BR112021015626B1 - Microorganismo recombinante superexpressando uma enzima tendo atividade d-ribose-5-fosfato aldolase, método de produção do mesmo e método de produção de um ou mais produtos selecionados de monoetilenoglicol e ácido glicólico - Google Patents

Microorganismo recombinante superexpressando uma enzima tendo atividade d-ribose-5-fosfato aldolase, método de produção do mesmo e método de produção de um ou mais produtos selecionados de monoetilenoglicol e ácido glicólico Download PDF

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Daniel Johannes Koch
Lucas Pedersen Parizzi
Felipe Galzerani
Jean Marie François
Sophie Lajus
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Braskem S.A
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Abstract

VIA DE DEGRADAÇÃO PARA AÇÚCARES PENTOSE E HEXOSE. A presente invenção refere-se a micro-organismos recombinantes úteis na biossíntese de monoetileno glicol (MEG) ou ácido glicólico (GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose. São também providos métodos de produção de MEG (ou GA), ou MEG (ou GA) e um ou mais coprodutos, a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose usando os micro-organismos recombinantes, bem como composições compreendendo os micro-organismos recombinantes e/ou os produtos MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/808.258, depositado em 20 de fevereiro de 2019, intitulado “DEGRADATION PATHWAY FOR PENTOSE AND HEXOSE SU-GARS”, cujo relatório descritivo é aqui incorporado a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a micro-organismos recombinantes úteis na biossíntese de monoetileno glicol ou monoetileno glicol e um ou mais coprodutos a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose. O presente pedido refere-se ainda a micro-organismos recombinantes úteis na biossíntese de ácido glicólico ou ácido glicólico e um ou mais coprodutos a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose. O pedido refere-se ainda a métodos de produção de monoetileno glicol ou monoetileno glicol e um ou mais coprodutos a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose usando os micro-organismos recombinantes, bem como métodos de produção de ácido glicólico ou ácido glicólico e um ou mais coprodutos a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose usando os microorganismos recombinantes. O pedido refere-se ainda a composições compreendendo um ou mais desses compostos e/ou os microorganismos recombinantes.
DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[003] A Listagem de Sequências associada ao presente pedido é fornecida em formato de texto no lugar de uma cópia de papel, e é incorporada ao presente pedido a título de referência. O nome do arquivo de texto contendo a Listagem de Sequência é BRSK- 007_02WO_ST25.txt. O arquivo de texto tem cerca de 641 KB, foi criado em 18 de fevereiro de 2020 e está sendo apresentado eletronicamente por meio do EFS-Web.
ANTECEDENTES
[004] Um grande número de compostos químicos é atualmente derivado de petroquímicos. Compostos tais como monoetilenoglicol (MEG), ácido glicólico, acetona, isopropanol (IPA), propeno, serina, glicina, monoetanolamina e etilenodiamina são valiosos como matéria- prima na produção de produtos tais como resinas de tereftalato de polietileno (PET) (de MEG), polipropileno plástico (de propeno), ácido poliglicólico e outros copolímeros biocompatíveis (de ácido glicólico) e fibras de poliuretano (de etilenodiamina). Alcenos (tais como etileno, propileno, butenos diferentes e pentenos, por exemplo) são usados na indústria de plásticos, combustíveis e em outras áreas da indústria química. Por exemplo, o isobuteno é uma molécula pequena, altamente reativa, que é usada extensivamente como uma plataforma química para fabricar uma ampla variedade de produtos incluindo aditivos para combustível, borracha e aditivos para borracha e produtos químicos especiais.
[005] No entanto, os compostos são atualmente produzidos a partir de precursores que se originam de combustíveis fósseis, que contribuem para mudança climática. Para desenvolver processos mais ambientalmente amigáveis para a produção de MEG, os pesquisadores criaram micro-organismos com vias biossintéticas para produzir MEG. No entanto, essas vias são desafiadoras de implementar, com perda de rendimento de produto, equilíbrio redox e formação de biomassa em excesso sendo alguns dos principais obstáculos a serem superados.
[006] Desta maneira, existe uma necessidade de vias de biossíntese aperfeiçoadas para a produção de MEG e outros compostos químicos úteis em aplicações industriais e farmacêuticas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção permite a conversão de uma variedade de açúcares C5 e C6, sem perda de carbono, em intermediários-chave amplamente utilizáveis gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído, tendo como base principalmente reações naturais, comprovadas, através da introdução de apenas uma nova reação catalisada por uma pentose-fosfato aldolase.
[008] Em algumas modalidades, as reações enzimáticas da invenção permitem que MEG em alto rendimento (ou ácido glicólico) ou MEG (ou GA) e um ou mais coprodutos produzidos a partir de glicose, xilose ou vários outros açúcares possam então entrar na via das pentose-fosfato. Em outras modalidades, as reações enzimáticas da invenção permitem a produção MEG em alto rendimento (ou ácido glicólico) ou MEG (ou GA) e coprodutos a partir de uma variedade de oligômeros de açúcar que podem ser prontamente decompostos nos monômeros correspondentes. Em modalidades adicionais, as reações enzimáticas da invenção permitem a produção de MEG em alto rendimento (ou ácido glicólico) ou MEG (ou GA) e coprodutos a partir de uma mistura de monômeros e/ou oligômeros de açúcar C5 e/ou C6.
[009] Em algumas modalidades, os presentes métodos resolvem ou reduzem os problemas que seguem comparado com outros métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) baseados em glicose: deficiência de ATP; excesso de NADH grande; potencial de rendimento geral de produto baixo. Em modalidades adicionais, os presentes métodos permitem ainda utilização de D-glicose, D-xilose e/ou vários outros açúcares ou misturas com o mesmo MEG em alto rendimento ou ácido glicólico comparado com outros métodos de produção de MEG ou ácido glicólico com base em glicose.
[0010] Em algumas modalidades, os presentes métodos resolvem os desafios e problemas abaixo comparado com outros métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) baseados em D-xilose, bem como outros métodos de produção de MEG e coproduto à base de D-xilose: um processo dependente de xilose (disponibilidade/limitações de mercado, alto preço ou baixa pureza, captação mais lenta e menos eficiente do que a D-glicose); inibição induzida por glicose de utilização de D-xilose. Em modalidades adicionais, os presentes métodos permitem ainda utilização de D-glicose, D-xilose e/ou vários outros açúcares ou misturas com o mesmo rendimento alto de MEG ou ácido glicólico ou MEG e um ou mais coprodutos comparado com outros métodos de produção de MEG com base em D-xilose (ou ácido glicólico), bem como outros métodos de produção de MEG e coproduto com base em D-xilose.
[0011] Em um aspecto, a presente invenção provê um micro organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas que produz um ou mais produtos derivados de D- gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário de pentose-fosfato.
[0012] Em algumas modalidades, o intermediário de pentose- fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato e em que a enzima tem atividade de D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5- fosfato ou D-xilulose-5-fosfato aldolase.
[0013] Em algumas modalidades, uma enzima ribulocinase catalisa a fosforilação de D-ribulose em D-ribulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por AraB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com AraB de E. coli (SEQ ID NO: 288).
[0014] Em algumas modalidades, uma enzima ribocinase catalisa a fosforilação de D-ribose em D-ribose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribocinase é codificada por RbsK de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rbsK de E. coli (SEQ ID NO: 290).
[0015] Em algumas modalidades, uma enzima xilulocinase catalisa a fosforilação de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribocinase é codificada por XuK de T. maritima. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com XuK de T. maritima (SEQ ID NO: 291).
[0016] Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em uma modalidade adicional, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina ou uma combinação dos mesmos. Em ainda uma outra modalidade, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA).
[0017] Portanto, em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade que converte um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em uma conversão sem perdas em intermediário de pentose-fosfato e compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade pentose- fosfato aldolase que converte o intermediário de pentose-fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfago (G3P).
[0018] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade que converte um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em uma conversão sem perdas em intermediário D-ribose-5-fosfato e compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade de D- ribose-5-fosfato aldolase (DERA) que converte o intermediário D-ribose- 5-fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfago (G3P).
[0019] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase. Em algumas modalidades, o microorganismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase (DERA). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 148 e 150. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase são tktA ou homólogo da mesma. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase são tktB ou homólogo da mesma. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 147 e 149. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de D-ribose- 5-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com deoC de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase é deoC de E. coli.
[0020] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: ATGACGATGAATATCGCGAAAATGATCGATCATACGCTGCTCAAA CCGGAAGCGACAGAACAACAAATCGTGCAACTGTGCACGGAAGC AAAGCAATACGGCTTTGCTGCCGTGTGCGTCAACCCAACGTGGGT GAAAACGGCGGCGCGCGAGCTTTCCGGCACGGATGTCCGCGTCT GCACGGTCATCGGCTTTCCACTTGGGGCAACGACGCCGGAAACA AAGGCGTTTGAAACAACGAACGCCATCGAAAACGGCGCTCGCGA AGTCGACATGGTGATCAACATCGGTGCGTTAAAAAGCGGGCAAGA CGAGCTTGTCGAGCGCGACATTCGTGCGGTTGTCGAAGCGGCGG CTGGCAGGGCGCTTGTCAAAGTGATCGTTGAAACGGCGCTTTTGA CCGATGAGGAAAAAGTGCGCGCCTGCCAGCTCGCAGTGAAAGCC GGCGCTGATTATGTGAAAACGTCGACCGGGTTTTCCGGCGGAGG TGCGACGGTGGAGGATGTGGCGCTGATGCGGAAAACGGTCGGC GACAGAGCAGGCGTCAAAGCATCAGGCGGCGTCCGTGACTGGAA AACCGCTGAGGCGATGATCAACGCCGGCGCGACGCGCATCGGCA CAAGCTCTGGGGTGGCGATCGTCACCGGCGGGACGGGCCGCGC TGACTACTAA (SEQ ID NO: 286).
[0021] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é codificada por uma sequência de cDNA otimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: CCATGGCAAACATCGCGAAGATGATTGACCACACCCTGCTGAAAC CGGAGGCGACCGAACAGCAAATCGTTCAGCTGTGCACCGAGGCG AAACAATACGGCTTCGCGGCGGTGTGCGTTAACCCGACCTGGGT TAAGACCGCGGCGCGTGAACTGAGCGGTACCGACGTGCGTGTTT GCACCGTGATTGGTTTCCCGCTGGGTGCGACCACCCCGGAGACC AAAGCGTTTGAAACCACCAACGCGATTGAGAACGGCGCGCGTGA AGTTGATATGGTGATCAACATTGGCGCGCTGAAGAGCGGTCAGGA CGAGCTGGTTGAGCGTGATATTCGTGCGGTGGTTGAGGCTGCGG CGGGTCGTGCGCTGGTGAAAGTTATTGTGGAAACCGCGCTGCTG ACCGACGAGGAAAAAGTGCGTGCGTGCCAACTGGCGGTTAAGGC GGGTGCGGATTACGTGAAAACCAGCACCGGTTTTAGCGGTGGCG GTGCGACCGTTGAGGATGTGGCGCTGATGCGTAAGACCGTTGGC GATCGTGCGGGTGTGAAAGCGAGCGGCGGTGTTCGTGACTGGAA GACCGCGGAAGCGATGATCAACGCGGGTGCGACCCGTATTGGTA CCAGCAGCGGTGTTGCGATTGTGACCGGCGGTACCGGTCGTGCG GATTATAAGCTT (SEQ ID NO: 287).
[0022] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTDLKASSLRALKLMDLTTLNDDDTDEKVIALCHQAKTPVGNTAAICIY PRFIPIARKTLKEQGTPEIRIATVTNFPHGNDDIDIALAETRAAIAYGAD EVDVVFPYRALMAGNEQVGFDLVKACKEACAAANVLLKVIIETGELKD EALIRKASEISIKAGADFIKTSTGKVAVNATPESARIMMEVIRDMGVEK TVGFKPAGGVRTAEDAQKYLAIADELFGADWADARHYRFGASSLLAS LLKALGHGDGKSASSY (SEQ ID NO: 256).
[0023] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTMNIAKMIDHTLLKPEATEQQIVQLCTEAKQYGFAAVCVNPTWVKT AARELSGTDVRVCTVIGFPLGATTPETKAFETTNAIENGAREVDMVINI GALKSGQDELVERDIRAVVEAAAGRALVKVIVETALLTDEEKVRACQL AVKAGADYVKTSTGFSGGGATVEDVALMRKTVGDRAGVKASGGVR DWKTAEAMINAGATRIGTSSGVAIVTGGTGRADY (SEQ ID NO: 297).
[0024] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus compreende uma mutação C37N e é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: ATGACGATGAATATCGCGAAAATGATCGATCATACGCTGCTCAAA CCGGAAGCGACAGAACAACAAATCGTGCAACTGTGCACGGAAGC AAAGCAATACGGCTTTGCTGCCGTGTGCGTCAACCCAACGTGGGT GAAAACGGCGGCGCGCGAGCTTTCCGGCACGGATGTCCGCGTCT GCACGGTCATCGGCTTTCCACTTGGGGCAACGACGCCGGAAACA AAGGCGTTTGAAACAACGAACGCCATCGAAAACGGCGCTCGCGA AGTCGACATGGTGATCAACATCGGTGCGTTAAAAAGCGGGCAAGA CGAGCTTGTCGAGCGCGACATTCGTGCGGTTGTCGAAGCGGCGG CTGGCAGGGCGCTTGTCAAAGTGATCGTTGAAACGGCGCTTTTGA CCGATGAGGAAAAAGTGCGCGCCTGCCAGCTCGCAGTGAAAGCC GGCGCTGATTATGTGAAAACGTCGACCGGGTTTTCCGGCGGAGG TGCGACGGTGGAGGATGTGGCGCTGATGCGGAAAACGGTCGGC GACAGAGCAGGCGTCAAAGCATCAGGCGGCGTCCGTGACTGGAA AACCGCTGAGGCGATGATCAACGCCGGCGCGACGCGCATCGGCA CAAGCTCTGGGGTGGCGATCGTCACCGGCGGGACGGGCCGCGC TGACTACTAA (SEQ ID NO: 286).
[0025] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus compreende uma mutação C37N e é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTMNIAKMIDHTLLKPEATEQQIVQLCTEAKQYGFAAVNVNPTWVKT AARELSGTDVRVCTVIGFPLGATTPETKAFETTNAIENGAREVDMVINI GALKSGQDELVERDIRAVVEAAAGRALVKVIVETALLTDEEKVRACQL AVKAGADYVKTSTGFSGGGATVEDVALMRKTVGDRAGVKASGGVR DWKTAEAMINAGATRIGTSSGVAIVTGGTGRADY (SEQ ID NO: 298).
[0026] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transaldolase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 152 e 154. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 151 e 153.
[0027] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase é rpe de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157.
[0028] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose- 5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 155.
[0029] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreendendo expressão de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase e uma atividade de D-ribose-5- fosfato aldolase, compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída de uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato mutase. Em algumas modalidades, a enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase endógena é gapA, a fosfoglicerato cinase é pgk e a fosfoglicerato mutase é gpmA ou gpmM.
[0030] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase é selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 212, 214, 216 e 218. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 211, 213, 215 e 217.
[0031] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 220 e 222. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 219 e 221.
[0032] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreendendo expressão de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase, uma atividade de fosfato acetiltransferase, uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase e uma atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma enzima 6- fosfofrutocinase endógena. Em algumas modalidades, a enzima 6- fosfofrutocinase endógena é pfkA e/ou pfkB.
[0033] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilose isomerase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylA de E. coli ou Pyromyces sp. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilose isomerase é selecionada de xylA de E. coli e xylA de Pyromyces sp. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 95 e 144. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 93, 94 e 143. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é xylB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose A 5-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 145.
[0034] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase. Em uma modalidade, a pelo menos enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com fbp de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose 1,6- bisfosfatase é fbp E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase converte D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato. Em outras modalidades, D-frutose é convertida em frutose 1,6-bisfosfato por enzimas endógenas no micro-organismo recombinante.
[0035] Em algumas modalidades de qualquer um dos micro organismos recombinantes descritos acima, o micro-organismo recombinante compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato- 1-desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. Em modalidades adicionais, a glicose 6-fosfato-1- desidrogenase é zwf, a 6-fosfogluconolactonase é pgl e a 6- fosfogluconato desidrogenase é gnd.
[0036] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do microorganismo recombinante. Em outras modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos de monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos.
[0037] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase e a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase permitem uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato e a conversão subsequente de D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído.
[0038] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz MEG ou ácido glicólico (GA) através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em algumas modalidades, MEG é produzido através da redução do glicolaldeído por enzima tendo atividade da glicolaldeído redutase em uma via C2. Em outras modalidades, o GA é produzido através da oxidação do glicolaldeído por enzima tendo atividade da glicolaldeído desidrogenase em uma via C2.
[0039] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de MEG ou GA é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato redutase, uma atividade de glicolaldeído redutase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de glicerato descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase e uma atividade de glioxilato redutase.
[0040] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz MEG através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e produz um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em outras modalidades, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e um ou mais compostos da via da serina. Em algumas modalidades preferidas, o um composto ou mais compostos da via da serina são selecionados de serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e etilenodiamina (EDA).
[0041] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de acetiltransferase tiolase ou acetil coenzima A, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase e uma atividade de acetoacetato descarboxilase e o um produto ou mais coprodutos compreendem acetona.
[0042] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase e uma atividade de álcool desidrogenase secundária e o um produto ou mais coprodutos compreendem isopropanol.
[0043] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de álcool desidrogenase secundária e uma atividade de desidratase e o um produto ou mais coprodutos compreendem propeno.
[0044] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase, uma atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase, uma atividade de metilglutaconil-CoA hidratase, uma atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase, uma atividade de metilcrotonil-CoA hidratase, uma atividade de 3-hidroxiisovaleril-CoA tioesterase, uma atividade de 3HIV cinase, uma atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase e uma atividade de 3HIV descarboxilase e o um ou mais coprodutos compreendem isobuteno.
[0045] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfaglicerato- fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase e uma atividade de glicerato 2-cinase e o um ou mais coprodutos compreendem L-serina.
[0046] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de transferase, uma atividade de formaldeído desidrogenase, uma atividade de formato desidrogenase, uma atividade associada a sistema de clivagem de glicina, uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade glicerato 2-cinase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de glicolato desidrogenase, uma atividade de alanina-glioxilato aminotransferase, uma atividade de alanina transaminase, uma atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H e o um ou mais coprodutos compreendem glicina. Em uma modalidade adicional, a atividade associada ao sistema de clivagem de glicina compreende uma enzima ou proteína selecionada de uma glicina descarboxilase (proteína P), uma aminometiltransferase (proteína T), uma di-hidrolipoamida desidrogenase (proteína L) e uma proteína H.
[0047] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de 3-fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de acetaldeído desidrogenase e uma atividade de etanolamina amônia liase e o um ou mais coprodutos compreendem monoetanolamina (MEA).
[0048] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina desidrogenase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase, uma atividade de aminoacetaldeído transaminase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase, uma atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina desidrogenase, uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de aldeído oxidase, uma atividade de N-acetil transferase ou O-acetil transferase, uma atividade de N-acetil serina desidrogenase, uma atividade de transaminase, uma atividade de desacetilase, uma atividade de serina aminase e uma atividade de 2,3-diaminopropanoato amônia liase e o um ou mais coprodutos compreendem etilenodiamina (EDA).
[0049] Em algumas modalidades de qualquer um dos micro organismos recombinantes descritos acima, o micro-organismo recombinante compreende ainda uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em um glicolaldeído redutase, uma glicolaldeído desidrogenase, uma lactato desidrogenase ou uma combinação das mesmas.
[0050] Em uma modalidade, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada para produzir ATP.
[0051] Em uma modalidade, formação de biomassa em excesso é minimizada e produção de MEG (ou ácido glicólico), ou MEG (ou GA) e um ou mais coprodutos, é maximizada.
[0052] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de produção de um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído usando um micro-organismo recombinante de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende cultivo do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo um ou mais açúcares pentose e/ou hexose provendo uma fonte de carbono até que o um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído sejam produzidos. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em modalidades adicionais, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina (EDA) ou uma combinação dos mesmos. Em ainda modalidades adicionais, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA).
[0053] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método de produção de um micro-organismo recombinante que produz ou acumula um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário D-ribose-5-fosfato, compreendendo: introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão do um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no intermediário D-ribose-5-fosfato; introduzir ou expressar no microorganismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído; introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais produtos a partir do glicolaldeído em uma via C2; e introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais produtos de G3P em uma via ou mais vias C3; e cultura do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose para produzir ou acumular o um ou mais produtos. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em modalidades adicionais, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina (EDA) ou uma combinação dos mesmos. Em ainda outras modalidades, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0054] Modalidades ilustrativas da invenção são ilustradas nos desenhos, nos quais: a FIG. 1 ilustra uma via de degradação para pentoses ou hexoses. O símbolo x significa enzimas a serem potencialmente diminuídas ou inativadas/abolidas, isto é, respectivo gene potencialmente atenuado ou deletado.
[0055] A FIG. 2 ilustra uma variação de uma via de degradação para pentoses ou hexoses que compreendem frutose-6-fosfato fosfocetolase (Fpk) e fosfato acetiltransferase (pta). O símbolo x significa enzimas a serem potencialmente diminuídas ou inativadas/abolidas, isto é, respectivo gene potencialmente atenuado ou deletado.
[0056] A FIG. 3 ilustra transformação sem perdas de vários açúcares em glicolaldeído e gliceraldeído 3-fosfato.
[0057] A FIG. 4 ilustra MEG em alto rendimento e possíveis vias de coprodução por meio de pentose-fosfato (D-ribose 5-fosfato, D-ribulose 5-fosfato e D-xilulose 5-fosfato).
[0058] A FIG. 5 ilustra vias de ácido glicólico de alto rendimento por meio de pentose-fosfato (D-ribose 5-fosfato, D-ribulose 5-fosfato e D- xilulose 5-fosfato).
[0059] A FIG. 6 ilustra uma visão geral das vias de coprodução de MEG e Ser, Gly, MEA, EDA.
[0060] A FIG. 7 ilustra vias de produção de EDA publicadas. Do WO 2014/049382. Reação F: aminação direta de L-serina por meio de L- serina aminase. Reação G: aminação direta de piruvato via 2,3- diaminopropionato amônia liase.
[0061] A FIG. 8 é uma representação do alinhamento de DERA de E. coli e B. Caldolyticus com mutações destacadas.
[0062] A FIG. 9 é um esquema mostrando a reação de um ensaio para medição da atividade de pentose cinase.
[0063] A FIG. 10 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima rbsK recombinante em um substrato de pentose. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0064] A FIG. 11 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima xilulocinase recombinante em um substrato de pentose. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0065] A FIG. 12 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima AraB recombinante em um substrato de pentose. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0066] A FIG. 13 é um esquema mostrando a reação de um ensaio para medição da atividade DERA recombinante usando o substrato natural, 2-desóxi-robose-5P.
[0067] A FIG. 14 é um esquema mostrando a reação de um ensaio para medição da atividade de DERA recombinante de um substrato de pentose.
[0068] A FIG. 15 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima DERA derivada de E. coli comercialmente disponível usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0069] A FIG. 16 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima DERA do tipo selvagem derivada de E. coli recombinante usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0070] A FIG. 17 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma enzima DERA de tipo selvagem derivada de B. Caldolyticus recombinante usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0071] A FIG. 18 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma variante da enzima DERA mutada em C47N derivada de E. coli recombinante usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0072] A FIG. 19 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma variante da enzima DERA mutada em C47N derivada de E. coli recombinante usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0073] A FIG. 20 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de uma variante da enzima DERA mutada em K201N derivada de E. coli recombinante usando o substrato natural, desóxi-ribose-5P. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0074] A FIG. 21 é um esquema mostrando a reação de um ensaio para medição da atividade de aldA usando um substrato de glicoaldeído.
[0075] A FIG. 22 é um gráfico de uma curva de Michaelis-Menten de aldA usando glicoaldeído como um substrato. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato.
[0076] A FIG. 23 é um esquema mostrando a reação de um ensaio para medir a produção de glicolato de uma pentose.
[0077] A FIG. 24 é um esquema de atividade DERA usando uma cepa MG1655-ΔtktA-ΔtktB expressando a proteína DERA e crescendo em xilose.
[0078] A FIG. 25 é um gráfico de curvas de crescimento de cepas de E. coli crescendo em meio mínimo de xilose.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0079] As definições e abreviações que seguem devem ser usadas para interpretação da invenção.
[0080] Conforme usado aqui e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um", "uma" e "o", “a” incluem referentes no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzimas e a referência a "o micro-organismo" inclui referência a um micro-organismo ou mais micro-organismos e assim por diante.
[0081] Como usado aqui, os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tem”, “tendo”, “contém”, “contendo” ou qualquer outra variação dos mesmos pretendem compreender uma inclusão não exclusiva. Uma composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressamente declarado o contrário, "ou" se refere a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo.
[0082] Os termos "cerca de" e "próximo de", conforme usado aqui para modificar um valor numérico, indicam uma faixa próxima em torno desse valor explícito. Se "X" fosse o valor, "cerca de X" ou "próximo de X" indicaria um valor de 0,9X a 1,1X ou, em algumas modalidades, um valor de 0,95X a 1,05X. Qualquer referência a "cerca de X" ou "próximo de X" indica especificamente pelo menos os valores X, 0,95X, 0,96X, 0,97X, 0,98X, 0,99X, 1,01X, 1,02X, 1,03X, 1,04X e 1,05X. Assim, "cerca de X" e "próximo de X" pretendem ensinar e prover suporte para descrição escrito para uma limitação de reivindicação de, por exemplo, "0,98X".
[0083] Como usado aqui, os termos "microbiano", "organismo microbiano" e "micro-organismo" incluem qualquer organismo que exista como uma célula microscópica que está incluída nos domínios de arqueias, bactérias ou eucariotas, os últimos incluindo leveduras e fungos filamentosos, protozoários, algas ou Protista superior. Portanto, o termo pretende compreender células procarióticas ou eucarióticas ou organismos tendo um tamanho microscópico e inclui bactérias, arqueias e eubactérias de todas as espécies, bem como micro-organismos eucarióticos, tais como leveduras e fungos. Também estão incluídas culturas de células de qualquer espécie que possam ser culturadas para a produção de um produto químico.
[0084] Como descrito aqui, em algumas modalidades, os micro organismos recombinantes são micro-organismos procarióticos. Em algumas modalidades, os micro-organismos procarióticos são bactérias. "Bactérias" ou "eubactérias" se referem a um domínio de organismos procarióticos. As bactérias incluem pelo menos onze grupos distintos como segue: (1) bactérias Gram-positivas (gram+), das quais existem duas subdivisões principais: (1) grupo G+ Calto (Actinomycetes, Mycobateria, Micrococcus, outros) (2) Grupo G+C baixo (Bacillus, Clostridia, Lactobacillus, Staphylococci, Streptococci, Mycoplasmas); (2) Proteobactérias, por exemplo, bactérias Gram-negativas fotossintéticas + não fotossintéticas roxas (inclui a maioria das bactérias Gram-negativas "comuns"); (3) Cianobactérias, por exemplo, fototróficos oxigenados; (4) Espiroquetas e espécies relacionadas; (5) Planctomicetes; (6) Bacteroides, Flavobactérias; (7) Clamídia; (8) Bactérias verdes de enxofre; (9) Bactérias verdes sem enxofre (também fototróficos anaeróbicos); (10) Micrococos radiorresistentes e parentes; (11) Termofílicos Thermotoga e Thermosipho.
[0085] "Bactérias Gram-negativas" incluem cocos, bastonetes não entéricos e bastonetes entéricos. Os gêneros de bactérias Gram- negativas incluem, por exemplo, Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema e Fusobacterium.
[0086] "Bactérias Gram-positivas" incluem cocos, bastonetes não esporulados e bastonetes esporulados. Os gêneros de bactérias gram positivas incluem, por exemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces.
[0087] Os termos "micro-organismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" são usados intercomutavelmente aqui e se referem a micro-organismos que foram geneticamente modificados para expressar ou superexpressar enzimas endógenas, para expressar enzimas heterólogas, tais como aquelas incluídas em um vetor, em um construto de integração, ou que têm uma alteração em expressão de um gene endógeno. Por "alteração" quer dizer que a expressão do gene, ou nível de uma molécula de RNA ou moléculas de RNA equivalentes codificando um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídicas, ou atividade de um ou mais polipeptídeos ou subunidades polipeptídicas, é regulado para mais ou para menos, de forma que expressão, nível ou atividade seja maior ou menor do que aquele observado na ausência da alteração. Por exemplo, o termo "alterar" pode significar "inibir", mas o uso da palavra "alterar" não é limitado a essa definição. É compreendido que os termos "microorganismo recombinante" e "célula hospedeira recombinante" se referem não apenas ao micro-organismo recombinante particular, mas à progênie ou progênie potencial de tal micro-organismo. Devido ao fato que certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo como usado aqui.
[0088] O termo "expressão" em relação a uma sequência de gene se refere à transcrição do gene e, conforme apropriado, à tradução do transcrito de mRNA resultante para uma proteína. Assim, como ficará claro a partir do contexto, a expressão de uma proteína resulta da transcrição e tradução da sequência do quadro de leitura aberta. O nível de expressão de um produto desejado em uma célula hospedeira pode ser determinado ou com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula ou na quantidade do produto desejado codificado pela sequência selecionada. Por exemplo, mRNA transcrito de uma sequência selecionada pode ser quantificado por qRT-PCR ou por hibridização Northern (vide Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). A proteína codificada por uma sequência selecionada pode ser quantificada através de vários métodos, por exemplo, através de ELISA, através do ensaio da atividade biológica da proteína ou através do emprego de ensaios que são independentes de tal atividade, tal como Western blotting ou radioimunoensaio, usando anticorpos que reconhecem e se ligam à proteína. Vide Sambrook e outros, 1989, supra.
