WO2010038802A1 - 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 - Google Patents

宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 Download PDF

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WO2010038802A1
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sugar chain
gene
heterologous protein
transformant
glycoside
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薫 竹川
祐子 浜
英毅 東田
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旭硝子株式会社
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a host, a transformant, a method for producing the same, and a method for producing an O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein.
  • Glycosylation of secreted proteins and the like in eukaryotes is one of the important processes in post-translational modification and is managed by various enzymes related to the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus.
  • a sugar chain bound to a protein by glycosylation is formed by mannose (Man), galactose (Gal), N-acetylglucosamine or the like.
  • the sugar chains that bind to proteins include N-glycoside type sugar chains that bind to the nitrogen atoms of amides of asparagine residues and O-glycoside type sugar chains that bind to oxygen atoms of hydroxyl groups of serine and threonine residues. There are two types.
  • a genetic engineering production method using a transformant into which a gene encoding a target heterologous protein (protein that is not originally produced by a host) is introduced is widely used.
  • the host is considered to be best to use eukaryotic microorganisms when producing eukaryotic proteins, and yeast is often used because it does not contain substances that adversely affect the human body.
  • yeast is often used because it does not contain substances that adversely affect the human body.
  • Schizosaccharomyces pombe (hereinafter referred to as “S. pombe”), which is a fission yeast, is a budding yeast such as Schizosaccharomyces cerevisiae (hereinafter referred to as “S. cerevisiae”).
  • S. cerevisiae Schizosaccharomyces cerevisiae
  • the cell cycle, chromosomal structure, RNA splicing, etc. are said to be more similar to those of animal cells, and post-translational modification of the
  • S.M A heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain in which the sugar chain structure is controlled to a disaccharide structure using Pombe as a host and the sugar chain structure is O-Man-Gal (a sugar chain in which mannose and galactose are bonded in order to the oxygen atom of the heterologous protein)
  • O-Man-Gal a sugar chain in which mannose and galactose are bonded in order to the oxygen atom of the heterologous protein
  • the host of the present invention is a strain of S. cerevisiae in which the omh1 gene has been deleted or inactivated.
  • the transformant of the present invention has a S. cerevisiae having the omh1 gene deleted or inactivated. It contains a gene encoding a heterologous protein using Pombe as a host.
  • the transformant of the present invention further includes a gene encoding a secretory signal functioning in the Schizosaccharomyces pombe bound to the 5 ′ end of the gene encoding the heterologous protein.
  • the wild-type protein corresponding to the heterologous protein is preferably a protein having an O-glycoside type sugar chain.
  • the method for producing the transformant of the present invention is a method for producing S. cerevisiae having the omh1 gene deleted or inactivated. Pombe is used as a host, and a gene encoding a heterologous protein is incorporated into the host. Further, the method for producing a transformant of the present invention preferably has a gene encoding a secretory signal functioning in Schizosaccharomyces pombe at the 5 ′ end side of the gene encoding the heterologous protein. . Furthermore, in the method for producing a transformant of the present invention, the wild type protein corresponding to the heterologous protein is preferably a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain.
  • the method for producing an O-glycoside type sugar chain-containing heterologous protein according to the present invention comprises culturing the transformant and producing the produced heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain having a disaccharide structure of O-Man-Gal. This is a method for producing a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain.
  • the sugar chain of the heterologous protein having the produced O-glycoside-type sugar chain is the sugar chain of the wild-type heterologous protein corresponding to the heterologous protein.
  • the sugar chain structure preferably has a disaccharide structure of O-Man-Gal. Furthermore, in the method for producing an O-glycoside type sugar chain-containing heterologous protein of the present invention, it is preferable to obtain a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain from a culture medium in which the transformant is cultured.
  • the Pombe host is useful as a host for producing a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain having a disaccharide structure of O-Man-Gal. S. of the present invention.
  • a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain in which the sugar chain structure is controlled to a disaccharide structure of O-Man-Gal can be obtained.
  • a transformant from which a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain in which the sugar chain structure is controlled to a disaccharide structure of O-Man-Gal is obtained. be able to.
  • an O-glycoside sugar chain-containing heterologous protein having a sugar chain structure controlled to a disaccharide structure of O-Man-Gal can be produced using the transformant.
  • FIG. 6 is a view showing the result after culturing in Example 3.
  • 4 is a photograph of non-denatured PAGE showing the analysis result of acid phosphatase in Example 4.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE photograph showing the results of analysis of chitinase in Examples 5-12.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the sugar chain structure by normal phase HPLC in Examples 13 to 19.
  • FIG. 14 shows the results of normal phase HPLC analysis of the sugar chain structure in Example 20.
  • A pREP41-GFP
  • B pREP41-omh1-GFP
  • FIG. 20 shows the observation results of cells in Example 20.
  • A Nomarski optical system mounting observation device, (b) fluorescence microscope (GFP observation), (c) fluorescence microscope (RFP observation).
  • FIG. 26 is a result of reverse phase HPLC analysis of a sugar chain structure of a preparatively purified disaccharide in Example 25.
  • the host of the present invention is a strain of S. cerevisiae in which the omh1 gene has been deleted or inactivated. It is a host composed of pombe and is useful as a host for producing the transformant of the present invention.
  • a transformant of the present invention is produced by introducing a gene encoding a heterologous protein (hereinafter also referred to as “heterologous protein gene”) into this host.
  • the transformant of the present invention produces a heterologous protein having an O-glycoside type sugar chain having a disaccharide structure of O-Man-Gal.
  • the produced O-glycoside type sugar is produced.
  • a heterologous protein having a chain is obtained.
  • heterologous protein refers to the host S. cerevisiae. It means a protein that is not naturally produced by pombe (wild-type S. pombe does not have a gene encoding the protein).
  • the heterologous protein is preferably a protein produced by humans or other mammals from the viewpoint of excellent industrial value.
  • the “wild-type protein corresponding to a heterologous protein” refers to a protein produced by a cell of an organism that produces the heterologous protein (an organism other than S. pombe).
  • the heterologous protein produced by the transformant of the present invention may be different in sugar chain from this wild type protein.
  • the heterologous protein produced by the transformant of the present invention is an O-glycoside type sugar chain-containing heterologous protein having a sugar chain having a disaccharide structure of O-Man-Gal, and has a structure other than the disaccharide structure of O-Man-Gal. It is a heterologous protein that has substantially no O-glycoside type sugar chain.
  • the wild-type protein is a gene encoding a protein (glycoprotein) having an O-glycoside type sugar chain.
  • heterologous proteins include S. Examples include chitinase not produced by pombe, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), and the like.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • the expressed heterologous protein is fused to the endoplasmic reticulum or Golgi by fusing a secretory signal to the N-terminus.
  • a heterologous protein having an O-glycoside-type sugar chain can be obtained depending on the amino acid sequence and the secondary structure or tertiary structure of the protein.
  • a chimeric sequence having a DNA sequence encoding an appropriate secretion signal may be used.
  • S. used as a host Pombe is a yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces, which is particularly excellent in acid resistance compared to other yeasts, has a similar cell cycle, chromosome structure, RNA splicing, etc. to those of animal cells, and is a produced protein This post-translational modification is a microorganism thought to be close to that of animal cells.
  • the host of the present invention is S. cerevisiae.
  • Pombe is a mutant type having a chromosome in which the omh1 gene is deleted or inactivated. This variant of S. Pombe maintains the above characteristics, and a transformant obtained by introducing a heterologous protein gene into this host also maintains the above characteristics.
  • the omh1 gene (SPBC19C7.12c, accession number: O60160) It is one of the genes encoding omh1p described later, which is an enzyme (protein) that synthesizes an O-glycoside type sugar chain in pombe, and is an enzyme gene that plays a major role in the synthesis thereof.
  • the accession number represents a registration number of the protein database Uniprot (URL: http://www.Uniprot.org/).
  • the synthesis of the O-glycoside type sugar chain is initiated by O-mannosyltransferase expressed from the PMT gene family as in the case of Schizosaccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). This gene is highly conserved from yeast to multicellular organisms.
  • mannose is added to serine residues and threonine residues in proteins by O-mannosyltransferase encoded by the PMT gene family.
  • S. After the first mannose is added to the protein, S. In S. cerevisiae, as described above, ⁇ 1,2-mannosyltransferase and ⁇ 1,3-mannosyltransferase encoded by the KTR gene family and the MNN1 gene family are involved in sugar chain elongation. On the other hand, S.M. The gene of the enzyme involved in the elongation of the O-glycoside type sugar chain in Pombe has not been identified so far.
  • S.I In the Pombe chromosome, S. A gene (omh gene, O-glycoside ⁇ 1,2-mannosyltransferase homologues) having high homology with the KTR gene (gene encoding ⁇ 1,2-mannosyltransferase) family involved in the elongation reaction of O-glycosidic sugar chains of S. cerevisiae Examined.
  • KTR gene gene encoding ⁇ 1,2-mannosyltransferase
  • FIG. A comparison of the amino acid sequences of the Kre2 gene, the Ktr1 gene, the Ktr3 gene of the K. cerevisiae KTR gene family and the respective proteins encoded by the omh1 to omh6 genes is shown.
  • the homology of the nucleotide sequence of the omh1 gene to the omh5 gene is 33 to 55% with respect to the Kre2 gene, Ktr1 gene, and Ktr3 gene subfamily of the KTR gene family of S. cerevisiae.
  • the omh6 gene has lower homology than the omh1 to omh5 genes.
  • ⁇ 1,2-mannosyltransferase (hereinafter referred to as “Kre2p”) encoded by the Kre2 gene has an EPD (Glu247-Pro248-Asp249) site corresponding to the DXD motif of various known glycosyltransferases ( FIG. 1).
  • the ⁇ 1,2-mannosyltransferase encoded by the omh1 gene to omh6 gene (hereinafter referred to as “omh1p” to “omh6p”, respectively) also has a corresponding site, and the aspartic acid residue at position 249 has no serine residue.
  • omh1p to omh6p are involved in sugar chain elongation by the same mechanism as Kre2p. That is, Kre2p interacts with the phosphate group of the donor sugar nucleotide (GDP-mannose) by coordination of divalent cation with glutamic acid at position 247, and the tyrosine residue at position 220 (marked with a circle in FIG. 1). It plays an important role in sugar transfer between the donor sugar nucleotide and the terminal mannose of the acceptor. Similarly to Kre2p, it is considered that omh1p to omh6p also undergo sugar transfer due to the contribution of tyrosine residues.
  • the omh1 gene is a gene encoding an enzyme that plays an important role in the elongation reaction of O-glycoside type sugar chains.
  • the transformant of the present invention by deleting or inactivating the omh1 gene, omh1p is not expressed, and the structure of the O-glycoside type sugar chain that binds to the heterologous protein produced by the transformant is O-Man- Controlled by Gal. This is thought to be because omh1p ( ⁇ 1,2-mannosyltransferase) encoded by the omh1 gene contributes to the reaction of binding the second mannose to the first mannose bound to the protein. .
