JP5248735B2 - 酵母の形質転換方法 - Google Patents
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MM培地:Alfa C, Fantes P, Hyams J, McLeod M, and Warbrick E. Experiments with fission yeast: A laboratory course manual. Plainview: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.pp 134.
YES培地:Moreno S, Klar A, and Nurse P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. In: Guthrie C, Fink GR eds. Methods in Enzymology. Volume 194: Guide to yeast genetics and molecular biology. San Diego: Academic Press, Inc., 1991: 795-823.pp801.
固体培地上での培養時間は特に限定されないが、1日〜10日程度が好ましく、培養効率を高めるためには、1日〜5日間培養して形質転換に供することが好ましい。また、最小限の栄養成分しか含まない上記のような固体培地には必要により栄養源を添加して使用することができる。この追加の栄養源は多すぎると転換効率が低下しやすい。飢餓状態の菌ほど転換効率が高いといわれることもあるが、栄養源が少なすぎると菌の発育が不充分となるおそれがある。本発明における固体培地としてはグルコースなどの糖を5%以下添加した上記のようなSD固体培地等を使用することが好ましい。
酵母菌体をMM固体培地上で3日間培養し、そこにできたコロニーを、直接100μLの処理溶液[10μLのpAL水溶液(1.0μgのpALを含む)、10μLのキャリアDNA水溶液(100μgのキャリアDNAを含む)、70μLの処理原水溶液(50w/vのPEG4000、100mMの酢酸リチウム、10mMのTris−HClおよび1mMのEDTAを含む:pH=4.9)および残余の水を混合して100μLとしたもの]に加え、30℃で1日間インキュベーション後、42℃で15分ヒートショック処理し、選択培地上に塗布し、培養して形質転換体の数を測定した。図1に持ち込み菌体数と形質転換菌体数との関係を示す。
持ち込み菌体を5×107個(/100μL処理溶液)として、処理用液中のpALの量を変える以外は実施例1と同じ実験を行った。その結果、処理溶液100μLあたり0.5μgより少ない場合は、形質転換効率は500個/μgDNA以下になり(0.1μgのpALの場合、315個/μgDNA)、効率的形質転換はできないことがわかった。
酵母菌体をSD固体培地上、MM固体培地上、YES固体培地上でそれぞれ3日間培養し、そこにできたコロニーをそれぞれ持ち込み菌体量を5×107個(/100μL処理溶液)として使用し、実施例1と同じ実験を行った。図2に固体培地の種類によるインキュベーション時間と形質転換菌体数との関係を示す。
持ち込み菌体を5×107個(/100μL処理溶液)として、処理用液中のキャリアーDNA量を変化させる以外は実施例1と同じ試験を行った。キャリアーDNAを100μgまで増加させたところ、形質転換効率の上昇が確認できたが、キャリアーDNA量がpALの20倍質量未満の場合、形質転換効率は500個/μgDNA以下になり、効率的形質転換はできないことがわかった。図3にキャリアDNA量と形質転換転換菌体数との関係を示す。
Claims (3)
- 分裂酵母を形質転換用DNAで形質転換して形質転換体を製造する方法において、形質転換用DNA、キャリアDNA、ポリエチレングリコールおよびリチウム塩を含む緩衝液からなる処理溶液に、SD(Synthetic Dextrose)固体培地上で培養した酵母菌体を形質転換用DNA1μgあたり1×107個以上添加して30分以上インキュベーションすること、並びに、前記処理溶液がその100μLあたり形質転換用DNAを0.5〜10μg、キャリアDNAを該形質転換用DNAに対し20倍質量以上含むことを特徴とする分裂酵母の形質転換方法。
- マイクロプレートを使用して形質転換を行う、請求項1に記載の方法。
- 分裂酵母がシゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)である、請求項1または2に記載の方法。
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