KR20110063650A - 숙주, 형질 전환체 및 그 제조 방법, 그리고 ｏ-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
S. 폼베를 숙주로서 이용하여, 당 사슬 구조를 특정 구조로 제어한 O－글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 얻을 수 있는 형질 전환체, 그 형질 전환체의 제조 방법, 및 그 형질 전환체를 얻기 위한 숙주, 그리고 O－글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
omh1 유전자가 결실 또는 실활된 염색체를 갖는 S. 폼베로 이루어지는 숙주로서, 유전자 공학적 방법에 의해 이종 단백질을 코드하는 유전자를 발현시키고, 또한 발현된 이종 단백질에 당 사슬을 결합시켜, 특정한 O－글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 생산시키기 위한 숙주. 또한, 그 숙주를 사용한 형질 전환체 및 그 제조 방법, 그리고 그 형질 전환체를 이용한 O－글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법.
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Description
본 발명은 숙주 형질 전환체 및 그 제조 방법, 그리고 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
진핵 생물에 있어서의 분비 단백질 등의 글리코실화는 번역 후 수식 중에서도 중요한 과정의 하나로서, 소포체나 골지체에 관련된 여러 가지 효소에 의해 관리되고 있다. 글리코실화에 의해 단백질에 결합되는 당 사슬은 만노오스 (Man) 나 갈락토오스 (Gal), N-아세틸글루코사민 등에 의해 형성된다. 단백질에 결합하는 당 사슬에는, 아스파라긴 잔기의 아미드의 질소 원자에 결합하는 N-글리코사이드형 당 사슬과, 세린 잔기나 트레오닌 잔기의 수산기의 산소 원자에 결합하는 O-글리코사이드형 당 사슬의 2 종류가 있다. 이와 같은 당 사슬은 단백질에 대한 안정성의 부여나, 세포와의 상호 작용에 영향을 주고 있는 것으로 알려져 있다. 그 때문에, 의약품 제조를 목적으로 하여, N-글리코사이드형 당 사슬이 결합된 단백질을 제조하는 기술의 개발이 시도되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 및 2 참조).
N-글리코사이드형 당 사슬에 대해서는, 여러 가지 지견이 집적되어 있지만, O-글리코사이드형 당 사슬에 대해서는 지견이 적다. 통상, 생체에서는 여러 가지 구조를 갖는 O-글리코사이드형 당 사슬이 결합한 단백질이 생산되지만, 특히 의약품의 제조에 있어서는, 단백질에 결합하는 당 사슬의 구조를 특정한 것으로 제어하는 것이 중요하다. 그래서, O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 단백질에 대해서도, 특정한 당 사슬 구조를 갖는 것을 높은 생산성으로 제조하는 기술이 요구되고 있다.
목적의 단백질을 높은 생산성으로 제조하는 방법으로서는, 목적의 이종 단백질 (숙주가 본래 생산하지 않는 단백질) 을 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환체를 이용하는 유전자 공학적인 제조 방법이 널리 사용되고 있다. 숙주는, 진핵 생물 유래의 단백질을 제조하는 경우, 진핵 생물인 미생물을 사용하는 것이 가장 좋은 것으로 생각되고 있으며, 인체에 악영향을 미치는 물질을 함유하지 않는 점에서, 효모가 많이 이용되고 있다. 그 중에서도, 분열 효모인 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (이하, 「S. 폼베」라고 한다) 는 시조사카로미세스·세레비시에 (이하, 「S. 세레비시에」라고 한다) 등의 출아 효모에 비해, 세포 주기나 염색체의 구조, RNA 스플라이싱 등이 동물 세포의 것과 더욱 유사하다고 전해지며, 생산되는 단백질의 번역 후 수식도 동물 세포의 수식에 가까운 것으로 생각되고 있다.
S. 세레비시에에 있어서의 O-글리코사이드형 당 사슬의 합성은 PMT 유전자 패밀리가 코드하는 O-만노실트랜스퍼라아제에 의해, 단백질의 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기의 산소에 만노오스가 결합됨으로써 개시된다 (비특허문헌 1 및 2 참조). 그 후, 당 사슬의 신장에는, KTR 유전자 패밀리가 코드하는 α1,2-만노실트랜스퍼라아제와, MNN1 유전자 패밀리가 코드하는 α1,3-만노실트랜스퍼라아제가 관여하고 있다 (비특허문헌 3 참조).
한편, S. 폼베에 대해서는 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 관여하는 유전자는 특정되어 있지 않았다.
S. 폼베를 사용한 이종 단백질의 제조에 대해서는, S. 폼베 내에서 기능하는 프로모터나 분비 시그널 유전자, 멀티클로닝 벡터 등이 개발되어 있다. 그러나, S. 폼베에 있어서의 O-글리코사이드형 당 사슬의 당 사슬 수식에 관여하는 유전자에 대해서는 잘 몰랐기 때문에, 지금까지 O-글리코사이드형 당 사슬의 구조를 제어할 수 없었다.
이상으로부터, S. 폼베를 이용하여 특정한 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 제조하는 방법이 요망되고 있다.
Strahl-Bolsinger S, Gentzsch M and Tanner W, Biochim Biophys Acta, 1426, 297-307 (1999)
Girrbach V and Strahl S, J Biol Chem, 278, 12554-12562 (2003)
Lussier M, Sdicu M and Bussey H, Biochim Biophys Acta, 1426, 323-334 (1999)
그래서 본 발명에서는, S. 폼베를 숙주로서 이용하여, 당 사슬 구조를 O-Man-Gal (이종 단백질의 산소 원자에 만노오스, 갈락토오스의 순서로 결합한 당 사슬) 인 디사카라이드 구조로 제어한 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 얻을 수 있는 형질 전환체, 및 그 형질 전환체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 이 형질 전환체를 얻기 위한 S. 폼베 숙주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명에서는, 상기 형질 전환체를 이용한 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 숙주는 omh1 유전자가 결실 또는 실활된 S. 폼베로 이루어지는 숙주로서, 유전자 공학적 방법에 의해 이종 단백질을 코드하는 유전자를 발현시키고, 또한 발현된 이종 단백질에 당 사슬을 결합시켜, O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조의 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 생산시키기 위한 숙주이다.
본 발명의 형질 전환체는 omh1 유전자가 결실 또는 실활된 S. 폼베를 숙주로 하여, 이종 단백질을 코드하는 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명의 형질 전환체는, 또한, 상기 이종 단백질을 코드하는 유전자의 5' 말단에 결합한 상기 시조사카로미세스·폼베 내에서 기능하는 분비 시그널을 코드하는 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 형질 전환체는 상기 이종 단백질에 대응하는 야생형 단백질이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖고 있는 단백질인 것이 바람직하다.
본 발명의 형질 전환체의 제조 방법은 omh1 유전자가 결실 또는 실활된 S. 폼베를 숙주로 하여, 이종 단백질을 코드하는 유전자를 상기 숙주에 삽입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 형질 전환체의 제조 방법은 상기 이종 단백질을 코드하는 유전자의 5' 말단측에 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 내에서 기능하는 분비 시그널을 코드하는 유전자를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 형질 전환체의 제조 방법은 상기 이종 단백질에 대응하는 야생형 단백질이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖고 있는 이종 단백질인 것이 바람직하다.
본 발명의 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법은 상기 형질 전환체를 배양하여, 생산된 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조를 갖는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 제조하는 방법이다.
또한, 본 발명의 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법에서는, 생산되는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질의 당 사슬이 당해 이종 단백질에 대응하는 야생형 이종 단백질의 당 사슬의 유무나 당 사슬 구조에 관계 없이, O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법에서는, 형질 전환체를 배양한 배양액으로부터 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득하는 것이 바람직하다.
본 발명의 S. 폼베의 숙주는 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조의 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 생산시키기 위한 숙주로서 유용하다.
본 발명의 S. 폼베를 숙주로 한 형질 전환체에 의하면, 당 사슬 구조를 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조로 제어한 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 형질 전환체의 제조 방법에 의하면, 당 사슬 구조를 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조로 제어한 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질이 얻어지는 형질 전환체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 상기 형질 전환체를 이용하여, 당 사슬 구조를 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조로 제어한 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질을 제조할 수 있다.
