KR102142423B1 - 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법 - Google Patents

신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102142423B1
KR102142423B1 KR1020190000368A KR20190000368A KR102142423B1 KR 102142423 B1 KR102142423 B1 KR 102142423B1 KR 1020190000368 A KR1020190000368 A KR 1020190000368A KR 20190000368 A KR20190000368 A KR 20190000368A KR 102142423 B1 KR102142423 B1 KR 102142423B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell wall
strain
gene
och1
chs3
Prior art date
Application number
KR1020190000368A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200084220A (ko
Inventor
강현아
루반트린
문혜연
유수진
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Priority to KR1020190000368A priority Critical patent/KR102142423B1/ko
Publication of KR20200084220A publication Critical patent/KR20200084220A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102142423B1 publication Critical patent/KR102142423B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01016—Chitin synthase (2.4.1.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01232—Initiation-specific alpha-1,6-mannosyltransferase (2.4.1.232)

Abstract

본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 세포벽 생합성에 관여하는 OCH1과 CHS3 유전자의 발현 조절에 근거한 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주 제작 및 이를 이용한 글루타치온 세포외 분비 생산 방법에 관한 것으로서, OCH1은 효모 세포벽 당단백질에 부착된 N-당사슬의 바깥 사슬 생합성 개시에 관여하는 효소인 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자이며 CHS3는 세포벽 키틴질의 대부분을 합성하는 데 관여하는 키틴생합성 효소 III를 암호화하는 유전자이다. 세포의 성장을 저해하는 유전자 파쇄 대신 메티오닌에 의해 활성이 억제되는 MET3 프로모터와 같이 특정 조건에서 활성이 억제되는 프로모터를 이용하여 OCH1과 CHS3 유전자 발현이 억제되는 균주를 개발하였고, 이 균주들은 메티오닌 유무에 따라 엄격하게 조절되는 조건적 세포벽 분해 표현형을 보였다. 본 발명자들은 상기 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주들이 현저하게 향상된 글루타치온 세포외 생산 효율을 달성함을 관찰함으로써, 산업적 경제성이 높은 글루타치온 세포외 분비생산 균주로서의 높은 활용 가능성을 제시하게 되었다.

Description

신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법{Novel cell-wall lysis mutant strains of yeast and method for producing glutathione using the same}
본 발명은 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 세포벽 생합성에 관여하는 OCH1과 CHS3 유전자 발현 조절에 근거한 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주 제작 및 이를 이용한 글루타치온 세포외 분비 생산 방법에 관한 것이다.
전통 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 산업적 잠재력을 가진 재조합 단백질과 대사물질의 생산을 위한 숙주로서 널리 쓰여져 왔다. 효모의 세포벽은 출아(budding), 교배(mating), 응집(aggregation) 및 포자형성(sporulation)과 같은 여러 과정에 관여하며 세포내 삼투 조건의 안정화, 스트레스에 대한 보호 및 세포 형태의 유지에 주요 기능을 수행한다. 하지만, 두껍고 단단한 효모의 세포벽은 분리 및 정제와 같은 생성물의 효율적인 회수 과정을 가로막는 주요 장애물이다. 세포내 생성물의 회수를 위해서는, 물리적, 화학적, 또는 효소적 파쇄 방법을 통한 세포벽 파쇄가 필요한 데 이러한 방법들은 생성물의 손실과 생산 단가의 증가 등의 문제를 발생시킨다. 일부 재조합 단백질들의 경우는 숙주 세포로부터 방출시키기 위해 단백질 분비 경로를 이용하는 것이 세포벽 파쇄가 필요없는 대안적인 접근법이다. 그러나 단백질 분비 생산의 경우도 낮은 분비 효율, 비정상적인 번역 후 수정, 또는 세포벽 내 체류 등과 같은 몇 가지 한계점을 마주한다. 특히, 바이러스 유사입자(virus-like particles, VLPs)와 고도의 만노실화 단백질과 같은 크고 복잡한 재조합 단백질들은 분비 경로를 통해 효과적으로 배출되기 어렵다. 따라서 효모로부터 세포내 내용물을 효율적으로 방출시키고 분비 효율을 강화시키기 위해 효모 세포벽을 파쇄하는 값싸고 효과적인 방법의 개발이 요구되고 있다.
