TW202323515A - 具有降低之降解丙烯酸之傾向之酵母細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於經基因改造以降低其降解某些平台化學物質，諸如丙烯酸之傾向的酵母細胞，以及製備此類酵母細胞及將其用於產生丙烯酸及其他化合物之方法。

Description

具有降低之降解丙烯酸之傾向之酵母細胞
本發明係關於經基因改造以降低其降解某些平台化學物質，諸如丙烯酸之傾向的酵母細胞，以及製備此類酵母細胞及將其用於產生丙烯酸及其他化合物之方法。
丙烯酸(Acrylic acid；AA)為市售重要化學物質。截至2025年，預期AA之生產能力達到900萬噸，且其市場大小為$200億。其現行生產視石油化學製程而定，其為不可持續且環境不友好的。自可再生非食物生物質產生AA已存在大量關注。
已嘗試組合生物催化及化學催化方法。在一種方法中，首先以微生物方式產生乳酸(lactic acid；LA)。但利用LA之脫水的後續AA產生由於其抗水解性而證明為困難的。近年來，達成藉由使由微生物醱酵產生之3-羥基丙酸(3-HP)脫水來產生AA。歸因於其高能量消耗及由催化劑、純化及分離步驟引起之額外成本，此組合方法並不提供優於基於石油之產品的實質性益處。
一些實施例包括一種製備對丙烯酸具有改良耐受性之酵母的方法，其包含允許酵母在丙烯酸之存在下繁殖。
在一些實施例中，酵母之某些基因修飾降低某些化合物(特定言之丙烯酸)在酵母細胞(諸如彼等釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae； S. cerevisiae))中之降解。
一些實施例包括一種組合物，其包含酵母、丙烯酸及酵母生長培養基。
一些實施例包括藉由一種方法製備之酵母，該方法包含允許酵母在丙烯酸之存在下繁殖。
一些實施例包括一種對丙烯酸具有耐受性之酵母，其包含具有非天然存在之基因突變或改造的酵母，其中該酵母具有當該酵母在600 nm下於參考丙烯酸組合物中之光學密度為0.2時，該酵母繁殖以使得該酵母之光學密度在30小時內增加0.2至0.4的特性，其中該參考丙烯酸組合物由以下組成：1.8 g/L丙烯酸、20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4•7H 2O、50 μg/L d-生物素、1 mg/L D-泛酸半鈣鹽、1 mg/L硫胺素-HCl、1 mg/L吡哆醇-HCl (Pyridoxin-HCl)、1 mg/L菸鹼酸、0.2 mg/L 4-胺基苯甲酸、25 mg/L m-肌醇、3 mg/L FeSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L ZnSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L CaCl 2∙2H 2O、1 mg/L MnCl 2∙4H 2O、0.3 mg/L CoCl 2∙6H 2O、0.3 mg/L CuSO 4∙5H 2O、0.4 mg/L Na 2MoO 4∙2H 2O、1 mg/L H 3BO 3、0.1 mg/L KI及19 mg/L Na 2EDTA∙2H 2O。
一些實施例包括一種經基因改造之釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae； S. cerevisiae)，其具有使得該釀酒酵母合成以下的對野生型之基因體之改造：經改造之ACH1、WAR1、NHA1、TRK1、ALD3、PMA1、GLG2、MIX23、ATG26、SYT1、SNF3、ARR3、TRS33、GPR1、OCT1、TPO1、MET2、RPC82或其組合。
自可再生資源研發AA之單步醱酵生產可為解決上文所描述之問題的替代性解決方案。釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae； S. cerevisiae)可潛在地研發用於醱酵產生所關注之化學物質的具有改良特性之釀酒酵母菌株。
已發現釀酒酵母可降解丙烯酸，因此限制培養物中之AA效價。進一步發現某些基因改造產生具有降低之降解丙烯酸之傾向，同時具有用於AA產生之潛在應用的酵母菌株。
使用包含酵母及丙烯酸以及視情況選用之酵母生長培養基之適應性實驗室演變(Adaptive laboratory evolution；ALE)的組合物來起始酵母之ALE。
酵母包含在丙烯酸之存在下需要改良耐受性的任何類型之酵母，諸如釀酒酵母。
酵母生長培養基可含有酵母提取物、碳水化合物、肽及抗生素、磷酸鹽、硫酸鹽或其組合。在一些實施例中，酵母生長培養基包含酵母提取物、碳水化合物、肽及抗生素、磷酸鹽及硫酸鹽。
酵母生長培養基可包括任何適合之酵母提取物，例如無細胞壁之酵母之細胞內含物。
酵母生長培養基可包括任何適合之碳水化合物，其包括單醣(諸如葡萄糖)、雙醣(諸如蔗糖)、多醣(諸如澱粉)等。在一些實施例中，碳水化合物包括瓊脂、葡萄糖或其組合。在一些實施例中，碳水化合物包括瓊脂。在一些實施例中，碳水化合物包括葡萄糖。
酵母生長培養基可包括任何適合之肽，諸如蛋白腖，例如蛋白質部分水解之水溶性產物。
酵母生長培養基可包括任何適合之抗生素，諸如G418二硫酸鹽、安比西林鈉(ampicillin sodium)或其組合。
酵母生長培養基可包括任何適合之磷酸鹽，諸如KH 2PO 4。
酵母生長培養基可包括任何適合之硫酸鹽，諸如(NH 4) 2SO 4、MgSO 4·7H 2O或其組合。
酵母生長培養基可包括維生素溶液，例如呈約0.1至10 mL/L、約0.1至2 mL/L、約2至4 mL/L、約4至6 mL/L、約6至8 mL/L、約8至10 mL/L或約1 mL/L之濃度的維生素溶液。
適合之維生素溶液可含有d-生物素(例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至100 μg/L、約40至60 μg/L或約50 μg/L之d-生物素的量)、D-泛酸(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之半鈣鹽或莫耳當量之另一形式的量)、硫胺素(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之HCl鹽或莫耳當量之另一形式的量)、吡哆醇(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之HCl鹽或莫耳當量之另一形式的量)、1 mg/L菸鹼酸(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之酸形式或莫耳當量之鹽形式的量)、4-胺基苯甲酸(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至0.5 mg/L、約0.1至0.3 mg/L或約0.2 mg/L之酸形式或莫耳當量之鹽形式的量)、m-肌醇(例如，呈使得酵母生長培養基含有約5至200 mg/L、約20至30 mg/L或約25 mg/L之量)，或其組合。
