JPH10234375A - マルチクローニングベクター - Google Patents
マルチクローニングベクターInfo
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- JPH10234375A JPH10234375A JP9046296A JP4629697A JPH10234375A JP H10234375 A JPH10234375 A JP H10234375A JP 9046296 A JP9046296 A JP 9046296A JP 4629697 A JP4629697 A JP 4629697A JP H10234375 A JPH10234375 A JP H10234375A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】単一の発現ベクターで容易にＳ．ポンベを形質
転換させることができかつ形質転換体の選別が極めて効
率よく行いうるマルチクローニングベクターの提供。 【解決手段】分裂酵母Ｓ．ポンベにおいて機能しうるプ
ロモーター（ｈＣＭＶｐ）、該プロモーターによって支
配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチ
クローニングサイト、及びＳ．ポンベにおいて機能しう
る複製開始点を有し、好ましくは更に、ｈＣＭＶｐより
も低い転写活性を有する第２のプロモーター（ＳＶ４０
ｐ）、第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子、大腸菌内で機能しうる薬剤耐性遺伝子、
Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を相補しうる構造遺伝子、
大腸菌内で機能してベクターを多複製数に増幅しうる第
２の複製開始点などを有するマルチクローニングベクタ
ー。並びに、このマルチクローニングベクターに異種蛋
白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクター、この発現
ベクターを有するＳ．ポンベ形質転換体、及びその形質
転換体を用いる異種蛋白質の製造法。
転換させることができかつ形質転換体の選別が極めて効
率よく行いうるマルチクローニングベクターの提供。 【解決手段】分裂酵母Ｓ．ポンベにおいて機能しうるプ
ロモーター（ｈＣＭＶｐ）、該プロモーターによって支
配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチ
クローニングサイト、及びＳ．ポンベにおいて機能しう
る複製開始点を有し、好ましくは更に、ｈＣＭＶｐより
も低い転写活性を有する第２のプロモーター（ＳＶ４０
ｐ）、第２のプロモーターによって支配される抗生物質
耐性遺伝子、大腸菌内で機能しうる薬剤耐性遺伝子、
Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を相補しうる構造遺伝子、
大腸菌内で機能してベクターを多複製数に増幅しうる第
２の複製開始点などを有するマルチクローニングベクタ
ー。並びに、このマルチクローニングベクターに異種蛋
白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクター、この発現
ベクターを有するＳ．ポンベ形質転換体、及びその形質
転換体を用いる異種蛋白質の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分裂酵母シゾサッ
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe 、以
下Ｓ．ポンベという）による異種蛋白質の製造に有用な
マルチクローニングベクターに関する。また、このマル
チクローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入
してなる発現ベクター、この発現ベクターを含有する
Ｓ．ポンベからなる形質転換体、その形質転換体を用い
る異種蛋白質の製造法に関する。
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe 、以
下Ｓ．ポンベという）による異種蛋白質の製造に有用な
マルチクローニングベクターに関する。また、このマル
チクローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入
してなる発現ベクター、この発現ベクターを含有する
Ｓ．ポンベからなる形質転換体、その形質転換体を用い
る異種蛋白質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた異種蛋白質の
生産は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、以下
Ｅ．コリという）、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae、以下Ｓ．セレビシエという）お
よびバチルス（Bacillus）属等の微生物、あるいは動物
細胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いて盛んに行われて
きた。様々な生物由来の蛋白質（本発明ではこの用語を
ポリペプチドと区別しない意味で用いる）が対象と考え
られ、既に多くのものが工業的に生産され、医薬品等に
用いられている。
生産は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、以下
Ｅ．コリという）、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae、以下Ｓ．セレビシエという）お
よびバチルス（Bacillus）属等の微生物、あるいは動物
細胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いて盛んに行われて
きた。様々な生物由来の蛋白質（本発明ではこの用語を
ポリペプチドと区別しない意味で用いる）が対象と考え
られ、既に多くのものが工業的に生産され、医薬品等に
用いられている。
【０００３】しかし、原核生物を用いる方法では必ずし
も全ての蛋白質に対して有効ではなく、真核生物由来の
蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ立体構
造を再現することは必ずしも容易ではない。実際、原核
細胞にて生産された生産物の構造および活性が不均一で
あるために医薬品等への利用が拒まれているものも知ら
れている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3428-3432,198
9)。
も全ての蛋白質に対して有効ではなく、真核生物由来の
蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ立体構
造を再現することは必ずしも容易ではない。実際、原核
細胞にて生産された生産物の構造および活性が不均一で
あるために医薬品等への利用が拒まれているものも知ら
れている(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3428-3432,198
9)。
【０００４】またＥ．コリには特有のエンドトキシンが
存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。動物細
胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いる方法は扱いが微生
物より難しく、培養にコストがかかり、得られる細胞濃
度が低いために、生産効率が悪い。このため異種蛋白
質、特に真核生物由来の蛋白質を生産するために最も理
想的な生物は、微生物でありかつ真核生物である酵母で
あるとされている。培養方法も確立しており、真核生物
の遺伝情報を発現させるという点でも都合がよい。従来
より醗酵並びに食品工業で用いられており、人体に関す
る安全性も確立されている。エンドトキシンも含まな
い。
存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。動物細
胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いる方法は扱いが微生
物より難しく、培養にコストがかかり、得られる細胞濃
度が低いために、生産効率が悪い。このため異種蛋白
質、特に真核生物由来の蛋白質を生産するために最も理
想的な生物は、微生物でありかつ真核生物である酵母で
あるとされている。培養方法も確立しており、真核生物
の遺伝情報を発現させるという点でも都合がよい。従来
より醗酵並びに食品工業で用いられており、人体に関す
る安全性も確立されている。エンドトキシンも含まな
い。
【０００５】酵母類のなかでもＳ．ポンベはＳ．セレビ
シエよりも動物細胞に近い性質を持つと考えられてい
る。このため、異種蛋白質を発現させる宿主としてＳ．
ポンベを用いることによって、動物細胞の場合と同様
の、より天然体に近い遺伝子産物が得られることが期待
される。培養方法も酵母類で共通の点が多く、他の酵母
で知られている知見を容易に応用しうる。したがって、
微生物学の方法と組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｓ．ポン
ベを用いた異種蛋白質製造法を用いることが有利である
のは明白である。
シエよりも動物細胞に近い性質を持つと考えられてい
る。このため、異種蛋白質を発現させる宿主としてＳ．
ポンベを用いることによって、動物細胞の場合と同様
の、より天然体に近い遺伝子産物が得られることが期待
される。培養方法も酵母類で共通の点が多く、他の酵母
で知られている知見を容易に応用しうる。したがって、
微生物学の方法と組換えＤＮＡ技術を用いて、Ｓ．ポン
ベを用いた異種蛋白質製造法を用いることが有利である
のは明白である。
【０００６】ところが、Ｓ．ポンベを用いた遺伝子組換
えに関する研究はＥ．コリやＳ．セレビシエに比べてか
なり遅れており、特に遺伝子発現に関する研究は少な
い。例えば、本発明者らの研究以外には特開昭６１−１
８１３９７、特開平２−２８３２８８および特開平４−
６３５９６等に記載された発明があるにすぎない。
えに関する研究はＥ．コリやＳ．セレビシエに比べてか
なり遅れており、特に遺伝子発現に関する研究は少な
い。例えば、本発明者らの研究以外には特開昭６１−１
８１３９７、特開平２−２８３２８８および特開平４−
６３５９６等に記載された発明があるにすぎない。
【０００７】本発明者らは上記問題を解決しうるマルチ
クローニングベクターや発現ベクターを構築した（特開
平５−１５３８０、特開平７−１６３３７３、ＷＯ９６
／２３８９０参照）。これら公報等に記載されているよ
うに、この発現ベクターを用いることにより、これまで
にＳ．ポンベを宿主としてヒトリポコルチンＩ、ラット
アルギナーゼ、ヒトアルギナーゼ、ラットＮＤＰキナー
ゼ、ヒトインターロイキン６、チトクロームＣなど多数
の異種蛋白質の発現に成功している。
クローニングベクターや発現ベクターを構築した（特開
平５−１５３８０、特開平７−１６３３７３、ＷＯ９６
／２３８９０参照）。これら公報等に記載されているよ
うに、この発現ベクターを用いることにより、これまで
にＳ．ポンベを宿主としてヒトリポコルチンＩ、ラット
アルギナーゼ、ヒトアルギナーゼ、ラットＮＤＰキナー
ゼ、ヒトインターロイキン６、チトクロームＣなど多数
の異種蛋白質の発現に成功している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし、本発明者らの