글루타치온(glutathione, GSH)은 세포 내에서 가장 일반적으로 존재하는 유기 황화합물로서 대부분의 동물, 식물, 미생물 세포 내에 높은 농도로(0.2-10 mM) 존재한다. 글리신(glycine), 글루탐산(glutamate), 시스테인(cysteine) 세 아미노산들이 결합한 트리펩타이드(tripeptide) 형태이며 세포 내에서는 환원형 글루타치온(GSH)과 산화형 글루타치온(GSSG) 두 가지 형태로 존재한다. 상대적으로 높은 비율로 존재하는 환원형 글루타치온(GSH)은 인체의 간과 피부 세포에 주로 분포하며 멜라닌 색소 생성을 억제하는 동시에 활성산소를 분해, 제거하는 항산화 기능에도 중요한 역할을 한다. 또한, 면역 시스템에도 영향을 끼쳐 면역력 증진에 기여할 뿐만 아니라 독성물질과 같은 외인성 화합물의 제거에도 관여한다. 이러한 기능과 효과들 덕분에 다양한 방면으로 글루타치온의 상업화가 이루어지고 있다. 체내에서 기본적으로 생성될지라도 노화가 진행될수록 글루타치온 생성량은 점점 감소하는 데, 항산화, 해독작용에 중요한 역할을 하는 글루타치온 생성량의 감소는 노화의 주범인 활성산소의 축적을 야기하며 노화를 더욱 촉진시킨다. 따라서 외부에서 글루타치온 공급의 필요성이 대두되고 있으며, 이러한 필요성에 힘입어 제약, 식품, 화장품 산업 등 다양한 분야에서 글루타치온이 활용되고 있다. 글루타치온은 주로 미백크림, 주사, 영양제 등의 형태로 이용되고 있으며, 글루타치온을 생산하는 효모를 직접 섭취하는 형태의 글루타치온 포함 식품도 출시된 만큼 글루타치온 시장은 그 기능과 필요성으로 인해 성장 가능성을 가지고 있다.
이전까지 생물체로부터의 추출이나 화학적 합성으로 글루타치온을 생성했지만 현재는 글루타치온 생합성 경로에 관여하는 효소 반응 또는 미생물에 의한 글루타치온 대량 생산이 이루어지고 있다. 글루타치온 생산을 위한 미생물로 세포 내 높은 글루타치온을 함유하며 식품 생산에 안전한 미생물로 인식되는 효모가 널리 이용되어져 왔는데, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 칸디다 유틸리스(Candida utilis)가 대표적이다. 이 종들의 야생형 균주에서, 글루타치온 농도는 건조 중량의 0.1-1% 정도로 이미 상당히 높고 다양하다. 또한, 값싼 배양액에서 고밀도의 빠른 성장이 가능한 효모를 이용한 발효는 경제성이 높으며, 세균과는 달리 최종 산물에 내독소의 위험이 없다는 장점이 있다.
글루타치온 생합성은 세포 내에서 두 단계의 연속적인 ATP-소모 반응에 의해 이루어진다. 즉, GSH1 유전자에 의해 암호화되는 γ-glutamylcysteine (γ-GC) synthetase (γ-GCS)에 의해 글루탐산과 시스테인으로부터 γ-GC가 형성되고, GSH2 유전자로부터 암호화되는 glutathione synthase (GS)가 γ-GC와 글리신으로부터 글루타치온을 생성한다. γ-GCS의 활성은 최종 생성물인 글루타치온의 양이 많아지게 되면 글루타치온에 의한 되먹임 억제(feedback inhibition)를 받기 때문에 글루타치온의 최종 생성량은 일정하게 유지된다. 세포 내에서 축적된 글루타치온에 의한 되먹임 억제를 해소하기 위한 전략으로 침투화된 세포(permeated cells)를 이용한 효소적 글루타치온 생산법이 개발되었다. 그러나, 효소적 글루타치온 생산법은 ATP와 기질 아미노산들의 외부 공급을 필요로 하기 때문에 전반적인 생산 단가를 높이게 된다. 따라서, 세포외 글루타치온 발효 공정이 더 높은 글루타치온 수득률을 달성하기 위한 매력적인 방법으로 제시되고 있다. 글루타치온을 세포 밖으로 배출하는 생산 방식은 기질 아미노산에 대한 요구와 공간적 제한이 없으므로 일반적인 세포내 발효 공정법과 효소적 방법의 장점을 모두 갖게 된다. 더 나아가 세포내 축적된 글루타치온을 방출함으로써 되먹임 억제의 영향을 피해 글루타치온 총 생산량을 늘릴 수 있으며, 세포로부터 글루타치온 추출 과정을 간소화할 수 있기 때문에 상업적으로도 큰 장점이 있다.