[도 1] KTR 패밀리 및 omh 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
[도 2] 예 2 에 있어서 세포 형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 예 3 에 있어서의 배양 후의 결과를 나타낸 도면이다.
[도 4] 예 4 에 있어서의 산성 포스파타아제의 분석 결과를 나타낸 비변성 PAGE 의 사진이다. (레인 1) 야생형 S. 폼베, (레인 2) omh1 변이주, (레인 3) omh2 변이주, (레인 4) omh3 변이주, (레인 5) omh4 변이주, (레인 6) omh5 변이주, (레인 7) omh6 변이주.
[도 5] 예 5 ∼ 12 에 있어서의 키티나아제를 분석한 결과를 나타내는 SDS-PAGE 의 사진이다. (레인 1) S. 세레비시에, (레인 2) 야생형 S. 폼베, (레인 3) omh1 변이주, (레인 4) omh2 변이주, (레인 5) omh3 변이주, (레인 6) omh4 변이주, (레인 7) omh5 변이주, (레인 8) omh6 변이주.
[도 6] 예 13 ∼ 19 에 있어서 당 사슬 구조를 순상(順相) HPLC 에 의해 분석한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 야생형 S. 폼베, (b) omh1 변이주, (c) omh2 변이주, (d) omh3 변이주, (e) omh4 변이주, (f) omh5 변이주, (g) omh6 변이주.
[도 7] 예 20 에 있어서의 당 사슬 구조의 순상 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다. (a) pREP41-GFP, (b) pREP41-omh1-GFP.
[도 8] 예 20 에 있어서의 세포의 관찰 결과를 나타낸 도면이다. (a) 노마르스키 광학계 탑재 관찰 장치, (b) 형광 현미경 (GFP 관찰), (c) 형광 현미경 (RFP 관찰).
[도 9] 예 21 및 22 에 있어서의 키티나아제를 분석한 결과를 나타내는 SDS-PAGE 의 사진이다. (레인 1) S. 폼베 야생주, (레인 2) omh1 변이주.
[도 10] 예 23 및 24 에 있어서의 당 사슬 구조의 순상 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다. (a) S. 폼베 야생주, (b) omh1 변이주.
[도 11] 예 25 에 있어서의 분취 정제한 디사카라이드의 당 사슬 구조의 역상(逆相) HPLC 분석 결과이다. (a) 및 (e) 표준 당 사슬, (b) ∼ (d) S. 폼베 야생주, (f) ∼ (h) omh1 변이주.
[도 2] 예 2 에 있어서 세포 형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 예 3 에 있어서의 배양 후의 결과를 나타낸 도면이다.
[도 4] 예 4 에 있어서의 산성 포스파타아제의 분석 결과를 나타낸 비변성 PAGE 의 사진이다. (레인 1) 야생형 S. 폼베, (레인 2) omh1 변이주, (레인 3) omh2 변이주, (레인 4) omh3 변이주, (레인 5) omh4 변이주, (레인 6) omh5 변이주, (레인 7) omh6 변이주.
[도 5] 예 5 ∼ 12 에 있어서의 키티나아제를 분석한 결과를 나타내는 SDS-PAGE 의 사진이다. (레인 1) S. 세레비시에, (레인 2) 야생형 S. 폼베, (레인 3) omh1 변이주, (레인 4) omh2 변이주, (레인 5) omh3 변이주, (레인 6) omh4 변이주, (레인 7) omh5 변이주, (레인 8) omh6 변이주.
[도 6] 예 13 ∼ 19 에 있어서 당 사슬 구조를 순상(順相) HPLC 에 의해 분석한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 야생형 S. 폼베, (b) omh1 변이주, (c) omh2 변이주, (d) omh3 변이주, (e) omh4 변이주, (f) omh5 변이주, (g) omh6 변이주.
[도 7] 예 20 에 있어서의 당 사슬 구조의 순상 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다. (a) pREP41-GFP, (b) pREP41-omh1-GFP.
[도 8] 예 20 에 있어서의 세포의 관찰 결과를 나타낸 도면이다. (a) 노마르스키 광학계 탑재 관찰 장치, (b) 형광 현미경 (GFP 관찰), (c) 형광 현미경 (RFP 관찰).
[도 9] 예 21 및 22 에 있어서의 키티나아제를 분석한 결과를 나타내는 SDS-PAGE 의 사진이다. (레인 1) S. 폼베 야생주, (레인 2) omh1 변이주.
[도 10] 예 23 및 24 에 있어서의 당 사슬 구조의 순상 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다. (a) S. 폼베 야생주, (b) omh1 변이주.
[도 11] 예 25 에 있어서의 분취 정제한 디사카라이드의 당 사슬 구조의 역상(逆相) HPLC 분석 결과이다. (a) 및 (e) 표준 당 사슬, (b) ∼ (d) S. 폼베 야생주, (f) ∼ (h) omh1 변이주.
본 발명의 숙주는 omh1 유전자가 결실 또는 실활된 S. 폼베로 이루어지는 숙주로서, 본 발명의 형질 전환체를 제조하기 위한 숙주로서 유용하다. 이종 단백질을 코드하는 유전자 (이하, 「이종 단백질 유전자」라고도 한다) 를 이 숙주에 도입하여, 본 발명의 형질 전환체가 제조된다. 본 발명의 형질 전환체는 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조의 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 생산하고, 본 발명의 단백질의 제조 방법에서는, 생산된 이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득한다.
본 발명에 있어서 「이종 단백질」이란, 숙주인 S. 폼베가 본래 생산하지 않는 (야생형 S. 폼베가 그 단백질을 코드하는 유전자를 갖지 않는) 단백질을 의미한다. 이종 단백질은, 산업적 가치가 우수한 점에서, 사람이나 다른 포유 동물이 생산하는 단백질인 것이 바람직하다. 「이종 단백질의 대응하는 야생형 단백질」이란, 이종 단백질을 생산하는 생물 (S. 폼베 이외의 생물) 의 세포가 생산하는 단백질을 말한다. 본 발명의 형질 전환체가 생산하는 이종 단백질은 이 야생형 단백질과 당 사슬이 상이해도 된다. 본 발명의 형질 전환체가 생산하는 이종 단백질은 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조의 당 사슬을 갖는 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질로서, O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조 이외의 O-글리코사이드형 당 사슬을 실질적으로 갖지 않는 이종 단백질이다.
이종 단백질 유전자로서는, O-글리코사이드형 당 사슬의 구조가 O-Man-Gal (산소 원자에 만노오스, 갈락토오스의 순서로 당이 결합한 당 사슬 구조) 로 제어된 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질이 안정적으로 얻어지기 쉬운 점에서, 야생형 단백질이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖고 있는 단백질 (당 단백질) 을 코드하는 유전자인 것이 바람직하다. 이와 같은 이종 단백질로서는, 예를 들어, S. 폼베가 생산하지 않는 키티나아제, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 형질 전환체에서는, 야생형이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖지 않는 이종 단백질이라도, N 말단에 분비 시그널을 융합시킴으로써, 발현된 이종 단백질을 소포체나 골지체로 수송할 수 있기 때문에, 아미노산 배열이나, 그 단백질의 2 차 구조나 3 차 구조에 의해서는, O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 얻을 수 있다. 야생형에 있어서 N 말단에 분비 시그널을 갖지 않는 단백질의 경우에는, 적당한 분비 시그널을 코드하는 DNA 배열을 구비한 키메라 배열로 해도 된다.
(숙주)
숙주로서 사용하는 S. 폼베는 시조사카로미세스속에 속하는 효모로서, 다른 효모에 비해 특히 내산성이 우수하고, 세포 주기나 염색체의 구조, RNA 스플라이싱 등이 동물 세포의 것과 더욱 유사하고, 생산되는 단백질의 번역 후 수식도 동물세포의 수식에 가까운 것으로 생각되는 미생물이다. 본 발명의 숙주인 S. 폼베는 omh1 유전자를 결실 또는 실활시킨 염색체를 갖는 변이형이다. 이 변이형의 S. 폼베는 상기 특징을 유지하고 있고, 또한 이 숙주에 이종 단백질 유전자를 도입하여 얻어지는 형질 전환체도 상기 특징을 유지하고 있다.
omh1 유전자 (SPBC19C7.12c, 액세션 번호 : O60160) 는 S. 폼베 내에서 O-글리코사이드형 당 사슬을 합성하는 효소 (단백질) 인 후술하는 omh1p 를 코드하는 유전자의 하나로서, 특히 그 합성에 있어서 주요한 역할을 하는 효소의 유전자이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 액세션 번호란, 단백질 데이터베이스 Uniprot (URL:http://www.Uniprot.org/) 의 등록 번호를 나타낸다.