[0089] O termo "polinucleotídeo" é usado aqui intercomutavelmente com o termo "ácido nucleico" e se refere a um polímero orgânico composto por dois ou mais monômeros incluindo nucleotídeos, nucleosídeos ou análogos dos mesmos, incluindo, mas não limitado a, ácido desoxirribonucleico (DNA) de filamento simples ou duplo, de sentido ou antissentido de qualquer comprimento e, onde apropriado, ácido ribonucleico (RNA) de filamento simples ou duplo, de sentido ou antissentido de qualquer comprimento, incluindo siRNA. O termo "nucleotídeo" se refere a qualquer um de vários compostos que consistem em um açúcar ribose ou desoxirribose unido a uma base purina ou pirimidina e a um grupo fosfato, e que são unidades estruturais básicas de ácidos nucleicos. O termo "nucleosídeo" se refere a um composto (tal como guanosina ou adenosina) que consiste em uma base de purina ou pirimidina combinada com desoxirribose ou ribose e é encontrado especialmente em ácidos nucleicos. O termo "análogo de nucleotídeo" ou "análogo de nucleosídeo" se refere, respectivamente, a um nucleotídeo ou nucleosídeo em que um ou mais átomos individuais foram substituídos por um átomo diferente ou por um grupo funcional diferente. Consequentemente, o termo polinucleotídeo inclui ácidos nucleicos de qualquer comprimento, DNA, RNA, análogos e fragmentos dos mesmos. Um polinucleotídeo de três ou mais nucleotídeos também é chamado oligômero nucleotídico ou oligonucleotídeo.
[0090] É compreendido que os polinucleotídeos descritos aqui incluem "genes" e que as moléculas de ácido nucleico descritas aqui incluem "vetores" ou "plasmídeos". Consequentemente, o termo "gene", também chamado de "gene estrutural" se refere a um polinucleotídeo que codifica uma sequência particular de aminoácidos, que compreende a totalidade ou parte de uma ou mais proteínas ou enzimas, e pode incluir sequências de DNA reguladoras (não transcritas), tais como sequências promotoras, que determinam, por exemplo, as condições sob as quais o gene é expresso. A região transcrita do gene pode incluir regiões não traduzidas, incluindo íntrons, região 5'-não traduzida (UTR) e 3'-UTR, bem como a sequência de codificação.
[0091] O termo "enzima" como usado aqui se refere a qualquer substância que catalisa ou promove uma ou mais reações químicas ou bioquímicas, que geralmente inclui enzimas totalmente ou parcialmente compreendidas de um polipeptídeo ou polipeptídeos, mas pode incluir enzimas compreendidas de uma molécula diferente incluindo polinucleotídeos.
[0092] Como usado aqui, o termo "de ocorrência não natural", quando usado em referência a um organismo micro-organismo ou atividade de enzima da invenção, pretende significar que o organismo micro-organismo ou enzima tem pelo menos uma alteração genética tipicamente não encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies referidas, incluindo cepas de tipo selvagem das espécies referidas. Alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos expressáveis codificando polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, deleções de ácido nucleico e/ou outra interrupção funcional do material genético do microorganismo. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões de codificação e fragmentos funcionais das mesmas, para polipeptídeos heterólogos, homólogos ou ambos heterólogos e homólogos às espécies referidas. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras de não codificação nas quais as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Um micro-organismo ou atividade de enzima exemplar de ocorrência não natural inclui a atividade de hidroxilação descrita acima.
[0093] O termo "exógeno" como usado aqui com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., se refere a moléculas que não são tipicamente ou naturalmente encontradas em e/ou produzidas por uma dada levedura, bactéria, organismo, micro-organismo ou célula na natureza.
[0094] Por outro lado, o termo "endógeno" ou "nativo" como usado aqui com referência a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., se refere a moléculas que são tipicamente ou naturalmente encontradas em e/ou produzidas por uma dada levedura, bactéria, organismo, micro-organismo ou célula na natureza.
[0095] O termo "heterólogo" como usado aqui no contexto de uma célula hospedeira modificada se refere a várias moléculas, por exemplo, polinucleotídeos, polipeptídeos, enzimas, etc., em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: (a) a molécula(s) é/são estranhas (“exógenas”) para a (ou seja, não são encontrados naturalmente na) célula hospedeira; (b) a(s) molécula(s) é/são naturalmente encontradas em (por exemplo, é "endógena para") um dado micro-organismo hospedeiro ou célula hospedeira, mas é produzida em um local não natural ou em uma quantidade não natural na célula; e/ou (c) a(s) molécula(s) difere(m) em sequência de nucleotídeo ou aminoácido da(s) sequência(s) de nucleotídeo ou de aminoácido endógena(s) de modo que a molécula diferindo em sequência de nucleotídeo ou aminoácido do nucleotídeo ou aminoácido endógeno como encontrado endogenamente é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que a encontrada naturalmente) na célula.
[0096] O termo "homólogo", como usado aqui com respeito a uma enzima ou gene original de uma primeira família ou espécie, se refere a enzimas ou genes distintos de uma segunda família ou espécie que são determinados através de análises funcionais, estruturais ou genômicas ser uma enzima ou gene da segunda família ou espécie que corresponde à enzima ou gene original da primeira família ou espécie. Homólogos geralmente têm similaridades funcionais, estruturais ou genômicas. São conhecidas técnicas através das quais homólogos de uma enzima ou gene podem ser facilmente clonados usando sondas genéticas e PCR. A identidade de sequências clonadas como homólogas pode ser confirmada usando ensaios funcionais e/ou através de mapeamento genômico dos genes.
[0097] Uma proteína tem "homologia com" ou é "homóloga a" uma segunda proteína se a sequência de aminoácidos codificada por um gene tem uma sequência de aminoácidos similar àquela do segundo gene. Alternativamente, uma proteína tem homologia com uma segunda proteína se as duas proteínas tiverem sequências de aminoácidos "similares". Assim, o termo "proteínas homólogas" pretende significar que as duas proteínas têm sequências de aminoácidos similares. Em certos casos, a homologia entre duas proteínas é indicativa de sua ancestralidade compartilhada, relacionada pela evolução. Os termos "sequências homólogas" ou "homólogos" são imaginados, acreditados ou conhecidos estar funcionalmente relacionados. Uma relação funcional pode ser indicada em qualquer uma de várias maneiras, incluindo, mas não limitado a: (a) grau de identidade de sequência e/ou (b) a mesma função biológica ou similar. Preferivelmente, ambos (a) e (b) são indicados. O grau de identidade de sequência pode variar, mas em uma modalidade, é de pelo menos 50% (quando usando programas de alinhamento de sequência padrão conhecidos na técnica), pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75% , pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos 98,5% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9%. Homologia pode ser determinada usando programas de software prontamente disponíveis na técnica, tais como aqueles discutidos em Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e outros, Eds., 1987) Suplemento 30, seção 7.718, Tabela 7.71. Alguns programas de alinhamento são MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, Reino Unido) e ALIGN Plus (Scientifc and Educational Software, Pensilvânia). Outros programas de alinhamento não limitantes incluem Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan), AlignX e Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma função biológica similar pode incluir, mas não está limitada a: catalisar a mesma reação enzimática ou similar; ter a mesma seletividade ou similar para um substrato ou cofator; ter a mesma estabilidade ou estabilidade similar; ter a mesma tolerância ou tolerância similar a várias condições de fermentação (temperatura, pH, etc.); e/ou ter a mesma tolerância ou tolerância similar a vários substratos metabólicos, produtos, subprodutos, intermediários, etc. O grau de similaridade em função biológica pode variar, mas em uma modalidade, é pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos cerca de 91% , pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos 98,5% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de acordo com um ou mais ensaios conhecidos por um versado na técnica para determinar uma dada função biológica.
[0098] O termo "variante" se refere a qualquer polipeptídeo ou enzima descrito aqui. Uma variante também compreende um ou mais componentes de um multímero, multímeros compreendendo um componente individual, multímeros compreendendo múltiplos de um componente individual (por exemplo, multímeros de uma molécula de referência), um produto de degradação química e um produto de degradação biológica. Em particular, modalidades não limitantes, uma enzima pode ser uma "variante" em relação a uma enzima de referência em virtude de alteração(ões) em qualquer parte da sequência polipeptídica codificando a enzima de referência. Uma variante de uma enzima de referência pode ter atividade de enzima de pelo menos 10%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 105%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130% ou mais em um ensaio padrão usado para medição da atividade de enzima de uma preparação da enzima de referência. Em algumas modalidades, uma variante também pode se referir a polipeptídeos tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93 %, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com as enzimas de comprimento integral ou não processadas da presente invenção. Em algumas modalidades, uma variante também pode se referir a polipeptídeos tendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93 %, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com as enzimas maduras ou processadas da presente invenção.
[0099] O termo "sequência de sinal" como usado aqui se refere a uma sequência de aminoácidos que direciona peptídeos e polipeptídeos para sítios celulares ou para o ambiente extracelular. As sequências de sinal estão tipicamente na porção N-terminal de um polipeptídeo e são tipicamente removidas enzimaticamente. Os polipeptídeos que têm suas sequências de sinal são referidos como sendo de comprimento total e/ou não processados. Os polipeptídeos que tiveram suas sequências de sinal removidas são referidos como maduros e/ou processados.
[00100] O termo "potencial de rendimento" como usado aqui se refere a um rendimento de um produto de uma via biossintética. Em uma modalidade, o potencial de rendimento pode ser expresso como uma porcentagem em peso de produto final por peso de composto inicial.
[00101] O termo "rendimento máximo termodinâmico" como usado aqui se refere ao rendimento máximo de um produto obtido a partir da fermentação de uma dada matéria-prima, tal como glicose, com base no valor energético do produto comparado com a matéria-prima. Em uma fermentação normal, sem uso de fontes de energia adicionais tal como luz, gás hidrogênio ou metano ou eletricidade, por exemplo, o produto não pode conter mais energia do que a matéria-prima. O rendimento máximo termodinâmico significa um rendimento do produto no qual toda a energia e massa da matéria-prima são convertidas no produto. Esse rendimento pode ser calculado e é independente de uma via específica. Se uma via específica para um produto tem um rendimento menor do que o rendimento máximo termodinâmico, então ele perde massa e pode mais provavelmente ser melhorado ou substituído por uma via mais eficiente para o produto.
[00102] O termo "redox equilibrado" se refere a um conjunto de reações, que juntas produzem tantos quantos cofatores redox elas consomem. Projeto de vias metabólicas e engenharia de um organismo de modo que os cofatores redox sejam equilibrados ou perto de ser equilibrados geralmente resultam em uma produção com rendimento maior, mais eficiente, dos compostos desejados. Reações redox sempre ocorrem juntas como duas semirreações acontecendo simultaneamente, uma sendo uma reação de oxidação e a outra uma reação de redução. Nos processos redox, o redutor transfere elétrons para o oxidante. Assim, na reação, o redutor ou agente de redução perde elétrons e é oxidado, e o oxidante ou agente de oxidação ganha elétrons e é reduzido. Em uma modalidade, as reações redox ocorrem em um sistema biológico. Energia biológica é frequentemente armazenada e liberada por meio de reações redox. Fotossíntese envolve a redução do dióxido de carbono em açúcares e a oxidação da água em oxigênio molecular. A reação reversa, respiração, oxida açúcares para produzir dióxido de carbono e água. Como etapas intermediárias, os compostos de carbono reduzido são usados para reduzir dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NAD+), que então contribui para a criação de um gradiente de prótons, que direciona a síntese de trifosfato de adenosina (ATP) e é mantido pela redução de oxigênio. O termo estado redox é frequentemente usado para descrever o equilíbrio de GSH/GSSG, NAD+/NADH e NADP+/NADPH em um sistema biológico tal como uma célula ou órgão. O estado redox é refletido no equilíbrio de vários conjuntos de metabolitos (por exemplo, lactato e piruvato, beta-hidroxibutirato e acetoacetato), cuja interconversão é dependente dessas razões. Um estado redox anormal pode se desenvolver em uma variedade de situações prejudiciais, tais como hipóxia, choque e sepse.
[00103] O termo "via C2", "via de ramificação C2", "via bioquímica C2" ou "corrente C2" como usado aqui se refere a uma via bioquímica em que MEG pode ser produzido por meio de glicolaldeído.
[00104] O termo "via C3", "via de ramificação C3", "via bioquímica C3" ou "corrente C3" como usado aqui se refere a uma via bioquímica em que MEG e/ou um ou mais coprodutos tais como acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e/ou compostos da via da serina podem ser produzidos por meio de piruvato, acetil-CoA ou di- hidroxiacetonafosfato (DHAP).
[00105] Os termos "açúcares C5" e "açúcares pentose" são usados intercomutavelmente e se referem a moléculas de açúcar compreendidas de 5 átomos de carbono. Similarmente, os termos "açúcares C6" e "açúcares hexose" são usados intercomutavelmente e se referem a moléculas de açúcar compreendidas de 6 átomos de carbono. Os açúcares podem ser monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade exemplar, o açúcar é glicose ou oligômeros de glicose do mesmo. Em outras modalidades, os oligômeros de glicose são selecionados de frutose, sacarose, amido, celobiose, maltose, lactose e celulose. Em ainda outras modalidades, os açúcares compreendem D-xilose, D-galactose, D-manose, D- arabinose, L-arabinose, D-frutose ou uma combinação dos mesmos.
Introdução
[00106] A presente invenção permite acessar os intermediários- chave amplamente utilizáveis gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído, sem perda de carbono, de uma variedade de açúcares C5 (pentose) e C6 (hexose), dependendo principalmente de reações naturais, comprovadas, introduzindo apenas uma nova reação catalisada por uma pentose-fosfato aldolase. Em algumas modalidades, hexoses podem ser selecionadas de D-alose, D-altrose, D-glicose, D- manose, D-gulose, D-idose, D-galactose, D-talose, D-tagtose, D- sorbose, D-frutose, D-psicose e outras hexoses conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, pentoses podem ser selecionadas de D- xilose, D-ribose, D-arabinose, D-lixose, D-xilulose, D-ribulose e outras pentoses conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as hexoses e pentoses podem ser selecionadas do enantiômero levogiratório ou dextrogiratório de qualquer uma das hexoses e pentoses descritas aqui.
[00107] As reações enzimáticas descritas da invenção permitem, por exemplo, produção de MEG em alto rendimento (ou ácido glicólico), ou MEG (ou GA) e coprodutos, a partir de glicose, xilose ou vários outros açúcares que podem entrar na via das pentose-fosfato ou uma variedade de oligômeros de açúcar que podem ser facilmente decompostos nos monômeros mencionados acima ou uma mistura deles.
[00108] Comparado com outros métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) com base em glicose, os presentes métodos resolvem ou reduzem os problemas que seguem: deficiência de ATP; excesso de NADH grande; baixo potencial de rendimento geral de produto. Comparado com outros métodos de produção de MEG ou ácido glicólico com base em glicose, os presentes métodos permitem ainda utilização de D-glicose, D-xilose e/ou vários outros açúcares ou misturas com o mesmo rendimento alto.
[00109] Comparado com outros métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) à base de D-xilose, bem como outros métodos de produção de MEG e coproduto à base de D-xilose, os presentes métodos resolvem os desafios e problemas que seguem: um processo dependente de xilose (disponibilidade/limitações de mercado, alto preço ou baixa pureza, captação mais lenta e menos eficiente do que D- glicose); inibição induzida por glicose de utilização de D-xilose. Comparado com outros métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) à base de D-xilose, bem como outros métodos de produção de MEG e coproduto à base de D-xilose, os presentes métodos permitem ainda a utilização de D-glicose, D-xilose e/ou vários outros açúcares ou misturas com o mesmo rendimento alto.
[00110] Todos os métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) atualmente conhecidos usando glicose como matéria-prima têm baixo potencial de rendimento. Esse é um inconveniente intrínseco da bioquímica de como glicose é degradada em MEG, com uma descarboxilação ocorrendo por molécula de MEG (ou ácido glicólico) produzida para todas as vias propostas e conhecidas. No entanto, uma descarboxilação por MEG é muito para atingir o redox neutro e, portanto, rendimento ideal.
[00111] A presente invenção descreve uma forma inteiramente nova de degradação de pentose ou hexose por meio da via da pentose fosfato e/ou seus intermediários-chave de pentose-fosfato, incluindo D-ribose- 5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato e D-xilulose-5-fosfato, através do estabelecimento de uma reação de pentose-fosfato aldolase até agora não descrita, em que a aldolase tem atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade de D- xilulose-5-fosfato aldolase, produzindo os precursores-chave glicoladeído e gliceraldeído 3-fosfato (G3P) (FIG. 1). Dependendo da entrada na via da pentose fosfato, essa conversão é conseguida sem perda de carbono, mesmo de hexoses. A presente invenção permite assim a produção à base de hexose e/ou pentose de vários derivados de G3P ou glicolaldeído com alto rendimento. Utilização de uma entrada não oxidativa na via da pentose fosfato
[00112] Essa tecnologia pode ser usada com uma transformação sem perdas de glicose em um intermediário de pentose-fosfato por meio da via não oxidativa de pentose fosfato. Em que o intermediário de pentose-fosfato compreende D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato. Uma transcetolase, tal como codificada por tktA ou tktB de E. coli, é usada como uma entrada não oxidativa na via da pentose fosfato para transformar os intermediários de glicólise D-frutose 6-fosfato e D-gliceraldeído 3-fosfato em D-xilulose 5-fosfato e D-eritrose 4-fosfato. D-eritrose 4-fosfato e um outro D-frutose 6-fosfato são processados adicionalmente por uma transaldolase (tal como talA ou talB de E. coli) e então por uma transcetolase em D-ribose 5-fosfato e D-xilulose 5-fosfato. As moléculas de D-xilulose 5-fosfato podem ser prontamente transformadas em D-ribose 5-fosfato por D-ribulose 5- fosfato 3-epimerase (rpe) e D-ribose 5-fosfato isomerase (rpi) (FIG. 1).
[00113] A equação final é: 2,5 D-glicose + 2,5 ATP + 0,5 fosfato ^ 3 D-ribose 5-fosfato + 2,5 ADP
[00114] Se D-xilose for usada como fonte de carbono, uma isomerização simples (xylA em E. coli) e ativação (xylB em E. coli, xilulose 5-cinase) geram D-xilulose 5-fosfato, que através de ação de rpe e rpi pode ser transformada em D-ribose 5-fosfato. Essa já é a rota natural de utilização de xilose em muitos organismos tal como a E. coli.
[00115] A equação final é: 2 D-xilose +2 ATP ^ 2 D-ribose 5-fosfato + 2 ADP Otimização de fluxo para a entrada não oxidativa na via da pentose fosfato
[00116] Para evitar a perda de um carbono, a entrada oxidativa na via da pentose fosfato por meio de 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona e descarboxilação oxidativa em D-ribulose 5-fosfato, a via comum em E. coli, não devem ser utilizadas. É vantajoso inibir pelo menos uma ou mais das reações apropriadas, a saber, glucose 6-fosfato 1- desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase, eliminando ou reprimindo um ou mais dos genes responsáveis (em E. coli : zwf, pgl, gnd). Utilização de entrada alternativa, não oxidativa, na via da pentose fosfato
[00117] Alternativamente, uma D-frutose 6-fosfato fosfocetolase (Fpk) específica e uma fosfato acetiltransferase (PTA) podem ser usadas como entrada sem perdas na via da pentose fosfato, formando uma D-eritrose 4-fosfato e uma acetil-CoA a partir de D-frutose 6- fosfato. D-eritrose 4-fosfato e uma D-frutose 6-fosfato adicional são processados em duas D-ribose 5-fosfatos, como descrito acima (FIG. 2).
[00118] A equação final é: 2 D-glucose +2 ATP +1 CoA ^ 2 D-ribose 5-fosfato +1 acetil-CoA +2 ADP Sub-regulagem das reações a jusante de glicólise
[00119] A parte superior de glicólise é necessária para transformar 2,5 D-glicose ou D-frutose em intermediários-chave 2x D-frutose-6- fosfato e 1x D-gliceraldeído-3-fosfato. Para reduzir ou eliminar o fluxo adicional através da parte inferior da glicólise, isto é, a fosforilação oxidativa de D-gliceraldeído 3-fosfato em 1,3-bisfosfo D-glicerato e sua conversão subsequente em 3-fosfo-D-glicerato e 2-fosfo- D-glicerato, atividade de D-gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato mutase, codificados por gapA, pgk e gpmA/gpmM, respectivamente, em E. coli, pode ser diminuída.
[00120] Se a entrada alternativa na via da pentose fosfato por meio de Fpk for utilizada, então nenhum D-gliceraldeído 3-fosfato é necessário e a atividade de 6-fosfofrutocinase apropriada pode ser diminuída ou excluída (genes pfkA e/ou pfkB em E. coli). Utilização de mais açúcares
[00121] Se um organismo tem ou foi dotado com a capacidade de consumir amido ou sacarose ou celulose ou maltose, ou oligômeros de açúcares C5 ou C6 tal como glicose ou xilose, por exemplo, através da expressão de uma sacarose invertase ou importador de celobiose e celobiose hidrolase, ou qualquer outro açúcar que possa ser degradado por meio da via da pentose fosfato, ele pode gerar o intermediário-chave da presente invenção, D-ribose 5-fosfato, então permitindo que ele utilize as composições e métodos da presente invenção da mesma maneira e na mesma extensão, produzindo os mesmos benefícios. Por exemplo, L- e D-arabinose podem ser ambos processados naturalmente em E. coli, sem perda de carbono, através de vias de degradação conhecidas, nos intermediários da via da pentose fosfato D-xilulose 5- fosfato ou D-ribulose 5-fosfato, respectivamente (FIG. 3). Esses podem então ser prontamente convertidos em D-ribose 5-fosfato por meio de atividade mediada por rpe e rpi. Também D-manose e D-galactose são naturalmente, por exemplo em E. coli, degradadas na molécula de entrada da via da pentose fosfato D-frutose 6-fosfato.
[00122] A D-frutose, em E. coli, não é degradada por meio de D- frutose 6-fosfato, mas sim por meio de D-frutose 1-fosfato e D-frutose 1,6-bifosfato. No entanto, uma simples superexpressão da frutose intrínseca 1,6-bisfosfatase levaria à D-frutose 6-fosfato e, portanto, permite a utilização da presente invenção com D-frutose, ou D-frutose produzindo oligômeros tal como sacarose. Possível utilização dos produtos de reação
[00123] G3P é um intermediário-chave inicial da glicólise e, portanto, pode ser usado para a síntese da maioria dos produtos químicos que podem ser derivados da glicose tais como, mas não limitados a, acetona, 2-propanol, propeno, isobuteno, monoetilenoglicol (MEG), ácido glicólico (GA) e compostos da via da serina. Os compostos da via da serina podem incluir L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e etilenodiamina (EDA). Glicolaldeído pode ser facilmente convertido em MEG por meio de redução ou GA por meio de oxidação (FIG. 4 e FIG. 5).
[00124] A maioria dos organismos também pode oxidar naturalmente glicolaldeído em ácido glioxílico e convertê-lo ainda nos intermediários comuns oxaloacetato, malato ou 2-fosfoglicerato (via semialdeído tartronato). Esses intermediários podem ser transformados em biomassa ou em uma variedade de compostos químicos. Se essas reações devem ser evitadas, por exemplo para melhorar a produção de MEG, elas podem ser diminuídas ou eliminadas pela redução ou exclusão da atividade dos genes apropriados. Produção de alto rendimento de MEG
[00125] Essa tecnologia permite uma via de alto rendimento, nova e vantajosa para a produção de MEG a partir de glicose ou xilose, ou mesmo misturas de ambos os açúcares utilizando a mesma via de degradação de núcleo (FIG. 4).
[00126] Se glicose for utilizada para produção de MEG, então todos os métodos descritos até agora ensinam uma degradação por meio de glicólise em 3-fosfoglicerato e ainda por meio de reações da via da L- serina em MEG. No entanto, dessa forma esse composto de 3 carbonos será degradado em um composto de 2 carbonos (MEG), perdendo um CO2 por MEG, o que é verdadeiro para todas as variações de vias descritas. A produção de CO2 em excesso é acompanhada por uma superprodução de equivalentes de redução (NADH) e leva a uma perda significante de potencial de rendimento (apenas 0,69 g_MEG por grama de açúcar, vs 0,82 g_MEG de potencial de rendimento máximo termodinâmico): 1 D-glicose ^ 2 MEG + 2 CO2 + 2 NADH, y = 0,69 g/g
[00127] A produção de MEG fermentativa é descrita no WO2010/076324 (ou US2011/0294178; Metabolic Explorer), que é aqui incorporado em sua totalidade. Esse pedido sugeriu produção de diol por meio de descarboxilação e redução de 2-ceto ácido, incluindo uma via baseada na biossíntese de serina para o hidroxipiruvato intermediário e ainda para etilenoglicol. No entanto, a via revelada tem um potencial de rendimento total reduzido de 0,69 g_MEG/g_glucose, enquanto o rendimento máximo termodinâmico para uma conversão de glicose ^ MEG é 0,82 g/g. Essa via também não é redox equilibrada e tem um excesso grande de 2 mol de NADH por mol de glicose consumida, que precisa ser reoxidada para que a célula seja viável. Em uma fermentação aeróbica, esse NADH pode ser usado para gerar ATP, que, no entanto, estaria em excesso grande (2 NADH ^ 6 ATP), levando à formação de biomassa em excesso durante a fase de produção e, portanto, formação e rendimento de produto reduzidos.
[00128] Assim, a via de produção de MEG fermentativa revelada no WO2010/076324 tem uma deficiência de ATP (-1ATP por MEG), excesso de NADH (+1 NADH por MEG), potencial de baixo rendimento (ymax = 0,69 g_MEG/g_glucose) e é uma via desafiadora que não foi demonstrada em alta eficiência/produtividade.
[00129] A invenção do WO2011/130378A1 (ou US2011/0312049; Genomatica) propõe uma abordagem similar à do WO2010/076324 para produzir MEG a partir de glicose por meio de hidroxipiruvato, mas também menciona variações de via com intermediários-chave glicerato ou etanolamina alternativos, mas relacionados.
[00130] A invenção do WO2011/130378A1 tem os mesmos inconvenientes que o WO2010/076324, exceto a deficiência de ATP. ATP pode ser +0 ou +1 por MEG, dependendo das enzimas utilizadas.
[00131] A presente invenção permite um rendimento de MEG redox neutro a partir de D-glicose de 0,827 g/g se a via da pentose fosfato não oxidativa for usada para transformar D-glicose em D-ribose 5-fosfato (FIG. 4). 5/6 D-glicose ou 1 D-xilose ^ 2 MEG +1 CO2 +0 NADH, y = 0,827 g/g
[00132] Se voltando para o uso de D-xilose, outras invenções recentes demonstraram D-xilose para vias de MEG com um rendimento de 0,827 g/g.
[00133] Uma produção fermentativa demonstrada de MEG a partir de xilose (WO2013/126721), por meio de ribulose-1-fosfato, tem um potencial de rendimento alto (0,82 g_MEG/g_xilose) que é igual ao rendimento máximo termodinâmico. Ela produz MEG por meio de duas vias diferentes que são ativas em paralelo, uma corrente de 2 carbonos (via glicolaldeído) e uma corrente de 3 carbonos (via di- hidroxiacetonafosfato). O fluxo de C2 é fácil de implementar, mas o fluxo de C3 é difícil de implementar em alta eficiência por meio de engenharia metabólica. O fluxo de C3 utiliza as vias apresentadas no WO2010/076324 ou WO2011/130378.
[00134] Supondo uma importação de xilose tipicamente conduzida por ATP, o processo geral é pelo menos ATP neutro. Assim, um pouco de xilose e, portanto, rendimento, será perdido a fim de obter um pouco de ATP excedente necessário para crescimento e manutenção das células.
[00135] No entanto, a absorção da xilose não é tão eficiente e rápida quanto a da glicose, a fonte de carbono preferida da maioria dos microorganismos. Também, a presença de glicose no meio geralmente inibe utilização de outros açúcares tal como xilose. Para um processo mais eficiente, a regulagem do organismo que leva a esse consumo preferencial precisa ser interrompida e a cepa adaptada para a preferência de xilose ou coconsumo de açúcar.
[00136] O principal desafio, no entanto, é obter xilose como uma matéria-prima acessível e limpa. A xilose como produto químico puro é cara e não está disponível em grandes quantidades. A xilose em hidrolisados de hemicelulose está disponível em grandes quantidades e a um custo potencialmente menor do que a glicose, mas é acompanhada por muitas impurezas e substâncias que inibem fermentações.
[00137] Portanto, a produção fermentativa de MEG (ou ácido glicólico) a partir de xilose (WO2013/126721) representa um desafio em relação ao uso de xilose como matéria-prima (disponibilidade, preço, pureza, inibição da utilização de xilose por glicose) e ao uso de uma via C3, que não foi demonstrada em alta eficiência/produtividade. Além disso, há uma carência de ATP, + 0ATP (ou -1ATP se não estiver usando glicerato cinase), que não é suficiente para a manutenção celular.
[00138] Uma produção fermentativa demonstrada de MEG adicional a partir de xilose (Alkim e outros, Microb. Cell Fact. (2015) 14: 127), via xilulose-1-fosfato, é muito similar à via descrita pelo WO2013/126721. Ela tem o mesmo potencial de rendimento alto (0,82 g/g), difícil de implementar o fluxo C3 para produção de MEG por meio de DHAP, deficiência de ATP e desafios de matéria-prima.
[00139] Uma outra produção fermentativa demonstrada de MEG a partir de xilose (WO2013/119020), por meio de xilonato, compartilha similaridades com a via descrita pelo WO2013/126721. Ela produz glicolaldeído e piruvato como intermediários-chave, permitindo produção de MEG a partir de glicolaldeído com um potencial de rendimento de 0,41 g/g. Isso representa um rendimento relativo alto, pois é obtido com apenas metade do fluxo. No entanto, nenhuma via para converter o piruvato restante em MEG é apresentada no WO2013/119020 ou em outro lugar. Atualmente, nenhuma via realista e eficiente é conhecida para converter piruvato em MEG. Enquanto o piruvato como um coproduto em si permitiria um processo neutro redox geral (+0 NADH), ele não é um produto economicamente interessante e o processo careceria de 1 ATP (provavelmente ~2 ATP mais para exportação de piruvato). Assim, idealmente um coproduto economicamente interessante, derivado de piruvato, em alto rendimento é necessário que forneça ATP excedente. Portanto, a produção fermentativa de MEG a partir de xilose (WO2013/119020), por meio de xilonato, representa um desafio em relação ao uso de xilose como matéria-prima (disponibilidade, preço, pureza, inibição da utilização de xilose por glicose), baixo rendimento absoluto de MEG, deficiência de ATP (dependendo do coproduto, ela pode ser -1 a -3 ATP com piruvato) e exigir um coproduto derivado do piruvato com alto potencial de rendimento e ATP excedente.