미국등록특허 US 8,574,871 B2 (2013.11.05 등록)
본 발명의 목적은 메티오닌 첨가에 따라 활성이 억제되는 프로모터를 이용하여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 세포벽 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 상기 균주를 이용한 글루타치온 세포외 분비 생산 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를 발현 조절이 가능한 프로모터 유전자로 치환시킨 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터 유전자로 치환시키는 단계를 포함하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주를 메티오닌(methionine)이 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 글루타치온(glutathione) 생산방법을 제공한다.
본 발명은 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법에 관한 것으로서, 본 발명에서는 특정 조건에서 활성이 억제되는 프로모터를 이용하여 세포벽 생합성에 관여하는 OCH1과 CHS3 유전자 발현이 억제됨으로써 특정 조건에서 엄격하게 조절되는 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주들을 제작하였다. 상기 세포벽 변이 효모 균주들은 현저하게 향상된 글루타치온 세포외 생산 효율 효과를 보여 산업적 경제성이 높은 글루타치온 세포외 분비생산에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 Saccharomyces cerevisiae에서 OCH1 및 CHS3 발현을 조절을 통한 조건부 세포벽 돌연변이의 제작 과정을 나타낸다. (a) 효모 세포벽의 구조 모식도 및 OCH1 및 CHS3 작용 위치 모식도. (b) OCH1 및 CHS3 프로모터를 MET3 프로모터로 대체하기 위한 카세트 제작 모식도 및 메티오닌에 의해 유전자 발현 조절 모식도.
도 2는 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주 제작 개략도를 나타낸다. (a) 균주 제작에 사용된 벡터 모식도. (b) MET3 프로모터에 의해 OCH1 및 CHS3 발현이 조절되는 단일 및 이중 돌연변이 효모 균주에 대한 도식.
도 3은 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주의 성장 및 삼투 분해 분석 결과를 나타낸다. (a) 2 mM 메티오닌을 첨가 또는 비첨가 SD 배지에서 배양된 효모 균주들의 성장 곡선. (b) 효모 균주들의 삼투 용해 효율 비교 분석. 용해 효율 단위는 삼투성 용해 전 A600 단위의 세포 당 삼투 충격 후 상층액의 A260 단위 값이다.
도 4는 다양한 세포벽 약화 조건에서 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주의 성장 분석 결과를 나타낸다. (a) 메티오닌 유무에 따른 30 μg/ml hygromycin B (HgB), 7 mg/ml Calcofluor White (CFW)가 첨가된 배지 및 다양한 온도에서의 성장. (b) 1 M Sorbitol을 보충한 배지에서의 회복 성장.
도 5는 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주들의 글루타치온 생산성 비교 분석 결과를 나타냔다. (a) 세포내 및 (b) 세포외 글루타치온 생산량 분석.
이에, 본 발명자들은 효모 사카로마이세스 세레비지애 세포벽의 N-당사슬의 바깥 사슬 생합성 개시에 관여하는 단백질을 암호화하는 OCH1 유전자와 세포벽 키틴질(chitin)의 대부분을 합성하는데 관여하는 CHS3 유전자의 발현을 조절함으로써 일련의 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주를 개발하였고, 이 균주들을 이용하여 글루타치온 세포외 생산 가능성을 조사하였다. 본 발명에서 개발된 OCH1과 CHS3 유전자 발현 조절에 근거한 세포벽 분해 변이 균주들은 엄격하게 조절되는 조건적 세포벽 분해 표현형을 지니며 현저하게 향상된 글루타치온 세포외 생산 효율을 보여 주어, 경제성이 높은 글루타치온 세포외 분비생산 균주로서의 높은 활용 가능성을 제시하고 있다.