O-글리코사이드형 당 사슬의 합성은, 시조사카로미세스·세레비시에 (S. 세레비시에) 의 경우와 마찬가지로, PMT 유전자 패밀리로부터 발현되는 O-만노실트랜스퍼라아제에 의해 개시된다. 이 유전자는 효모에서 다세포 생물까지 고도로 보존되어 있고, S. 폼베에 있어서도 PMT 유전자 패밀리가 코드하는 O-만노실트랜스퍼라아제에 의해, 단백질 중의 세린 잔기나 트레오닌 잔기에 만노오스가 부가된다.
단백질에 첫번째의 만노오스가 부가된 후, S. 세레비시에에서는, 전술한 바와 같이 KTR 유전자 패밀리 및 MNN1 유전자 패밀리에 의해 코드되어 있는 α1,2-만노실트랜스퍼라아제와 α1,3-만노실트랜스퍼라아제가 당 사슬의 신장에 관여한다. 이에 대하여, S. 폼베에 있어서의 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 관여하는 효소의 유전자는 지금까지 특정되어 있지 않았다.
그래서 본 발명자들은, S. 폼베의 염색체에 있어서, S. 세레비시에의 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장 반응에 관여하는 KTR 유전자 (α1,2-만노실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자) 패밀리와 상동성이 높은 유전자 (omh 유전자, O-glycoside α1,2-mannosyltransferase homologues) 를 조사하였다. 그 결과, S. 폼베 내에서 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 관여하는 효소의 6 개의 유전자, SPBC19C7.12c (omh1 유전자), SPBC16H5.09c (omh2 유전자, 액세션 번호 : O42944), SPCC777.07 (omh3 유전자, 액세션 번호 : O74546), SPBC1773.08c (omh4 유전자, 액세션 번호 : O94565), SPBC32H8.08c (omh5 유전자, 액세션 번호 : Q96WW1), 및 SPAC959.04c (omh6 유전자, 액세션 번호 : Q9P4X2) 를 발견하였다. 또한, 상기 MNN1 유전자와 상동성이 높은 유전자는 S. 폼베에 있어서는 발견되지 않았다.
도 1 에, S. 세레비시에의 KTR 유전자 패밀리의 Kre2 유전자, Ktr1 유전자, Ktr3 유전자와, omh1 유전자 ∼ omh6 유전자에 의해 코드되는 각각의 단백질의 아미노산 배열의 비교를 나타낸다.
S. 세레비시에의 KTR 유전자 패밀리의 Kre2 유전자, Ktr1 유전자, Ktr3 유전자의 서브패밀리에 대한 omh1 유전자 ∼ omh5 유전자의 염기 배열의 상동성은 33 ∼ 55 ％ 이다. 한편, omh6 유전자는 omh1 유전자 ∼ omh5 유전자에 비하면 상동성이 낮다.
Kre2 유전자가 코드하는 α1,2-만노실트랜스퍼라아제 (이하, 「Kre2p」라고 한다) 는 공지된 여러 가지 글리코실트랜스퍼라아제가 갖는 DXD 모티프에 상당하는 EPD (Glu247-Pro248-Asp249) 부위를 갖고 있다 (도 1). omh1 유전자 ∼ omh6 유전자가 코드하는 α1,2-만노실트랜스퍼라아제 (이하, 각각 「omh1p」 ∼ 「omh6p」라고 한다) 도 이것에 상당하는 부위를 갖고 있으며, 249 위치의 아스파르트산 잔기는 세린 잔기, 글리신 잔기, 글루탐산 잔기로 변화되어 있는 것도 있지만, 247 위치의 글루탐산은 고도로 보존되어 있다. 이로부터, omh1p ∼ omh6p 는 Kre2p 와 동일한 기구로 당 사슬의 신장에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 즉, Kre2p 는 247 위치의 글루탐산이 2 가의 카티온의 배위에 의해 공여체의 당 뉴클레오티드 (GDP-만노오스) 의 인산기와 상호 작용하여, 220 위치의 티로신 잔기 (도 1 의 ○ 표) 가 상기 공여체의 당 뉴클레오티드와 수용체의 말단의 만노오스와의 사이의 당 전이에 중요한 역할을 하고 있다. omh1p ∼ omh6p 에 대해서도, Kre2p 와 마찬가지로, 티로신 잔기의 기여에 의한 당 전이가 행해지는 것으로 생각된다.
또한, Kre2p 와 omh1p ∼ omh6p 의 사이에서는, 7 개의 시스테인 잔기 (도 1 의 ● 표) 의 위치도 보존되어 있다. 그 밖에도, 많은 부위에서 아미노산 배열이 고도로 보존되어 있다 (도 1 의 반전 부분). 이로부터, omh1p ∼ omh6p 는 Kre2p 와 동일한 삼차원 구조를 갖고 있는 것으로 생각된다.
또한, Kre2p 에 있어서 상기 공여체 및 수용체에 결합하여 활성 부위가 되는 아미노산 배열 (YNLCHFWSNFEI, 도 1 하선부) 도, omh1p ∼ omh6p 에 있어서 고도로 보존되어 있는 점에서도, omh1p ∼ omh6p 는 Kre2p 와 동일한 기구로 당 사슬 신장을 행하는 것으로 생각된다.
이들 omh 유전자 중에서도 omh1 유전자는 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장 반응에 있어서 중요한 역할을 맡고 있는 효소를 코드하고 있는 유전자이다. 본 발명의 형질 전환체에서는, omh1 유전자를 결실 또는 실활시킴으로써, omh1p 가 발현하지 않고, 형질 전환체가 생산하는 이종 단백질에 결합하는 O-글리코사이드형 당 사슬의 구조가 O-Man-Gal 로 제어된다.
이것은, omh1 유전자가 코드하는 omh1p (α1,2-만노실트랜스퍼라아제) 가, 단백질에 결합한 첫번째의 만노오스에 대하여, 두번째의 만노오스를 결합시키는 반응에 기여하고 있기 때문인 것으로 생각된다. 즉, omh1 유전자를 결실 또는 실활시킴으로써, 첫번째의 만노오스에 두번째의 만노오스를 결합시킬 수 없게 되기 때문에, 갈락토실트랜스퍼라아제에 의해 첫번째의 만노오스에 갈락토오스가 결합하는 것으로 생각된다.
omh1 유전자 ∼ omh6 유전자는 모두 S. 폼베의 생육에 필수적인 유전자가 아니며, 또한 omh1 유전자를 실활 또는 결실시켜도 세포의 표현형은 특별히 변화하지 않는다. 그 때문에, 본 발명의 형질 전환체는 omh1 유전자를 실활 또는 결실시키고 있지만, O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질을 안정적으로 제조할 수 있다.
또한, S. 폼베에서는, omh1 유전자를 결실 또는 실활시킨 경우에, omh1 유전자의 기능은 omh2 유전자 ∼ omh6 유전자의 과잉 발현에 의해서는 보충되지 않는다. 또한, omh2 유전자 ∼ omh5 유전자 중 어느 하나를 파괴해도, 야생형과 동일한 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 단백질이 생산되는 점에서, 이들 유전자가 코드하는 효소는 모두 세번째의 만노오스의 부가에 관여하고 있거나, 혹은 당 사슬의 합성에 잉여의 기능을 갖고 있는 것으로 생각된다.
omh1 유전자를 결실 또는 실활시키는 방법으로서는 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, Latour법 (Nucreic Acids Res (2006) 34 : e11, 및 국제 공개 제2007/063919호 팜플렛 등에 기재) 을 이용함으로써 유전자를 결실시킬 수 있다. 또한, 변이제를 사용한 돌연변이 분리법 (효모 분자 유전학 실험법, 1996년, 학회 출판 센터) 이나, PCR (폴리머라아제 연쇄 반응) 을 이용한 랜덤 변이법 (PCR Methods Appl.), 1992년, 제 2 권, p.28-33) 등에 의해 유전자의 일부에 변이를 도입함으로써 그 유전자를 실활시킬 수 있다.