[00140] A presente invenção apresenta uma solução adicional para produção de MEG em alto rendimento a partir de D-xilose. No entanto, diferente das soluções anteriores, essa solução também permite uma produção de MEG em alto rendimento a partir da D-glicose, usando a mesma via de degradação de núcleo. Coprodução em alto rendimento de MEG e compostos derivados DHAP
[00141] A presente invenção também permite uma via de alto rendimento, vantajosa, para a coprodução de MEG, que requer equivalentes de redução, com um composto cuja via biossintética gera equivalentes de redução, tais como acetona, 2-propanol, propeno, isobuteno e/ou compostos da via da serina. Em algumas modalidades, os compostos da via da serina incluem L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e/ou etilenodiamina (EDA). Embora a coprodução sinérgica de MEG com outros compostos tenha sido descrita anteriormente (vide Pedido US No. 62/305.814, Pedido US No. 62/430.742 e Pedido US No. 62/406.684, cada um dos quais é aqui incorporado em sua totalidade), essa solução permite utilização não apenas de D-xilose, mas de D-glicose e até mesmo misturas de D- glicose e D-xilose com o mesmo rendimento alto e vantagens de coprodução sinérgica. Produção em alto rendimento de ácido glicólico (GA)
[00142] As vias descritas de D-glicose para GA também passam por reações da via de 3-fosfoglicerato e L-serina, ou por meio da derivação de glioxilato. Em ambos os casos, um CO2 é perdido por ácido glicólico, novamente em excesso, levando a um rendimento máximo de apenas 0,84 g/g, muito menor do que potencial de rendimento máximo termodinâmico (1,7 g/g): 1 D-glicose ^ 2 GA + 2 CO2 + 6 NADH, y = 0,84 g/g
[00143] Novas vias com rendimento melhorado para a produção de GA foram descritas (WO2016079440, WO2013126721, WO2013119020). No entanto, elas funcionam apenas se D-xilose for usada como fonte de carbono, que atualmente não está prontamente disponível como uma mercadoria: 1 D-xilose ^ 2 GA +1 CO2 +4 NADH, y = 1,01 g/g
[00144] Usando as composições e métodos da presente invenção, o rendimento de D-glicose (com via da pentose fosfato não oxidativa) é significantemente aumentado. Também funciona com D-xilose com o mesmo rendimento (FIG. 5): 5/6 D-glicose ou 1 D-xilose -> 2 GA + 1 CO2 + 4 NADH, y = 1,01 g/g
[00145] As estequiometrias que seguem são dadas para produção de MEG (ou ácido glicólico, GA) por meio de vias padrão usando D- glicose ou D-xilose versus as vias da presente invenção usando D- glicose ou D-xilose.
[00146] Estequiometrias associadas às vias de D-glicose padrão (tal como revelado no WO2010/076324 ou no WO2011/130378A1) para produção de MEG ou GA: 1 D-glicose ^ 2 GA + 6 NADH + 0 ATP; y = 0,844 g/g ou 1 D-glucose ^ 2 MEG + 4 NADH +0 ATP; y = 0,689 g/g
[00147] Estequiometrias associadas a vias da presente invenção usando D-glicose para produção de MEG ou GA: 2,5 D-glicose + 2,5 ATP + 0,5 fosfato ^ 3 R5P ^ 3 GA + 3 DHAP + 3 NADH ^ 6 GA + 12 NADH + 3 ATP 1 D-glicose ^ 2,4 GA + 4,8 NADH + 1,2 ATP; y = 1,01 g/g ou 1 D-glicose ^ 2,4 MEG + 0 NADH + 1,2 ATP, y = 0,827 g/g
[00148] Estequiometrias associadas a vias de D-xilose padrão (tais como as vias descritas no WO2013/126721 ou em Alkim e outros, Microb Cell Fact (2015) 14: 127) para produção de MEG ou GA: 1 D-xilose ^ 2 GA + 4 NADH -1ATP *; y = 1,01 g/g ou 1 D-xilose ^ 2 MEG + 0 NADH -1 ATP *; y = 0,827 g/g * ~ -0,1 ATP se o simportador XylE for usado ao invés do importador de xilose ativo XylFGH
[00149] Estequiometrias associadas a vias da presente invenção usando D-xilose para produção de MEG ou GA: 1 D-xilose + 2 ATP ^ D-xilulose 5-P ^ D-Ribose 5-P ^ GA + 1 NADH + DHAP ^ 2 GA + 4 NADH + 1 ATP 1 D-xilose ^ 2 GA + 4 NADH -1 ATP *; y = 1,01 g/g ou 1 D-xilose ^ 2 MEG + 0 NADH -1 ATP *; y = 0,827 g/g * ~ -0,1 ATP se o simportador XylE for usado ao invés do importador de xilose ativo XylFGH
Monoetilenoglicol (MEG)
[00150] O monoetilenoglicol (MEG) é uma matéria-prima importante para aplicações industriais. Um uso principal de MEG é na fabricação de resinas, filmes e fibras de tereftalato de polietileno (PET). Além disso, o MEG é importante na produção de anticongelantes, refrigerantes, anticongelantes e descongelantes para aeronaves e solventes. MEG também é conhecido como etano-1,2-diol.
[00151] Etilenoglicol também é usado como um meio para transferência de calor por convecção em, por exemplo, automóveis e computadores refrigerados a líquido.
[00152] Devido ao seu ponto de ebulição alto e afinidade com água, o etilenoglicol é um dessecante útil. O etilenoglicol é amplamente usado para inibir a formação de clatratos de gás natural (hidratos) em dutos multifásicos longos que transportam gás natural a partir de campos de gás remotos para uma instalação de processamento de gás. Etilenoglicol pode ser recuperado a partir do gás natural e reutilizado como um inibidor após tratamento de purificação que remove água e sais inorgânicos.
[00153] Utilizações secundárias de etilenoglicol incluem na fabricação de capacitores, como um intermediário químico na fabricação de 1,4-dioxano e como um aditivo para evitar a corrosão em sistemas de resfriamento por líquido para computadores pessoais. Etilenoglicol também é usado na fabricação de algumas vacinas; como um ingrediente secundário em graxa para sapatos, tintas e corantes; como um tratamento para apodrecimento e fungos para madeira; e como um conservante para espécimes biológicos.
Ácido glicólico
[00154] Ácido glicólico é usado na indústria têxtil como agente de tingimento e curtimento, em processamento de alimentos como agente aromatizante e como conservante e na indústria farmacêutica como agente de cuidado da pele. Ele também é usado em adesivos e plásticos. O ácido glicólico é frequentemente incluído em polímeros de emulsão, solventes e aditivos para tintas e tintas a fim de melhorar as propriedades de fluxo e conferir brilho. Ele é usado em produtos de tratamento de superfície que aumentam o coeficiente de atrito em revestimentos de azulejos.
[00155] Devido à sua excelente capacidade de penetrar na pele, o ácido glicólico encontra aplicações em produtos de cuidados da pele para melhorar a aparência e textura da pele. Pode ser utilizado como peeling químico realizado por um dermatologista em concentrações de 20 a 70% ou kits caseiros em concentrações menores entre 10 e 20%. Em adição à concentração, o pH também desempenha um grande papel na determinação da potência de ácido glicólico em solução.
[00156] O ácido glicólico pode ser sintetizado de várias maneiras. A abordagem predominante utiliza uma reação catalisada de formaldeído com gás de síntese (carbonilação de formaldeído), por seu baixo custo. Ele também é preparado pela reação de ácido cloroacético com hidróxido de sódio seguido de reacidificação. Outros métodos, não visivelmente em uso, incluem hidrogenação de ácido oxálico e hidrólise da cianoidrina derivada de formaldeído. Alguns dos ácidos glicólicos atuais são livres de ácido fórmico. Ácido glicólico pode ser isolado de fontes naturais, tais como cana-de-açúcar, beterraba, abacaxi, melão e uvas verdes.
[00157] Ácido glicólico é um intermediário útil para síntese orgânica, em uma gama de reações, incluindo: oxidação-redução, esterificação e polimerização de cadeia longa. Ele é usado como um monômero na preparação de ácido poliglicólico e outros copolímeros biocompatíveis (por exemplo, PLGA). Comercialmente, derivados importantes incluem os ésteres de metila (CAS # 96-35-5) e etila (CAS # 623-50-7) que são facilmente destiláveis. O éster de butila é um componente de alguns vernizes, sendo desejável por ser não volátil e ter boas propriedades de dissolução.
Acetona
[00158] A acetona (também conhecida como propanona) é um composto orgânico com a fórmula (CH3)2CO. É um líquido incolor, volátil, inflamável e é a cetona mais simples.
[00159] A acetona é miscível com água e serve como um solvente importante, tipicamente para fins de limpeza em laboratório. Mais de 6,7 milhões de toneladas são produzidas em todo o mundo, principalmente para uso como um solvente e produção de metacrilato de metila e bisfenol A. ela é um bloco de construção comum em química orgânica. Os usos domésticos familiares da acetona são como o ingrediente ativo em removedor de esmalte de unha e diluente de tinta.
Isopropanol
[00160] Álcool isopropílico (nome IUPAC 2-propanol), também chamado isopropanol, é um composto com a fórmula química C3H8O ou C3H7OH ou CH3CHOHCH3. É um composto químico incolor, inflamável, com um odor forte. Ele é o exemplo mais simples de um álcool secundário, onde o átomo de carbono do álcool está ligado a dois outros átomos de carbono às vezes mostrados como (CH3)2CHOH. Ele é um isômero estrutural de propanol. Tem uma grande variedade de usos industriais e domésticos.
[00161] Propeno, também conhecido como propileno ou metil etileno, é um composto orgânico insaturado tendo a fórmula química C3H6. Ele tem uma ligação dupla e é o segundo membro mais simples da classe alceno de hidrocarbonetos.
[00162] Propeno é produzido a partir de combustíveis fósseis - petróleo, gás natural e, em muito menor grau, carvão. O propeno é um subproduto do refino de petróleo e do processamento de gás natural.
Isobuteno
[00163] Isobuteno (também conhecido como isobutileno ou 2- metilpropeno) é um hidrocarboneto de importância industrial. Ele é um alceno ramificado de quatro carbonos (olefina), um dos quatro isômeros de butileno (buteno). Em temperatura e pressão padrão, ele é um gás inflamável incolor.
[00164] Isobuteno é usado como um intermediário na produção de uma variedade de produtos. Ele é reagido com metanol e etanol na fabricação dos oxigenatos de gasolina éter metil terc-butílico (MTBE) e éter etil terc-butílico (ETBE), respectivamente. Alquilação com butano produz isooctano, um outro aditivo de combustível. O isobuteno também é usado na produção de metacroleína. Polimerização do isobuteno produz borracha butílica (poli-isobuteno). Antioxidantes tais como hidroxitolueno butilado (BHT) e hidroxianisol butilado (BHA) são produzidos através da alquilação de Friedel-Crafts de fenóis usando isobuteno.
[00165] Isobuteno de polímero e de grau químico é tipicamente obtido através de desidratação de álcool butílico terciário ou desidrogenação catalítica de isobutano. Oxigenatos de gasolina MTBE e ETBE são geralmente produzidos pela reação de metanol ou etanol com isobuteno contido em fluxos de buteno de crackers a vapor de olefinas ou refinarias. Isobuteno não é isolado antes da reação uma vez que separação dos éteres dos butenos restantes é mais simples.
Compostos da via da serina
[00166] Compostos que podem ser coproduzidos com MEG (ou ácido glicólico) incluem compostos da via da serina, por exemplo, serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e etilenodiamina (EDA).
[00167] A serina é um aminoácido não essencial que pode ser sintetizado no corpo humano. Por ser altamente solúvel em água, a serina encontra aplicação como hidratante em loções da indústria farmacêutica e cosmética. Além disso, existe um enorme mercado para a serina na indústria química porque ela pode ser convertida em outros produtos químicos tais como plásticos, detergentes, suplementos alimentares e uma variedade de outros produtos. Na realidade, serina tem sido mencionada como uma das 30 substâncias biológicas mais promissoras para substituir os produtos químicos da indústria do petróleo.
[00168] A a-descarboxilação da serina produz etanolamina, um produto industrial usado como um intermediário nas indústrias de herbicidas, têxteis, metais, detergentes, plásticos e produtos de cuidado pessoal com um volume de produção de várias centenas de quilotoneladas por ano (Scott, E. e outros (2007) “Biomass in the manufacture of industrial products-the use of proteins and amino acids”. Appl Microbiol Biotechnol. 75 (4): 751-762).
[00169] A glicina, o aminoácido mais simples, é valiosa para aplicações farmacêuticas e industriais. Ela é incluída como um aditivo em alimentos para animais de estimação e rações para animais. Para humanos, a glicina é vendida como um adoçante/intensificador de sabor. Certos suplementos alimentares e bebidas proteicas contêm glicina. Certas formulações de fármacos incluem glicina para melhorar a absorção gástrica do fármaco. A glicina serve como um agente tamponante em antiácidos, analgésicos, antitranspirantes, cosméticos e produtos de higiene pessoal. Muitos produtos diversos usam glicina ou seus derivados, tal como a produção de produtos de esponja de borracha, fertilizantes e complexantes de metal. A glicina também é valiosa como intermediário na síntese de uma variedade de produtos químicos. Ela é usada na fabricação do herbicida glifosato. A glicina pode ser convertida em ácido oxálico, que é usado como agente de branqueamento nas indústrias têxteis e de celulose e no tratamento de águas residuais. A glicina também é amplamente utilizada em pesquisas de laboratório, por exemplo, em eletroforese em gel.
[00170] Etilenodiamina (EDA) (1,2-diaminoetano, C2H4(NH2)2) é usada em grandes quantidades para produção de muitos produtos químicos industriais. Ela forma derivados com ácidos carboxílicos (incluindo ácidos graxos), nitrilas, álcoois (em temperaturas elevadas), agentes alquilantes, dissulfeto de carbono e aldeídos e cetonas. Devido à sua natureza bifuncional, tendo duas aminas, ela forma prontamente heterociclos tais como as imidazolidinas. Um derivado mais proeminente da etilenodiamina é o agente quelante EDTA, que é derivado da etilenodiamina por meio de uma síntese de Strecker envolvendo cianeto e formaldeído. Hidroxietiletilenodiamina é um outro agente quelante comercialmente significante. Vários compostos bioativos e fármacos contêm a ligação N-CH2-CH2-N, incluindo alguns anti-histamínicos. Sais de etilenobisditiocarbamato são fungicidas comercialmente significantes sob as marcas Maneb, Mancozeb, Zineb e Metiram. Alguns fungicidas contendo imidazolina são derivados da etilenodiamina. A etilenodiamina é um ingrediente no fármaco broncodilatador comum aminofilina, onde ele serve para solubilizar o ingrediente ativo teofilina. A etilenodiamina também tem sido usada em preparações dermatológicas. Quando usada como excipiente farmacêutico, após administração oral, sua biodisponibilidade é de cerca de 0,34, devido a um efeito substancial de primeira passagem. Menos de 20% são eliminados pela excreção urinária. A etilenodiamina, por conter dois grupos amina, é um precursor amplamente utilizado para vários polímeros. Condensados derivados do formaldeído são plastificantes. Ele é amplamente utilizado na produção de fibras de poliuretano. A classe PAMAM de dendrímeros é derivada de etilenodiamina. O ativador de branqueamento tetraacetiletilenodiamina é gerado a partir da etilenodiamina. O derivado N,N-etilenobis (estearamida) (EBS) é um agente de liberação de molde comercialmente significante e um tensoativo na gasolina e óleo de motor.
[00171] Etilenodiamina também é usada como: um solvente para solubilizar proteínas tais como albuminas e caseína; certos banhos de galvanoplastia; inibidor de corrosão em tintas e refrigerantes; produtos químicos para revelação de fotografia colorida, aglutinantes, adesivos, amaciantes de roupas, agentes de cura para epóxi e tinturas. Di- idroiodeto de etilenodiamina (EDDI) é adicionado à ração animal como fonte de iodeto.
Enzimas
[00172] Enzimas exemplares que podem ser usadas nas vias de biossíntese de MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, descritas aqui são listadas na Tabela 1. Tabela 1
Glicolaldeído redutase (EC 1.1.1.77)
[00173] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações reversíveis que seguem: etilenoglicol + NAD+ # glicolaldeído + NADH + H + (S)-propano-l ,2-diol + NAD+ # (S)-lactaldeído + NADH + H +
[00174] A glicolaldeído redutase também pode ser conhecida como lactaldeído redutase, propanodiol oxidorredutase, (R) [ou (S)]-propano- 1,2-diol: NAD+ oxidorredutase ou L-1,2-propanodiol oxidorredutase.
[00175] Assim, em algumas modalidades, a invenção provê uma enzima que desempenha papéis na via de degradação do etilenoglicol, na supervia do metabolismo e degradação de glicol, na via de degradação de L-lactaldeído anaeróbico e/ou na supervia de degradação de fucose e ramnose. Em uma modalidade, a enzima pode usar Fe2+ como um cofator.
[00176] A L-1,2-propanodiol oxidorredutase é uma desidrogenase do grupo III dependente de ferro. Ela reduz anaerobicamente L-lactaldeído, um produto de ambas vias catabólicas da L-fucose e da L-ramnose, a L-1,2-propanodiol, que é então excretado da célula.
[00177] Estruturas de cristal da enzima foram resolvidas, mostrando um dímero de domínio trocado no qual o metal, cofator e sítios de ligação de substrato podem ser localizados. Um aspartato e três resíduos de histidina conservados são necessários para ligação de Fe2+ e atividade de enzima.
[00178] In vitro, a enzima pode ser reativada por concentrações altas de NAD+ e eficientemente inativada por uma mistura de Fe3+ e ascorbato ou Fe2+ e H2O2. Oxidação catalisada por metal do resíduo His277 conservado é proposta ser a causa da inativação.
[00179] Expressão de FucO permite reversão engenheirada de uma volta do ciclo de oxidação β. A atividade FucO contribui para a conversão de isobutiraldeído em isobutanol em uma cepa engenheirada.
[00180] Em modalidades particulares, a enzima converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a glicolaldeído redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído redutase é codificada pelo gene fucO.
[00181] Em uma modalidade, a glicolaldeído redutase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de E. coli e S. cerevisiae. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafB (dkgB) e/ou yqhE (dkgA) ou seus homólogos. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são yqhD. Em algumas modalidades, o yqhD compreende uma mutação em G149E. Em uma modalidade adicional, a glicolaldeído redutase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma outra modalidade, a glicolaldeído redutase é codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
[00182] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo ácido glicólico compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase para evitar a conversão de glicolaldeído em monoetilenoglicol (MEG) e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de glicolaldeído em ácido glicólico (GA). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada pelo gene fucO ou seu homólogo.
Aldeído redutases
[00183] Várias aldeído redutases podem ser usadas para converter glicolaldeído em MEG.
[00184] Uma aldeído redutase dependente de NADPH (YqhD) pode catalisar as reações que seguem: acetol + NADP+ # metilglioxal + NADPH + H + (reversível, EC 1.1.1.-) um álcool + NADP+ # um aldeído + NADPH + H + (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.2) um aldeído + NADP+ + H2O ^ um carboxilato + NADPH + 2 H + (EC 1.2.1.4) 1,3-propanodiol + NADP+ # 3-hidroxipropionaldeído + NADPH + H + (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.-) D-3,4-di-hidroxibutanal + NADPH # 1,3,4-butanotriol + NADP+ (reversibilidade não especificada)
[00185] YqhD é uma aldeído redutase dependente de NADPH que pode estar envolvida em desintoxicação de glioxal e/ou ser parte de uma resposta independente de glutationa à peroxidação de lipídeo.
[00186] Foi relatado que vários álcoois, aldeídos, aminoácidos, açúcares e a-hidroxiácidos foram testados como substratos para YqhD. A proteína purificada mostra apenas atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP, com uma preferência por álcoois mais longos que C(3), mas com valores de Km na faixa milimolar, sugerindo que eles nãos ao substratos fisiológicos. Em contraste, YqhD exibe atividade de aldeído redutase de cadeia curta com substratos tais como propanaldeído, acetaldeído e butanaldeído, bem como acroleína e malonodialdeído. Em uma cepa engenheirada metabolicamente, fenilacetaldeído e 4-hidroxifenilacetaldeído são reduzidos para 2- feniletanol e 2-(4-hidroxifenil) etanol pelas aldeído redutases endógenas YqhD, YjgB e YahK.
[00187] Superexpressão de YqhD aumenta a atividade da 1,3- propanodiol oxidorredutase da célula. E. coli foi engenheirada para expressar YqhD para a produção industrial de 1,3-propanodiol. A atividade YqhD contribui para a produção de isobutanol, 1,2- propanodiol, 1,2,4-butanotriol e acetol também. Mutação de yqhD permite a produção de butanol por uma reversão projetada de uma volta do ciclo de oxidação β.
[00188] YqhD tem atividade furfural redutase, que parece causar inibição do crescimento devido à depleção de NADPH em cepas engenheiradas metabolicamente que produzem álcool a partir de biomassa lignocelulósica.
[00189] A estrutura de cristal de YqhD foi resolvida em resolução de 2 Â. YqhD é um dímero assimétrico de dímeros, e o sítio ativo contém um íon Zn2 +. O cofator NADPH é modificado por grupos hidroxila nas posições 5 e 6 no anel nicotinamida.
[00190] Superexpressão de yqhD leva à resistência aumentada a compostos de geração de oxigênio reativos tais como peróxido de hidrogênio, paraquate, cromato e telurito de potássio. Um mutante de deleção de yqhD mostra sensibilidade aumentada a esses compostos e ao glioxal, e contém níveis aumentados de aldeídos reativos que são gerados durante peroxidação lipídica. Por outro lado, a deleção de yqhD leva ao aumento da tolerância a furfural.
[00191] Em modalidades particulares, uma aldeído redutase dependente de NADPH converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a aldeído redutase dependente de NADPH é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a aldeído redutase dependente de NADPH é codificada pelo gene yqhD.
[00192] Uma metilglioxal redutase multifuncional (DkgA) pode catalisar as reações que seguem: acetol + NADP+ # metilglioxal + NADPH + H + (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-) isobutanol + NADP+ # isobutanal + NADPH + H + (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.-) etil- (2R) -metil- (3S) -hidroxibutanoato + NADP+ # etil-2- metilacetoacetato + NADPH + H + (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.-) 2-ceto-L-gulonato + NADP+ ^ 2,5-didesidro-D-gluconato + NADPH + H + (a reação é favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.346)
[00193] DkgA (YqhE) pertence à família aldo-ceto redutase (AKR) e foi mostrado ter atividade de metilglioxal redutase e beta-ceto éster redutase.
[00194] dkgA é relatado codificar uma 2,5-diceto-D-gluconato redutase (25DKGR) A, uma de duas redutases 25DKG em E. coli. A enzima usa NADPH como o doador de elétrons preferido e é acreditado estar envolvido no metabolismo do cetogluconato. A atividade específica da enzima em relação a 2,5-diceto-D-gluconato é relatada ser quase 1000 vezes menor do que sua atividade em relação ao metilglioxal.
[00195] Devido ao seu baixo Km para NADPH, a redução de furanos por DkgA pode esgotar os agrupamentos de NADPH e, assim, limitar a biossíntese celular. Uma ampla pesquisa de aldeído redutases mostrou que DkgA era uma de várias aldeído redutases endógenas que contribuem para a degradação de produtos finais aldeídos desejados de engenharia metabólica.
[00196] Uma estrutura de cristal de DkgA foi resolvida em resolução de 2,16 A.
[00197] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase multifuncional converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é codificada pelo gene dkgA.
[00198] Uma metilglioxal redutase multifuncional (DkgB) pode catalisar as reações que seguem: acetol + NADP+ # metilglioxal + NADPH + H + (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-) álcool 4-nitrobenzílico + NADP+ # 4-nitrobenzaldeído + NADPH + H + (reversibilidade não especificada, EC 1.1.1.91) 2-ceto-L-gulonato + NADP+ ^ 2,5-didesidro-D-gluconato + NADPH + H + (a reação é favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.346)
[00199] DkgB (YafB) é um membro da subfamília 3F da aldo-ceto redutase (AKR). DkgB foi mostrado ter atividades de 2,5-diceto-D- gluconato redutase, metilglioxal redutase e 4-nitrobenzaldeído redutase.
[00200] dkgB é relatado codificar 2,5-diceto-D-gluconato redutase (25DKGR) B, uma das duas redutases 25DKG em E. coli. A enzima usa NADPH como o doador de elétrons preferido e é acreditada estar envolvida no metabolismo do cetogluconato. No entanto, a atividade específica da enzima em relação a 2,5-diceto-D-gluconato é relatada como quase 1000 vezes menor do que sua atividade em relação a metilglioxal.
[00201] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase multifuncional converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase multifuncional é codificada pelo gene dkgB.
[00202] Uma metilglioxal redutase (YeaE) pode catalisar a reação que segue: acetol + NADP+ # metilglioxal + NADPH + H + (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-) YeaE demonstrou ter atividade de metilglioxal redutase.
[00203] A estrutura da subunidade de YeaE não foi determinada, mas sua similaridade de sequência de aminoácidos com as aldo-ceto redutases DkgA (YqhE) e DkgB (YafB) sugere que pode ser monomérica.
[00204] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase é codificada pelo gene yeaE.
[00205] Uma L-gliceraldeído 3-fosfato redutase (yghZ) pode catalisar as reações que seguem: L-gliceraldeído 3-fosfato + NADPH + H + ^ sn-glicerol 3-fosfato + NADP+ (EC 1.1.1.-) acetol + NADP+ # metilglioxal + NADPH + H + (a reação é fisiologicamente favorecida na direção oposta, EC 1.1.1.-)
[00206] YghZ é uma L-gliceraldeído 3-fosfato (L-GAP) redutase. A enzima também é capaz de desintoxicar metilglioxal em uma taxa baixa. YghZ define a família de proteínas AKR14 (aldo-ceto redutase 14).
[00207] L-GAP não é um metabólito natural e é tóxico para E. coli. L- GAP é um substrato de ambos sistemas de transporte de glicerol-3- fosfato e hexose fosfato de E. coli K-12. Foi postulado que o papel fisiológico de YghZ seja a desintoxicação de L-GAP, que pode ser formado por racemização não enzimática do GAP ou através de um processo celular desconhecido.
[00208] A estrutura de cristal da enzima E. coli foi determinada e é sugerida ser um tetrâmero. No entanto, outros constaram que a proteína forma um octâmero com base em estudos de filtragem em gel e microscopia eletrônica.
[00209] Em modalidades particulares, uma L-gliceraldeído 3-fosfato redutase converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a L-gliceraldeído 3-fosfato redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a L-gliceraldeído 3-fosfato redutase é codificada pelo gene yghZ.
[00210] Uma L-1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase (GldA) pode catalisar as reações que seguem: (S)-propano-l ,2-diol + NAD+ # acetol + NADH + H + (reação reversível) aminoacetona + NADH + H + ^ (R) -1-aminopropan-2-ol + NAD+ (EC 1.1.1.75) glicerol + NAD+ # di-hidroxiacetona + NADH + H + (reação reversível, EC 1.1.1.6)
[00211] A função fisiológica da enzima GldA há muito tempo não é clara. A enzima foi isolada independentemente como uma glicerol desidrogenase e uma D-1-amino-2-propanol:NAD+ oxidorredutase. Naquela época, D-1-amino-2-propanol era pensado ser um intermediário para a biossíntese de vitamina B12 e, embora E. coli seja incapaz de sintetizar vitamina B12 de novo, enzimas catalisando a síntese desse composto foram buscadas. Foi constatado mais tarde que GldA era responsável por ambas atividades.
[00212] O principal papel in vivo de GldA foi recentemente proposto ser a remoção de di-hidroxiacetona através de sua conversão em glicerol. No entanto, um papel duplo na fermentação do glicerol foi também recentemente estabelecido. Dissimilação do glicerol em E. coli pode ser realizada por duas vias diferentes. A via de degradação do glicerol e glicerofosfodiéster requer a presença de um aceitador de elétrons terminal e utiliza uma cinase dependente de ATP do sistema Glp, que fosforila glicerol em glicerol-3-fosfato. No entanto, quando da inativação da cinase e seleção para crescimento em glicerol, foi constatado que uma desidrogenase ligada a NAD+, GldA, foi capaz de suportar fermentação de glicerol. Recentemente, foi mostrado que GldA estava envolvido em fermentação do glicerol ambos como glicerol desidrogenase, produzindo di-hidroxiacetona, e como uma 1,2- propanodiol desidrogenase, regenerando NAD+ através da produção de 1,2-propanodiol a partir de acetol.
[00213] A enzima é encontrada em duas formas cataliticamente ativas, uma forma grande de oito subunidades e uma forma pequena de duas subunidades. A forma grande parece ser a espécie principal.
[00214] Em modalidades particulares, uma L-1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a L-1,2-propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a L-1,2- propanodiol desidrogenase/glicerol desidrogenase é codificada pelo gene gldA.
[00215] Uma metilglioxal redutase dependente de NADPH (GRE2) de Saccharomyces cerevisiae pode catalisar as reações que seguem: (S)-lactaldeído + NADP+ # metilglioxal + NADPH 3-metilbutanol + NAD (P) + # 3-metilbutanal + NAD(P)H
[00216] Gre2 é uma enzima versátil que catalisa a redução estereosseletiva de uma ampla gama de substratos, incluindo cetonas alifáticas e aromáticas, dicetonas, bem como aldeídos, usando NADPH como o cofator.
[00217] As estruturas de cristal de Gre2 de S. cerevisiae em uma forma apo a 2,00Â e forma complexada com NADPH a 2,40Â de resolução foram resolvidas. Gre2 forma um homodímero, cada subunidade do qual contém um domínio N-terminal de dobra de Rossmann e um domínio C-terminal variável, que participa de reconhecimento de substrato. O ajuste induzido quando da ligação ao cofator NADPH faz com que os dois domínios se desloquem um em direção ao outro, produzindo uma fenda interdomínio que se ajusta melhor ao substrato. Simulação computacional combinada com mutagênese direcionada a sítio e análise de atividade de enzima permitiu caracterização de uma bolsa de ligação a substrato potencial que determina a estereosseletividade do substrato rigorosa para catálise.