본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를 발현 조절이 가능한 프로모터 유전자로 치환시킨 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제공한다.
바람직하게는, 상기 발현 조절이 가능한 프로모터 유전자는 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 세포벽 생합성 유전자는 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제(α-1,6-mannosyltransferase; OCH1) 유전자 및 키틴질 생합성 효소 III(chitin synthase III; CHS3) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서 기재한 OCH1 유전자는 NCBI accession no. 852485이고, CHS3 유전자는 NCBI accession no. 852311이다.
바람직하게는, 상기 MET3 프로모터 유전자는 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 OCH1 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 본 발명의 실시예에 기재된 P MET3 -OCH1 균주로서, 수탁번호 KCTC 13710BP로 기탁된 균주일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 CHS3 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 본 발명의 실시예에 기재된 P MET3 -CHS3 균주로서, 수탁번호 KCTC 13709BP로 기탁된 균주일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 OCH1 유전자의 프로모터 및 CHS3 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 본 발명의 실시예에 기재된 P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주로서, 수탁번호 KCTC 13711BP로 기탁된 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터 유전자로 치환시키는 단계를 포함하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포벽 생합성 유전자는 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제(α-1,6-mannosyltransferase; OCH1) 유전자 및 키틴질 생합성 효소 III(chitin synthase III; CHS3) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 MET3 프로모터 유전자는 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 수탁번호 KCTC 13709BP, 수탁번호 KCTC 13710BP 또는 수탁번호 KCTC 13711BP로 기탁된 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주를 메티오닌(methionine)이 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 글루타치온(glutathione) 생산방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 글루타치온을 세포 외(extracellular) 분비할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 신규한 세포벽 분해 변이 효모 균주 제작
효모 세포벽은 세포벽 만노단백질(Cell wall mannoprotein), β-1,3- 및 β-1,6-글루칸(glucans), 키틴(chitin)으로 구성된다. 대부분의 효모 세포벽 만노단백질은 만노즈 중합체와 공유 결합되어 세포벽 안정화(cell wall integrity)에 중요한 역할을 하며 세포벽 다공성을 조절한다. 효모의 세포벽 만노단백질들은 대체로 N-/O-당사슬이 부착되어 있는데, 특히 S. cerevisiae N-당사슬은 매우 긴 당사슬 외쇄(outer chain)를 지니고 있는데, S. cerevisiae OCH1 유전자 산물은 골지(Golgi)에 위치한 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제로써 단백질에 부착된 N-당사슬에 첫번째 α(1,6)-만노즈를 결합시켜 당사슬 외쇄 합성을 시작하는데 관여한다. β-글루칸층은 대부분 β-1,3-글루칸 (80-90%)으로 구성되어 있으며 β-1,6-글루칸 (10-18%)을 소량으로 함유하고 있다. β-1,3-글루칸은 외면에 위치하고, β-1,6-글루칸은 내벽과 외벽의 성분을 연결하거나 글라이코실 포스파티딜 이노시톨(GPI)-만노단백질을 연결한다. 100~190개의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 β-1,4로 결합된 폴리머인 키틴(chitin)은 외벽의 미량 성분 존재하지만 글루칸 고분자와 결합하여 세포벽의 기계적 강도와 탄성에 큰 역할을 한다. S. cerevisiae CHS3 유전자 산물인 키틴질 생합성 효소 III는 대부분의 세포벽 키틴 및 chitin ring 생합성에 중요한 역할을 담당하고 있다(도 1a).
