CN116254286A - 氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法，其构建方法包括：将酿酒酵母菌中的半乳糖调控系统的转录抑制因子Gal80敲除，将酿酒酵母菌中的转录激活因子Gal4的启动子替换为氰胺诱导型DDI2/3启动子，所获的酿酒酵母工程菌可以使氰胺诱导系统偶联半乳糖(GAL)表达系统，实现氰胺剂量响应的GAL表达系统信号输出。当氰胺诱导系统用于调控酿酒酵母菌中内源ARO1突变体(N端降解子融合于AroD组份)的活性时，该表达系统表现出良好的低渗漏特征。因此，采用上述方法构建可得到严谨可控且高效的酿酒酵母蛋白表达系统，未来可应用于高效表达蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是酵母种属中应用最广泛的菌株，也是最早实现工业化生产的微生物之一，其工业化应用历程反映了生物产业的发展。
在工业生产方面，酿酒酵母菌株具备良好的生产性能。相较于多数细菌菌株，酿酒酵母具备耐酸、不易受噬菌体等菌株污染的优点。酵母能够在低pH下进行发酵，这不仅减少用于控制pH的碱液消耗，而且能简化除盐工艺，有效降低了产品的分离成本。正是因为酿酒酵母强鲁棒性和集成分离工艺的经济性，在生产菌株性能差距不大的情况下，工业规模的生产会倾向于选择酿酒酵母菌株进行生产。
然而，想要最大化目标化合物的产量，就需要优化平衡酿酒酵母胞内代谢流、缓解细胞生产的代谢压力、解决降低中间产物积累等问题，以实现目标化合物高产量、高产率、高转化。要实现上述目的，调控合成途径酶的表达便是关键。
选用不同强度的启动子来调控外源基因的转录活性是一种常用的表达调控方法。在酿酒酵母中，有大量研究成熟的启动子可以使用，这些启动子主要分为组成型和诱导型两大类。组成型启动子使基因在所有组织中启动表达，不受外界条件的影响。这类启动子无需诱导物，所启动基因的表达具持续性。酿酒酵母中常用的组成型启动子有TEF1、PGK等。然而组成型的持续表达使外源蛋白积累，可能导致代谢负担，造成菌体生长受阻等影响。
诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子的转录活性受到诱导剂控制，进而能够实现时间、空间以及强度的调控。酿酒酵母中已发掘多种诱导型启动子，包括由铜离子诱导的CUP1启动子、由半乳糖诱导的GAL表达系统、被葡萄糖抑制及乙醇诱导的ADH2启动子等。其中，GAL1、GAL10启动子因其调控机理清晰、表达严谨被广泛使用于外源基因的表达。GAL1、GAL10启动子受转录激活蛋白Gal4及其抑制子Gal80的调控，其以半乳糖为碳源启动表达。但是，半乳糖的价格昂贵，不利于工业化生产成本控制；此外，酵母的生长需要葡萄糖，转换碳源既会增加生产步骤，还会增加调控的复杂性，不利于规模化生产应用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，其包括：
将酿酒酵母菌中的Gal80敲除，将酿酒酵母菌中的Gal4启动子替换为氰胺诱导型DDI2/3启动子，在酿酒酵母菌内源的ARO1基因的AROD组分融合N端降解子，以便获得重组酿酒酵母菌。
根据本发明实施例的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，该方法将酿酒酵母菌中的Gal80基因敲除；将酿酒酵母菌中的Gal4启动子替换为内源性DDI2/3氰胺诱导启动子，从而使酿酒酵母的半乳糖调控系统转变为氰胺诱导的严谨型酿酒酵母表达系统。当氰胺诱导系统进一步用于调控酿酒酵母菌中内源ARO1突变体(N端降解子融合于AroD组份)的活性时，氰胺诱导系统可严格控制烟草蚀刻病毒的半胱氨酸蛋白酶(TEV)表达，在添加氰胺诱导时无法合成色氨酸和苯丙氨酸而致死，在不添加氰胺诱导时菌体保持正常生长。因此，本发明涉及的严谨可控且高效的酿酒酵母蛋白表达系统，未来可应用于高效表达蛋白，同时在酿酒酵母代谢工程领域具有研究和应用价值，具有巨大的工业化应用潜力。
另外，根据本发明上述实施例提出的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Gal80_del_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的Gal80_del_R为引物，经PCR扩增得到Gal80敲除片段。
可选地，以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DDI2_IntGal4_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的DDI2_IntGal4_R为引物，经PCR扩增得到DDI2/3启动子序列。
可选地，以核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的基因为模板，核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示的NdegF-SplitD_F和核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的NdegF-SplitD_R为引物，经PCR扩增得到N端降解子核酸片段。
可选地，酿酒酵母菌中的Gal80敲除，Gal4启动子替换为DDI2/3启动子和N端降解子融合于酿酒酵母菌内源ARO1基因的AROD组分均是通过CRISPR/Cas9无痕敲入技术操作。