[00218] Gre2 catalisa a redução irreversível do composto citotóxico metilglioxal (MG) em (S)-lactaldeído como uma alternativa à desintoxicação de MG pela glioxalase I GLO1. MG é sintetizado através de um desvio de glicólise da fosfato de di-hidroxiacetona e é acreditado desempenhar um papel na regulagem do ciclo celular e na adaptação a estresse. GRE2 também catalisa a redução de isovaleraldeído em álcool isoamílico. A enzima serve para suprimir a filamentação induzida por álcool isoamílico ao modular os níveis de isovaleraldeído, o sinal ao qual as células respondem por filamentação. GRE2 também está envolvido no metabolismo de ergosterol.
[00219] Em modalidades particulares, uma metilglioxal redutase dependente de NADPH converte glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase dependente de NADPH é de S. cerevisiae. Em algumas modalidades, a metilglioxal redutase dependente de NADPH é codificada pelo gene GRE2.
Tiolase/acetil coenzima A acetiltransferase (EC 2.3.1.9)
[00220] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 2 acetil-CoA # acetoacetil-CoA + coenzima A (reação reversível)
[00221] Tiolase/Acetil coenzima A acetiltransferase também pode ser conhecida como acetil-CoA-C-acetiltransferase, acetoacetil-CoA tiolase, acetil-CoA:acetil-CoA C-acetiltransferase ou tiolase II.
[00222] Portanto, em algumas modalidades, a invenção provê uma enzima que desempenha um papel em degradação de acetoacetato (em acetil CoA). Em uma modalidade, um inibidor dessa enzima pode ser acetoacetil-CoA.
[00223] Em modalidades particulares, a enzima converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Em uma modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium sp., Bacillus sp., E. coli, Saccharomyces sp. e Marinobacter sp. Em algumas modalidades, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosaccharolyticum, Bacillus cereus, E. coli, Saccharomyces cerevisiae hidrocarbonoclástico Marinobacteriae. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são thlA, atoB e/ou ERG10, ou homólogo faz mesmas. Em uma modalidade adicional, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 35, 37 e 40. Em ainda uma outra modalidade, a tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 33, 34, 36, 38 e 39.
Acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase (EC 2.8.3.-)
[00224] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: acetoacetato + acetil-CoA # acetoacetil-CoA + acetato (reação reversível, EC 2.8.3.-)
[00225] Acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase também pode ser conhecida como acetato:acetoacetil-CoA transferase ou acetoacetil- CoA transferase.
[00226] Assim, em algumas modalidades, a invenção provê uma enzima que desempenha um papel em degradação de acetoacetato (em acetil CoA). Em uma modalidade, inibidores dEssa enzima podem incluir acetil-CoA e coenzima A.
[00227] O crescimento de E. coli em ácidos graxos de cadeia curta (C3-C6) requer a ativação dos ácidos em seus respectivos tioésteres. Essa ativação é catalisada por acetoacetil-CoA transferase. A reação ocorre em duas semirreações que envolvem uma enzima-CoA covalente. A enzima sofre duas mudanças conformacionais detectáveis durante a reação. É provável que a reação ocorra por um mecanismo de pingue-pongue. A enzima pode utilizar uma variedade de substratos de acil-CoA e ácido carboxílico de cadeia curta, mas exibe atividade máxima com substratos normais e 3-ceto.
[00228] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoacetil- CoA em acetoacetato. Em algumas modalidades, a acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase é de Clostridium spp. Em algumas modalidades, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase é de Clostridium acetobutylicum. Em algumas modalidades, a acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase é codificada pelos genes atoA e atoD. Em uma modalidade adicional, a composição da subunidade de acetoacetil-CoA transferase é [(AtoA)2] [(AtoD)2], com (AtoA)2 sendo o complexo β e (AtoD) 2 sendo o complexo α. Em uma modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase é uma acetil- CoA fundida: acetoacetato-CoA transferase: subunidade α/subunidade β. Em uma modalidade adicional, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase é codificada pelo gene ydiF.
Acetato:Acetoacetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.11)
[00229] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: acetoacetil-CoA + H2O CoA + acetoacetato
[00230] Acetoacetil-CoA hidrolase também pode ser conhecida como acetoacetil coenzima A hidrolase, acetoacetil CoA desacilase ou acetoacetil coenzima A desacilase.
[00231] Essa enzima pertence à família de hidrolases, especificamente aquelas que agem nas ligações tioéster.
[00232] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoacetil- CoA em acetoacetato. Em algumas modalidades, o acetato:acetoacetil- CoA hidrolase é de Clostridium spp. Em algumas modalidades, a acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é de Clostridium acetobutylicum. Em uma modalidade adicional, a Acetoacetil-CoA hidrolase é codificada pelos genes ctfA (subunidade A) e/ou ctfB (subunidade B).
[00233] Em uma modalidade adicional, a acetil-CoA:acetoacetato- CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 43, 46, 97, 99, 101 e 103. Em ainda uma outra modalidade, a acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 41, 42, 44, 45, 96, 98, 100 e 102. Acetoacetato descarboxilase (EC 4.1.1.4)
[00234] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: acetoacetato + H + ^ acetona + CO2
[00235] Acetoacetato descarboxilase também pode ser conhecida como ADC, AADC ou acetoacetato carbóxi-liase.
[00236] Assim, em algumas modalidades, a invenção provê uma enzima que desempenha papéis em biossíntese de isopropanol, fermentação de piruvato em acetona, a supervia de fermentação acidogênica e solventogênica de Clostridium acetobutylicum e/ou a supervia de fermentação solventogênica de Clostridium acetobutylicum.
[00237] Acetoacetato descarboxilase (ADC) desempenha um papel fundamental em produção de solvente em Clostridium acetobutylicum. Durante a fase acidogênica de crescimento, os ácidos acumulam causando uma mudança metabólica para a produção de solventes. Nesta fase, os ácidos são reassimilados e metabolizados para produzir acetona, butanol e etanol.
[00238] Purificação e cristalização preliminares da enzima revelaram que um resíduo de lisina está implicado no sítio ativo. A enzima é um complexo grande composto por 12 cópias de um tipo único de subunidade.
[00239] A enzima de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi purificada e o gene adc codificando a mesma foi clonado. A enzima também foi purificada a partir da cepa relacionada Clostridium acetobutylicum DSM 792 e o gene clonado e sequenciado. A reação de descarboxilação prossegue pela formação de um intermediário de base de Schiff.
[00240] ADC é uma enzima-chave em absorção de ácido, puxando efetivamente a reação de CoA-transferase na direção da formação de acetoacetato.
[00241] Em modalidades particulares, a enzima converte acetoacetato em acetona. Em uma modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium sp., Bacillus sp., Chromobacterium sp. e Pseudomonas sp. Em uma modalidade adicional, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa, Chromobacterium violaceum e Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a acetoacetato descarboxilase é adc ou homólogo da mesma. Em uma modalidade adicional, a acetoacetato descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 49 e 52. Em ainda uma outra modalidade, a acetoacetato descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51.
Álcool desidrogenase (EC 1.1.1.-)
[00242] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a oxidação reversível de álcoois primários ou secundários em aldeídos ou cetonas, respectivamente. Em uma modalidade, a enzima é uma álcool desidrogenase secundária (S-ADH) e catalisa a redução de cetonas tal como acetona em álcoois secundários tal como 2-propanol (isopropanol).
[00243] Em algumas modalidades, o S-ADH é de Burkholderia sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Burkholderia sp. AIU 652. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Alcaligenes sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Alcaligenes eutrophus. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Clostridium sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Clostridium ragsdalei. Em algumas modalidades, o S- ADH é de Clostridium beijerinckii. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter brockii. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Thermoanaerobacter ethanolicus (Clostridium thermohydrosulfuricum). Em algumas modalidades, o S-ADH é codificado pelo gene adhB. Em algumas modalidades, o S-ADH é do tripanossomatídeo Phytomonas sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Rhodococcus sp. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Rhodococcus ruber. Em algumas modalidades, o S-ADH é de Methanobacterium palustre. Em algumas modalidades, o S-ADH é de arquea metanogênica Methanogenium liminatans. Em algumas modalidades, o S-ADH é do protista parasítico Entamoeba histolytica (EhAdh1). Em algumas modalidades, o S-ADH é de protozoário parasítico Tritrichomonas fetus. Em algumas modalidades, o S-ADH é do parasita humano Trichomonas vaginalis.
[00244] Em algumas modalidades, o S-ADH é predito de homologia e pode ser de Thermoanaerobacter mathranii, Micrococcus luteus, Nocardiopsis alba, Mycobacterium hassiacum, Helicobacter suis, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida orthopsniamances clapsaviosis, Candera metapsniamances e Scheffilosis. estipite.
[00245] Em algumas modalidades, a álcool desidrogenase tem pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma álcool desidrogenase de Clostridium sp. Em outras modalidades, a álcool desidrogenase é uma álcool desidrogenase selecionada de adh de Clostridium beijerinckii e adh de Clostridium carboxidivorans. Em uma modalidade adicional, a álcool desidrogenase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 138 e 140. Em ainda uma outra modalidade, a álcool desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136, 137 e 139.
Desidratase (EC 4.2.1.-)
[00246] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: isopropanol # propeno + H2O
D-xilose isomerase (EC 5.3.1.5)
[00247] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação reversível que segue: D-xilopiranose # D-xilulose
[00248] D-xilose isomerase também pode ser conhecida como xilose isomerase ou D-xilose cetol-isomerase.
[00249] Assim, em algumas modalidades, a invenção provê uma enzima que desempenha um papel em degradação de xilose.
[00250] A xilose isomerase catalisa a primeira reação no catabolismo da D-xilose.
[00251] Dois resíduos de histidina conservados, H101 e H271, foram mostrados ser essenciais para atividade catalítica. A fluorescência de dois resíduos de triptofano conservados, W49 e W188, é extinta durante a ligação da xilose, e W49 mostrou ser essencial para a atividade catalítica. A presença de Mg2+, Mn2+ ou Co2+ protege a enzima de desnaturação térmica.
[00252] A composição da subunidade não foi estabelecida experimentalmente.
[00253] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante compreende ainda uma xilose isomerase endógena ou exógena que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a xilose isomerase é exógena. Em uma modalidade adicional, a xilose isomerase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pyromyces sp ou E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase é xylA ou homólogo da mesma. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 95 e 144. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 93, 94 e 143.
[00254] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou GA ou, opcionalmente, MEG ou GA e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma D-xilose isomerase para evitar conversão de D-xilose em D-xilulose e, em vez disso, desviar a reação em direção à conversão de D-xilose em D- xilulose.
D-xilulose 5-cinase/xilulocinase
[00255] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: D-xilulose + ATP ^ D-xilulose 5-fosfato + ADP + H + (EC 2.7.1.17) ATP + 1-desóxi-D-xilulose ^ 1-desóxi-D-xilulose 5-fosfato + ADP + H + (EC 2.7.1.-)
[00256] D-xilulose 5-cinase também pode ser conhecida como xilulose cinase ou xilulocinase.
[00257] Xilulocinase catalisa a fosforilação da D-xilulose, a segunda etapa na via de degradação da xilose, produzindo D-xilulose-5-fosfato, um intermediário da via da pentose fosfato.
[00258] Na ausência de substrato, a xilulocinase tem atividade de ATPase fraca. A xilulocinase também pode catalisar a fosforilação de 1- desóxi-D-xilulose. Isso permitiria uma via de resgate potencial para geração de 5-fosfato de 1-desóxi-D-xilulose para uso na biossíntese de terpenoides, tiamina e piridoxal. A taxa de fosforilação de 1-desóxi-D- xilulose é 32 vezes menor do que a taxa de fosforilação de D-xilulose.
[00259] O mecanismo cinético da enzima bacteriana foi estudado, sugerindo um mecanismo de reação predominantemente ordenado. A enzima sofre mudanças conformacionais significantes quando da ligação do substrato e de ATP. Dois resíduos de aspartato conservados, D6 e D233, foram verificados ser essenciais para atividade catalítica, e um mecanismo catalítico foi proposto.
[00260] As estruturas de cristal da xilulocinase bacteriana na forma apo e ligada à D-xilulose foram determinadas com resolução de 2,7 e 2,1 Â, respectivamente.
[00261] Em modalidades particulares, a enzima converte D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a D-xilulose 5- cinase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a D-xilulose 5- cinase é codificada pelo gene xylB. Em algumas modalidades, a D- xilulose 5-cinase é de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a D-xilulose 5-cinase é codificada pelo gene XKS1. Em algumas modalidades, a D-xilulose 5-cinase é de Pichia stipitis. Em algumas modalidades, a D-xilulose 5-cinase é codificada pelo gene XYL3.
[00262] Em algumas modalidades, a D-xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a D-xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em ainda uma modalidade adicional, a D-xilulose 5- cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em outras modalidades, a D-xilulose 5-cinase é xylB de E. coli.
[00263] Em uma modalidade, a D-xilulose 5-cinase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase é xylB ou seu homólogo. Em outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose A 5-cinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 145.
[00264] Em algumas modalidades, uma enzima ribulocinase catalisa a fosforilação de D-ribulose em D-ribulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por AraB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com AraB de E. coli (SEQ ID NO: 288).
[00265] Em algumas modalidades, uma enzima ribocinase catalisa a fosforilação de D-ribose em D-ribose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribocinase é codificada por RbsK de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rbsK de E. coli (SEQ ID NO: 290).
[00266] Em algumas modalidades, uma enzima xilulocinase catalisa a fosforilação de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Em algumas modalidades, a enzima ribocinase é codificada por XuK de T. maritima. Em algumas modalidades, a enzima ribulocinase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com XuK de T. maritima (SEQ ID NO: 291).
Glicolaldeído desidrogenase (1.2.1.21)
[00267] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: glicolaldeído + NAD+ + H2O glicolato + NADH + 2 H +
[00268] Essa enzima pertence à família das oxidorredutases, especificamente aquelas que agem no grupo aldeído ou oxo de doador com NAD+ ou NADP+ como aceitador. Essa enzima participa de metabolismo de glioxilato e dicarboxilato.
[00269] Glicolaldeído desidrogenase também pode ser conhecida como glicolaldeído: NAD+ oxidorredutase ou glicol aldeído desidrogenase.
[00270] Em E. coli, aldeído desidrogenase A (AldA) é uma enzima de especificidade de substrato relativamente ampla para substratos de α- hidroxialdeído pequenos. Portanto, é utilizada em várias vias metabólicas.
[00271] L-fucose e L-ramnose são metabolizadas por vias paralelas que convergem após suas reações de aldolase correspondentes produzindo os mesmos produtos: fosfato de di-hidroxiacetona e L- lactaldeído. Aerobicamente, a aldeído desidrogenase A oxida L- lactaldeído em L-lactato.
[00272] Em vias paralelas utilizando as mesmas enzimas, D- arabinose e L-xilose podem ser metabolizadas em di-hidroxiacetona fosfato e glicolaldeído, que é oxidado em glicolato pelo aldeído desidrogenase A.
[00273] Estruturas de cristal da enzima sozinha e em complexos ternários e binários foram resolvidas.
[00274] Aldeído desidrogenase A está presente apenas em condições aeróbicas e é mais altamente induzida pela presença de fucose, ramnose ou glutamato. A enzima é inibida por NADH, que pode atuar como um interruptor para mudar de oxidação de lactaldeído para sua redução pela propanodiol oxidorredutase. A AldA é regulada positivamente durante adaptação de curto prazo à limitação de glicose.
[00275] Com base em similaridade de sequência, AldA foi prevista ser uma succinato-semialdeído desidrogenase.
[00276] Regulagem de expressão de aldA foi investigada. O gene é regulado pela repressão catabólica, repressão sob condições anaeróbicas via ArcA e indução pela fonte de carbono.
[00277] Em modalidades particulares, a enzima converte glicolaldeído em glicolato. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é codificada pelo gene aldA.
[00278] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase para evitar a produção de ácido glicólico a partir de glicolaldeído e, em vez disso, desviar a reação para a conversão do glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a deleção, interrupção, mutação e/ou redução na atividade de uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico é parcial, em que uma quantidade de ácido glicólico é ainda produzida.
[00279] Em outras modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo ácido glicólico compreende ou expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando uma glicolaldeído desidrogenase.
Lactato desidrogenase (1.1.1.28)
[00280] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: (R)-lactato + NAD+ ^ piruvato + NADH + H +
[00281] A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima encontrada em quase todas as células vivas tal como em animais, plantas e procariontes. LDH catalisa a conversão de lactato em ácido pirúvico e o contrário, pois converte NADH em NAD+ e o contrário. Uma desidrogenase é uma enzima que transfere um hidreto de uma molécula para outra.
[00282] LDH existe em quatro classes distintas de enzimas. A mais comum é L-lactato desidrogenase dependente de NAD (P). Outras LDHs agem no D-lactato e/ou são dependentes do citocromo c: D- lactato desidrogenase (citocromo) e L-lactato desidrogenase (citocromo).
[00283] LDH tem sido de significância médica porque é encontrada extensivamente em tecidos corporais, tais como células sanguíneas e músculo cardíaco. Por ser liberado durante dano a tecido, ela é um marcador de lesões e doenças comuns tal como insuficiência cardíaca.
[00284] Lactato desidrogenase também pode ser conhecida como ácido lático desidrogenase, (R)-lactato: NAD+ oxidorredutase ou D- lactato desidrogenase - fermentativa.
[00285] Em E. coli, a lactato desidrogenase (LdhA) é uma lactato desidrogenase ligada a NAD (LDH) solúvel que é específica para a produção de D-lactato. LdhA é um homotetrâmero e mostra cooperatividade homotrópica positiva sob condições de pH mais alto.
[00286] E. coli contém duas outras lactatos desidrogenases: D- lactato desidrogenase e L-lactato desidrogenase. Ambas são flavoproteínas associadas à membrana necessárias para crescimento aeróbico em lactato.
[00287] LdhA está presente sob condições aeróbias, mas é induzida quando E. coli é cultivada em uma variedade de açúcares sob condições anaeróbicas em pH ácido. Diferente da maioria dos genes envolvidos em respiração anaeróbica, ldhA não é ativado por Fnr; em vez disso, o sistema ArcAB e vários genes envolvidos no controle do metabolismo de carboidratos (csrAB e mlc) parecem regular expressão. A expressão de ldhA é afetada negativamente pelo regulador transcripcional ArcA. IdhA pertence ao regulon α32.
[00288] O gene ldhA é um alvo frequente para mutações em engenharia metabólica, na maioria das vezes para eliminar produção de produtos colaterais indesejáveis da fermentação, mas também para produzir especificamente D-lactato.
[00289] Em modalidades particulares, a enzima converte piruvato em lactato. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene ldhA.
[00290] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante que produz MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma lactato desidrogenase para prevenir a produção de lactato de piruvato e, em vez disso, desviar a reação para produção de um ou mais coprodutos.
Transidrogenase de nucleotídeo de piridina solúvel (EC 1.6.1.1.)
[00291] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: NADH + NADP+ •= NAD+ + NADPH
[00292] A piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel também pode ser conhecida como NAD (P) + transidrogenase (específica de B), STH, piridina nucleotídeo transidrogenase ou transidrogenase.
[00293] E. coli contém ambas uma transidrogenase de nucleotídeo de piridina solúvel e uma ligada à membrana. A piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel é o produto do gene sthA ou udhA; seu papel fisiológico primário parece ser a reoxidação de NADPH. A transidrogenase de translocação de prótons ligada à membrana é o produto do gene pntAB; PntAB é uma fonte importante de NADPH.
[00294] UdhA contém FAD não covalentemente ligado e está presente em uma forma que consiste em sete ou oito monômeros. Superexpressão moderada de UdhA (SthA) permite uma taxa de crescimento máxima aumentada de um mutante de fosfoglicose isomerase, e um mutante duplo pgi sthA não é viável. Esses fenótipos podem ser devidos à capacidade de UdhA em restaurar o equilíbrio redox celular sob condições de formação excessiva de NADPH. Mutações em sthA aparecem durante adaptação de uma cepa mutante de pgi a crescimento em meio mínimo de glicose. A transcrição de sthA é sub-regulada pelo crescimento em glicerol.
[00295] Em algumas modalidades, expressão de uma transidrogenase pode aumentar a atividade de um álcool desidrogenase dependente de NADPH, levando à conversão melhorada de acetona em 2-propanol. Em uma modalidade, a piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel é codificada por a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel é udhA, ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 142. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a piridina nucleotídeo transidrogenase solúvel são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 141.
Hidroximetilglutaril-CoA sintase (EC 2.3.3.-)
[00296] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: acetoacetil-CoA + acetil-CoA + H2O θ (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA + coenzima A + H +
[00297] A hidroximetilglutaril-CoA sintase também pode ser conhecida como (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA acetoacetil-CoA-liase (CoA-acetilação), 3-hidróxi-3-metilglutaril CoA sintetase, 3-hidróxi-3- metilglutaril coenzima A sintase, 3-hidróxi-3-metilglutaril coenzima A sintetase, 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase, 3-hidróxi-3-metilglutaril- coenzima A sintase, β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA sintase, HMG-CoA sintase, acetoacetil coenzima A transacetase, hidroximetilglutaril coenzima A sintase e hidroximetilglutaril coenzima A-enzima de condensação.
[00298] Hidroximetilglutaril-CoA sintase catalisa a condensação de acetil-CoA com acetoacetil-CoA para formar (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril- CoA, um estágio inicial na síntese de (R)-mevalonato, um precursor de colesterol.
[00299] A enzima catalisa uma reação complexa que pode ser dividida em quatro etapas. A primeira etapa envolve a formação de um complexo binário de enzima acetil-CoA, seguido pela transferência do grupo acetila do tioéster CoA para um resíduo de cisteína na enzima, formando um intermediário tioéster acil-enzima. Na próxima etapa a agora CoA reduzida se dissocia e o segundo substrato, acetoacetil-CoA, se liga à enzima. A terceira etapa envolve a formação de um carbânion através da remoção de um próton da metila da acetilcisteína. A acetilcisteína ativada então sofre uma condensação do tipo Claisen com o carbono Y do ligante acetoacetil-CoA, que forma o HMG-CoA enquanto retendo a ligação tioéster à enzima. A última etapa compreende a hidrólise dessa ligação, resultando em HMG-CoA livre.
[00300] O gene HMGCS1 de Homo sapiens foi clonado e sequenciado (Russ, A.P. e outros (1992) “Amplification and direct sequencing of a cDNA encoding human cytosolic 3-hydroxy-3- methylglutaryl-coenzyme A synthase.” Biochim Biophys Acta 1132 (3): 329-31). O gene foi expresso em Escherichia coli e a proteína recombinante foi purificada e caracterizada (Rokosz, L.L. e outros (1994) “Human cytoplasmic 3-hydroxy-3-methylglutaril coenzyme A synthase: expression, purification, and characterization of recombinante wild-type and Cys129 mutant enzymes”. Arch Biochem Biophys 312(1): 1-13). A enzima é um homodímero de 120 kDa. A catálise prossegue através da formação de um intermediário acetil-enzima covalente. Os dados cinéticos sugerem que os dois substratos (acetil-CoA e acetoacetil-CoA) competem por ligação ao mesmo local.
[00301] Em uma modalidade, a hidroximetilglutaril-CoA sintase pode ter uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase e pode catalisar a reação que segue: acetona + acetil-CoA + H2O θ 3-hidróxi-isovalerato
[00302] Em uma modalidade, a 3HIV sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de Mus sp., Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. e Polaromonas sp. Em uma modalidade adicional, a 3HIV sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um micro-organismo selecionado de Mus musculus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus crispatus e Polaromonas naphthalenivorans. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV sintase são selecionadas de Hmgcs1, ERG13, PksG e/ou Pnap_0477 ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV sintase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 105, 107, 109 e 111. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV sintase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 104, 106, 108 e 110. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a hidroximetilglutaril-CoA sintase é hmgS, ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a hidroximetilglutaril-CoA sintase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 123. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a hidroximetilglutaril-CoA sintase é codificada por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 122.
Metilglutaconil-CoA hidratase (EC 4.2.1.18)
[00303] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA θ trans-3-metilglutaconil-CoA + H2O
[00304] Essa enzima catalisa a syn-hidratação de 3-metilglutaconil- CoA em (S)-3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA na via de degradação da leucina. A enzima bacteriana foi caracterizada em Pseudomonas putida. Ela difere da enzima de mamíferos por ter apenas um resíduo de glutamila em seu sítio ativo ao invés de dois, resultando em um mecanismo de reação diferente. Essas enzimas são membros da superfamília da crotonase (Wong, B.J. e Gerlt, J.A. (2004) “Evolution of function in the crotonase superfamily: (3S)-methylglutaconyl-CoA hydratase from Pseudomonas putida”. Biochemistry 43 (16): 4646-4654) e revisado em (Hamed, R.B. e outros (2008) “Mechanisms and structures of crotonase superfamily enzymes - hott nature controls enolate and oxyanion reactivity. Cell Mol. Life. Sci. 65 (16): 2507-2527).
[00305] Enzima recombinante foi expressa em Escherichia coli, purificada e caracterizada. A massa molecular aparente do polipeptídeo marcado com 10-His foi determinada ser 32,251 kDa através de ESIMS. O marcador 10-His foi subsequentemente removido antes da caracterização da enzima (Wong e Gerlt, 2004).
[00306] Em uma modalidade, a metilglutaconil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas sp. Em uma modalidade adicional, a metilglutaconil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilglutaconil-CoA hidratase é liuC ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilglutaconil-CoA hidratase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 125. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilglutaconil-CoA hidratase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 124.
Metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4)
[00307] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: ADP + fosfato + H + + 3-metilglutaconil-CoA θ ATP + 3-metilcrotonoil- CoA + HCO3-
[00308] A atividade de enzima está associada ao complexo de 3- metilcrotonil-CoA carboxilase. Essa enzima é uma carboxilase dependente de biotina, contendo biotina, envolvida na via de degradação da L-leucina (e isovalerato) de Pseudomonas aeruginosa PAO1. Essa via também é a última fase da via de utilização do terpeno acíclico (vias de degradação de citronelol e degradação de cis-genanil- CoA). A enzima não é expressa em células cultivadas com citronelol ou citronelato, mas é expressa em células cultivadas com isovalerato. Os genes liuB e liuD codificam as duas subunidades da 3-metilcrotonil-CoA carboxilase. As subunidades são codificadas no agrupamento de genes liuRABCDE desse organismo (Hoschle, B. e outros (2005) “Methylcrotonyl-CoA and geranyl-CoA carboxylases are involved in leucine/isovalerate utilization (Liu) and acyclic terpene utilization (Atu), and are encoded by liuB/liuD and atuC/atuF, em Pseudomonas aeruginosa”. Microbiology 151 (Pt 11): 3649-3656; Forster-Fromme, K. e Jendrossek, D. (2010). “Catabolism of citronellol and related acyclic terpenoids in pseudomonads”. Appl Microbiol Biotechnol 87(3): 859869).
[00309] A enzima foi purificada a partir de extratos celulares atraves de cromatografia de afinidade com avidina e as subunidades isoladas em gel de SDS foram submetidas à análise de impressão digital de tripsina e ESI-MS que permitiu a identificação de seus genes correspondentes (Hoschle e outros, 2005).
[00310] A 3-metilcrotonil-CoA carboxilase de Pseudomonas citronellolis foi caracterizada em trabalho anterior (Hector ML e Fall RR (1976) “Multiple acyl-coenzyme A carboxylases in Pseudomonas citronellolis”. Biochemistry 15 (16): 3465-3472; Fall, R.R. e Hector, M.L. (1977) “Acyl-coenzyme A carboxylases. Homologous 3-methylcrotonyl- CoA and geranyl-CoA carboxylases from Pseudonomas citronellolis”. Biochemistry 16(18): 4000-4005; Fall, R.R. (1981) 3-Methylcrotonyl-CoA and geranyl-CoA carboxylases from Pseudomonas citronellolis. Methods Enzymol 71 Pt C: 791-799).
[00311] Em uma modalidade, a metilcrotonil-CoA carboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas sp. Em uma modalidade adicional, a metilcrotonil-CoA carboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas aeruginosa. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA carboxilase são selecionadas de liuB e/ou liuD ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA carboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 127 e 129. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA carboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 126 e 128.
Metilcrotonil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17)
[00312] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: trans-2 (ou 3) -enoil-CoA + H2O θ (3S) -3-hidroxiacil-CoA
[00313] Uma enzima exemplar é uma 3-cetoacil-CoA tiolase. Ela está envolvida na degradação de ácidos graxos por meio do ciclo de β- oxidação. Ela tem especificidade de comprimento de cadeia ampla para substratos, embora exiba sua atividade maior com substratos de cadeia média. Ela é parte de um complexo de múltiplas enzimas e é codificada pelo gene fadA (Yang, S.Y. e outros (1990) “Nucleotide sequence of the fadA gene. Primary structure of 3-ketoacyl-coenzyme A thiolase from Escherichia coli and the structural organization of the fadAB operon”. J. Biol. Chem. 265(18): 10424-10429; http://www.ncbi.nlm.nig.gov/pubmed/7024730 Binstock, J. F. e Schulz, H. (1981) Fatty acid oxidation complex from Escherichia coli. Methods Enzymol 71 Pt C:403-11).
[00314] 3-cetoacil-CoA tiolase também pode ser conhecida como acetil-CoA C-aciltransferase, β-cetotiolase, acetil-CoA aciltransferase e acil-CoA:acetil-CoA C-aciltransferase.
[00315] Uma outra enzima exemplar é uma enoil-CoA hidratase. A subunidade alfa tem quatro atividades enzimáticas associadas a ela. Ela é parte de um complexo de múltiplas enzimas. Duas das atividades, enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17) e 3-OH acil-CoA epimerase (EC 5.1.2.3) são realizadas pelo mesmo sítio ativo N terminal (Yang, S.Y. e Elzinga, M. (1993) “Association of both enoyl coenzyme A hydratase and 3-hydroxyacyl coenzyme A epimerase with an active site in the amino-terminal domain of the multifunctional fatty acid oxidation protein from Escherichia coli”. J. Biol. Chem. 268 (9): 6588-6592).