본 발명자들은 CHS3 , OCH1 발현이 메티오닌 존재 여부에 따라 조절가능한 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주 제작을 위해 CHS3와 OCH1 유전자 각각의 프로모터(promoter) 부분을 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터로 치환하였다(도 1b). OCH1 프로모터 치환을 위해서 OCH1 promoter -242 bp 및 -1bp 지점에 해당되는 염기서열 정보를 해당되는 프라이머 세트 5'-OCH1-SacI-fw와 5'-OCH1-NotI-rv(표 1)를 이용하여 PCR로 증폭한 OCH1 5’ UTR DNA 절편을 SacI/NotI을 처리하여 MET3 promoter를 지닌 pBluSKP-pScMET3 벡터에 삽입하고, OCH1 ATG를 포함하는 N-OCH1-EcoRI-fw와 ORF 297bp 지점의 N-OCH1-SalI-rv 프라이머(표 1)를 이용하여 PCR로 증폭한 OCH1 유전자의 N 절편 부분을 EcoRI/SalI 처리한 한 후 삽입하여 pB-P MET3 -OCH1(표 2)을 제작하였다. 이후 pop-out 가능한 URA3 (Kang et al., 2000)는 pTcUR3(표 2)에서 ScURA3pp-NotI-fw, ScURA3pp-NotI-rv 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 후 NotI 처리 후 pB-P MET3 -OCH1에 삽입함으로써 pB-P MET3 -OCH1-URA3(표 2)를 제작하였다(도 2a). 제작된 pB-P MET3 -OCH1-URA3를 SacI/SalI으로 절단하여 준비된 카세트를 S. cerevisiae BY4742 균주에 LiAC/PEG 방법으로 형질전환한 후 Ura+을 SC-URA 배지에서 선별하여 P MET3 -OCH1 균주를 제작하였다(도 2b). CHS3 조건적 발현 벡터 제작 역시 동일한 방법으로 수행하였다. 두 종류의 프라이머 세트 5'-CHS3-SacI-fw/5'-CHS3-NotI-rv와 N-CHS3-EcoI-fw/N-CHS3-SalI-rv(표 1)를 이용하여 CHS3 5’ UTR 절편과 N 절편 부분을 PCR로 증폭하여 pBluSKP-pScMET3 벡터에 삽입함으로써 pB-P MET3 -CHS3(표 2)를 제작하고 pop-out 가능한 URA3 (Kang et al., 2000)는 pTcUR3(표 2)에서 ScURA3pp-NotI-fw/ScURA3pp-NotI-rv 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고 NotI 위치로 삽입함으로써 pB-P MET3 -CHS3-URA3(표 2)를 제작하였다(도 2a). 제작된 pB-P MET3 -CHS3-URA3를 SacI/SalI 처리하여 준비된 카세트를 S. cerevisiae BY4742, P MET3 -OCH1, och1Δ 균주에 각각 형질전환한 후 SC-URA 배지에서 선별하여 P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3, och1Δ/P MET3 -CHS3(표 3) 균주를 제작하였다(도 2b). 각각 제작된 균주들은 5’-FOA 배지에서 배양함으로써 URA3 유전자를 pop-out 하였다(표 3).
Primer Sequence(5’-3’) Discription
5'-OCH1-SacI-fw CGAGCTCGAGCTGAATAATACTTCTTCAACC Amplification of 5’OCH1 flanking fragment
5'-OCH1-NotI-rv ATAAGAATGCGGCCGCGTCCAAAAAGGCGCGTTTAG Amplification of 5’OCH1 flanking fragment
N-OCH1-EcoRI-fw GGAATTCTCTAGGAAGTTGTCCCACCT Amplification of N-OCH1 flanking fragment
N-OCH1-SalI-rv ACGCGTCGACCACCCTTTGCGGGATGGG Amplification of N-OCH1 flanking fragment
5'-CHS3-SacI-fw GACGAGCTCCTGTGTCACAAAGCTCTTGTATTG Amplification of 5’CHS3 flanking fragment
5'-CHS3-NotI-rv GCAGCGGCCGCATTGAATATGCTTCAAGAAATATCC Amplification of 5’CHS3 flanking fragment
N-CHS3-EcoI-fw GCAGAATTCACCGGCTTGAATGGAGATG Amplification of N-CHS3 flanking fragment
N-CHS3-SalI-rv GCAGTCGACGCTTCTCACTAGGCCTTTGG Amplification of N-CHS3 flanking fragment
ScURA3pp-NotI-fw ATTTGCGGCCGCGATCCACAGGACGGGTGTG Amplification of ScURA3
ScURA3pp-NotI-rv ATTTGCGGCCGCATCGTCCATTCCGACAGC Amplification of ScURA3
* 제한효소 인식사이트는 밑줄로 표시하였다.
