CN116042621A - 一种酵母杂交启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母杂交启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明以巴斯德毕赤酵母菌为表达宿主，通过将内源性组成型启动子Ppgk1、Pssa1、Pgcw14、Peno1、Pkar2经过随机杂交构建杂交启动子文库，结合高通量筛选策略，获得发酵前期转录水平显著提高的启动子变体。在发酵12h、24h分别是常用组成型启动子Pgap的2.86倍和1.97倍，为毕赤酵母的发酵和生产提供一个新型具有良好特征的启动子，丰富了可供毕赤酵母使用的启动子的种类。

Description

一种酵母杂交启动子及其应用
技术领域
本发明公开了一种酵母杂交启动子及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)作为一株甲基营养酵母菌株，因其独特的优势，如生物生长迅速、易于实现高密度发酵，低内源性蛋白质背景和强大的蛋白修饰折叠的能力等，被广泛用于基础研究的底盘微生物。随着合成生物学的兴起，毕赤酵母细胞工厂也已被广泛用于重组蛋白、生物制药以及高附加值化学品的工业生产等。
转录通常是基因表达的关键步骤。启动子在转录水平上决定了基因的表达水平，可以说启动子的活性高低在很大程度上影响着最终产物的表达水平。迄今，尽管在毕赤酵母里有大量野生型诱导型和组成型启动子可用，但是由于甲醇的毒性、诱导剂的加入导致成本的增加以及运输上的不安全，并且与诱导型启动子相比，组成型启动子通常可以简化培养过程，使用组成性启动子对于优化毕赤酵母细胞工厂更为有益。此外，在代谢工程和合成生物学中，尤其是代谢通路的构建往往会涉及到多个、跨越几个数量级基因的表达，对于启动子的常见改造，使用易错PCR等完全非理性改造，会产生大量无效突变，而且只是针对“某个”启动子的活性高低在变化。而根据不同启动子的结构，对不同区域进行随机杂交，既可以提高将不同功能特性糅合在同一启动子上的可能性，也使获得强启动子的概率增加。目前对于化学品的生产工业和基因表达的微调需要不同性质的具有优良特征的启动子。因此，基于启动子的特点进行设计和构建具有阶段特异性或不同特定强度的启动子至关重要。
发明内容
本发明是通过对毕赤酵母内源性组成型启动子Pkar2、Pssa1、Pgcw14、Ppgk1、Peno1杂交，将其连接到游离表达载体上，构建重组菌。以eGFP作为报告基因，得到杂交后的启动子在12h、24h的荧光强度分别提高至对照启动子Pgap的2.86倍和1.97倍，可极大地提高目的基因在发酵前期的表达水平。
本发明提供了一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了含有上述启动子的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pGAP-pan-HIS4、pYX212、或pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5为表达载体。
本发明还提供了一种携带上述启动子或上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
在一种实施方式中，所述重组细胞的表达宿主包括但不现由于大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母。
本发明还提供了一种酵母基因工程菌，所述酵母基因工程菌是将含有上述启动子、异源基因序列、终止子的表达框转化到宿主细胞中得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母基因工程菌是以毕赤酵母、酿酒酵母或产甘油假丝酵母为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酵母工程菌以Komagataella phaffii(Pichia pastoris)GS115、S.cerevisiae CEN.PK2-1C、产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5为表达宿主。
产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5的制备：以野生型菌株产甘油假丝酵母CCTCC：M93018(在中国专利CN1070235C中公开)为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对出发菌株URA5基因进行敲除，从而获得产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5。
本发明还提供了上述启动子在调控基因表达方面的应用，所述应用是将含有所述启动子的遗传构建体转化到酵母细胞中。
本发明还提供了上述启动子或上述重组载体或上述重组细胞或上述酵母基因工程菌在蛋白合成、代谢产物生产方面的应用。
本发明提供了上述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的制备方法，所述启动子是将核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示的Ppgk1启动子、Pssa1启动子、Pgcw14启动子、Peno1启动子、Pkar2启动子按照a～c进行杂交制备得到的：
(a)内源性启动子扩增；