[00316] Em uma modalidade, a metilcrotonil-CoA hidratase é uma 3- cetoacil-CoA tiolase. Em uma modalidade adicional, a metilcrotonil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase é fadA ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 131. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase é codificada por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 130.
[00317] Em uma modalidade, a metilcrotonil-CoA hidratase é uma enoil-CoA hidratase. Em uma modalidade adicional, a metilcrotonil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase é fadB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 133. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a metilcrotonil-CoA hidratase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 132.
3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase (EC 3.1.2.-)
[00318] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: 3-hidróxi-isovaleril-CoA + H2O θ 3-hidróxi-isovalerato + CoA uma acil-CoA + H2O ^ um carboxilato + coenzima A + H+
[00319] Uma acil-CoA tioesterase exemplar é TesB. A tioesterase II (TesB) é uma de várias tioesterases presentes em E. coli. A enzima tem especificidade de substrato relativamente ampla, clivando substratos de acil-CoA de cadeias média e longa; o melhor substrato testado foi 3,5- tetradecadienoil-CoA (Nie, L. e outros (2008) “A novel paradigma of fatty acid beta-oxidation exemplified by the thioesterase-dependent partical degradation of conjugated linoleic acid tha fully supports growth of Escherichia coli”. Biochemistry 47 (36): 9618-9626). A tioesterase II é uma das tioesterases que sustentam o crescimento em oleato ou ácido linoleico conjugado como a única fonte de carbono (Nie e outros, 2008).
[00320] Uma estrutura de cristal da enzima foi resolvida em resolução de 1,9 Â. O resíduo D204 foi previsto estar no sítio ativo; sua importância foi confirmada através de análise cinética de mutantes (Li, J. e outros (2000) Crystal structure of the Escherichia coli thioesterase II, a homologo of the human Nef binding enzyme”. Nat. Struct. Biol. 7 (7): 555-559).
[00321] As cepas ou com falta ou superprodução de tesB não têm defeito óbvio (Narasimhan, M.L. e outros (1986) “Genetic and biochemical characterization of an Escherichia coli K-12 mutant deficient in acyl-coenzyme A thioesterase II”. J. Bacteriol. 165(3): 911-917; Naggert, J. e outros (1991) “Cloning, sequencing, and characterization of Escherichia coli thioesterase II”. J. Biol. Chem. 266(17): 1104411050). Superprodução de TesB alivia inibição de síntese de ácido graxo por moléculas de acil-ACP de cadeia longa que acumulam quando da privação de glicerol (Jiang, P. e Cronan, J.E. (1994) “Inhibition of fatty acid synthesis in Escherichia coli in the absence of phospholipid synthesis and release of inhibition by thioesterase action”. J. Bacteriol. 176(10): 2814-2821).
[00322] Em uma modalidade, a 3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase é tesB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3- hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 135. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 134.
Mevalonato-3-cinase (EC 2.7.1.-)
[00323] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 3-hidróxi-isovalerato + ATP •= ADP + H (+) + 3-fosfonóxi-isovalerato (R)-mevalonato + ATP ^ (R)-mevalonato 3-fosfato + ADP + H +
[00324] A mevalonato-3-cinase também pode ser conhecida como (R) -MVA 3-fosfotransferase ou 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) cinase.
[00325] A estrutura da subunidade dessa enzima de Thermoplasma acidophilum não foi relatada.
[00326] A mevalonato-3-cinase da arqueia termofílica Thermoplasma acidophilum é pensada participar em uma variante da via do mevalonato encontrada na arqueia, Azami, Y. e outros (2014) “(R)-Mevalonate 3-Phosphate Is an Intermediate of the Mevalonate Pathway in Thermoplasma acidophilum”. J Biol Chem 289 (23): 1595715967; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24914732 Vinokur, J.M .e outros (2014) Evidence of a Novel Mevalonate Pathway in Archaea”. Biochemistry 53 (25): 4161-4168).
[00327] A enzima marcada com His recombinante foi expressa em Escherichia coli, purificada e caracterizada. Apesar de sua homologia com difosfomevalonato descarboxilase, ela não apresentou nenhuma atividade de descarboxilase (Azami e outros 2014; Vinokur e outros 2014). A enzima mostrou atividade fraca de fosfomevalonato cinase, produzindo quantidades pequenas de (R)-mevalonato difosfato (Azami e outros, 2014). Ela não tinha atividade de mevalonato-5-cinase (Vinokur e outros, 2014).
[00328] Em uma modalidade, a 3HIV cinase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Thermoplasma sp. e Picrophilus sp. Em uma modalidade adicional, a 3HIV cinase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Thermoplasma acidophilum e Picrophilus torridus. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV cinase são TA1305 e/ou PTO1356 ou seu homólogo. Em algumas modalidades, o TA1305 compreende uma mutação L200E. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 113, 115 e 117. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 112, 114 e 116.
Mevalonato difosfato descarboxilase (EC 4.1.1.-)
[00329] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: (R)-mevalonato difosfato + ATP ^ isopentenil difosfato + CO2 + ADP + fosfato 3-fosfonoxiisovalerato ^ CO2_+ isobuteno 3-hidróxi-isovalerato ^ CO2 + isobuteno
[00330] Mevalonato difosfato descarboxilase também pode ser conhecida como pirofosfomevalonato descarboxilase, mevalonato-5- pirofosfato descarboxilase, ácido pirofosfomevalônico descarboxilase, 5-pirofosfomevalonato descarboxilase, mevalonato-5-difosfato descarboxilase e ATP:(R)-5-difosfomevalonato carboxilase (desidratação), 3-fosfonóxi-isovalerato descarboxilase, 3-hidróxi- isovalerato-3-fosfato descarboxilase, 3HIV-3-fosfato descarboxilase, 3- hidróxi-isovalerato descarboxilase e 3HIV descarboxilase.
[00331] Essa enzima converte mevalonato 5-difosfato (MVAPP) em isopentenil difosfato (IPP) por meio de descarboxilação dependente de ATP. Os dois substratos dessa enzima são ATP e mevalonato 5- difosfato, enquanto seus quatro produtos são ADP, fosfato, isopentenil difosfato e CO2.
[00332] Mevalonato difosfato descarboxilase catalisa a etapa final na via do mevalonato. A via do mevalonato é responsável pela biossíntese de isoprenoides a partir de acetato. Essa via desempenha um papel fundamental em vários processos celulares através da síntese de isoprenoides esteróis, tal como colesterol, e isoprenoides não esteróis, tal como dolicol, heme A, tRNA isopenteniltransferase e ubiquinona. Essa enzima pertence à família de liases, especificamente as carbóxi- liases, que clivam as ligações carbono-carbono.
[00333] Mevalonato difosfato descarboxilase reconhece e se liga a dois substratos: ATP e mevalonato 5-difosfato. Após ligação, a enzima realiza três tipos de reações que podem ser separadas em dois estágios principais. Primeiro, fosforilação ocorre. Isso cria um intermediário reativo, que no segundo estágio sofre desfosforilação e descarboxilação combinadas.
[00334] Em uma modalidade, a enzima que catalisa a reação 3- fosfonoxiisovalerato ^ CO2 + isobuteno é uma 3HIV-3-fosfato descarboxilase. Em uma modalidade adicional, a 3HIV-3-fosfato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Streptococcus sp. Em algumas modalidades, o micro-organismo é selecionado de Streptococcus mitis e/ou Streptococcus gordonii. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV-3-fosfato descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 119 e 121. Em modalidades adicionais, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV- 3-fosfato descarboxilase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 118 e 120.
[00335] Em uma modalidade, a enzima que catalisa a reação 3- hidróxi-isovalerato ^ CO2 + isobuteno é uma 3HIV descarboxilase. Em uma modalidade adicional, a 3HIV descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Streptococcus sp., Thermoplasma sp. e Picrophilus sp. Em uma modalidade adicional, a 3HIV descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Streptococcus gordonii, Thermoplasma acidophilum e Picrophilus torridus. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a descarboxilase 3HIV compreendem mvaD, TA1305 e/ou PTO1356 ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 113, 117 e 121. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 3HIV descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 112, 116 e 120.
Transcetolase (EC 2.2.1.1)
[00336] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: D-eritrose 4-fosfato + D-xilulose 5-fosfato θ β-D-frutofuranose 6-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato D-sedoeptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato θ D-ribose 5- fosfato + D-xilulose 5-fosfato
[00337] A transcetolase também pode ser conhecida como glicolaldeídotransferase.
[00338] A transcetolase catalisa a transferência reversível de um grupo cetol entre vários substratos doadores e aceitadores. Essa enzima-chave é uma ligação reversível entre glicólise e a via da pentose fosfato. A enzima está envolvida no catabolismo de açúcares pentose, na formação de D-ribose 5-fosfato e no fornecimento de D-eritrose 4- fosfato, um precursor de aminoácidos aromáticos e PLP. E. coli contém duas isozimas transcetolase, TktA e TktB. O TktA é responsável pela principal atividade da transcetolase.
[00339] Além de sua função em metabolismo central de carbono, a transcetolase parece também ter um papel inesperado em estrutura de cromossomo; um mutante de tktA afeta topologia do cromossomo.
[00340] Estruturas de cristal de TktA em complexo com substratos doadores e aceitadores foram resolvidas, elucidando o mecanismo de reação e modo de ação de transcetolase. Um modelo computacional de atividade da transcetolase usando um método de mecânica quântica/mecânica molecular foi proposto, definindo uma nova rota para ativação de difosfato de tiamina. A transcetolase I (TktA) é homodimérica. As vias de desnaturação de ureia de tipo selvagem e de mutantes de sítio ativo de TktA foram investigadas e os efeitos de temperatura e pH sobre a estrutura, estabilidade, agregação e atividade da transcetolase foram determinados. A especificidade do aceitador de TktA foi investigada.
[00341] A abundância de TktA é afetada pelo indutor SOS e mutagênico 7-metóxi-2-nitronafto[2,1-b]furano (R7000). tktA é sub- regulado durante entrada na fase estacionária. O efeito do RpoS é provavelmente indireto e seria mediado por um regulador intermediário que é diretamente regulado por RpoS.
[00342] A estrutura de subunidade de transcetolase II (TktB) não foi determinada explicitamente. A superprodução de TktB suprime o fenótipo mutante tktA. Expressão de tktB é aumentada em um mutante tyrR na presença de fenilalanina. Expressão de tktB é aumentada na fase estacionária e regulada positivamente por RpoS e ppGpp. Os níveis de proteína TktB aumentam durante estresse osmótico sob condições de crescimento aeróbico, mas não anaeróbico. TktB parece estar associado ao degradossoma e pode conectar metabolismo do carbono à replicação.
[00343] Expressão de tktA e tktB é complementar, resultando em níveis aproximadamente constantes de expressão da transcetolase ao longo do crescimento.
[00344] Em algumas modalidades, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em uma modalidade adicional, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em ainda uma modalidade adicional, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em outras modalidades, a transcetolase é tktA de E. coli. Em algumas modalidades, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em ainda uma modalidade adicional, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em outras modalidades, a transcetolase é tktB de E. coli.
[00345] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transcetolase é tktA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transcetolase é tktB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transcetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 148 e 150. Em uma a modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transcetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 147 e 149.
Transaldolase (EC 2.2.1.2)
[00346] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-sedoeptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato θ β-D- frutofuranose 6-fosfato + D-eritrose 4-fosfato
[00347] A transaldolase também pode ser conhecida como di- hidroxiacetonatransferase; di-hidroxiacetona sintase; formaldeído transcetolase.
[00348] A transaldolase B é uma enzima do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato. Junto com a transcetolase, a transaldolase cria uma ligação reversível entre a via da pentose fosfato e a glicólise. Ela catalisa a interconversão de gliceraldeído-3-fosfato e sedoeptulose-7- fosfato em frutose-6-fosfato e eritrose-4-fosfato. A reversibilidade dessa reação e do fluxo de carbono através da via da pentose fosfato foi abordada tanto experimental quanto teoricamente.
[00349] Existem duas transaldolases intimamente relacionadas em E. coli, codificadas por talA e talB. Apenas a transaldolase B foi caracterizada bioquimicamente. TalB é um dímero em solução e na estrutura de cristal. Mutação do resíduo R300 leva à formação de monômeros cataliticamente ativos. Resíduos do sítio ativo cataliticamente importantes foram identificados por mutagênese dirigida ao sítio.
[00350] Estruturas de cristal da transaldolase B foram determinadas, confirmando a presença de um intermediário de base de Schiff no sítio ativo e levando a um mecanismo de reação proposto.
[00351] Um mutante talB nulo não tem nenhum defeito de crescimento em meio mínimo com glicose como a fonte de carbono.
[00352] Em algumas modalidades, a transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em ainda modalidade adicional, a transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em outras modalidades, a transaldolase é talA de E. coli. Em ainda modalidades adicionais, a transaldolase é talB de E. coli.
[00353] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transaldolase é talA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transaldolase é talB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transaldolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 152 e 154. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a transaldolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 151 e 153.
Ribose-5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6)
[00354] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-ribose 5-fosfato θ D-ribulose 5-fosfato
[00355] A ribose-5-fosfato isomerase também pode ser conhecida como fosfopentoseisomerase; fosforriboisomerase; ribose fosfato isomerase; 5-fosforribose isomerase; D-ribose 5-fosfato isomerase; D- ribose-5-fosfato cetol-isomerase.
[00356] Existem duas ribose-5-fosfato isomerases fisicamente e geneticamente distintas presentes em E. coli. A ribose-5-fosfato isomerase A (rpiA) constitutiva tipicamente é responsável por mais de 99% da atividade da ribose-5-fosfato isomerase na célula e funciona na via da pentose fosfato (ramo não oxidativo). A ribose-5-fosfato isomerase B induzível (rpiB) pode substituir a função de rpiA se sua expressão for induzida. Não há nenhuma similaridade de sequência entre as duas enzimas.
[00357] Estruturas de cristal de RpiA foram resolvidas e os resíduos do sítio ativo e um mecanismo catalítico ácido-base foram previstos. Um mutante de rpiA requer ribose para crescimento.
[00358] Em algumas modalidades, a ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em uma modalidade adicional, a ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em ainda uma modalidade adicional, a ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a ribose-5-fosfato isomerase é rpiA de E. coli.
[00359] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribose-5-fosfato isomerase é rpiA ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribose-5 -fosfato isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 155.
Ribulose-5-fosfato 3-epimerase (EC 5.1.3.1)
[00360] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-ribulose 5-fosfato θ D-xilulose 5-fosfato
[00361] A ribulose-5-fosfato 3-epimerase também pode ser conhecida como ribulose-fosfato 3-epimerase; fosforribulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose 3- epimerase; xilulose fosfato 3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; D-ribulose fosfato-3-epimerase; D-ribulose 5-fosfato epimerase; D- ribulose-5-P 3-epimerase; D-xilulose-5-fosfato 3-epimerase; pentose-5- fosfato 3-epimerase.
[00362] Ribulose-5-fosfato 3-epimerase (Rpe) é uma enzima do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato.
[00363] Rpe requer ferro ferroso para atividade e é vulnerável a danos por H2O2 devido à química de Fenton. Mn2+, Co2+ e Zn2+ podem substituir Fe2+ em vários graus, e Rpe contendo esses cátions alternativos não é vulnerável a H2O2. Indução do transportador de manganês pode proteger Rpe de danos por H2O2.
[00364] Em algumas modalidades, a ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em uma modalidade adicional, a ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em ainda uma modalidade adicional, a ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em outras modalidades, a ribulose-5-fosfato 3-epimerase é rpe de E. coli.
[00365] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribulose-5-fosfato 3- epimerase é rpe ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribulose-5-fosfato 3-epimerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a ribulose-5-fosfato 3-epimerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157.
Frutose 6-fosfato fosfocetolase (Fpk, EC 4.1.2.22)
[00366] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-frutose 6-fosfato + fosfato θ acetil fosfato + D-eritrose 4-fosfato + H2O
[00367] A reação de fosfocetolase pela qual β-D-frutofuranose 6- fosfato é convertida em D-eritrose 4-fosfato e acetil fosfato é uma das principais reações na derivação de Bifidobacterium. Há evidências da existência de duas enzimas F6P-fosfocetolase distintas em bifidobactérias. Uma é específica apenas para F6P, enquanto a outra é capaz de utilizar F6P e D-xilulose 5-fosfato (EC: 4.1.2.9), uma reação que aparece mais tarde na derivação de Bifidobacterium. A enzima codificada pelo gene xfp, originalmente verificada em Bifidobacterium animalis lactis, é a enzima de especificidade dupla. Uma fosfocetolase também foi purificada a partir de Leuconostoc nesenteroides (LEUM_1961).
[00368] [0005] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium dentium BDP_1006, Bifidobacterium lactis xfp, Lactobacillus paraplantarum xpkA e Bifidobacterium breve xfp. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium dentium BDP_1006, Bifidobacterium lactis xfp, Lactobacillus paraplantarum xpkA e Bifidobacterium breve xfp. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a frutose-6-fosfato fosfocetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 212, 214, 216 e 218. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais molécula de ácido nucleico que codificam a frutose-6- fosfato fosfocetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 211, 213, 215 e 217.
Fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8)
[00369] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: Acetil-CoA + fosfato θ CoA + acetil fosfato
[00370] Fosfato acetiltransferase (Pta) catalisa a conversão reversível entre acetil-CoA e acetilfosfato, uma etapa do metabolismo de acetato. Ambos piruvato e fosfoenolpiruvato ativam a enzima na direção da síntese do acetilfosfato e inibem a enzima na direção da síntese de acetil-CoA. A formação de acetato a partir da via acetil-CoA I tem sido o alvo de engenharia metabólica para reduzir o fluxo para acetato e aumentar a produção de produtos finais comercialmente desejados. Ela também foi estudada usando abordagens de biologia de sistemas tal como modelagem metabólica e análise de equilíbrio de fluxo.
[00371] Pta é composto por três domínios; apenas o domínio C- terminal é necessário para a atividade da fosfato acetiltransferase. O domínio N-terminal está envolvido na estabilização da estrutura quaternária nativa e na regulagem metabólica.
[00372] Pta pode ser capaz de utilizar ambos acetil-CoA e propionil- CoA. Um mutante duplo ack pta reduziu os níveis de propionato de L- treonina, sugerindo que a enzima é parte da via anaeróbia que metaboliza L-treonina em propionato. Um mutante pta não cresce em acetato como única fonte de carbono. Ambos mutantes pta e pta ackA são prejudicados em sua capacidade de sobreviver à privação de glicose. O defeito de crescimento de um mutante pta parece ser devido à perturbação do fluxo de acetil-CoA. Mutantes pta produzem grandes quantidades de lactato quando cultivados em glicose como a fonte de carbono sob condições microaerofílicas. O efeito de uma mutação pta no metabolismo, atividade de enzima e expressão de genes foi exaustivamente estudado recentemente. Mutantes pta e recBC são inibidos de crescimento sinteticamente.
[00373] Os níveis de Pta são diminuídos com o crescimento em acetato e sob condições de pH baixo. pta pertence ao regulon CreBC. FNR tem um efeito ligeiramente positivo sobre expressão de pta. O padrão de expressão dependente da taxa de crescimento de pta-ackA foi medido.
[00374] O gene pta que codifica a enzima foi clonado de Clostridium acetobutylicum, sequenciado e expresso em Escherichia coli. O gene é adjacente ao gene ackA, que codifica a enzima que catalisa a segunda etapa - acetato cinase. Ensaios de atividade de enzima realizados em extratos celulares de Escherichia coli e Clostridium acetobutylicum contendo o subclone mostraram atividade elevada. As enzimas mostraram uma diminuição em atividade específica quando o organismo atinge o estágio de formação do solvente.
[00375] Enzimas tendo atividade de fosfato acetiltransferase ou genes de fosfato acetiltransferase também foram identificadas ou medidas a partir de E. coli (eutD, pta), Roseovarius nubinhibens ISM, Clostridium kluyveri, Chlamydomonas reinhardtii (PAT2), Dasytricha ruminantium, Pelobacter acetylenicus, Gottschalkia acidurici, Lactobacillus sanfranciscensis, Paracoccus denitrificans NKNIS, Eubacterium oxidoreducens G41, Mycoplasma pneumoniae M129, Thermotoga maritima, Moorella thermoacetica, Methanosarcina thermophile, Clostridium propionicum and Fusobacterium nucleatum.
[00376] Em algumas modalidades, enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de fosfato de acetiltransferase selecionada de E. coli pta e Clostridium acetobutylicum pta. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é selecionada de E. coli pta e Clostridium acetobutylicum pta. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a fosfato acetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 220 e 222. Em uma modalidade adicional a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando o fosfato acetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 219 e 221.
Glicose-6-fosfato 1-desidrogenase (EC 1.1.1.49)
[00377] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-glicose 6-fosfato + NADP+ θ 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona + NADPH
[00378] Glicose-6-fosfato 1-desidrogenase também pode ser conhecida como glicose-6-fosfato desidrogenase (NADP+); NADP- glicose-6-fosfato desidrogenase; Zwischenferment; D-glicose 6-fosfato desidrogenase; glicose 6-fosfato desidrogenase (NADP); glicose 6- fosfato desidrogenase dependente de NADP; 6-fosfoglucose desidrogenase; Enzima Entner-Doudoroff; G6PDH; GPD; glicose-6- fosfato desidrogenase.
[00379] Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima da via da pentose fosfato e fornece uma grande fração do NADPH necessário para anabolismo.
[00380] A E. coli G6PDH mostra uma forte preferência por NADP+ em relação a NAD+. A base estrutural para essa preferência foi estudada usando simulações moleculares, caracterização cinética de mutantes dirigidos a local e análises filogenéticas.
[00381] Fluxo metabólico através das vias de metabolismo de carbono central foi medido usando GC-MS e marcação com 13C e espectroscopia de RMN 2D. Regulagem dessas vias sob condições de crescimento diferentes foi medida no nível de expressão e atividade da enzima.
[00382] Substituição de uma enzima produtora de NADPH nativa por glicose-6-fosfato desidrogenase produtora de NADH reduziu a taxa de crescimento de células do tipo selvagem, enquanto aumentando a taxa de crescimento de um mutante Δpgi. Isso sugere que se a produção de NADH por G6PDH é benéfica ou prejudicial in vivo depende da operação da via superior de Embden-Meyerhof.
[00383] Em adição ao seu papel em metabolismo central do carbono, G6PDH foi verificada ser a fonte de um peptídeo linear com a sequência de aminoácidos Asn-Asn-Trp-Asn-Asn (NNWNN) que age como um "fator de morte extracelular" (EDF) para morte celular mediada por MazEF. O peptídeo age aumentando a atividade de endorribonuclease das toxinas MazF e ChpBK. Produção de EDF sob condições de estresse é devido à clivagem do mRNA de zwf em sítios ACA específicos por MazF, gerando um mRNA truncado sem líder. A localização da região de codificação de EDF em relação aos locais de clivagem de MazF é importante e o sistema de trans-tradução é necessário.
[00384] zwf é um dos genes mais consistentemente acoplados a fluxo, que são genes cujos padrões de transição de expressão em perturbações são correlacionados com seus valores de fluxo correspondentes. Expressão de zwf é regulada pela taxa de crescimento no nível transcripcional. Atividade de G6PDH é maior em células de crescimento rápido, e é maior sob condições de crescimento limitado por nitrogênio comparado com condições de crescimento limitado por carbono. zwf é uma parte do regulon SoxRS que responde a estresse por superóxido. Reguladores adicionais foram mostrados ativar transcrição de zwf. Exposição a telurito ativa transcrição de zwf e, portanto, aumenta a síntese de NADPH.
[00385] Uma mutação zwf nula não afeta a taxa de crescimento significantemente. No entanto, metabolismo central de carbono e fluxo metabólico são modificados. Um mutante duplo zwf pgi não cresce em glicose como a única fonte de carbono. Na presença de glicose, ele acumula níveis altos de glicose-6-fosfato, que inibe a atividade da frutose-1,6-bisfosfatase I. A exclusão de zwf reduz a tolerância a solvente orgânico de JM109 de E. coli.
[00386] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicose-6-fosfato desidrogenase para prevenir o fluxo de glicose-6-fosfato através do ramo oxidativo da via da pentose fosfato e, em vez disso, deriva a glicose-6-fosfato através do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir intermediário D-ribose-5-fosfato.
6-fosfogluconolactonase (EC 3.1.1.31)
[00387] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona + H2O ^ D-gluconato 6-fosfato + H +
[00388] A 6-fosfogluconolactonase também pode ser conhecida como fosfogluconolactonase; 6-PGL.
[00389] A 6-fosfogluconolactonase é uma enzima da via oxidativa da pentose fosfato.
[00390] Uma cepa mutante pgl cresce apenas ligeiramente mais lentamente do que o tipo selvagem em glicose como a única fonte de carbono. Crescimento da glicose pode ser devido à hidrólise não enzimática de 6-fosfo D-glucono-1,5-lactona ou uma via de desvio que envolve desfosforilação e exportação de gluconolactona, hidrólise para gluconato, seguido por reimportação e fosforilação de gluconato. Quando cultivadas em meio de maltose, as cepas sem atividade de Pgl ficam azuis após o tratamento com iodo. O fenótipo de uma cepa de deleção de pgl pode ser complementado pela expressão do gene pgl de Pseudomonas putida, embora não haja nenhuma similaridade detectável entre os dois genes.
[00391] Uma estratégia para engenharia metabólica de E. coli para a produção de riboflavina incluiu a superexpressão de pgl, levando a um aumento no título de riboflavina.
[00392] pgl é parte de uma região genômica que é excluída na cepa BL21 de E. coli B, mas está presente na cepa K-12 MG1655.
[00393] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante que produz MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconolactonase para evitar o fluxo de glicose-6-fosfato através do ramo oxidativo da via da pentose fosfato e em vez disso deriva a glicose-6-fosfato através do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir intermediário D-ribose-5-fosfato.
6-fosfogluconato desidrogenase, descarboxilação (EC 1.1.1.44)
[00394] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-gluconato 6-fosfato + NADP+ ^ D-ribulose 5-fosfato + CO2 + NADPH
[00395] 6-Fosfogluconato desidrogenase também pode ser conhecida como fosfogluconato desidrogenase (dependente de NADP+, descarboxilação); ácido fosfoglucônico desidrogenase; 6- fosfoglucônico desidrogenase; carboxilase 6-fosfoglucônica; 6-fosfo-D- gluconato desidrogenase; gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.
[00396] A 6-fosfogluconato desidrogenase é uma enzima do ramo oxidativo da via da pentose fosfato.
[00397] Três estruturas de cristal da enzima em complexo com compostos de substrato e co-substrato foram resolvidas. Ligação de NADP+ pode induzir uma mudança conformacional na enzima. Um mecanismo catalítico foi proposto.
[00398] gnd é um gene altamente polimórfico dentro das populações de E. coli, provavelmente devido à transferência e recombinação entre as cepas. Isso pode ser um resultado de sua proximidade com a região rfb, que determina a estrutura do antígeno O.
[00399] Expressão da 6-fosfogluconato desidrogenase é regulada pela taxa de crescimento. A maior parte do aumento dependente da taxa de crescimento nos níveis de Gnd é devido à transcrição aumentada, levando a níveis de mRNA maiores. Regulagem pós-transcripcional envolve um elemento de estrutura secundária entre os códons 67 e 78 do mRNA de gnd. Essa região pode funcionar através de sequestro da região de iniciação da tradução em uma estrutura secundária de mRNA, dessa maneira reduzindo a eficiência da iniciação da tradução. No entanto, o efetor desse mecanismo regulador aparentemente ainda não foi identificado. Os mutantes truA (hisT) reduzem o aumento dependente da taxa de crescimento de expressão de Gnd através de regulagem pós-transcripcional. Crescimento sob condições ácidas regula positivamente expressão de gnd. gnd é um dos genes mais consistentemente acoplados a fluxo (FCGs), que são genes cujos padrões de transição de expressão em perturbações estão correlacionados com seus valores de fluxo correspondentes.
[00400] Certas condições de crescimento selecionadas para uma mutação de deleção na região do promotor que resulta em transcrição aumentada de gnd e atividade de enzima aumentada. Um mutante duplo edd gnd é incapaz de crescer em gluconato. Uma mutação nula em gnd não altera significantemente a taxa de crescimento. No entanto, metabolismo celular e fluxo metabólico são modificados; produção de succinato é aumentada durante crescimento em glicose ou glicerol. Um mutante de deleção de gnd mostra produção aumentada de etanol e H2 comparado com o tipo selvagem durante crescimento anaeróbico em glicerol, enquanto em uma cepa diferente, completamente engenheirada, superexpressão de gnd aumenta produção de etanol e H2.
[00401] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconato desidrogenase para prevenir o fluxo de glicose-6-fosfato através do ramo oxidativo da via da pentose fosfato e em vez disso deriva a glicose- 6-fosfato através do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir intermediário D-ribose-5-fosfato.
Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosforilação (EC 1.2.1.12)
[00402] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-gliceraldeído 3-fosfato + NAD+ + fosfato θ 1,3-bisfosfo-D-glicerato + NADH + H +
[00403] A gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase também pode ser conhecida como gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (fosforilação); triosefosfato desidrogenase; desidrogenase, gliceraldeído fosfato; fosfogliceraldeído desidrogenase; 3-fosfogliceraldeído desidrogenase; gliceraldeído fosfato desidrogenase dependente de NAD+; gliceraldeído fosfato desidrogenase (NAD+); gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NAD+); NADH-gliceraldeído fosfato desidrogenase; gliceraldeído-3-P- desidrogenase.
[00404] Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase A catalisa a fosforilação oxidativa reversível de D-gliceraldeído-3-fosfato em 1,3- bisfosfo-D-glicerato na presença de NAD+ e fosfato durante glicólise e gliconeogênese em E. coli. A enzima também é encontrada em muitos outros organismos e suas propriedades têm sido amplamente estudadas.
[00405] E. coli é incomum tendo duas atividades gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH) codificadas por gapA e epd (gapB). No entanto, a enzima codificada por gapA tem uma atividade altamente eficiente de fosforilação gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e uma baixa atividade de fosforilação eritrose-4-fosfato desidrogenase, enquanto a enzima codificada por epd tem uma atividade eficiente de não fosforilação de eritrose-4-fosfato desidrogenase e uma atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de fosforilação muito baixa.