発明にかかわる上記発現ベクターはその内部にＳ・ポン
ベ細胞内で機能しうる複製開始点（例えば、後述ａｒ
ｓ）を有さないことから、この発現ベクターは宿主内で
複製（増幅）されない。そのため複製開始点を有する他
の酵母ベクター（導入ベクター）とこの発現ベクターと
を同時に酵母に導入し、酵母内での組換え（homologous
recombination）をおこさせることが必要であった。こ
の酵母内組換えにより発現ベクターに複製開始点が導入
され、導入された複製開始点によって発現ベクターの宿
主内複製が起こる。
発明にかかわる上記発現ベクターはその内部にＳ・ポン
ベ細胞内で機能しうる複製開始点（例えば、後述ａｒ
ｓ）を有さないことから、この発現ベクターは宿主内で
複製（増幅）されない。そのため複製開始点を有する他
の酵母ベクター（導入ベクター）とこの発現ベクターと
を同時に酵母に導入し、酵母内での組換え（homologous
recombination）をおこさせることが必要であった。こ
の酵母内組換えにより発現ベクターに複製開始点が導入
され、導入された複製開始点によって発現ベクターの宿
主内複製が起こる。
【０００９】また、本発明者らの発明を記載した上記特
開平７−１６３３７３には、その発明にかかわるマルチ
クローニングベクター（ｐＴＬ２Ｍ１）に複製開始点を
導入しうると記載されている。しかし引き続いて、この
マルチクローニングベクターは大きなベクターでありそ
のようなベクターに複製開始点を導入することは実際に
は困難であり、酵母内組換えにより発現ベクターに複製
開始点が導入される、と記載されている。
開平７−１６３３７３には、その発明にかかわるマルチ
クローニングベクター（ｐＴＬ２Ｍ１）に複製開始点を
導入しうると記載されている。しかし引き続いて、この
マルチクローニングベクターは大きなベクターでありそ
のようなベクターに複製開始点を導入することは実際に
は困難であり、酵母内組換えにより発現ベクターに複製
開始点が導入される、と記載されている。
【００１０】この酵母内組換えによる複製開始点の導入
において、酵母内組換えの過程の人為的な制御は事実上
不可能である。そのため、導入ベクターの複製開始点以
外の部分が発現ベクターに導入されるなどの目的とする
組換え以外の組換えが起こる場合が少なくない。このよ
うな目的とする組換え以外の組換えによる組換え体が生
成した場合は目的とする組換え体の選択に多大な労力を
必要とした。
において、酵母内組換えの過程の人為的な制御は事実上
不可能である。そのため、導入ベクターの複製開始点以
外の部分が発現ベクターに導入されるなどの目的とする
組換え以外の組換えが起こる場合が少なくない。このよ
うな目的とする組換え以外の組換えによる組換え体が生
成した場合は目的とする組換え体の選択に多大な労力を
必要とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、マルチクロ
ーニングベクターに複製開始点を実際に導入してその有
用性を確認し前記課題を解決した。本発明は、このマル
チクローニングベクター、そのマルチクローニングサイ
トに異種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクタ
ー、その発現ベクターを含有する形質転換体、およびそ
の形質転換体を用いる異種蛋白質の製造法に関する下記
発明である。
ーニングベクターに複製開始点を実際に導入してその有
用性を確認し前記課題を解決した。本発明は、このマル
チクローニングベクター、そのマルチクローニングサイ
トに異種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクタ
ー、その発現ベクターを含有する形質転換体、およびそ
の形質転換体を用いる異種蛋白質の製造法に関する下記
発明である。
【００１２】分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞内において機能し
うるプロモーター領域、該プロモーター領域の下流に位
置しかつ該プロモーターによって支配される異種蛋白質
構造遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイ
ト、および、Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる複製開始点
を有することを特徴とするマルチクローニングベクタ
ー。
うるプロモーター領域、該プロモーター領域の下流に位
置しかつ該プロモーターによって支配される異種蛋白質
構造遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイ
ト、および、Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる複製開始点
を有することを特徴とするマルチクローニングベクタ
ー。
【００１３】分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞内において機能し
うる第１のプロモーター領域、第１のプロモーター領域
の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される
異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチクローニ
ングサイト、第１のプロモーターよりも低い転写活性を
有する第２のプロモーターであってかつＳ．ポンベ細胞
内において機能しうる第２のプロモーター領域、第２の
プロモーター領域の下流に位置しかつ該プロモーターに
よって支配される抗生物質耐性遺伝子、大腸菌内で機能
しうる薬剤耐性遺伝子、Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を
相補しうる構造遺伝子、Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる
第１の複製開始点、および、大腸菌内で機能してベクタ
ーを多複製数に増幅しうる第２の複製開始点、を有する
ことを特徴とするマルチクローニングベクター。
うる第１のプロモーター領域、第１のプロモーター領域
の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される
異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチクローニ
ングサイト、第１のプロモーターよりも低い転写活性を
有する第２のプロモーターであってかつＳ．ポンベ細胞
内において機能しうる第２のプロモーター領域、第２の
プロモーター領域の下流に位置しかつ該プロモーターに
よって支配される抗生物質耐性遺伝子、大腸菌内で機能
しうる薬剤耐性遺伝子、Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を
相補しうる構造遺伝子、Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる
第１の複製開始点、および、大腸菌内で機能してベクタ
ーを多複製数に増幅しうる第２の複製開始点、を有する
ことを特徴とするマルチクローニングベクター。
【００１４】図５記載の制限酵素切断地図で表されるマ
ルチクローニングベクターｐＴＡＬ２Ｍ１。上記マルチ
クローニングベクターのマルチクローニングサイトに異
種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクター。上記
発現ベクターを含有する分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞からな
る形質転換体。上記形質転換体を培養し、得られた培養
細胞または培養液から異種蛋白質を取得することを特徴
とする異種蛋白質の製造法。
ルチクローニングベクターｐＴＡＬ２Ｍ１。上記マルチ
クローニングベクターのマルチクローニングサイトに異
種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発現ベクター。上記
発現ベクターを含有する分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞からな
る形質転換体。上記形質転換体を培養し、得られた培養
細胞または培養液から異種蛋白質を取得することを特徴
とする異種蛋白質の製造法。
【００１５】本発明のマルチクローニングベクターは、
前記公知のマルチクローニングベクター（ｐＴＬ２Ｍ
１）に複製開始点のみを導入したものであるのみなら
ず、さらに改良したものであってもよい。実際に本発明
の具体例であるマルチクローニングベクターは、ｐＴＬ
２Ｍ１が有していなかったａｒｓのみならず後述ＬＥＵ
２’、ＯＲＩなどの遺伝子を含む。
前記公知のマルチクローニングベクター（ｐＴＬ２Ｍ
１）に複製開始点のみを導入したものであるのみなら
ず、さらに改良したものであってもよい。実際に本発明
の具体例であるマルチクローニングベクターは、ｐＴＬ
２Ｍ１が有していなかったａｒｓのみならず後述ＬＥＵ
２’、ＯＲＩなどの遺伝子を含む。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下の説明において、下記の略号
を用いる。なお、制限酵素の名称〜略号は周知〜公知で
あることよりその説明を省略する。
を用いる。なお、制限酵素の名称〜略号は周知〜公知で
あることよりその説明を省略する。
【００１７】（１）本発明マルチクローニングベクター
に関連するベクター（プラスミド） ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２：いずれも遺伝子組換え実験
に汎用されているプラスミド。 ｐＡＬ７：公知の酵母用導入ベクター（Nucleic Acids
Research,18,6485-6489,1991) 。 ｐＴＬ２Ｍ１：特開平７−１６３３７３記載のマルチク
ローニングベクター。 その由来や構成は特開平５−１５３８０も参照。
に関連するベクター（プラスミド） ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２：いずれも遺伝子組換え実験
に汎用されているプラスミド。 ｐＡＬ７：公知の酵母用導入ベクター（Nucleic Acids
Research,18,6485-6489,1991) 。 ｐＴＬ２Ｍ１：特開平７−１６３３７３記載のマルチク
ローニングベクター。 その由来や構成は特開平５−１５３８０も参照。
【００１８】（２）本発明マルチクローニングベクター
に関連する遺伝子 ａｒｓ：Ｓ．ポンベ由来の自律複製領域(autonomous re
plicating sequence）（Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる
複製開始点の一種）。 ｈＣＭＶｐ：ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモー
ター（Ｓ・ポンベ細胞内において機能しうる（第１の）
プロモーター領域の一種）。 ＭＣＳ：マルチクローニングサイト（第１のプロモータ
ー領域の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配
される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチク
ローニングサイト）。
に関連する遺伝子 ａｒｓ：Ｓ．ポンベ由来の自律複製領域(autonomous re
plicating sequence）（Ｓ．ポンベ細胞内で機能しうる