(b)各启动子经内切酶SacI、DraI酶切；
(c)片段以等摩尔比经T4 DNA Ligase连接；
本发明提供了一种生产蛋白的方法，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上述启动子启动目的蛋白的表达。
在一种实施方式中，将上述启动子连接至报告蛋白eGFP基因的上游，构建得到重组质粒，将重组质粒转入毕赤酵母中得到重组菌。
在一种实施方式中，将所述重组菌接种至48孔板中，在30℃，200r/min下培养。
在一种实施方式中，将所述重组菌接种至MD液体培养基中，在28～30℃培养。
在一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白。
在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供了所述的启动子，或所述表达载体，或所述微生物细胞在提高目的蛋白表达量中的应用。
有益效果
本发明通过在毕赤酵母内源性组成型启动子Pkar2、Pssa1、Pgcw14、Ppgk1、Peno1之间随机杂交的基础上筛选到一个强启动子，在发酵前期表达水平明显增强，将其应用于eGFP的表达时，培养12h、24h其荧光强度分别提高至常用组成型启动子Pgap的2.86倍和1.97倍，适用于前期增强表达、后期微弱表达的状况。
附图说明
图1：毕赤酵母游离表达载体的质粒图谱pGAP-HIS4-GFP。
图2：为启动子杂交文库的构建和表征示意图。
图3：为克隆各内源性启动子基因胶图。
图4：构建毕赤酵母游离表达载体pGAP-HIS4-GFP。
图5：为构建的杂交强启动子在毕赤酵母中荧光蛋白的表达情况，其中图5a为12h绿色荧光蛋白表达情况，图5b为24h绿色荧光蛋白表达情况。
图6：酿酒酵母游离表达载体示意图。
图7：产甘油假丝酵母游离表达载体示意图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5的制备：以野生型菌株产甘油假丝酵母CCTCC：M93018(在中国专利CN1070235C中公开)为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对出发菌株URA5基因进行敲除，从而获得产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MD液体培养基(g/L):葡萄糖20，YNB 13.4，生物素0.4。
MD固体培养基(g/L):在MD液体培养基的基础之上添加20g/L的琼脂。
各组分溶解后高压灭菌；0.22μm滤膜过滤除菌的生物素在冷却到60℃后加入。
YNB液体培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，pH＝6.2～6.5。
尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，亮氨酸60mg/L、组氨酸20mg/L、色氨酸20mg/L，pH＝6.2～6.5。
下述实施例中所涉及的培养方法如下：
平板培养：静置培养3-4天，培养温度30℃。
孔板培养：48深孔板培养温度30℃，摇床转速200r/min。
摇瓶培养：挑取单菌落接入液体培养基中，培养温度30℃，摇床转速200r/min。
下述实施例中所涉及的绿色荧光蛋白表达量及生物量测定如下：
在96孔板中用PBS缓冲液将发酵液稀释至合成浓度，使用多功能酶标仪Biotek(美国伯腾仪器有限公司)测定，绿色荧光激发波长：488nm；绿色荧光发射波长：520nm；细胞吸收波长：600nm。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：所用引物
Figure BDA0004040849170000041
Figure BDA0004040849170000051
实施例1：毕赤酵母游离表达载体pGAP-HIS4-GFP的构建
具体步骤如下：
(1)以实验室前期构建的载体pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5(具体构建方法记载于公开号为CN114085863A的中国发明专利申请文本中)为模板，使用引物对FPHIS4 F/R(见表1)对目标片段进行反向PCR扩增，PCR反应体系如下(50μL)：25μL Ex Taq DNA聚合酶(2×)，15pmol引物，150ng模板，加双蒸水至50μL(引物为上海亦欣生物科技有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；60℃，15s，72℃，2kb/min，30个循环。之后按照试剂盒说明书进行回收。
(2)以质粒pPIC9k为模板，使用引物对HIS4 F/R(见表1)对目标片段进行PCR扩增，反应体系与条件如步骤(1)所述。
(3)将步骤(1)和(2)中分别得到的基因片段和载体，通过同源重组技术完成连接，并将连接产物转入JM109感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入1mL LB培养基，37℃孵育1小时(37℃，200r/min)，离心菌液后涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，用引物YZ-HIS4-F/R(见表1)进行菌落PCR验证，条带正确的挑菌进行液体培养，提取质粒备用(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。