(형질 전환체)
본 발명의 형질 전환체는 상기 본 발명의 omh1 유전자가 결실 또는 실활된 숙주에 이종 단백질 유전자를 도입함으로써 얻어진다. 이종 단백질 유전자는 목적 이종 단백질을 코드하는 부분 이외에 분비 시그널을 코드하는 부분을 갖고 있어도 된다. 이 분비 시그널을 코드하는 부분은 이종 단백질을 생산하는 생물 (S. 폼베 이외) 의 세포에 있어서 기능하는 분비 시그널을 코드하는 부분으로서, 그 세포 내에서 N 말단에 분비 시그널을 갖는 단백질이 발현된 후, 세포 내에서 분비 시그널 부분이 삭제되고, 그 후, 세포로부터 분비 시그널을 갖고 있지 않은 이종 단백질이 분비된다. 이종 단백질 유전자가 분비 시그널을 코드하는 부분을 갖고 있는 경우에는, 그 분비 시그널은 상기 본 발명의 숙주에 있어서도 기능할 필요가 있다. 그 분비 시그널이 상기 본 발명의 숙주에 있어서 기능하지 않는 경우에는, 그 기능하지 않는 분비 시그널 대신에, 상기 숙주에 있어서 기능하는 분비 시그널을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 본 발명의 숙주에 있어서 기능하는 분비 시그널로서는 S. 폼베가 갖는 분비 시그널이 바람직하다. 이 S. 폼베가 갖는 분비 시그널을 코드하는 유전자를 이종 단백질 유전자의 5' 말단측에 결합시킴으로써, 이종 단백질의 N 말단측에 이 분비 시그널이 결합한 단백질이 발현하고, 이어서 상기 본 발명의 숙주 내에서 이 분비 시그널이 삭제된다. S. 폼베 내에서 기능하는 분비 시그널 유전자로서는, 국제 공개 제96/23890호 팜플렛에 기재된 분비 시그널 유전자가 바람직하다. 특히, 이 문헌에 기재된 분비 시그널 P3 을 코드하는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
숙주를 형질 전환하기 위해서는, 이종 단백질 유전자를 갖는 발현 벡터가 사용된다. 이종 단백질 유전자가 숙주 내에서 기능하는 분비 시그널의 유전자를 포함하지 않는 경우에는, 숙주 내에서 기능하는 분비 시그널의 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 이종 단백질 유전자가 숙주 내에서 기능하지 않는 분비 시그널의 유전자를 포함하는 경우에는, 그 분비 시그널의 유전자를 제거한 이종 단백질 유전자를 사용하고, 대신에 숙주 내에서 기능하는 분비 시그널의 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 벡터에는, 또한 통상 숙주 내에서 기능하는 프로모터를 포함하고, 추가로 터미네이터, 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역 중 어느 하나가 포함되어 있어도 된다. 프로모터는 숙주인 S. 폼베 내에서 기능하여 이종 단백질을 발현할 수 있는 것이면 된다.
본 발명에 있어서의 프로모터로서는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평5-15380호, 일본 공개특허공보 평7-163373호, 및 일본 공개특허공보 평10-234375호에 기재되어 있는 동물 세포 바이러스 유래의 프로모터를 들 수 있고, CMV 프로모터, SV40 프로모터가 바람직하다. 그 밖에, 일본 공개특허공보 평11-192094호, 국제 공개 제2007/26617호 팜플렛 등에 기재된 S. 폼베 내에서 기능할 수 있는 프로모터로서 알려져 있는 여러 가지 프로모터를 사용할 수 있다.
이종 단백질 유전자를 갖는 발현 벡터를 사용하여 S. 폼베를 형질 전환하는 방법은 상기 공지예를 비롯하여 여러 가지 알려져 있으며, 그 공지된 방법을 사용할 수 있다. 상기 이외의 구체예로서는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2000-262284호, 일본 공개특허공보 2003-310269호, 일본 공개특허공보 2005-198612호 등에 기재된 벡터나 그것을 사용한 형질 전환 방법을 채용할 수 있다. 이종 단백질 유전자는 발현 벡터의 형태로 숙주의 염색체 외에 도입하여 형질 전환체를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 발현 카세트의 형태로 숙주의 염색체에 도입할 수 있다. 발현 카세트는 이종 단백질 유전자와 함께 상기 프로모터나 분비 시그널 등을 갖고, 통상, 상동 재조합법을 사용하여 숙주의 염색체에 삽입한다. 발현 카세트를 사용하여 염색체에 이종 단백질 유전자를 삽입하는 방법에 의해 S. 폼베를 형질 전환하는 방법으로서는, 상기 일본 공개특허공보 2000-262284호에 기재된 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 발현 카세트가 염색체에 조합되어 있으면, 형질 전환체의 배양 중에 발현 카세트가 세포로부터 탈락하여 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 생산능이 소실되는 것을 억제하기 쉽다. 또한, 발현 카세트를 S. 폼베의 염색체에 삽입하는 경우에는, O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 생산성이 향상되는 점에서, 조합되는 발현 카세트는 2 개 이상인 것이 바람직하다.
이상 설명한 바와 같은 벡터를 S. 폼베의 세포에 도입하여 형질 전환한다. 형질 전환한 형질 전환체는 상기 항생 물질 내성 유전자나 영양 요구성 마커를 이용하여 선택할 수 있다.
항생 물질 내성 유전자를 갖는 벡터를 사용한 경우에는, 그 항생 물질을 함유하는 배지를 사용함으로써 형질 전환체를 선택할 수 있다. 항생 물질 내성 유전자로서는, 예를 들어, 네오마이신 내성 유전자를 들 수 있다. 또한, 영양 요구성 마커로서는, 예를 들어, 오로티딘인산데카르복실라아제 유전자 (ura4 유전자) 나, 이소프로필말산데히드로게나아제 유전자 (leu1 유전자) 를 들 수 있다.
영양 요구성 마커를 사용하는 경우에는, 예를 들어, ura4 유전자를 결실 또는 실활시켜 우라실 요구성으로 한 S. 폼베를 숙주로 하여, ura4 유전자를 갖는 상기 벡터에 의해 형질 전환한 후, 우라실 요구성이 소실된 것을 선택함으로써, 벡터가 조합된 형질 전환체를 얻을 수 있다.
선택하는 방법으로서는, 예를 들어, 이하에 나타내는 방법을 들 수 있다. 상기 영양 요구성 마커에 의해 형질 전환체를 선택할 수 있는 배지에 의해 스크리닝하고, 얻어진 콜로니로부터 복수를 선택한다. 다음으로, 그것들을 따로 따로 액체 배양한 후, 각각의 배양액에 있어서의 이종 단백질의 발현량을 조사하여, 이종 단백질의 발현량이 보다 많은 형질 전환체를 선택한다. 또한, 이들 선택한 형질 전환체에 대하여 펄스 필드 겔 전기 영동법에 의한 게놈 해석을 행함으로써, 염색체에 조합된 발현 카세트의 수를 조사할 수 있다.
[O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법]
본 발명의 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법은 본 발명의 형질 전환체를 배양하여, 그 형질 전환체에 의해 생산되는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득하는 방법이다.
배양액에는, 공지된 효모 배양 배지를 사용할 수 있고, S. 폼베가 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, S. 폼베의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 것이면 된다.
배양액으로서는, 천연 배지를 사용해도 되고, 합성 배지를 사용해도 된다.
탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 등의 당, 전분 등의 탄수화물을 들 수 있다. 그 중에서도, 글루코오스 또는 수크로오스가 바람직하다.
질소원으로서는, 예를 들어, 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 무기산의 암모늄염, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스를 들 수 있다. 그 중에서도, 황산암모늄 또는 효모 엑기스가 바람직하다.
무기 염류로서는, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨을 들 수 있다. 그 중에서도, 인산마그네슘이 바람직하다.
또한, 배양액에는 프로테오리피드가 함유되어 있어도 된다.
배양은 진탕 배양, 교반 배양 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 배양 온도는 16 ∼ 37 ℃ 인 것이 바람직하고, 25 ∼ 32 ℃ 가 더욱 바람직하다. 또한, 배양 시간은 적절히 결정할 수 있다.