  • Omh1 gene to omh6 gene are all S.P. It is not a gene essential for the growth of pombe, and even if the omh1 gene is inactivated or deleted, the phenotype of the cell is not particularly changed. Therefore, the transformant of the present invention has the omh1 gene inactivated or deleted, but can stably produce an O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein.
  • a known method can be used as a method for deleting or inactivating the omh1 gene. Specifically, a gene can be deleted by using the Latour method (described in Nucleic Acids Res (2006) 34: e11 and International Publication No. 2007/063919 pamphlet). In addition, mutation isolation methods using mutants (Yeast Molecular Genetics Experimental Method, 1996, Society Publishing Center) and random mutation methods using PCR (polymerase chain reaction) (PCR Methods Applications (PCR Methods) Appl.), 1992, Vol. 2, p.28-33.) Etc., the gene can be inactivated by introducing a mutation into a part of the gene.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing a heterologous protein gene into a host in which the omh1 gene of the present invention has been deleted or inactivated.
  • the heterologous protein gene may have a part encoding a secretory signal in addition to the part encoding the target heterologous protein.
  • This secretory signal-encoding portion is a portion encoding a secretory signal that functions in a cell of an organism (other than S. pombe) that produces a heterologous protein, and a protein having a secretory signal at the N-terminus was expressed in the cell.
  • the secretory signal portion is deleted in the cell, and then a heterologous protein having no secretory signal is secreted from the cell.
  • the heterologous protein gene has a portion encoding a secretion signal
  • the secretion signal needs to function also in the host of the present invention.
  • the secretion signal does not function in the host of the present invention, it is preferable to use a secretion signal that functions in the host instead of the non-functional secretion signal.
  • secretion signals that function in the host of the present invention include S. cerevisiae. The secretion signal possessed by Pombe is preferred. This S.I.
  • a protein to which this secretory signal is bound is expressed on the N-terminal side of the heterologous protein, and then in the host of the present invention described above.
  • This secretion signal is deleted.
  • the secretory signal gene functioning in the pombe the secretory signal gene described in WO 96/23890 is preferable. In particular, it is preferable to use a gene encoding the secretion signal P3 described in this document.
  • an expression vector having a heterologous protein gene is used.
  • the heterologous protein gene does not include a secretory signal gene that functions in the host, it preferably includes a secretory signal gene that functions in the host.
  • the heterologous protein gene contains a secretory signal gene that does not function in the host, use the heterologous protein gene from which the secretory signal gene has been removed, and use a secretory signal gene that functions in the host instead.
  • the vector further includes a promoter that normally functions in the host, and may further include any one or more of a terminator, a 5′-untranslated region, and a 3′-untranslated region. The promoter is the host S. cerevisiae.
  • any substance that functions in a pombe and can express a heterologous protein may be used.
  • the promoter in the present invention include promoters derived from animal cell viruses described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, and JP-A-10-234375.
  • the SV40 promoter is preferred.
  • JP-A-11-192094 International Publication No. 2007/26617 pamphlet and the like.
  • Various promoters known as promoters that can function in the pombe can be used.
  • heterologous protein gene can be introduced not only into the host chromosome in the form of an expression vector to obtain a transformant, but also into the host chromosome in the form of an expression cassette.
  • the expression cassette has the above promoter and secretion signal together with the heterologous protein gene, and is usually integrated into the host chromosome using the homologous recombination method.
  • a method for integrating a heterologous protein gene into a chromosome using an expression cassette As a method for transforming pombe, it is preferable to use the method described in JP-A-2000-262284. If the expression cassette is integrated into the chromosome, it is easy to suppress the loss of the ability to produce a heterologous protein containing an O-glycoside-type sugar chain due to the expression cassette dropping out of the cell during the culture of the transformant.
  • the expression cassette is S. cerevisiae.
  • two or more expression cassettes are preferably incorporated from the viewpoint of improving the productivity of a heterologous protein containing an O-glycoside type sugar chain.
  • the vectors as described above are S. Introduce into Pombe cells and transform.
  • the transformed transformant can be selected using the antibiotic resistance gene or auxotrophic marker.
  • a transformant can be selected by using a medium containing the antibiotic.
  • antibiotic resistance genes include neomycin resistance genes.
  • auxotrophic marker include orotidine phosphate decarboxylase gene (ura4 gene) and isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene).
  • ura4 gene orotidine phosphate decarboxylase gene
  • leu1 gene isopropylmalate dehydrogenase gene
  • Examples of the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected. Next, after separately cultivating them, the expression level of the heterologous protein in each culture solution is examined, and a transformant with a higher expression level of the heterologous protein is selected. Moreover, the number of the expression cassettes integrated in the chromosome can be examined by performing genome analysis by pulse field gel electrophoresis on the selected transformants.
  • the method for producing an O-glycoside sugar chain-containing heterologous protein of the present invention is a method for culturing the transformant of the present invention and obtaining a heterologous protein having an O-glycoside sugar chain produced by the transformant. is there.
  • a known yeast culture medium can be used as the culture solution. Containing carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be utilized by Pombe; Any material that can efficiently culture pombe is acceptable.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as the culture solution.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, and sucrose, and carbohydrates such as starch. Among these, glucose or sucrose is preferable.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic acids such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium acetate, peptone, meat extract, and yeast extract. Of these, ammonium sulfate or yeast extract is preferable.
  • Examples of inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride. Among these, magnesium phosphate is preferable.
  • the culture solution may contain proteolipid.
  • the culture can be performed by shaking culture, stirring culture, or the like.
  • the culture temperature is preferably 16 to 37 ° C, more preferably 25 to 32 ° C.
  • the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • continuous culture for example, an O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein is obtained from a culture solution cultured for a certain period of time, the culture supernatant is collected, and the culture solution is added again to the culture supernatant and cultured. The method of culturing continuously is mentioned. By performing continuous culture, the productivity of the O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein is further improved.
  • a known protein purification method can be used to obtain an O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein from the culture solution.
  • S. cerevisiae having a chromosome in which the omh1 gene is deleted or inactivated By using a transformant using pombe as a host, an O-glycoside sugar chain-containing heterologous protein in which the O-glycoside sugar chain is controlled by O-Man-Gal can be obtained.
  • Example 1 Cloning and omh gene disruption Using ura4 as a selection marker, omh1 gene to omh6 gene were disrupted. Using the sense and antisense primers shown in Table 1, From the pombe genomic DNA, three DNA fragments (1.3 kb, 1.6 kb, 1.25 kb) each containing a part or all of the omh1, om2 and omh3 genes were amplified and subcloned. As the vector, pGEM-T Easy vector and pGEM-T vector (Promega) were used.
  • the vector was cleaved within the omh1 gene by restriction enzyme treatment with KpnI and EcoRI, and a ura4 + cassette (1.6 kb) was inserted at that position to obtain a vector in which the omh1 gene was disrupted.
  • a vector in which the omh2 gene was disrupted using restriction enzymes EcoRV and HindIII, and a vector in which the omh3 gene was disrupted using restriction enzymes EcoRI and XhoI were obtained.
  • S. cerevisiae lacking uracil synthesis ability was used.
  • the Pombe ARC039 strain (haploid) was transformed and selected with a uracil selection medium to obtain an omh1 mutant strain having a disrupted omh1 gene.
  • An omh2 mutant having a disrupted omh2 gene and an omh3 mutant having a disrupted omh3 gene were also constructed in the same manner. Confirmation that the desired omh1 mutant, omh2 mutant, and omh3 mutant were obtained was performed by Southern blotting and PCR.
  • a loxP cassette vector (pBS loxP-ura4-loxP, described in Biosci Biotechnol Biochem, 68, 545-550 (2004)) was used for disruption of the omh4 gene to omh6 gene.
  • the upstream fragment of the omh4 gene was amplified by PCR using a sense primer and an antisense primer (Table 1) having XhoI and HindIII restriction enzyme sites, respectively, and the downstream fragment was expressed as an EcoRI and BamHI restriction enzyme site, respectively. Amplified by PCR using sense primers and antisense primers (Table 1). These amplified fragments were treated with appropriate restriction enzymes, respectively, and then inserted into the pBS loxP-ura4-loxP vector.
  • the upstream and downstream fragments of the omh4 gene were respectively present on both sides of the loxP-ura4-loxP cassette.
  • the located omh4 gene disruption vector was obtained.
  • the vector for omh5 gene disruption and the vector for omh6 gene disruption were obtained by the same method using the sense primer and antisense primer shown in Table 1. Using DNA fragments obtained by linearizing these vectors, S. aureus lacking the ability to synthesize uracil.
  • the Pombe ARC039 strain (haploid) was transformed and selected with a uracil selective medium to obtain omh4 mutant, omh5 mutant, and omh6 mutant, respectively.
  • Example 2 Observation of cell morphology
  • the omh1 to omh6 mutants obtained in Example 1 were cultured overnight at 30 ° C and 37 ° C in a YES medium (5 ml), and then equipped with a Nomarski optical system. Their cell morphology was observed with an observation device.
  • wild type S. cerevisiae. Pombe was also cultured in the same manner as each mutant strain, and the cell morphology was observed. The results are shown in FIGS. 2 (a) to (g). In FIG.
  • omh1p encoded by omh1 gene This indicates that it is not involved in the formation of the sugar chain structure essential for the structure and function of Pombe's normal cell wall.
  • the omh6 mutant showed a phenotype different from the wild type.
  • Example 3 Temperature dependence and antibiotic resistance (hygromycin B) Each culture solution after the culture in Example 2 was diluted with water so that the OD 600 would be 0.5 (corresponding to 10 7 cells / ml). After further 10-fold dilution (10 ⁇ 1 in FIG. 3, leftmost column), 7 ⁇ l of this was streaked into YES medium (agar medium), 30 ° C. (FIG. 3 (a)), and 37 ° C. (FIG. 3). The cells were cultured for 3 days under the conditions of 3 (c)). Similarly, a YES medium (5 ml) containing 20 ⁇ g / ml hygromycin B (0.005% by mass) was also cultured overnight at 30 ° C. (FIG.
  • FIGS. 3 (a) to 3 (c) those having an OD 600 of 0.5 in order from the left are diluted 10 times (10 ⁇ 1 , 10 ⁇ 2 , 10 ⁇ 3 , 10 ⁇ 4 ) under each condition. The culture result of a thing is shown.
  • the omh1 mutant, omh2 mutant, omh4 mutant, and omh5 mutant are less affected by temperature and hygromycin B, and wild type S. It was found that it grows at a rate that does not change significantly from Pombe. On the other hand, in the omh3 mutant and the omh6 mutant, the growth rate decreased in culture at 37 ° C. and culture in a medium containing hygromycin B.