[00406] A proteína GapA tem uma sequência que é mais similar às sequências eucarióticas do que a enzimas bacterianas termofílicas e a enzimas procarióticas em geral. O produto gapA é necessário para glicólise, enquanto o produto epd não. Ambas enzimas podem estar envolvidas em produção de piridoxal 5'-fosfato (PLP).
[00407] Estudos iniciais de mutantes gapA de E. coli K-10 implicaram seu papel em glicólise e demonstraram algumas de suas propriedades catalíticas. Um mutante de gapA exibe um defeito de crescimento e também exibe fenótipos de agregação e lise aumentados que são resgatados por meio com alto teor de sal.
[00408] Regulagem de expressão de gene gapA foi estudada. A regulagem dos genes fkpA, gapA e hslT é afetada pela evolução sob condições de estresse térmico crônico.
[00409] A sequência de E. coli contém vários aminoácidos que são conservados em todos os GAPDHs e são postulados como envolvidos em ligação de NAD+, ou o mecanismo catalítico.
[00410] A estrutura de cristal da enzima do tipo selvagem na presença de NAD+ foi determinada em resolução de 1,80 Â e foi similar àquela de outras GAPDHs. A estrutura de cristal de um mutante de N313T também foi determinada em resolução de 2,17 Â. Várias outras estruturas de cristal GAPDH de E. coli foram relatadas com e sem NAD+ ligado e no estado intermediário hemiacetal.
[00411] Fatores moleculares responsáveis pela estereoespecificidade do cofator NAD+ foram estudados usando mutagênese sítio-dirigida. A enzima é uma desidrogenase específica de B que catalisa transferência do hidrogênio pró-S e se liga a NAD(H) na orientação de nicotinamida syn. Redobra de GAPDH de E. coli desnaturada na presença de proteína chaperona Tig; fator desencadeante foi estudado.
[00412] O GAPDH ribosilado com ADP é um fator de virulência secretado em alguns fungos e patógenos Gram-positivos, bem como em cepas patogênicas de E. coli. E. coli não patogênica não secreta GAPDH. Evidência sugere que GAPDH de E. coli de também está envolvida em reparo de DNA.
[00413] Uma série de vetores expressando indutivelmente RNAs de antissentido de terminal emparelhado foi construída para silenciar o metabolismo central do carbono no hospedeiro K-12 MG1655 de E. coli. Um vetor que silenciou gapA com eficácia de 93% causou inibição de crescimento severa. Regulagem da expressão de um gapA de E. coli engenheirado por meio de mudanças em temperatura foi demonstrada controlar glicólise.
[00414] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase para evitar a conversão de gliceraldeído 3-fosfato em 1,3-bisfosfo-D-glicerato e em vez disso permitir que gliceraldeído 3- fosfato seja convertido em xilulose-5-fosfato (com uma conversão simultânea de frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato) por uma transcetolase, que pode ainda ser convertida em D-ribose 5-fosfato, um intermediário na via da pentose fosfato não oxidativa, que pode ser convertido por uma D-ribose 5-fosfato aldolase nos intermediários glicoladeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) para a produção de MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos.
Pentose-Fosfato Aldolase
[00415] Pentose-fosfato aldolases catalisam a reação aldol reversível convertendo uma pentose-fosfato em gliceraldeído-3-fosfato e glicoaldeído. Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase é uma D-ribose-5-fosfato aldolase (DERA), uma D-ribulose-5-fosfato aldolase ou uma D-xilulose-5-fosfato aldolase.
[00416] Em algumas modalidades, uma D-ribose-5-fosfato aldolase catalisa a conversão de D-ribose-5-fosfato em acetaldeído e gliceraldeído-3-fosfato.
[00417] Em algumas modalidades, uma D-ribulose-5-fosfato aldolase catalisa a conversão de D-ribulose-5-fosfato em um glicoaldeído e gliceraldeído-3-fosfato.
[00418] Em algumas modalidades, uma D-xilulose-5-fosfato aldolase catalisa a conversão de D-xilulose-5-fosfato em um glicoaldeído e gliceraldeído-3-fosfato.
[00419] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase é derivada de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a pentose- fosfato aldolase é derivada de Bacillus caldolyticus.
[00420] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo: ATGACTGATC TGAAAGCAAG CAGCCTGCGT GCACTGAAAT TGATGGACCT GACCACCCTG AATGACGACG ACACCGACGA GAAAGTGATC GCCCTGTGTC ATCAGGCCAA AACTCCGGTC GGCAATACCG CCGCTATCTG TATCTATCCT CGCTTTATCC CGATTGCTCG CAAAACTCTG AAAGAGCAGG GCACCCCGGA AATCCGTATC GCTACGGTAA CCAACTTCCC ACACGGTAAC GACGACATCG ACATCGCGCT GGCAGAAACC CGTGCGGCAA TCGCCTACGG TGCTGATGAA GTTGACGTTG TGTTCCCGTA CCGCGCGCTG ATGGCGGGTA ACGAGCAGGT TGGTTTTGAC CTGGTGAAAG CCTGTAAAGA GGCTTGCGCG GCAGCGAATG TACTGCTGAA AGTGATCATC GAAACCGGCG AACTGAAAGA CGAAGCGCTG ATCCGTAAAG CGTCTGAAAT CTCCATCAAAGCGGGTGCGG ACTTCATCAA AACCTCTACC GGTAAAGTGG CTGTGAACGC GACGCCGGAA AGCGCGCGCA TCATGATGGA AGTGATCCGT GATATGGGCG TAGAAAAAAC CGTTGGTTTC AAACCGGCGG GCGGCGTGCGTACTGCGGAA GATGCGCAGA AATATCTCGC CATTGCAGAT GAACTGTTCG GTGCTGACTG GGCAGATGCG CGTCACTACC GCTTTGGCGC TTCCAGCCTG CTGGCAAGCC TGCTGAAAGC GCTGGGTCAC GGCGACGGTA AGAGCGCCAG CAGCTACTAA (SEQ ID NO: 255).
[00421] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli é uma sequência de aminoácidos compreendendo: MTDLKASSLRALKLMDLTTLNDDDTDEKVIALCHQAKTPVGNTAAICIY PRFIPIARKTLKEQGTPEIRIATVTNFPHGNDDIDIALAETRAAIAYGAD EVDVVFPYRALMAGNEQVGFDLVKACKEACAAANVLLKVIIETGELKD EALIRKASEISIKAGADFIKTSTGKVAVNATPESARIMMEVIRDMGVEK TVGFKPAGGVRTAEDAQKYLAIADELFGADWADARHYRFGASSLLAS LLKALGHGDGKSASSY (SEQ ID NO: 256).
[00422] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli compreende uma mutação C47N e é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo: ATGACTGATCTGAAAGCAAGCAGCCTGCGTGCACTGAAATTGATG GACCTGACCACCCTGAATGACGACGACACCGACGAGAAAGTGAT CGCCCTGTGTCATCAGGCCAAAACTCCGGTCGGCAATACCGCCG CTATCAATATCTATCCTCGCTTTATCCCGATTGCTCGCAAAACTCT GAAAGAGCAGGGCACCCCGGAAATCCGTATCGCTACGGTAACCA ACTTCCCACACGGTAACGACGACATCGACATCGCGCTGGCAGAAA CCCGTGCGGCAATCGCCTACGGTGCTGATGAAGTTGACGTTGTGT TCCCGTACCGCGCGCTGATGGCGGGTAACGAGCAGGTTGGTTTT GACCTGGTGAAAGCCTGTAAAGAGGCTTGCGCGGCAGCGAATGT ACTGCTGAAAGTGATCATCGAAACCGGCGAACTGAAAGACGAAGC GCTGATCCGTAAAGCGTCTGAAATCTCCATCAAAGCGGGTGCGGA CTTCATCAAAACCTCTACCGGTAAAGTGGCTGTGAACGCGACGCC GGAAAGCGCGCGCATCATGATGGAAGTGATCCGTGATATGGGCG TAGAAAAAACCGTTGGTTTCAAACCGGCGGGCGGCGTGCGTACT GCGGAAGATGCGCAGAAATATCTCGCCATTGCAGATGAACTGTTC GGTGCTGACTGGGCAGATGCGCGTCACTACCGCTTTGGCGCTTC CAGCCTGCTGGCAAGCCTGCTGAAAGCGCTGGGTCACGGCGACG GTAAGAGCGCCAGCAGCTACTAA (SEQ ID NO: 255).
[00423] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: ATGACGATGAATATCGCGAAAATGATCGATCATACGCTGCTCAAA CCGGAAGCGACAGAACAACAAATCGTGCAACTGTGCACGGAAGC AAAGCAATACGGCTTTGCTGCCGTGTGCGTCAACCCAACGTGGGT GAAAACGGCGGCGCGCGAGCTTTCCGGCACGGATGTCCGCGTCT GCACGGTCATCGGCTTTCCACTTGGGGCAACGACGCCGGAAACA AAGGCGTTTGAAACAACGAACGCCATCGAAAACGGCGCTCGCGA AGTCGACATGGTGATCAACATCGGTGCGTTAAAAAGCGGGCAAGA CGAGCTTGTCGAGCGCGACATTCGTGCGGTTGTCGAAGCGGCGG CTGGCAGGGCGCTTGTCAAAGTGATCGTTGAAACGGCGCTTTTGA CCGATGAGGAAAAAGTGCGCGCCTGCCAGCTCGCAGTGAAAGCC GGCGCTGATTATGTGAAAACGTCGACCGGGTTTTCCGGCGGAGG TGCGACGGTGGAGGATGTGGCGCTGATGCGGAAAACGGTCGGC GACAGAGCAGGCGTCAAAGCATCAGGCGGCGTCCGTGACTGGAA AACCGCTGAGGCGATGATCAACGCCGGCGCGACGCGCATCGGCA CAAGCTCTGGGGTGGCGATCGTCACCGGCGGGACGGGCCGCGC TGACTACTAA (SEQ ID NO: 286).
[00424] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é codificada por uma sequência de cDNA otimizada compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: CCATGGCAAACATCGCGAAGATGATTGACCACACCCTGCTGAAAC CGGAGGCGACCGAACAGCAAATCGTTCAGCTGTGCACCGAGGCG AAACAATACGGCTTCGCGGCGGTGTGCGTTAACCCGACCTGGGT TAAGACCGCGGCGCGTGAACTGAGCGGTACCGACGTGCGTGTTT GCACCGTGATTGGTTTCCCGCTGGGTGCGACCACCCCGGAGACC AAAGCGTTTGAAACCACCAACGCGATTGAGAACGGCGCGCGTGA AGTTGATATGGTGATCAACATTGGCGCGCTGAAGAGCGGTCAGGA CGAGCTGGTTGAGCGTGATATTCGTGCGGTGGTTGAGGCTGCGG CGGGTCGTGCGCTGGTGAAAGTTATTGTGGAAACCGCGCTGCTG ACCGACGAGGAAAAAGTGCGTGCGTGCCAACTGGCGGTTAAGGC GGGTGCGGATTACGTGAAAACCAGCACCGGTTTTAGCGGTGGCG GTGCGACCGTTGAGGATGTGGCGCTGATGCGTAAGACCGTTGGC GATCGTGCGGGTGTGAAAGCGAGCGGCGGTGTTCGTGACTGGAA GACCGCGGAAGCGATGATCAACGCGGGTGCGACCCGTATTGGTA CCAGCAGCGGTGTTGCGATTGTGACCGGCGGTACCGGTCGTGCG GATTATAAGCTT (SEQ ID NO: 287).
[00425] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTDLKASSLRALKLMDLTTLNDDDTDEKVIALCHQAKTPVGNTAAICIY PRFIPIARKTLKEQGTPEIRIATVTNFPHGNDDIDIALAETRAAIAYGAD EVDVVFPYRALMAGNEQVGFDLVKACKEACAAANVLLKVIIETGELKD EALIRKASEISIKAGADFIKTSTGKVAVNATPESARIMMEVIRDMGVEK TVGFKPAGGVRTAEDAQKYLAIADELFGADWADARHYRFGASSLLAS LLKALGHGDGKSASSY (SEQ ID NO: 256).
[00426] Em algumas modalidades, a pentose-fosfato aldolase de E. coli é uma sequência de aminoácido que compreende uma mutação C47N e compreende: MTDLKASSLRALKLMDLTTLNDDDTDEKVIALCHQAKTPVGNTAAINIY PRFIPIARKTLKEQGTPEIRIATVTNFPHGNDDIDIALAETRAAIAYGAD EVDVVFPYRALMAGNEQVGFDLVKACKEACAAANVLLKVIIETGELKD EALIRKASEISIKAGADFIKTSTGKVAVNATPESARIMMEVIRDMGVEK TVGFKPAGGVRTAEDAQKYLAIADELFGADWADARHYRFGASSLLAS LLKALGHGDGKSASSY (SEQ ID NO: 299).
[00427] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTMNIAKMIDHTLLKPEATEQQIVQLCTEAKQYGFAAVCVNPTWVKT AARELSGTDVRVCTVIGFPLGATTPETKAFETTNAIENGAREVDMVINI GALKSGQDELVERDIRAVVEAAAGRALVKVIVETALLTDEEKVRACQL AVKAGADYVKTSTGFSGGGATVEDVALMRKTVGDRAGVKASGGVR DWKTAEAMINAGATRIGTSSGVAIVTGGTGRADY (SEQ ID NO: 297).
[00428] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus compreende uma mutação C37N e é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: ATGACGATGAATATCGCGAAAATGATCGATCATACGCTGCTCAAA CCGGAAGCGACAGAACAACAAATCGTGCAACTGTGCACGGAAGC AAAGCAATACGGCTTTGCTGCCGTGTGCGTCAACCCAACGTGGGT GAAAACGGCGGCGCGCGAGCTTTCCGGCACGGATGTCCGCGTCT GCACGGTCATCGGCTTTCCACTTGGGGCAACGACGCCGGAAACA AAGGCGTTTGAAACAACGAACGCCATCGAAAACGGCGCTCGCGA AGTCGACATGGTGATCAACATCGGTGCGTTAAAAAGCGGGCAAGA CGAGCTTGTCGAGCGCGACATTCGTGCGGTTGTCGAAGCGGCGG CTGGCAGGGCGCTTGTCAAAGTGATCGTTGAAACGGCGCTTTTGA CCGATGAGGAAAAAGTGCGCGCCTGCCAGCTCGCAGTGAAAGCC GGCGCTGATTATGTGAAAACGTCGACCGGGTTTTCCGGCGGAGG TGCGACGGTGGAGGATGTGGCGCTGATGCGGAAAACGGTCGGC GACAGAGCAGGCGTCAAAGCATCAGGCGGCGTCCGTGACTGGAA AACCGCTGAGGCGATGATCAACGCCGGCGCGACGCGCATCGGCA CAAGCTCTGGGGTGGCGATCGTCACCGGCGGGACGGGCCGCGC TGACTACTAA (SEQ ID NO: 286).
[00429] Em algumas modalidades, pentose-fosfato aldolase de B. Caldolyticus compreende uma mutação C37N e é uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com: MTMNIAKMIDHTLLKPEATEQQIVQLCTEAKQYGFAAVNVNPTWVKT AARELSGTDVRVCTVIGFPLGATTPETKAFETTNAIENGAREVDMVINI GALKSGQDELVERDIRAVVEAAAGRALVKVIVETALLTDEEKVRACQL AVKAGADYVKTSTGFSGGGATVEDVALMRKTVGDRAGVKASGGVR DWKTAEAMINAGATRIGTSSGVAIVTGGTGRADY (SEQ ID NO: 298)
6-fosfofrutocinase (EC 2.7.1.11)
[00430] A fosfofrutocinase (Pfk) catalisa a fosforilação de frutose-6- fosfato no carbono C1 durante glicólise. E. coli contém duas isozimas Pfk, Pfk-1 (pfkA) e Pfk-2 (pfkB), que não compartilham similaridade de sequência. Mais de 90% da atividade da fosfofrutocinase presente na E. coli do tipo selvagem podem ser atribuídos a Pfk-1.
[00431] PfkA catalisa a fosforilação de frutose-6-fosfato e é uma enzima- chave que regula a via da glicólise. A enzima não pode catalisar a reação reversa in vivo. A enzima mostra cinética cooperativa com o substrato frutose-6-fosfato, mas não com o outro substrato, ATP. Recentemente, foi demonstrado que PfkA também catalisa fosforilação de sedoheptulose-7-fosfato como parte do desvio de sedoeptulose bifosfato. As estruturas de cristal de PfkA foram resolvidas com e sem ativadores e inibidores. Com base em similaridade de sequência, PfkA foi previsto ser uma NAD+ cinase.
[00432] PfkB é um membro da família ribocinase de cinases de açúcar. PfkB, diferente de PfkA, não mostra interação cooperativa com frutose-6-fosfato, inibição por PEP ou ativação por ADP. MgATP2- é o verdadeiro substrato da enzima. PfkB também pode usar tagatose-6- fosfato como um substrato. Esta reação faz parte da via do catabolismo do galactitol. Uma estrutura de cristal de PfkB na forma tetramérica inibida por MgATP foi resolvida em resolução de 1,98 Â. Comparação dessa estrutura com uma estrutura de cristal de PfkB em complexo com frutose-6-fosfato sugere interação negativa entre a ligação de frutose-6- fosfato e a ligação de MgATP.
[00433] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante produzindo MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfofrutocinase para evitar a conversão de frutose-6-fosfato em 1,6-bifosfato e em vez disso permitir que a frutose-6-fosfato seja convertida em eritrose-4-fosfato e acetil- fosfato por uma frutose-6-fosfato fosfocetolase e forneça mais eritrose- 4-fosfato para o ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir ainda intermediário D-ribose 5-fosfato, que pode ser convertido por uma D-ribose 5-fosfato aldolase nos intermediários glicoladeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) necessários para a produção de MEG ou ácido glicólico, ou MEG e um ou mais coprodutos. Em algumas modalidades, a 6-fosfofrutocinase é pfkA e/ou pfkB.
Hidroxipiruvato descarboxilase, 2-oxoglutarato descarboxilase, 2- ceto ácido descarboxilase (EC 4.1.1.-)
[00434] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: hidroxipiruvato + H + θ CO2 + glicolaldeído 2-oxoglutarato + coenzima A + NAD+ ^ succinil-CoA + CO2 + NADH 4-metil-2-oxopentanoato + H + ^ 3-metilbutanal + CO2 3-metil-2-oxobutanoato + H + ^ isobutanal + CO2
[00435] Hidroxipiruvato descarboxilase também pode ser conhecida como hidroxipiruvato carbóxi-liase.
[00436] A 2-oxoglutarato descarboxilase também pode ser conhecida como oxoglutarato descarboxilase; alfa-cetoglutarato descarboxilase; alfa-cetoglutárico descarboxilase; pré-2-oxoglutarato descarboxilase; 2-oxoglutarato carbóxi-liase.
[00437] SucA de E. coli é responsável pela atividade 2-oxoglutarato descarboxilase do complexo de múltiplas enzimas 2-oxoglutarato desidrogenase (OGDHC) que catalisa a conversão de 2-oxoglutarato (2- cetoglutarato) em succinil-CoA e CO2, com a produção de NADH.
[00438] OGDHC é um membro da família 2-oxo ácido desidrogenase. Os membros desta família contêm várias cópias de três componentes enzimáticos: 2-oxoglutarato descarboxilase (E1), lipoamida aciltransferase (E2) e lipoamida desidrogenase (E3). Na maioria das bactérias Gram-positivas e nas mitocôndrias, o componente E1 é um heterodímero composto de duas subunidades, enquanto na maioria (mas não todas) as bactérias Gram-negativas é formado por um único tipo de subunidade. Em ambos os casos, várias cópias do componente E1 juntamente com várias cópias do componente E3 são montadas em torno de um núcleo E2 de 24 subunidades com simetria octaédrica ou 60 subunidades com simetria eicosaédrica (dependendo de qual complexo e espécie). Em E. coli, o componente E3 é compartilhado com os complexos de múltiplas enzimas de clivagem de piruvato desidrogenase e glicina. E1 e E2 diferem ligeiramente para os complexos de 2-oxoglutarato e piruvato desidrogenase e são designados (o) e (p) para distingui-los.
[00439] O OGDHC de E. coli contém 12 unidades do componente E1(o) 2-oxoglutarato descarboxilase, que requer tiamina codificada por sucA, 24 unidades do componente E2(o) di-hidrolipoiltransuccinilase codificado por sucB e 2 unidades do componente E3lipoamida desidrogenase codificado por lpd. As 24 unidades E2(o) formam o núcleo octaédrico do complexo. Elas contêm lipoilisina e sítios de ligação para dímeros das subunidades E1(o) e E3. Criotomografia de elétrons mostrou que elas são presas de forma flexível ao núcleo de E2.
[00440] Durante o ciclo de reação de OGDHC, o 2-oxoglutarato é ligado e descarboxilado por SucA, uma enzima contendo cofator tiamina-difosfato. A estrutura de cristal de uma forma apo truncada de SucA sem os 77 resíduos N-terminais foi determinada em resolução de 2,6 Â. A estrutura da forma holo com tiamina difosfato e Mg2+ foi determinada em resolução de 3,5 Â. A forma truncada reteve atividade de descarboxilase, mas não se reuniu com E2(o) em um complexo de OGDH. Os dados também sugeriram a presença de um sítio de ligação de AMP. Um radical livre de tiamina dependente de oxigênio foi demonstrado no OGDHC, o qual foi gerado por uma reação colateral com O2.
[00441] Estudos de SucA engenheirado preparado por mutagênese de saturação de His260 e His298 sugeriram que His260 é necessário para reconhecimento de substrato, mas His298 poderia ser substituído por resíduos hidrofóbicos de tamanho similar. Os dados também sugeriram que E2(o) tem um papel em especificidade.
[00442] O gene sucA foi clonado e sequenciado em trabalhos anteriores e regulagem de sucABCD foi estudada. Os genes sucAB e sucCD foram mostrados ser mutuamente essenciais, com qualquer par suficiente para produzir succinil-CoA, mas deleção simultânea de sucAB e sucCD não era viável.
[00443] α-cetoisovalerato descarboxilase catalisa a descarboxilação de 3-metil-2-oxobutanoato em isobutanal. A enzima é altamente específica para 3-metil-2-oxobutanoato, mas também mostra atividade com outros 2-ceto ácidos de cadeia ramificada (4-metil-2- oxopentanoato, 22,7% de atividade relativa; (S)-3-metil-2- oxopentanoato, 16,7%, 2-oxo-3-fenilpropanoato, 7,1% e 4-(metiltio)-2- oxobutanoato, 5,8%.
[00444] A enzima é um homotetrâmero, codificado pelo gene kivd, que foi sequenciado e clonado. A sequência de proteína deduzida compartilha 98,6% de identidade (em seus primeiros 438 aminoácidos) com uma proteína da cepa IL1403 de L. lactis, codificada pelo gene ipd (esse gene é interrompido na posição L439 pela inserção de um elemento IS983). O gene kivd não tem nenhuma homologia com qualquer gene(s) nos genomas sequenciados de MG1363 e SK11 das cepas L. lactis.
[00445] Um estudo da atividade de Kivd testando 156 cepas de bactérias de ácido láctico (Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc) indicou que apenas as cepas de L. lactis possuem a atividade, e mesmo dentro das cepas de lactococo, apenas 7 de 45 cepas tinham a atividade.
[00446] Uma proteína homóloga foi descrita a partir de B1157 da cepa de L. lactis cepa como uma cadeia ramificada de α-ceto ácido descarboxilase. Essa proteína mostra 89,8% de identidade com Kivd e também tem uma preferência por 2-ceto-isovalerato.
[00447] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 2- ceto ácido descarboxilase, uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase ou enzima tendo atividade de 2- oxoglutarato descarboxilase converte hidroxipiruvato em glicolaldeído. Em algumas modalidades, a enzima que converte hidroxipiruvato em glicolaldeído é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com Kivd ou SucA. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 2-ceto ácido descarboxilase é Kivd. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato descarboxilase é SucA.
[00448] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 2- oxoglutarato descarboxilase é sucA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 2-ceto ácido descarboxilase é Kivd ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2-ceto ácido descarboxilase, uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase ou enzima tendo atividade de 2- oxoglutarato descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 224 e 226. Em outra modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2-ceto ácido descarboxilase, uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase ou uma enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 223 e 225.
2-oxoglutarato redutase, 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase, 3- fosfoglicerato desidrogenase (EC 1.1.1.-)
[00449] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: (S)-2-hidroxiglutarato + NAD+ θ 2-oxoglutarato + NADH + H + 3-fosfo-D-glicerato + NAD+ θ 3-fosfo-hidroxipiruvato + NADH + H + (R)-2-hidroxiglutarato + NAD+ θ 2-oxoglutarato + NADH + H +
[00450] A 3-fosfoglicerato desidrogenase também pode ser conhecida como fosfoglicerato desidrogenase; PHGDH (nome do gene); D-3-fosfoglicerato: NAD+ oxidorredutase; alfa-fosfoglicerato desidrogenase; 3-fosfoglicérico ácido desidrogenase; D-3-fosfoglicerato desidrogenase; glicerato 3-fosfato desidrogenase; glicerato-1,3-fosfato desidrogenase; fosfoglicerato oxidorredutase; ácido fosfoglicérico desidrogenase; SerA; 3-fosfoglicerato: NAD+ 2-oxidorredutase; SerA 3PG desidrogenase; 3PHP redutase.
[00451] 3-Fosfoglicerato desidrogenase catalisa a primeira etapa comprometida na biossíntese de L-serina. A enzima é regulada por inibição de produto final alostérico que mostra cooperatividade. Inibição por serina age principalmente por meio da redução de velocidade catalítica e tem apenas um pequeno efeito sobre os Kms dos substratos; SerA é então classificado como uma enzima alostérica do tipo V.
[00452] A base para inibição alostérica e cooperativa por serina foi estudada extensivamente. Ocupação de dois dos quatro sítios de ligação de serina no homotetrâmero resulta em 85% de inibição da atividade. Ligação adicional da serina mostra cooperatividade negativa. Fosfato é capaz de reduzir os efeitos cooperativos sítio-para-sítio em ligação de serina; o efeito foi principalmente devido à presença de NADH intrinsecamente ligado. Uma mutação Trp139Gly resulta em uma enzima homodimérica que perdeu a cooperatividade em ligação de serina e inibição alostérica. A mutagênese direcionada a sítio de resíduos dentro do sítio de ligação efetora, a interface reguladora entre subunidades e uma região de dobra flexível dão suporte a um modelo em que o movimento de domínios adjacentes está envolvido na inibição da atividade de enzima. Análise cinética transitória mostrou que a cooperatividade de inibição de atividade catalítica resulta de uma mudança conformacional devido à ligação da serina. Uma enzima sem o domínio regulador não é mais inibida por serina, mas outros parâmetros cinéticos permanecem os mesmos. Tetrâmeros híbridos forneceram informações adicionais sobre o mecanismo de inibição alostérica.
[00453] Mutagênese sítio-dirigida permitiu a identificação de resíduos dentro do sítio ativo que contribuem para a ligação do substrato e catálise. Mutações na região de dobra entre o substrato e os domínios de ligação de nucleotídeos afetam o kcat da enzima; certas mutações desacoplam a ligação da serina e inibição catalítica.
[00454] Extensos estudos de mutagênese sítio-dirigida e estruturais contribuíram para uma visão detalhada das interações entre regulagem alostérica, cooperatividade e atividade catalítica. Uma visão mais aprofundada da via catalítica foi provida por análise cinética de fluxo interrompido, indicando que a etapa de limitação de taxa em ambas as direções catalíticas é uma mudança conformacional da enzima. Ligação de serina parece levar à formação de um complexo quaternário de extremidade nula entre a enzima, coenzima, substrato e efetor que elimina a mudança conformacional subsequente à ligação do substrato.
[00455] A enzima foi mostrada também ter uma atividade de α- cetoglutarato redutase, produzindo 2-hidroxiglutarato. Embora o papel metabólico dessa reação ainda não seja conhecido, é acreditado que ela possa desempenhar um papel em regulagem da biossíntese de serina e em reciclagem de NADH de volta para NAD+, especialmente durante a anaerobiose.
[00456] Estruturas de cristal da enzima do tipo selvagem e vários mutantes foram resolvidas. A estrutura mostrou que cada subunidade do homotetrâmero consiste em três domínios distintos, um domínio de ligação de nucleotídeo, um domínio de ligação de substrato e um domínio de ligação regulador/serina.
[00457] serA é essencial para crescimento em meio mínimo de glicerol; defeito de crescimento pode ser reparado pela adição de serina.
[00458] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase pode ser uma enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou uma enzima tendo atividade de 2- oxoglutarato redutase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou uma enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato redutase catalisa a conversão de glicerato 3-fosfato em 3-fosfo-hidroxipiruvato. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato redutase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com o serA. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou a enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato redutase é serA.
[00459] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase é serA ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato redutase compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 228. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase, uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato redutase ou enzima tendo atividade de 2-oxoglutarato redutase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 227.
3-fosfoserina aminotransferase, serina aminotransferase, L-serina transaminase (EC 2.6.1.52)
[00460] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: 3-fosfo-L-serina + 2-oxoglutarato θ L-glutamato + 3-fosfo- hidroxipiruvato (3R)-3-hidróxi-2-oxo-4 fosfono-oxibutanoato + L-glutamato θ 4-fosfo- hidróxi-L-treonina + 2-oxoglutarato 2-oxoglutarato + N-succinil-L, L-2,6-diaminopimelato θ L-glutamato + N-succinil-2-amino-6-cetopimelato
[00461] A 3-fosfoserina aminotransferase também pode ser conhecida como fosfoserina transaminase; PSAT; fosfoserina aminotransferase; fosfato hidroxipirúvico-transaminase glutâmico; L- fosfoserina aminotransferase; fosfo-hidroxipiruvato transaminase; fosfo- hidroxipirúvico-glutâmico transaminase; 3-O-fosfo-L-serina: 2- oxoglutarato aminotransferase; SerC; PdxC; 3PHP transaminase.