또한, 배양은 회분 배양이어도 되고, 연속 배양이어도 된다.
연속 배양은, 예를 들어, 일정 시간 배양한 배양액으로부터 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질을 취득함과 함께 배양 상청을 회수하고, 그 배양 상청에 다시 배양액을 첨가하여 배양하는 것을 반복하여 연속적으로 배양하는 방법을 들 수 있다. 연속 배양을 행함으로써, O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 생산성이 더욱 향상된다.
배양액으로부터의 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 취득은 공지된 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, omh1 유전자가 결실 또는 실활된 염색체를 갖는 S. 폼베를 숙주로 한 형질 전환체를 이용함으로써, O-글리코사이드형 당 사슬이 O-Man-Gal 로 제어된 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질을 얻을 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 기재에 의해서는 한정되지 않는다. 또한, 본 실시예에 있어서의 형질 전환은 아세트산리튬법 혹은 일렉트로포레이션법 (Electroporation) 에 의해 행하였다.
[예 1] 클로닝 및 omh 유전자의 파괴
선택 마커로서 ura4 를 이용하여, omh1 유전자 ∼ omh6 유전자의 파괴를 행하였다.
표 1 에 나타내는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용하여 야생형 S. 폼베의 게놈 DNA 로부터, omh1 유전자, omh2 유전자, omh3 유전자의 일부 또는 전부를 각각 포함하는 3 개의 DNA 단편 (1.3kb, 1.6kb, 1.25kb) 을 증폭시키고, 서브클로닝을 행하였다. 벡터에는, pGEM-T Easy 벡터 및 pGEM-T 벡터 (Promega) 를 사용하였다.
서브클로닝 후, KpnI 및 EcoRI 에 의한 제한 효소 처리에 의해 벡터의 omh1 유전자 내에서 절단을 일으키고, 그 위치에 ura4+ 카세트 (1.6kb) 를 삽입함으로써, omh1 유전자를 파괴한 벡터를 얻었다. 마찬가지로, 제한 효소 EcoRV 및 HindIII 를 이용하여 omh2 유전자를 파괴한 벡터, 제한 효소 EcoRI 및 XhoI 를 이용하여 omh3 유전자를 파괴한 벡터를 얻었다.
다음으로, 파괴된 omh1 유전자를 각각 갖는 벡터를 직선 형상으로 한 DNA 단편을 이용하여 우라실 합성능이 결손된 S. 폼베의 ARC039 주 (일배체) 를 형질 전환하고, 우라실 선택 배지에 의해 선택함으로써, 파괴된 omh1 유전자를 갖는 omh1 변이주를 얻었다. 파괴된 omh2 유전자를 갖는 omh2 변이주, 및 파괴된 omh3 유전자를 갖는 omh3 변이주도 동일한 방법으로 구축하였다. 원하는 omh1 변이주, omh2 변이주, omh3 변이주가 얻어지고 있다는 확인은 서던 블롯법 및 PCR 에 의해 행하였다.
omh4 유전자 ∼ omh6 유전자의 파괴에는, loxP 카세트 벡터 (pBS loxP-ura4-loxP, Biosci Biotechnol Biochem, 68, 545-550 (2004) 에 기재) 를 사용하였다.
omh4 유전자의 상류측의 단편을, XhoI 와 HindIII 의 제한 효소 사이트를 각각 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머 (표 1) 에 의해 PCR 로 증폭시키고, 하류측의 단편을, EcoRI 와 BamHI 의 제한 효소 사이트를 각각 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머 (표 1) 에 의해 PCR 로 증폭시켰다. 이들 증폭 단편을, 각각 적합한 제한 효소에 의해 처리한 후, pBS loxP-ura4-loxP 벡터에 삽입하고, loxP-ura4-loxP 카세트의 양 측에 omh4 유전자의 상류측의 단편과 하류측의 단편이 각각 위치하는 omh4 유전자 파괴용 벡터를 얻었다. 또한, 표 1 에 나타내는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용하여, 동일한 방법으로, omh5 유전자 파괴용 벡터 및 omh6 유전자 파괴용 벡터를 얻었다.
이들 벡터를 직선 형상으로 한 DNA 단편을 이용하여, 우라실 합성능이 결손 된 S. 폼베의 ARC039 주 (일배체) 를 형질 전환하고, 우라실 선택 배지에 의해 선택함으로써, 각각 omh4 변이주, omh5 변이주, omh6 변이주를 얻었다.
[예 2] 세포 형태의 관찰
예 1 에서 얻어진 omh1 변이주 ∼ omh6 변이주를, YES 배지 (5 ㎖) 에서, 30 ℃ 및 37 ℃ 에서 각각 하룻밤 배양한 후, 노마르스키 광학계를 탑재한 관찰 장치에 의해, 그들의 세포 형태를 관찰하였다.
또한, 비교 대상으로서, 야생형 S. 폼베에 대해서도 각 변이주와 동일한 배양을 행하고, 세포 형태를 관찰하였다. 결과를 도 2(a) ∼ (g) 에 나타낸다. 도 2 에 있어서, (a) 가 야생형 S. 폼베, (b) 가 omh1 변이주, (c) 가 omh2 변이주, (d) 가 omh3 변이주, (e) 가 omh4 변이주, (f) 가 omh5 변이주, (g) 가 omh6 변이주에 있어서의 관찰 결과이다.
도 2 에 나타내는 바와 같이, omh1 변이주 ∼ omh6 변이주의 모든 변이주가 생육 가능하고, omh1 유전자 ∼ omh6 유전자는 모두 생육에 필수의 유전자가 아님을 알 수 있었다. 또한, omh1 변이주 ∼ omh5 변이주에 대해서는, omh1 유전자 ∼ omh5 유전자 중 어느 하나가 파괴되어 있어도, 세포의 표현형이 야생형 S. 폼베와 동일하였다. omh1 변이주의 표현형이 야생형 S. 폼베와 동일한 것은, omh1 유전자가 코드하는 omh1p 가, 야생형 S. 폼베의 통상적인 세포벽의 구성이나 기능에 필수인 당 사슬 구조의 형성에는 관여하고 있지 않음을 나타내고 있다.
한편, omh6 변이주에서는, 야생형과는 상이한 표현형을 나타내었다.
[예 3] 온도 의존성 및 항생 물질 내성 (하이그로마이신 B)
예 2 의 배양 후의 각각의 배양액을, 물에 의해 OD600 이 0.5 (세포 수 107 개/㎖ 에 상당) 가 되도록 희석하였다. 또한, 10 배 희석 (도 3 중의 10-1, 가장 좌측의 열) 한 후, 그 중 7 ㎕ 를 YES 배지 (한천 배지) 에 스트리크하고, 30 ℃ (도 3(a)), 및 37 ℃ (도 3(c)) 의 조건으로 3 일간 배양하였다. 또한, 마찬가지로, 20㎍/㎖ 하이그로마이신 B (0.005 질량％) 를 함유하는 YES 배지 (5 ㎖) 에서도 30 ℃ 에서 각각 하룻밤 배양하였다 (도 3(b)). 또한, 조기에 급격한 증식이 보여지는 경우에는, 추가로 10 배씩 희석해 가, 동일한 조건에서 배양을 행하였다. 도 3(a) ∼ (c) 에는, 각 조건에 있어서, 좌측으로부터 순서대로 OD600 이 0.5 인 것을 10 배씩 희석 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4) 한 것의 배양 결과를 나타낸다.
도 3 에 나타내는 바와 같이, omh1 변이주, omh2 변이주, omh4 변이주 및 omh5 변이주는 온도나 하이그로마이신 B 의 영향이 작아, 야생형 S. 폼베와 크게 다르지 않은 속도로 생육함을 알 수 있었다.
한편, omh3 변이주와 omh6 변이주에서는, 37 ℃ 에서의 배양, 및 하이그로마이신 B 를 함유하는 배지에 있어서의 배양에 있어서 생육 속도가 저하되었다.
[예 4] 산성 포스파타아제의 분석
omh1 변이주 ∼ omh6 변이주에 있어서의 산성 포스파타아제에 대한 영향을 분석함으로써, omh1p ∼ omh6p 의 N-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 대한 영향을 조사하였다.