  • Example 4 Analysis of acid phosphatase
  • omh1 mutant to omh6 mutant By analyzing the influence of omh1 mutant to omh6 mutant on acid phosphatase, the influence of omh1p to omh6p on the elongation of N-glycoside type sugar chain was examined. After culturing the ARC039 strain and the omh1 mutant to omh6 mutant strains in a YES medium (5 ml) at 30 ° C. until the OD 600 was 1.5, 1.5 ⁇ 10 8 cells were obtained by centrifugation.
  • the cells are based on MM medium described in MMP medium (Methods Enzymol, 194,795-823 (1991), and contain 14.6 mM sodium acetate instead of disodium hydrogen phosphate and potassium hydrogen phthalate. Culture medium. ) And was incubated at 30 ° C. for 3 hours to induce the production of acid phosphatase. Next, the obtained cells were collected by centrifugation, washed with Tris-HCl buffer (62.5 mM, pH 6.8), and then ice-cooled 200 ⁇ l of lysate (62.5 mM Tris-HCl, pH 6).
  • Lane 1 is wild type S. cerevisiae. Pombe
  • lane 2 is the omh1 mutant
  • lane 3 is the omh2 mutant
  • lane 4 is the omh3 mutant
  • lane 5 is the omh4 mutant
  • lane 6 is the omh5 mutant
  • lane 7 is the result of electrophoresis in the omh6 mutant.
  • the mobility of acid phosphatase in electrophoresis is as follows: omh1 mutant strain to omh6 mutant strain and wild type S. cerevisiae. There was no change with Pombe and it was equivalent. From this result, it was found that omh1p to omh6p are not involved in the elongation of the N-glycoside type sugar chain.
  • chitinase expression medium (based on MM medium, 0.1% (w / v) instead of 2% (w / v) glucose. / Vv) containing glucose and 2% (w / v) fructose)) and incubated at 30 ° C. for 3 hours. Thereafter, chitinase was collected from the supernatant of the medium, and O-glycoside type sugar chain was elongated by SDS (Sodium dodecyl sulfate) -PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) using 6% (w / v) polyacrylamide gel. analyzed.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PAGE Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis
  • chitinase Recovery of chitinase from the medium was performed as shown below. Chitin beads (20 mg, Sigma) were added to the medium, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours and centrifuged to give a pellet. The pellet was washed 3 times with sodium buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl), and chitinase was extracted by boiling for 5 minutes with SDS sample buffer (50 ⁇ l). Gel staining was performed with Coomassie Brilliant Blue R-250.
  • Examples 6 to 12 Wild type S. Chimase was analyzed in the same manner as in Example 5 for pombe (Example 6) and omh2 mutant to omh6 (Examples 7 to 11) mutants.
  • S. S. cerevisiae (Example 12) was cultured in YPD medium (10 ml) at 30 ° C., and chitinase was separated by SDS-PAGE using 6% (w / v) polyacrylamide gel in the same manner as in Example 5. The results are shown in FIG. Lane 1 is S. Cerevisiae, lane 2 is wild type S. cerevisiae.
  • lane 3 is the omh1 mutant
  • lane 4 is the omh2 mutant
  • lane 5 is the omh3 mutant
  • lane 6 is the omh4 mutant
  • lane 7 is the omh5 mutant
  • lane 8 is the result of electrophoresis in the omh6 mutant.
  • the molecular weight of chitinase was determined using the 83 kDa and 175 kDa markers.
  • the molecular weight of chitinase was about 100 kDa, and the elongation of the O-glycoside type sugar chain was significantly impaired. From this result, it was confirmed that the omh1 gene is deeply involved in the elongation of O-glycoside type sugar chains.
  • the sugar chain of the glycoprotein (O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein) obtained from Pombe and omh1 mutant to omh6 mutant is hydrolyzed, converted to pyridylamino (PA) and analyzed by HPLC (High performance liquid chromatography). went.
  • PA pyridylamino
  • HPLC High performance liquid chromatography
  • Example 14 Wild type S. For Pombe (Example 14) and omh2 mutant to omh6 mutant (Examples 15 to 19), the normal phase HPLC analysis of the sugar chain was performed in the same manner as in Example 13.
  • Example 14 also collects the five major peaks detected and examines how these peaks change after treatment with jack bean alpha mannosidase and coffee bean alpha galactosidase. The corresponding sugar chain structure was confirmed.
  • FIG. 6 shows wild type S. cerevisiae.
  • Peak 2G was Gal-Man-PA
  • Peak 2M was Man-Man-PA
  • Peak 3G was Gal-Man-Man-PA
  • Peak 3M was Man-Man-Man-PA.
  • Peak 4i was a mixture of sugar chains having four sugars.
  • the sugar chains in the omh2 mutant to omh6 mutant (FIGS. 6 (c) to (g)) are wild-type S. mutans. It was almost the same as that of Pombe (FIG. 6 (a)), and there was no change.
  • the omh1 gene was isolated from wild type S. After amplification by PCR from the genomic DNA of pombe, cleavage sites of restriction enzymes BglII and NotI were introduced and treated with these restriction enzymes, vector pREP41-GFP (vector pTN197 obtained from pREP41, Mol Biol Cell, 12, 3955) The vector pREP41-omh1-GFP having a gene expressing omh1p in which GFP (green fluorescent protein) was bound at the C-terminal was obtained by cloning at the corresponding site of (-3972 (2001)).
  • the vector pAU-Gms1 having a gene expressing Gms1p UDP galactose transporter encoded by the Gms1 gene
  • RFP red fluorescent protein
  • the omh1 mutant strain transformed with pREP41-GFP or pREP41-omh1-GFP was cultured in MM medium not containing leucine at 30 ° C. until stationary phase.
  • the results of normal phase HPLC analysis of this in the same manner as in Example 13 are shown in FIGS. 7 (a) (pREP41-GFP) and (b) (pREP41-omh1-GFP).
  • FIGS. 8 (a) to (c) The results are shown in FIGS. 8 (a) to (c).
  • FIG. 8 (a) is an observation apparatus equipped with a Nomarski optical system
  • FIG. 8 (b) is an observation of pREP41-GFP with a fluorescence microscope
  • FIG. 8 (c) is an observation of pAU-Gms1-RFP. Is.
  • omh1p-GFP (omh1p bound with GFP) was localized at the same place as Gms1p-RFP (Gms1p bound with RFP).
  • Gms1p is a protein that transports galactose necessary for sugar chain synthesis. From this result, it was also confirmed that the omh1 gene is involved in the synthesis of O-glycoside type sugar chains.
  • chitinase was collected from the supernatant of the medium, and the purity of the chitinase was confirmed by SDS-PAGE using 6% (w / v) polyacrylamide gel.
  • the recovery of chitinase from the medium was performed as follows. After adding chitin (400 mg, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the medium, the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours and centrifuged to form a pellet.
  • the pellet was washed three times with sodium buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl), and SDS sample buffer (63 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v / v) glycerol, 2% (w / v) Chitinase was extracted by boiling for 5 minutes with SDS, 0.002% (w / v) BPB, 1 ml). Gel staining was performed with Coomassie Brilliant Blue R-250.
  • Example 22 The omh1 mutant was analyzed for chitinase in the same manner as in Example 21. The results of Examples 21 and 22 are shown in FIG. Lane 1 shows wild type S. cerevisiae. Pombe, lane 2 shows the results of the omh1 mutant.
  • the sugar chain of chitinase (O-glycoside-type sugar chain-containing heterologous protein) purified from Pombe wild strain and omh1 mutant was liberated by hydrazine decomposition, and the reducing end was converted to pyridylamino (PA) and analyzed by HPLC.
  • Example 23 In Example 21, in order to remove SDS from the chitinase extracted from chitin, dialysis was performed against MilliQ water (ultra pure water), followed by lyophilization. S. 1 mg of lyophilized powder was obtained from the pombe wild strain. Next, 0.3 mg of lyophilized chitinase was subjected to hydrazine decomposition using Hydra Club C-206 (manufactured by J Oil Mills). Next, the obtained free sugar chain sample is heated with a pyridylaminating agent (20 ⁇ l) at 90 ° C. for 60 minutes, and then a reducing agent (20 ⁇ l) is added and heated at 80 ° C. for 35 minutes to reduce the sugar chain.
  • a pyridylaminating agent (20 ⁇ l) at 90 ° C. for 60 minutes
  • a reducing agent (20 ⁇ l) is added and heated at 80 ° C. for 35 minutes to reduce the sugar chain.
  • 2-Aminopyridine was added to the terminal. Excess pyridylaminating agent and reducing agent were removed by extraction with phenol / chloroform (volume ratio 50/50). Next, normal phase HPLC analysis (column: Amide-80 column (4.6 mm ⁇ 75 mm), manufactured by Tosoh Corporation) was performed on the obtained sample. The molecular size of the sugar chain was determined by PA-labeled standard markers, PA-mannose, PA-maltose, and PA-isomaltooligosaccharide (Takara Bio Inc.).
  • Example 24 In Example 22, in order to remove SDS from the chitinase extracted from chitin, dialysis was performed against MilliQ water, followed by lyophilization. 0.5 mg of lyophilized powder was obtained from the omh1 mutant. Thereafter, normal phase HPLC analysis was carried out in the same manner as in Example 23. The results of normal phase HPLC analysis of Examples 23 and 24 are shown in FIG. In FIG. Pombe wild strain, (b) shows the result of omh1 mutant.
  • Example 25 S.
  • the disaccharide peak was preparatively purified and subjected to reverse phase HPLC analysis (column: ODS-80Ts column (4.6 mm ⁇ 150 mm), manufactured by Tosoh Corporation) was performed. Further, after the pre-purified disaccharide was digested with ⁇ -galactosidase (Sigma G8507, derived from coffee beans) and digested with ⁇ -mannosidase (Sigma M7257, derived from Jack beans), the reverse was similarly applied. Phase HPLC analysis was performed.
  • FIG. (A) and (e) in FIG. 11 show the retention times of Man-PA and Man-Man-PA (Man ⁇ 1-2Man-PA), which are standard sugar chains.
  • 11 (b) to 11 (d) show S.I.
  • FIG. 11 (f) to (h) show the analysis results of the omh1 mutant
  • FIGS. 11 (b) and (f) show the results of preparative purification
  • (c) and (g). ) Shows the analysis results after ⁇ -galactosidase digestion
  • (d) and (f) show the analysis results after ⁇ -mannosidase digestion.
  • the transformant of the present invention can produce a heterologous protein in which the structure of the O-glycoside sugar chain to be bound is controlled. Therefore, the method for producing an O-glycoside sugar chain-containing heterologous protein using the transformant can be suitably used in the medical field and the like.