複製開始点の一種）。 ｈＣＭＶｐ：ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモー
ター（Ｓ・ポンベ細胞内において機能しうる（第１の）
プロモーター領域の一種）。 ＭＣＳ：マルチクローニングサイト（第１のプロモータ
ー領域の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配
される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチク
ローニングサイト）。
【００１９】ＯＲＩ：ｐＵＣ１９由来の複製開始点（大
腸菌内で機能してベクターを多複製数に増幅しうる複製
開始点の一種）。このＯＲＩは下記ｏｒｉに由来するが
ｏｒｉの複製数を抑制する制御部分を除いた複製開始点
であり、ｏｒｉに比較して活性が高い。 ＳＶ４０ｐ：ＳＶ４０ウイルス由来のプロモーター（第
１のプロモーターよりも低い転写活性を有する第２のプ
ロモーターであってかつ分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞内にお
いて機能しうる第２のプロモーターの一種）。ｈＣＭＶ
ｐよりも転写活性が低い。
腸菌内で機能してベクターを多複製数に増幅しうる複製
開始点の一種）。このＯＲＩは下記ｏｒｉに由来するが
ｏｒｉの複製数を抑制する制御部分を除いた複製開始点
であり、ｏｒｉに比較して活性が高い。 ＳＶ４０ｐ：ＳＶ４０ウイルス由来のプロモーター（第
１のプロモーターよりも低い転写活性を有する第２のプ
ロモーターであってかつ分裂酵母Ｓ．ポンベ細胞内にお
いて機能しうる第２のプロモーターの一種）。ｈＣＭＶ
ｐよりも転写活性が低い。
【００２０】ＮｍＲ：抗生物質Ｇ４１８（ネオマイシン
の一種）耐性遺伝子であって、バクテリアトランスポゾ
ンＴｎ９０３由来のアミノ−３’−ホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（第２のプロモーター領域の下流に位置し
かつ該プロモーターによって支配される抗生物質耐性遺
伝子の一種）。 ＬＥＵ２’：下記ＬＥＵ２遺伝子内の制限酵素ＡｆｌＩ
ＩＩ認識部位を消失させたもの［ただし、それがコード
するアミノ酸配列はＬＥＵ２がコードするアミノ酸配列
と同一］（分裂酵母Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を相補
しうる構造遺伝子の一種）。
の一種）耐性遺伝子であって、バクテリアトランスポゾ
ンＴｎ９０３由来のアミノ−３’−ホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（第２のプロモーター領域の下流に位置し
かつ該プロモーターによって支配される抗生物質耐性遺
伝子の一種）。 ＬＥＵ２’：下記ＬＥＵ２遺伝子内の制限酵素ＡｆｌＩ
ＩＩ認識部位を消失させたもの［ただし、それがコード
するアミノ酸配列はＬＥＵ２がコードするアミノ酸配列
と同一］（分裂酵母Ｓ．ポンベの栄養要求性変異を相補
しうる構造遺伝子の一種）。
【００２１】ＡｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌
内で機能しうる薬剤耐性遺伝子の一種）。 ＳＶ４０ｔ：ＳＶ４０ウイルス由来のターミネーター。 ５’−ＵＴＲ：プロモーター領域とＭＣＳを連結する非
翻訳領域。 ３’−ＵＴＲ：ＭＣＳ下流側の非翻訳領域。
内で機能しうる薬剤耐性遺伝子の一種）。 ＳＶ４０ｔ：ＳＶ４０ウイルス由来のターミネーター。 ５’−ＵＴＲ：プロモーター領域とＭＣＳを連結する非
翻訳領域。 ３’−ＵＴＲ：ＭＣＳ下流側の非翻訳領域。
【００２２】（３）他のベクターに関連する遺伝子 ＬＥＵ２：分裂酵母Ｓ．ポンベのロイシン要求性変異Ｌ
ＥＵを相補しうる酵母Ｓ．セレビシエ由来のβ−イソプ
ロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（栄養要求性変
異を相補しうる構造遺伝子の一種）。 ｏｒｉ：大腸菌内で機能しうるｐＢＲ３２２由来の複製
開始点。このｏｒｉには大腸菌内でのコピー数を抑制す
る制御部分を有しているためｏｒｉを有するベクターは
大腸菌内でのコピー数は制限されている。 ｓｔｂ：ｐＡＬ７においてａｒｓと一体となってベクタ
ーの保持に寄与していると考えられている遺伝子。
ＥＵを相補しうる酵母Ｓ．セレビシエ由来のβ−イソプ
ロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（栄養要求性変
異を相補しうる構造遺伝子の一種）。 ｏｒｉ：大腸菌内で機能しうるｐＢＲ３２２由来の複製
開始点。このｏｒｉには大腸菌内でのコピー数を抑制す
る制御部分を有しているためｏｒｉを有するベクターは
大腸菌内でのコピー数は制限されている。 ｓｔｂ：ｐＡＬ７においてａｒｓと一体となってベクタ
ーの保持に寄与していると考えられている遺伝子。
【００２３】本発明のマルチクローニングベクターは、
Ｓ．ポンベ内において機能しうるプロモーター領域（ｈ
ＣＭＶｐが好ましい）を有し、その下流に該プロモータ
ーによって支配されるＭＣＳ、およびＳ．ポンベ内で機
能しうる複製開始点（ａｒｓが好ましい）を有する。こ
のマルチクローニングベクターはさらに、大腸菌内で多
複製数に増幅しうる第２の複製開始点（ＯＲＩが好まし
い）とＳ．ポンベの栄養要求性変異を相補しうる構造遺
伝子（ＬＥＵ２やＬＥＵ２’が好ましい）を有すること
が好ましい。
Ｓ．ポンベ内において機能しうるプロモーター領域（ｈ
ＣＭＶｐが好ましい）を有し、その下流に該プロモータ
ーによって支配されるＭＣＳ、およびＳ．ポンベ内で機
能しうる複製開始点（ａｒｓが好ましい）を有する。こ
のマルチクローニングベクターはさらに、大腸菌内で多
複製数に増幅しうる第２の複製開始点（ＯＲＩが好まし
い）とＳ．ポンベの栄養要求性変異を相補しうる構造遺
伝子（ＬＥＵ２やＬＥＵ２’が好ましい）を有すること
が好ましい。
【００２４】さらに、特開平７−１６３３７３記載のマ
ルチクローニングベクターと同様に、第２のプロモータ
ー領域（ＳＶ４０ｐが好ましい）とそれに支配される抗
生物質耐性構造遺伝子（ＮｍＲが好ましい）を有するこ
とが好ましい。第２のプロモーターは第１のプロモータ
ーよりも転写活性の低いものを用いることにより、形質
転換体の培養における異種蛋白質の産生量を著しく増大
させることを可能とする（特開平７−１６３３７３の記
載参照）。
ルチクローニングベクターと同様に、第２のプロモータ
ー領域（ＳＶ４０ｐが好ましい）とそれに支配される抗
生物質耐性構造遺伝子（ＮｍＲが好ましい）を有するこ
とが好ましい。第２のプロモーターは第１のプロモータ
ーよりも転写活性の低いものを用いることにより、形質
転換体の培養における異種蛋白質の産生量を著しく増大
させることを可能とする（特開平７−１６３３７３の記
載参照）。
【００２５】また、さらに本発明のマルチクローニング
ベクターは通常のマルチクローニングベクターの場合と
同様に、ＭＣＳの上流側に５’−ＵＴＲを下流側に３’
−ＵＴＲを有し、さらに少なくとも１つのターミネータ
ー（ＳＶ４０ｔが好ましい）を有することが好ましい。
ベクターは通常のマルチクローニングベクターの場合と
同様に、ＭＣＳの上流側に５’−ＵＴＲを下流側に３’
−ＵＴＲを有し、さらに少なくとも１つのターミネータ
ー（ＳＶ４０ｔが好ましい）を有することが好ましい。
【００２６】本発明のマルチクローニングベクターとし
ては上記遺伝子をすべて有するものが好ましく、特に図
５の制限酵素切断地図に示すマルチクローニングベクタ
ーｐＴＡＬ２Ｍ１が好ましい。以下、このｐＴＡＬ２Ｍ
１を例にして本発明を特開平７−１６３３７３記載のｐ
ＴＬ２Ｍ１と比較して説明する。
ては上記遺伝子をすべて有するものが好ましく、特に図
５の制限酵素切断地図に示すマルチクローニングベクタ
ーｐＴＡＬ２Ｍ１が好ましい。以下、このｐＴＡＬ２Ｍ
１を例にして本発明を特開平７−１６３３７３記載のｐ
ＴＬ２Ｍ１と比較して説明する。
【００２７】ｐＴＬ２Ｍ１と比較してｐＴＡＬ２Ｍ１は
ｏｒｉが除かれ、新たにａｒｓ、ＬＥＵ’、およびＯＲ
Ｉが導入されている。ａｒｓが導入されていることよ
り、ｐＴＡＬ２Ｍ１は酵母内でそれ単独で複製が起こ
り、酵母内組換えを必要としないことより前記酵母内組
換えに伴う問題が生じるおそれがない。また、ｏｒｉの
代わりにＯＲＩが導入されていることより、大腸菌内で
の複製数が高まりシャトルベクターとしてより優れたベ
クターとなっている。さらにＬＥＵ’が導入されている
ことより、単独で栄養要求性変異を相補しうる。
ｏｒｉが除かれ、新たにａｒｓ、ＬＥＵ’、およびＯＲ
Ｉが導入されている。ａｒｓが導入されていることよ
り、ｐＴＡＬ２Ｍ１は酵母内でそれ単独で複製が起こ
り、酵母内組換えを必要としないことより前記酵母内組
換えに伴う問題が生じるおそれがない。また、ｏｒｉの
代わりにＯＲＩが導入されていることより、大腸菌内で
の複製数が高まりシャトルベクターとしてより優れたベ
クターとなっている。さらにＬＥＵ’が導入されている
ことより、単独で栄養要求性変異を相補しうる。
【００２８】このｐＴＡＬ２Ｍ１の大きさは約６８００
ｂｐであり、ｐＴＬ２Ｍ１（約５０００ｂｐ）に比較し
て新たにａｒｓ、ＬＥＵ’が導入されかつｏｒｉに代っ
てより活性の高いＯＲＩが導入されているにもかかわら
ずさほど大きなベクターとなっていない。したがって、
ｐＴＬ２Ｍ１に複製開始点を導入しようとする場合に危
惧されたベクターが大きくなりすぎるという問題（特開
平７−１６３３７３の記載参照）は解決されている。こ
のようなことが可能となった理由の一つは、ｐＡＬ７に
おけるａｒｓ−ｓｔｂからｓｔｂを切り離すとともに本
来のａｒｓの両端をさらに切り取り、本来のａｒｓ（約
１１００ｂｐ）の活性を維持したより短いａｒｓ（約９
００ｂｐ）を取り出して導入したことによる。さらに、
ＬＥＵ２’についても本来のＬＥＵ２（約１８５０ｂ
ｐ）の活性を維持したより短いＬＥＵ２（約１４００ｂ
ｐ）を元とした遺伝子である。
ｂｐであり、ｐＴＬ２Ｍ１（約５０００ｂｐ）に比較し
て新たにａｒｓ、ＬＥＵ’が導入されかつｏｒｉに代っ
てより活性の高いＯＲＩが導入されているにもかかわら
ずさほど大きなベクターとなっていない。したがって、
ｐＴＬ２Ｍ１に複製開始点を導入しようとする場合に危
惧されたベクターが大きくなりすぎるという問題（特開
平７−１６３３７３の記載参照）は解決されている。こ
のようなことが可能となった理由の一つは、ｐＡＬ７に
おけるａｒｓ−ｓｔｂからｓｔｂを切り離すとともに本
来のａｒｓの両端をさらに切り取り、本来のａｒｓ（約
１１００ｂｐ）の活性を維持したより短いａｒｓ（約９
００ｂｐ）を取り出して導入したことによる。さらに、
ＬＥＵ２’についても本来のＬＥＵ２（約１８５０ｂ
ｐ）の活性を維持したより短いＬＥＵ２（約１４００ｂ
ｐ）を元とした遺伝子である。
【００２９】また、ｐＴＡＬ２Ｍ１におけるＬＥＵ２’
はＬＥＵ２そのものではなく、ＬＥＵ２遺伝子内の制限
酵素ＡｆｌＩＩＩ認識部位を消失させたものである。こ
れはマルチクローニングサイトに制限酵素ＡｆｌＩＩＩ
認識部位を持たせているため（ＷＯ９６／２３８９０参
照）、ＬＥＵ２におけるＡｆｌＩＩＩ認識部位を消失さ
せる必要があったことによる。ただし、ＬＥＵ２の機能
を維持する必要があるためＬＥＵ２’がコードするアミ
ノ酸配列はＬＥＵ２がコードするアミノ酸配列と同一で
ある必要がある。このため人為的なミュータジェネシス
（突然変異誘発）などによりアミノ酸配列を変化させる
ことなく塩基配列を変換してＡｆｌＩＩＩ認識部位を消
失させることが好ましい。
はＬＥＵ２そのものではなく、ＬＥＵ２遺伝子内の制限
酵素ＡｆｌＩＩＩ認識部位を消失させたものである。こ
れはマルチクローニングサイトに制限酵素ＡｆｌＩＩＩ