(4)对于步骤(3)中得到的质粒经过SphI&PstI双酶切验证，结果如图4所示。
最终得到pGAP-HIS4-GFP重组载体(图1)。
实施例2：构建含有杂交启动子、报告基因eGFP的重组质粒
启动子杂交文库的构建和表征如图2所示，具体步骤如下：
(1)以毕赤酵母GS115基因组(NCBI编号为：22977)为模板，用引物(见表1)对目标启动子进行PCR扩增。PCR反应体系与条件如实施例1步骤(1)所述，扩增产物电泳完毕后(如图3所示)按照试剂盒说明书进行回收，获得了各启动子Ppgk1、Pssa1、Pgcw14、Peno1、Pkar2基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示)。
(2)将步骤(1)获得的启动子基因经限制性核酸内切酶Sac I、Dra I酶切。酶切反应体系如下(50μL)：10μL Quick Cut Buffer，2μL SacI&DraI(购自TaKaRa公司)，30μL基因片段(200ng/μL)，加双蒸水至50μL。酶切条件如下：37℃水浴3h。酶切完毕之后经过乙醇沉淀回收DNA。回收步骤如下：向酶切反应液中加入1/10体积的乙酸钠(3mol/L，PH＝5.2)、2倍体积无水乙醇充分混匀后置于-40℃中1～2h，9000rpm离心20分钟；加入1/2离心管容量的70％乙醇，9000rpm离心10分钟，移出上清液后开盖使残留的乙醇挥发后加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。
(3)将步骤(2)中回收到的基因片段以等摩尔比经用T4 DNA Ligase连接。连接反应体系如下(50μL)：10μL Ligase Buffer，5μL T4 DNA Ligase(购自TaKaRa公司)，各基因片段等摩尔比混合，加双蒸水至50μL。过夜连接后按照步骤(2)乙醇沉淀说明进行回收。
(4)以实施例1构建的毕赤酵母游离表达质粒pGAP-HIS4-GFP为模板，使用引物对FP F/R(见表1)对目标片段进行反向PCR扩增，反应体系与条件如实施例1步骤(1)所述。
(5)将步骤(3)和(4)中分别得到的基因片段和载体，通过同源重组技术完成连接，具体反应条件与步骤如实施例1步骤(1)所述。用引物YZ-promoter-F/R(见表1)进行菌落PCR验证，洗下平板上菌体进行液体培养，提取质粒备用(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，分别制备得到含有不同杂交启动子的重组质粒：p杂交启动子-HIS4-GFP。
实施例3：含有不同杂交启动子的重组菌的构建
具体步骤如下：
将实施例2中构建得到的重组质粒p杂交启动子-HIS4-GFP通过氯化锂化学转化法转化到毕赤酵母菌GS115中，制备得到重组毕赤酵母GS115/p杂交启动子-HIS4-GFP：
将毕赤酵母GS115接入YPD液体培养基中，在30℃，200r/min条件下摇瓶培养，当OD600值达到2～3后，离心收集菌体，无菌双蒸水洗涤2次。
重悬于转化体系：240μL 50％PEG3350，36μL 1mol/L LiCl，25μL 5mg/mL ssDNA(使用前98℃煮沸10min后冰浴5min)，15～20μL质粒，补足无菌双蒸水至360μL。
充分混匀后，42℃热激60min，离心收集菌体，重悬于1mL YPD液体培养基，后培养2小时(30℃，200r/min)。离心收集菌体，无菌双蒸水洗涤3次，加入100μL双蒸水，混匀后涂布于MD固体培养基，30℃恒温培养箱中培养3～4天得到转化子，制备得到各重组杂交启动子的重组菌：GS115/p杂交启动子-HIS4-GFP。
实施例4：重组菌的筛选及绿色荧光蛋白的表达
具体步骤如下：
(1)分别挑取实施例3中得到的单菌落GS115/p杂交启动子-HIS4-GFP，接种到含有1mLMD液体培养基的48深孔板中，在30℃，200r/min下培养，12h、24h后测定eGFP的表达强度和OD600，结果如表2所示。
表2：不同菌株在12h、24h中的荧光强度
Figure BDA0004040849170000071
注：表中每一个单元格代表一个单菌。
(2)将步骤(1)中相对荧光强度最强的5个单菌落，分别命名为：GS115/p1-HIS4-GFP、GS115/p2-HIS4-GFP、GS115/p3-HIS4-GFP、GS115/p4-HIS4-GFP、GS115/p5-HIS4-GFP，接种至含有30mL液体MD培养基的250mL摇瓶中，在30℃、200rpm下培养，定时测定eGFP的表达强度和OD600；相对荧光强度定义为eGFP的表达强度/OD600，同时，以GS115/pGAP-HIS4-GFP作为对照，其结果如表3、图5a～b所示，其中图5a分别是含有GAP的菌株、含有P1(pHybrid)启动子的菌株在12h的相对荧光强度；图5b分别是含有GAP的菌株、含有P1(pHybrid)启动子的菌株在24h的相对荧光强度。
表3：不同菌株在不同时间的相对荧光强度
Figure BDA0004040849170000072
Figure BDA0004040849170000081
结果显示：孔板中选择的5个单菌在摇瓶水平上也能达到较高的表达水平，可见，最优的启动子是P1，命名为pHybrid，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