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Abstract

　Ｓ．ポンベを宿主として用い、糖鎖構造を特定の構造に制御したＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることのできる形質転換体、該形質転換体の製造方法、および該形質転換体を得るための宿主、ならびにＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法を提供することを目的する。 　ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活した染色体を有するＳ．ポンベからなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、特定のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための宿主。また、該宿主を用いた形質転換体およびその製造方法、ならびに該形質転換体を用いたＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。

Description

宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法
　本発明は、宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法に関する。
　真核生物における分泌蛋白質等のグリコシル化は、翻訳後修飾の中でも重要な過程の一つであり、小胞体やゴルジ体に関連する様々な酵素によって管理されている。グリコシル化により蛋白質に結合される糖鎖は、マンノース（Ｍａｎ）やガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン等により形成される。蛋白質に結合する糖鎖には、アスパラギン残基のアミドの窒素原子に結合するＮ－グリコシド型糖鎖と、セリン残基やトレオニン残基の水酸基の酸素原子に結合するＯ－グリコシド型糖鎖の２種類がある。このような糖鎖は、蛋白質への安定性の付与や、細胞との相互作用に影響していると言われている。そのため、医薬品製造を目的として、Ｎ－グリコシド型糖鎖が結合された蛋白質を製造する技術の開発が試みられている（例えば、特許文献１および２参照）。
　Ｎ－グリコシド型糖鎖については、様々な知見が集積されているが、Ｏ－グリコシド型糖鎖については知見が少ない。通常、生体では様々な構造を有するＯ－グリコシド型糖鎖が結合した蛋白質が産生されるが、特に医薬品の製造においては、蛋白質に結合する糖鎖の構造を特定のものに制御することが重要である。そこで、Ｏ－グリコシド型糖鎖を有する蛋白質についても、特定の糖鎖構造を有するものを高い生産性で製造する技術が求められている。
　目的の蛋白質を高い生産性で製造する方法としては、目的の異種蛋白質（宿主が本来産生しない蛋白質）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的な製造方法が広く用いられている。宿主は、真核生物由来の蛋白質を製造する場合、真核生物である微生物を用いることが最も良いと考えられており、人体に悪影響を及ぼす物質を含まない点から、酵母が多く用いられている。なかでも、分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）（以下、「Ｓ．ポンベ」という。）は、シゾサッカロミセス・セレビシエ（以下、「Ｓ．セレビシエ」という。）等の出芽酵母に比べて、細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシング等が動物細胞のものにより類似していると言われ、産生される蛋白質の翻訳後修飾も動物細胞のそれに近いと考えられている。
　Ｓ．セレビシエにおけるＯ－グリコシド型糖鎖の合成は、ＰＭＴ遺伝子ファミリーがコードするＯ－マンノシルトランスフェラーゼにより、蛋白質のセリン残基またはトレオニン残基の酸素にマンノースが結合されることにより開始される（非特許文献１および２参照）。その後、糖鎖の伸長には、ＫＴＲ遺伝子ファミリーがコードするα１，２－マンノシルトランスフェラーゼと、ＭＮＮ１遺伝子ファミリーがコードするα１，３－マンノシルトランスフェラーゼが関与している（非特許文献３参照）。
　一方、Ｓ．ポンベについてはＯ－グリコシド型糖鎖の伸長に関与する遺伝子は特定されていなかった。
　Ｓ．ポンベを用いた異種蛋白質の製造については、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターや分泌シグナル遺伝子、マルチクローニングベクター等が開発されている。しかし、Ｓ．ポンベにおけるＯ－グリコシド型糖鎖の糖鎖修飾に関与する遺伝子については、よくわかっていなかったため、これまでＯ－グリコシド型糖鎖の構造を制御することはできなかった。
　以上のことから、Ｓ．ポンベを用いて特定のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を製造する方法が望まれている。
特表２００４－５０１６４２号公報 特表２００５－５１４０２１号公報
Strahl-Bolsinger S, Gentzsch M and Tanner W, Biochim Biophys Acta, 1426, 297-307 (1999). Girrbach V and Strahl S, J Biol Chem, 278, 12554-12562 (2003) Lussier M, Sdicu M and Bussey H, Biochim Biophys Acta, 1426, 323-334 (1999)
　そこで本発明では、Ｓ．ポンベを宿主として用い、糖鎖構造をＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌ（異種蛋白質の酸素原子に、マンノース、ガラクトースの順に結合した糖鎖）なるジサッカライド構造に制御したＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることのできる形質転換体、および該形質転換体の製造方法を提供することを目的とする。また、この形質転換体を得るためのＳ．ポンベ宿主を提供することを目的とする。
　さらに、本発明では、前記形質転換体を用いたＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の宿主は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベからなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための、宿主である。
　本発明の形質転換体は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含む。
　また、本発明の形質転換体は、さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含むことが好ましい。
　さらに、本発明の形質転換体は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、Ｏ－グリコシド型糖鎖を有している蛋白質であることが好ましい。
　本発明の形質転換体の製造方法は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を前記宿主に組み込むことを特徴とする。
　また、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有することが好ましい。
　さらに、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がＯ－グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質であることが好ましい。
　本発明のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、前記形質転換体を培養し、産生されたＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造を有するＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することを特徴とするＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を製造する方法である。
　また、本発明のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、産生されるＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質の糖鎖が、当該異種蛋白質に対応する野生型異種蛋白質の糖鎖の有無や糖鎖構造にかかわりなく、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造を有することが好ましい。
　さらに、本発明のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、形質転換体を培養した培養液からＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することが好ましい。
　本発明のＳ．ポンベの宿主は、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための宿主として有用である。
　本発明のＳ．ポンベを宿主とした形質転換体によれば、糖鎖構造をＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。
　また、本発明の形質転換体の製造方法によれば、糖鎖構造をＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質が得られる形質転換体を製造することができる。
　また、本発明によれば、前記形質転換体を用いて、糖鎖構造をＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を製造することができる。
ＫＴＲファミリーおよびｏｍｈ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を示した図である。 例２において細胞形態を観察した結果を示す図である。 例３における培養後の結果を示した図である。 例４における酸性ホスファターゼの分析結果を示した非変性ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）野生型Ｓ．ポンベ、（レーン２）ｏｍｈ１変異株、（レーン３）ｏｍｈ２変異株、（レーン４）ｏｍｈ３変異株、（レーン５）ｏｍｈ４変異株、（レーン６）ｏｍｈ５変異株、（レーン７）ｏｍｈ６変異株。 例５～１２におけるキチナーゼを分析した結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）Ｓ．セレビシエ、（レーン２）野生型Ｓ．ポンベ、（レーン３）ｏｍｈ１変異株、（レーン４）ｏｍｈ２変異株、（レーン５）ｏｍｈ３変異株、（レーン６）ｏｍｈ４変異株、（レーン７）ｏｍｈ５変異株、（レーン８）ｏｍｈ６変異株。 例１３～１９において糖鎖構造を順相ＨＰＬＣにより分析した結果を示した図である。（ａ）野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）ｏｍｈ１変異株、（ｃ）ｏｍｈ２変異株、（ｄ）ｏｍｈ３変異株、（ｅ）ｏｍｈ４変異株、（ｆ）ｏｍｈ５変異株、（ｇ）ｏｍｈ６変異株。 例２０における糖鎖構造の順相ＨＰＬＣ分析結果を示した図である。（ａ）ｐＲＥＰ４１－ＧＦＰ、（ｂ）ｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰ。 例２０における細胞の観察結果を示した図である。（ａ）ノマルスキー光学系搭載観察装置、（ｂ）蛍光顕微鏡（ＧＦＰ観察）、（ｃ）蛍光顕微鏡（ＲＦＰ観察）。 例２１および２２におけるキチナーゼを分析した結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）Ｓ．ポンベ野生株、（レーン２）ｏｍｈ１変異株。 例２３および２４における糖鎖構造の順相ＨＰＬＣ分析結果を示した図である。（ａ）Ｓ．ポンベ野生株、（ｂ）ｏｍｈ１変異株。 例２５における分取精製したジサッカライドの糖鎖構造の逆相ＨＰＬＣ分析結果である。（ａ）および（ｅ）標準糖鎖、（ｂ）～（ｄ）Ｓ．ポンベ野生株、（ｆ）～（ｈ）ｏｍｈ１変異株。
　本発明の宿主は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベからなる宿主であり、本発明の形質転換体を製造するための宿主として有用である。異種蛋白質をコードする遺伝子（以下、「異種蛋白質遺伝子」ともいう。）をこの宿主に導入して、本発明の形質転換体が製造される。本発明の形質転換体は、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生し、本発明の蛋白質の製造方法では、産生されたこのＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する。
　本発明において「異種蛋白質」とは、宿主であるＳ．ポンベが本来産生しない（野生型のＳ．ポンベが、その蛋白質をコードする遺伝子を有しない）蛋白質を意味する。異種蛋白質は、産業的価値に優れる点から、ヒトや他の哺乳動物が産生する蛋白質であることが好ましい。「異種蛋白質の対応する野生型蛋白質」とは、異種蛋白質を産生する生物（Ｓ．ポンベ以外の生物）の細胞が産生する蛋白質をいう。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、この野生型蛋白質と糖鎖が異なっていてもよい。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造の糖鎖を有するＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質であり、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造以外のＯ－グリコシド型糖鎖を実質的に有しない異種蛋白質である。
　異種蛋白質遺伝子としては、Ｏ－グリコシド型糖鎖の構造がＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌ（酸素原子にマンノース、ガラクトースの順に糖が結合した糖鎖構造）に制御されたＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質が安定して得られやすい点から、野生型の蛋白質がＯ－グリコシド型糖鎖を有している蛋白質（糖蛋白質）をコードする遺伝子であることが好ましい。このような異種蛋白質としては、例えば、Ｓ．ポンベが産生しないキチナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　また、本発明の形質転換体では、野生型がＯ－グリコシド型糖鎖を有さない異種蛋白質であっても、Ｎ末端に分泌シグナルを融合させることにより、発現した異種蛋白質を小胞体やゴルジ体へ輸送することができるため、アミノ酸配列や、その蛋白質の二次構造や三時構造によっては、Ｏ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。野生型においてＮ末端に分泌シグナルを有さない蛋白質の場合は、適当な分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を備えたキメラ配列としてもよい。