認識部位を持たせているため（ＷＯ９６／２３８９０参
照）、ＬＥＵ２におけるＡｆｌＩＩＩ認識部位を消失さ
せる必要があったことによる。ただし、ＬＥＵ２の機能
を維持する必要があるためＬＥＵ２’がコードするアミ
ノ酸配列はＬＥＵ２がコードするアミノ酸配列と同一で
ある必要がある。このため人為的なミュータジェネシス
（突然変異誘発）などによりアミノ酸配列を変化させる
ことなく塩基配列を変換してＡｆｌＩＩＩ認識部位を消
失させることが好ましい。
【００３０】上記ＬＥＵ２ばかりでなく他の栄養要求性
変異を相補しうる構造遺伝子やそれ以外の遺伝子におい
ても、ＭＣＳにおける異種蛋白質構造遺伝子導入のため
の制限酵素認識部位と同じ制限酵素認識部位を有するこ
とは不都合である。したがって本発明マルチクローニン
グベクターを構成する遺伝子としては、その遺伝子がＭ
ＣＳの制限酵素認識部位と同じ制限酵素認識部位を有し
ている場合は、そのような制限酵素認識部位を有しない
ように変異させた（それがコードするアミノ酸配列は変
化させないように変異させることが好ましい）遺伝子と
する必要がある。遺伝子以外の部分の塩基配列において
も同様である。なお、ｐＴＡＬ２Ｍ１は図示したように
制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、Ｘｂａｌ
Ｉ、ＳａｌＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有し
ている。
変異を相補しうる構造遺伝子やそれ以外の遺伝子におい
ても、ＭＣＳにおける異種蛋白質構造遺伝子導入のため
の制限酵素認識部位と同じ制限酵素認識部位を有するこ
とは不都合である。したがって本発明マルチクローニン
グベクターを構成する遺伝子としては、その遺伝子がＭ
ＣＳの制限酵素認識部位と同じ制限酵素認識部位を有し
ている場合は、そのような制限酵素認識部位を有しない
ように変異させた（それがコードするアミノ酸配列は変
化させないように変異させることが好ましい）遺伝子と
する必要がある。遺伝子以外の部分の塩基配列において
も同様である。なお、ｐＴＡＬ２Ｍ１は図示したように
制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、Ｘｂａｌ
Ｉ、ＳａｌＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有し
ている。
【００３１】ｐＴＡＬ２Ｍ１は以下のようにして構築し
た（図１〜４のｐＴＡＬ２Ｍ１の構築手順を示す構築図
を参照）。まず、図１に示すように、ｐＡＬ７からａｒ
ｓ（本来のａｒｓより短い約９００ｂｐのもの）を切り
出し、これをＡｐＲとＯＲＩを有するｐＵＣ１９に挿入
した（得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ａｒｓとい
う）。一方別に、図２に示すように、ｐＡＬ７からＬＥ
Ｕ２を切り出し、これをｐＵＣ１９に挿入した後Ａｆｌ
ＩＩＩ認識部位をミュータジェネシスで消失させた（得
られたプラスミドをｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’という）。
次に、図３に示すように、ｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’から
ＬＥＵ２’を切り出し、これをｐＵＣ１９−ａｒｓに挿
入した（得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’
−ａｒｓという）。このｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒ
ｓは、ＬＥＵ２’とａｒｓの他にｐＵＣ１９に由来する
ＡｐＲとＯＲＩを有している。
た（図１〜４のｐＴＡＬ２Ｍ１の構築手順を示す構築図
を参照）。まず、図１に示すように、ｐＡＬ７からａｒ
ｓ（本来のａｒｓより短い約９００ｂｐのもの）を切り
出し、これをＡｐＲとＯＲＩを有するｐＵＣ１９に挿入
した（得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ａｒｓとい
う）。一方別に、図２に示すように、ｐＡＬ７からＬＥ
Ｕ２を切り出し、これをｐＵＣ１９に挿入した後Ａｆｌ
ＩＩＩ認識部位をミュータジェネシスで消失させた（得
られたプラスミドをｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’という）。
次に、図３に示すように、ｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’から
ＬＥＵ２’を切り出し、これをｐＵＣ１９−ａｒｓに挿
入した（得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’
−ａｒｓという）。このｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒ
ｓは、ＬＥＵ２’とａｒｓの他にｐＵＣ１９に由来する
ＡｐＲとＯＲＩを有している。
【００３２】さらに、図４に示すように、前記マルチク
ローニングベクターｐＴＬ２Ｍ１からＡｐＲとｏｒｉを
削除して約２５００ｂｐの断片を取り出し、またｐＵＣ
１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓの上記４遺伝子を有する約４
３００ｂｐの断片を取り出し、これら２つの断片を連結
してｐＴＡＬ２Ｍ１を得た。ｐＴＬ２Ｍ１から取り出さ
れた約２５００ｂｐの断片は、ＭＣＳとｈＣＭＶの他
に、ＭＣＳの両側に５’−ＵＴＲと３’−ＵＴＲ、ＳＶ
４０ｐとその下流にＮｍＲ、および両端にＳＶ４０ｔを
有する。したがって、ｐＴＡＬ２Ｍ１はこれら遺伝子と
ｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓに由来するＬＥＵ
２’、ａｒｓ、ＡｐＲおよびＯＲＩを有しているマルチ
クローニングベクターである。なお、ｐＴＬ２Ｍ１にお
けるＡｐＲは元来ｐＡＬ７から由来したものであってｐ
ＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓにおけるＡｐＲと同じ遺
伝子であり、ｏｒｉは同じくｐＡＬ７から由来したもの
である。
ローニングベクターｐＴＬ２Ｍ１からＡｐＲとｏｒｉを
削除して約２５００ｂｐの断片を取り出し、またｐＵＣ
１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓの上記４遺伝子を有する約４
３００ｂｐの断片を取り出し、これら２つの断片を連結
してｐＴＡＬ２Ｍ１を得た。ｐＴＬ２Ｍ１から取り出さ
れた約２５００ｂｐの断片は、ＭＣＳとｈＣＭＶの他
に、ＭＣＳの両側に５’−ＵＴＲと３’−ＵＴＲ、ＳＶ
４０ｐとその下流にＮｍＲ、および両端にＳＶ４０ｔを
有する。したがって、ｐＴＡＬ２Ｍ１はこれら遺伝子と
ｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓに由来するＬＥＵ
２’、ａｒｓ、ＡｐＲおよびＯＲＩを有しているマルチ
クローニングベクターである。なお、ｐＴＬ２Ｍ１にお
けるＡｐＲは元来ｐＡＬ７から由来したものであってｐ
ＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓにおけるＡｐＲと同じ遺
伝子であり、ｏｒｉは同じくｐＡＬ７から由来したもの
である。
【００３３】上記のようにして得られたｐＴＡＬ２Ｍ１
の制限酵素切断地図を図５に示す。なお、この制限酵素
切断地図においてＭＣＳ部分に囲んで示した制限酵素は
異種蛋白質構造遺伝子を導入するために使用できる制限
酵素を示し、ＭＣＳ部分以外にこれら制限酵素による切
断部位はない。
の制限酵素切断地図を図５に示す。なお、この制限酵素
切断地図においてＭＣＳ部分に囲んで示した制限酵素は
異種蛋白質構造遺伝子を導入するために使用できる制限
酵素を示し、ＭＣＳ部分以外にこれら制限酵素による切
断部位はない。
【００３４】上記ベクター（プラスミド）を構築するた
めの具体的操作方法としては公知の方法を使用できる。
例えば、文献「J.Sambrook et al.,"Molecular Cloning
2nded.",Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)
」に記載されている操作方法を使用できる。後述の具
体例においてはこのような公知の方法を使用してｐＴＡ
Ｌ２Ｍ１を構築した。
めの具体的操作方法としては公知の方法を使用できる。
例えば、文献「J.Sambrook et al.,"Molecular Cloning
2nded.",Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)
」に記載されている操作方法を使用できる。後述の具
体例においてはこのような公知の方法を使用してｐＴＡ
Ｌ２Ｍ１を構築した。
【００３５】本発明はまた上記マルチクローニングベク
ターのＭＣＳに異種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発
現ベクターである。異種蛋白質とはＳ．ポンベが本来有
していない種々の蛋白質であり、その種類は特に限定さ
れるものではない。前記本発明者らの発明にかかわる公
知例に記載されているマルチクローニングベクターと同
様に、本発明マルチクローニングベクターはきわめて多
種類の異種蛋白質の製造に適用できる。また、ＭＣＳへ
の異種蛋白質構造遺伝子の導入においてはＭＣＳにおけ
る塩基配列を特開平７−１６３３７３記載発明の構造と
することもできる。また導入する異種蛋白質構造遺伝子
にＷＯ９６／２３８９０記載発明のような分泌シグナル
遺伝子を連結して異種蛋白質がＳ・ポンベ細胞外に分泌
されるようにすることもできる。ＭＣＳへの異種蛋白質
構造遺伝子の導入方法としては公知の方法を使用でき
る。
ターのＭＣＳに異種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発
現ベクターである。異種蛋白質とはＳ．ポンベが本来有
していない種々の蛋白質であり、その種類は特に限定さ
れるものではない。前記本発明者らの発明にかかわる公
知例に記載されているマルチクローニングベクターと同
様に、本発明マルチクローニングベクターはきわめて多
種類の異種蛋白質の製造に適用できる。また、ＭＣＳへ
の異種蛋白質構造遺伝子の導入においてはＭＣＳにおけ
る塩基配列を特開平７−１６３３７３記載発明の構造と
することもできる。また導入する異種蛋白質構造遺伝子
にＷＯ９６／２３８９０記載発明のような分泌シグナル
遺伝子を連結して異種蛋白質がＳ・ポンベ細胞外に分泌
されるようにすることもできる。ＭＣＳへの異種蛋白質
構造遺伝子の導入方法としては公知の方法を使用でき
る。
【００３６】本発明はさらに上記発現ベクターを含有す
るＳ・ポンベ細胞からなる形質転換体であり、またこの
形質転換体を培養し、得られた培養細胞または培養液か
ら異種蛋白質を取得することを特徴とする異種蛋白質の
製造法である。
るＳ・ポンベ細胞からなる形質転換体であり、またこの
形質転換体を培養し、得られた培養細胞または培養液か
ら異種蛋白質を取得することを特徴とする異種蛋白質の
製造法である。
【００３７】本発明で用いるＳ．ポンベの菌株として
は、例えばＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１- ３２ｈ
- ）またはＡＴＣＣ ３８４３６（ｕｒａ４- ２９４ｈ
- ）等が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（American Type Culture Coll