ARC039 주 및 omh1 변이주 ∼ omh6 변이주를, 각각 YES 배지 (5 ㎖) 에서 30 ℃ 에서 OD600 이 1.5 가 될 때까지 배양한 후, 원심 분리에 의해 1.5×108 개의 세포를 얻고, 또한 그 세포를 MMP 배지 (Methods Enzymol, 194, 795-823 (1991) 에 기재된 MM 배지를 기초로 하여, 인산수소이나트륨 및 프탈산수소칼륨 대신에 14.6 mM 아세트산나트륨을 함유하는 배지) 의 5 ㎖ 에 재현탁하고, 30 ℃ 에서 3 시간 온치(溫置)함으로써 산성 포스파타아제의 생산을 유도하였다.
이어서, 얻어진 세포를 원심 분리하여 회수하고, Tris-HCl 완충액 (62.5 mM, pH 6.8) 으로 세정한 후, 빙랭시킨 200 ㎕ 의 용균액 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1 mM EDTA, 2 mM 불화페닐메틸술포닐, 0.1 mM 디티오트레이톨, 10 ％ (v/v) 글리세롤) 에 현탁하여 현탁액을 얻었다.
그 후, 미니 비즈 비터 8 (Mini Bead Beater-8, 바이오스펙·프로덕츠사 제조) 을 이용하여, 직경 0.5 ㎜ 의 유리 비즈에 의한 상기 현탁액의 교반 (4 ℃, 30 초간) 을 5 번 행하여, 세포 용해물을 얻었다. 세포 용해물을 6 ％ (w/v) 폴리아크릴아미드 겔 (비변성) 로 전기 영동하여, 활성 염색 (Yeast, 18, 903-904 (2001) 에 기재된 방법) 을 행하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. 레인 1 은 야생형 S. 폼베, 레인 2 는 omh1 변이주, 레인 3 은 omh2 변이주, 레인 4 는 omh3 변이주, 레인 5 는 omh4 변이주, 레인 6 은 omh5 변이주, 레인 7 은 omh6 변이주에 있어서의 전기 영동의 결과이다.
도 4 에 나타내는 바와 같이, 전기 영동에 있어서의 산성 포스파타아제의 이동도는, omh1 변이주 ∼ omh6 변이주와 야생형 S. 폼베에서는 변화가 없고, 동등하였다. 이 결과로부터, omh1p ∼ omh6p 는, N-글리코사이드형 당 사슬의 신장에는 관여하고 있지 않음을 알 수 있었다.
<이종 발현한 출아 효모 키티나아제 (분비 단백질) 의 당 사슬 구조 해석 (1)>
[예 5]
S. 세레비시에의 키티나아제 (Cts1) 유전자 [5' 말단측에 S. 세레비시에의 분비 시그널 유전자를 함유] 와 S. 폼베의 nmt1 프로모터를 갖는 벡터 pREP41-ScCTS1 (문헌 : N. Tanaka et al., Biochem Biophys Res Commun (2005) 330:813-820. 참조) 을 사용하여 omh1 변이주를 형질 전환 (문헌 : T. Morita and K. Takegawa, Yeast (2004) 21:613-617., 및 일본 공개특허공보 2005-198612호 참조) 하였다. 이어서, 류신을 함유하고 있지 않은 MM 배지 (5 ㎖) 를 이용하여 정상기까지 배양하고, 키티나아제의 발현 배지 (MM 배지를 기초로 하여, 2 ％ (w/v) 글루코오스 대신에 0.1 ％ (w/vv) 글루코오스 및 2 ％ (w/v) 프룩토오스를 함유한다) 의 10 ㎖ 로 옮겨 30 ℃ 에서 3 시간 온치하였다. 그 후, 배지의 상징(上澄)으로부터 키티나아제를 회수하고, 6 ％ (w/v) 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS (Sodium dodecyl sulfate) - PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) 로 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장을 분석하였다.
배지로부터의 키티나아제의 회수는 이하에 나타내는 바와 같이 행하였다. 배지에 키틴비즈 (20 ㎎, 시그마) 를 첨가한 후, 4 ℃ 에서 12 시간 교반하고, 원심하여 펠릿으로 하였다. 그 펠릿을 나트륨 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl) 로 3 회 세정하고, SDS 샘플 완충액 (50 ㎕) 으로 5 분간 보일 (boil) 함으로써 키티나아제를 추출하였다. 겔의 염색은 Coomassie Brilliant Blue R-250 에 의해 행하였다.
[예 6 ∼ 12]
야생형 S. 폼베 (예 6), omh2 변이주 ∼ omh6 (예 7 ∼ 11) 변이주에 대하여, 예 5 와 동일한 방법으로 키티나아제의 분석을 행하였다. 또한, S. 세레비시에 (예 12) 를 YPD 배지 (10 ㎖) 에서 30 ℃ 에서 배양하고, 예 5 와 동일하게 하여 6 ％ (w/v) 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE 로 키티나아제를 분리하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 레인 1 은 S. 세레비시에, 레인 2 는 야생형 S. 폼베, 레인 3 은 omh1 변이주, 레인 4 는 omh2 변이주, 레인 5 는 omh3 변이주, 레인 6 은 omh4 변이주, 레인 7 은 omh5 변이주, 레인 8 은 omh6 변이주에 있어서의 전기 영동의 결과이다. 키티나아제의 분자량은 83 kDa 와 175 kDa 의 마커를 이용하여 결정하였다.
도 5 에 나타내는 바와 같이, 야생형 S. 폼베 (예 6, 레인 2) 및 S. 세레비시에 (예 12, 레인 1) 에 있어서의 키티나아제는 대략 동등한 이동도 (분자량 약 130 kDa 에 상당) 였다. 또한, omh2 변이주 ∼ omh6 변이주 (예 7 ∼ 예 11, 레인 4 ∼ 8) 에 있어서의 키티나아제에 대해서도 이동도는 영향을 받지 않고, S. 세레비시에의 키티나아제와 대략 동등하였다. 이에 대하여, omh1 변이주 (예 5, 레인 3) 에 있어서는, 키티나아제의 분자량이 약 100 kDa 가 되어, O-글리코사이드형 당 사슬의 신장이 현저히 손상되어 있었다. 이 결과로부터, omh1 유전자가 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 깊이 관여하고 있음이 확인되었다.
다음으로, O-글리코사이드형 당 사슬의 구조에 관한 추가적인 정보를 얻기 위하여, 야생형 S. 폼베 및 omh1 변이주 ∼ omh6 변이주에서 얻어진 당 단백질 (O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질) 의 당 사슬을 히드라진 분해하고, 피리딜아미노 (PA) 화하여 HPLC (High performance liquid chromatography) 에 의해 분석을 행하였다.
[예 13]
YES 배지에 의해 omh1 변이주를 30 ℃ 에서 정상기까지 배양하고, 그로부터 세포 표면의 갈락토만난을 추출하여, 동결 건조 상태의 갈락토만난을 얻었다 (Methods Enzymol, 185, 440-470 (1990) 에 기재된 방법). 다음으로, 동결 건조 상태의 갈락토만난 2 ㎎ 을 무수 히드라진 0.2 ㎖ 와 함께 60 ℃ 에서 6 시간 가열하여, 히드라진을 증발시키고, 카티온 교환 수지 (Dowex50W-x2(H+)) 에 통과시켜 나트륨 이온을 제거하였다. 다음으로, 얻어진 샘플을 피리딜아미노화제 (20 ㎕) 와 함께 90 ℃ 에서 60 분 가열하고, 환원제 (20 ㎕) 를 첨가하여 80 ℃ 에서 35 분 가열함으로써, 당 사슬의 환원 말단에 2-아미노피리딘을 부가하였다. 여분의 피리딜아미노화제 및 환원제는 페놀/클로로포름 (체적비는 50/50) 추출에 의해 제거하였다.
다음으로, 얻어진 샘플에 대하여 순상 HPLC 분석 (칼럼 : Asahipak NH2P-50 column (4.6 ㎜ × 50 ㎜), 쇼와덴코사 제조) 을 행하였다. 당 사슬의 분자 사이즈는, PA (피리딜아미노) 라벨링한 표준 마커인 PA 화 만노오스, PA 화 말토오스, PA 화 이소말토올리고당 (다카라바이오사 제조) 에 의해 결정하였다.