[00462] A enzima codificada por serC, fosfoserina/fosfo- hidroxitreonina aminotransferase, atua na biossíntese de ambas serina e piridoxina, mas usando substratos diferentes. Piridoxal 5'-fosfato é um cofator para ambas atividades enzimáticas, sugerindo que pode ele atuar de maneira autocatalítica, estimulando sua própria biossíntese.
[00463] A redundância e a promiscuidade entre as enzimas aminotransferases foram investigadas. Nenhuma atividade pôde ser observada com substratos não fosforilados; entretanto, o 3- hidroxipiruvato foi capaz de ser usado como substrato para um ensaio de atividade de enzima de SerC. Ainda, experimentos genéticos mostraram que SerC é uma alanina transaminase secundária.
[00464] As atividades normais de duas enzimas, ArgD e SerC, são suficientes para biossíntese de succinildiaminopimelato (SDAP) e lisina; uma terceira enzima, AstC, é suficiente para biossíntese de SDAP, mas sozinha não pode atender às necessidades celulares por lisina. Enzimas adicionais, incluindo GabT e PuuE, podem ser capazes de contribuir para a biossíntese de SDAP. A expressão de argD, astC, serC, aspC, gabT, hisC, ilvE, patA, puuE ou tyrB a partir de um plasmídeo permite crescimento do mutante triplo ΔargD serC astC em meio mínimo.
[00465] Estruturas de cristal da enzima na forma não ligada e em complexo com o análogo de substrato α-metil-L-glutamato foram resolvidas e um mecanismo de reação molecular foi proposto.
[00466] serC é essencial para crescimento em meio mínimo de glicerol; o defeito de crescimento pode ser reparado pela adição de serina e piridoxol/piridoxina.
[00467] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase pode ser enzima tendo atividade de L- serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase catalisam a conversão de L-serina em hidroxipiruvato. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, a enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou a enzima tendo atividade de serina aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com serC. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, a enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou a enzima tendo atividade de serina aminotransferase é serC.
[00468] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase é serC ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 230. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 229.
3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase
[00469] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 3-fosfo-hidroxipiruvato + H2O ^ hidroxipiruvato + fosfato
[00470] YeaB (NudL) pertence à família Nudix de hidrolases e foi prevista ter atividade de pirofosfoidrolase CoA.
[00471] yeaB (nudL) foi isolado como um supressor de múltiplas cópias da repressão de transcrição de flhDC em um mutante de pgsA. A supressão pode ser devido à redução de expressão de aS em células que superexpressam nudL.
[00472] yeaB (nudL) foi também isolado como um supressor de múltiplas cópias da auxotrofia PLP de uma cepa de deleção de pdxB. NudL foi verificado ser parte de uma via metabólica casual que produz um intermediário da via de biossíntese I de piridoxal 5'-fosfato, 4-fosfo- hidróxi-L-treonina, que se encontra a jusante de PdxB. A via 3-fosfo- hidroxipiruvato da biossíntese de serina. Com um Kcat de 5,7x10-5, NudL é um catalisador ineficiente da conversão de 3-fosfoidroxipiruvato em hidroxipiruvato, mas sua atividade parece ser suficiente para a produção de PLP.
[00473] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfo-hidroxipiruvato fosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com yeaB. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase é yeaB.
[00474] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfo-hidroxipiruvato fosfatase é yeaB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 232. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 231.
Fosfoserina fosfatase (EC 3.1.3.3)
[00475] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 3-fosfo-L-serina + H2O ^ L-serina + fosfato
[00476] Fosfoserina fosfatase catalisa a última etapa em biossíntese da serina. A enzima pertence à superfamília das hidrolases do tipo haloácido desalogenase (HAD). Os estudos enzimáticos foram originalmente realizados usando enzima parcialmente purificada de W da cepa de E. coli; ensaios da enzima purificada foram realizados como parte de uma investigação da superfamília de enzimas HAD.
[00477] serB é essencial para crescimento em meio mínimo de glicerol; o defeito de crescimento pode ser reparado pela adição de serina. Gph, HisB e YtjC foram identificados como supressores de multicópias do fenótipo ΔserB condicional. Experimentos de evolução direcionada identificaram mutações que aumentaram a adequação e a atividade de enzima desses supressores.
[00478] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com serB. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase é serB.
[00479] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase é serB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 234. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 233.
Serina-piruvato aminotransferase (EC 2.6.1.51)
[00480] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: piruvato + L-serina θ L-alanina + hidroxipiruvato glioxilato + L-alanina θ glicina + piruvato
[00481] A serina-piruvato aminotransferase também pode ser conhecida como alanina-glioxilato aminotransferase.
[00482] A serina--piruvato aminotransferase peroxissomal (AGXT1) e alanina-glioxilato aminotransferase 2 localizada mitocondrialmente (AGXT2) catalisam a conversão de glioxilato em glicina usando alanina como doador de amino. Ao contrário de AGXT2, AGXT1 não pode utilizar dimetilarginina assimétrica (ADMA) como um doador de amino.
[00483] Serina--piruvato aminotransferase peroxissomal é uma enzima específica do fígado dependente de piridoxal fosfato composta por um homodímero. Sua localização no peroxissomo é crucial para atividade de enzima adequada. Uma sequência de direcionamento peroxissomal (PTS1) no terminal C é necessária para a translocação em peroxissomos.
[00484] Disfunção ou direcionamento incorreto da serina--piruvato aminotransferase levando à ausência em peroxissomos hepáticos, faz com que o glioxilato escape para o citosol, onde ele é metabolizado mais em oxalato e glicolato. Oxalato não pode ser metabolizado mais em humanos e leva à formação de oxalato de cálcio insolúvel no rim e trato urinário. Mutações no gene AGXT1 levam a direcionamento peroxissomal impróprio e causam o distúrbio metabólico autossômico recessivo, hiperoxalúria primária tipo 1, que resulta em dano renal irreversível. Um terço dos pacientes com hiperoxalúria tipo 1 primária tem um defeito único de classificação de proteínas, no qual a enzima peroxissômica hepática é direcionada incorretamente para a mitocôndria.
[00485] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com AGXT1 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase é AGXT1 de Homo sapiens.
[00486] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase é AGXT1 ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 244. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo A atividade da serina-piruvato aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 243.
Serina descarboxilase (EC 4.1.1.65)
[00487] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: uma 3-O-sn-fosfatidil-L-serina + H + ^ uma L-1-fosfatidiletanolamina + CO2
[00488] Serina descarboxilase também pode ser conhecida como fosfatidilserina descarboxilase; PS descarboxilase; fosfatidil-L-serina carbóxi-liase.
[00489] Fosfatidilserina descarboxilase é uma de uma pequena classe de enzimas que usam um grupo prostético de piruvoil ligado covalentemente. O grupo piruvoil é pensado agir analogamente ao cofator de fosfato piridoxal, formando uma base de Schiff com o grupo amino do substrato e então servindo como reservatório de elétrons para facilitar a descarboxilação.
[00490] Quatro dessas enzimas, histidina descarboxilase (E.C. 4.1.1.22), fosfatidil-serina descarboxilase, aspartato 1-descarboxilase e S-adenosilmetionina descarboxilase são descarboxilases formando aminas biológicas importantes. Todas essas enzimas são conhecidas ter o grupo prostético piruvoil ligado por meio de uma ligação amida ao terminal amino da subunidade α. Duas outras enzimas nesse grupo são a D-prolina redutase e a glicina redutase (E.C. 1.21.4.2).
[00491] As enzimas contendo piruvoil são expressas como um zimogênio que é processado pós-traducionalmente por uma clivagem de automaturação chamada serinólise. Nesse processo, o grupo piruvoil é formado a partir de um resíduo de serina, dividindo a proteína precursora em duas partes que se tornam as subunidades α e β. Em alguns casos, subunidades adicionais podem estar envolvidas.
[00492] Essa enzima difere de outras descarboxilases dependentes de piruvoil compostas de subunidades não idênticas pelo fato do grupo prostético de piruvato estar associado à subunidade menor. A enzima é um multímero de número desconhecido do heterodímero.
[00493] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase catalisa a conversão de L-serina em etanolamina.
[00494] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina descarboxilase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SDC de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina descarboxilase é SDC de Arabidopsis thaliana.
[00495] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina descarboxilase é SDC ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 236. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 235.
Etanolamina oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.3.8), Etanolamina aminotransferase (EC 2.6.1.-)
[00496] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: etanolamina + oxigênio + H2O ^ amônio + peróxido de hidrogênio + glicolaldeído etanolamina + 2-oxoglutarato ^ glicolaldeído + L-glutamato
[00497] Etanolamina oxidorredutase (desaminação) também pode ser conhecida como etanolamina oxidase. Essa enzima pertence à família de oxidorredutases, especificamente aquelas que agem no grupo de doadores CH-NH2 com oxigênio como aceitador.
[00498] Em algumas modalidades, uma etanolamina oxidase ou uma etanolamina aminotransferase catalisa a conversão de etanolamina em glicolaldeído.
[00499] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina oxidase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com tynA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina oxidase é tynA de E. coli.
[00500] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina oxidase é tynA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina oxidase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 238. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima com etanolamina oxidase a atividade são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 237.
[00501] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com alaA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase é alaA de E. coli.
[00502] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase é alaA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 240. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 239.
Hidroxipiruvato redutase (EC 1.1.1.-)
[00503] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: D-glicerato + NAD (P) + θ hidroxipiruvato + NAD(P)H + H +
[00504] Hidroxipiruvato redutase também pode ser conhecida como beta-hidroxipiruvato redutase; NADH:hidroxipiruvato redutase; D- glicerato desidrogenase.
[00505] A hidroxipiruvato redutase é uma enzima encontrada em plantas superiores, algas, tecidos de mamíferos e bactérias. Na maioria dos casos, foi postulado converter hidroxipiruvato em glicerato. No entanto, a maioria das enzimas também conduz a redução de glioxilato em glicolato.
[00506] Nos metilotrofos de ciclo de serina, a hidroxipiruvato redutase desempenha um papel fundamental na assimilação do carbono. Ela atalisa a conversão de hidroxipiruvato em glicerato, uma etapa-chave do ciclo da serina, mas ela também desempenha um papel importante no metabolismo de compostos C2, ao interconverter glioxilato e glicolato.
[00507] Em algumas modalidades, hidroxipiruvato redutase catalisa a conversão de glicerato em hidroxipiruvato.
[00508] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ghrB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase é ghrB de E. coli.
[00509] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a hidroxipiruvato redutase é ghrB ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 242. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 241.
Glicerato descarboxilase
[00510] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-glicerato + H + ^ etilenoglicol + CO2
[00511] Em algumas modalidades, a glicerato descarboxilase catalisa a conversão de glicerato em etilenoglicol.
3-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.38) ou 2-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.20)
[00512] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 3-fosfo-D-glicerato + H2O ^ D-glicerato + fosfato 2-fosfo-D-glicerato + H2O ^ D-glicerato + fosfato
[00513] 3-fosfoglicerato fosfatase também pode ser conhecida como D-3-fosfoglicerato fosfatase; 3-PGA fosfatase. 2-fosfoglicerato fosfatase também pode ser conhecida como D-2-fosfoglicerato fosfatase; 2-PGA fosfatase. Essas enzimas pertencem à família de hidrolases, especificamente aquelas que agem nas ligações de monoéster fosfórico.
[00514] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato fosfatase ou a enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% identidade de sequência com phoA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase ou enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase é phoA de E. coli.
[00515] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato fosfatase ou enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase é phoA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase ou enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 246. Em uma modalidade adicional, a ou molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase ou enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 245.
Glicerato cinase (EC 2.7.1.31)
[00516] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: D-glicerato + ATP θ 3-fosfo-D-glicerato + ADP + H + D-glicerato + ATP θ 2-fosfo-D-glicerato + ADP + H +
[00517] Glicerato cinase também pode ser conhecida como glicerato 3-cinase; glicerato cinase (fosforilação) (ambíguo); D-glicerato 3-cinase; D-glicerato cinase (ambíguo); glicerato-cinase (ambíguo); GK (ambíguo); ácido D-glicérico cinase (ambíguo); ATP: (R)-glicerato 3- fosfotransferase.
[00518] Essa enzima pertence à família de transferases, especificamente aquelas que transferem grupos contendo fósforo (fosfotransferases) com um grupo álcool como aceitador. Essa enzima participa de 3 vias metabólicas: metabolismo de serina/glicina/treonina, metabolismo de glicerolipídeos e metabolismo de glioxilato- dicarboxilato.
[00519] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de glicerato cinase catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato. Em outras modalidades, uma enzima tendo atividade de glicerato cinase catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato.
[00520] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato cinase é uma glicerato 3-cinase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com GLYK de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a glicerato 3-cinase é GLYK de Arabidopsis thaliana.
[00521] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase é GLYK ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 248. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo a atividade de glicerato 3-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 247.
[00522] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato cinase é enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com glxK de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com garK de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase é glxK de E. coli. Em algumas modalidades, a glicerato 2-cinase é garK de E. coli.
[00523] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase é glxK ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase é garK ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 250 e 252. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 249 e 251.
Transferase que transfere grupo de um carbono (EC 2.1.2.-)
[00524] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: M-THF + H2O θ THF + formaldeído
[00525] Transferases tais como a hidroximetil-, formil- e transferases relacionadas podem ser usadas. Exemplos de hidroximetil-, formil- e transferases relacionadas incluem glicina hidroximetiltransferase, fosforribosilglicinamida formiltransferase, fosforribosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferase, glicina formimidoiltransferase, glutamato formiminotransferase, D-alanina-2 hidroximetiltransferase, desoxicitidilato 5-hidroximetiltransferase, metionil-tRNA formiltransferase, aminometiltransferase, 3-metil-2 - oxobutanoato hidroximetiltransferase e UDP-4-amino-4-desóxi-L- arabinose formiltransferase.
Serina hidroximetiltransferase (EC 2.1.2.1)
[00526] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: L-serina + tetraidrofolato (THF) θ Glicina + 5,10-metilenotetraidrofolato (M-THF)
[00527] Serina hidroximetiltransferase (GlyA) converte serina em glicina, transferindo um grupo metil para tetraidrofolato, dessa maneira formando 5,10-metileno-tetraidrofolato (M-THF). O M-THF é a principal fonte de unidades C1 na célula, tornando a GlyA uma enzima-chave na biossíntese de purinas, timidina, metionina, colina e lipídios.
[00528] A enzima também catalisa várias reações colaterais incluindo a hidrólise de 5,10-metenilTHF em 5-formilTHF e a clivagem reversível de 3-hidroxi aminoácidos (L-treonina, alotreonina, 3-fenil- serina) em glicina e um aldeído. D-alanina inativa a enzima ao reagir com o grupo prostético de piridoxal fosfato para formar fosfato de piridoxamina.
[00529] O resíduo Thr226 dentro de uma região conservada da enzima parece estar envolvido na discriminação de substrato. O resíduo His228 desempenha um papel na determinação da especificidade da reação. Lys229 não parece desempenhar um papel catalítico. Arg363 parece ser o sítio de ligação para o grupo carboxila do substrato de aminoácido. O grupo hidroxila de Tyr65 pode estar envolvido na conversão do sítio ativo de uma conformação fechada para uma aberta. Ambos Tyr55 e Arg235 são necessários para a reação de transaldiminação.
[00530] Estudos sobre redobra da enzima indicam que piridoxal 5'- fosfato (PLP) se liga apenas à apoenzima dimérica no final da via de dobra. O mecanismo de adição de PLP foi investigado mais. Em concentrações altas de PLP, uma segunda molécula de PLP pode se ligar a Lys346. Uma área de contato hidrofóbica conservada está envolvida em estabilidade do sítio de ligação PLP. Tyr55 é necessário para posicionamento correto do cofator PLP.
[00531] Estruturas de cristal da serina hidroximetiltransferase do tipo selvagem e mutante foram resolvidas.
[00532] Mutantes de glyA não podem usar glicina como a única fonte de nitrogênio. Um mutante de glyA é auxotrófico para glicina; glyA mais tarde foi mostrado ser essencial para o crescimento em meio mínimo de glicerol.
[00533] As sequências 3’ para o gene estrutural dentro do mRNA de glyA são necessárias para a estabilidade do mRNA.
[00534] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com glyA de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima com serina hidroximetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A825. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo serina hidroximetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947022.
Formaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.46 e EC 1.2.1.-)
[00535] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: formaldeído + NAD+ + H2O ^ formato + NADH + 2 H+
[00536] Formaldeído desidrogenase também pode ser conhecida como formaldeído desidrogenase ligada a NAD, formaldeído desidrogenase dependente de NAD ou formaldeído:NAD+ oxidorredutase.
[00537] A maioria dos formaldeídos desidrogenases encontrados em animais, plantas e bactérias pertence a um grupo chamado grupo álcool desidrogenase classe III e requer a adição de glutationa para atividade. Na verdade, o verdadeiro substrato para essas enzimas foi mostrado não ser o formaldeído, mas S-hidroximetilglutationa, que é formada não enzimaticamente a partir de formaldeído e glutationa.
[00538] Diferente dessas enzimas, a enzima isolada de Pseudomonas putida catalisa a oxidação irreversível de formaldeído em formato sem a adição de glutationa. Uma vez que seu substrato é formaldeído, em essência essa é a formaldeído desidrogenase "genuína". Como outro formaldeído desidrogenases, a FDH de P. putida é uma metaloenzima contendo zinco. Ela também requer NAD+ como o aceitador de elétrons. No entanto, diferente das enzimas que pertencem ao grupo do álcool desidrogenase classe III, ela é sensível a 4- metilpirazol. Em uma modalidade, a formaldeído desidrogenase é de Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, a formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com fdhA de P. putida. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um formaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada no GenBank Accession BAA04743.1. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma formaldeído desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada no GenBank Accession D21201.1.
[00539] No actinomiceto Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 industrialmente importante, evidência sugere que duas enzimas contribuem para a degradação do formaldeído tóxico, formaldeído desidrogenase dependente de micotiol codificado pelo gene fadH e, em menor extensão, acetaldeído desidrogenase codificada pelo gene ald (acetaldeído desidrogenase). Um mutante sem essas duas enzimas foi incapaz de crescer em meio contendo formaldeído. Ele também não cresceu em meio contendo vanilato porque a oxidação de vanilato produz formaldeído intracelular. Desintoxicação de formaldeído é necessária quando essa bactéria do solo encontra formaldeído em seu habitat ou quando o formaldeído é gerado durante metabolismo de compostos ambientais tal como o vanilato. O formato produzido por FadH pode ser oxidado mais em CO2 pelo formato desidrogenase codificado pelo gene fdhF.
[00540] Um mutante de ald mostrou uma redução em degradação de formaldeído de cerca de 30% comparado com o tipo selvagem. Inativação do gene ald cromossômico resultou em perda de atividade de acetaldeído desidrogenase e perda da capacidade desse organismo de crescer em ou utilizar etanol, sugerindo uma oxidação em duas etapas de etanol em acetato. Expressão de gene ald é dependente do regulador transcripcional RamA, enquanto RamB tem um efeito ligeiramente negativo sobre expressão. Em uma modalidade, a formaldeído desidrogenase é de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Em algumas modalidades, a formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% identidade de sequência com Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ald. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um formaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID Q8NLZ0. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um formaldeído desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostra em Gene ID 1020739.
[00541] Em algumas modalidades, a formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com alkH de Pseudomonas oleovorans.
[00542] Em Saccharomyces cerevisiae, dois genes repetidos em tandem ALD2 e ALD3 codificam duas isoformas de aldeído desidrogenase induzíveis por estresse citoplasmático. A expressão dessas isoformas é dependente dos fatores de transcrição de estresse geral Msn2 e Msn4, mas é independente da via da HOG MAP cinase. Ambas as formas podem usar o cofator NAD+ com muito mais eficiência que NADP+ e não são ativadas por nenhum cátion. Enquanto ALD3 é induzido por uma variedade de estresses, incluindo choque osmótico, choque térmico, exaustão de glicose, estresse oxidativo e drogas, ALD2 é apenas induzido por estresse osmótico e exaustão de glicose.
[00543] Em algumas modalidades, a formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com Saccharomyces cerevisiae ALD2. Em outras modalidades, a formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ALD3 de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um formaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P47771 e UniProt ID P54114. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma formaldeído desidrogenase são codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 855206 e Gene ID 855205.
[00544] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ALDH3A2 de Homo sapiens. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ALDH9A1 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P51648 e UniProt ID P49189. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do Gene ID 224 e Gene ID 223.
Formato desidrogenase (EC 1.2.1.-)
[00545] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: formato + um aceitador de elétrons oxidado + H + ^ CO2 + um aceitador de elétrons reduzido formato + H+ ^ CO2 + H2 (catalisado por complexo) formato + uma hidrogenase oxidada 3 ^ CO2 + uma hidrogenase reduzida 3
[00546] Formato desidrogenase-H é uma das três isoenzimas de formato desidrogenase associadas à membrana em E. coli. Todas são funcionais no metabolismo anaeróbico do organismo.
[00547] Formato desidrogenase-H (FDH-H) está localizada no citoplasma e junto com hidrogenase-3 FDH-H forma o complexo formato-hidrogeno liase. A enzima é sensível a oxigênio e contém selênio como selenocisteína incorporada cotranslacionalmente na posição de um códon de parada UGA no quadro de leitura aberto FdhF. Uma estrutura de cristal de FDH-H foi resolvida em resolução de 2,3 Â, confirmando a presença de um agrupamento [4Fe-4S], coordenação do cofator Mo por selenocisteína e a posição do sítio de ligação para o nitrato inibidor. A expressão de fdhF é induzida por formato e a ausência de aceitadores de elétrons externos, e é reprimida por nitrato, nitrito, N- óxido de trimetilamina e oxigênio. Formato pode superar repressão por nitrato, mas não por oxigênio. A inibição da DNA girase aumenta a expressão de fdhF.
[00548] fdnGHI codifica formato desidrogenase N ligada à membrana (FDH-N) - uma enzima respiratória que catalisa a oxidação de formato em dióxido de carbono, doando elétrons para o grupo de quinonas para a redução de substratos respiratórios anaeróbicos tais como nitrato e N- óxido de trimetilamina . FDH-N é um membro da família do complexo ferro-enxofre-molibdoenzima (CISM). A oxidação do formato por FDH- N é eletrogênica (H +/e- = 1); oxidação do formato no periplasma é acompanhada por redução de menaquinona na face citoplasmática da membrana interna. Expressão de formato desidrogenase-N é induzida por nitrato e anaerobiose, mediada por NarL e Fnr, respectivamente. FDH-N purificado contém três subunidades, chamadas α (FdnG), β (FdnH) e Y (FdnI). Uma estrutura de cristal, resolvida em 1,6 Â, indica que esse subcomplexo é ainda organizado em trímeros fisiologicamente relevantes com as subunidades α e β localizadas em direção à face periplasmática da membrana interna e as subunidades y localizadas em direção ao citoplasma. Os elétrons são transferidos do sítio de oxidação do formato na subunidade α através da membrana para o sítio de redução de menaquinona na subunidade y. Prótons são retirados do citoplasma no sítio de redução da menaquinona.
[00549] fdoGHI codifica formato desidrogenase O (FDH-O) - uma molibdoenzima respiratória que catalisa a oxidação do formato em dióxido de carbono, doando elétrons ao grupo de quinona solúvel na membrana para a redução de nitrato. FDH-O e nitrato redutase Z participam de uma via de transporte de elétrons de formato em nitrato que é ativa quando as células passam de condições aeróbicas para anaeróbicas. A via opera ou com menaquinona ou ubiquinona. FDH-O parece ser expresso constitutivamente; diferente da formato desidrogenase N (FDH-N), ele não é regulado por Fnr ou NarL. Expressão de FDH-O é aumentada em condições aeróbicas; sob condições anaeróbicas, nitrato estimula expressão ligeiramente; os reguladores globais H-NS e CRP podem desempenhar um papel em regulagem de expressão de FDH-O. FDH-O pode contribuir para a capacidade das células em adaptarem rapidamente à anaerobiose, enquanto os níveis de FDH-N ainda são insuficientes. FDH-O é um complexo heterotrimérico consistindo em uma subunidade α (FdoG), uma β (FdoH) e uma Y (FdoI) - ele compartilha extensa similaridade de sequência e propriedades imunológicas com o FDH-N expresso anaerobicamente.
[00550] Formato desidrogenase FDH1 de Candida boidinii é uma enzima dependente de NAD que faz a mediação da desintoxicação de formato e é fortemente inibida por Cu2+, Hg, p-cloromercuribenzoato, cianeto, azida, tiocianato e cianato. A inibição de cianeto é reversível e compete com formato. Expressão da proteína é induzida por metanol e reprimida por glicose. Uma vez que a reação enzimática catalisada por esse formato desidrogenase pode regenerar NADH, ela foi clonada em E. coli para otimizar NADH que requer vias engenheiradas.
[00551] No actinomiceto industrialmente importante Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, evidência sugere que um formato desidrogenase catalisa a oxidação de formato em CO2. Ambos formato e formaldeído tóxico estão presentes no ambiente e podem ser dissimilados por essa bactéria do solo por meio da oxidação de formaldeído em formato. Isso pode ser realizado por meio de FadH e Ald. Formato é então convertido em CO2 por FdhF. FdhF é um formato desidrogenase dependente de cofator de molibdênio que é ativa sob condições óxicas e foi especulada estar envolvida na resposta a estresse. O aceitador de elétrons exato usado por FdhF não foi definido. O gene fdhF é parte de um agrupamento de genes contendo genes relacionados fdhD e cg0617 que foram mostrados através de análise de mutante ser necessários para atividade do formato desidrogenase. O crescimento de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é inibido até certo ponto na presença de formato e cepas sem atividade de formato desidrogenase mostram inibição aumentada. Experimentos com radiotraçadores mostraram que quando Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi cultivado com glicose e formato de 13C, ele foi metabolizado em dióxido de carbono 13C. Um mutante de deleção de fdhF não pode metabolizar formato. Estudos de crescimento também demonstraram a necessidade de Mo2+. Análise da sequência de proteínas sugeriu que FdhF não é uma proteína de membrana integral, mas é provavelmente ou citosólica ou associada à membrana. Ortólogos putativos foram identificados em uma variedade de outras bactérias do solo.
[00552] Quando Cupriavidus oxalaticus é cultivado em formato como a principal fonte de carbono e energia, formato desidrogenase dependente de NAD+ é a enzima-chave que gera NADH e CO2. O último entra na reação de ribulose difosfato carboxilase. A enzima foi purificada até homogeneidade a partir de células culturadas com formato. A enzima é uma flavoproteína complexa contendo 2 FMN (mononucleotídeo de flavina), 18-25 átomos de ferro não heme e 15-20 sulfetos ácidos-lábeis. A atividade específica foi de 42 unidades/mg. A enzima é específica para seu formato de substrato natural, mas pode aceitar vários aceitadores de elétrons não fisiológicos, incluindo metilviologeno, metossulfato de fenazina, azul de metileno, sal de nitroazul de tetrazólio, FMN, FAD, riboflavina e oxigênio. Foi mostrado que a enzima também pode catalisar a reação na direção oposta. No entanto, sob as condições empregadas, a enzima catalisou a oxidação de formato cerca de 30 vezes mais rápido do que redução de CO2.
[00553] Formato desidrogenase dependente de NAD+ de Gottschalkia acidurici catalisa uma reação reversível. Enquanto ela catalisa a oxidação do formato em CO2, também catalisa a redução do último em formato, que é então convertido em acetato. A enzima foi parcialmente purificada e verificada ser um complexo enzimático grande (peso molecular de pelo menos 200 kDa) que é muito sensível a oxigênio e luz. A enzima contém uma L-selenocisteína. Preparações brutas da enzima puderam ser acopladas à redução de NAD durante oxidação de formato por meio da ferredoxina. Quando o aceitador de elétrons artificial metil viologen foi usado ao invés de NAD, ferredoxina não foi necessária. Cianeto inibiu a enzima em 90%. Atividade de oxidação de formato basal em extratos celulares foi 0,85 μmol/min/mg de proteína, mas aumentou 12 vezes com a adição de tungstato e selenita. Interessantemente, a enzima do organismo relacionado Clostridium cylindrosporum, embora tendo uma necessidade similar de selenita, requer molibdato ao invés de tungstato, o que tem um efeito antagônico sobre ela.
[00554] A formato desidrogenase dependente de NAD+ contendo tungstênio de Methylobacterium extorquens é um heterodímero contendo aglomerados de ferro-enxofre, FMN e tungstênio. É um tanto incomum encontrar uma enzima contendo tungstênio em bactérias aeróbicas, embora vários outros exemplos tenham sido encontrados. A subunidade β menor parece ser uma proteína de fusão, com seu domínio N-terminal relacionado a subunidades similares a NueE, e seu domínio C-terminal relacionado a subunidades similares a NuoF de NADH-ubiquinona oxidorredutases conhecidas.
[00555] Duas formas diferentes de formato desidrogenase FDH foram purificadas a partir de Methylosinus trichosporium OB3b independentemente por dois grupos, e as duas proteínas foram verificadas ter propriedades diferentes. Essa proteína é composta de dois tipos de subunidades em um arranjo α2β2 aparente, com tamanho total de 315 kDa. Ela contém ferro não heme e sulfeto, e nenhum outro metal, e parece requerer FMN.
[00556] A formato desidrogenase dependente de NAD+ fdh de Moraxella sp. é uma proteína dimérica relativamente simples, sem grupos prostéticos.
[00557] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de formato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma formato desidrogenase selecionada do grupo consistindo em fdhF de E. coli (chlF, FDH-H), FDH-N de E. coli, FDH-O de E. coli, FDH1 de Candida boidinii, fdhF de Corynebacterium glutamicum, formato desidrogenase dependente de NAD+ de Cupriavidus oxalaticus, formato desidrogenase dependente de NAD+ de Gottschalkia acidurici, Fdh1 Methylobacterium extorquens, formato desidrogenase de Methylosinus trichosporium e formato desidrogenase dependente de NAD+ fdh de Moraxella sp. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de formato desidrogenase ou formato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P07658, UniProt ID P0AEK7, UniProt ID P0AAJ3, UniProt ID P24183, UniProt ID P32176, UniProt ID P0AAJ5, UniProt ID P0AEL0, UniProt ID O13437, UniProt ID Q8NSY6, UniProt ID Q8KTI7, UniProt ID Q8KTI8 e UniProt ID O08375. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um formato desidrogenase ou subunidade de formato desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 948584, Gene ID 946038, Gene ID 948794, Gene ID 946035, Gene ID 948394, Gene ID 948395, Gene ID 948383, acesso GenBank AJ011046.2, Gene ID 1021531, acesso GenBank AF489516 e acesso GenBank Y13245.1.