ection）から入手できる。発現ベクターを用いてＳ．ポ
ンベを形質転換する方法は公知であり、例えば酢酸リチ
ウム法（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,648
5-6489(1990)）等によって、Ｓ．ポンベの形質転換体が
得られる。
は、例えばＡＴＣＣ ３８３９９（ｌｅｕ１- ３２ｈ
- ）またはＡＴＣＣ ３８４３６（ｕｒａ４- ２９４ｈ
- ）等が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（American Type Culture Coll
ection）から入手できる。発現ベクターを用いてＳ．ポ
ンベを形質転換する方法は公知であり、例えば酢酸リチ
ウム法（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,648
5-6489(1990)）等によって、Ｓ．ポンベの形質転換体が
得られる。
【００３８】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Met
hods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Labolat
oryPress(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Oka
zaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）
等を使用できる。形質転換体の培養は、通常１６〜４２
℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時間、好ま
しくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培養のいず
れも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えても
よい。
あり、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Met
hods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Labolat
oryPress(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Oka
zaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）
等を使用できる。形質転換体の培養は、通常１６〜４２
℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時間、好ま
しくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培養のいず
れも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えても
よい。
【００３９】培養形質転換体細胞を超音波破砕や機械的
破砕により目的異種蛋白質を含む細胞抽出液を取り出し
そこから目的異種蛋白質を単離・精製法する。また、目
的異種蛋白質が細胞外に分泌される場合は培養液から目
的異種蛋白質を単離・精製法する。これら産生した蛋白
質を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩
析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透
析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動
法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
破砕により目的異種蛋白質を含む細胞抽出液を取り出し
そこから目的異種蛋白質を単離・精製法する。また、目
的異種蛋白質が細胞外に分泌される場合は培養液から目
的異種蛋白質を単離・精製法する。これら産生した蛋白
質を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩
析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透
析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動
法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
【００４０】単離・精製した蛋白質の確認方法として
は、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定
法等が挙げられる。精製された蛋白質は、アミノ酸分
析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造
を明らかにすることができる。
は、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定
法等が挙げられる。精製された蛋白質は、アミノ酸分
析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造
を明らかにすることができる。
【００４１】
【実施例】以下の実施例によって、本発明をより具体的
に説明する。図１に本発明の手順を示す。ただし、本発
明はこれらの例によりその技術範囲が限定されない。例
１〜５はｐＴＡＬ２Ｍ１の構築方法を示す例であり、図
１〜図４に用いたベクター（プラスミド）とその組み合
わせを表した構築図を示す。
に説明する。図１に本発明の手順を示す。ただし、本発
明はこれらの例によりその技術範囲が限定されない。例
１〜５はｐＴＡＬ２Ｍ１の構築方法を示す例であり、図
１〜図４に用いたベクター（プラスミド）とその組み合
わせを表した構築図を示す。
【００４２】［例１：ｐＵＣ１９−ａｒｓの作製（図１
参照）］ａｒｓを含むｐＡＬ７（６５１４ｂｐ）を公知
の方法で調製し、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ( ニューイング
ランドバイオラボ社販売）で消化後、末端をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑化しアガロースゲル電気泳動により
分離した。ａｒｓ領域を含む約９００塩基対に相当する
ＤＮＡをガラスパウダー法（旭硝子（株）製”ＤＮＡＰ
ＲＥＰ”）によって精製した。
参照）］ａｒｓを含むｐＡＬ７（６５１４ｂｐ）を公知
の方法で調製し、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ( ニューイング
ランドバイオラボ社販売）で消化後、末端をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑化しアガロースゲル電気泳動により
分離した。ａｒｓ領域を含む約９００塩基対に相当する
ＤＮＡをガラスパウダー法（旭硝子（株）製”ＤＮＡＰ
ＲＥＰ”）によって精製した。
【００４３】別に、公知の方法で調製したｐＵＣ１９
（２６８６ｂｐ）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造（株）販
売）で切断後、牛小腸由来アルカリホスファターゼで脱
リン酸化後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によ
って核酸分画を回収した。両ＤＮＡを、ライゲーション
キット（宝酒造（株）販売）でライゲーションした後、
大腸菌ＤＨ５（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得
られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とする
ｐＵＣ１９−ａｒｓを持った形質転換体をスクリーニン
グした。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の
作製から目的とするプラスミドｐＵＣ１９−ａｒｓ（３
６００ｂｐ）であることを確認した。
（２６８６ｂｐ）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造（株）販
売）で切断後、牛小腸由来アルカリホスファターゼで脱
リン酸化後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によ
って核酸分画を回収した。両ＤＮＡを、ライゲーション
キット（宝酒造（株）販売）でライゲーションした後、
大腸菌ＤＨ５（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得
られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とする
ｐＵＣ１９−ａｒｓを持った形質転換体をスクリーニン
グした。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の
作製から目的とするプラスミドｐＵＣ１９−ａｒｓ（３
６００ｂｐ）であることを確認した。
【００４４】［例２：ＬＵＥ２のサブクローニングによ
るｐＵＣ１９−ＬＥＵ２の作製（図２参照）］Ｓ．ポン
ベのロイシン要求性株ｌｅｕ１- ３２ｈ- （ＡＴＣＣ
３８３９９）の栄養要求性変異株を相補するＳ．セレビ
シエのＬＥＵ２遺伝子を以下の手順でｐＵＣ１９にサブ
クローニングした。
るｐＵＣ１９−ＬＥＵ２の作製（図２参照）］Ｓ．ポン
ベのロイシン要求性株ｌｅｕ１- ３２ｈ- （ＡＴＣＣ
３８３９９）の栄養要求性変異株を相補するＳ．セレビ
シエのＬＥＵ２遺伝子を以下の手順でｐＵＣ１９にサブ
クローニングした。
【００４５】ｐＡＬ７を制限酵素ＢｓａＡＩ（宝酒造
（株）販売）とＡａｔＩＩ（宝酒造（株）販売）で消化
し、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。一方、ｐＵＣ１９をＳｍａＩで切断
後、牛小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化
後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。両ＤＮＡを、ライゲーションキットで
ライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。
得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とす
るｐＵＣ１９−ＬＥＵ２を持った形質転換体をスクリー
ニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地
図の作製から目的のプラスミドｐＵＣ１９−ＬＥＵ２で
あることを確認した。
（株）販売）とＡａｔＩＩ（宝酒造（株）販売）で消化
し、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。一方、ｐＵＣ１９をＳｍａＩで切断
後、牛小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化
後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。両ＤＮＡを、ライゲーションキットで
ライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。