Plasmid Description Reference
pBluSKP-pScMET3 pBluSKP containing the ScMET3 promoter (Yoo et al. 2015)
pTcUR3 pBluSKP containing the Tc:ScURA3:Tc blaster cassette (Kang et al. 2000)
pB-P MET3 -OCH1 pBluSKP containing the ScMET3 promoter and the 5’UTR/5’ORF OCH1 본 발명
pB-P MET3 -CHS3 pBluSKP containing the ScMET3 promoter and the 5’UTR/5’ORF CHS3 본 발명
pB-P MET3 -OCH1-URA3 pBluSKP-PMET3-OCH1-Tc:ScURA3:Tc 본 발명
pB-P MET3 -CHS3-URA3 pBluSKP-PMET3-CHS3-Tc:ScURA3:Tc 본 발명
S. cerevisiae strain Genotype Reference
BY4742 MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Open Biosystems
BY4742 och1 △ MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 och1 △ Open Biosystems
P MET3 - OCH1 BY4742 expressing OCH1 under the control of P MET3 본 발명
P MET3 - CHS3 BY4742 expressing CHS3 under the control of P MET3 본 발명
P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 BY4742 expressing CHS3 and OCH1 under the control of P MET3 본 발명
och1 △/P MET3 - CHS3 BY4742 och1 △ expressing CHS3 under the control of P MET3 본 발명
< 실시예 2> 신규 세포벽 분해 변이 효모 생리적 특징
실시예 1에서 제작된 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3, och1Δ, och1Δ/P MET3 -CHS3 균주들의 메티오닌 첨가 유무에 따른 성장 패턴을 S. cerevisiae BY4742 야생형 균주와 비교 분석하였다. 메티오닌이 없는 최소 배지(SD)에서 배양시 제작된 재조합 균주들은 야생형 균주와 상당히 유사한 성장을 보이며 크게 성장이 저해되지 않았지만, 2 mM 메티오닌이 첨가된 배지(SD+Met)에서 배양하면 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주들의 경우 성장이 뚜렷하게 감소되었다(도 3a). 또한, 삼투압 충격(osmotic shock)에 의한 세포 분해(cell lysis) 정도를 확인하기 위하여 대수 증식기(log-growth phase)까지 배양한 균주를 1/10 부피의 증류수에 1 시간동안 배양 후 TOMY mixer 24 로 10분 혼합한 후 원심분리하여 샘플을 얻은 후 스펙트럼을 이용하여 OD260 값을 얻었다. 스펙트럼 측정 결과 메티오닌 첨가 배지에서 배양된 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주들의 세포 분해가 현저히 일어나 A260/A600 수치가 증가됨이 관찰되었고, 이러한 결과는 배양 시간이 증가할수록 더 뚜렷이 나타났다. 한편, OCH1 유전자가 결손되어 있는 och1Δ, och1Δ/P MET3 -CHS3 균주들은 메티오닌이 없는 배양 조건에서 어느 정도 세포 분해가 일어나고 있음이 관찰되었다(도 3b). 따라서 본 발명에서 제작된 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주는 메티오닌 존재 여부에 따라 OCH1, CHS3의 발현이 억제되어 세포 분해가 진행되는 조건적 세포 분해 변이 효모임이 확인되었다. 또한 세포벽 약화 물질인 hygromycin B, CFW (Calcofluor White)를 처리한 YPD 배지와 25℃ (저온), 37℃ (고온) 배양 조건에서의 균주 배양을 수행한 결과 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주에서 2 mM 메티오닌을 첨가했을 때 성장이 크게 저해됨이 확인하였다(도 4a). 이와 같은 성장 저해는 1M 소비톨(sorbitol)을 첨가하여 삼투압 충격을 감소시켰을 때 거의 회복되는 것을 확인되었다(도 4b). 이러한 결과들은 본 발명에서 제작된 P MET3 -OCH1, P MET3 -CHS3, P MET3 -OCH1/P MET3 -CHS3 균주들은 세포벽 안정성에 결함을 가진 조건적 세포벽 분해 변이 효모임을 입증해 주고 있다.