（宿主）
　宿主として用いるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れており、細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシング等が動物細胞のものにより類似し、産生される蛋白質の翻訳後修飾も動物細胞のそれに近いと考えられる微生物である。本発明の宿主であるＳ．ポンベは、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させた染色体を有する変異型である。この変異型のＳ．ポンベは、上記特徴を維持しており、また、この宿主に異種蛋白質遺伝子を導入して得られる形質転換体も上記特徴を維持している。
　ｏｍｈ１遺伝子（ＳＰＢＣ１９Ｃ７．１２ｃ、アクセッション番号：Ｏ６０１６０）は、Ｓ．ポンベ内でＯ－グリコシド型糖鎖を合成する酵素（蛋白質）である後述のｏｍｈ１ｐをコードする遺伝子の一つであり、特にその合成において主要な役割を果たす酵素の遺伝子である。なお、本明細書において、アクセッション番号とは、蛋白質データベースＵｎｉｐｒｏｔ（URL：http：／／www．Uniprot．org／）の登録番号を表わす。
　Ｏ－グリコシド型糖鎖の合成は、シゾサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）の場合と同様、ＰＭＴ遺伝子ファミリーから発現されるＯ－マンノシルトランスフェラーゼにより開始される。この遺伝子は酵母から多細胞生物まで高度に保存されており、Ｓ．ポンベにおいてもＰＭＴ遺伝子ファミリーがコードするＯ－マンノシルトランスフェラーゼにより、蛋白質中のセリン残基やトレオニン残基にマンノースが付加される。
　蛋白質に１つ目のマンノースが付加された後、Ｓ．セレビシエでは、前述のようにＫＴＲ遺伝子ファミリーおよびＭＮＮ１遺伝子ファミリーによりコードされているα１，２－マンノシルトランスフェラーゼとα１，３－マンノシルトランスフェラーゼが糖鎖の伸長に関わる。これに対し、Ｓ．ポンベにおけるＯ－グリコシド型糖鎖の伸長に関与する酵素の遺伝子は、これまで特定されていなかった。
　そこで本発明者等は、Ｓ．ポンベの染色体において、Ｓ．セレビシエのＯ－グリコシド型糖鎖の伸長反応に関与するＫＴＲ遺伝子（α１，２－マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）ファミリーと相同性の高い遺伝子（ｏｍｈ遺伝子、Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　α１，２－ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を調べた。その結果、Ｓ．ポンベ内でＯ－グリコシド型糖鎖の伸長に関与する酵素の６つの遺伝子、ＳＰＢＣ１９Ｃ７．１２ｃ（ｏｍｈ１遺伝子）、ＳＰＢＣ１６Ｈ５．０９ｃ（ｏｍｈ２遺伝子、アクセッション番号：Ｏ４２９４４）、ＳＰＣＣ７７７．０７（ｏｍｈ３遺伝子、アクセッション番号：Ｏ７４５４６）、ＳＰＢＣ１７７３．０８ｃ（ｏｍｈ４遺伝子、アクセッション番号：Ｏ９４５６５）、ＳＰＢＣ３２Ｈ８．０８ｃ（ｏｍｈ５遺伝子、アクセッション番号：Ｑ９６ＷＷ１）、およびＳＰＡＣ９５９．０４ｃ（ｏｍｈ６遺伝子、アクセッション番号：Ｑ９Ｐ４Ｘ２）を見つけた。また、前記ＭＮＮ１遺伝子と相同性の高い遺伝子は、Ｓ．ポンベにおいては見つからなかった。
　図１に、Ｓ．セレビシエのＫＴＲ遺伝子ファミリーのＫｒｅ２遺伝子、Ｋｔｒ１遺伝子、Ｋｔｒ３遺伝子と、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子によりコードされるそれぞれの蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す。
　Ｓ．セレビシエのＫＴＲ遺伝子ファミリーのＫｒｅ２遺伝子、Ｋｔｒ１遺伝子、Ｋｔｒ３遺伝子のサブファミリーに対する、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ５遺伝子の塩基配列の相同性は３３～５５％である。一方、ｏｍｈ６遺伝子は、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ５遺伝子に比べると相同性が低い。
　Ｋｒｅ２遺伝子がコードするα１，２－マンノシルトランスフェラーゼ（以下、「Ｋｒｅ２ｐ」という。）は、公知の様々なグリコシルトランスフェラーゼが有するＤＸＤモチーフに相当するＥＰＤ（Ｇｌｕ２４７－Ｐｒｏ２４８－Ａｓｐ２４９）部位を有している（図１）。ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子がコードするα１，２－マンノシルトランスフェラーゼ（以下、それぞれ「ｏｍｈ１ｐ」～「ｏｍｈ６ｐ」という。）もこれに相当する部位を有しており、２４９位のアスパラギン酸残基はセリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基に変化しているものもあるが、２４７位のグルタミン酸は高度に保存されている。このことから、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐは、Ｋｒｅ２ｐと同じ機構で糖鎖の伸長に関与していると考えられる。すなわち、Ｋｒｅ２ｐは２４７位のグルタミン酸が２価のカチオンの配位により供与体の糖ヌクレオチド（ＧＤＰ－マンノース）のリン酸基と相互作用し、２２０位のチロシン残基（図１の○印）が前記供与体の糖ヌクレオチドと、受容体の末端のマンノースとの間の糖転移に重要な役割を果たしている。ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐについても、Ｋｒｅ２ｐと同様に、チロシン残基の寄与による糖転移が行われると考えられる。
　また、Ｋｒｅ２ｐとｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐとの間では、７つのシステイン残基（図１の●印）の位置も保存されている。その他にも、多くの部位でアミノ酸配列が高度に保存されている（図１の反転部分）。このとから、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐは、Ｋｒｅ２ｐと同様の三次元構造を有していると考えられる。
　また、Ｋｒｅ２ｐにおいて前記供与体および受容体に結合して活性部位となるアミノ酸配列（ＹＮＬＣＨＦＷＳＮＦＥＩ、図１下線部）も、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐにおいて高度に保存されていることからも、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐはＫｒｅ２ｐと同様の機構で糖鎖伸長を行うと考えられる。
　これらのｏｍｈ遺伝子の中でもｏｍｈ１遺伝子は、Ｏ－グリコシド型糖鎖の伸長反応において重要な役割を担っている酵素をコードしている遺伝子である。本発明の形質転換体では、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させることで、ｏｍｈ１ｐが発現せず、形質転換体が産生する異種蛋白質に結合するＯ－グリコシド型糖鎖の構造がＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌに制御される。
　これは、ｏｍｈ１遺伝子がコードするｏｍｈ１ｐ（α１，２－マンノシルトランスフェラーゼ）が、蛋白質に結合した１つ目のマンノースに対し、２つめのマンノースを結合させる反応に寄与しているためであると考えられる。すなわち、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させることにより、１つ目のマンノースに２つ目のマンノースを結合させることができなくなるため、ガラクトシルトランスフェラーゼにより１つ目のマンノースにガラクトースが結合すると考えられる。
　ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子は、いずれもＳ．ポンベの生育に必須な遺伝子ではなく、またｏｍｈ１遺伝子を失活または欠失させても細胞の表現型は特に変化しない。そのため、本発明の形質転換体は、ｏｍｈ１遺伝子を失活または欠失させているが、Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を安定して製造することができる。
　また、Ｓ．ポンベでは、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させた場合に、ｏｍｈ１遺伝子の機能は、ｏｍｈ２遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子の過剰発現によっては補われない。また、ｏｍｈ２遺伝子～ｏｍｈ５遺伝子のいずれか１つを破壊しても、野生型と同じＯ－グリコシド型糖鎖含有蛋白質が産生されることから、これらの遺伝子がコードする酵素は、いずれも３つ目のマンノースの付加に関わっているか、もしくは糖鎖の合成に余剰の機能を有していると考えられる。
　ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅ１１、および国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８－３３．）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させることができる。
（形質転換体）
　本発明の形質転換体は、上記本発明のｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活した宿主に異種蛋白質遺伝子を導入することにより得られる。異種蛋白質遺伝子は、目的異種蛋白質をコードする部分以外に分泌シグナルをコードする部分を有していてもよい。この分泌シグナルをコードする部分は、異種蛋白質を産生する生物（Ｓ．ポンベ以外）の細胞において機能する分泌シグナルをコードする部分であり、その細胞内でＮ末端に分泌シグナルを有する蛋白質が発現した後、細胞内で分泌シグナル部分が削除され、その後、細胞から分泌シグナルを有していない異種蛋白質が分泌される。異種蛋白質遺伝子が分泌シグナルをコードする部分を有している場合は、その分泌シグナルは、上記本発明の宿主においても機能する必要がある。その分泌シグナルが上記本発明の宿主において機能しない場合は、その機能しない分泌シグナルの代わりに、上記宿主において機能する分泌シグナルを使用することが好ましい。
　上記本発明の宿主において機能する分泌シグナルとしては、Ｓ．ポンベが有する分泌シグナルが好ましい。このＳ．ポンベが有する分泌シグナルをコードする遺伝子を異種蛋白質遺伝子の５’末端側に結合させることにより、異種蛋白質のＮ末端側にこの分泌シグナルが結合した蛋白質が発現し、次いで上記本発明の宿主内で、この分泌シグナルが削除される。Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット記載の分泌シグナル遺伝子が好ましい。特に、この文献記載の分泌シグナルＰ３をコードする遺伝子を使用することが好ましい。
　宿主を形質転換するためには、異種蛋白質遺伝子を有する発現ベクターが使用される。異種蛋白質遺伝子が宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を含まない場合は、宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を含むことが好ましい。なお、異種蛋白質遺伝子が宿主内で機能しない分泌シグナルの遺伝子を含む場合は、その分泌シグナルの遺伝子を除去した異種蛋白質遺伝子を使用し、代わりに宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を使用することが好ましい。ベクターには、さらに通常宿主内で機能するプロモーターを含み、さらにターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。プロモーターは、宿主であるＳ．ポンベ内で機能して異種蛋白質を発現できるものであればよい。
　本発明におけるプロモーターとしては、例えば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、および特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。そのほか、特開平１１－１９２０９４号公報、国際公開第２００７／２６６１７号パンフレットなどに記載のＳ．ポンベ内で機能しうるプロモーターとして知られている種々のプロモーターを使用できる。
　異種蛋白質遺伝子を有する発現ベクターを使用してＳ．ポンベを形質転換する方法は、上記公知例をはじめ種々知られており、その公知の方法を使用できる。上記以外の具体例としては、例えば、特開２０００－２６２２８４号公報、特開２００３－３１０２６９号公報、特開２００５－１９８６１２号公報などに記載のベクターやそれを用いた形質転換方法を採用できる。異種蛋白質遺伝子は、発現ベクターの形で宿主の染色体外に導入して形質転換体を得ることができるばかりでなく、発現カセットの形で宿主の染色体に導入することができる。発現カセットは、異種蛋白質遺伝子とともに上記プロモーターや分泌シグナルなどを有し、通常、相同組換え法を使用して宿主の染色体に組み込む。発現カセットを使用して染色体に異種蛋白質遺伝子を組み込む方法でＳ．ポンベを形質転換する方法としては、上記特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法を用いることが好ましい。発現カセットが染色体に組み込まれていれば、形質転換体の培養中に発現カセットが細胞から脱落してＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の産生能が失われることを抑制しやすい。また、発現カセットをＳ．ポンベの染色体に組み込む場合には、Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の生産性が向上する点から、組み込まれる発現カセットは２個以上であることが好ましい。
　以上説明したようなベクターをＳ．ポンベの細胞に導入して形質転換する。形質転換した形質転換体は、前記抗生物質耐性遺伝子や栄養要求性マーカーを用いて選択することができる。
　抗生物質耐性遺伝子を有するベクターを用いた場合には、その抗生物質を含有する培地を用いることにより形質転換体を選択することができる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。また、栄養要求性マーカーとしては、例えば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）や、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
　栄養要求性マーカーを用いる場合は、例えば、ｕｒａ４遺伝子を欠失または失活させてウラシル要求性としたＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子を有する前記ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。
　選択する方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質の発現量を調べ、異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。また、それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれた発現カセットの数を調べることができる。
［Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法］
　本発明のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体により産生されるＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する方法である。
　培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、Ｓ．ポンベが資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。
培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖、デンプン等の炭水化物が挙げられる。中でも、グルコースまたはスクロースが好ましい。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスが挙げられる。中でも、硫酸アンモニウムまたは酵母エキスが好ましい。
　無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。中でも、リン酸マグネシウムが好ましい。
　また、培養液にはプロテオリピドが含まれていてもよい。
　培養は、振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。
　また、培養温度は、１６～３７℃であることが好ましく、２５～３２℃がより好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
　連続培養は、例えば、一定時間培養した培養液からＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を取得するとともに培養上清を回収し、該培養上清に再び培養液を加えて培養することを繰り返して連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の生産性がより向上する。
　培養液からのＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の取得は、公知の蛋白質精製方法を用いることができる。
　以上説明したように、本発明によれば、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活した染色体を有するＳ．ポンベを宿主とした形質転換体を用いることで、Ｏ－グリコシド型糖鎖がＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌに制御されたＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を得ることができる。
　以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例における形質転換は、酢酸リチウム法もしくはエレクトロポレーション法（Electroporation）により行った。
［例１］クローニングおよびｏｍｈ遺伝子の破壊
　選択マーカーとしてｕｒａ４を用い、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子の破壊を行った。
　表１に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、野生型Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡから、ｏｍｈ１遺伝子、ｏｍｈ２遺伝子、ｏｍｈ３遺伝子の一部または全部をそれぞれ含む３つのＤＮＡ断片（１．３ｋｂ、１．６ｋｂ、１．２５ｋｂ）を増幅し、サブクローニングを行った。ベクターには、ｐＧＥＭ－Ｔ　ＥａｓｙベクターおよびｐＧＥＭ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
　サブクローニング後、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩによる制限酵素処理によりベクターのｏｍｈ１遺伝子内で切断を起こし、その位置にｕｒａ４＋カセット（１．６ｋｂ）を挿入することにより、ｏｍｈ１遺伝子を破壊したベクターを得た。同様に、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｏｍｈ２遺伝子を破壊したベクター、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｏｍｈ３遺伝子を破壊したベクターを得た。
　次に、破壊されたｏｍｈ１遺伝子をそれぞれ有するベクターを直線状にしたＤＮＡ断片を用い、ウラシル合成能が欠損したＳ．ポンベのＡＲＣ０３９株（一倍体）を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、破壊されたｏｍｈ１遺伝子を有するｏｍｈ１変異株を得た。破壊されたｏｍｈ２遺伝子を有するｏｍｈ２変異株、および破壊されたｏｍｈ３遺伝子を有するｏｍｈ３変異株も同様の方法で構築した。所望のｏｍｈ１変異株、ｏｍｈ２変異株、ｏｍｈ３変異株が得られていることの確認は、サザンブロット法およびＰＣＲにより行った。
　ｏｍｈ４遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子の破壊には、ｌｏｘＰカセットベクター（ｐＢＳ　ｌｏｘＰ－ｕｒａ４－ｌｏｘＰ、Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ， ６８，５４５－５５０（２００４）に記載）を用いた。
　ｏｍｈ４遺伝子の上流側の断片を、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（表１）によりＰＣＲで増幅し、下流側の断片を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（表１）によりＰＣＲで増幅した。これらの増幅断片を、それぞれ適した制限酵素により処理した後、ｐＢＳ　ｌｏｘＰ－ｕｒａ４－ｌｏｘＰベクターに挿入し、ｌｏｘＰ－ｕｒａ４－ｌｏｘＰカセットの両側にｏｍｈ４遺伝子の上流側の断片と下流側の断片がそれぞれ位置するｏｍｈ４遺伝子破壊用のベクターを得た。また、表１に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、同様の方法で、ｏｍｈ５遺伝子破壊用のベクターおよびｏｍｈ６遺伝子破壊用のベクターを得た。
　これらのベクターを直線状にしたＤＮＡ断片を用い、ウラシル合成能が欠損したＳ．ポンベのＡＲＣ０３９株（一倍体）を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、それぞれｏｍｈ４変異株、ｏｍｈ５変異株、ｏｍｈ６変異株を得た。
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［例２］細胞形態の観察
　例１で得られたｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株を、ＹＥＳ培地（５ｍｌ）にて、３０℃および３７℃でそれぞれ一晩培養した後、ノマルスキー光学系を搭載した観察装置により、それらの細胞形態を観察した。
　また、比較対象として、野生型Ｓ．ポンベについても各変異株と同様の培養を行い、細胞形態を観察した。結果を図２（ａ）～（ｇ）に示す。図２において、（ａ）が野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）がｏｍｈ１変異株、（ｃ）がｏｍｈ２変異株、（ｄ）がｏｍｈ３変異株、（ｅ）がｏｍｈ４変異株、（ｆ）がｏｍｈ５変異株、（ｇ）がｏｍｈ６変異株における観察結果である。
　図２に示すように、ｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株の全ての変異株が生育可能であり、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ６遺伝子は、いずれも生育に必須の遺伝子ではないことがわかった。また、ｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ５変異株については、ｏｍｈ１遺伝子～ｏｍｈ５遺伝子のうちいずれか一つが破壊されていても、細胞の表現型が野生型Ｓ．ポンベと同じであった。ｏｍｈ１変異株の表現型が野生型Ｓ．ポンベと同じであることは、ｏｍｈ１遺伝子がコードするｏｍｈ１ｐが、野生型Ｓ．ポンベの通常の細胞壁の構成や機能に必須の糖鎖構造の形成には関わっていないことを示している。
　一方、ｏｍｈ６変異株では、野生型とは異なる表現型を示した。
［例３］温度依存性および抗生物質耐性（ハイグロマイシンＢ）
　例２の培養後の各々の培養液を、水によりＯＤ６００が０．５（細胞数１０７個／ｍｌに相当）となるように希釈した。さらに１０倍希釈（図３中の１０－１、一番左側の列）した後、そのうち７μｌをＹＥＳ培地（寒天培地）にストリークし、３０℃（図３（ａ））、および３７℃（図３（ｃ））の条件で３日間培養した。また、同様に、２０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（０．００５質量％）を含有するＹＥＳ培地（５ｍｌ）でも３０℃でそれぞれ一晩培養した（図３（ｂ））。また、早期に急激な増殖が見られる場合は、更に１０倍ずつ希釈していき、同様の条件で培養を行った。図３（ａ）～（ｃ）には、各条件において、左側から順にＯＤ６００が０．５のものを１０倍ずつ希釈（１０－１、１０－２、１０－３、１０－４）したものの培養結果を示す。
　図３に示すように、ｏｍｈ１変異株、ｏｍｈ２変異株、ｏｍｈ４変異株、およびｏｍｈ５変異株は、温度やハイグロマイシンＢの影響が小さく、野生型Ｓ．ポンベと大きく変らない速度で生育することがわかった。
　一方、ｏｍｈ３変異株とｏｍｈ６変異株では、３７℃での培養、およびハイグロマイシンＢを含有する培地における培養において生育速度が低下した。
［例４］酸性ホスファターゼの分析
　ｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株における酸性ホスファターゼへの影響を分析することにより、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐのＮ－グリコシド型糖鎖の伸長への影響を調べた。
　ＡＲＣ０３９株およびｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株を、それぞれＹＥＳ培地（５ｍｌ）にて３０℃でＯＤ６００が１．５となるまで培養した後、遠心分離により１．５×１０８個の細胞を得て、さらに該細胞をＭＭＰ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９４，７９５－８２３（１９９１）に記載のＭＭ培地を基礎とし、リン酸水素二ナトリウムおよびフタル酸水素カリウムの代わりに１４．６ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する培地。
）の５ｍｌに再懸濁し、３０℃で３時間温置することにより酸性ホスファターゼの産生を誘導した。
　次いで、得られた細胞を遠心分離して回収し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（６２．５ｍＭ、ｐＨ６．８）にて洗浄した後、氷冷した２００μｌの溶菌液（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．１ｍＭジチオスレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に懸濁して懸濁液を得た。
　その後、ミニビーズビーター８（Ｍｉｎｉ　Ｂｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ－８、バイオスペック・プロダクツ社製）を用いて、直径０．５ｍｍのガラスビーズによる前記懸濁液の攪拌（４℃、３０秒間）を５度行い、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（非変性）にて電気泳動し、活性染色（Ｙｅａｓｔ，１８，９０３－９０４（２００１）に記載の方法）を行った。結果を図４に示す。レーン１は野生型Ｓ．ポンベ、レーン２はｏｍｈ１変異株、レーン３はｏｍｈ２変異株、レーン４はｏｍｈ３変異株、レーン５はｏｍｈ４変異株、レーン６はｏｍｈ５変異株、レーン７はｏｍｈ６変異株における電気泳動の結果である。
　図４に示すように、電気泳動における酸性ホスファターゼの移動度は、ｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株と野生型Ｓ．ポンベとでは変化がなく、同等であった。この結果から、ｏｍｈ１ｐ～ｏｍｈ６ｐは、Ｎ－グリコシド型糖鎖の伸長には関与していないことがわかった。
＜異種発現した出芽酵母キチナーゼ（分泌蛋白質）の糖鎖構造解析（１）＞
［例５］
　Ｓ．セレビシエのキチナーゼ（Ｃｔｓ１）遺伝子［５’末端側にＳ．セレビシエの分泌シグナル遺伝子を含有］とＳ．ポンベのｎｍｔ１プロモーターとを有するベクターｐＲＥＰ４１－ＳｃＣＴＳ１（文献：N. Tanaka et al., Biochem Biophys Res Commun (2005) 330:813-820.参照）を使用してｏｍｈ１変異株を形質転換（文献：T. Morita and K. Takegawa, Yeast (2004) 21:613-617.、および特開2005-198612号公報参照）した。次いで、ロイシンを含有していないＭＭ培地（５ｍｌ）を用いて定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地（ＭＭ培地を基礎とし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに０．１％（ｗ／ｖｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）フルクトースを含有する。）の１０ｍｌに移して３０℃で３時間温置した。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）－ＰＡＧＥ（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）にてＯ－グリコシド型糖鎖の伸長を分析した。
培地からのキチナーゼの回収は、以下に示すように行った。培地にキチンビーズ（２０ｍｇ、シグマ）を加えた後、４℃で１２時間撹拌し、遠心してペレットとした。該ペレットをナトリウム緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）で３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液（５０μｌ）で５分間ボイル（ｂｏｉｌ）することによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ－２５０により行った。
［例６～１２］