得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とす
るｐＵＣ１９−ＬＥＵ２を持った形質転換体をスクリー
ニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地
図の作製から目的のプラスミドｐＵＣ１９−ＬＥＵ２で
あることを確認した。
【００４６】［例３：ＬＥＵ２の変異体作製（ｐＵＣ１
９−ＬＥＵ２’の作製）（図２参照）］ＬＥＵ中のＡｆ
ｌＩＩＩ認識サイトを変異させ、それがコードするアミ
ノ酸配列を変化させないようにＡｆｌＩＩＩの認識サイ
トを破壊した。すなわち、変異前の配列［5'-....GAGAT
GATATCACCAAACATGTTGCTG....］（下線部はＡｆｌＩＩＩ
の認識サイト）を［5'-....GAGATGATATCACCAAACATATTGC
TG..... ］（下線部が変更した塩基）に変更しＡｆｌＩ
ＩＩの認識サイトを破壊した。具体的な手順は以下の通
り。
９−ＬＥＵ２’の作製）（図２参照）］ＬＥＵ中のＡｆ
ｌＩＩＩ認識サイトを変異させ、それがコードするアミ
ノ酸配列を変化させないようにＡｆｌＩＩＩの認識サイ
トを破壊した。すなわち、変異前の配列［5'-....GAGAT
GATATCACCAAACATGTTGCTG....］（下線部はＡｆｌＩＩＩ
の認識サイト）を［5'-....GAGATGATATCACCAAACATATTGC
TG..... ］（下線部が変更した塩基）に変更しＡｆｌＩ
ＩＩの認識サイトを破壊した。具体的な手順は以下の通
り。
【００４７】プライマー３０８［5'-GAGATGATATCACCAAA
CATATTGCTG］（配列番号１）およびプライマー３０９
［5'-CAGCAATATGTTTGGTGATATGCATCTC ］（配列番号２）
を合成し、Ｍ１３ユニバーサルプライマーＭ４０および
Ｍ１３ユニバーサルプライマーＲＶ（ともに宝酒造
（株）販売）と組み合わせ、例２で作製したｐＵＣ１９
−ＬＥＵ２をテンプレートにＥｘＴａｑポリメラーゼ
（宝酒造（株）販売）を用いたＰＣＲを行った。すなわ
ち、ディネーチャー（９４℃、３０秒）、アニーリング
（５０℃、６０秒）、エクステンション（７２℃、１２
０秒）のサイクルを２５回繰り返した。ＰＣＲ反応後、
２．５ｍＭのｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ混液）２μｌと４ユニットのクレノーフ
ラグメント（宝酒造（株）販売）をＰＣＲ反応液に直接
加え、３７℃で１０分間反応させた。次いでＰＣＲ産物
を”QIAquick PCR Purification Kit ”（ＱＩＡＧＥＮ
社販売）を用いて単離した。
CATATTGCTG］（配列番号１）およびプライマー３０９
［5'-CAGCAATATGTTTGGTGATATGCATCTC ］（配列番号２）
を合成し、Ｍ１３ユニバーサルプライマーＭ４０および
Ｍ１３ユニバーサルプライマーＲＶ（ともに宝酒造
（株）販売）と組み合わせ、例２で作製したｐＵＣ１９
−ＬＥＵ２をテンプレートにＥｘＴａｑポリメラーゼ
（宝酒造（株）販売）を用いたＰＣＲを行った。すなわ
ち、ディネーチャー（９４℃、３０秒）、アニーリング
（５０℃、６０秒）、エクステンション（７２℃、１２
０秒）のサイクルを２５回繰り返した。ＰＣＲ反応後、
２．５ｍＭのｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ混液）２μｌと４ユニットのクレノーフ
ラグメント（宝酒造（株）販売）をＰＣＲ反応液に直接
加え、３７℃で１０分間反応させた。次いでＰＣＲ産物
を”QIAquick PCR Purification Kit ”（ＱＩＡＧＥＮ
社販売）を用いて単離した。
【００４８】得られた２種類のＰＣＲ産物をテンプレー
トにＭ１３ユニバーサルプライマーＭ４０およびＭ１３
ユニバーサルプライマーＲＶを用いて２度目のＰＣＲを
行った。すなわち、ディネーチャー（９４℃、３０
秒）、アニーリング（６０℃、６０秒）、エクステンシ
ョン（７２℃、１５０秒）のサイクルを２０回繰り返し
た。ＰＣＲ反応後、”QIAquick PCR Purification Kit
”を用いてＰＣＲ産物を単離した。次いで、これを制
限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造（株）販売）で消化し、フェノ
ール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収
した。
トにＭ１３ユニバーサルプライマーＭ４０およびＭ１３
ユニバーサルプライマーＲＶを用いて２度目のＰＣＲを
行った。すなわち、ディネーチャー（９４℃、３０
秒）、アニーリング（６０℃、６０秒）、エクステンシ
ョン（７２℃、１５０秒）のサイクルを２０回繰り返し
た。ＰＣＲ反応後、”QIAquick PCR Purification Kit
”を用いてＰＣＲ産物を単離した。次いで、これを制
限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造（株）販売）で消化し、フェノ
ール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収
した。
【００４９】一方、ｐＵＣ１９をＳｍａＩで切断後、牛
小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回
収した。両ＤＮＡを、ライゲーションキットでライゲー
ションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた
形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とするｐＵＣ
１９−ＬＥＵ２’を持った形質転換体をスクリーニング
した。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の作
製から目的のプラスミドｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’（４２
００ｂｐ）であることを確認した。
小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回
収した。両ＤＮＡを、ライゲーションキットでライゲー
ションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得られた
形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とするｐＵＣ
１９−ＬＥＵ２’を持った形質転換体をスクリーニング
した。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の作
製から目的のプラスミドｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’（４２
００ｂｐ）であることを確認した。
【００５０】［例４：ｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓ
の作製（図３参照）］例２で作製したｐＵＣ１９−ａｒ
ｓを公知の方法で調製した後、これをＡｆｌＩＩＩで消
化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によっ
て核酸分画を回収した。ついでこれを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造（株）販売）で消化しアガロースゲル電気泳
動により分離した。ａｒｓ領域を含む約３２００塩基対
に相当するＤＮＡをガラスパウダー法によって精製し
た。
の作製（図３参照）］例２で作製したｐＵＣ１９−ａｒ
ｓを公知の方法で調製した後、これをＡｆｌＩＩＩで消
化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によっ
て核酸分画を回収した。ついでこれを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造（株）販売）で消化しアガロースゲル電気泳
動により分離した。ａｒｓ領域を含む約３２００塩基対
に相当するＤＮＡをガラスパウダー法によって精製し
た。
【００５１】一方、例３で作製したｐＵＣ１９−ＬＥＵ
２’を同様に公知の方法で調製後、ＳａｃＩで消化しフ
ェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を
回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。ついでこれをＢａｍＨＩで消化しアガ
ロースゲル電気泳動により分離した。ＬＥＵ２’領域を
含む約１５００塩基対に相当するＤＮＡをガラスパウダ
ー法によって精製した。
２’を同様に公知の方法で調製後、ＳａｃＩで消化しフ
ェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を
回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸
分画を回収した。ついでこれをＢａｍＨＩで消化しアガ
ロースゲル電気泳動により分離した。ＬＥＵ２’領域を
含む約１５００塩基対に相当するＤＮＡをガラスパウダ
ー法によって精製した。
【００５２】上記２つのＤＮＡを、ライゲーションキッ
トでライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換し
た。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的
とするｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓを持った形質転
換体をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および
制限酵素切断地図の作製から目的のプラスミドｐＵＣ１
９−ＬＥＵ２’−ａｒｓ（４７００ｂｐ）であることを
確認した。
トでライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換し
た。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的
とするｐＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓを持った形質転
換体をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および
制限酵素切断地図の作製から目的のプラスミドｐＵＣ１
９−ＬＥＵ２’−ａｒｓ（４７００ｂｐ）であることを
確認した。
【００５３】［例５：ｐＴＡＬ２Ｍ１の作製（図４参
照）］公知の方法で調製したプラスミドｐＴＬ２Ｍ１
（５０８４ｂｐ）（特開平７−１６３３７３）を制限酵
素ＭｕｎＩ（宝酒造（株）販売）で消化後、フェノール
抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収し
た。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、
アガロースゲル電気泳動後、ガラスパウダー法によって
約２５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
照）］公知の方法で調製したプラスミドｐＴＬ２Ｍ１
（５０８４ｂｐ）（特開平７−１６３３７３）を制限酵
素ＭｕｎＩ（宝酒造（株）販売）で消化後、フェノール
抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収し
た。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、
アガロースゲル電気泳動後、ガラスパウダー法によって
約２５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
【００５４】別に、公知の方法で調製した例４で得たｐ
ＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓをＳａｃＩおよびＳｓｐ
Ｉで消化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によっ
て核酸分画を回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑化しアガロースゲル電気泳動後、ガラスパ
ウダー法によって約４３００塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
ＵＣ１９−ＬＥＵ２’−ａｒｓをＳａｃＩおよびＳｓｐ
Ｉで消化しフェノール抽出およびエタノール沈殿によっ
て核酸分画を回収した。ついで末端をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑化しアガロースゲル電気泳動後、ガラスパ
ウダー法によって約４３００塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
【００５５】両ＤＮＡを、ライゲーションキットでライ
ゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得ら
れた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とするｐ
ＴＡＬ２Ｍ１を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の作製
から目的のマルチクローニングベクターｐＴＡＬ２Ｍ１
（６８００ｂｐ）であることを確認した。図５にその制
限酵素切断地図を示す。
ゲーションした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。得ら
れた形質転換体よりプラスミドを調製し、目的とするｐ
ＴＡＬ２Ｍ１を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素切断地図の作製
から目的のマルチクローニングベクターｐＴＡＬ２Ｍ１
（６８００ｂｐ）であることを確認した。図５にその制
限酵素切断地図を示す。
【００５６】［例６：発現ベクターｐＴＡＬ２Ｌの作
製］特開平５−１５３８０記載のリポコルチンＩｃＤＮ
Ａ全長を含むプラスミドｐｃＤ４ｌｉｐｏＩをテンプレ
ートとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド［5'ーATGCC
ATGGCAATGGTATCAGAATT-3' ］（配列番号３）およびオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド［5'-AGCCAGTATACACTCCGCT
A-3'］（配列番号４）を合成プライマーとして、Ｔａｑ
ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造（株）販売）およびＳａ
ｌＩ（宝酒造（株）販売）で末端を切断し、フェノール
抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動に
より約１００００塩基対に相当するバンドを切出し、ガ
ラスパウダー法で精製した。
製］特開平５−１５３８０記載のリポコルチンＩｃＤＮ
Ａ全長を含むプラスミドｐｃＤ４ｌｉｐｏＩをテンプレ
ートとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド［5'ーATGCC
ATGGCAATGGTATCAGAATT-3' ］（配列番号３）およびオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド［5'-AGCCAGTATACACTCCGCT
A-3'］（配列番号４）を合成プライマーとして、Ｔａｑ
ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅し
た。制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造（株）販売）およびＳａ
ｌＩ（宝酒造（株）販売）で末端を切断し、フェノール
抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動に
より約１００００塩基対に相当するバンドを切出し、ガ
ラスパウダー法で精製した。
【００５７】別に、ｐＴＡＬ２Ｍ１をＡｆｌＩＩＩおよ
びＳａｌＩで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、アガロースゲル電気泳動より約６８００塩基対に
相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精製し
た。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸菌Ｄ
Ｈ５を形質転換して目的とする発現ベクター（以下、ｐ
ＴＡＬ２Ｌという）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素切断地図の作製から目的のｐＴ
ＡＬ２Ｌ（７８４０ｂｐ）であることを確認した。図６
にその制限酵素切断地図を示す。
びＳａｌＩで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、アガロースゲル電気泳動より約６８００塩基対に
相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で精製し
た。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸菌Ｄ
Ｈ５を形質転換して目的とする発現ベクター（以下、ｐ
ＴＡＬ２Ｌという）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素切断地図の作製から目的のｐＴ
ＡＬ２Ｌ（７８４０ｂｐ）であることを確認した。図６
にその制限酵素切断地図を示す。
【００５８】［例７：ｐＴＡＬ２ＬとｐＴＡＬ２Ｍ１の
酵母への導入］Ｓ．ポンベのロイシン要求性株ｌｅｕ１
- ３２ｈ- （ＡＴＣＣ ３８３９９）を最少培地で０．
８×１０7 細胞数／ｍｌになるまで生育させた。集菌、
洗菌後１０9 細胞数／ｍｌになるように０．１モル酢酸
リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間イ
ンキュベートした。その後、例７で得たｐＴＡＬ２Ｌの
２μｇをＴＥ（ＥＤＴＡを含んだトリスバッファー）１
５μｌに溶かして加え、５０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ４０
００を２９０μｌ加えよく混合したのち３０℃で６０分
間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュ
ベートした。遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、培養
液１ｍｌに懸濁した。このうち１００μｌを分取し、９
００μｌの培養液を加えて、３２℃、３０分間インキュ
ベートした。うち３００μｌをロイシンを含まない最少
寒天培地にスプレッドした。３２℃で３日間インキュベ
ートすることでロイシン非要求性となったコロニーが出
現し、これらが目的とする形質転換体である。形質転換
効率は１０3 ／μｇ以上であった。
酵母への導入］Ｓ．ポンベのロイシン要求性株ｌｅｕ１
- ３２ｈ- （ＡＴＣＣ ３８３９９）を最少培地で０．
８×１０7 細胞数／ｍｌになるまで生育させた。集菌、
洗菌後１０9 細胞数／ｍｌになるように０．１モル酢酸
リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０℃で６０分間イ
ンキュベートした。その後、例７で得たｐＴＡＬ２Ｌの
２μｇをＴＥ（ＥＤＴＡを含んだトリスバッファー）１
５μｌに溶かして加え、５０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ４０
００を２９０μｌ加えよく混合したのち３０℃で６０分
間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュ
ベートした。遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、培養
液１ｍｌに懸濁した。このうち１００μｌを分取し、９
００μｌの培養液を加えて、３２℃、３０分間インキュ
ベートした。うち３００μｌをロイシンを含まない最少
寒天培地にスプレッドした。３２℃で３日間インキュベ
ートすることでロイシン非要求性となったコロニーが出
現し、これらが目的とする形質転換体である。形質転換
効率は１０3 ／μｇ以上であった。
【００５９】上記と同様にしてｐＴＡＬ２Ｍ１をＳ．ポ
ンベに導入し形質転換体を得た。このｐＴＡＬ２Ｍ１の
みを保持している形質転換体を以下の試験における陰性
対象（コントロール）に用いた。
ンベに導入し形質転換体を得た。このｐＴＡＬ２Ｍ１の
みを保持している形質転換体を以下の試験における陰性
対象（コントロール）に用いた。
【００６０】［例８：形質転換体の培養および細胞抽出
液の調製］例７で得たｐＴＡＬ２Ｌを保持している形質
転換体２４株を２ｗｔ％グルコース、１ｗｔ％イースト
抽出液、２ｗｔ％ペプトン、およびＧ４１８を２００μ
ｇ／ｍｌを含む液体培地５ｍｌで３２℃３日間培養し
た。Ｇ４１８による選別の結果、ロイシンを含まない最
少寒天培地から植菌した形質転換体２４株すべてに増殖
が認められた。これを上述の組成からなるＧ４１８含有
培養液５０ｍｌに植菌しさらに３日間培養し菌体を得
た。また、例７で得たｐＴＡＬ２Ｍ１のみを保持してい
る形質転換体についても同様にＧ４１８による選別を行
い菌体を得た。
液の調製］例７で得たｐＴＡＬ２Ｌを保持している形質
転換体２４株を２ｗｔ％グルコース、１ｗｔ％イースト
抽出液、２ｗｔ％ペプトン、およびＧ４１８を２００μ
ｇ／ｍｌを含む液体培地５ｍｌで３２℃３日間培養し
た。Ｇ４１８による選別の結果、ロイシンを含まない最
少寒天培地から植菌した形質転換体２４株すべてに増殖
が認められた。これを上述の組成からなるＧ４１８含有
培養液５０ｍｌに植菌しさらに３日間培養し菌体を得
た。また、例７で得たｐＴＡＬ２Ｍ１のみを保持してい
る形質転換体についても同様にＧ４１８による選別を行
い菌体を得た。
【００６１】［例９：ヒトリポコルチンＩの発現解析］
例８で得た形質転換体から細胞抽出液を調製した。この
際、産物の分解を防ぐため細胞抽出液にプロテアーゼ
（１２μＭ ＰＭＳＦ、２５μＭ ロイペプチン、５μ
Ｍ Ｅ−６４）を存在させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥ
ＦＣＯ社製 ４−２０％ポリアクリルアミドゲル）にて
調べたところ、分子量３６Ｋの位置にコントロールのｐ
ＴＡＬ２Ｍ１保持形質転換体抽出液には見られないバン
ドが確認された。図７にその電気泳動図を示す。Ａは形
質転換していないＳ．ポンベの細胞抽出液、ＢはｐＴＡ
Ｌ２Ｍ１で形質転換したＳ．ポンベの細胞抽出液、Ｃは
ｐＴＡＬ２Ｌで形質転換したＳ．ポンベの細胞抽出液を
示す。