一些實施例包括d-生物素(例如，呈使得酵母生長培養基含有50 μg/L之量)、D-泛酸半鈣鹽(例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、硫胺素-HCl (例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、吡哆醇-HCl (例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、菸鹼酸(例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、4-胺基苯甲酸(例如，呈使得酵母生長培養基含有0.2 mg/L之量)，及m-肌醇(例如，呈使得酵母生長培養基含有25 mg/L之量)。
酵母生長培養基可包括痕量金屬溶液，例如呈約0.1至10 mL/L、約0.1至2 mL/L、約2至4 mL/L、約4至6 mL/L、約6至8 mL/L、約8至10 mL/L或約1 mL/L之濃度的痕量金屬溶液。
適合的痕量金屬溶液可含有FeSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有0.5至10 mg/L、約2至4 mg/L或約3 mg/L之∙7H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、ZnSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至10 mg/L、約4至5 mg/L或約4.5 mg/L之∙7H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CaCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至10 mg/L、約4至5 mg/L或約4.5 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、MnCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之∙4H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CoCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至6 mg/L、約0.2至0.4 mg/L或約0.3 mg/L之∙6H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CuSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至6 mg/L、約0.2至0.4 mg/L或約0.3 mg/L之∙5H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、Na 2MoO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至8 mg/L、約0.3至0.5 mg/L或約0.4 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、H 3BO 3(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之H 3BO 3或莫耳當量之其鹽的量)、KI (例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.01至1 mg/L、約0.05至0.15 mg/L或約0.1 mg/L之KI或莫耳當量之另一碘化鹽的量)、Na 2EDTA∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至40 mg/L、約10至30 mg/L或約19 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)，或其組合。
在一些實施例中，痕量金屬溶液含有FeSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有0.5至10 mg/L、約2至4 mg/L或約3 mg/L之∙7H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、ZnSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至10 mg/L、約4至5 mg/L或約4.5 mg/L之∙7H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CaCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至10 mg/L、約4至5 mg/L或約4.5 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、MnCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之∙4H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CoCl 2(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至6 mg/L、約0.2至0.4 mg/L或約0.3 mg/L之∙6H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、CuSO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至6 mg/L、約0.2至0.4 mg/L或約0.3 mg/L之∙5H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、Na 2MoO 4(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.05至8 mg/L、約0.3至0.5 mg/L或約0.4 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)、H 3BO 3(例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.1至10 mg/L、約0.5至1.5 mg/L或約1 mg/L之量)、KI (例如，呈使得酵母生長培養基含有約0.01至1 mg/L、約0.05至0.15 mg/L或約0.1 mg/L之量)及Na 2EDTA∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有約1至40 mg/L、約10至30 mg/L或約19 mg/L之∙2H 2O形式或莫耳當量之另一形式的量)。