在本发明的第二个方面，本发明提出由上述工程菌的构建方法构建得到的氰胺诱导的酿酒酵母工程菌。
根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌，可实现利用廉价的氰胺作为诱导剂，实现酿酒酵母可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的氰胺诱导表达系统的设计思路；
图2为根据本发明实施例的氰胺梯度诱导绿色荧光蛋白表达；
图3为根据本发明实施例的氰胺诱导Aro1蛋白靶向降解的生长抑制情况。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。
所用材料来源：酿酒酵母CEN.PK2-1C和TOP10为市售，其中TOP10菌株用于载体构建。常规半乳糖诱导表达载体pRS425GAL1为市售。Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒和基因组DNA提取试剂盒购买自上海生物工程有限公司。
LB培养基组成为：10g·L-1蛋白胨、5g·L-1酵母粉、5g·L-1NaCl，余量为双蒸水，需要时添加15g·L-1琼脂粉制成固体培养基。
YPD培养基组成为：10g·L-1酵母粉、20g·L-1蛋白胨、20g·L-1葡萄糖，余量为双蒸水，需要时添加15g·L-1琼脂粉制成固体培养基。
YNBD培养基组成为：葡萄糖20g·L-1、酵母基础氮源(YNB)6.7g·L-1、以及根据实际需要添加氨基酸以达到筛选等目的。
氰胺购买于上海麦克林生化科技股份有限公司。
在以下实施例中，采用已报道的CRISPR/Cas9技术(DiCarlo JE,et al.NucleicAcids Res41(7):4336-43)进行敲除和整合操作；感受态细胞制备流程及电击法采用已报道方法(DiCarlo JE,et al.Nucleic Acids Res 41(7):4336-43)操作。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
1、敲除酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C基因组中的Gal80基因
以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Gal80_del_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的Gal80_del_R为引物，经高保真酶PCR扩增，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶，使用胶回收试剂盒回收，得到回收产物即为Gal80敲除片段。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环29次；72℃2min。
以CEN.PK2-1C为出发菌株，制作感受态。将上一步得到的Gal80敲除片段通过CRISPR/Cas9技术敲除CEN.PK2-1C基因组的Gal80基因，得到敲除菌株。
使用核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的Gal80_F200为前引物、核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的Gal80_R200为后引物，PCR确认所得敲除菌株JS-Δgal80。
2、DDI2/3启动子替换步骤1所得酿酒酵母工程菌株基因组的GAL4启动子
以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DDI2_IntGal4_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的DDI2_IntGal4_R为引物，经高保真酶PCR扩增得到DDI2/3启动子序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶，使用胶回收试剂盒回收，得到回收产物即为目的片段。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃1min，72℃1min，循环30次；72℃2min。
活化步骤1所得的敲除菌株JS-Δgal80并制作感受态。将上一步得到的DDI2/3启动子片段通过CRISPR/Cas9技术替换酿酒酵母工程菌株基因组的GAL4基因，得到酿酒酵母工程菌株JS-Cyan。
使用核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的Gal4_F300为前引物、核苷酸序列为SEQIDNO:8所示的Gal4in_R100为后引物，PCR确认所得酿酒酵母工程菌株JS-Cyan。
表1：PCR扩增引物列表
实施例2
将实施例1步骤2构建的酿酒酵母工程菌株JS-Cyan制备感受态细胞，再将含有EGFP绿色荧光蛋白基因(Sheff MA,et al.Yeast 21(8):661-70.)的pRS425GAL1表达载体通过电击法导入重组酿酒酵母菌感受态细胞中，涂至YNBD-Leu平板，在30℃下培养48h；挑点至YNBD-Leu液体培养基中，在30℃下培养24h。