< 실시예 3> 세포벽 분해 효모를 이용한 글루타치온 분비생산
본 발명에서 개발한 조건적 세포벽 분해 변이 균주들의 유용 대사물질 분비생산 숙주로서의 가능성을 평가하기 위해 글루타치온 세포외 생산능을 분석하였다. 실험 방법은 다음과 같다. 탄소원으로 포도당이 첨가된 50 ml의 최소 배지(SD)에 30 ℃에서 효모 세포를 배양하였다. 세포 배양액을 5,000 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 OD600 100의 세포 펠릿과 배양 상등액으로 분리하였다. 환원형과 산화형을 합친 총 글루타치온의 양을 Ellman 시약(5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic) acid), 글루타치온 환원효소, NADPH가 포함된 총 100 μl의 반응액에서 비색법(colorimetric method)에 근거한 표준 재순환 분석법(the standard recycling assay)을 이용하여 측정하였다. 세포 용해물은 세포 펠릿으로부터 글라스 비즈(glass beads) 파쇄 또는 삼투 용해(osmotic lysis)하여 얻었다. 배양 상등액은 5% TCA (2,2,2-trichloroacetic acid)로 제단백 후 0.5 M NaOH로 중화시켰다.
세포내 및 세포외 글루타치온 양의 비교를 위해 글라스 비즈 파쇄 또는 삼투 용해로 얻은 세포 용해물과 배양 상등액으로부터 글루타치온 양을 측정하였다(도 5). 삼투 용해에 의한 세포내 글루타치온 분비량은 야생형 균주에 비해 대부분의 조건적 세포벽 분해 변이 균주들에서 약 4-9배 정도로 크게 높았다. 그러나, 삼투 용해에 의한 글루타치온 분비 효율은 글라스 비즈 파쇄에 의한 글루타치온 분비 효율의 최대 약 20% 정도로 조건적 변이 균주들에서조차 훨씬 낮았다(도 5A). 그럼에도 불구하고, 대부분의 조건적 변이 균주들은 야생형 균주보다 4.5배까지 증가된, 상당히 향상된 세포외 글루타치온 수준을 보이는 것을 관찰할 수 있었다(도 5B). 특히, 조건적 변이 균주 P MET3 - OCH1/P MET3 - CHS3와 och1Δ/P MET3 - CHS3에서 세포내 및 세포외 형태를 포함한 전체 글루타치온 중 약 40%의 글루타치온이 세포외 산물로서 분비된 것은 주목할 만하다. 따라서, 본 발명에서 개발된 조건적 세포벽 분해 변이 효모 균주들은 생산성 제고 및 분리정제의 간편성 측면에서 현재의 효모 세포로부터의 추출법을 대신할 효과적인 대안으로 대두되고 있는 글루타치온 세포외 대량 생산을 위한 숙주로서 유용하게 활용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC13709BP 20181112 한국생명공학연구원 KCTC13710BP 20181112 한국생명공학연구원 KCTC13711BP 20181112
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Novel cell-wall lysis mutant strains of yeast and method for producing glutathione using the same <130> ADP-2018-0350 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 631 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 gtataaatca cggaagggat gatttataag aaaaatgaat actattacac ttcatttacc 60 accctctgat ctagattttc caacgatatg tacgtagtgg tataaggtga gggggtccac 120 agatataaca tcgtttaatt tagtactaac agagactttt gtcacaacta catataagtg 180 tacaaatata gtacagatat gacacacttg tagcgccaac gcgcatccta cggattgctg 240 acagaaaaaa aggtcacgtg accagaaaag tcacgtgtaa ttttgtaact caccgcattc 300 tagcggtccc tgtcgtgcac actgcactca acaccataaa ccttagcaac ctccaaagga 360 aatcaccgta taacaaagcc acagttttac aacttagtct cttatgaagt tacttaccaa 420 tgagaaatag aggctctttc tcgagaaata tgaatatgga tatatatata tatatatata 480 tatatatata tatatatgta aacttggttc ttttttagct tgtgatctct agcttgggtc 540 tctctctgtc gtaacagttg tgatatcgtt tcttaacaat tgaaaaggaa ctaagaaagt 600 ataataataa caagaataaa gtataattaa c 631

Claims (13)

  1. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 α-1,6-만노실 트랜스퍼라아제(α-1,6-mannosyltransferase; OCH1) 유전자 및 키틴질 생합성 효소 III(chitin synthase III; CHS3) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를, 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터 유전자로 치환시킨 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 MET3 프로모터 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 OCH1 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 수탁번호 KCTC 13710BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 CHS3 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 수탁번호 KCTC 13709BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 OCH1 유전자의 프로모터 및 CHS3 유전자의 프로모터가 MET3 프로모터 유전자로 치환된 것으로, 수탁번호 KCTC 13711BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주.