一些實施例包括FeSO 4∙7H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有3 mg/L之量)、ZnSO 4∙7H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有4.5 mg/L之量)、CaCl 2∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有4.5 mg/L之量)、MnCl 2∙4H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、CoCl 2∙6H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.3 mg/L之量)、CuSO 4∙5H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.3 mg/L之量)、Na 2MoO 4∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.4 mg/L之量)、H 3BO 3(例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、KI (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.1 mg/L之量)、Na 2EDTA∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有19 mg/L之量)，或其組合。
一些實施例包括FeSO 4∙7H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有3 mg/L之量)、ZnSO 4∙7H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有4.5 mg/L之量)、CaCl 2∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有4.5 mg/L之量)、MnCl 2∙4H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、CoCl 2∙6H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.3 mg/L之量)、CuSO 4∙5H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.3 mg/L之量)、Na 2MoO 4∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.4 mg/L之量)、H 3BO 3(例如，呈使得酵母生長培養基含有1 mg/L之量)、KI (例如，呈使得酵母生長培養基含有0.1 mg/L之量)及Na 2EDTA∙2H 2O (例如，呈使得酵母生長培養基含有19 mg/L之量)。
ALE之組合物之pH可用KOH或另一鹼調節至約4-6，諸如約5，且例如用檸檬酸及/或磷酸鹽緩衝液，諸如97 mL/L 0.5 M檸檬酸及103 mL/L之1 M Na 2HPO 4緩衝。
為了製備對丙烯酸具有改良耐受性之酵母，使ALE之組合物中之酵母在丙烯酸之存在下繁殖。一般而言，ALE製程以較低濃度之丙烯酸開始，且隨時間推移逐漸增加丙烯酸之濃度以促進對丙烯酸具有增加之耐受性的新酵母生物體之演變。在一些實施例中，本文所揭示之釀酒酵母酵母菌株防止丙烯酸降解，或比野生型釀酒酵母相比降解丙烯酸更少或更緩慢地降解丙烯酸。
初始ALE組合物中之酵母之量可為任何適合量。酵母濃度可適宜地藉由OD600定量，該OD600為ALE組合物在600 nm波長下之光學密度。在一些實施例中，初始ALE組合物之OD600為約0.01至0.1、約0.01至0.03、約0.03至0.06、約0.06至0.1、約0.04至0.06或約0.05。
ALE製程通常以對酵母略微耐受之丙烯酸濃度開始，諸如至少約0.05 g/L、約0.05至1 g/L、約0.1至0.3 g/L、約0.3至0.6 g/L、約0.6至1 g/L、約0.05至0.1 g/L、約0.1至0.2 g/L、約0.2至0.3 g/L、約0.3至0.4 g/L、約0.4至0.5、約0.5至0.6 g/L、約0.6至0.7 g/L、約0.7至0.8 g/L、約0.8至0.9 g/L或約0.9至1 g/L。
在ALE製程期間，使ALE之組合物中的酵母繁殖。此可在任何適合的溫度下發生，諸如在約1℃至200℃、約5℃至100℃、約100℃至150℃、約150℃至200℃、約1℃至10℃、約10℃至20℃、約20℃至30℃、約25℃至35℃、約30℃至40℃、約40℃至60℃、約60℃至80℃或約80℃至100℃之溫度下發生。
丙烯酸之增加可藉由逐步連續方法(例如隨時間推移連續添加少量丙烯酸)或藉由逐步方法(例如以精密間隔添加增加量之丙烯酸)進行，但在逐步方法中，丙烯酸之間隔及量可自一種添加變化為另一種添加。
丙烯酸濃度之增加速率可為經24小時時段之任何適合速率，諸如約0.005至0.5 g/L、約0.005至0.01 g/L、約0.01至0.02 g/L、約0.02至0.03 g/L、約0.03至0.04 g/L、約0.04至0.05 g/L、約0.05至0.06 g/L、約0.06至0.07 g/L、約0.07至0.08 g/L、約0.08至0.09 g/L、約0.09至0.1 g/L、約0.1至0.2 g/L、約0.2至0.3 g/L、約0.3至0.4 g/L或約0.4至0.5 g/L，或經較長或較短時段之等效速率。舉例而言，經24小時時段之0.005至0.5 g/L將等效於經12小時時段之0.0025至0.25 g/L或經48小時時段之0.01至1 g/L。
對於丙烯酸之連續添加，丙烯酸濃度之增加速率可為例如58至5787 ng∙L -1∙s -1、約58至116 ng∙L -1∙s -1、約116至231 ng∙L -1∙s -1、約231至347 ng∙L -1∙s -1、約347至463 ng∙L -1∙s -1、約463至579 ng∙L -1∙s -1、約579至694 ng∙L -1∙s -1、約694至810 ng∙L -1∙s -1、約810至926 ng∙L -1∙s -1、約926至1042 ng∙L -1∙s -1、約1042至1157 ng∙L -1∙s -1、約1157至2315 ng∙L -1∙s -1、約2315至3472 ng∙L -1∙s -1、約3472至4630 ng∙L -1∙s -1或約4630至5787 ng∙L -1∙s -1。
對於丙烯酸之逐步添加，丙烯酸之濃度可以任何適合之間隔增加，諸如至少1小時、約1小時至約4週、約1至200小時、約1至8小時、約8至16小時、約16至24小時、約24至30小時、約30至36小時、約36至48小時、約48至72小時、約72至96小時、約1至7天、約7至14天、約2至4週、約20至30小時或約24小時。
對於以24小時間隔添加丙烯酸，丙烯酸之增加可為任何適合量，諸如約0.005至0.5 g/L、約0.005至0.01 g/L、約0.01至0.02 g/L、約0.02至0.03 g/L、約0.03至0.04 g/L、約0.04至0.05 g/L、約0.05至0.06 g/L、約0.06至0.07 g/L、約0.07至0.08 g/L、約0.08至0.09 g/L、約0.09至0.1 g/L、約0.1至0.2 g/L、約0.2至0.3 g/L、約0.3至0.4 g/L或約0.4至0.5 g/L。對於其他間隔，丙烯酸之增加可處於上述範圍中之任一者內，適當增加或減少至等效增加速率。舉例而言，經24小時時段之0.005至0.5 g/L將等效於經12小時時段之0.0025至0.25 g/L或經48小時時段之0.01至1 g/L。