据表3可得；所得杂交启动子P1在12h、24h的相对荧光强度分别为GAP的2.86倍和1.97倍；具体为：70110.87/24347.13＝2.86；41884.46/21261.15＝1.97。
实施例5：杂交启动子pHybrid特征的广谱性
将实施例4中得到重组毕赤酵母菌GS115/p1-HIS4-GFP(GS115/ppHybrid-HIS4-GFP)中含有目标杂交启动子的质粒进行提取备用(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。按照案例1步骤(3)中大肠杆菌转化方法将质粒ppHybrid-HIS4-GFP重新转入大肠杆菌进行游离性验证，用引物YZ-promoter-F/R(见表1)菌落PCR验证并将所杂交启动子质粒ppHybrid-HIS4-GFP，送至上海生工测序。
(1)分别以酿酒酵母和产甘油假丝酵母游离表达质粒pYX212、pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5为模板，使用引物对FP-S.c F/R、FP-C.g F/R(见表1)对目标片段进行反向PCR扩增，反应体系与条件如步骤(1)所述。
(2)使用引物对phybrid-F/R(见表1)对杂交启动子片段进行PCR扩增，反应体系与条件如案例1步骤(1)所述。将启动子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)通过同源重组技术连接至酿酒酵母、产甘油假丝酵母游离表达载体，对eGFP表达情况定时测定。具体转化、测定方法如实施例1中所述，得到的表达载体pYX212-pHybrid-GFP(图6)、pTpHybrid-GFP-TRP1t-panARS-URA5(图7)。
(3)将步骤(2)得到的表达载体pYX212-pHybrid-GFP、pTpHybrid-GFP-TRP1t-panARS-URA5以及对照质粒pYX212-pGAP-GFP、CCTCC:M93018ΔURA5/pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5分别导入到酿酒酵母S.cerevisiae CEN、产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5中，分别制备得到重组菌株：酿酒酵母S.cerevisiae CEN/pYX212-pHybrid-GFP、S.cerevisiae CEN/pYX212-pGAP-GFP；产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5/pTpHybrid-GFP-TRP1t-panARS-URA5、CCTCC：M93018ΔURA5/pT GAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5；其中pHybrid为酵母杂交启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(4)分别将上述重组菌株酿酒酵母S.cerevisiae CEN/pYX212-pHybrid-GFP、产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5/pTpHybrid-GFP-TRP1t-panARS-URA5接种至尿嘧啶缺陷型YNB液体培养基中，在30℃，200rpm条件下培养，分别检测荧光蛋白的表达量和生物量，其相对荧光水平结果表4及表5所示。
表4：重组菌株的荧光蛋白的相对荧光强度
Figure BDA0004040849170000091
表5：重组菌株的荧光蛋白的相对荧光强度
Figure BDA0004040849170000092
结果显示：所得到的杂交启动子在酿酒酵母、产甘油假丝酵母中都能比对照质粒达到相对高的荧光水平，具有良好的酵母普遍适用性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.携带权利要求1所述启动子的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5或pYX212为表达载体。
4.携带权利要求1所述启动子或权利要求2或3所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种酵母基因工程菌，其特征在于，所述酵母基因工程菌是将携带权利要求1所述的启动子、异源基因序列、终止子的表达框转化到宿主细胞中得到的。
7.根据权利要求6所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述酵母基因工程菌是以毕赤酵母、酿酒酵母或产甘油假丝酵母为宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为Komagataellaphaffii GS115；所述酿酒酵母为S.cerevisiae CEN；所述产甘油假丝酵母为敲除URA5基因的产甘油假丝酵母CCTCC：M93018。
9.权利要求1所述启动子在调控基因表达方面的应用，其特征在于，所述应用是将含有所述启动子的遗传构建体转化到酵母细胞中进行基因的表达。
10.权利要求1所述的启动子或权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求6～8任一所述的酵母基因工程菌在蛋白合成、代谢产物生产方面的应用。
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