[예 14 ∼ 19]
야생형 S. 폼베 (예 14) 및 omh2 변이주 ∼ omh6 변이주 (예 15 ∼ 19) 에 대해서도 예 13 과 동일하게 하여 당 사슬의 순상 HPLC 분석을 행하였다. 또한, 예 14 에서는, 검출된 5 개의 주요한 피크를 회수하고, 잭콩 α 만노시다아제나 커피콩 α 갈락토시다아제에 의한 처리 후, 이들 피크가 어떻게 변화하는지를 조사하고, 이들 5 개의 피크에 각각 상당하는 당 사슬 구조를 확인하였다.
예 13 ∼ 19 의 순상 HPLC 분석의 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 에 있어서, (a) 는 야생형 S. 폼베, (b) 는 omh1 변이주, (c) 는 omh2 변이주, (d) 는 omh3 변이주, (e) 는 omh4 변이주, (f) 는 omh5 변이주, (g) 는 omh6 변이주에 있어서의 순상 HPLC 분석의 결과이다.
도 6(a) 에 나타내는 바와 같이, 야생형 S. 폼베에서는 5 개의 주요한 피크 (2G, 2M, 3G, 3M, 4i) 가 확인되었다. 피크 2G 는 Gal-Man-PA, 피크 2M 은 Man-Man-PA, 피크 3G 는 Gal-Man-Man-PA, 피크 3M 은 Man-Man-Man-PA 였다. 또한, 피크 4i 는 4 개의 당을 갖는 당 사슬의 혼합물이었다.
omh2 변이주 ∼ omh6 변이주 (도 6(c) ∼ (g)) 에 있어서의 당 사슬은 야생형 S. 폼베의 것 (도 6(a)) 과 대략 동등하고, 변화가 없었다.
이에 대하여, omh1 변이주에서는 3 개 이상의 당을 갖는 당 사슬의 양이 극단적으로 적어, 그 대부분이 피크 2G 가 되어 있었다 (도 6(b)). 또한, omh1 변이주에서 얻어진 피크 2G 를 잭콩 α 만노시다아제 및 커피콩 α 갈락토시다아제에 의해 처리한 결과, α 만노시다아제에 의한 처리에서는 분해되지 않고, α 갈락토시다아제에 의해 분해되어, 모두 Man-PA (도 6(a) 의 피크 M1 에 상당) 가 되었다.
이들의 결과로부터, omh1 변이주에서는, 첫번째의 만노오스에 α1,2 결합에서 두번째의 만노오스가 결합하는 것이 억제되어 있고, omh1 유전자가 O-글리코사이드형 당 사슬의 신장에 중요한 역할을 하고 있음이 나타났다.
[예 20]
omh1 유전자를, 야생형 S. 폼베의 게놈 DNA 로부터 PCR 에 의해 증폭시키고, 제한 효소 BglII 및 NotI 의 절단 부위를 도입하고, 이들 제한 효소에 의해 처리한 후, 벡터 pREP41-GFP (pREP41 로부터 얻은 벡터 pTN197, Mol Biol Cell, 12, 3955-3972 (2001) 에 기재) 의 상당하는 부위에 삽입하여 클로닝함으로써, C 말단에 GFP (녹색 형광 단백질) 가 결합한 omh1p 를 발현하는 유전자를 갖는 벡터 pREP41-omh1-GFP 를 얻었다. 또한, Yeast, 18, 745-757 (2001) 에 기재된 방법에 의해, RFP (적색 형광 단백질) 가 결합한 Gms1p (Gms1 유전자에 의해 코드되는 UDP 갈락토오스 수송체) 를 발현하는 유전자를 갖는 벡터 pAU-Gms1-RFP 를 얻었다.
omh1 변이주를, pREP41-GFP 또는 pREP41-omh1-GFP 로 형질 전환한 것을, 류신을 함유하지 않는 MM 배지에 의해 30 ℃ 에서 정상기까지 배양하였다. 이것을 예 13 과 동일한 방법으로 순상 HPLC 분석한 결과를 도 7(a) (pREP41-GFP) 및 (b) (pREP41-omh1-GFP) 에 나타낸다.
또한, omh1 변이주를, pREP41-omh1-GFP 또는 pAU-Gms1-RFP 로 형질 전환한 것을 우라실 및 류신을 함유하지 않는 MM 배지에 의해 30 ℃ 에서 배양하였다. 그 후, 회수한 세포 (OD600=0.5) 를 관찰하였다. 그 결과를 도 8(a) ∼ (c) 에 나타낸다. 도 8(a) 는 노마르스키 광학계를 탑재한 관찰 장치에 의해 관찰한 것, 도 8(b) 는 형광 현미경에 의해 pREP41-GFP 를 관찰한 것, 도 8(c) 는 pAU-Gms1-RFP 를 관찰한 것이다.
도 7(a) 에 나타내는 바와 같이, pREP41-GFP 를 포함하는 omh1 변이주에서는, 확인된 피크는 예 13 과 동일하고, 3 개 이상의 당을 갖는 당 사슬은 거의 합성되어 있지 않았다. 한편, 도 7(b) 에 나타내는 바와 같이, pREP41-omh1-GFP 를 포함하는 omh1 변이주에서는, 예 14 의 야생형 S. 폼베와 동일한 5 개의 주요한 피크가 확인되었다. 이것은, 도입한 벡터로부터 omh1p 가 발현함으로써, 첫번째의 만노오스에 두번째의 만노오스가 결합할 수 있게 되었기 때문이다.
또한, 도 8(a) ∼ (c) 에 나타내는 바와 같이, omh1p-GFP (GFP 가 결합한 omh1p) 는 Gms1p-RFP (RFP 가 결합한 Gms1p) 와 동일한 장소에 국재하고 있었다. Gms1p 는 당 사슬의 합성에 필요한 갈락토오스를 수송하는 단백질이고, 이 결과로부터도, omh1 유전자가 O-글리코사이드형 당 사슬의 합성에 관여하고 있는 것이 확인되었다.
<이종 발현한 출아 효모 키티나아제의 당 사슬 구조 해석 (2)>
[예 21]
S. 세레비지에의 키티나아제 (Cts1) 유전자와 S. 폼베의 인베르타아제 프로모터와 시그널펩티드를 코드하는 DNA 배열을 갖는 벡터 pFM1-1-ScCts1 를 사용하여, S. 폼베의 야생주를 형질 전환하고, 류신을 함유하고 있지 않은 MM 배지 (단, 2 ％ (w/v) 글루코오스 대신에 8 ％ (w/v) 글루코오스를 함유한다) 100 ㎖ 에서 정상기까지 배양하고, 키티나아제의 발현 배지 (MM 배지를 기초로 하여, 2 ％ (w/v) 글루코오스 대신에 0.05 ％ (w/v) 글루코오스 및 3 ％ (v/v) 글리세롤을 함유한다) 의 100 ㎖ 로 옮기고, 30 ℃ 에서 12 시간 진탕 배양을 행하였다. 그 후, 배지의 상징으로부터 키티나아제를 회수하고, 6 ％ (w/v) 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE 로 키티나아제의 정제도를 확인하였다. 배지로부터의 키티나아제의 회수는 이하와 같이 하여 행하였다. 배지에 키틴 (400 ㎎, 와코준야쿠사 제조) 을 첨가한 후, 4 ℃ 에서 12 시간 교반하고, 원심하여 펠릿으로 하였다. 펠릿을 나트륨 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl) 으로 3 회 세정하고, SDS 샘플 완충액 (63 mM 트리스염산 (pH 6.8), 10 ％ (v/v) 글리세롤, 2 ％ (w/v) SDS, 0.002 ％ (w/v) BPB, 1 ㎖) 으로 5 분간 보일함으로써 키티나아제를 추출하였다. 겔의 염색은 Coomassie Brilliant Blue R-250 에 의해 행하였다.
[예 22]
omh1 변이주에 대하여, 예 21 과 동일한 방법으로 키티나아제의 해석을 행하였다.
예 21 및 22 의 결과를 도 9 에 나타낸다. 레인 1 은 야생주 S. 폼베, 레인 2 는 omh1 변이주의 결과를 나타낸다.