逐步添加丙烯酸可在一系列繁殖循環中進行。繁殖循環包含增加丙烯酸之濃度、添加額外酵母生長培養基及允許酵母再次繁殖。可進行任何適合量之繁殖循環，諸如額外1至100、1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90或90至100個繁殖循環。額外繁殖循環為丙烯酸濃度之第一次增加、額外酵母生長培養基之添加及允許酵母在已使酵母在初始條件下繁殖持續一間隔之後繁殖。繁殖循環可經任何適合之時段進行，諸如至少1小時、約1小時至約4週、約1至200小時、約1至8小時、約8至16小時、約16至24小時、約24至30小時、約30至36小時、約36至48小時、約48至72小時、約72至96小時、約1至7天、約7至14天、約2至4週、約20至30小時或約24小時。
雖然可以多種方式進行繁殖循環，但在一些實施例中，將一體積之ALE組合物例如藉由轉移而稀釋至具有較高丙烯酸濃度之新鮮培養基中，諸如丙烯酸之增加量對應於上述段落中所敍述之丙烯酸濃度之增加速率。可進行稀釋以達成某一酵母水平，諸如與OD600相關之酵母水平為約0.01至0.2、約0.01至0.05、約0.05至0.1、約0.1至0.15、約0.15至2、約0.08至0.12或約0.1。
可繼續ALE直至達成所要程度之丙烯酸耐受性。在一些實施例中，在進行約5至20、約5至10、約10至15或約15至20個繁殖循環之後停止ALE而酵母生長速率無可觀測的增加。在一些實施例中，在生長速率不存在可觀測的增加持續約3至28天、約7至21天、約12至16天或約14天之後停止ALE。
一些實施例包括一種製備對丙烯酸具有改良耐受性之酵母的方法，其包含允許酵母在丙烯酸之存在下繁殖。在一些實施例中，使酵母在存在至少0.05 g/L丙烯酸之情況下繁殖。在一些實施例中，在已使酵母在丙烯酸之存在下繁殖至少約1小時之後增加丙烯酸之濃度。關於上述實施例中之任一者，在一些實施例中，該方法進一步包含執行至少一個額外繁殖循環，其中繁殖循環包含：增加丙烯酸之濃度、添加額外酵母生長培養基及允許酵母再次繁殖。在一些實施例中，進行額外1至100個繁殖循環。在一些實施例中，進行額外30至40個繁殖循環。關於此段落中之上述任何實施例，在一些實施例中，使酵母在約5℃至約100℃之溫度下繁殖。關於此段落中之上述任何實施例，在一些實施例中，使酵母在各繁殖循環中繁殖約1小時至約200小時。關於此段落中之上述任何實施例，在一些實施例中，使酵母在各繁殖循環中繁殖約20小時至約30小時。關於此段落中之上述任何實施例，在一些實施例中，在兩週時段期間生長速率不存在可觀測的增加之後停止繁殖循環。
本文所描述之方法可用於製備經改變酵母，諸如對丙烯酸具有耐受性之酵母(例如釀酒酵母)。在一些實施例中，此類酵母包含具有並非天然存在之基因突變或改造的酵母，其中該酵母具有當該酵母在600 nm下於參考丙烯酸組合物中之光學密度為0.2時，該酵母繁殖以使得該酵母之光學密度在30小時內自0.2增加至0.4的特性，其中該參考丙烯酸組合物由以下組成：含1.8 g/L丙烯酸之代爾夫特培養基(Delft media) (20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4•7H 2O、50 μg/L d-生物素、1 mg/L D-泛酸半鈣鹽、1 mg/L硫胺素-HCl、1 mg/L吡哆醇-HCl、1 mg/L菸鹼酸、0.2 mg/L 4-胺基苯甲酸、25 mg/L m-肌醇、3 mg/L FeSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L ZnSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L CaCl 2∙2H 2O、1 mg/L MnCl 2∙4H 2O、0.3 mg/L CoCl 2∙6H 2O、0.3 mg/L CuSO 4∙5H 2O、0.4 mg/L Na 2MoO 4∙2H 2O、1 mg/L H 3BO 3、0.1 mg/L KI及19 mg/L Na 2EDTA∙2H 2O)。
本文所描述之酵母可適用於諸如藉由在酵母之存在下使葡萄糖醱酵來製備丙烯酸。
在一些實施例中，經基因改造或突變之酵母不產生式R-(C=O)-COA之醯基-CoA化合物，其中R為具有5個原子或更少之碳鏈。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對下表1中之蛋白質或肽中之一者的胺基酸序列之改造。 表 1.
蛋白質或肽 縮寫
乙酸CoA-轉移酶及乙醯基-CoA水解酶 ACH1
PDR12之轉錄因子 WAR1
Na+/H+反向轉運蛋白 NHA1
鉀離子跨膜轉運體 TRK1
醛去氫酶 ALD3
質膜ATP酶 PMA1
肝醣核心蛋白葡萄糖基移酶 GLG2
粒線體膜間隙CX(n)C模體蛋白 MIX23
固醇3-β-葡萄糖基移酶 ATG26
Arf蛋白質之鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF) SYT1
質膜低葡萄糖感測器 SNF3
亞銻酸鹽及亞砷酸鹽跨膜轉運體 ARR3
轉運蛋白粒子(TRAPP)複合物I、II及IV之核心組分 TRS33
G蛋白偶聯受體 GPR1
粒線體中間肽酶 OCT1
主要易化子超家族之多元胺轉運體 TPO1
L-高絲胺酸-O-乙醯轉移酶 MET2
RNA聚合酶III亞單位C82 RPC82
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1之胺基酸序列之改造，諸如：R334G、A367T、T383K、V353F、G393E、fsN137、H439Y、Q275K或其組合；或對WAR1之胺基酸序列之改造，諸如W936L。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對NHA1之胺基酸序列之改造，諸如：H164D、E290K或其組合；或對TRK1之胺基酸序列之改造，諸如：S144F、R8975、N750K、P11635、L764F或其組合。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ALD3之胺基酸序列之改造，諸如F295L；對PMA1之胺基酸序列之改造，諸如D591V；對GLG2之胺基酸序列之改造，諸如Q144P；對MIX23之胺基酸序列之改造，諸如T17K；對ATG26之胺基酸序列之改造，諸如Y599C；對SYT1之胺基酸序列之改造，諸如E126V；或對SNF3之胺基酸序列之改造，諸如V509I。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ARR3之胺基酸序列之改造，諸如N401K；對TRS33之胺基酸序列之改造，諸如T178K；對GPR1之胺基酸序列之改造，諸如A622E或A622P；對OCT1之胺基酸序列之改造，諸如R90P。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對TPO1之胺基酸序列之改造，諸如V256F；或對MET2之胺基酸序列之改造，諸如Q343K、H372L或其組合。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對RPC82之胺基酸序列之改造，諸如D84G。
在對胺基酸序列之上述改造中，標號指示胺基酸變化之位置且哪個胺基酸置換原始肽中之胺基酸。舉例而言，改造R334G至ACH1意謂在ACH1中，第334胺基酸在經改造酵母中自野生型之精胺酸(R)變為甘胺酸(G)。胺基酸之符號展示於下表2中。改造fsN137至ACH1意謂自肽序列缺失第137胺基酸(其為天冬醯胺(N))。 表 2.
胺基酸 符號
丙胺酸 A
精胺酸 R
天冬醯胺 N
天冬胺酸 D
半胱胺酸 C
麩醯胺酸 Q
麩胺酸 E
甘胺酸 G
組胺酸 H
異白胺酸 I
白胺酸 L
離胺酸 K
甲硫胺酸 M
苯丙胺酸 F
脯胺酸 P
絲胺酸 S
蘇胺酸 T
色胺酸 W
酪胺酸 Y
纈胺酸 V
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1或WAR1之胺基酸序列之改造；及對NHA1或TRK1之胺基酸序列之改造，諸如：S144F、R8975、N750K、P11635、L764F或其組合。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1及NHA1之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1及ALD3之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、PMA1及ARR3之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1及TRK1之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、TRK1、GLG2及TR533之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、NHA1、MIX23、GPR1、TPO1及RPC82之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、TRK1及ATG26之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、NHA1及SYT1之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對WAR1及TRK1之胺基酸序列之改造。
在一些實施例中，對丙烯酸具有增加之耐受性的酵母可為使其基因體具有改造之釀酒酵母，該改造產生對ACH1、TRK1、SNF3、OCT1及MET2之胺基酸序列之改造。
在上述實施例中，除所描述之改造以外，經改造之釀酒酵母可與野生型釀酒酵母具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%同源性，至多100%同源性。 表 3.對釀酒酵母之核酸及蛋白質改造的序列資訊
基因體基因座 改造 野生型蛋白質 改造
Chr II, 194944 (Seq. ID 1) 野生型 ACH1 (Seq. ID 2) 野生型
Chr II, 194944 A1000G ACH1 R334G
Chr II, 194944 G1099A ACH1  A367T
Chr II, 194944 C1148A ACH1  T383K
Chr II, 194944 G1057T ACH1  V353F
Chr II, 194944 G1178A ACH1  G393E
Chr II, 194944 C411缺失 ACH1  fsN137
Chr II, 194944 C1315T ACH1  H439Y
Chr II, 194944 C823A ACH1  Q275K
Chr XIII, 112541 (Seq. ID 3) 野生型 WAR1 (Seq. ID 4) 野生型
Chr XIII, 112541 G2807T WAR1 W936L
Chr XII, 419304 (Seq. ID 5) 野生型 NHA1 (Seq. ID 6) 野生型
Chr XII, 419304 C490G NHA1 H164D
Chr XII, 419304 G868A NHA1 E290K
Chr X, 173820 (Seq. ID 7) 野生型  TRK1 (Seq. ID 8) 野生型
Chr X, 173820 C431T TRK1 S144F
Chr X, 173820 C2689A TRK1 R8975
Chr X, 173820 C2250G TRK1 N750K
Chr X, 173820 C3487T TRK1 P11635
Chr X, 173820 A2292T TRK1 L764F
在表3中，改造標號與用於肽之標號類似。舉例而言，「A1000G」意謂腺嘌呤(A) (第1000核苷酸)經鳥嘌呤(G)置換。上表中所列之其他核苷酸為胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)。
在一些實施例中，具有非天然存在之基因突變或改造之酵母(例如釀酒酵母)具有當酵母在600 nm下於參考丙烯酸組合物中的初始光學密度為約0.05至0.5、約0.05至0.1、約0.1至0.2、約0.2至0.3、約0.05、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4或約0.5時，丙烯酸濃度在48小時內減少小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於20%或小於10%的特性，其中該參考丙烯酸組合物最初由以下組成：50至200 mg/L、約80至85 mg/L或約160至170 mg/L或約0.08 mg/mL之丙烯酸、20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4•7H 2O、50 μg/L d-生物素、1 mg/L D-泛酸半鈣鹽、1 mg/L硫胺素-HCl、1 mg/L吡哆醇-HCl、1 mg/L菸鹼酸、0.2 mg/L 4-胺基苯甲酸、25 mg/L m-肌醇、3 mg/L FeSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L ZnSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L CaCl 2∙2H 2O、1 mg/L MnCl 2∙4H 2O、0.3 mg/L CoCl 2∙6H 2O、0.3 mg/L CuSO 4∙5H 2O、0.4 mg/L Na 2MoO 4∙2H 2O、1 mg/L H 3BO 3、0.1 mg/L KI及19 mg/L Na 2EDTA∙2H 2O。
涵蓋以下實施例： 實施例 1.一種降低釀酒酵母之丙烯酸降解之方法，其包含將丙烯酸暴露於經基因改造之釀酒酵母，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之ACH1、經改造之WAR1或其組合。 實施例 2.如實施例1之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之NHA1、經改造之TRK1或其組合。 實施例 3.如實施例1或2之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之ACH1。 實施例 4.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為R334G之變化。 實施例 5.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為A367T之變化。 實施例 6.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為T383K之變化。 實施例 7.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為V353F之變化。 實施例 8.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為G393E之變化。 實施例 9.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為fsN137之變化。 實施例 10.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為H439Y之變化。 實施例 11.如實施例3之方法，其中該經改造之ACH1包含為Q275K之變化。 實施例 12.如實施例1或2之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之WAR1。 實施例 13.如實施例12之方法，其中該經改造之WAR1包含為W936L之變化。 實施例 14.如實施例2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之NHA1。 實施例 15.如實施例14之方法，其中該經改造之NHA1包含為H164D之變化。 實施例 16.如實施例14之方法，其中該經改造之NHA1包含為E290K之變化。 實施例 17.如實施例2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之TRK1。 實施例 18.如實施例17之方法，其中該經改造之TRK1包含為S144F之變化。 實施例 19.如實施例17之方法，其中該經改造之TRK1包含為R8975之變化。 實施例 20.如實施例17之方法，其中該經改造之TRK1包含為N750K之變化。 實施例 21.如實施例17之方法，其中該經改造之TRK1包含為P11635之變化。 實施例 22.如實施例17之方法，其中該經改造之TRK1包含為L764F之變化。 實施例 23.一種具有降低之丙烯酸降解的經基因改造之釀酒酵母，其藉由如實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22之方法製備。 實施例 24.一種具有降低之丙烯酸降解的酵母，其包含具有非天然存在之基因突變或改造的酵母，其中該酵母具有當該酵母在600 nm下於參考丙烯酸組合物中之初始光學密度為0.1時，丙烯酸濃度在48小時內減少小於60%的特性，其中該參考丙烯酸組合物最初由以下組成：80 mg/L至85 mg/mL之丙烯酸、20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4•7H 2O、50 μg/L d-生物素、1 mg/L D-泛酸半鈣鹽、1 mg/L硫胺素-HCl、1 mg/L吡哆醇-HCl、1 mg/L菸鹼酸、0.2 mg/L 4-胺基苯甲酸、25 mg/L m-肌醇、3 mg/L FeSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L ZnSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L CaCl 2∙2H 2O、1 mg/L MnCl 2∙4H 2O、0.3 mg/L CoCl 2∙6H 2O、0.3 mg/L CuSO 4∙5H 2O、0.4 mg/L Na 2MoO 4∙2H 2O、1 mg/L H 3BO 3、0.1 mg/L KI及19 mg/L Na 2EDTA∙2H 2O。
實例 實例 1 方法 菌株、 DNA 操縱及培養基菌株釀酒酵母CEN.PK113-7D (MATa MAL2-8c SUC2)、CEN.PK113-5D ()及CEN.PK113-1A (MATα MAL2-8c SUC2)獲自Scientific Research and Development GmbH (Oberursel, Germany)。基於CEN.PK113-7D (GL01)之菌株獲自(Pereira等人，2019)，且用於ALE實驗中。對於釀酒酵母中之AA產生，引入β-丙胺酸介導之路徑且在背景菌株IMX581中經工程改造，得到菌株BA01。大腸桿菌( E. coli) DH5α用於質體分離及維持。
寡核苷酸購自IDT或Genscript。使用來自ThermoFisher之Platinum SuperFi II DNA聚合酶進行PCR。用來自凱傑之各別套組進行質體提取及PCR產物純化。
在含有10 g/L蛋白腖、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物且補充有100 mg/L之安比西林鈉鹽的盧里亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani；LB)培養基進行大腸桿菌中之質體之選擇及維持。固體LB亦包括16 g/L瓊脂。
對於選擇具有KANMX標記物之釀酒酵母菌株，使用含有10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白腖、20 g/L葡萄糖且補充有200 mg/L G418硫酸氫鹽(SigmaAldrich)的酵母提取物蛋白腖右旋糖(YPD)培養基。對於使用Ura標記物之選擇，在不添加尿嘧啶之情況下製備標準基本培養基。藉由添加20 g/L瓊脂來製備任一培養基之固體型式。
所有生長及演變實驗均在由(Verduyn等人，1992)描述之含有以下之基本培養基中進行：20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4·7H 2O、1 mL/L維生素溶液及1 mL/L痕量金屬溶液。用KOH將培養基之pH調節至5.0且在此pH下藉由添加97 mL/L 0.5 M檸檬酸及103 mL/L 1 M Na 2HPO 4來緩衝。
使用KH 2PO 4將AA調節至pH 5，且製成0.1 g/mL之儲備濃度。
對於AA產生，使用用於搖瓶培養之代爾夫特基本培養基，其含有20 g/L葡萄糖、7.5 g/L (NH 4) 2SO 4、14.4 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4·7H 2O、1 mL/L維生素溶液及2 mL/L痕量金屬溶液。用KOH將培養基之pH調節至6.5。將β-丙胺酸添加至3 g/L之濃度。
生長篩選所有生長測試均在生長測繪器960 (Enzyscreen)中使用96半深孔微量培養盤進行，其中培養體積為250 μL，以250 rpm攪動，溫度控制在30℃且初始OD600為0.05。藉由在OD600相對於時間之自然對數之曲線中找到最高斜率來計算各菌株之最大比生長速率。
適應性實驗室演變 (ALE)使用含有丙烯酸之培養基中之連續培養，以自0.3 g/L增加至2 g/L之濃度演變菌株GL01。演變六種獨立培養物。隨著釀酒酵母繁殖，其最初使用葡萄糖作為食物。此稱為葡萄糖階段。當葡萄糖耗竭時，釀酒酵母使用乙醇作為食物。此稱為乙醇階段。在此實驗中，選擇兩個初始AA濃度，使得在24小時內，六種培養物中之三者將處於乙醇階段，且其他三者將處於葡萄糖階段。將培養物在30℃振盪器中在200 rpm下於30 mL燒瓶中連續繁殖。
每24小時量測各培養物之OD600，且計算待轉移至新鮮培養基之舊培養物之體積以使得新培養物之起始OD600將為0.1。調節新培養物中之AA濃度以使得其將在二十四小時內達到指定生長期(乙醇或葡萄糖)。記錄各燒瓶之終止OD600，且將各培養物之甘油儲備液保存於-80冷凍器中。當在兩週時段期間生長速率不存在可觀測的增加(如由終止OD600之增加所反映)時，停止演變實驗。
DNA 提取及定序將自演變群體分離之純系在YPD培養基中培養過夜。血液及細胞培養物DNA微型套組(Blood & Cell Culture DNA Mini Kit) (Qiagen, location)用於使用製造商推薦之方案自3 mL之過夜酵母培養物(約5×10 8個細胞)提取基因體DNA。在Illumina ®定序平台上執行雙端定序(pair-end sequencing)，其中在各端處之讀數長度為PE150 bp，且每個樣品之基因體覆蓋率為100×。
AA 分析方法藉由以13,000 rpm離心10 min來收集培養物。接著經由0.22 μm PVDF針筒過濾器(視情況選用的)過濾上清液。使用高效液相層析(HPLC)分析AA濃度。AA標準化學物質購自Sigma-Aldrich (AA，147230)。管柱為Eclipse C18 plus管柱(5 μm，4.6×150 mm，Agilent)。C18管柱之溫度設定為30℃。移動相：(A) 0.1%磷酸(85 wt%於H 2O中)於再蒸餾水(v/v)中及(B)乙腈。流動速率為0.8 mL/min。
運行程序如下： 0−5 min，0% B； 5−14 min，B之線性梯度為0%至70%； 14−15 min，B之線性梯度為70%至100%； 15−17 min，100% B； 17−18 min，B之線性梯度為100%至0%； 18−19 min，0% B。
利用經工程改造之釀酒酵母的 AA 產生將經工程改造之菌株BA01擴散於SD-ura培養盤上且在30℃下培育三天。自培養盤選取單一群落，且用於使預先培養物在30℃下於2 mL代爾夫特基本培養基(針對搖瓶培養物)中生長18至30小時。量測預培養物之OD600，且將適合量之細胞用於10 mL新鮮培養物(代爾夫特基本培養基加3 g/L β-丙胺酸)中，其中初始OD600為0.05。在48、72及96小時獲取樣品，且如所描述進行分析。
定序資料分析經由BWA軟體將有效定序資料與參考序列(釀酒酵母S288c；R64-2-1)比對。使用SAMtools偵測SNP及InDel。使用BreakDancer偵測SV。使用CNVnator偵測CNV。使用ANNOVAR標註所有變異體。定製工具用於減去野生型(GL01)對照背景。
菌株構築具有點突變或單一核苷酸插入/缺失之反向工程改造菌株可使用(Laughery等人，2015)中所描述之單一gRNA方法構築。基於網站之資源可用於根據與待取代之核苷酸的接近度及使用同義取代使PAM位點不活化之可能性，幫助選擇最佳gRNA位點。修復模板可經設計以引入所需突變且使PAM位點不活化，且經合成為兩個互補寡核苷酸。側接兩個50 bp序列之所需20 bp gRNA目標序列(無PAM位點)可合成為兩個互補120 bp寡核苷酸，該等兩個50 bp序列與可用質體上之gRNA位點同源。該對互補寡核苷酸可以等莫耳量混合且藉由將混合物加熱至95℃持續5 min且使其在室溫下冷卻來退火。可使用諸如Gibson Assembly之標準方法將雙股gRNA插入物選殖至能夠進行Cas9表現及gRNA表現之適合質體中。視質體上之選擇標記物而定，使用諸如(Gietz及Woods，2006)之高效率方案，可用2 μg之各別基因之雙股修復片段將100 ng之各gRNA+Cas9質體共轉型至適合菌株中。轉型混合物可視菌株及質體而定擴散於含有適合選擇藥物之培養盤上。可挑取個別群落，且可進行經改造區之PCR擴增。PCR產物之定序可允許確認成功地引入各突變。
結果 演變酵母菌株之生長在ALE之35傳代之後，在各種AA濃度下在代爾夫特基本培養基(pH 5)中測試演變菌株，其中野生型菌株GL01作為對照。下圖中顯示在1.8 g/L丙烯酸之存在下四(4)種演變菌株(35E23、35E32、35G13、35G32)及GL01對照的生長曲線。菌株名稱以傳代次數開始，其中G指示葡萄糖階段轉移(phase transfer)，且E指示乙醇階段轉移。對於字母之後的數字，第一數位為培養數目(1至3)，且第二數位為分離數目(1至8)。觀測到與野生型對照相比生長之各種程度的改良。
計算E組或G組中最佳菌株以及野生型對照在若干不同丙烯酸濃度(0、0.7及1.8 g/L)下之最大比生長速率，且顯示於表4中。圖1展示1.8 g/L丙烯酸濃度下之生長曲線。 表 4 .比較演變菌株與野生型之間的生長速率
[AA] (g/L) 菌株 μ max(h -1) 滯後時間(h)
0 35 E 0.43 ±0.01 1
35 G 0.43 ± 0.00 1
GL01 0.41 ± 0.00 1
0.7 35 E 0.23 ± 0.04 3.3 ± 1.2
35 G 0.23 ± 0.03 2.7 ± 1.0
GL01 0.08 ± 0.00 8.8 ± 1.1
1.8 35 E 0.10 ± 0.02 9.2 ± 3.1
35 G 0.11 ± 0.03 6.7 ± 2.8
GL01 0.025 ± 0.003 22 ± 2.8
演變酵母菌株之定序在來自具有葡萄糖階段轉移之傳代91的AA演變菌株中偵測之變異體呈現於表5中。 表 5 .所偵測變異體之實例
基因座 基因 變化
        
91G14      
Chr I, 225859 PHO11 N134D (A--＞G)
Chr II, 194944 ACH1 Q275K (C--＞A)
Chr III, 270021 FIG2 T863R (C--＞G)
Chr V, 20192 DSF1 Q202X (C--＞T)
Chr XI, 68366 PTK1 S619P (T--＞C)
Chr VII, 1082465 COS6 V89F (G--＞T)
Chr XII, 419304 NHA1 E290K (G--＞A)
Chr XVI, 724341 SYT1 E126V (A--＞T)
        
91G21      
Chr I, 225859 PHO11 N134D (A--＞G)
Chr XIII, 112541 WAR1 W936L (G--＞T)
Chr III, 270021 FIG2 T863R (C--＞G)
Chr V, 20192 DSF1 Q202X (C--＞T)
Chr XI, 68366 PTK1 S619P (T--＞C)
Chr VII, 1082465 COS6 V89F (G--＞T)
Chr X, 173820 TRK1 P1163S (C--＞T)
        
91G33      
Chr I, 225859 PHO11 N134D (A--＞G)
Chr II, 194531 ACH1 N137fs (C411缺失)
Chr IV, 113104 SNF3 V509I (G--＞A)
Chr XI, 191174 OCT1 R90P (G--＞C)
Chr XIV, 118375 MET2 Q343K (C--＞A)
Chr III, 270021 FIG2 T863R (C--＞G)
Chr V, 20125 DSF1 E179D (A--＞T)
Chr XI, 68366 PTK1 S619P (T--＞C)
Chr VII, 1082477 COS6 V85I (G--＞A)
Chr X, 175015 TRK1 L764F (A--＞T)
實例 2 釀酒酵母中之 AA 降解在評估酵母中之AA產生期間，發現當延長培養時間時AA之積聚減少，在大約96小時可完全降解。進一步測試野生型酵母菌株IMX581中AA降解之可能性。如圖2A至圖2D中所示，野生型酵母菌株可在大約48小時內降解AA高達300 mg/L (圖2A至圖2C)。但當AA濃度大於300 mg/L時，降解在前48小時期間變得更弱，且隨後穩定(圖2D)。
演變酵母菌株降低 AA 降解如圖3A至圖3C中所示，當測試經由ALE衍生之演變菌株時，證實其具有與野生型相比降低許多的降解AA之傾向。
參考文獻： Xu, X., Williams, T. C., et al. 2019 Biotechnology for Biofuels 12: 97 Pereira, R., Wei, Y., et al. 2019 Metabolic Engineering 56: 130 Pereira, R., Mohamed, E. T., et al. 2020 PNAS 117: 27954 WO2002042418
除非另外指示，否則本文所使用之表述成分之數量、特性(諸如分子量、反應條件等)的所有數字應理解為在所有情況下均由術語「約」改造。各數值參數應至少根據所報導之有效數位之數目且藉由應用一般捨入技術來解釋。因此，除非有相反指示，否則數值參數可根據設法達成之所需特性進行修改，且因此應被視為本發明之一部分。至少，本文所展示之實例僅用於說明，而非作為限制本發明之範疇的嘗試。
除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描繪本發明之實施例之情形下(尤其在以下實施例之情形下)使用的術語「一(a/an)」、「該(the)」及類似指示物均解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所描述之所有方法可以任何適合之次序執行。本文所提供之任何及所有實例或代表性語言(例如「諸如」)之使用僅意欲更好地說明本發明之實施例且不會對任何實施例之範疇造成限制。本說明書中之任何語言均不應理解為指示實踐本發明之實施例所必需的任何不體現之要素。
本文所揭示之替代要素或實施例之分組不應解釋為限制。可個別地或以與群組之其他成員或本文中所發現之其他要素的任何組合來參考及體現各群組成員。預期群組中之一或多個成員可出於便利性及/或專利性的原因而包括於群組中或自群組刪除。
本文描述某些實施例，包括本發明人已知用於進行實施例之最佳模式。當然，此等所描述實施例之變化形式在一般熟習此項技術者閱讀前述描述後將變得顯而易見。本發明人預期熟習此項技術者適當時採用此等變化形式，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之方式來實踐本發明之實施例。因此，實施例包括如可適用法律所准許的實施例中所敍述之主題的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則涵蓋上文所描述之要素在其所有可能變化形式中之任何組合。
總之，應理解本文所揭示之實施例說明實施例之原理。可採用之其他修改在實施例之範疇內。因此，藉助於實例但非限制，可根據本文中之教示內容來利用替代性實施例。因此，實施例不限於恰好如所展示及描述之實施例。
相關申請案之交叉參考本申請案主張2021年9月24日申請之美國臨時申請案第63/261,650號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。
序列表本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。2021年9月17日創建之該ASCII複本命名為N3253_10151US01_SL.txt且大小為46,904位元組。
圖1為描繪野生型及演變釀酒酵母菌株在1.8 g/L丙烯酸中之生長的曲線。 圖2A至圖2D為描繪在野生型釀酒酵母菌株之存在下丙烯酸隨時間推移之降解的曲線。 圖3A至圖3C為描繪在野生型或演變釀酒酵母菌株之存在下丙烯酸隨時間推移之降解的曲線。
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Claims (20)

  1. 一種降低釀酒酵母( S. cerevisiae)之丙烯酸降解之方法，其包含將丙烯酸暴露於經基因改造之釀酒酵母，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之ACH1、經改造之WAR1或其組合。
  2. 如請求項1之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之NHA1、經改造之TRK1或其組合。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之ACH1。
  4. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為R334G之變化。
  5. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為A367T之變化。
  6. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為T383K之變化。
  7. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為V353F之變化。
  8. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為G393E之變化。
  9. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為fsN137之變化。
  10. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為H439Y之變化。
  11. 如請求項3之方法，其中該經改造之ACH1包含為Q275K之變化。
  12. 如請求項1或2之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母合成經改造之WAR1。
  13. 如請求項12之方法，其中該經改造之WAR1包含為W936L之變化。
  14. 如請求項2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之NHA1。
  15. 如請求項14之方法，其中該經改造之NHA1包含為H164D之變化。
  16. 如請求項14之方法，其中該經改造之NHA1包含為E290K之變化。
  17. 如請求項2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13之方法，其中該經基因改造之釀酒酵母進一步合成經改造之TRK1。
  18. 如請求項17之方法，其中該經改造之TRK1包含為S144F、R8975、N750K、P11635、L764F或其組合的變化。
  19. 一種具有降低之丙烯酸降解的經基因改造之釀酒酵母，其係藉由如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18之方法製備。
  20. 一種具有降低之丙烯酸降解的酵母，其包含具有非天然存在之基因突變或改造的酵母，其中該酵母具有當該酵母在600 nm下於參考丙烯酸組合物中之初始光學密度為0.1時，丙烯酸濃度在48小時內減少小於60%的特性，其中該參考丙烯酸組合物最初由以下組分組成：80 mg/L至85 mg/mL之丙烯酸、20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH 4) 2SO 4、3 g/L KH 2PO 4、0.5 g/L MgSO 4•7H 2O、50 μg/L d-生物素、1 mg/L D-泛酸半鈣鹽、1 mg/L硫胺素-HCl、1 mg/L吡哆醇-HCl (Pyridoxin-HCl)、1 mg/L菸鹼酸、0.2 mg/L 4-胺基苯甲酸、25 mg/L m-肌醇、3 mg/L FeSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L ZnSO 4∙7H 2O、4.5 mg/L CaCl 2∙2H 2O、1 mg/L MnCl 2∙4H 2O、0.3 mg/L CoCl 2∙6H 2O、0.3 mg/L CuSO 4∙5H 2O、0.4 mg/L Na 2MoO 4∙2H 2O、1 mg/L H 3BO 3、0.1 mg/L KI及19 mg/L Na 2EDTA∙2H 2O。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005052182A2 (en) * 2003-11-26 2005-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
BRPI0913901A2 (pt) * 2008-06-17 2016-12-13 Genomatica Inc micro-organismos e métodos para a biossíntese de fumarato, malato e acrilato
US20140342414A1 (en) * 2011-09-22 2014-11-20 Codexis, Inc. Direct biocatalytic production of acrylic acid and other carboxylic acid compounds
WO2013059362A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Calysta Biosystems Host cells and method for making acrylate and precursors thereof using an odd-numbered alkane feedstock
CN107406821B (zh) * 2015-02-27 2021-10-15 诺维信公司 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
CN108004274B (zh) * 2018-01-19 2021-06-04 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

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