例８で得た形質転換体から細胞抽出液を調製した。この
際、産物の分解を防ぐため細胞抽出液にプロテアーゼ
（１２μＭ ＰＭＳＦ、２５μＭ ロイペプチン、５μ
Ｍ Ｅ−６４）を存在させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥ
ＦＣＯ社製 ４−２０％ポリアクリルアミドゲル）にて
調べたところ、分子量３６Ｋの位置にコントロールのｐ
ＴＡＬ２Ｍ１保持形質転換体抽出液には見られないバン
ドが確認された。図７にその電気泳動図を示す。Ａは形
質転換していないＳ．ポンベの細胞抽出液、ＢはｐＴＡ
Ｌ２Ｍ１で形質転換したＳ．ポンベの細胞抽出液、Ｃは
ｐＴＡＬ２Ｌで形質転換したＳ．ポンベの細胞抽出液を
示す。
【００６２】［例１０（比較例）：ｐＴＬ２Ｌによる分
裂酵母の形質転換］特開平７ー１６３３７３号明細書実
施例５記載のヒトリポコルチンＩ遺伝子を有する発現ベ
クターｐＴＬ２Ｌを用いて例７〜例９と同様にＳ．ポン
ベを形質転換してヒトリポコルチンＩを発現させた。
裂酵母の形質転換］特開平７ー１６３３７３号明細書実
施例５記載のヒトリポコルチンＩ遺伝子を有する発現ベ
クターｐＴＬ２Ｌを用いて例７〜例９と同様にＳ．ポン
ベを形質転換してヒトリポコルチンＩを発現させた。
【００６３】宿主として例７と同じＳ．ポンベ（ｌｅｕ
１- ３２ｈ- ）を用いた。この宿主細胞を最少培地にて
０．５〜１×１０7 細胞数／ｍｌになるまで生育させ、
集菌洗菌後１０9 細胞数／ｍｌとなるように、０．１Ｍ
酢酸リチウム（ｐＨ ５）で懸濁し、３０℃で６０分
間インキュベートした。その後、ｐＡＬ７を制限酵素Ｐ
ｓｔＩ（宝酒造（株）販売）で切断したもの１μｇとｐ
ＴＬ２Ｌの２μｇとを上記懸濁液１００μｌに加え、さ
らに５０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ４０００を２９０μｌ加
えてよく撹拌した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５
分間インキュベートし、室温で１０分間放置した。遠心
によりＰＥＧ４０００を除去した後、適当量の培養液に
懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は１０5 ／μ
ｇ（ｐＡＬ７）以上であった。
１- ３２ｈ- ）を用いた。この宿主細胞を最少培地にて
０．５〜１×１０7 細胞数／ｍｌになるまで生育させ、
集菌洗菌後１０9 細胞数／ｍｌとなるように、０．１Ｍ
酢酸リチウム（ｐＨ ５）で懸濁し、３０℃で６０分
間インキュベートした。その後、ｐＡＬ７を制限酵素Ｐ
ｓｔＩ（宝酒造（株）販売）で切断したもの１μｇとｐ
ＴＬ２Ｌの２μｇとを上記懸濁液１００μｌに加え、さ
らに５０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ４０００を２９０μｌ加
えてよく撹拌した後、３０℃で６０分間、４３℃で１５
分間インキュベートし、室温で１０分間放置した。遠心
によりＰＥＧ４０００を除去した後、適当量の培養液に
懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は１０5 ／μ
ｇ（ｐＡＬ７）以上であった。
【００６４】上記によって得られた形質転換体を２４株
取り、例８と同様にＧ４１８選択を行った。その結果、
２４株中１６株（６７％）にしか増殖が認められなかっ
た。
取り、例８と同様にＧ４１８選択を行った。その結果、
２４株中１６株（６７％）にしか増殖が認められなかっ
た。
【００６５】
【発明の効果】本発明マルチクローニングベクターを用
いることにより、単一の発現ベクターで容易にＳ．ポン
ベを形質転換させることができ、かつ、形質転換体の選
別がきわめて効率よく行えるようになった。また、ヒト
リポコルチンＩの発現に見られるように、その発現量は
菌体蛋白質の５０ｗｔを占めるまでに高い。したがっ
て、本発明によりＳ．ポンベを用いる異種蛋白質の製造
をきわめて効率よく行いうる。
いることにより、単一の発現ベクターで容易にＳ．ポン
ベを形質転換させることができ、かつ、形質転換体の選
別がきわめて効率よく行えるようになった。また、ヒト
リポコルチンＩの発現に見られるように、その発現量は
菌体蛋白質の５０ｗｔを占めるまでに高い。したがっ
て、本発明によりＳ．ポンベを用いる異種蛋白質の製造
をきわめて効率よく行いうる。
【００６６】
配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GAGATGATATCACCAAACATATTGCTG
【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CAGCAATATGTTTGGTGATATGCATCTC
【００６８】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： ATGCCATGGCAATGGTATCAGAATT
【００６９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： ＡＧＣＣＡＧＴＡＴＡＣＡＣＴＣＣＧＣＴＡ
【図１】ｐＵＣ１９−ａｒｓの構築図
【図２】ｐＵＣ１９−ＬＥＵ’の構築図
【図３】ｐＵＣ１９−ＬＥＵ’−ａｒｓの構築図
【図４】ｐＴＡＬ２Ｍ１の構築図
【図５】ｐＴＡＬ２Ｍ１の制限酵素切断地図
【図６】ｐＴＡＬ２Ｌの制限酵素切断地図
【図７】ヒトリポコルチンＩの発現を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動図
ＧＥ電気泳動図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 塚本 洋子 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 浜 祐子 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 熊谷 博道 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内
Claims (10)
- 【請求項１】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ細胞
内において機能しうるプロモーター領域、該プロモータ
ー領域の下流に位置しかつ該プロモーターによって支配
される異種蛋白質構造遺伝子を導入するためのマルチク
ローニングサイト、および、シゾサッカロミセス・ポン
ベ細胞内で機能しうる複製開始点を有することを特徴と
するマルチクローニングベクター。 - 【請求項２】ベクターが、さらに、大腸菌内で機能して
ベクターを多複製数に増幅しうる第２の複製開始点を有
する、請求項１記載のマルチクローニングベクター。 - 【請求項３】ベクターが、さらに、分裂酵母シゾサッカ
ロミセス・ポンベの栄養要求性変異を相補しうる構造遺
伝子を有する、請求項１または２記載のマルチクローニ
ングベクター。 - 【請求項４】栄養要求性変異を相補しうる構造遺伝子
が、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベの栄養要求性
変異を相補しうる、酵母サッカロミセス・セレビシエ由
来のβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子
である、請求項３記載のマルチクローニングベクター。 - 【請求項５】栄養要求性変異を相補しうる構造遺伝子
が、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子
であって、かつマルチクローニングサイトの制限酵素認
識部位と同じ制限酵素認識部位を有しないように変異さ
せた遺伝子である、請求項４記載のマルチクローニング
ベクター。 - 【請求項６】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ細胞
内において機能しうる第１のプロモーター領域、第１の
プロモーター領域の下流に位置しかつ該プロモーターに
よって支配される異種蛋白質構造遺伝子を導入するため
のマルチクローニングサイト、第１のプロモーターより
も低い転写活性を有する第２のプロモーターであってか
つシゾサッカロミセス・ポンベ細胞内において機能しう
る第２のプロモーター領域、第２のプロモーター領域の
下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される抗
生物質耐性遺伝子、大腸菌内で機能しうる薬剤耐性遺伝
子、シゾサッカロミセス・ポンベの栄養要求性変異を相
補しうる構造遺伝子、シゾサッカロミセス・ポンベ細胞
内で機能しうる第１の複製開始点、および、大腸菌内で
機能してベクターを多複製数に増幅しうる第２の複製開
始点、を有することを特徴とするマルチクローニングベ
クター。 - 【請求項７】図５記載の制限酵素切断地図で表されるマ
ルチクローニングベクターｐＴＡＬ２Ｍ１。 - 【請求項８】請求項１、２、３、４、５、６または７記
載のマルチクローニングベクターのマルチクローニング
サイトに異種蛋白質構造遺伝子を導入してなる発現ベク
ター。 - 【請求項９】請求項８記載の発現ベクターを含有する分
裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ細胞からなる形質転
換体。 - 【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培養し、得
られた培養細胞または培養液から異種蛋白質を取得する
ことを特徴とする異種蛋白質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9046296A JPH10234375A (ja) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | マルチクローニングベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9046296A JPH10234375A (ja) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | マルチクローニングベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10234375A true JPH10234375A (ja) | 1998-09-08 |
Family
ID=12743261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9046296A Pending JPH10234375A (ja) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | マルチクローニングベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10234375A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010038802A1 (ja) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | 旭硝子株式会社 | 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 |
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1997
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