　野生型Ｓ．ポンベ（例６）、ｏｍｈ２変異株～ｏｍｈ６（例７～１１）変異株について、例５と同様の方法でキチナーゼの分析を行った。また、Ｓ．セレビシエ（例１２）をＹＰＤ培地（１０ｍｌ）にて３０℃で培養し、例５と同様にして６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにてキチナーゼを分離した。結果を図５に示す。レーン１はＳ．セレビシエ、レーン２は野生型Ｓ．ポンベ、レーン３はｏｍｈ１変異株、レーン４はｏｍｈ２変異株、レーン５はｏｍｈ３変異株、レーン６はｏｍｈ４変異株、レーン７はｏｍｈ５変異株、レーン８はｏｍｈ６変異株における電気泳動の結果である。キチナーゼの分子量は、８３ｋＤａと１７５ｋＤａのマーカーを用いて決定した。
　図５に示すように、野生型Ｓ．ポンベ（例６、レーン２）およびＳ．セレビシエ（例１２、レーン１）におけるキチナーゼは、ほぼ同等の移動度（分子量約１３０ｋＤａに相当）であった。また、ｏｍｈ２変異株～ｏｍｈ６変異株（例７～例１１、レーン４～８）におけるキチナーゼについても移動度は影響を受けず、Ｓ．セレビシエのキチナーゼとほぼ同等であった。これに対し、ｏｍｈ１変異株（例５、レーン３）においては、キチナーゼの分子量が約１００ｋＤａとなり、Ｏ－グリコシド型糖鎖の伸長が著しく損なわれていた。この結果から、ｏｍｈ１遺伝子が、Ｏ－グリコシド型糖鎖の伸長に深く関わっていることが確認された。
　次に、Ｏ－グリコシド型糖鎖の構造に関する更なる情報を得るため、野生型Ｓ．ポンベおよびｏｍｈ１変異株～ｏｍｈ６変異株で得られた糖蛋白質（Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質）の糖鎖をヒドラジン分解し、ピリジルアミノ（ＰＡ）化してＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography)により分析を行った。
［例１３］
　ＹＥＳ培地によりｏｍｈ１変異株を３０℃で定常期まで培養し、そこから細胞表面のガラクトマンナンを抽出し、凍結乾燥状態のガラクトマンナンを得た（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５，４４０－４７０（１９９０）に記載の方法）。次に、凍結乾燥状態のガラクトマンナン２ｍｇを無水ヒドラジン０．２ｍｌとともに６０℃で６時間加熱し、ヒドラジンを蒸発させ、カチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ－ｘ２（Ｈ＋））に通してナトリウムイオンを除去した。次に、得られたサンプルをピリジルアミノ化剤（２０μｌ）とともに９０℃で６０分加熱し、還元剤（２０μｌ）を加えて８０℃で３５分加熱することにより、糖鎖の還元末端に２－アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤は、フェノール／クロロホルム（体積比は５０／５０）抽出により除去した。
　次に、得られたサンプルについて順相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）、昭和電工社製）を行った。糖鎖の分子サイズは、ＰＡ（ピリジルアミノ）ラベルした標準マーカーであるＰＡ化マンノース、ＰＡ化マルトース、ＰＡ化イソマルトオリゴ糖（タカラバイオ社製）により決定した。
［例１４～１９］
　野生型Ｓ．ポンベ（例１４）およびｏｍｈ２変異株～ｏｍｈ６変異株（例１５～１９）についても例１３と同様にして糖鎖の順相ＨＰＬＣ分析を行った。また、例１４では、検出された５つの主要なピークを回収し、ジャック豆αマンノシダーゼやコーヒー豆αガラクトシダーゼによる処理後、それらのピークがどのように変化するかを調べ、それら５つのピークにそれぞれ相当する糖鎖構造を確認した。
　例１３～１９の順相ＨＰＬＣ分析の結果を図６に示す。図６において、（ａ）は野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）はｏｍｈ１変異株、（ｃ）はｏｍｈ２変異株、（ｄ）はｏｍｈ３変異株、（ｅ）はｏｍｈ４変異株、（ｆ）はｏｍｈ５変異株、（ｇ）はｏｍｈ６変異株における順相ＨＰＬＣ分析の結果である。
　図６（ａ）に示すように、野生型Ｓ．ポンベでは、５つの主要なピーク（２Ｇ、２Ｍ、３Ｇ、３Ｍ、４ｉ）が確認された。ピーク２ＧはＧａｌ－Ｍａｎ－ＰＡ、ピーク２ＭはＭａｎ－Ｍａｎ－ＰＡ、ピーク３ＧはＧａｌ－Ｍａｎ－Ｍａｎ－ＰＡ、ピーク３ＭはＭａｎ－Ｍａｎ－Ｍａｎ－ＰＡであった。また、ピーク４ｉは４つの糖を有する糖鎖の混合物であった。
　ｏｍｈ２変異株～ｏｍｈ６変異株（図６（ｃ）～（ｇ））における糖鎖は、野生型Ｓ．ポンベのもの（図６（ａ））とほぼ同等であり、変化がなかった。
　これに対し、ｏｍｈ１変異株では３つ以上の糖を有する糖鎖の量が極端に少なくなっており、そのほとんどがピーク２Ｇとなっていた（図６（ｂ））。また、ｏｍｈ１変異株で得られたピーク２Ｇをジャック豆αマンノシダーゼおよびコーヒー豆αガラクトシダーゼにより処理したところ、αマンノシダーゼによる処理では分解されず、αガラクトシダーゼにより分解されて、全てＭａｎ－ＰＡ（図６（ａ）のピークＭ１に相当）となった。
　これらの結果から、ｏｍｈ１変異株では、１つ目のマンノースにα１，２結合で２つ目のマンノースが結合することが抑制されており、ｏｍｈ１遺伝子がＯ－グリコシド型糖鎖の伸長に重要な役割を果たしていることが示された。
［例２０］
　ｏｍｈ１遺伝子を、野生型Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩの切断部位を導入して、それら制限酵素により処理した後、ベクターｐＲＥＰ４１－ＧＦＰ（ｐＲＥＰ４１から得たベクターｐＴＮ１９７、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ，１２，３９５５－３９７２（２００１）に記載）の相当する部位に挿入してクローニングすることにより、Ｃ末端にＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）が結合したｏｍｈ１ｐを発現する遺伝子を有するベクターｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰを得た。また、Ｙｅａｓｔ，１８，７４５－７５７（２００１）に記載の方法により、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）が結合したＧｍｓ１ｐ（Ｇｍｓ１遺伝子によりコードされるＵＤＰガラクトース輸送体）を発現する遺伝子を有するベクターｐＡＵ－Ｇｍｓ１－ＲＦＰを得た。
　ｏｍｈ１変異株を、ｐＲＥＰ４１－ＧＦＰまたはｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰで形質転換したものを、ロイシンを含有しないＭＭ培地により３０℃で定常期まで培養した。これを例１３と同様の方法で順相ＨＰＬＣ分析した結果を図７（ａ）（ｐＲＥＰ４１－ＧＦＰ）および（ｂ）（ｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰ）に示す。
　また、ｏｍｈ１変異株を、ｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰまたはｐＡＵ－Ｇｍｓ１－ＲＦＰで形質転換したものを、ウラシルおよびロイシンを含有しないＭＭ培地により３０℃で培養した。その後、回収した細胞（ＯＤ６００＝０．５）を観察した。その結果を図８（ａ）～（ｃ）に示す。図８（ａ）はノマルスキー光学系を搭載した観察装置により観察したもの、図８（ｂ）は蛍光顕微鏡によりｐＲＥＰ４１－ＧＦＰを観察したもの、図８（ｃ）はｐＡＵ－Ｇｍｓ１－ＲＦＰを観察したものである。
　図７（ａ）に示すように、ｐＲＥＰ４１－ＧＦＰを含むｏｍｈ１変異株では、確認されたピークは例１３と同様であり、３つ以上の糖を有する糖鎖は、ほとんど合成されていなかった。一方、図７（ｂ）に示すように、ｐＲＥＰ４１－ｏｍｈ１－ＧＦＰを含むｏｍｈ１変異株では、例１４の野生型Ｓ．ポンベと同様の５つの主要なピークが確認された。これは、導入したベクターからｏｍｈ１ｐが発現することで、１つ目のマンノースに２つ目のマンノースが結合することができるようになったためである。
　また、図８（ａ）～（ｃ）に示すように、ｏｍｈ１ｐ－ＧＦＰ（ＧＦＰが結合したｏｍｈ１ｐ）は、Ｇｍｓ１ｐ－ＲＦＰ（ＲＦＰが結合したＧｍｓ１ｐ）と同じ場所に局在していた。Ｇｍｓ１ｐは、糖鎖の合成に必要なガラクトースを輸送する蛋白質であり、この結果からも、ｏｍｈ１遺伝子がＯ－グリコシド型糖鎖の合成に関与していることが確認された。
＜異種発現した出芽酵母キチナーゼの糖鎖構造解析（２）＞
［例２１］
　Ｓ．セレビジエのキチナーゼ（Ｃｔｓ１）遺伝子とＳ．ポンベのインベルターゼプロモーターとシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを有するベクターｐＦＭ１－１－ＳｃＣｔｓ１を使用して、Ｓ．ポンベの野生株を形質転換し、ロイシンを含有していないＭＭ培地（ただし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに８％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する。）１００ｍｌで定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地（ＭＭ培地を基礎とし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに０．０５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび３％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する。）の１００ｍｌに移して、３０℃で１２時間震盪培養を行った。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにてキチナーゼの精製度を確認した。培地からのキチナーゼの回収は、以下のようにして行った。培地にキチン（４００ｍｇ、和光純薬社製）を加えた後、４℃で１２時間撹拌し、遠心してペレットとした。ペレットをナトリウム緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）で３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液（６３ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＢＰＢ、１ｍｌ）で５分間ボイルすることによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色はＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ－２５０により行った。
［例２２］
　ｏｍｈ１変異株について、例２１と同様の方法でキチナーゼの解析を行った。
　例２１および２２の結果を図９に示す。レーン１は野生株Ｓ．ポンベ、レーン２はｏｍｈ１変異株の結果を示す。
　図９に示すように、レーン１およびレーン２において単一バンドが検出されており、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株から回収したキチナーゼは、ともに単一タンパク質として精製されたことが確認された。また、例６（図５、レーン２）と同様に、ｏｍｈ１変異株では分子量の減少が見られた。
　次に、Ｏ－グリコシド型糖鎖の構造に関する更なる情報を得るため、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株から精製したキチナーゼ（Ｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質）の糖鎖をヒドラジン分解により遊離し、還元末端をピリジルアミノ（ＰＡ）化してＨＰＬＣにより分析を行った。
［例２３］
　例２１においてキチンから抽出したキチナーゼからＳＤＳを除去するために、ＭｉｌｌｉＱ水（超純水）に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。Ｓ．ポンベ野生株から１ｍｇの凍結乾燥粉末を得た。
　次に、凍結乾燥粉末のキチナーゼ０．３ｍｇをヒドラクラブＣ－２０６（Ｊオイルミルズ社製）を用いてヒドラジン分解を行った。次に、得られた遊離糖鎖サンプルをピリジルアミノ化剤（２０μｌ）とともに９０℃で６０分加熱し、次いで還元剤（２０μｌ）を加えて、８０℃で３５分加熱することにより、糖鎖の還元末端に２－アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤はフェノール／クロロホルム（体積比は５０／５０）抽出により除去した。
　次に、得られたサンプルについて、順相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ａｍｉｄｅ－８０　ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ）、東ソー社製）を行った。糖鎖の分子サイズは、ＰＡラベルした標準マーカーであるＰＡ化マンノース、ＰＡ化マルトース、ＰＡ化イソマルトオリゴ糖（タカラバイオ社製）により決定した。
［例２４］
　例２２においてキチンから抽出したキチナーゼからＳＤＳを除去するために、ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。ｏｍｈ１変異株から０．５ｍｇの凍結乾燥粉末を得た。その後、例２３と同様にして、順相ＨＰＬＣ分析を行った。
　例２３および２４の順相ＨＰＬＣ分析の結果を図１０に示す。図１０において、（ａ）はＳ．ポンベ野生株、（ｂ）はｏｍｈ１変異株の結果を示す。
　図１０（ａ）に示すように、Ｓ．ポンベ野生株では、主にジサッカライド（図１０の（Ｈｅｘ）２－ＰＡ）、テトラサッカライド（図１０の（Ｈｅｘ）４－ＰＡ）に相当するピークが確認された。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、ｏｍｈ１変異株では、ほぼジサッカライドに相当するピークのみが確認された。
［例２５］
　Ｓ．ポンベ野生株（例２３）およびｏｍｈ１変異株（例２４）で確認されたジサッカライドのピークの構造を詳細に分析するために、ジサッカライドのピークを分取精製し、逆相ＨＰＬＣ分析（カラム：ＯＤＳ－８０Ｔｓ　ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、東ソー社製）を行った。また、分取精製したジサッカライドに対してα－ガラクトシダーゼ（シグマ社製Ｇ８５０７、コーヒー豆由来）による消化、α－マンノシダーゼ（シグマ社製Ｍ７２５７、ジャック豆由来）による消化を行った後に、同様に逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
　逆相ＨＰＬＣ分析の結果を図１１に示す。図１１の（ａ）と（ｅ）は標準糖鎖であるＭａｎ－ＰＡとＭａｎ－Ｍａｎ－ＰＡ（Ｍａｎα１－２Ｍａｎ－ＰＡ）の保持時間を示す。また、図１１（ｂ）～（ｄ）はＳ．ポンベ野生株の分析結果、図１１（ｆ）～（ｈ）はｏｍｈ１変異株の分析結果を示しており、図１１の（ｂ）および（ｆ）が分取精製後、（ｃ）および（ｇ）がα－ガラクトシダーゼ消化後、（ｄ）および（ｆ）がα－マンノシダーゼ消化後の分析結果である。
　図１１（ｂ）、および（ｆ）に示すように、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株のジサッカライドは、主に単一ピークからなることが確認され、Ｍａｎα１－２Ｍａｎ－ＰＡの標準糖鎖の保持時間とは異なることが確認された。また、両株のジサッカライドサンプルは、α－マンノシダーゼによる処理では分解されず（図１１の（ｄ）と（ｈ））、α－ガラクトシダーゼにより分解されて全てＭａｎ－ＰＡとなった（図１１の（ｃ）と（ｇ））。
