母細胞がピキア（Pichia）酵母である、上記［１］または［２］に記載の酵母細胞。
［４］
前記細胞がピキア（Pichia）細胞である、上記［１］または［２］に記載の酵母細胞。
［５］
前記細胞がピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、上記［１］から［４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［６］
前記組換え核酸分子が、前記メチロトローフ酵母細胞のゲノムに安定に組み込まれている、上記［１］から［５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［７］
前記組換え核酸分子が、複製コンピテントプラスミドから染色体外で発現されている、上記［１］から［５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［８］
前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＡｄｒ１配列、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ１配列、またはカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＴｒｍ２配列を含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の酵母細胞。
［９］
前記転写活性化因子をコードする外因性核酸が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＭｘｒ１配列を含む、上記［１］から［８］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１０］
前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ５７３６５で示される配列を含む、上記［１］から［９］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１１］
前記転写活性化因子が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３９５１２４で示される核酸配列によりコードされる、上記［１０］に記載の酵母細胞。
［１２］
前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）からのＡＯＤ１プロモーター要素、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）からのＭＯＸプロモーター要素、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）からのＭＯＤ１プロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＤＨＡＳプロモーター要素、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＦＬＤ１プロモーター要素、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのＰＥＸ８プロモーター要素からなる群から選択される、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１３］
前記少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１４］
少なくとも１種のメタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む核酸分子をさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の酵母細胞。
［１５］
前記異種核酸が、鉄共同因子の生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする、上記［１４］に記載の酵母細胞。
［１６］
前記鉄共同因子がヘムである、上記［１５］に記載の酵母細胞。
［１７］
前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される、上記［１６］に記載の酵母細胞。
［１８］
前記ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドが、ＡＬＡシンターゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ＵＰＧＩＩＩシンターゼ、ＵＰＧＩＩＩデカルボキシラーゼ、ＣＰＧオキシダーゼ、ＰＰＧオキシダーゼ、およびフェロキラターゼからなる群から選択される２種以上のポリペプチドを含む、上記［１６］に記載の酵母細胞。
［１９］
前記酵母細胞が選択のための異種配列を欠く、上記［１］から［１８］のいずれかに記載の酵母細胞。
［２０］
細胞中で異種ポリペプチドを発現する方法であって、
先行する項目のいずれかに記載の酵母細胞を提供すること；
少なくとも１種のピキア・パストリス（Pichia pastoris）のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーター要素と作動的に連結しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種核酸を含む組換え核酸分子をメチロトローフ酵母細胞に導入すること；および
前記組換え核酸分子の発現のために適当な条件下で前記細胞を培養して、それにより異種ポリペプチドを発現すること
を含む、方法。
［２１］
前記異種ポリペプチドが、グロビンファミリーＰＦ０００４２のメンバーである、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
前記異種ポリペプチドが植物ヘモグロビンである、上記［２０］に記載の方法。
［２３］
前記植物ヘモグロビンがレグヘモグロビンである、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
前記レグヘモグロビンが、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される配列を有する、上記［２３］に記載の方法。
［２５］
前記導入ステップが、形質導入、電気穿孔、微粒子銃送達、および化学的形質転換からなる群から選択される技法を含む、上記［２０］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記細胞が培養される前記条件が、鉄または薬学的にもしくは代謝的に許容されるそれらの塩の添加を含む、上記［２０］から［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］
前記培養ステップが、メタノールの存在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
前記培養ステップが、メタノールの不在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２９］
前記培養ステップが、選択の不在下で前記細胞を培養することを含む、上記［２０］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］
組換え核酸分子を含むメチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞であって、前記組換え核酸分子が、
Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのＭｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸；
グロビンファミリー（ＰＦ０００４２）のメンバーをコードする核酸；および
ヘムの生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸
を含む、メチロトローフピキア（Pichia）酵母細胞。
［３１］
前記Ｍｘｒ１転写活性化因子配列をコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター
要素と作動的に連結している、上記［３０］に記載の酵母細胞。
［３２］
前記グロビンファミリーのメンバーがレグヘモグロビンである、上記［３０］に記載の方法。
［３３］
前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３４］
前記グロビンファミリーのメンバーをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３５］
前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、メタノール誘導性プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３６］
前記ヘム生合成に関与する少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が、構成的プロモーター要素と作動的に連結している、上記［３０］から［３４］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３７］
前記メタノール誘導性プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からのアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーター要素である、上記［３０］、［３１］、［３３］、または［３５］のいずれかに記載の酵母細胞。
［３８］
前記構成的プロモーター要素が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）からの転写伸長因子ＥＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）プロモーター要素である、上記［３０］、［３４］または［３６］のいずれかに記載の酵母細胞。
Claims (11)
- プロモーター要素と作動的に連結している転写活性化因子をコードする第１の核酸であって、ここで、前記プロモーター要素は、前記転写活性化因子に結合する第２の核酸を含み、前記転写活性化因子は、Ｍｉｔ１、Ｔｒｍ１およびＴｒｍ２から選択される、第１の核酸と、
ヘム含有ポリペプチドまたはヘム生合成に関与する酵素をコードする第３の核酸と
を含む、核酸構築物であって、
但し、前記核酸構築物は、翻訳エンハンサーエレメントを含まない、核酸構築物。 - 前記プロモーター要素が、ＡＯＸ１、ＭＯＸ、ＡＯＤ１、ＭＯＤ１、ＭＯＤ２、ＤＨＡＳ、ＦＬＤ１およびＰＥＸ８から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーター要素が、ＡＯＸ１である、請求項２に記載の核酸構築物。
- 前記転写活性化因子が、Ｔｒｍ１またはＴｒｍ２である、請求項１に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーター要素が、ＡＯＤ１である、請求項４に記載の核酸構築物。
- 前記転写活性化因子が、Ｍｉｔ１である、請求項１に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーター要素が、ＡＯＸ１である、請求項６に記載の核酸構築物。
- 終結配列をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
- 請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、メチロトローフ酵母細胞。
- 前記メチロトローフ酵母細胞が、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）およびトルロプシス属（Torulopsis）からなる群から選択された酵母である、請求項９に記載のメチロトローフ酵母細胞。
- 前記メチロトローフ酵母細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、請求項９に記載のメチロトローフ酵母細胞。
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