도 9 에 나타내는 바와 같이, 레인 1 및 레인 2 에 있어서 단일 밴드가 검출 되어 있고, S. 폼베 야생주 및 omh1 변이주로부터 회수한 키티나아제는 모두 단일 단백질로서 정제되었음이 확인되었다. 또한, 예 6 (도 5, 레인 2) 와 마찬가지로, omh1 변이주에서는 분자량의 감소가 관찰되었다.
다음으로, O-글리코사이드형 당 사슬의 구조에 관한 추가적인 정보를 얻기 위하여, S. 폼베 야생주 및 omh1 변이주로부터 정제한 키티나아제 (O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질) 의 당 사슬을 히드라진 분해에 의해 유리하고, 환원 말단을 피리딜아미노 (PA) 화하고 HPLC 에 의해 분석을 행하였다.
[예 23]
예 21 에 있어서 키틴으로부터 추출한 키티나아제로부터 SDS 를 제거하기 위하여, MilliQ 수 (초순수) 에 대하여 투석을 행한 후, 동결 건조를 행하였다. S. 폼베 야생주로부터 1 ㎎ 의 동결 건조 분말을 얻었다.
다음으로, 동결 건조 분말의 키티나아제 0.3 ㎎ 를 히드라클럽 C-206 (J 오일밀즈사 제조) 을 이용하여 히드라진 분해를 행하였다. 다음으로, 얻어진 유리 당 사슬 샘플을 피리딜아미노화제 (20 ㎕) 와 함께 90 ℃ 에서 60 분 가열하고, 이어서 환원제 (20 ㎕) 를 첨가하고, 80 ℃ 에서 35 분 가열함으로써, 당 사슬의 환원 말단에 2-아미노피리딘을 부가하였다. 여분의 피리딜아미노화제 및 환원제는 페놀/클로로포름 (체적비는 50/50) 추출에 의해 제거하였다.
다음으로, 얻어진 샘플에 대하여 순상 HPLC 분석 (칼럼 : Amide-80 column (4.6 ㎜ × 75 ㎜), 토소사 제조) 를 행하였다. 당 사슬의 분자 사이즈는 PA 라벨링한 표준 마커인 PA 화 만노오스, PA 화 말토오스, PA 화 이소말토올리고당 (다카라바이오사 제조) 에 의해 결정하였다.
[예 24]
예 22 에 있어서 키틴으로부터 추출한 키티나아제로부터 SDS 를 제거하기 위하여, MilliQ 수에 대하여 투석을 행한 후, 동결 건조를 행하였다. omh1 변이주로부터 0.5 ㎎ 의 동결 건조 분말을 얻었다. 그 후, 예 23 과 동일하게 하여 순상 HPLC 분석을 행하였다.
예 23 및 24 의 순상 HPLC 분석의 결과를 도 10 에 나타낸다. 도 10 에 있어서, (a) 는 S. 폼베 야생주, (b) 는 omh1 변이주의 결과를 나타낸다.
도 10(a) 에 나타내는 바와 같이, S. 폼베 야생주에서는, 주로 디사카라이드 (도 10 의 (Hex)2-PA), 테트라사카라이드 (도 10 의 (Hex)4-PA) 에 상당하는 피크가 확인되었다. 이에 대하여, 도 10(b) 에 나타내는 바와 같이, omh1 변이주에서는 대략 디사카라이드에 상당하는 피크만이 확인되었다.
[예 25]
S. 폼베 야생주 (예 23) 및 omh1 변이주 (예 24) 에서 확인된 디사카라이드의 피크의 구조를 상세하게 분석하기 위하여, 디사카라이드의 피크를 분취 정제하고, 역상 HPLC 분석 (칼럼 : ODS-80 Ts column (4.6 ㎜ × 150 ㎜), 토소사 제조) 을 행하였다. 또한, 분취 정제한 디사카라이드에 대하여 α-갈락토시다아제 (시그마사 제조 G8507, 커피콩 유래) 에 의한 소화, α-만노시다아제 (시그마사 제조 M7257, 잭콩 유래) 에 의한 소화를 행한 후에, 동일하게 역상 HPLC 분석을 행하였다.
역상 HPLC 분석의 결과를 도 11 에 나타낸다. 도 11 의 (a) 와 (e) 는 표준 당 사슬인 Man-PA 와 Man-Man-PA (Man α1-2 Man-PA) 의 유지 시간을 나타낸다. 또한, 도 11(b) ∼ (d) 는 S. 폼베 야생주의 분석 결과, 도 11(f) ∼ (h)는 omh1 변이주의 분석 결과를 나타내고 있고, 도 11 의 (b) 및 (f) 가 분취 정제 후, (c) 및 (g) 가 α-갈락토시다아제 소화 후, (d) 및 (f) 가 α-만노시다아제 소화 후의 분석 결과이다.
도 11(b), 및 (f) 에 나타내는 바와 같이, S. 폼베 야생주 및 omh1 변이주의 디사카라이드는 주로 단일 피크로 이루어지는 것이 확인되고, Man α1-2 Man-PA 의 표준 당 사슬의 유지 시간과는 상이함이 확인되었다. 또한, 양 주의 디사카라이드 샘플은 α-만노시다아제에 의한 처리에서는 분해되지 않고 (도 11 의 (d) 와 (h)), α-갈락토시다아제에 의해 분해되어 모두 Man-PA 가 되었다 (도 11 의 (c) 와 (g)).
이들 결과로부터, S. 폼베 야생주에서 발현시킨 키티나아제의 디사카라이드가 주로 O-Man-Gal 로 이루어지는 것, omh1 변이주에서 발현시킨 키티나아제의 모든 당 사슬이 O-Man-Gal 로 이루어지는 것이 나타나고, 이종 단백질 발현시에도, 그 당 사슬 구조가 세포 표면의 갈락토만난과 동일한 당 사슬 구조로 이루어지는 것이 나타났다.
산업상 이용가능성
본 발명의 형질 전환체는 결합하는 O-글리코사이드형 당 사슬의 구조를 제어한 이종 단백질을 제조할 수 있다. 그 때문에, 그 형질 전환체를 이용한 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법은 의료 분야 등에 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 2008년 10월 1일에 출원된 일본 특허출원 2008-256354호, 및 2009년 5월 15일에 출원된 일본 특허출원 2009-119280호의 명세서, 특허 청구의 범위, 도면 및 요약서의 전체 내용을 여기에 인용하고, 본 발명의 명세서의 개시로서 도입하는 것이다.
Claims (10)
- omh1 유전자가 결실 또는 실활된 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 로 이루어지는 숙주로서, 유전자 공학적 방법에 의해 이종 단백질을 코드하는 유전자를 발현시키고, 또한 발현된 이종 단백질에 당 사슬을 결합시켜, O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조의 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 생산시키기 위한 숙주.
- omh1 유전자가 결실 또는 실활된 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 를 숙주로 하여, 이종 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 형질 전환체.
- 제 2 항에 있어서,
또한, 상기 이종 단백질을 코드하는 유전자의 5' 말단에 결합한 상기 시조사카로미세스·폼베 내에서 기능하는 분비 시그널을 코드하는 유전자를 포함하는 형질 전환체. - 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 이종 단백질에 대응하는 야생형 단백질이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖고 있는 단백질인 형질 전환체. - omh1 유전자가 결실 또는 실활된 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 를 숙주로 하여, 이종 단백질을 코드하는 유전자를 상기 숙주에 삽입하는 것을 특징으로 하는 형질 전환체의 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 이종 단백질을 코드하는 유전자의 5' 말단측에 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 내에서 기능하는 분비 시그널을 코드하는 유전자를 갖는 형질 전환체의 제조 방법. - 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 이종 단백질에 대응하는 야생형 단백질이 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖고 있는 이종 단백질인 형질 전환체의 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를 배양하여, 생산된 O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조를 갖는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법.
- 제 8 항에 있어서,
생산되는 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질의 당 사슬이 당해 이종 단백질에 대응하는 야생형 이종 단백질의 당 사슬의 유무나 당 사슬 구조에 관계 없이, O-Man-Gal 인 디사카라이드 구조를 갖는 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법. - 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
형질 전환체를 배양한 배양액으로부터 O-글리코사이드형 당 사슬을 갖는 이종 단백질을 취득하는 O-글리코사이드형 당 사슬 함유 이종 단백질의 제조 방법.
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