　これらの結果から、Ｓ．ポンベ野生株で発現させたキチナーゼのジサッカライドが主にＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌからなること、ｏｍｈ１変異株で発現させたキチナーゼの全ての糖鎖がＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌからなることが示され、異種タンパク質発現時にも、その糖鎖構造が細胞表面のガラクトマンナンと同様の糖鎖構造からなることが示された。
　本発明の形質転換体は、結合するＯ－グリコシド型糖鎖の構造を制御した異種蛋白質を製造することができる。そのため、該形質転換体を用いたＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、医療分野等に好適に使用できる。

　なお、２００８年１０月１日に出願された日本特許出願２００８－２５６３５４号、及び２００９年５月１５日に出願された日本特許出願２００９－１１９２８０号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (10)

  1. 　ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）からなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための、宿主。
  2. 　ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含む形質転換体。
  3. 　さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含む、請求項２に記載の形質転換体。
  4. 　前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、Ｏ－グリコシド型糖鎖を有している蛋白質である、請求項２または３に記載の形質転換体。
  5. 　ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を前記宿主に組み込むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
  6. 　前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有する、請求項５に記載の形質転換体の製造方法。
  7. 　前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がＯ－グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質である、請求項５または６に記載の形質転換体の製造方法。
  8. 　請求項２～４のいずれかに記載の形質転換体を培養し、産生されたＯ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造を有するＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することを特徴とするＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
  9. 　産生されるＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質の糖鎖が、当該異種蛋白質に対応する野生型異種蛋白質の糖鎖の有無や糖鎖構造にかかわりなく、Ｏ－Ｍａｎ－Ｇａｌなるジサッカライド構造を有する、請求項８に記載のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
  10. 　形質転換体を培養した培養液からＯ－グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する、請求項８または９に記載のＯ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
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Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0515380A (ja) 1990-09-14 1993-01-26 Asahi Glass Co Ltd ベクター
JPH07163373A (ja) 1993-10-05 1995-06-27 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
WO1996023890A1 (fr) 1995-02-03 1996-08-08 Asahi Glass Company Ltd. Gene de signal de secretion et vecteur d'expression comprenant ce signal
JPH10234375A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター
JPH11192094A (ja) 1997-10-31 1999-07-21 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらの利用
JP2000262284A (ja) 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法
JP2003310269A (ja) 2002-04-25 2003-11-05 Asahi Glass Co Ltd マツエバクターキトサナーゼの製造方法
JP2004501642A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 グライコフィ，　インコーポレイテッド 改変された糖タンパク質を生成するための方法
JP2005514021A (ja) 2001-12-27 2005-05-19 グライコフィ， インコーポレイテッド 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法
JP2005198612A (ja) 2004-01-19 2005-07-28 Asahi Glass Co Ltd 酵母の形質転換方法
WO2007026617A1 (ja) 2005-08-29 2007-03-08 Asahi Glass Company, Limited 発現ベクター、それを導入した形質転換体、および異種タンパク質の製造方法
WO2007063919A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Asahi Glass Company, Limited 染色体改変方法
JP2008256354A (ja) 1997-08-01 2008-10-23 Eurokera Snc ガラスセラミックプレート及びその製造方法
JP2009119280A (ja) 1999-06-25 2009-06-04 Oratec Interventions Inc 組織を電気外科切除するための電極

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1592786A (zh) * 2000-12-05 2005-03-09 宾夕法尼亚州立研究基金会 在酵母菌中高效生产异源性蛋白质的方法和组合物
ATE420198T1 (de) * 2002-04-26 2009-01-15 Kirin Pharma Kk Methylotrophe hefe,die eine zuckerkette eines säugers herstellt
MX2011001706A (es) * 2008-08-12 2011-03-24 Glycofi Inc Vectores mejorados y cepas de levadura para produccion de proteina: sobreexpresion de ca2+ atpasa.

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0515380A (ja) 1990-09-14 1993-01-26 Asahi Glass Co Ltd ベクター
JPH07163373A (ja) 1993-10-05 1995-06-27 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
WO1996023890A1 (fr) 1995-02-03 1996-08-08 Asahi Glass Company Ltd. Gene de signal de secretion et vecteur d'expression comprenant ce signal
JPH10234375A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター
JP2008256354A (ja) 1997-08-01 2008-10-23 Eurokera Snc ガラスセラミックプレート及びその製造方法
JPH11192094A (ja) 1997-10-31 1999-07-21 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらの利用
JP2000262284A (ja) 1999-03-18 2000-09-26 Asahi Glass Co Ltd シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法
JP2009119280A (ja) 1999-06-25 2009-06-04 Oratec Interventions Inc 組織を電気外科切除するための電極
JP2004501642A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 グライコフィ，　インコーポレイテッド 改変された糖タンパク質を生成するための方法
JP2005514021A (ja) 2001-12-27 2005-05-19 グライコフィ， インコーポレイテッド 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法
JP2003310269A (ja) 2002-04-25 2003-11-05 Asahi Glass Co Ltd マツエバクターキトサナーゼの製造方法
JP2005198612A (ja) 2004-01-19 2005-07-28 Asahi Glass Co Ltd 酵母の形質転換方法
WO2007026617A1 (ja) 2005-08-29 2007-03-08 Asahi Glass Company, Limited 発現ベクター、それを導入した形質転換体、および異種タンパク質の製造方法
WO2007063919A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Asahi Glass Company, Limited 染色体改変方法

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Koubo Bunshi Idengaku Jikken-Hou", 1996, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETIES PRESS
BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM, vol. 68, 2004, pages 545 - 550
DATABASE DDBJ/EMBL/GENBANK [online] 9 May 2008 (2008-05-09), WOOD,V. ET AL., XP008146781, Database accession no. NM_001022088 *
GEMMILL, TR ET AL.: "Schizosaccharomyces pombe produces novel GalO-2Man1-3 O-linked oligosaccharides.", GLYCOBIOLOGY, vol. 9, no. 5, 1999, pages 507 - 515, XP008146782 *
GIRRBACH V, STRAHL S, J BIOL CHEM, vol. 278, 2003, pages 12554 - 12562
IKEDA, Y. ET AL.: "Identification and characterization of a gene required for alphal,2-mannose extension in the O-linked glycan synthesis pathway in Schizosaccharomyces pombe.", FEMS YEAST RES, vol. 9, no. 1, 9 February 2009 (2009-02-09), pages 115 - 125, XP008146783 *
LUSSIER M, SDICU M, BUSSEY H, BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1426, 1999, pages 323 - 334
LUSSIER, M. ET AL.: "Functional characterization of the YUR1, KTR1, and KTR2 genes as members of the yeast KRE2/MNT1 mannosyltransferase gene family.", J BIOL CHEM, vol. 271, no. 18, 1996, pages 11001 - 11008, XP002109538 *
LUSSIER, M. ET AL.: "The KTR and MNN1 mannosyltransferase families of Saccharomyces cerevisiae.", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1426, no. 2, 1999, pages 323 - 334, XP004276260 *
METHODS ENZYMO, vol. 194, 1991, pages 795 - 823
METHODS ENZYMOL, vol. 18, 1990, pages 440 - 470
MOL BIOL CELL, vol. 12, 2001, pages 3955 - 3972
N. TANAKA ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 330, 2005, pages 813 - 820
NUCREIC ACIDS RES, vol. 34, 2006, pages E11
PCR METHODS APPL., vol. 2, 1992, pages 28 - 33
STRAHL-BOLSINGER S, GENTZSCH M, TANNER W, BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1426, 1999, pages 297 - 307
T. MORITA, K. TAKEGAWA, YEAST, vol. 21, 2004, pages 613 - 617
YEAST, vol. 18, 2001, pages 745 - 757
YEAST, vol. 18, 2001, pages 903 - 904

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