以1％的接种量将上一步所得菌液接种至新的YNBD-Leu液体培养基，在接种后立刻向培养基中添加0～1mM范围内不同浓度氰胺，在30℃下培养24h。使用酶标仪检测GFP信号值。
结果如图2所示，氰胺在0～1mM时可诱导EGFP生成，EGFP合成量与氰胺诱导浓度呈正相关。
实施例3
以核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的基因为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的NdegF-SplitD_F和核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的NdegF-SplitD_R为引物，经高保真酶PCR扩增，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶，使用胶回收试剂盒回收，得到回收产物即为N端降解子核酸片段。PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃1min，72℃1min，循环30次；72℃2min。将上一步得到的N端降解子核酸片段通过CRISPR/Cas9技术整合至酿酒酵母工程菌株JS-Cyan基因组的ARO1基因上，使用核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的NdegF_fwd为前引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的ScAroE_rev为后引物，PCR确认所得酿酒酵母工程菌株JS-Cyan-Aro1splitDE。
为验证酿酒酵母工程菌株的严谨调控功能，进行生长抑制实验。活化酿酒酵母工程菌株JS-Cyan-Aro1splitDE，并制作感受态细胞，将含有p14*-TEV基因的PCT190-6载体通过电击法导入JS-Cyan-Aro1splitDE酿酒酵母菌感受态中，涂至YNBD-Ura固体培养基上，在30℃下培养48h；挑点至YNBD-Ura液体培养基中，在30℃下培养24h。取1mL菌液，用双蒸水逐级稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个稀释度的菌悬液。分别取10μL，垂直滴于缺失色氨酸、苯丙氨酸、添加500μM氰胺的YNBD固体培养基和缺失色氨酸、苯丙氨酸的YNBD固体培养基上，在30℃下培养48小时。
结果如图3所示，在添加了500μM氰胺的固体培养基上，氰胺诱导TEV酶表达，进而部分降解了Aro1酶，因此酿酒酵母工程菌株JS-Cyan-Aro1splitDE无法合成色氨酸和苯丙氨酸，无法在缺失色氨酸和苯丙氨酸的条件下生长；而在未添加氰胺的固体培养基上，TEV酶不表达，酿酒酵母工程菌株JS-Cyan-Aro1splitDE可在缺失色氨酸和苯丙氨酸的条件下生长。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (6)
1.一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
将酿酒酵母菌中的Gal80敲除，将酿酒酵母菌中的Gal4启动子替换为氰胺诱导型DDI2/3启动子，在酿酒酵母菌内源的ARO1基因的AROD组分融合N端降解子，以便获得重组酿酒酵母菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Gal80_del_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的Gal80_del_R为引物，经PCR扩增得到Gal80敲除片段。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DDI2_IntGal4_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的DDI2_IntGal4_R为引物，经PCR扩增得到DDI2/3启动子序列。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述N端降解子序列是以核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的N-degron为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:09所示的NdegF-SplitD_F和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的NdegF-SplitD_R为引物，经PCR扩增得到。
5.如权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，酿酒酵母菌中的Gal80敲除，Gal4启动子替换为DDI2/3启动子，N端降解子融合于酿酒酵母菌内源ARO1基因的AROD组分是通过CRISPR/Cas9无痕敲入技术操作。
6.一种氰胺诱导的酿酒酵母工程菌，其特征在于，由如权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建得到。
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