  8. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 내 OCH1 유전자 및 CHS3 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포벽 생합성 유전자의 프로모터 유전자를 메티오닌(methionine)에 의해 발현이 억제되는 MET3 프로모터 유전자로 치환시키는 단계를 포함하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 MET3 프로모터 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 수탁번호 KCTC 13709BP, 수탁번호 KCTC 13710BP 또는 수탁번호 KCTC 13711BP로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주 제조방법.
  12. 제1항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주를 메티오닌(methionine)이 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 글루타치온(glutathione) 생산방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포벽 분해 변이 사카로마이세스 세레비지애 균주는 글루타치온을 세포 외(extracellular) 분비하는 것을 특징으로 하는 글루타치온 생산방법.

KR1020190000368A 2019-01-02 2019-01-02 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법 KR102142423B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190000368A KR102142423B1 (ko) 2019-01-02 2019-01-02 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190000368A KR102142423B1 (ko) 2019-01-02 2019-01-02 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200084220A KR20200084220A (ko) 2020-07-10
KR102142423B1 true KR102142423B1 (ko) 2020-08-07

Family

ID=71604080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190000368A KR102142423B1 (ko) 2019-01-02 2019-01-02 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102142423B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621882A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2912154B1 (fr) 2007-02-02 2012-11-02 Glycode Levures genetiquement modifiees pour la production de glycoproteines homogenes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number CP005133 (2016.05.23.)*
Van-Trinh Luu 등. 2018년도 한국미생물생명공학회 초록집. H-26. 페이지 449 (2018.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200084220A (ko) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Developing Aspergillus niger as a cell factory for food enzyme production
Johnson Biotechnology of non-Saccharomyces yeasts—the ascomycetes
TWI232238B (en) Novel yeast mutant strains and method for preparing glycoprotein with mammalian-typed sugar chains
WO2017150304A1 (ja) エルゴチオネインの発酵生産
ES2671555T3 (es) Obtención de oligosacáridos mediante un proceso biotecnológico
EP2826857B1 (en) Yeast cell with inactivated NADH dehydrogenase and method of producing lactate using the yeast cell
EP3158075A2 (en) Method for fermenting sugars using genetically engineered yeast
CN107075465A (zh) 阿魏酸转化为香草醛的方法
Singh et al. Aureobasidium pullulans-an industrially important pullulan producing black yeast
WO2004092391A2 (en) Metabolic engineering for enhanced production of chitin and chitosan in microorganisms
EP3266875A1 (en) Method for producing glutathione
KR102142423B1 (ko) 신규 세포벽 분해 변이 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법
Shimma et al. A defect in GTP synthesis affects mannose outer chain elongation in Saccharomyces cerevisiae
Zhang et al. Enhanced bioproduction of chitin in engineered Pichia pastoris
US7285404B1 (en) Cyclic depsipeptide synthetase and method for recombinant production
US7803605B2 (en) Breeding method for yeast, yeast and a production method for glycoprotein or beta-glucan
JP6757341B2 (ja) アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
JP2011172526A (ja) 酵母宿主
Ghezelbash et al. Study of polyols production by Yarrowia lipolytica in batch culture and optimization of growth condition for maximum production
JP5119466B2 (ja) 酵母の製造方法、酵母、及び糖タンパク質又はβ−グルカンの製造方法
US20140308715A1 (en) Microbial conversion of sugar acids and means therein
CN112639117A (zh) 谷胱甘肽的制造方法
JPH09266792A (ja) 酵母のマンノース−１−リン酸転移を正に制御する遺伝子ならびにこの遺伝子の欠損変異株を利用する高マンノース型中性糖鎖の製造方法
JP6507469B2 (ja) アスペルギルス属微生物が生産するタンパク質のｎ型糖鎖構造を改変する方法
Csernetics et al. expression of a bacterial β-carotene hydroxylase in canthaxanthin producing mutant Mucor circinelloides strains

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant