BR112020017374A2 - Vias metabólicas com rendimento de carbono aumentado - Google Patents

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Abstract

VIAS METABÓLICAS COM RENDIMENTO DE CARBONO AUMENTADO. A presente invenção se refere à conversão de uma fonte de carbono em acetil-fosfato com rendimento de carbono aumentado. Em particular, a invenção fornece micro-organismos submetidos à engenharia metabólica com capacidade para produzir acetil-fosfato de uma fonte de carbono com rendimento de carbono aumentado, sendo que os micro-organismos foram transformados com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase e que são geneticamente modificados ainda para ter atividade de transcetolase eliminada. A invenção também fornece métodos para a produção de produtos químicos com o uso dos ditos micro-organismos.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para “VIAS METABÓLICAS COM RENDIMENTO DE CARBONO AUMENTADO”
CAMPO DA TÉCNICA
[0001] O presente pedido refere-se, de modo geral, à modificação metabólica de micro-organismos. Em particular, o presente pedido se refere a micro-organismos que são submetidos à engenharia metabólica para aprimorar o rendimento de carbono de vias metabólicas, mais particularmente, para sintetizar acetil-coenzima A ou produtos derivados da mesma de uma fonte de carbono adequada com rendimento de carbono aprimorado.
ANTECEDENTES
[0002] A acetil-coenzima A (CoA) é um metabólito central em micro-organismos principais, entre outros, para a biossíntese de biocombustíveis e outros produtos químicos, tais como sem limitação, n- butanol, isobutanol, isopropanol, etanol, etc.
[0003] A acetil-CoA é derivada geralmente de glicolise que envolve a oxidação parcial e divisão de açúcares externos ou intracelulares em piruvato que é, por sua vez, descarboxilado para produzir acetil-CoA. A descarboxilação oxidativa de piruvato resulta na perda de uma molécula de CO2 a cada molécula de piruvato, desse modo, limitando o rendimento de carbono teórico a apenas dois mols de metabólitos de dois carbonos (C2) a cada mol de hexose. O CO2 residual tem um grande impacto na economia geral de processos biossintéticos em um contexto industrial.
[0004] A otimização do rendimento de carbono na conversão metabólica de uma fonte de carbono em produtos químicos de valor causa o surgimento de inúmeras vias metabólicas projetadas não naturais.
[0005] Por exemplo, uma via cíclica não oxidativa, também denominada de via Glicolítica não Oxidativa (NOG), permite a produção de quantidades estequiométrica de metabólitos C2 de fosfatos de açúcar sem perda de carbono (Bogorad et al. 2013 Nature 502:693 a 698; WO2014153036). A via de NOG existe em várias configurações, dependendo ou da atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase (Fpk) ou da atividade de xilulose-5-fosfato fosfocetolase (Xpk) ou tanto na atividade de Fpk quanto de Xpk (WO2014/153036). Além disso, existem vias de NOG dependentes de frutose-1,6-bisfosfato (FBP) e vias de NOG dependentes de sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP). Em uma via de NOG exemplificativa (Figura 1B), um fosfato de açúcar, tal como frutose-6-fosfato (F6P), é a molécula inicial. A molécula de frutose-6-fosfato é rompida em uma molécula de acetil-fosfato (AcP) e em uma molécula de eritrose-4-fosfato (E4P) pela fosfocetolase (Fpk). A eritrose-4-fosfato condensa com outra molécula de frutose-6-fosfato para gerar duas moléculas de pentose-fosfato (xilulose-5-fosfato (X5P) e ribose-5-fosfato (R5P)) após redisposições de carbono mediada por transaldolase (Tal) – transcetolase (Tkt). A ribose-5- fosfato é isomerizada em xilulose-5-fosfato (X5P) por uma ribose-5-fosfato isomerase (Rpi) e uma ribulose-3-fosfato epimerase (Rpe). Ambas as moléculas de xilulose-5-fosfato são divididas adicionalmente em duas moléculas de acetil-fosfato e em duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que, em seguida, são ambas submetidas à redisposição de carbono para regenerar a molécula de frutose 6-fosfato inicialmente investida, o que pode ocorrer de diversas maneiras, por exemplo, por meio de uma rede dependente de frutose-1,6-bisfosfato. A rede de redisposição de carbono dependente de frutose-1,6-bisfosfato envolve ribose-5-fosfato triose fosfato isomerase (Tpi), uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase (Fba) e uma frutose- 1,6-bifosfatase (Fbp).
[0006] De modo geral, há uma necessidade de processos biossintéticos com utilização eficiente de carbonos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] Em determinados micro-organismos, em particular, em C. acetobutylicum, as vias metabólicas que geram acetil-CoA e que empregam enzimas transaldolase-transcetolase, em particular, a via de NOG, não são ativas, apesar da presença de todas as enzimas necessárias. Em particular, os presentes inventores constataram um acúmulo da sedoeptulose-7-fosfato intermediária, o que limita essas vias. Sem se ater a nenhuma teoria, acredita-se que devido à rápida metabolização de gliceraldeído-3-fosfato (G3P), que é cogerada com sedoeptulose-7-fosfato (S7P) pela ação de Tal e Tkt, a S7P se acumula nessas vias, o que causa o uso ineficiente das mesmas (Figura 2).
[0008] Consequentemente, os presentes inventores constataram que a conversão de sedoeptulose-7-fosfato aumentada pode intensificar os fluxos de carbono nesses organismos por meio da ativação dessas vias metabólicas, em particular, a via de NOG. Em particular, constatou-se que mediante a introdução de uma sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase (Spk) para converter sedoeptulose-7-fosfato em acetil-fosfato e ribose-5-fosfato, o acúmulo da sedoeptulose-7-fosfato nessas vias, em particular, a via de NOG, é reduzido ou eliminado (Figura 2), o que resulta em vias mais eficientes. Outra vantagem é o fato de que essa é uma reação irreversível e, por conseguinte, constitui uma força de acionamento irreversível para vias cíclicas, tais como a via de NOG, em contrapartida à transcetolase (Tkt) e transaldolase (Tal), que são enzimas reversíveis cuja direção de ação é difícil de controlar. Além disso, a Spk é uma enzima de monossubstrato, isto é, a atividade de Spk exige um substrato único, ao passo que a Tkt e a Tal têm diversos substratos, em particular, a Tkt e Tal catalisam reações bi-bi (isto é, reações catalisadas por uma enzima única na qual dois substratos e dois produtos estão envolvidos), o que complica mais o controle de suas atividades. Além disso, a conversão produtos obtida dividindo-se sedoeptulose-7-fosfato com Spk são facilmente metabolizados adicionalmente.
[0009] Desse modo, a invenção se refere a micro- organismos submetidos à engenharia metabólica que aumentaram a conversão da acetil-fosfato de uma fonte de carbono em comparação a um micro-organismo não submetido à engenharia metabólica correspondente como um resultado da introdução de um gene exógeno que codifica uma fosfocetolase, mais particularmente, uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase. Nas modalidades, a fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase também tem atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase e/ou atividade de xilulose-5- fosfato fosfocetolase. Em modalidades particulares, a fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase é uma Bifidobacterium longum fosfocetolase ou uma variante fuincional da mesma, tal como a fosfocetolase da cepa da Bifidobacterium longum NCC2705.
[0010] Em modalidades particulares, o micro-organismo é adicionalmente selecionado ou submetido à engenharia para ter ou atividade de transcetolase eliminada ou reduzida, de preferência, atividade de transcetolase eliminada. Em determinadas modalidades, a eliminação da atividade de transcetolase é obtida deletando-se o gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transcetolase (tkt). Em modalidades particulares, a invenção fornece, então, um micro-organismo submetido à engenharia metabólica com capacidade para conversão aumentada de acetil-fosfato de uma fonte de carbono em comparação a um micro- organismo não submetido à engenharia metabólica correspondente, em que o micro-organismo compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, e em que o micro-organismo é geneticamente modificado ainda para ter atividade reduzida de transcetolase ou eliminada ou, de preferência, eliminada. Em determinadas modalidades, a invenção fornece um micro-organismo submetido à engenharia metabólica com capacidade para conversão aumentada de acetil-fosfato de uma fonte de carbono em comparação a um micro- organismo não submetido à engenharia metabólica correspondente, em que o micro-organismo compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, e uma deleção do gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transcetolase.
[0011] Em modalidades adicionais, o micro-organismo é adicionalmente selecionado ou submetido à engenharia para ter atividade de transcetolase eliminada e atividade de transaldolase eliminada. Em determinadas modalidades, a eliminação da atividade de transcetolase e atividade de transaldolase é obtida deletando-se os genes endógenos que codifica uma transcetolase (tkt) e uma transaldolase (tal). Consequentemente, em determinadas modalidades, é fornecido um micro- organismo submetido à engenharia metabólica que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, uma deleção do gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transcetolase e uma deleção do gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transaldolase.
[0012] Curiosamente, os micro-organismos em que o gene (ou genes) tkt é submetido à deleção, ou tanto o gene (ou genes) tkt quanto o gene (ou genes) tal, são viáveis, por exemplo, em meios mínimos de glicose M9. Isso é inesperado, visto que a atividade de transcetolase é necessária em micro-organismos para a produção de eritrose-4-fosfato, um precursor de aminoácidos aromáticos e vitaminas (Lee (Edição) 2009 "Systems Biology and Biotechnology of Escherichia coli", Figura 9.9).
[0013] Os micro-organismos da presente invenção são de interesse para uso em diferentes vias metabólicas, mais particularmente, para aumentar o rendimento dos produtos finais das ditas vias. Em modalidades particulares, os micro-organismos são modificados ainda até esse ponto.
[0014] Nas modalidades adicionais, os micro-organismos são submetidos à engenharia adicionalmente para facilitar uma via metabólica de conservação de carbono que gera acetil-fosfato de uma fonte de carbono, tal como uma via metabólica que converte frutose-6-fosfato em 3 moléculas de acetil-fosfato, mais particularmente, uma via metabólica que converte 1 molécula de frutose-6-fosftato e 2 moléculas de fosfato em 3 moléculas de acetil-fosfato e 2 moléculas de água.
[0015] Em modalidades particulares, os micro-organismos são caracterizados adicionalmente pelo fato de que compreendem adicionalmente ou pelo fato de que são adicionalmente submetidos à engenharia de modo que compreendam as enzimas de uma via metabólica que gera acetil-fosfato e que envolve as enzimas transaldolase- transcetolase. Constatou-se que tais vias metabólicas são mais eficientes nos micro-organismos mediante a modificação genética dos micro- organismos de modo que tenham atividade de transcetolase eliminada ou reduzida e, opcionalmente, ou atividade de transaldolase reduzida ou eliminada e mediante a introdução de um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase nesses micro-organismos.
[0016] Em modalidades mais particulares, os micro- organismos são caracterizados pelo fato de que compreendem uma ou mais, de preferência, todas, dentre uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase, uma transaldolase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma triose fosfato isomerase, uma frutose 1,6-bisfosfato aldolase e uma frutose 1,6-bisfosfatase. Opcionalmente, os micro-organismos são submetidos à engenharia para expressar ou superexpressar uma ou mais dessas enzimas. Consequentemente, em modalidades particulares, o micro- organismo é adicionalmente submetido à engenharia para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase, uma transaldolase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma triose fosfato isomerase, uma frutose 1,6-bisfosfato aldolase e uma frutose 1,6-bisfosfatase, de preferência, uma frutose 1,6-bisfosfatase.
[0017] Em modalidades mais particulares, a presença da fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase também pode aumentar a eficiência do ciclo de condensação de metanol. Consequentemente, em modalidades particulares, o micro-organismo compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7- bisfosfatase; uma hexulose-6-fosfato sintase; uma hexulose-6-fosfato isomerase; e uma metanol de-hidrogenase; ou o micro-organismo compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7- bisfosfatase; uma di-hidroxiacetona sintase; uma frutose-6-fosfato aldolase; e uma metanol de-hidrogenase. Em modalidades particulares, o micro-
organismo é adicionalmente submetido à engenharia para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7- bisfosfatase; uma hexulose-6-fosfato sintase; uma hexulose-6-fosfato isomerase; e uma metanol de-hidrogenase; ou é adicionalmente submetido à engenharia para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase; uma di-hidroxiacetona sintase; uma frutose-6-fosfato aldolase; e uma metanol de-hidrogenase.
[0018] Os micro-organismos da presente invenção também são de interesse em novas vias metabólicas que permitem a conversão estequiométrica de uma fonte de carbono em acetil-fosfato, tal como a via de GATHCYC. Em modalidades particulares, os micro-organismos compreendem uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou atividade de xilulose-5-fosfocetolase, uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; e uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase. Em modalidades adicionais, os micro-organismos são adicionalmente submetidos à engenharia para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou atividade de xilulose-5-
fosfocetolase, uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose-fosfato isomerase; uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase, de preferência, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase.
[0019] Em modalidades particulares, os micro-organismos descritos no presente documento são adicionalmente submetidos à engenharia para ter atividade reduzida ou eliminada de uma enzima envolvida em uma via concorrente (isto é, uma via que concorre com uma via metabólica que converte frutose-6-fosfato em 3 moléculas de acetil- fosfato), tal como a via de glicolise (inferior) ou de pentose fosfato. Consequentemente, em modalidades particulares, os micro-organismos são adicionalmente submetidos à engenharia para ter atividade reduzida ou eliminada de uma ou mais dentre uma fosfoglicerato quinase, uma fosfofrutoquinase e uma glicose-6-fosfato de-hidrogenase.
[0020] Em modalidades particulares, o micro-organismo da invenção é uma bactéria ou uma levedura. Em modalidades particulares, o micro-organismo da invenção é selecionado a partir das espécies E. coli ou Clostridium acetobutylicum, ou uma levedura. Em determinadas modalidades, o micro-organismo é um micro-organismo mixotrófico ou metanotrófico.
[0021] A invenção se refere adicionalmente a aplicações dos micro-organismos descritos acima. Consequentemente, a invenção se refere adicionalmente ao uso de um micro-organismo da invenção para a produção de uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é derivada de acetil-CoA. Mais particularmente, a invenção fornece métodos para a produção de uma molécula de interesse que é derivada de acetil-CoA, sendo que o dito método compreende cultivar um micro-organismo submetido à engenharia metabólica de acordo com a invenção em uma fonte de carbono adequada que pode ser metabolizada pelo dito micro-organismo. Em modalidades particulares, as ditas moléculas de interesse são selecionadas dentre policetídeos, poli-hidroxialcanoatos, hidroxiácidos (incluindo 3-hidroxipropionato, 3-hidrobutirato, 3- hidroxivalerato e 3-hidroxi-hexanoato), álcoois graxos, ácidos graxos, aminoácidos (ácido glutâmico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, sucinato, lisina, leucina, isoleucina), acetona, isopropanol, butanol, isobutanol, isobuteno e propeno.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0022] O ensinamento do presente pedido é ilustrado pelas Figuras a seguir que devem ser consideradas como ilustrativas apenas e não limitam de qualquer maneira o escopo das reivindicações.
[0023] A Figura 1 mostra vias de Glicose Não Oxidativa (NOG) exemplificativas para converter um fosfato de açúcar, em particular, frutose-6-fosfato (F6P) em 3 moléculas de acetil-fosfato (AcP), envolvendo apenas Xpk (A) apenas Fpk (B) ou Xpk e Fpk (C). Outras abreviações são: E4P: eritrose-4-fosfato; G3P: gliceraldeído-3-fosfato; S7P: sedoeptulose-7- fosfato; X5P: xilulose-5-fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona fosfato; R5P: ribose-5-fosfato; Ru5P: ribulose-5-fosfato; FBP: frutose-1,6-bisfosfato. Fpk: frutose-6-fosfato fosfocetolase; Xpk: xilulose-5-fosfato fosfocetolase; Tal: transaldolase; Tkt: transcetolase; Rpi: ribose-5-fosfato isomerase; Rpe: ribulose-3-fosfato epimerase; Tpi: triose fosfato isomerase; Fba: frutose-1,6- bisfosfato aldolase; Fbp: frutose-1,6-bifosfatase.ribose-5-fosfato.
[0024] A Figura 2 mostra o gargalo cinético das vias metabólicas que envolvem enzimas transaldolase (Tal) e transcetolase (Tkt). A ação de ambas as enzimas gera sedoeptulose-7-fosfato (S7P) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P), sendo que a última é depletada rapidamente pela ação de múltiplas outras enzimas, o que causa o acúmulo de S7P. A enzima sedohetpulose-7-fosfato fosfocetolase (spk) tem capacidade para eliminar o acúmulo de S7P. Outras abreviações são: E4P: eritrose-4-
fosfato; F6P: frutose-6-fosfato; X5P: xilulose-5-fosfato; R5P: ribose-5- fosfato; AcP: acetil-fosfato; acetilCoA: acetil-Coenzima A;
[0025] A Figura 3 mostra uma via de Glicose não Oxidativa Auxiliada por Sedoeptulose Fosfocetolase (SPANOG) para converter um fosfato de açúcar, em particular, frutose-6-fosfato (F6P) em 3 moléculas de acetil-fosfato (AcP), envolvendo apenas Spk (A), Xpk e Spk (B), Fpk e Spk (C) ou Xpk, Fpk e Spk (D). Outras abreviações são: E4P: eritrose- 4-fosfato; G3P: gliceraldeído-3-fosfato; S7P: sedoeptulose-7-fosfato; X5P: xilulose-5- fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona-fosfato; R5P: ribose-5-fosfato; Ru5P: ribulose-5-fosfato; FBP: frutose-1,6-bisfosfato; Spk: sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase; Fpk: frutose-6-fosfato fosfocetolase; Xpk: xilulose-5-fosfato fosfocetolase; Tal: transaldolase; Tkt: transcetolase; Rpi: ribose-5-fosfato isomerase; Rpe: ribulose-3-fosfato epimerase; Tpi: triose-fosfato isomerase; Fba: frutose-1,6-bisfosfato aldolase; Fbp: frutose-1,6-bifosfatase.
[0026] A Figura 4 mostra uma parte do Ciclo de Condensação de Metanol Auxiliado por Sedoeptulose Fosfocetolase (SPAMCC), em particular, a condensação de duas moléculas de moléculas de formaldeído derivadas de metanol (CH2O) e uma molécula de frutose-6- fosfato (F6P) em 4 moléculas de acetil-fosfato (AcP). Outras abreviações são: E4P: eritrose-4-fosfato; G3P: gliceraldeído-3-fosfato; S7P: sedoeptulose-7-fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona-fosfato; R5P: ribose-5- fosfato; Ru5P: ribulose-5-fosfato; SBP: sedoeptulose-1,7-bisfosfato; H6P: fosfo-hexulose; Spk: sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase. Fpk: frutose-6- fosfato fosfocetolase ; Xpk: xilulose 5-fosfato fosfocetolase; Rpi: ribose-5- fosfato isomerase; Rpe: ribulose-3-fosfato epimerase; Tpi: triose-fosfato isomerase; Sba: sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; Sbp: sedoeptulose- 1,7-bifosfatase; Hps: H6P sintase; Phi: fosfo-hexulose isomerase.
[0027] A Figura 5 mostra uma simulação de estado estável da via de NOG, conforme ilustrado na Figura 1A com fluxo constante de xilose.
[0028] A Figura 6 mostra uma simulação de estado estável da via de SPANOG, conforme ilustrado na Figura 3D.
[0029] Figura 7 mostra um Ciclo de Alto Rendimento de Carbono Alternativo de Glicose (GATHCYC) para converter um fosfato de açúcar, em particular, frutose 6-fosfato (F6P) em 3 moléculas de acetil- fosfato (AcP). Outras abreviações são: E4P: eritrose 4-fosfato; G3P: gliceraldeído 3-fosfato; S7P: sedoeptulose 7-fosfato; X5P: xilulose 5-fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona fosfato; R5P: ribose 5-fosfato; Ru5P: ribulose 5- fosfato; SBP: sedoeptulose 1,7-bisfosfato; Spk: sedoeptulose fosfocetolase. Fpk: frutose 6-fosfato fosfocetolase ; Xpk: xilulose 5-fosfato fosfocetolase; Rpi: ribose 5-fosfato isomerase; Rpe: ribulose 5-fosfato epimerase; Tpi: triose fosfato isomerase; Sba: sedoeptulose 1,7-bisfosfato aldolase; Sbp: sedoeptulose 1,7-bifosfatase.
[0030] A Figura 8 mostra uma via de glicose não oxidativa auxiliada por sedoeptulose fosfocetolase (SPANOG) (A) e uma via de ciclo de alto rendimento de carbono alternativo de glicose (GATHCYC) (B) na levedura, em particular, em S. cerevisae. Os genes nativos de S. cerevisiae estão em itálico e em caixa-alta; genes não nativos estão em itálico. As reações de fosfocetolase (Fpk, Spk, Xpk) são todas catalisadas pela B. longum fosfocetolase (Xfspk).
[0031] A Figura 9 mostra a sequência de nucleotídeos do gene fosfocetolase da Bifidobacterium longum NCC2705 (SEQ ID NO:3), otimizada por códon para S. cerevisiae.
[0032] Figura 10 mostra glicolise superior e a via de Pentose Fosfato em uma levedura recombinante, em particular, S.
cerevisae com fundo de GATHCYC. O fundo de tkl1Δ tkl2Δ zwf1Δ exige um ciclo de GATHCYC funcional para produzir R5P a partir de glicose.
[0033] Figura 11 mostra os resultados do teste in vitro da via de GATHCYC na levedura S. cerevisae. Um ensaio de fosfocetolase in vitro foi realizado em extratos livres de células cruas, com frutose-6-fosfato (F6P) 90 mM como substrato, por 2 h à temperatura ambiente Ambas as cepas tiveram o genótipo GATHCYC, porém JH10 também foi shb17Δ de modo que a completa utilização do ciclo GATHCYC fosse bloqueada (via- negativa). A) O primeiro teste com 130 µg de proteína total em todos os poços resultou em uma concentração final de AcP de 10,9 mM para JH9 (via-positiva) e 4,0 mM para JH10 (via-negativa). B) O segundo teste com 170 µg de proteína total resultou em uma concentração final de AcP de 15,7 mM para JH9 e 5,6 mM para JH10. As cepas foram cultivadas em triplicatas biológicas (com exceção do segundo teste, em que JH9 usou duplicatas biológicas) e testadas em duplicatas técnicas. Os asteriscos (*) indicam uma diferença significativa (p<0,001, teste t de student de bilateral com variância igual).
[0034] A Figura 12 mostra os resultados de uma PCR de colônia das colônias JH18 e JH19. Um genótipo ZWF1 knockout resultou em uma banda de 895 bp, ao passo que um ZWF1 intacto mostrou uma banda de 2.413 bp.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0035] Salvo quando definido de outro modo, todos os termos usados na revelação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado conforme entendido comumente por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. A título de mais orientação, as definições de termo são incluídas a fim de melhor observar os ensinamentos da presente invenção.
[0036] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", “o” e "a" incluem tanto o plural quanto o singular salvo quando o contexto indicar de outro modo.
[0037] Os termos “compreender”, “compreende” e “compreendido de”, conforme usado no presente documento, são sinônimos de “incluir”, “inclui” ou “conter”, “contém” e são inclusivos ou ilimitados e não excluem membros, elementos ou etapas de método não recitados adicionais. Quando a referência é feita às modalidades como compreendendo determinados elementos ou etapas, isso também abrange modalidades que consistem essencialmente nos elementos ou etapas recitadas.
[0038] A recitação de faixas numéricas por pontos finais inclui todos os números e frações subsumidos dentro das respectivas faixas, assim como os pontos finais recitados.
[0039] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento com referência a um valor mensurável, tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, significa abranger variações de +/-10% ou menos, de preferência, +/-5% ou menos, com mais preferência, +/-1% ou menos e, ainda com mais preferência, +/-0,1% ou menos do a partir do valor especificado, desde que tais variações sejam apropriadas para realizar na invenção revelada. Deve-se entender que o valor ao qual o modificador "cerca de" se refere também é especificamente e, de preferência, revelado.
[0040] Todos os documentos citados no presente relatório descritivo estão incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade.
[0041] Conforme usado no presente documento, os termos "microbiano", "organismo microbiano" ou "micro-organismo" devem significar qualquer organismo que existe como uma célula microscópica que está incluída dentro dos domínios de arquea, bactéria ou eucariota.
Portanto, o termo deve abranger células procarióticas ou eucarióticas ou organismos que têm um tamanho microscópico e incluem bactérias, arquaea e eubactéria de todas as espécies assim como micro-organismos eucarióticos, tais como fungos, incluindo leveduras e algas. O termo também inclui culturas células de quaisquer espécies que podem ser cultivadas para a produção de um produto bioquímico.
[0042] Os termos "submetido(a) à engenharia genética" ou "geneticamente modificado(a)" ou "recombinante(s)", conforme usado no presente documento com referência a um organismo hospedeiro, em particular, um micro-organismo, ou uma célula hospedeira, denotam um organismo ou célula de ocorrência não natural, assim como progênie recombinante, que tem pelo menos uma alteração genética não constatada em uma cepa de ocorrência natural das espécies citadas, incluindo cepas do tipo selvagem das espécies citadas. Tal modificação genética é obtida tipicamente por meios técnicos (isto é, não naturais) através de intervenção humana e pode incluir, por exemplo, a introdução de um ácido nucleico exógeno e/ou a modificação de um ácido nucleico endógeno. Um organismo hospedeiro submetido à engenharia genética ou modificado também pode incluir, alternativa ou adicionalmente, a introdução de um ácido nucleico exógeno no hospedeiro, ruptura, deleção ou submissão a knockout de um gene ou um polinucleotídeo. Os termos "submetido(a) à engenharia metabólica" ou "metabolicamente modificado(a)", conforme usado no presente documento, se referem especificamente a células hospedeiras submetidas à engenharia genética ou geneticamente modificadas em que a alteração genética induz ou modificada ou altera uma via metabólica ou biossintética.
[0043] Os termos "via biossintética" ou "via metabólica" se referem a um conjunto de reações anabólicas ou catabólicas bioquímicas para converter uma espécie química em outra.
[0044] O termo "exógeno" ou "estranho", conforme usado no presente documento deve significar a molécula citada, em particular, ácido nucleico, não está naturalmente presente no organismo ou célula hospedeira.
[0045] O termo "endógeno" ou "nativo", conforme usado no presente documento denota que a molécula citada, em particular, ácido nucleico, está presente no organismo ou célula hospedeira natural não modificada.
[0046] Por "ácido nucleico" entende-se oligômeros e polímeros de qualquer comprimento composto essencialmente de nucleotídeos, por exemplo, desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos. Os ácidos nucleicos podem compreender bases de purina e/ou pirimidina e/ou outras bases de nucleotídeos naturais (por exemplo, xantina, inosina, hipoxantina), química ou bioquimicamente modificadas (por exemplo, metiladas), não naturais ou derivatizadas. A cadeia principal de ácidos nucleicos pode compreender açúcares e grupos fosfatos, conforme pode ser tipicamente constatado em RNA ou DNA e/ou um ou mais açúcares modificados ou substituído e/ou um ou mais grupos fosfato modificados ou substituídos. As modificações de grupos fosfato ou açúcares podem ser introduzidas para aprimorar a estabilidade, resistência à degradação enzimática ou alguma outra propriedade útil. Um "ácido nucleico" pode ser, por exemplo, dupla fita, parcialmente dupla fita ou fita simples. Quando for fita simples, o ácido nucleico poderá ser a fita senso ou fita antissenso. O "ácido nucleico" pode ser circular ou linear. O termo "ácido nucleico", conforme usado no presente documento, abrange, de preferência, DNA e RNA, especificamente incluindo ácidos nucleicos genômicos, recombinantes ou sintéticos de hnRNA, pré-mRNA, mRNA, cDNA, incluindo vetores.
[0047] Por "codificação" entende-se que uma sequência ou parte (ou partes) do ácido nucleico corresponde, devido ao código genético de um organismo em questão, a uma sequência particular de aminoácidos, por exemplo, a sequências de aminoácidos de um polipeptídeo ou proteína desejado, de preferência, uma enzima. A título de exemplo, os ácidos nucleicos "que codificam" um polipeptídeo ou proteína particular, por exemplo, uma enzima, podem abranger ácidos nucleicos genômicos, recombinantes ou sintéticos de hnRNA, pré-mRNA, mRNA, cDNA.
[0048] De preferência, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou proteína particular, em particular, uma enzima, pode compreender um quadro aberto de leitura (ORF) que codifica o dito polipeptídeo ou proteína. Um "quadro aberto de leitura" ou "ORF" se refere a uma sucessão de tripletos de nucleotídeos de codificação (códons) que iniciam com um códon de iniciação de transição e que terminam com um códon de terminação de tradução conhecido por si só e que não contêm qualquer códon de terminação de tradução interno no quadro e potencialmente com capacidade para codificar um polipeptídeo. Por conseguinte, o termo pode ser sinônimo de "sequências de codificação", conforme usado na técnica.
[0049] O presente pedido fornece métodos e composições, incluindo micro-organismos submetidos à engenharia metabólica, o que garante um rendimento de carbono aprimorado em comparação a um processo de descarboxilação de piruvato para a produção de acetil-fosfato. Em particular, nos métodos e composições descritos no presente documento, não há perda de carbono durante a conversão de uma fonte de carbono em acetil-fosfato.
[0050] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece micro- organismos submetidos à engenharia metabólica que compreendem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma que converte irreversivelmente sedoeptulose-7-fosfato, em particular, uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase.
[0051] Em modalidades particulares, os micro-organismos são geneticamente modificados ainda de modo que tenham atividade reduzida de transcetolase em comparação a micro-organismos que não são geneticamente modificados. Em determinadas modalidades, os micro- organismos são geneticamente modificado ainda de modo que não tenham atividade de transcetolase. Desse modo, no presente documento são fornecidos micro-organismos submetidos à engenharia metabólica que compreendem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, e em que o micro-organismo é geneticamente modificado ainda de modo que tenha atividade de transcetolase eliminada ou reduzida. Nas modalidades, os micro-organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descrita no presente documento podem não ter atividade de transaldolase reduzida ou eliminada. Nas modalidades, os micro- organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descritos no presente documento podem ter atividade reduzida ou eliminada de uma ou mais outras enzimas. Nas modalidades, os micro- organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descrita no presente documento podem ter atividade de transaldolase reduzida ou eliminada.
[0052] Nas modalidades particulares, os micro-organismos são geneticamente modificados ainda de modo que tenham atividade reduzida de transcetolase e atividade de transaldolase reduzida em comparação a micro-organismos que não são geneticamente modificados. Em determinadas modalidades, os micro-organismos são geneticamente modificados ainda de modo que não tenham atividade de transcetolase e atividade de transaldolase. Desse modo, no presente documento são fornecidos micro-organismos submetidos à engenharia metabólica que compreendem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, e em que o micro-organismo é geneticamente modificado ainda de modo que tenha atividade de transcetolase eliminada ou reduzida e atividade de transaldolase reduzida ou eliminada.
[0053] Conforme verificado anteriormente, constatou-se que a introdução de uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7- fosfato fosfocetolase elimina o acúmulo de sedoeptulose-7-fosfato nas vias metabólicas que geram acetil-fosfato e que envolve enzimas transaldolase- transcetolase, resultando na produção aumentada de aceil-fosfato. A redução ou eliminação da atividade de transcetolase tem um efeito benéfico adicional na produção de acetil-fosfato.
[0054] Os exemplos não limitativos de vias que se beneficiam da introdução de um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase e opcionalmente a redução da atividade de transcetolase incluem, sem limitação, a via glicolítica Não Oxidativa (Bogorad et al. 2013 Nature 502:693 a 698; WO2014153036), o ciclo de Calvin-Benson e o ciclo de condensação de metanol (também denominado de ciclo de alongamento de metanol) (Bogorad et al. 2014 PNAS 111:15.928 a 15.933; US20160060635).
[0055] Consequentemente, in determinadas modalidades, a invenção fornece micro-organismos submetidos à engenharia metabólica, conforme descrito no presente documento que produzem acetil-fosfato de uma fonte de carbono com o uso de uma via de glicose Não Oxidativa. Aumentando-se o consumo de sedoeptulose-7-fosfato, em particular, pela introdução de um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, o acúmulo de sedoeptulose-7-fosfato durante o uso da via de NOG é reduzido ou eliminado e, então, os efeitos de gargalo cinético são reduzidos ou eliminados, resultando em uma via de NOG mais eficiente. De fato, a sedoeptulose-7-fosfato pode inativar as enzimas de NOG, desse modo, prejudicando a dificultando via de NOG. Além disso, efeitos tóxicos no micro-organismo devido ao acúmulo de sedoeptulose-7-fosfato são reduzidos ou eliminados. Desse modo, a fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase garante que uma via de NOG esteja ativa nos micro-organismos, isto é, que o acetil-fosfato é produzido a partir de uma fonte de carbono com o uso de uma via de NOG.
[0056] Em determinadas modalidades, os micro-organismos da invenção compreendem as enzimas exigidas para converter uma fonte de carbono por meio de um fosfato de açúcar em acetil-fosfato por meio de uma via de NOG. Essas enzimas podem estar presentes de maneira endógena nos micro-organismos descritos no presente documento, ou as enzimas podem ser introduzidas nos micro-organismos descritos no presente documento, ou é possível uma combinação dos dois. Contempla- se, também, no presente documento que os micro-organismos descritos no presente documento podem ser submetidos à engenharia para superexpressar enzimas nativas.
[0057] Diferentes variações da via de NOG são possíveis e qualquer via de NOG é abrangida pelo presente documento. De fato, as vias dependentes de frutose-1,6-bisfosfato (FBP) existem, o que envolve uma transaldolase, uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase e uma frutose-1,6- bisfosfatase e as vias dependentes de sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP), o que não envolve uma transaldolase, porém exige uma sedoeptulose-1,7- bisfosfato aldolase e uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase. Além disso, para cada uma dentre essas vias dependentes de (FBP) e vias dependentes de (SBP), há variações que dependem da atividade de fosfocetolase: (1) vias de NOG que usam apenas uma fosfocetolase com atividade de frutose-6- fosfocetolase (denominado no presente documento de Fpk), (2) vias de NOG que usam apenas uma fosfocetolase com atividade de xilulose-5- fosfocetolase (denominada de Xpk no presente documento) e (3) vias de NOG que usam tanto Fpk quanto Xpk (denominadas de F/Xpk no presente documento). Os exemplos não limitativos de vias de NOG são descritos no documento nº WO 2014/153036. Em modalidades particulares, os micro- organismos descritos no presente documento compreendem (a) um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil-fosfato e eritrose-4-fosfato (E4P) da frutose-6-fosfato (F6P) e/ou a produção de acetil-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) de xilulose-5-fosfato (X5P); (b) um polipeptídeo que catalisa a conversão de frutose-6-fosfato (F6P) e E4P em sedoeptulose-7-fosfato (S7P) e G3P; opcionalmente (c) um polipeptídeo que catalisa a conversão de S7P e G3P em ribose-5-fosfato (R5P) e xilulose-5-fosfato (X5P); (d) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribose-5-fosfato (R5P) em ribulose-5-fosfato (Ru5P); (e) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribulose-5-fosfato (Ru5P) em xilulose-5-fosfato (X5P); (f) um polipeptídeo que converte gliceraldeído-3-fosfato em di- hidroxiacetona fosfato; (g) um polipeptídeo que converte di-hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato (FBP) e (h) um polipeptídeo que converte frutose-1,6-bisfosfato (FBP) em frutose-6-fosfato.
Nas modalidades adicionais particulares, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a) uma fosfocetolase (por exemplo, Fpk, Xpkou Fpk/Xpk, ou homólogo das mesmas); (b) uma transaldolase (por exemplo, Tal, ou um homólogo do mesmo); opcionalmente (c) uma transcetolase (por exemplo, Tkt, ou um homólogo do mesmo); (d) uma ribose-5-fosfato isomerase (por exemplo, Rpi, ou um homólogo do mesmo); (e) uma ribulose-5-fosfato epimerase (por exemplo, Rpe, ou um homólogo da mesma); (f) uma triose-fosfato isomerase (por exemplo, Tpi, ou um homólogo do mesmo); (g) uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase (por exemplo, Fba, ou um homólogo do mesmo) e (h) um frutose-1,6 bisfosfatase (por exemplo, Fbp ou homólogo do mesmo).
[0058] Em outras modalidades, os micro-organismos da invenção compreendem as enzimas necessárias para converter uma fonte de carbono, em particular, metanol, em acetil-fosfato por meio de um ciclo de condensação de metanol (MCC). Consequentemente, nas modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem adicionalmente (a) um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil- fosfato e eritrose-4-fosfato (E4P) de frutose-6-fosfato (F6P) e/ou a produção de acetil-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) a partir de xilulose-5-fosfato (X5P); (b) um polipeptídeo que catalisa a conversão de frutose-6-fosfato (F6P) e E4P em sedoeptulose-7-fosfato (S7P) e G3P; opcionalmente (c) um polipeptídeo que catalisa a conversão de S7P e G3P em ribose-5-fosfato (R5P) e xilulose-5-fosfato (X5P); (d) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribose-5-fosfato (R5P) em ribulose-5-fosfato (Ru5P); (e) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribulose-5-fosfato (Ru5P) em xilulose-5-fosfato (X5P); (f) um polipeptídeo que catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em di-hidroxiacetona fosfato; (g) um polipeptídeo que catalisa a conversão de di-hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3- fosfato (ou eritrose-4-fosfato (E4P)) em frutose-1,6-bisfosfato (FBP) (ou sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP)); (h) um polipeptídeo que catalisa a conversão de frutose-1,6-bisfosfato (FBP) (ou sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP)) em frutose-6-fosfato (ou sedoeptulose-7-fosfato (S7P)); (i) um polipeptídeo que catalisa a conversão de formaldeído (CH2O) e ribulose-5- fosfato (Ru5P) em hexose-6-fosfato (H6P); (j) um polipeptídeo que catalisa a conversão de hexose-6-fosfato (H6P) em frutose-6-fosfato (F6P); (k) um polipeptídeo que catalisa a conversão de metanol (CH3OH) em formaldeído (CH2O). Em outras modalidades, os micro-organismos compreendem (a')
um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil-fosfato e eritrose-4- fosfato (E4P) de frutose-6-fosfato (F6P) e/ou a produção de acetil-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) de xilulose-5-fosfato (X5P); (b') um polipeptídeo que catalisa a conversão de frutose-6-fosfato (F6P) e E4P em sedoeptulose-7-fosfato (S7P) e G3P; opcionalmente (c') um polipeptídeo que catalisa a conversão de S7P e G3P em ribose-5-fosfato (R5P) e xilulose-5-fosfato (X5P); (d') um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribose-5-fosfato (R5P) em ribulose-5-fosfato (Ru5P); (e') um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribulose-5-fosfato (Ru5P) em xilulose-5-fosfato (X5P); (f') um polipeptídeo que catalisa a conversão de gliceraldeído-3- fosfato em di-hidroxiacetona fosfato; (g') um polipeptídeo que catalisa a conversão de di-hidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3-fosfato (ou eritrose-4-fosfato (E4P)) em frutose-1,6-bisfosfato (FBP) (ou sedoeptulose- 1,7-bisfosfato (SBP)); (h') um polipeptídeo que catalisa a conversão de frutose-1,6-bisfosfato (FBP) (ou sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP)) em frutose-6-fosfato (ou sedoeptulose-7-fosfato (S7P)); (i') um polipeptídeo que catalisa a conversão de formaldeído (CH2O) e xilulose-5-fosfato (X5P) em gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicerona di-hidroxiacetona (DHA); (j') um polipeptídeo que catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicerona di-hidroxiacetona (DHA) em frutose-6-fosfato (F6P); (k') um polipeptídeo que catalisa a conversão de metanol (CH3OH) em formaldeído (CH2O). Nas modalidades adicionais particulares, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a) uma fosfocetolase (por exemplo, Fpk, Xpkou Fpk/Xpk ou homólogos das mesmas); (b) uma transaldolase (por exemplo, Tal, ou um homólogo das mesmas); opcionalmente (c) uma transcetolase (por exemplo, Tkt, ou um homólogo das mesmas); (d) uma ribose-5-fosfato isomerase (por exemplo, Rpi, ou um homólogo da mesma); (e) uma ribulose-5-fosfato epimerase (por exemplo, Rpe, ou um homólogo da mesma); f) uma triose-fosfato isomerase (por exemplo, Tpi, ou um homólogo da mesma); (g) uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase (por exemplo, Fba, Sba, ou um homólogo da mesma); e (h) uma frutose-1,6 bisfosfatase ou sedoeptulose-1,7-bisfosfatase (por exemplo, Fbp, Sbp, ou um homólogo da mesma); (i) uma hexulose-6-fosfato sintase (por exemplo, Hps, ou um homólogo da mesma); (j) uma hexulose-6-fosfato isomerase, (por exemplo, Phi, ou um homólogo da mesma); (k) metanol de-hidrogenase (por exemplo, Mdh ou um homólogo da mesma). Em outras modalidades adicionais particulares, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a) uma fosfocetolase (por exemplo, Fpk, Xpkou Fpk/Xpk ou homólogos das mesmas); (b) uma transaldolase (por exemplo, Tal, ou um homólogo da mesma); opcionalmente (c) uma transcetolase (por exemplo, Tkt, ou um homólogo da mesma); (d) uma ribose-5-fosfato isomerase (por exemplo, Rpi, ou um homólogo da mesma); (e) uma ribulose-5-fosfato epimerase (por exemplo, Rpe, ou um homólogo da mesma); f) uma triose-fosfato isomerase (por exemplo, Tpi, ou um homólogo da mesma); (g) uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase (por exemplo, Fba, Sba, ou um homólogo da mesma); e (h) uma frutose-1,6 bisfosfatase ou sedoeptulose- 1,7-bisfosfatase (por exemplo, Fbp, Sbp, ou um homólogo da mesma); (i') uma di-hidroxiacetona sintase (por exemplo, Das, ou um homólogo da mesma); (j') uma frutose-6-fosfato aldolase (por exemplo, Fsa, ou um homólogo da mesma); (k') metanol de-hidrogenase (por exemplo, Mdh ou um homólogo da mesma).
[0059] Ainda em outras modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem as enzimas exigidas para converter uma fonte de carbono por meio de um fosfato de açúcar, em particular, frutose-6-fosfato, em acetil-fosfato por meio da via de ciclo de alto rendimento de carbono alternativo de glicose (GATHCYC) (Figura 7).
Essa via de GATHCYC é uma nova via metabólica de conservação de carbono para conversão estequiométrica de uma fonte de carbono em acetil-fosfato, em que um fosfato de açúcar, tal como frutose-6-fosfato (F6P), é a molécula inicial.
A molécula de frutose-6-fosfato é rompida em uma molécula de acetil-fosfato (AcP) e em uma molécula de eritrose-4- fosfato (E4P) por uma fosfocetolase (Fpk). A eritrose-4-fosfato é condensada com uma molécula de di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) para gerar uma molécula de sedoeptulose-1,7-bisfosfato (SBP) por uma ação de sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase(Sba). A sedoeptulose-1,7-bisfosfato é defosforilada em uma molécula de sedoeptulose-7-fosfato (S7P) por uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase (Sbp). A molécula de sedoeptulose-7-fosfato é dividida adicionalmente uma molécula de acetil-fosfato e uma molécula de ribose-5-fosfato (R5P) por uma sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase (Spk). A ribose-5-fosfato é isomerizada em xilulose-5-fosfato (X5P) por uma ribose-5-fosfato isomerase (Rpi) e uma ribulose-3-fosfato epimerase (Rpe). A xilulose-5-fosfato molécula é dividida em uma molécula de acetil-fosfato e a gliceraldeído-3-fosfato por xilulose-5-fosfato fosfocetolase (Xpk). A molécula de gliceraldeído-3-fosfato resultante é convertida por uma triose- fosfato isomerase em di-hidroxiacetona fosfato, que é condensada com a molécula de eritrose-4-fosfato, conforme descrito acima.
Vantajosamente, essa via de GATHCYC tem apenas uma atividade enzimática em comum com a via de glicolise, que permite um controle independente de glicose sobre a GATHCYC.
As enzimas dessa via de GATHCYC podem estar presentes de maneira endógena nos micro-organismos descritos no presente documento ou as enzimas podem ser introduzidas nos micro- organismos descritos no presente documento, ou é possível uma combinação dos dois.
Contempla-se, também, no presente documento que os micro-organismos descritos no presente documento podem ser submetidos à engenharia para superexpressar enzimas nativas.
Consequentemente, em modalidades particulares, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a) um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil-fosfato e eritrose-4-fosfato (E4P) de frutose-6- fosfato (F6P); (b) um polipeptídeo que catalisa a condensação de di- hidroxiacetona fosfato (DHAP) e eritrose-4-fosfato (E4P) em sedoeptulose- 1,7-bisfosfato (SBP); (c) um polipeptídeo que converte sedoeptulose-1,7- bisfosfato em sedoeptulose-7-fosfato (S7P); (d) um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil-fosfato e ribose-5-fosfato (R5P) de sedoeptulose-7-fosfato (S7P); (e) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribose-5-fosfato (R5P) em ribulose-5-fosfato (Ru5P); (f) um polipeptídeo que catalisa a conversão de ribulose-5-fosfato (Ru5P) em xilulose-5-fosfato (X5P); (g) um polipeptídeo que catalisa a produção de acetil-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) a partir de xilulose-5-fosfato (X5P); (h) um polipeptídeo que catalisa a isomerização de di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em gliceraldeído-3-fosfato (G3P). Nas modalidades adicionais particulares, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a) uma frutose-6-fosfato fosfocetolase (por exemplo, Fpk ou um homólogo da mesma); (b) uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase (por exemplo, Sba ou um homólogo da mesma); (c) uma sedoeptulose-1,7- bisfosfatase (por exemplo, Sbp ou um homólogo da mesma); (d) sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase (por exemplo, Spk ou um homólogo da mesma); (e) um ribose-5-fosfato isomerase (por exemplo, Rpi ou um homólogo da mesma); (f) um ribulose-5-fosfato epimerase (por exemplo, Rpe ou um homólogo da mesma); (g) uma xilulose-5-fosfato fosfocetolase (por exemplo, Xpk ou um homólogo da mesma); (h) uma triose-fosfato isomerase (por exemplo, Tpi ou uma homólogo da mesma). Conforme detalhado a seguir, em determinadas modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem (a') uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase, atividade de sedoeptulose-7-
fosfato fosfocetolase e atividade de xilulose-5-fosfato fosfocetolase; (b') uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase (por exemplo, Sba, ou um homólogo da mesma); (c') uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase (por exemplo, Sbp ou um homólogo da mesma); (d') uma ribose-5-fosfato isomerase (por exemplo, Rpi, ou um homólogo da mesma); (e') uma ribulose-5-fosfato epimerase (por exemplo, Rpe, ou um homólogo da mesma); e (f') uma triose-fosfato isomerase (por exemplo, Tpi , ou um homólogo da mesma).
[0060] A aplicação fornece diferentes maneiras nas quais os micro-organismos podem ser submetidos à engenharia genética para garantir a conversão irreversível de sedoeptulose-7-fosfato. No entanto, a conversão reversível de sedoeptulose-7-fosfato pode ocorrer além da dita conversão irreversível.
[0061] Nas modalidades preferenciais, os micro-organismos descritos no presente documento compreendem um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase (Spk). Por "atividade de sedoeptulose- 7-fosfato fosfocetolase" ou “atividade de Spk" entende-se, no presente documento, a capacidade para catalisar a formação de ribose-5-fosfato e acetil-fosfato a partir de sedoeptulose-7-fosfato. No entanto, é reconhecido o fato de que uma enzima, em particular, uma fosfocetolase, além da dita atividade de Spk, pode ter outras atividades de enzima, tais como atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase ou atividade de Fpk (isto é, ter capacidade para catalisar a formação de acetil-fosfato e eritrose-4-fosfato a partir de frutose-6-fosfato), e/ou atividade de xilulose-5-fosfato fosfocetolase ou atividade de Xpk (isto é, ter capacidade para catalisar a formação de acetil-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato a partir de xilulose-5-fosfato).
[0062] Em modalidades particulares, uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase (Spk) é uma fosfocetolase da Bifidobacterium longum, tal como a fosfocetolase que tem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO:1 (mtspvigtpwkklnapvseealegvdkywrvanylsigqiylrsnplmkepftredvkhrlvghwgttpg lnflighinrfiadhgqntviimgpghggpagtsqsyldgtytetfpkitkdeaglqkffrqfsypggipshfap etpgsiheggelgyalshaygaimdnpslfvpaivgdgeaetgplatgwqsnklvnprtdgivlpilhlng ykianptilsrisdeelheffhgmgyepyefvagfddedhmsihrrfaelwetiwdeicdikaaaqtdnvh rpfypmlifrtpkgwtcpkyidgkktegswrahqvplasardteahfevlknwlesykpeelfdangavk ddvlafmpkgelriganpnanggvirddlklpnledyevkevaeyghgwgqleatrrlgvytrdiiknnpr dfrifgpdetasnrlqasyevtnkqwdagyisdevdehmhvsgqvveqlsehqmegfleaylltgrhgi wssyesfvhvidsmlnqhakwleatvreipwrkpiasmnllvsshvwrqdhngfshqdpgvtsvllnkc fhndhvigiyfatdanmllaiaekcykstnkinaiiagkqpaatwltldearaelekgaaawdwastaknn deaevvlaaagdvptqeimaasdklkelgvkfkvvnvadllslqsakendealtdeefadiftadkpvlfa yhsyahdvrgliydrpnhdnfnvhgyeeegstttpydmvrvnridryeltaealrmidadkyadkidelek frdeafqfavdkgydhpdytdwvysgvntdkkgavtataatagdne, também disponível na Versão de Acesso à Proteína NCBI WP_013140548.1) ou a fosfocetolase de cepa Bifidobacterium longum NCC 2705, que tem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (M T S P V I G T P W K K L N A P V S E E A
LEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLMKEPFTREDV KHRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIADHGQNTVIIM GPGHGGPAGTSQSYLDGTYTETFPKITKDEAGLQK FFRQFSYPGGIPSHFAPETPGSIHEGGELGYALSHA YGAIMDNPSLFVPAIVGDGEAETGPLATGWQSNKLV NPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFH GMGYEPYEFVAGFDDEDHMSIHRRFAELWETIWDE ICDIKATAQTDNVHRPFYPMLIFRTPKGWTCPKYID GKKTEGSWRSHQVPLASARDTEAHFEVLKNWLESY K P E E L F D A N G A V K D D V L A F PF K G E L R I G A N P N A N G G VIRNDLKLPNLEDYEVKEVAEYGHGWGQLEATRTL GAYTRDIIKNNPRDFRIFGPDETASNRLQASYEVTN KQWDAGYISDEVDEHMHVSGQVVEQLSEHQMEGF LEAYLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLEA TVREIPWRKPIASMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDP GVTSVLLNKCFHNDHVIGIYFATDANMLLAIAEKCYK STNKINAIIAGKQPAATWLTLDEARAELEKGAAAWD WASTAKNNDEAEVVLAAAGDVPTQEIMAASDKLKE LGIKFKVVNVADLLSLQSAKENDEALTDEEFADIFTA DKPVLFAYHSYAHDVRGLIYDRPNHDNFNVHGYEE EGSTTTPYDMVRVNRIDRYELTAEALRMIDADKYAD
KIDELEKFRDEAFQFAVDNGYDHPDYTDWVYSGVN T D K K G A V T A T A A T A G D N E, também disponível no GenBank sob o Número de Acesso AAN24771.1).
[0063] Contempla-se, também, no presente documento variantes funcionais das fosfocetolases da Bifidobacterium longum descrita no presente documento. O termo "variante", quando usado em combinação com uma proteína, tal como uma enzima, por exemplo, como em "uma variante da proteína X", se refere a um proteína, tal como uma enzima, que é alterada em sua sequência em comparação à proteína X, porém que retém a atividade da proteína X, tal como a atividade enzimática, conforme detalhado acima (isto é, uma variante funcional).
[0064] Essas variantes podem ter pelo menos cerca de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, ou 65% de identidade de sequência em relação às sequências de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, de preferência, calculados sobre todo o comprimento da sequência. As mudanças de sequência podem ser de ocorrência natural, por exemplo, devido à degeneração do código genético, ou pode ser introduzida artificialmente, por exemplo, por mutagênese direcionada da respectiva sequência. Tais técnicas são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica. Em modalidades particulares, a variante funcional é uma variante não natural (ou sintética). Em modalidades particulares, a variante funcional é um homólogo. O termo "homólogo", conforme usado no presente documento em combinação com uma proteína, tal como uma enzima, por exemplo, como em "um homólogo da proteína X" se refere ao fato de que a proteína é diferente da proteína X em sua sequência, porém retém a atividade ou proteína X, tal como a atividade enzimática, conforme detalhado acima, e se origina de outras espécies, isto é, é uma sequência de ocorrência natural. Um homólogo da proteína X pode ser identificado pela pessoa versada na técnica por métodos de busca em par, tais como BLAST, e verificação da atividade correspondente.
[0065] Em modalidades particulares, a fosfocetolase que tem atividade de Spk é uma enzima sintética. Conforme usado no presente documento, uma "enzima sintética" se refere a uma proteína que não existe na natureza (isto é, de ocorrência não natural). As enzimas sintéticas podem ser derivadas de enzimas de ocorrência natural por exemplo, introduzindo-se mutações. As fosfocetolases sintéticas que têm atividade de Spk abrangida pelo presente documento podem ser derivadas de fosfocetolases conhecidas. As fosfocetolases sintéticas que têm atividade de Spk podem ser obtidas com o uso de um sistema de seleção com base em sobrevivência para evolução direcionada para a atividade de Spk em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, E. coli, que não pode crescer na glicose ou sedoeptulose na ausência de uma enzima que tem atividade de Spk, por exemplo, devido ao knockout de uma ou mais enzimas envolvidas em glicolise ou outras vias vitais. Em suma, uma biblioteca de DNA mutante é gerada de fosfocetolases conhecidas, clonadas em um vetor de expressão e transformada em uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira transformada é cultivada em sedoeptulose. As células hospedeiras que sobrevivem em glicose ou sedoeptulose são selecionadas como tendo atividade de Spk. Outras estratégias para gerar enzimas sintéticas que têm atividade de Spk são descritas em Leemhuis et al. (2009 IUBMB Life. 61:222 a 8).
[0066] A expressão ou superexpressão de uma sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase nos micro-organismos descrita no presente documento é particularmente vantajosa pelo fato de que pode empurrar irreversivelmente a via de NOG e ciclo de condensação de metanol, resultando em uma via de NOG/MCC mais eficiente (denominada no presente documento de via de glicolítica não oxidativa auxiliada por sedoeptulose fosfocetolase (SPANOG) e ciclo de condensação de metanol auxiliado por sedoeptulose fosfocetolase (SPAMCC)). Na via de SPANOG, a molécula de entrada frutose-6-fosfato e uma molécula de eritrose-4- fosfato são convertidas em sedoeptulose-7-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato por uma transaldolase semelhante a vias de NOG conhecidas, ou a sedoeptulose-7-fosfato é gerada da condensação de eritrose-4-fosfato e di- hidroxiacetona fosfato em sedoeptulose-1,7-bisfosfato por sedoeptulose- 1,7-bisfosfato aldolase (Sba) seguida por desfosforilação mediada por sedoeptulose-1,7-bisfosfatase (para vias dependentes de (SBP), que não envolvem uma transaldolase), porém, em seguida, sedoeptulose-7-fosfato é irreversivelmente convertida em ribose-5-fosfato e uma molécula de acetil- fosfato por uma enzima que tem atividade de Spk em vez de ser convertida por uma transcetolase, e o gliceraldeído-3-fosfato é convertido diretamente em di-hidroxiacetona fosfato por uma triose-fosfato isomerase (Figura 3). No ciclo de condensação de metanol auxiliado por sedoeptulose fosfocetolase, a molécula de entrada metanol é reduzida para formaldeído (CH2O) por metanol de-hidrogenase; em seguida, o formaldeído condensa é condensado com uma ribulose-5-fosfato (Ru5P) (por meio de hexulose-6- fosfato sintase (Hps) e hexulose-6-fosfato isomerase (Phi); ou por meio de di-hidroxiacetona sintase e frutose-6-fosfato aldolase) para gerar uma frutose-6-fosfato (F6P); e a frutose-6-fosfato (ou uma nova molécula de entrada frutose-6-fosfato) e uma molécula de eritrose-4-fosfato (E4P) são convertidas em sedoeptulose-7-fosfato (S7P) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) por uma transaldolase (Tal) ou a sedoeptulose-7-fosfato é gerada da condensação de uma eritrose-4-fosfato e uma di-hidroxiacetona fosfato em sedoeptulose-1,7-bisfosfato por sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase (Sba) seguida por desfosforilação mediada por sedoeptulose-1,7-bisfosfatase, porém, em seguida, contrário a vias de MCC conhecidas, a sedoeptulose-7- fosfato é convertida irreversivelmente em ribose-5-fosfato e acetil-fosfato por uma enzima que tem atividade de Spk em vez de ser convertida por uma transcetolase, e o gliceraldeído-3-fosfato é convertido diretamente em di-hidroxiacetona fosfato por uma triose-fosfato isomerase (Figura 4). Em contrapartida, a transcetolase (Tkt) e a transaldolase (Tal) que estão envolvidas na via de NOG e MCC são enzimas reversíveis cuja direção de ação é mais difícil de controlar, e essas enzimas têm diferentes substratos, o que complica ainda mais o controle da atividade das mesmas.
[0067] Em modalidades adicionais, os micro-organismos descritos no presente documento são geneticamente modificados ainda de modo que tenham atividade reduzida de transcetolase. Em determinadas modalidades, os micro-organismos são geneticamente modificado de modo que não tenham atividade de transcetolase. Nas modalidades, os micro- organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descrita no presente documento não têm atividade de transaldolase reduzida ou eliminada. Nas modalidades, os micro-organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descritos no presente documento têm atividade reduzida ou eliminada de uma ou mais outras enzimas. Nas modalidades, os micro-organismos que têm atividade de transcetolase eliminada ou reduzida descrita no presente documento têm atividade de transaldolase reduzida ou eliminada.
[0068] Nas modalidades adicionais, os micro-organismos descritos no presente documento são geneticamente modificados ainda de modo que tenham atividade reduzida de transcetolase e atividade de transaldolase reduzida. Em determinadas modalidades, os micro- organismos são geneticamente modificados de modo que não tenham atividade de transcetolase e atividade de transaldolase.
[0069] As expressões "atividade reduzida de transcetolase" e "atividade de transaldolase reduzida" dentro do contexto da presente invenção abrangem "atividade de transcetolase eliminada" e "atividade de transaldolase eliminada" respectivamente e significam uma redução na expressão de genes endógenos (incluindo knockout de expressão), que codifica a transcetolase ou a transaldolase e/ou uma redução na quantidade da proteína de transcetolase ou transaldolase nos micro- organismos e/ou significam uma redução na atividade enzimática de transcetolase ou transaldolase nos micro-organismos, todos em comparação aos micro-organismos não modificados geneticamente (isto é, micro-organismos que não foram geneticamente modificados para atividade reduzida de transcetolase ou atividade de transaldolase reduzida).
[0070] A redução na expressão pode ser determinada medindo-se a quantidade de transcrições que codificam para a proteína de transcetolase ou transaldolase(s), por exemplo; por exemplo, por meio da análise de Northern Blot ou RT-PCR. Uma redução significa, de preferência, uma redução na quantidade de transcrições de pelo menos 50%, de preferência, pelo menos 70%, com mais preferência, pelo menos 85% e, com máxima preferência, pelo menos 90% ou até mesmo 100% (isto é, deleção ou knockout de expressão) em comparação aos micro- organismos correspondentes que não foram geneticamente modificados.
[0071] A redução na quantidade da proteína de transcetolase ou transaldolase, que resulta em uma atividade reduzida de transcetolase ou de transaldolase, pode ser determinada, por exemplo, por métodos imunológicos, tais como análise de Western blot, ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Ligado à Enzima ) ou RIA (Radioimunoensaio). No presente contexto, uma redução significa, de preferência, uma redução na quantidade de proteína de transcetolase ou transaldolase em comparação a micro-organismos correspondentes que não foram geneticamente modificados por pelo menos 50%, em particular, por pelo menos 70%, de preferência, por pelo menos 85% e particularmente, de preferência, por pelo menos 90%.
[0072] Em modalidades particulares, a eliminação de uma determinada atividade enzimática, tal como a eliminação de atividade de transcetolase e/ou a eliminação de atividade de transaldolase, é obtida deletando-se o gene endógeno (ou genes endógenos) que codificam a respectiva enzima, tal como o gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transcetolase e/ou o gene endógeno (ou genes endógenos) que codifica uma transaldolase.
[0073] Nas modalidades adicionais, os micro-organismos descritos no presente documento são submetidos à engenharia adicionalmente para facilitar uma via metabólica que permite conversão estequiométrica de uma fonte de carbono em acetil-fosfato, tal como a conversão de 1 molécula de frutose-6-fosfato em 3 moléculas de acetil- fosfato, mais particularmente, a conversão de 1 molécula de frutose-6- fosfato e 2 moléculas de fosfato em 3 moléculas de acetil-fosfato e 2 moléculas de água. Exemplos não limitativas de tais vias metabólicas são a via de SPANOG, o ciclo de condensação de metanol auxiliado por sedoeptulose fosfocetolase (SPAMCC) e a via de GATHCYC, conforme descrito acima. A fim de facilitar essas vias metabólicas, uma ou mais vias competitivas podem ser submetidas à knockout nos micro-organismos descritos no presente documento, por exemplo, deletando-se uma enzima de tal via concorrente, e/ou os micro-organismos descritos no presente documento podem ser submetidos à engenharia de modo que compreendam as enzimas dessas enzimas metabólicas.
Consequentemente, nas modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento podem ser submetidos à engenharia de modo que tenham uma atividade eliminada de uma enzima de uma via concorrente, por exemplo, uma enzima de uma via concorrente pode ser deletada.
Nas modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento podem ser submetidos à engenharia de modo que expressem ou superexpressem pelo menos uma dentre as enzimas dessas vias metabólicas, isto é, uma ou mais enzimas nativas dessas vias metabólicas podem ser superexpressas, ou uma ou mais enzimas dessas vias metabólicas podem ser introduzidas ou uma combinação de superexpressão de uma ou mais enzimas e introdução de uma ou mais enzimas podem ser possíveis.
Nas modalidades, os micro-organismos descritos no presente documento pode ser adicionalmente submetidos à engenharia para expressar ou superexpressar pelo menos uma dentre as enzimas dessas vias metabólicas e para ter atividade eliminada de uma enzima de uma via concorrente.
Em modalidades particulares, os micro- organismos descritos no presente documento são submetidos à engenharia adicionalmente de modo que tenham atividade reduzida ou eliminada de uma enzima envolvida em glicolise (inferior) (por exemplo, PGK1 ou um homólogo da mesma) e/ou uma enzima da via de Pentose Fosfato (por exemplo, zwf1 ou um homólogo da mesma). Em modalidades particulares, os micro-organismos descritos no presente documento são adicionalmente submetidos à engenharia para ter atividade reduzida ou eliminada de uma ou mais dentre uma fosfoglicerato quinase, uma fosfofrutoquinase e uma glicose-6-fosfato de-hidrogenase.
Em modalidades adicionais, os micro- organismos descritos no presente documento são submetidos à engenharia adicionalmente para ter uma deleção de pelo menos um gene selecionado a partir de um gene que codifica uma fosfoglicerato quinase (por exemplo, PGK1 ou um homólogo da mesma), um gene que codifica uma fosfofrutoquinase (por exemplo, PFK ou um homólogo da mesma) e um gene que codifica uma glicose-6-fosfato de-hidrogenase (por exemplo, zwf1 ou um homólogo da mesma).
[0074] Ainda em outras modalidades adicionais, os micro- organismos descritos no presente documento são submetidos à engenharia adicionalmente para garantir que a conversão de acetil-fosfato em acetil- CoA, que pode ser convertida adicionalmente para produzir, por exemplo, porém sem limitação, butanol, isobutanol, 2-pentanona e semelhantes. A fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8) é uma enzima que catalisa a reação química de acetil-CoA + fosfato em CoA + acetil-fosfato e vice-versa. A fosfato acetiltransferase é codificada em E.coli por pta. A PTA envolvida na conversão de acetato em acetil-CoA. Especificamente, a PTA catalisa a conversão de acetil-CoA em acetil-fosfato. Os homólogos e variantes de PTA são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0075] Em determinadas modalidades, os micro-organismos são submetidos à engenharia adicionalmente para garantir a produção de uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é derivada de acetil-CoA. Por exemplo, essas modificações genéticas adicionais podem abranger a expressão ou superexpressão de uma ou mais enzimas envolvidas na via metabólica para a produção da molécula de interesse. Os exemplos não limitativos de moléculas de interesse são acetona, isopropanol, butanol, isobutanol, isobuteno, propeno, policetídeos, poli-hidroxialcanoatos, hidroxiácidos (incluindo 3-hidroxipropionato, 3- hidrobutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxi-hexanoato), álcoois graxos, ácidos graxos, todos os aminoácidos naturais derivados de acetil-coA (incluindo ácido glutâmico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina,
metionina, treonina, cisteína, sucinato, lisina, leucina, isoleucina) e isoprenoides como farneseno. O rendimento dessas moléculas de interesse é aumentado nos micro-organismos da invenção em comparação a micro- organismos não modificados geneticamente que dependem tipicamente de piruvato descarboxilação para geração de acetil-fosfato. Consequentemente, os micro-organismos recombinantes da invenção que compreendem um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que garante a conversão irreversível de sedoeptulose-7-fosfato, em particular, uma fosfocetolase que tem atividade de Spk e que tem atividade reduzida de transcetolase e opcionalmente que tem atividade de transaldolase reduzida, podem ser distinguidos pelo fato de que têm rendimentos superiores para moléculas derivadas de acetil-fosfato, tais como acetil-CoA, e perdas reduzidas de CO2 ou pelo fato de que esses rendimentos superiores podem ser obtidos a um custo energético e cinético mais baixo visto que não há necessidade de refixação de CO2 .
[0076] Em modalidades particulares, os micro-organismos podem converter um ou mais fosfatos de açúcar em acetil-fosfato. Em uma modalidade particular, o fosfato de açúcar é selecionado dentre o grupo que consiste em: fosfatos de açúcar de uma triose (G3P, DHAP), uma eritrose (E4P), uma pentose (R5P, Ru5P, RuBP, X5P), uma hexose (F6P, H6P, FBP, G6P) e uma sedoeptulose (S7P, SBP), de preferência, uma hexose, com mais preferência, F6P.
[0077] Os micro-organismos descritos no presente documento podem usar várias fontes de carbono para produzir fosfatos de açúcar. Por exemplo, os fosfatos de açúcar podem ser derivados de metanol, metano, CO2, CO, formaldeído, formato, glicerol, um carbo-hidrato que tem a fórmula geral CnH2nOn, em que n=3 a 7, celulose ou hemicelulose como uma fonte de carbono. Em modalidades particulares, os micro-organismos são micro-organismos heterotróficos, mixotróficos,
autotróficos ou metanotróficos. O termo "heterotrófico", conforme usado no presente documento, em combinação com micro-organismos se refere a micro-organismos, por exemplo, leveduras, espécies E. coli, Clostridium , que são cultivados em substratos que contêm carbono ou utilizam matéria orgânica para seu crescimento. “Micro-organismos autotróficos", conforme usado no presente documento, se refere a micro-organismos, por exemplo, algas, que têm a capacidade de crescer de maneira autônoma por fotossíntese. "Organismos mixotróficos", conforme usado no presente documento, se referem a micro-organismos, por exemplo, espécie Clostridium , que têm capacidade para usar tanto fotossíntese (CO2) quanto matéria orgânica (por exemplo, gás de síntese (CO, H2) presentes para seu crescimento. Esse mixotróficos podem ser cultivados tanto na presença de luz quanto de matéria orgânica. “Micro-organismos metanotróficos", conforme usado no presente documento, se referem a micro-organismos que metabolizam metano como sua fonte de carbono.
[0078] Os micro-organismos que são particularmente úteis para serem submetidos à engenharia a fim de converter uma fonte de carbono, em particular, metanol, em acetil-fosfato por meio de um ciclo de condensação de metanol auxiliado por sedoeptulose fosfocetolase (SPAMCC), conforme descrito no presente documento são micro- organismos mixotróficos e metanotróficos.
[0079] Os micro-organismos fornecidos no presente documento podem ser de origem bacteriana, fúngica, em particular, levedura ou de origem algal. A princípio, qualquer espécie de micro- organismo que possa ser transformado adequadamente e/ou modificado geneticamente pode ser usada no contexto da presente invenção. Em modalidades particulares, os micro-organismos da presente invenção são bactérias geneticamente modificadas ou fungos geneticamente modificados, em particular, leveduras ou algas geneticamente modificado.
Em modalidades particulares, o micro-organismo é uma bactéria, tal como uma espécie Clostridium , em particular Clostridium acetobutylicum, ou E. coli; ou o micro-organismo é uma levedura, tal como S. cerevisae. Os métodos para gerar os micro-organismos submetidos à engenharia metabólica descritos no presente documento envolvem modificações genéticas padrão, para as quais métodos bem estabelecidos estão disponíveis para a pessoa versada na técnica.
[0080] A invenção abrange, então, métodos para a produção dos micro-organismos fornecidos no presente documento, mais particularmente, métodos para produzir um micro-organismo que tem produção aumentada de uma molécula de interesse derivada de acetil-CoA. Mais particularmente, os métodos para produzir os micro-organismos da invenção compreendem introduzir em um micro-organismo de interesse, pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase. Opcionalmente, os métodos podem compreender adicionalmente, selecionar micro-organismos com atividade aumentada de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase e/ou selecionar um micro-organismo que tem produção aumentada da dita molécula de interesse em comparação a micro-organismos que não compreendem o ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase.
[0081] A engenharia genética do organismo ou célula hospedeira através da introdução de um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de interesse é realizada em uma ou mais etapas por meio do projeto e construção de vetores adequados e transformação do hospedeiro com esses vetores.
[0082] A eletroporação e/ou métodos de transformação química (tais como, com base em cloreto de cálcio acetato de lítio) ou métodos de transformação mediados por Agrobacterium tumefaciens, conforme conhecido na técnica, podem ser usados.
[0083] Em modalidades particulares, o ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de interesse compreende uma sequência de codificação que codifica a enzima de interesse colocada sob o controle transcricional de um ou mais promotores e um ou mais terminadores, dentre os quais os dois são funcionais no organismo ou célula hospedeira.
[0084] As sequências de promotor e de terminador podem ser nativas para o organismo ou célula hospedeira ou exógeno ao organismo ou célula hospedeira. As sequências de terminador e promotor úteis incluem aquelas que são altamente idênticas (isto é, que têm uma pontuação de identidades de 90% ou mais, de preferência, 95% ou mais, com máxima preferência, 99% ou mais) em suas porções funcionais em comparação às porções funcionais de sequências de terminador e de promotor, respectivamente, que são nativas ao organismo ou célula hospedeira, particularmente, quando a inserção do ácido nucleico exógeno é tida como alvo em um sítio específico no genoma hospedeiro. O uso de promotores e terminadores nativos (ao organismo ou célula hospedeira), junto do das respectivas regiões de flanqueamento a montante e jusante dos mesmos, pode permitir a integração tida como alvo do ácido nucleico exógeno em loci específicos do genoma hospedeiro.
[0085] É possível que diferentes sequências de codificação que codificam uma enzima de interesse sejam colocadas sob o controle de diferentes tipos de promotores e/ou terminadores.
[0086] Inúmeros vetores são conhecidos pelos profissionais versados na técnica, e a seleção de um vetor apropriado é uma questão de escolha. Os vetores podem ser ou cortados com enzimas de restrição particulares ou usados como DNA circular.
[0087] Os vetores ensinados no presente documento compreendem, de preferência, (uma combinação de) um ácido nucleico exógeno, conforme descrito no presente documento. Em particular, um vetor compreende (uma combinação das) sequências de codificação de uma enzima de interesse e sequências associadas de terminador e promotor.
O vetor pode conter sítios de restrição de vários tipos para linearização ou fragmentação.
Os vetores podem conter adicionalmente uma porção de cadeia principal (tal como para a propagação em E. coli), dentre os quais muitos são obtidos convenientemente a partir de vetores de levedura ou bacterianos comercialmente disponíveis.
O vetor compreende, de preferência, um ou mais cassetes de gene marcador de seleção.
Um "gene marcador de seleção" é aquele que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e/ou crescimento da célula transformada em um meio de cultura seletivo.
Os genes marcadores de seleção codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como cloramfenicol, zeocin (gene sh ble da Streptoalloteichus hindustanus), genetecina, melibiase (MEL5), higromicina (gene de resistência a antibóticos aminoglicosídeos da E. coli), ampicillina, tetraciclina ou canamicina (gene de resistência a canamicina de Tn903), (b) deficiências auxotróficas complementares da célula.
Dois exemplos prominentes de deficiências auxotróficas são a deficiências do aminoácido leucina (por exemplo, gene LEU2) ou deficiência de urecila (por exemplo, gene URA3). As células que são orotidina-5'-fosfato decarboxilase nativas (ura3-) não podem crescer nos meios que não têm uracila.
Desse modo, um gene URA3 funcional pode ser usado como um marcador em uma célula que tem uma deficiência de uracila, e transformantes bem sucedidos podem ser selecionados em um meio que tem uracila.
Apenas as células transformadas com o gene URA3 podem sintetizar uracila e ser proliferadas em tal meio.
Caso a cepa do tipo selvagem não tenha uma deficiência de uracila (conforme é o caso com I. orientalis, por exemplo), um mutante auxotrófico que tem a deficiência precisa ser produzido para usar URA3 como um marcador de seleção para a cepa.
Os métodos para realizar isso são bem conhecidos na técnica. O cassete de marcador de seleção inclui tipicamente, ainda, uma sequência de promotor e terminador, ligado de maneira operacional ao gene marcador de seleção e que são operáveis no hospedeiro.
[0088] Os transformantes bem sucedidos podem ser selecionados de maneira conhecida, obtendo-se vantagem dos atributos contribuídos pelo gene marcador ou por outras características (tais como capacidade para crescer em substratos específicos, tal como, por exemplo, sedoeptulose) contribuídos pelos ácidos nucleicos exógenos inseridos. A triagem também pode ser realizada por PCR ou Análise Southern para confirmar que as inserções desejadas, e opcionalmente deleções ocorreram, para confirmar o número de cópia e identificar o ponto de integração das sequências de codificação no genoma hospedeiro. A atividade da enzima codificada pelas sequências de codificação inseridas podem ser confirmadas com o uso de métodos de ensaio conhecidos.
[0089] Em modalidades particulares, os métodos compreendem adicionalmente modificar geneticamente o micro-organismo de modo que tenham atividade de transcetolase eliminada ou reduzida e opcionalmente atividade de transaldolase reduzida ou eliminada.
[0090] A atividade de transcetolase e a atividade de transaldolase em micro-organismos submetidos à engenharia metabólica descritos no presente documento podem ser reduzidas por qualquer método que resulta em atividade reduzida da transcetolase ou da transaldolase no micro-organismo. Isso pode ser obtido, por exemplo, alterando-se transcetolase ou transaldolase a níveis de DNA, mRNA e/ou proteína. Nas modalidades, a atividade de transcetolase ou atividade de transaldolase podem ser reduzidas ou eliminadas tendo-se como alvo genes genômicos que codificam uma transcetolase ou a transaldolase. Por exemplo, o gene endógeno que codifica transcetolase ou transaldolase (ou genes) pode ser alterado, sem limitação, submetendo-se a knockout um ou mais genes de codificação de transcetolase ou transaldolase; submeter à knockin um DNA heterólogo para romper um ou mais genes de codificação de transcetolase ou transaldolase; inativando-se mutações. A pessoa versada na técnica entenderá que essas abordagens podem ser aplicadas às sequências de codificação, o promotor ou outros elementos reguladores necessários para transcrição de gene Em outras modalidades, a atividade de transcetolase ou atividade de transaldolase pode ser reduzida reduzindo-se níveis de transcrições de transcetolase mRNA ou transcrições de transaldolase mRNA por métodos conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitação, cossupressão, expressão antissenso, expressão de grampo pequeno (shRNA), expressão de RNA (RNAi) interferência, expressão de dupla fita (dsRNA), expressão de dsRNA de repetição invertida, RNA de microinterferência (miRNA), expressão simultânea de sequências senso e antissenso ou uma combinação dos mesmos, tendo como alvo genes de codificação de transcetolase ou transaldolase.
[0091] Um aspecto adicional fornece métodos para obter um micro-organismo submetido à engenharia metabólica, conforme descrito no presente documento, sendo que os métodos compreendem transformar o micro-organismo com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que converte irreversivelmente sedoeptulose-7-fosfato, conforme ensinado no presente documento, em particular, uma fosfocetolase que tem atividade de Spk. Em modalidades particulares, os métodos podem compreender as etapas de: a) transformar o micro-organismo com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima que garante a conversão irreversível de sedoeptulose-7-fosfato, em particular, uma fosfocetolase que tem atividade de Spk, conforme ensinado no presente documento;
b) opcionalmente, modificar geneticamente o micro-organismo de modo que tenha atividade de transcetolase eliminada ou reduzida e opcionalmente atividade de transaldolase reduzida ou eliminada; e c) selecionar um micro-organismo com capacidade para produção a alto rendimento de acetil-fosfato.
[0092] Conforme detalhado acima, modificações genéticas adicionais também são abrangidas pelo presente documento.
[0093] Dependendo do uso previsto dos micro-organismos da invenção e das enzimas presentes no dito micro-organismo, uma ou mais modificações adicionais podem ser abrangidas conforme descrito acima. Consequentemente, em modalidades particulares, os métodos compreendem adicionalmente submeter o micro-organismo à engenharia de modo que expresse ou superexpresse pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase, uma transaldolase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma triose fosfato isomerase, uma frutose 1,6-bisfosfato aldolase e uma frutose 1,6-bisfosfatase, de preferência, uma frutose 1,6- bisfosfatase. Em modalidades particulares, os métodos compreendem adicionalmente submeter à engenharia o micro-organismo de modo que expresse ou superexpresse pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6- fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose- fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase; uma hexulose-6-fosfato sintase; uma hexulose-6-fosfato isomerase; e uma metanol de-hidrogenase; ou em que o micro-organismo é submetido adicionalmente à engenharia ainda para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6- fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase; uma transaldolase; uma ribose-5-fosfato isomerase; uma ribulose-5-fosfato epimerase; uma triose- fosfato isomerase; uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase; uma frutose-1,6 bisfosfatase ou uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase; uma di-hidroxiacetona sintase; uma frutose- 6-fosfato aldolase; e uma metanol de-hidrogenase. Em modalidades particulares, os métodos compreende adicionalmente submeter à engenharia o micro-organismo de modo que expresse ou superexpresse pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5- fosfocetolase, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase e uma triose fosfato isomerase, de preferência, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase.
[0094] Em modalidades particulares, os métodos podem compreender adicionalmente submeter à engenharia genética o micro- organismo para expressar ou superexpressar uma ou mais enzimas necessárias para a produção do produto de interesse.
[0095] Os micro-organismos descritos no presente documento são, então, particularmente úteis para a biossíntese de acetil- fosfato, acetil-CoA e/ou produtos derivados dos mesmos. Consequentemente, um aspecto adicional se refere ao uso dos micro- organismos descritos no presente documento para a produção de uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é derivada de acetil-CoA. São revelados, também, no presente documento métodos para a produção de uma molécula de interesse, sendo que os ditos métodos compreendem cultivar um micro-organismo, conforme descrito no presente documento, na presença de uma fonte de carbono adequada. Os exemplos não limitativos de fontes de carbono adequadas incluem metanol, metano, CO2, CO, formaldeído, formato, glicerol, um carbo-hidrato que tem a fórmula geral CnH2nOn, em que n=3 a 7, celulose e hemicelulose.
[0096] A presente invenção será ilustrada adicionalmente a seguir por meio dos exemplos não limitativos a seguir.
EXEMPLOS Exemplo 1: Simulação cinética da via de NOG em C. acetobutylicum
[0097] Os parâmetros cinéticos das enzimas de C. acetobutylicum envolvidas na via de NOG foram medidos experimentalmente ou estimados da literatura (Tabela 1) e compilados em uma caixa de ferramentas COPASI para simulações cinéticas. Tabela 1: Parâmetros cinéticos de enzimas de NOG daC. acetobutylicum , medidos experimentalmente ou estimados da literatura. Xpk Fbp Km (µmol/ml) 6,4 0,063 V (µmol/(ml*s) 0,00041 0,00029 Tal Tkt Tkt' Keq 1,051 1,21 101 Vf (µmol/(ml*s) 0,0053 0,0035 0,0035 Vr (µmol/(ml*s) 0,0051 0,0029 0,00035 Kma (µmol/ml) 0,272 0,67 0,946 Kmb (µmol/ml) 0,786 0,235 0,67 Kmp (µmol/ml) 1,44 0,1 1,1 Kmq(µmol/ml) 0,362 0,15 0,1 Tpi Fba Rpe Rpi Kms (µmol/ml) 6,45 1,14 5,97 2,47 Kmp (µmol/ml) 5,25 2 7,7 5,7 Kmq (µmol/ml) - 2,4 - -
Ki (µmol/ml) 35,5 - - - Kip (µmol/ml) - 10 - - Keq - 0,069 (µmol/ml) 1,41 41 Vf (µmol/(ml*s) 0,5 0,0033 0,017 0,012 Vr (µmol/(ml*s) 11,8 0,048 - -
[0098] A Figura 5 mostra uma simulação de estado estável da via de NOG, conforme ilustrado na Figura 1A com fluxo constante de xilose. A Figura 5 mostra um rápido aumento em concentração de S7P (ainda mais rápido que a AcP de produto). Tal aumento na concentração é letal in vivo.
[0099] Após a introdução de Spk (que tem os mesmos parâmetros cinéticos que a Xpk inicial), o acúmulo de S7P foi eliminado, a concentração de todos os intermediários de metabólito atingiu um estado estável dentro de concentrações toleráveis in vivo e o acúmulo de AcP foi observado (Figura 6). Exemplo 2: Identificação de uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase
[0100] É construída uma cepa de levedura que tem uma deleção do gene (ou genes) de tkt e o gene (ou genes) de tal e que expressa Fpk, Xpk ou uma enzima F/Xpk bifuncional. As fosfocetolases são clonadas em um plasmídeo de expressão, e a cepa de levedura é transformada com esses plasmídeos de expressão. As células de levedura são cultivadas em sedoeptulose, e os transformantes que sobrevivem são selecionados como contendo uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase. Exemplo 3: Identificação e caracterização de uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase
[0101] A atividade de fosfocetolase das fosfocetolases identificadas no Exemplo 2 como tendo atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase é medida de maneira espectrofotométrica como hidroxamato de acetila férrica produzido a partir da acetil-fosfato gerada enzimaticamente pelo procedimento de Racker (1962 Methods Enzymol. 5:276 a 280). A mistura de reação padrão de 0,075 ml consiste em fosfato de potássio 33,3 mM (pH 6,5), cloridrato de L-cisteína (1,9 mM), fluoreto de sódio (23 mM), iodoacetato de sódio (8 mM), D-sedoeptulose-7-fosfato (Sigma) como um substrato (a uma concentração de 27 mM) e, por fim, a amostra de proteína que contém fosfoquetolase para iniciar a reação. Após incubação a 37 °C por 30 minutos, 0,075 ml de cloridrato de hidroxilamina (2 M, pH 6,5) é adicionado à temperatura ambiente Dez minutos depois, 0,05 ml de ácido tricoloacético a 15% (peso/volume), 0,05 ml de HCl 4 M e 0,05 ml de FeCl3 z 6 H2O (5% [peso/volume] em HCl 0,1 M) são adicionados para o desenvolvimento de cor final do hidroxamato férrico, que é, em seguida, quantificado de maneira espectrofotométrica a 505 nm comparando-se a uma série de padrões de acetil-fosfato (Sigma).
[0102] Para medições qualitativas da atividade de S7PPK em células inteiras, a E. coli ou outras células hospedeiras que contêm fosfocetolase recombinante são pré-tratadas com brometo de hexadeciltrimetilamônio (Sigma) antes de ser testada de acordo com o método de Orban e Patterson (2000 J. Microbiol. Methods 40:221 a 224).
[0103] Uma unidade da atividade de fosfocetolase é definida como a quantidade de extrato que forma 1 µmol de acetil-fosfato por minuto da S7P. A atividade específica é expressa como unidades por miligrama de proteína. As concentrações de proteína são determinadas pelo método de Lowry et al. com o uso de albumina sérica bovina como um padrão. Exemplo 4: Validação In vivo da via de NOG em E. coli
[0104] As cepas E. coli ΔldhA, ΔadhE, ΔmgsA, ΔfrdABCD, ΔpflAB, ΔpfkAB ou ΔldhA, ΔadhE, ΔfrdBC, ΔpflB (cepaE. coli JCL118, conforme descrito em Bogorad et al. (2013 Nature 502:693 a 698)) são modificadas ainda para ter uma deleção dos genes tkt e/ou tal . As cepas E. coli são transformadas com o plasmídeo de expressão identificado nos Exemplos 2 e 3 como contendo uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase.
[0105] As células E. coli são inoculadas em um meio de crescimento que contém uma fonte de carbono, por exemplo, um substrato de açúcar C6 e incubado de maneira anaeróbica para produzir acetato. A mistura final é girada, e um sobrenadante diluído é submetido à HPLC para medir a concentração de fonte de carbono e acetato. Exemplo 5: Validação In vivo da via de SPANOG na levedura (Saccharomyces cerevisiae)
[0106] Uma cepa de levedura, em particular, a cepa de levedura CEN.PK 113-5D descrita em Bergman et al. (2016 AMB Express. 6(1):115), é modificada adicionalmente para reduzir ou eliminar 1) atividade de transcetolase ou 2) tanto a atividade de transcetolase quanto a atividade de transaldolase. As células de levedura são transformadas adicionalmente com plasmídeos de expressão que abrigam enzimas fosfocetolase que têm atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, conforme identificado nos Exemplos 2 e 3 para monitorar os níveis de produção de acetato e taxas de crescimento em substratos de açúcar C6, conforme descrito no Exemplo 4. Exemplo 6: ValidaçãoIn vitro e in vivo das vias de SPANOG & GATHCYC na levedura (Saccharomyces cerevisiae)
[0107] A fim de avaliar se a via de SPANOG ou de GATHCYC é funcional na levedura, foram construídas cepas de levedura nas quais todas as enzimas necessárias estão presentes (Figura 8) e em que as vias competitivas foram submetidas à knockout. A formação de acetil-fosfato (AcP) foi medida in vitro em extratos livres de célula crua com o uso de um ensaio de fosfocetolase, e o teste in vivo foi realizado construindo-se cepas que dependem de uma via de SPANOG ou de GATHCYC funciona para sobreviver.
[0108] A fim de possibilitar a via de SPANOG na levedura, em particular, em S. cerevisae, a fosfocetolase Xfspk da Bifidobacterium longum foi introduzida, as transcetolases nativas (TKL1, TKL2) foram submetidas à knockout, e a frutose-1,6-bisfosfatase nativa (FBP1) e uma frutose-1,6-bisfosfatase cAMP intensiva (glpX) da E. coli foi superexpressa. Além disso, a PHO13 que codifica uma fosfatase alcalina foi submetida à deleção nas cepas de levedura a fim de evitar formação de sedoeptulose por meio de defosforilação de sedoeptulose-7-fosfato.
[0109] Para a via de GATHCYC, a fosfocetolase Xfspk de B. longum foi introduzida, as transcetolases nativas (TKL1, TKL2) e as transaldolases nativas (TAL1, NQM1) foram submetidas à deleção, e a sedoeptulose-1,7-bisfosfatase SHB17 nativa foi superexpressa. Além disso, PHO13 foi submetido à deleção nas cepas de levedura para evitar formação de sedoeptulose.
[0110] Cepas via-negativas foram construídos como controle negativo. As cepas via-negativas tiveram o mesmo genótipo que as cepas via-positivas, porém as transaldolases (TAL1, NQM1) foram submetidas à deleção (tal1Δ nqm1Δ) para as cepas SPANOG-negativas e sedoeptulose- 1,7-bisfosfatase (SHB17) foi submetida à deleção (shb17Δ) para a cepa GATHCYC-negativa.
[0111] Por fim, as cepas foram modificadas adicionalmente por deleção do gene ZWF1 nativo para serem dependentes de uma via funcional de SPANOG ou de GATHCYC para sobreviver (Figura 10). De fato, o knockout de ambas as transcetolases e a primeira etapa da via de pentose fosfato (PP) (ZWF1) foram relatados como letais para S. cerevisiae, até mesmo quando cultivados no meio complexo YPD, devido a uma falta de pentose fosfatos (Schaaff-Gerstenschläger et al. 1993 Eur. J.
Biochem. 217:487 a 492). Consequentemente, apenas as cepas com um ciclo funcional de SPANOG ou GATHCYC podem produzir R5P necessário para crescimento. Materiais e Métodos Cepas Saccharomyces cerevisiae
[0112] As cepas usadas são mostradas na Tabela 2. IMX581 (com base em Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D, Mans et al. 2015 FEMS Yeast Res. 15:1 a 15) foi usado como uma cepa parental para construir o fundo necessário para testar a via de GATHCYC. As cepas via-negativas têm SHB17 submetidas à deleção, o que bloqueia a utilização do ciclo completo de GATHCYC. Tabela 2 Cepasccharomyces cerevisiae usadas. Cepa Genótipo Observações IMX581 MATa ura3-52 can1Δ::cas9-natNT2 Expressão de TRP1 LEU2 HIS3 Cas9 JH1 IMX581 tkl1/2Δ JH2 JH1 tal1Δ nqm1Δ JH3 JH2 pho13Δ shb17Δ JH4 JH2 pho13Δ PSHB17Δ::PTDH3 JH9 JH4 pJGH1 Via positiva JH10 JH3 pJGH1 Via negativa JH18 Cassete de JH4 XII-1::xfspk via positiva JH19 Cassete de JH3 XII-1::xfspk via negativa JH20 JH18 zwf1Δ via positiva Meios de Cultivo
[0113] Todos os produtos químicos foram comprados da Sigma-Aldrich/Merck, salvo quando especificado de outro modo. O meio de crescimento para a construção de cepa de levedura foi levedura-peptona- dextrose (YPD), contendo 10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de peptona de carne e 20 g/l de glicose. AE. coli DH5α foi usada para construção de plasmídeo e cultivada em caldo lisogênico (LB), composto de 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona da caseína e 10 g/l de NaCl. Ágar- ágar foi adicionada a 20 g/l e 16 g/l para produzir placas de YPD e LB, respectivamente.
[0114] Os transformantes deE. coli foram selecionados em placas de LB suplementadas com 100 µg/ml de ampicilina.
[0115] A seleção dos transformantes de levedura foi realizada em placas sintéticas de perda completa (SD) sem uracila, que conteve 6,9 g/l base de nitrogênio de levedura (YNB) sem aminoácidos (Formedium), 0,77 g/l de mistura suplementar completa (CSM) sem uracila (Formedium), 20 g/l de glicose e 20 g/l de ágar-ágar. As placas de ácido 5- fluorótico (5-FOA) (que contém 6,9 g/l de YNB sem aminoácidos, 0,77 g/l de CSM, 1 g/l 5-FOA (Formedium), 20 g/l de glicose e 20 g/l de ágar-ágar) foram usadas para remover o marcador URA3 .
[0116] Os cultivos antes do ensaio de fosfocetolase foram realizados em um meio mínimo, que conteve 7,5 g/l de (NH4)2SO4, 14,4 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4·7H2O, 20 g/l de glicose, 1 ml/l de solução de vitamina, 2 ml/l de solução de metal-traço e pH ajustado para 6,5. A solução de vitamina e a solução de metal-traço foram preparadas de acordo com Verduyn et al. (1992 Yeast 8:501-517). Construção de Cepa e de Plasmídeo
[0117] Modificações genômicas de S. cerevisiae IMX581 (cepa CEN.PK113-5D que expressam constitutivamente Cas9 do genoma) foram realizadas introduzindo-se um plasmídeo que expressa RNA-guia (gRNA) de acordo com o fluxo de trabalho por Mans et al. (2015). As transformações deE. coli foram realizadas de acordo com Inoue et al. (1990 Gene 96:23 a 28). A Tabela 3 mostra os plasmídeos usados para a configuração de GATHCYC. O plasmídeo pJGH1 contém a gene fosfocetolase promíscuo de Bifidobacterium longum NCC2705 (SEQ ID NO:3). Tabela 3 Plasmídeos usados para a configuração de GATHCYC. Plasmídeo Descrição Origem pMEL10-can1 2-n11origin ampR KIURA3 gRNA- Mans et al. CAN1.Y (2015) pROS10- 2-n1/ade2_CIampR URA3 gRNA- Mans et al. can1/ade2 CAN1.Y gRNA-ADE2.Y (2015) pROS10- pROS10 gRNA-TKL1 gRNA-TKL2 Exemplo 5 tkl1/tkl2 pROS10- pROS10 gRNA-TAL1 gRNA-NQM1 Exemplo 5 tal1/nqm1 pROS10- pROS10 gRNA-PHO13 gRNA-SHB17 Exemplo 5 pho13/shb17 pROS10- pROS10 gRNA-PHO13 gRNA-PSHB17 Exemplo 5 pho13/shb17p pMEL10-zwf1 pMEL10 gRNA-ZWF1 Exemplo 5 pQC032 sítio de integração de pROS10 gRNA- Exemplo 5 XII-1 pBS01A 2-S01Arigin ampR URA3 pUC origin Exemplo 5 PTEF1 - PPGK1 pJGH1 pBS01A PTEF1–Exfspk (B. longum) – Exemplo 5 TADH1
[0118] Todos os kits, enzimas e tampões foram solicitados à Thermo Fisher Scientific, salvo quando especificado de outro modo. As sequências de gRNA foram projetadas com a ferramenta online Benchling (https://benchling.com) e estão listados na Tabela 4. A PCR foi realizada em DNA polimerase de Alta Fidelidade de Alta Fusão, e os produtos foram purificados com o uso ou do Gel de Extração GeneJET ou Kit de Purificação de PCR. Os iniciadores foram solicitados da Eurofins Genomics. Tabela 4. Sequências de gRNA usadas. A pontuação de especificidade de Hsu et al. (2013 Nat Biotechnol. 31:827 a 832) e pontuação de eficiência de Doench, Fusi et al. (2016 Nat Biotechnol. 34:184 a 191). As pontuações são 0 a 100, quanto mais alta, melhor. Sequência SE PA Pontuação Pontuaç Q M de ão de ID Especificida Eficiênci NO de a : gRNA- GCCAACTACAAACCATA 4 TG 99,6 76,3 TKL1 CGG G gRNA- CTTTGCCGCCACTTATA 5 AG 100,0 72,5 TKL2 ACG G gRNA- CTAGAACAATTGAAAGC 6 CG 100,0 61,5 TAL1 CTC G gRNA- TGATCAAGATAGCTTCT 7 TG 100,0 71,5 NQM1 ACG G gRNA- GCAAAGAGCTAAGATC 8 TG 100,0 74,0 SHB17 CGTG G gRNA- ACATTTTGTTCATAGCT 9 TG 100,0 59,7 PSHB17 AAG G gRNA- ACTGCAGTGTAACAGC 10 CG 99,4 61,6 PHO13 CAAA G gRNA- CCAGATAGAAGAGACG 11 GG 100,0 71,9 ZWF1 GTGT G
[0119] Modificações genômicas únicas e duplas foram realizadas clonando-se os gRNAs em pMEL10 e pROS10,
respectivamente, com o uso do conjunto Gibson (NEB). O plasmídeo montado foi transformado em E. coli, extraído com o Kit de Minipreparação de Plasmídeo GeneJET e verificado por sequenciamento de Sanger (Eurofins Genomics). A transformação em levedura foi realizada com o método acetato de lítio/PEG. Fragmentos de reparo para deleções de gene foram ordenados como dois oligos de 120 bp complementares (60 bp a montante e 60 bp a jusante do gene) e hibridados antes da transformação. A PCR de fusão foi usada para construir fragmentos de reparo para substituição de promotor e integração de cassete. Os transformantes foram verificados através de PCR de colônia e sequenciamento. O plasmídeo com base em URA3foi reciclado de transformantes bem-sucedidos colocando-se 5-FOA em placas, e a perda de plasmídeo confirmada colocando-se colônias únicas em placas tanto YPD-ura quanto de SD-ura. Os clones que não crescem em placas SD-ura foram cultivados em YPD de um dia para o outro e criopreservados a -80 °C em 15% de glicerol estéril, com o uso de um recipiente de CoolCell para manter viabilidade com o uso de congelamento.
[0120] A codificação de gene para a fosfocetolase de Bifidobacterium longum NCC2705 (GenBank: AAN24771.1) foi otimizada por códon para S. cerevisiae por Genscript (Figura 9, SEQ ID NO:3). O xfspk otimizado por códon (B. longum) foi clonado em pBS01A por clonagem de restrição com BcuI e NotI, colocando o mesmo a jusante do promotor TEF1 Ensaio de fosfocetolase
[0121] A via foi testada com o uso de estrados livres de célula crua purificada. Em suma, colônias únicas de JH9 e JH10 foram usadas para inocular 2 ml de meio mínimo, com o uso de triplicatas biológicas e cultivados a 30 °C por 3 duas a 200 rpm. As pré-culturas foram adicionadas a frascos de agitação de 100 ml sem defletores que contêm 20 ml de meio e cultivadas a 30 °C (200 rpm de agitação orbital) até OD600 = 1.
As células foram lavadas uma vez com 10 ml de água MQ e uma vez com 10 ml de tampão de extração de proteína (PEB) que contém 50 mM de tampão de fosfato de potássio, 1 mM de ditiotreitol, 2 mM de MgSO4 e ajustado para pH = 7,5. As células foram suspensas novamente em 0,4 ml de PEB e congeladas instantaneamente em N2 líquido após remoção de sobrenadante. O pélete celular foi armazenado a -80 °C até lise.
[0122] As células foram desgeladas em gelo antes da lise, suspensas novamente em 0,4 ml de PEB e transferidos a um tubo com parafuso-tampa de 2 ml que contém 500 mg de microesferas de vidro a 425 a 600 µm (Sigma G-8772). O Coquetel inibidor de protease Halt (Thermo Fisher Scientific) foi adicionado a uma concentração final de 1X. As células foram homogeneizadas com Precellys Evolution, com o uso de 4 ciclos de
6.800 rpm para 20 segundos e mantidas no gelo por 5 minutos entre os ciclos. O homogenato foi transferido a um tubo Eppendorf e dejetos celulares girados a 20.000 g durante 10 minutos a 0 ºC. O sobrenadante foi movido para um tubo fresco e armazenado no gelo. Os procedimentos de colheita e lise realizados em gelo com soluções frias. A lise e o ensaio foram realizados no mesmo dia.
[0123] A concentração de proteína dos extratos livres de célula crua foi determinada em duplicatas com kit de ensaio de proteína DC (Bio-Rad), com o uso de padrões de BSA pré-produzidos (Thermo Fisher Scientific). As amostras foram diluídos na mesma concentração de proteína com PEB. A produção de acetil-fosfato avaliadas com o método de hidroxamato de acetila férrica, de acordo com o protocolo modificado de Bergman et al. (2016 AMB Express 6:115). Em suma, o ensaio foi realizado em uma microplaca de 96 poços, com o uso de um volume de reação de 75 µl que consiste em 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5), 1 mM de MgSO4, 8 mM de iodoacetato, 23 mM de NaF, 90 mM de F6P e extrato livre de célula crua. As reações com padrões de acetil-fosfato de lítio (0 a
16 mM) foram realizadas no mesmo tampão de reação, porém sem F6P e extrato livre de célula crua. A reação foi iniciada pela adição do extrato livre de célula crua, e a microplaca foi incubada à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi interrompida, e o produto convertido em hidroxamato de acetila férrica, com o uso do mesmo procedimento conforme em Bergman et al. (2016), além do que fato de que o precipitado de proteína foi removido centrifugando-se a placa por 5 minutos a 2.300 g. O sobrenadante foi transferido a uma placa vazia e a absorbância mantida a 505 nm com o leitor de microplacas FLUOstar® Omega (BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Alemanha). Resultados
[0124] Os resultados do ensaio in vitro para as cepas de GATHCYC são mostradas na Figura 11, em que as cepas expressam a fosfocetolase de B. longum em um plasmídeo de alta cópia. O ensaio foi realizada duas vezes, quando as cepas via-positivas (JH9) geraram um sinal 2,7 superior em comparação ao controle via-negativa (cepa JH10) o primeiro tempo (Figura 11A) e 2,8 vezes maior que a segunda vez (Figura 11B), o que indica que a via de GATHCYC está funcionando na S. cerevisae.
[0125] A atividadeIn vivo da via de GATHCYC foi demonstrada deletando-se ZWF1 nas cepas GATHCYC com integração genômica da fosfocetolase (cepas JH18 e JH19) de modo que as ditas cepas sejam dependentes de uma via de GATHCYC funcional para sobreviver, uma vez que essa rota será a única maneira de produzir R5P. Esperou-se que a deleção do ZWF1 na cepa via-negativa (cepa JH19) fosse letal. A transformação gerou ~50 colônias dimensionáveis para JH18 (via-positiva) após 11 dias e JH19 (via-negativa) gerou 1 colônia após 3 dias. No entanto, a PCR de colônia revelou que o ZWF1 ainda estava intacto em JH19, o que indica que a colônia foi um falso positivo e foi,
também, submetida à deleção na JH18 (Figura 12). O produto de PCR da JH18 foi confirmado por sequenciamento, e seu fundo de GATHCYC foi verificado por PCR e sequenciamento dos fragmentos.
[0126] Os resultados combinados do experimento in vitro e in vivo mostram que a via de GATHCYC é funcional em S. cerevisae. Exemplo 6: Produção de acetato em E. coli com o uso da via de
GATHCYC
[0127] A via de GATHCYC é instalada em E. coli PHL13 (Lin et al. 2018 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA; 115/3.538 a 3.546). A fosfocetolase Xfspk de B. longum (xfspkBL) e a sedoeptulose-1,7-bisfosfatase da S. cerevisae (SHB17SC) são superexpressas de um operon que contém xfspkBL e SHB17SC), que são integrados em um genoma, com o uso de CRISPR, sob o controle do promotor constitutivo miniPtac. A reação de sedoeptulose 1,7-bisfosfato aldolase é realizada pelo fbaAnativo. As transcetolases (tktA e tktB) e transaldolases (talA e talB) nativas são submetidas à deleção. As cepas necessárias são mostradas na Tabela 5. Tabela 5: Cepas Escherichia coli Cepa Genótipo Origem PHL13 BW25113/F'[traD36 proAB+ Lin et al. (2018) lacIqZΔM15 (Tetr)] ΔgapA::FRT ΔmgsA::FRT Δ(pgk gapB)::FRT ΔpfkA::FRT ΔiclR::FRT ΔpoxB::cat Δzwf::FRT RTedd eda)::(PLlacO1::xpkBA), PpckΔ::PLlacO1 NOG21 Evoluído da PHL13 Lin et al. (2018) JHEC1 PHL13 pCAS Exemplo 6 JHEC2 Cassete de JHEC1 SS9::xfspk+shb17 Exemplo 6 JHEC3 JHEC2 ΔtktA Exemplo 6
JHEC4 JHEC3 ΔtktB ΔtalA Exemplo 6 JHEC5 JHEC4 ΔtalB Exemplo 6 JHEC6 JHEC5 pJGHE3 Exemplo 6
[0128] Os plasmídeos necessários para construção de cepa são mostrados na Tabela 6. O pJGHE3/4 pode ser escolhido dependendo da expressão necessária de xfspk e SHB17. Tabela 6: Plasmídeos para experimentos de E. coli Plasmídeo Descrição Origem pCAS repA101(Ts) kan Pcas-cas9 ParaB-Red Jiang et al. lacIq Ptrc-sgRNA-pMB1 (2015 Appl. Environ. Microbiol. 81:2.506 a
2.515) pTargetF-cadA pMB1 aadA sgRNA-cadA Jiang et al. (2015) Cassete de pTargetF sgRNA-SS9 Exemplo 6 pTargetT- SS9::xfspk+shb17 pTargetF-tktA pTargetF sgRNA-tktA Exemplo 6 pTargetF-talA pTargetF sgRNA-talA Exemplo 6 pTargetF-talB pTargetF sgRNA-talB Exemplo 6 pPL274 PLlacO1::xpkBA glfZM glk tkt2MT lalKP Lin et al. glpX ColE ori Carbr (2018) pJGHE3 PLlacO1::xfspkBL shb17SC glfZM glk Exemplo 6 ColE ori Carbr pJGHE4 PLlacO1::glfZM glk ColE ori Carbr Exemplo 6
[0129] A cepa JHEC6 é avaliada para produção de acetato acoplado a crescimento e em comparação a NOG21, em uma preparação, conforme descrito por Lin et al. (2018). Exemplo 7: Produção de 3-hidroxi-propionato (3-HP) em S. cerevisiae com o uso da via de GATHCYC
[0130] A cepa da GATHCYC do Exemplo 5 é submetido adicionalmente à engenharia para a produção de 3-HP. GPP1 é submetido à deleção para evitar produção de acetato de AcP, o gene pta de C. kluyveri é introduzido para converter AcP em acetil-CoA e o gene mcr de Chloroflexus aurantiacus que codifica malonil-CoA redutase é introduzido para produzir 3-HP da malonil-CoA. Além disso, o número de cópia de xfspk da B. longum é ajustado, visto que a expressão plasmídica de alta cópia pode ser muito alta e a expressão genômica muito baixa. Um ponto inicial é aumentar o número de cópia adicionando-se a xfspk em um plasmídeo centromérico a uma cepa com 1 cópia de xfspk integrada no genoma. As cepas são resumidas na Tabela 7. Tabela 7 Cepas Saccharomyces cerevisiae Cepa Genótipo Origem IMX581 MATa ura3-52 can1Δ::cas9-natNT2 Mans et al. TRP1 LEU2 HIS3 (2015) JH4 IMX581 tkl1/2Δ tal1Δ nqm1Δ pho13Δ Exemplo 5 PSHB17Δ::PTDH3 JH24 Cassete de JH4 XII-1::xfspk + PPGK1– Exemplo 7 pta (C. kluyveri)–TCYC1 JH25 JH24 gpp1Δ Exemplo 7 JH26 JH25 pJGH5 Exemplo 7 JH27 Cassete de IMX581 XII-1::xfspk + Exemplo 7 PPGK1–pta (C. kluyveri)–TCYC1 JH28 JH27 gpp1Δ Exemplo 7
JH29 JH28 pJGH5 Exemplo 7
[0131] Os plasmídeos necessários para a produção de 3-HP são mostradas na Tabela 8. Tabela 8 Plasmídeos para experimentos em S. cerevisiae . Plasmídeo Descrição Origem p416TEF AmpR centromérica de URA3 Mumberg et al. (1995) pJGH5 p416TEF PTEF1–Exfspk (B. longum) – Exemplo 7 TADH1 + PTDH3–mcr–TCYC1
[0132] A cepa JH26 é avaliada em frascos de agitação e no biorreator, com JH29 como controle. Os dois são caracterizados determinando-se os parâmetros fisiológicos e através de RNAseq e análise de fosfato de açúcar.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Micro-organismo submetido à engenharia metabólica com capacidade para conversão aumentada de acetil-fosfato de uma fonte de carbono em comparação a um micro-organismo não submetido à engenharia metabólica correspondente, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase, e em que o micro-organismo é modificado geneticamente ainda para ter atividade de transcetolase eliminada.
2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fosfocetolase que tem atividade de sedoeptulose-7-fosfato fosfocetolase é uma Bifidobacterium longum fosfocetolase ou uma variante funcional da mesma, de preferência, a fosfocetolase que compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:2.
3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é modificado geneticamente ainda para facilitar uma via metabólica que converte uma molécula de frutose-6-fosfato e 2 moléculas de fosfato em 3 moléculas de acetil-fosfato e 2 moléculas de água.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para ter atividade de transaldolase eliminada.
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfato aldolase, uma sedoeptulose-1,7-bisfosfatase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase e uma triose fosfato isomerase.
6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 5, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para expressar ou superexpressar uma sedoeptulose-1,7- bisfosfatase.
7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima selecionada dentre o grupo que compreende uma enzima que tem atividade de frutose-6-fosfocetolase e/ou de xilulose-5-fosfocetolase, uma transaldolase, uma ribose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma triose fosfato isomerase, uma frutose 1,6-bisfosfato aldolase e uma frutose 1,6-bisfosfatase.
8. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 7, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para expressar ou superexpressar uma frutose-1,6-bisfosfatase.
9. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado para ter atividade reduzida ou eliminada de uma ou mais dentre uma fosfoglicerato quinase, uma fosfofrutoquinase e uma glicose-6-fosfato de-hidrogenase.
10. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é geneticamente modificado para ter atividade reduzida ou eliminada de uma fosfatase alcalina.
11. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é geneticamente modificado ainda para expressar ou superexpressar pelo menos uma enzima de uma via que converte acetil- fosfato em uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é selecionada dentre o grupo que compreende policetídeos, poli- hidroxialcanoatos, hidroxiácidos (incluindo 3-hidroxipropionato, 3- hidrobutirato, 3-hidroxivalerato e 3-hidroxi-hexanoato), álcoois graxos, ácidos graxos, aminoácidos (ácido glutâmico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, sucinato, lisina, leucina, isoleucina), acetona, isopropanol, butanol, isobutanol, isobuteno e propeno.
12. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é uma bactéria ou uma levedura.
13. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, sendo que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é E. coli ou S. cerevisae.
14. Uso de um micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que ocorre serve para produção de uma produção de uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é derivada de acetil-CoA e selecionada dentre o grupo que compreende policetídeos, poli-hidroxialcanoatos, hidroxiácidos (incluindo 3-hidroxipropionato, 3-hidrobutirato, 3-hidroxivalerato e 3-hidroxi- hexanoato), álcoois graxos, ácidos graxos, aminoácidos (ácido glutâmico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, sucinato, lisina, leucina, isoleucina), acetona, isopropanol, butanol, isobutanol, isobuteno e propeno.
15. Método para a produção de uma molécula de interesse, sendo que a dita molécula de interesse é derivada de acetil-CoA e selecionada dentre o grupo que compreende policetídeos, poli- hidroxialcanoatos, hidroxiácidos (incluindo 3-hidroxipropionato, 3- hidrobutirato, 3-hidroxivalerato e 3-hidroxi-hexanoato), álcoois graxos, ácidos graxos, aminoácidos (ácido glutâmico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, sucinato, lisina, leucina, isoleucina), acetona, isopropanol, butanol, isobutanol, isobuteno e propeno, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar um micro-organismo submetido à engenharia metabólica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, na presença de uma fonte de carbono adequada que pode ser metabolizada pelo dito micro-organismo.
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