Sistema de clivagem de glicina
[00558] O sistema de clivagem de glicina é composto de quatro proteínas: três enzimas e uma proteína carreadora. Em animais, o sistema está fracamente ligado à membrana mitocondrial interna. As enzimas são i) proteína P (uma proteína contendo piridoxal fosfato) ou glicina desidrogenase (descarboxilação) (EC1.4.4.2), ii) proteína T ou aminometil-transferase (EC2.1.2.10) e iii) L-proteína ou di- hidrolipoamida desidrogenase (EC1.8.1.4). A proteína carreadora é chamada de proteína H (uma proteína que contém ácido lipoico).
[00559] A reação de clivagem da glicina catalisa a reação reversível que segue: Glicina + THF + NAD+ θ M-THF + CO2 + NH3 + NADH + H+
[00560] O sistema é dividido em três reações parciais. A reação é completamente reversível e, ambos na clivagem da glicina e na síntese de glicina uma fração de aminometila ligada ao ácido lipoico de proteína H representam um intermediário que é subsequentemente degradado em, ou pode ser formado a partir de, metileno-tetraidrofolato (M-THF) e amônia pela ação da proteína T. Possivelmente, a reação pode envolver um complexo ternário de proteína P, porção aminometila de glicina e proteína H, como um estado intermediário crucial. Reação catalisada pela proteína P
[00561] A primeira reação parcial da degradação da glicina é a descarboxilação catalisada por proteína P (uma glicina descarboxilase). A proteína H serve como um co-substrato. Uma das propriedades mais características da reação de clivagem da glicina é que, embora a proteína P deva pertencer a uma classe de descarboxilases de aminoácidos dependentes de piridoxal fosfato, a proteína P requer proteína H para catalisar a descarboxilação de glicina significantemente. A reação prossegue por meio de um mecanismo aleatório sequencial onde o carbono carboxílico da glicina é convertido em dióxido de carbono. O remanescente da molécula de glicina é transferido para um dos grupos sulfidrila formados pela clivagem redutiva do dissulfeto em lipoato ligado à proteína H.
[00562] A proteína P, uma proteína contendo piridoxal fosfato de cerca de 200 kDa, é ou um homodímero ou um dímero de heterodímeros. O primeiro tem uma molécula de piridoxal fosfato por subunidade, e o último tem uma molécula do cofator por dímero na subunidade β. O cofator piridoxal é ligado a um resíduo de lisina específico. O cofator piridoxal interage com a bolsa do sítio ativo não covalentemente. O sítio ativo da proteína P de T. thermophilus está conectado à superfície molecular por um canal com uma entrada ampla voltada para o solvente. A superfície molecular ao redor do canal é composta de vários resíduos de aminoácidos carregados positivamente, que estão possivelmente envolvidos na formação do complexo com proteína H.
[00563] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicina descarboxilase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvP de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicina descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P33195. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicina descarboxilase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947394. Reação catalisada pela proteína T
[00564] A porção descarboxilada de glicina ligada à proteína H é submetida à degradação adicional catalisada por proteína T (uma aminometiltransferase). A reação requer THF e produz amônia, M-THF e proteína H com lipoato reduzido. Na ausência de THF, formaldeído é produzido em vez de M-THF, mas a taxa de reação é menos de 0,05% daquela medida na presença de THF. Na reação reversa, proteína T catalisa a formação do intermediário aminometil lipoato ligado à proteína H a partir de M-THF, amônia e proteína H com lipoato reduzido por meio de um mecanismo Ter Bi ordenado, em que proteína H é o primeiro substrato a se ligar seguido por M-THF e amônia. A ordem de liberação do produto é THF e a proteína H carregada com metilamina.
[00565] A proteína T é um monômero de cerca de 40 kDa e forma um complexo 1:1 com a proteína H. Um estudo de reticulação empregando proteínas de E. coli revelou que a interação de proteína H com proteína T causa uma mudança conformacional da proteína T. Foi verificado contato intermolecular entre Lys-288 de proteína T e Asp-43 de proteína H. A região N-terminal de proteína T é essencial para a interação com a proteína H e para manter a proteína T em uma forma compacta. A estrutura de cristal da proteína T humana foi analisada em uma forma livre e ligada a N5-metil-tetra-hidrofolato, um análogo de M- THF. A estrutura geral consiste em três estruturas em forma de folha de trevo com a cavidade central onde o cofator THF é ligado com o anel de pteridina profundamente enterrado na bolsa hidrofóbica e o grupo glutamila apontado para a superfície lateral C-terminal. A estrutura lembra aquelas da proteína T bacteriana de OT3 de Termotoga naritima, E. coli e Pyrococcus horikoshii. Análises estruturais e mutacionais de proteína T humana indicaram que o Asp-101 invariante pode desempenhar um papel chave na iniciação de catálise ao aumentar o caráter nucleofílico do átomo N10 do substrato de folato.
[00566] Resíduos envolvidos em ligação de folato foram identificados através de reticulação e mutagênese sítio-dirigida. A região N-terminal de GvcT é importante para a conformação adequada de GvcT, permitindo interação com a proteína H.
[00567] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de aminometiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvT de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de aminometiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P27248. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de aminometiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947390.
Reação catalisada por proteína L
[00568] A última etapa da reação de clivagem de glicina é a reoxidação do lipoato reduzido ligado à proteína H catalisada por proteína L. A proteína L é bem conhecida como di-hidrolipoamida desidrogenase, lipoamida desidrogenase, di-hidrolipoil desidrogenase ou proteína E3 componente de complexos de múltiplas enzimas de 2- oxoácido (piruvato, 2-oxoglutarato e 2-oxoácido de cadeia ramificada) desidrogenase. Ela catalisa a transferência de elétrons para o aceitador final, o NAD.
[00569] Experimentos empregando proteína L e proteína H de ervilha mostraram que a oxidação de proteína H di-hidrolipoil não foi afetada pela presença de análogos estruturalmente relacionados tal como proteína apoH ou proteína H octanoilada. A interação estrutural entre proteína L e proteína H pode não ser essencial para a reação de oxidação.
[00570] Cinética da reação foi estudada e sugere um mecanismo de ping-pong modificado. Mutagênese sítio-dirigida foi usada para identificar e caracterizar o dissulfeto redox ativo e um resíduo carregado influenciando o potencial redox do cofator FAD. A inserção do cofator FAD é essencial para dimerização e atividade integral.
[00571] Um mutante com lpd nulo produz mais piruvato e L- glutamato sob condições aeróbicas. Análise de fluxo metabólico mostra que a via I de Entner-Doudoroff e a derivação de glioxilato estão ativados. Outra atividade de di-hidrolipoato desidrogenase foi detectada em mutantes de lpd de E. coli; então, uma isozima pode existir.
[00572] Uma mutação no gene lpd em E. coli faz com que o complexo piruvato desidrogenase seja menos sensível à inibição de NADH e ativo durante o crescimento anaeróbico. Substituições de aminoácidos em Glu354 que diminuíram a sensibilidade da enzima à inibição de NADH foram propostas atuar restringindo o movimento de NADH.
[00573] Mutações supressoras em lpd foram mostradas restaurar o crescimento para um mutante com defeito redox que carece de ambas vias de redução da tiorredoxina e da glutationa/glutarredoxina. As mutações supressoras reduziram atividade do Lpd resultando no acúmulo de di-hidrolipoamida, que poderia então servir como um doador de elétrons por meio da redução das glutarredoxinas. A reoxidação do Lpd restaurou a função dr ciclo dr TCA.
[00574] lpd mostra adaptação de códon diferencial, resultando em assinaturas de eficiência de tradução diferencial, em aerotolerante comparado com micróbios anaeróbicos obrigatórios. Ele foi então previsto desempenhar um papel na resposta a estresse oxidativo. Um mutante de deleção de lpd mostrou ser mais sensível do que o tipo selvagem especificamente à exposição a peróxido de hidrogênio, mas não a outros estresses.
[00575] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de di- hidrolipoamida desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com E. coli lpd (lpdA, subunidade E3). Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de di-hidrolipoamida desidrogenase compreende uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A9P0. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de di-hidrolipoamida desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 944854.
Proteína H
[00576] A proteína H é uma proteína monomérica e estável ao calor de cerca de 14 kDa. A proteína H do vertebrado é composta por 125 resíduos de aminoácidos e ácido lipoico é covalentemente ligado a Lys- 59. A estrutura de cristal de raios X da proteína H da folha de ervilha lipoilada (131 resíduos) revelou que a lipoil-lisina estava localizada na superfície da proteína. Como mencionado acima, o braço da lipoilisina na proteína H transporta o intermediário da reação e os equivalentes de redução entre os sítios ativos dos componentes do sistema de clivagem da glicina. O mecanismo é análogo àquele encontrado nos complexos 2-oxoácido desidrogenase.
[00577] Lipoilação de proteína H bem como de componentes da aciltransferase (E2) de complexos 2-oxoácido desidrogenase é catalisada pela lipoato-proteína ligase A (LplA) em E. coli. A enzima catalisa a formação de lipoil-AMP a partir de lipoato e ATP e a transferência da porção lipoil de lipoil-AMP para a proteína H e componentes E2. O estudo cristalográfico de raios X mostrou que LplA consiste em um domínio N-terminal grande e um domínio C-terminal pequeno com uma bolsa de ligação a substrato na interface entre os dois domínios.
[00578] Em mamíferos, lipoilação é um evento intramitocondrial. Ácido lipoico é primeiro ativado em lipoil-GMP pela enzima ativadora de lipoato, empregando GTP como um composto de alta energia. A enzima ativadora do lipoato é a mesma proteína já conhecida como ácido graxo de cadeia média que metaboliza xenobióticos: CoA ligase-III. Lipoato é então transferido de lipoil-GMP para as apoproteínas pela ação da lipoiltransferase.
[00579] A proteína H, codificada pelo gene gcvH em E. coli, é uma lipoilproteína que é reduzida conforme ela transporta o grupo metilamina de glicina da proteína P para a proteína T e é reoxidada pela di- hidrolipoamida desidrogenase. GcvH funciona como um substrato para as três enzimas do complexo gcv.
[00580] Os resíduos 61-65 são previstos conter a modificação de lipoil (em lisina), com base na conservação desses resíduos e sua correspondência com o sítio de fixação do lipoato da proteína Pisum sativum.
[00581] A interação entre GcvH e GcvT foi examinada. Interação entre as duas proteínas pode ser necessária para formar o sítio de ligação de folato, no qual a região de poliglutamil folato se liga, expondo o anel de pteridina. O terminal N de GcvT é importante para interação com GcvH, provavelmente através da mediação de uma mudança conformacional, e o resíduo D43 de GcvH é proximal a GcvT no complexo GcvH-GcvT.
[00582] Em algumas modalidades, a proteína H é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvH de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína H compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A6T9. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína H são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947393.
Glicolato desidrogenase ou glicolato oxidase (EC 1.1.99.14)
[00583] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: glicolato + um aceitador de elétrons oxidado ^ glioxilato + um aceitador de elétrons reduzido
[00584] Glicolato desidrogenase também pode ser conhecida como glicolato oxidase, glicolato oxidorredutase e glicolato: (aceitador) 2- oxidorredutase.
[00585] Glicolato oxidase catalisa a primeira etapa na utilização de glicolato como única fonte de carbono. A enzima pode estar associada à membrana. Uma atividade de glicolato oxidorredutase associada à membrana citoplasmática de E. coli ATCC11775 (sorovar O1:K1:H7) foi isolada, e a própria subunidade GlcF só pôde ser detectada na fração de membrana. O aceitador de elétrons fisiológico é desconhecido. Extratos brutos de uma cepa de E. coli expressando glcDEF a partir de um plasmídeo de múltiplas cópias contêm atividade de glicolato oxidase. Mutantes de inserção em glcD, glcE ou glcF abolem essa atividade, sugerindo que todos os três produtos de gene são subunidades de um complexo de glicolato oxidase. Expressão do operon glcDEFGB é induzida por crescimento em glicolato.
[00586] Uma glicolato oxidase putativa em Arabidopsis thaliana é uma proteína mitocondrial homodimérica que se liga a um FAD por monômero e é expressa em folhas, caules, flores e raízes. A atividade de enzima é inibida por íons cianeto. Ela catalisa a oxidação de D- lactato em piruvato estereoespecificamente, mediando a desintoxicação de metilglioxal e D-lactato.
[00587] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com enzima tendo atividade de glicolato desidrogenase selecionada de GLC glicolato desidrogenase de E. coli e glicolato desidrogenase de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de glicolato desidrogenase ou glicolato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P0AEP9, UniProt ID P52073, UniProt ID P52074 e UniProt ID Q94AX4. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de glicolato desidrogenase ou glicolato desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 947353, Gene ID 2847718, Gene ID 2847717 e acesso GenBank Y13245.1.
Alanina-glioxilato aminotransferase (EC 2.6.1.44)
[00588] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: glioxilato + L-alanina θ glicina + piruvato
[00589] Em Saccharomyces cerevisiae, a subunidade de alanina-- glioxilato aminotransferase é uma de três enzimas diferentes usadas para síntese de glicina. O gene AGX1, codificando essa enzima, foi identificado pela comparação das atividades específicas da enzima em cepas inativadas. Quando posto em uma base deficiente para as outras enzimas responsáveis pela síntese de glicina, a mutação em AGX1 produziu auxotrofia de glicina completa. As enzimas foram subsequentemente purificadas e caracterizadas. A enzima, que contém piridoxal 5'-fosfato como cofator, é um homodímero de cerca de 80 kDa e é altamente específica para L-alanina e glioxilato.
[00590] Ambas a alanina--glioxilato aminotransferase 2 (AGXT2) de Homo sapiens localizada na mitocôndria e serina--piruvato aminotransferase peroxisomal (AGXT1, vide acima) catalisam a conversão de glioxilato em glicina usando alanina como doador de amino. No entanto, AGXT2, mas não AGXT1, também pode utilizar dimetilarginina assimétrica (ADMA) como um doador de amino, levando à formação de ácido α-ceto-δ- (NN-dimetilguanidino) valérico (DMGV). ADMA é um inibidor endógeno potente da óxido nítrico (NO) sintase. Os níveis de ADMA também são controlados por dimetilarginina dimetilaminoidrolases (DDAHs) citosólica que hidrolisam ADMA em citrulina e dimetilamina. Níveis elevados de ADMA estão associados a diabetes, hipertensão, insuficiência cardíaca congestiva e aterosclerose. AGXT2 é uma enzima dependente de piridoxal fosfato que é expressa principalmente no rim, e sua atividade é um mecanismo através do qual o rim regula a pressão sanguínea.
[00591] Em Arabidopsis thaliana, alanina transaminases com quatro atividades de aminotransferase foram identificadas. AOAT1 (GGAT1) está localizado peroxissomal. Plantas inativadas têm atividade reduzida de AOAT, GPAT (glutamato:piruvato aminotransferase), AGAT (alanina:glioxilato aminotransferase) e GGAT (glutamato:glioxilato aminotransferase). As atividades de GGAT e AGAT foram reduzidas de forma mais drástica. Esses indicam que AOAT1 está principalmente envolvido na fotorrespiração. Similarmente, AOAT2 (GGAT2), que é previsto estar localizado no peroxissoma, está provavelmente envolvido na fotorrespiração. Ensaio in vitro das proteínas recombinantes indicou que GGAT1 e GGAT2 têm quatro atividades de aminotransferase, a saber GGAT, AGAT, GPAT e AOAT. As duas proteínas recombinantes exibiram valores de Km muito similares em relação aos substratos de aminoácidos glutamato e alanina, bem como aos substratos oxoácidos glioxilato, piruvato e 2-oxoglutarato.
[00592] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase selecionada de AGX1 de Saccharomyces cerevisiae, AGXT2 de Homo sapiens, AOAT1 de Arabidopsis thaliana e AOAT2 de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P43567, UniProt ID Q9BYV1, UniProt ID Q9LR30 e UniProt ID Q9S7E9. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 850514, Gene ID 64902, acesso TAIR AT1G23310 e acesso TAIR AT1G70580.
Alanina transaminase (EC 2.6.1.2)
[00593] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 2-oxoglutarato + L-alanina θ L-glutamato + piruvato
[00594] Em algumas modalidades, a alanina transaminase é uma glutamato-piruvato aminotransferase. AlaA é uma das três principais transaminases que sintetizam alanina em E. coli. AlaA e AlaC juntas são responsáveis por 90% da atividade da transaminase glutâmico-pirúvica (GPT) na célula. Uma estrutura de cristal de AlaA foi resolvida em resolução de 2,11 Â. A estrutura mostra um homodímero α2 simétrico típico de aminotransferases do tipo I dobradas. Uma cepa de deleção alaA não tem nenhum defeito de crescimento, mas um mutante duplo alaA avtA forma pequenas colônias em placas de ágar. Um mutante triplo alaA avtA alaC tem um fenótipo de crescimento lento em meio líquido. Os defeitos dos mutantes duplos e triplos podem ser auxiliados pela adição de alanina. Experimentos de adequação e crescimento competitivo foram realizados sob condições de crescimento diferentes. Particularmente sob condições limitantes de oxigênio, o tempo de duplicação da cepa ΔalaA em meios mínimos é aumentado comparado com crescimento em meios rico. Sob condições de crescimento competitivo, a mutação ΔalaA confere uma desvantagem comparado com tipo selvagem mesmo em meios ricos. alaA foi identificada em uma triagem de genes que reduzem os efeitos letais do estresse. Um mutante de inserção alaA é mais sensível do que o tipo selvagem à mitomicina C e outros estresses e menos sensível a SDS10%. O gene alaA foi primeiro identificado como um mutante com necessidade de alanina ou valina.
[00595] AlaB é uma de três principais transaminases de síntese de alanina em E. coli. AlaB catalisa uma reação glutamato-piruvato aminotransferase, gerando alanina a partir de piruvato com glutamato como doador de amino. Essa atividade foi testada em extratos celulares brutos, e o gene que codifica AlaB foi isolado em um plasmídeo. Expressão de alaB a partir de um plasmídeo de múltiplas cópias suprime parcialmente o defeito de crescimento de uma cepa mutante ilvE alaA.
[00596] AlaC é uma das três principais transaminases de síntese de alanina em E. coli. Um modelo de homologia da enzima com base na estrutura de cristal de AlaA foi gerado. Uma cepa de deleção alaC não tem nenhum defeito de crescimento, mas um mutante triplo alaA avtA alaC tem um fenótipo de crescimento lento em meio líquido. O defeito pode ser reparado pela adição de alanina. Experimentos de adequação e crescimento competitivo foram realizados em condições de crescimento diferentes. Particularmente sob condições limitantes de oxigênio, o tempo de duplicação da cepa ΔalaC em meios mínimos é aumentado comparado com crescimento em meios ricos; ao contrário dos mutantes alaA e avtA, adição de L-alanina retorna o tempo de duplicação ao observado no meio DMEM. Sob condições de crescimento competitivo, a mutação ΔalaC confere uma desvantagem comparado com o tipo selvagem mesmo em meios ricos. Expressão de alaC é ativada pelo regulador transcripcional SgrR. AlaC pode então desempenhar um papel em estresse de glicose-fosfato. No entanto, um mutante de deleção de alaC não mostra sensibilidade alterada a α- metilglucosídeo, que induz estresse açúcar-fosfato.
[00597] Em Homo sapiens, alanina aminotransferase é uma enzima citoplasmática que catalisa a transaminação reversível entre L-alanina e 2-oxoglutarato para formar piruvato e L-glutamato. A interconversão desses quatro principais intermediários metabólicos confere a essa enzima ambos papéis de degradação e biossintéticos. Ela participa do ciclo de alanina-glicose de músculo esquelético e fígado, gliconeogênese e geração de glutamato no cérebro. Alanina aminotransferase é expressa em rim, músculo esqueletal, tecido adiposo e coração. Existem duas isoformas da enzima: alanina aminotransferase 1 (GPT) e alanina aminotransferase 2 (GPT2). A alanina aminotransferase 1 humana (GPT) foi purificada do fígado. Alanina aminotransferase 2 humana recombinante (GPT2) de tecido adiposo foi expressa em Escherichia coli e a massa molecular foi determinada através de SDS-PAGE. A enzima é expressa em níveis altos em tecido adiposo, músculos, cérebro e rins e em níveis mais baixos em mama e fígado.
[00598] A estrutura de subunidade de uma alanina transaminase do anelídeo poliqueta marinho Arenicola marina (lagarta) não foi relatada. Ela tem uma massa molecular aparente nativa de 91 kDa conforme determinado através de cromatografia de filtragem em gel. O gene que a codifica nesse organismo não foi identificado. Em anelídeos e moluscos marinhos, essa reação participa de uma via de geração de energia anaeróbica que opera durante períodos de hipóxia ou anóxia. Alanina transaminase (glutamato piruvato transaminase) desse organismo foi parcialmente purificada do músculo da parede corporal e caracterizada. Atividade da alanina transaminase alta foi encontrada nesse tecido. Atividades de L-alanina transaminase e L-aspartato transaminase dependentes de L-glutamato, reversíveis, específicas, foram também demonstradas em tecidos do mexilhão Mytilus edulis.
[00599] A proteína TAA1 de triptofano aminotransferase de Arabidopsis thaliana está envolvida na formação de indol-3-piruvato, um precursor de indol-3-acetato (IAA), uma auxina biologicamente importante que atua como um fito-hormônio em muitas espécies de plantas. Ensaios in vitro revelam que essa aminotransferase dependente de piridoxal 5'-fosfato (PLP) pode atuar em uma série de L- aminoácidos diferentes, incluindo L-fenilalanina, L-tirosina, L-leucina, L- alanina, L-metionina e L-glutamina usando ou piruvato ou 2- oxoglutarato como um cossubstrato. No entanto, ensaios enzimáticos, experimentos de ancoragem in silico e análises fenotípicas mutantes sugerem que L-triptofano é o substrato in vivo para essa enzima. TAA1 tem um Km de 0,29 mM e um Vmax de 12,9 μM/min quando testado com L-triptofano e piruvato. Não está claro se o piruvato ou 2- oxoglutarato é o cossubstrato biologicamente mais relevante para essa enzima.
[00600] O gene codificando essa proteína foi identificado em triagens para mutantes de evitação de sombra e mutantes com uma insensibilidade a etileno fraca, sugerindo que a auxina sintetizada através de uma via mediada por TAA1 é particularmente importante para as respostas a estímulos ambientais e hormonais específicos. Ainda, processos de desenvolvimento normais, tal como embriogênese, que requerem níveis de auxina apropriados, são interrompidos quando TAA1 e um ou mais de seus membros da família intimamente relacionados (isto é, TAR1 e TAR2) são inativados em plantas de Arabidopsis. A atividade dessa enzima parece estar amplamente distribuída no reino vegetal, com base na capacidade de extratos enzimáticos de 30 espécies diferentes distribuídas em 16 famílias de catalisar a formação de IPA em uma reação de transaminase. Três espécies de algas também têm essa atividade.
[00601] Em Arabidopsis thaliana, alanina transaminases com quatro atividades de aminotransferase foram identificadas. AOAT1 (GGAT1) é localizado peroxissomal. Plantas com inativação têm atividade reduzida de AOAT, GPAT (glutamato:piruvato aminotransferase), AGAT (alanina:glioxilato aminotransferase) e GGAT (glutamato:glioxilato aminotransferase). As atividades GGAT e AGAT foram reduzidas de forma mais drástica. Essas indicam que AOAT1 está principalmente envolvido em fotorrespiração. Similarmente, AOAT2 (GGAT2), que é previsto estar localizado no peroxissoma, está provavelmente envolvido em fotorrespiração. Ensaio in vitro das proteínas recombinantes indicou que GGAT1 e GGAT2 têm quatro atividades de aminotransferase, a saber GGAT, AGAT, GPAT e AOAT. As duas proteínas recombinantes exibiram valores de Km muito similares em relação aos substratos de aminoácidos glutamato e alanina, assim como aos substratos de oxoácidos glioxilato, piruvato e 2-oxoglutarato.
[00602] Atividades de alanina aminotransferase também foram descritas de Candida maltosa, Clostridium propionicum, Pyrococcus furiosus, Megathyrsus maximus e Panicum miliaceum. A alanina aminotransferase putativa de Panicum miliaceum foi clonada a partir dessa planta NAD-ME tipo C4 e verificada expressar em ambas células do mesófilo e da bainha do feixe, e a expressão do gene era induzível pela luz. O acúmulo de mRNA aumentou dramaticamente durante o esverdeamento em ambos os tipos de células, o que está de acordo com seu papel previsto na fotossíntese de C4.
[00603] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina transaminase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina transaminase selecionada de glutamato-piruvato aminotransferase de E. coli alaA, glutamato-piruvato aminotransferase de E. coli alaB, glutamato-piruvato aminotransferase de E. coli alaC, alanina aminotransferase 1 (GPT) de Homo sapiens, alanina aminotransferase 2 de Homo sapiens, alanina transaminase de Arenicola marina, triptofano aminotransferase TAA1 de Arabidopsis thaliana, AOAT1 de Arabidopsis thaliana, AOAT2 de Arabidopsis thaliana, alanina aminotransferase de Candida maltosa, alanina aminotransferase de Clostridium propionicum, alanina aminotransferase aat de Pyrococcus furiosus, alanina transaminase de Megathyrsus maximus e alanina transaminase AlaAT-2 de Panicum miliaceum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando enzima tendo atividade de alanina transaminase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P0A959, UniProt ID P77434, UniProt ID P24298, UniProt ID Q8TD30, UniProt ID Q9S7N2, UniProt ID Q9LR30, UniProt ID Q9S7E9, UniProt ID Q9P9M8 e UniProt ID P34106. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando enzima tendo atividade de alanina transaminase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 946772, Gene ID 946850, Gene ID 2875, Gene ID 84706, Gene ID 843393, acesso TAIR AT1G23310, acesso TAIR AT1G70580, acesso GenBank AF163769.1 e acesso GenBank X69421.1.
Glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2 e EC 1.4.1.3)
[00604] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar as reações que seguem: L-glutamato + NAD+ + H2O θ 2-oxoglutarato + amônio + NADH + H+ L-glutamato + NAD (P) + + H2O θ 2-oxoglutarato + amônio + NAD(P)H+ H +
[00605] Em algumas modalidades, a glutamato desidrogenase é uma glutamato desidrogenase dependente de NAD de Saccharomyces cerevisiae (GDH2) que degrada o glutamato em amônia e alfa- cetoglutarato. Expressão de GDH2 é sensível à repressão de catabólito de nitrogênio e aos níveis de amônia intracelulares.
[00606] Existem dois genes de glutamato desidrogenase (GDH) dependentes de NAD em Arabidopsis, GDH1 e GDH2, codificando as subunidades alfa e beta, respectivamente. Sete isoformas hexaméricas de GDH foram detectadas, as quais são compostas de razões diferentes das subunidades alfa e beta. Isoformas diferentes são distribuídas em tecidos diferentes sob condições ambientais e fisiológicas diferentes. A atividade de enzima de GDH é controlada em parte no nível transcripcional.
[00607] Glutamato desidrogenase de Peptoniphilus asaccharolyticus catalisa a desaminação oxidativa de L-glutamato em 2-oxoglutarato dependente de NAD. A reação é altamente específica para substrato. Nenhuma atividade foi observada na presença de D-glutamato, D- ou L- aspartato, glutamina ou quando NADP substituiu NAD. Usando centrifugação de densidade de gradiente de sacarose, os pesquisadores estimaram que o peso molecular da enzima nativa estava entre 300-340 kDa, sugerindo que a enzima pode ser um homoexâmero. Outros pesquisadores, por outro lado, estimaram que o peso molecular da enzima nativa era de aproximadamente 226 kDa, usando filtragem em gel. Os valores de KM para L-glutamato e NAD+ foram 1,3 mM e 0,25 mM, respectivamente.
[00608] Halobacterium salinarum é um dos organismos relatados ter mais de uma forma de GDH, com formas diferentes utilizando cofatores diferentes (NAD e NADP). Foi eventualmente demonstrado que o organismo tem quatro genes codificando quatro enzimas glutamato desidrogenase diferentes. Dois desses produtos de gene foram purificados e caracterizados bioquimicamente. Um dos genes, gdhA1, que foi originalmente previsto codificar uma forma específica de NADP, foi verificado codificar uma enzima específica de NAD.
[00609] Glutamato desidrogenases de Homo sapiens (GDHs) são enzimas da matriz mitocondrial homoexamérica que catalisam a desaminação oxidativa reversível de L-glutamato em 2-oxoglutarato e amônia. GDHs de mamíferos são enzimas incomuns, pelo fato de que são capazes de usar ou NAD ou NADP como um cofator. Humanos expressam duas isoenzimas GDH. Glutamato desidrogenase 1 (GLUD1) é expressa em níveis altos em fígado, cérebro, pâncreas e rins. Glutamato desidrogenase 2 (GLUD2) é codificada por um gene sem íntron ligado ao cromossomo X e é expressa em retina, testículos e cérebro. Mutações em GLUD1 que levam à hiperatividade de enzima resultam em hiperinsulinemia. Controle alostérico de atividade de GDH em mamíferos por efetores positivos tais como ADP e L-leucina e efetores negativos tal como GTP tem sido amplamente estudado.
[00610] PCI 219 de Bacillus subtilis tem uma glutamato desidrogenase (GDH) única com especificidade de coenzima dupla para NAD(H) e NADP(H). Seu peso molecular foi estimado ser 250.000 +/20.000 através de filtragem em gel e 270.000 +/- 30.000 através de centrifugação de zona em um gradiente de densidade de sacarose. O tamanho da subunidade era cerca de 57.000, sugerindo que ela é um homotetrâmero.
[00611] Um clone de cDNA foi isolado de tecidos de Solanum lycopersicum. O cDNA codificava uma proteína que compartilha identidade com glutamato desidrogenase (GDH) de plantas. Análise de expressão dessa proteína mostrou que ela é expressa em caules, raízes e folhas, mas está ausente em tecidos de fruto. O estudo também mostrou que as duas subunidades de GDH1 de tomate foram codificadas por um único gene. Essa enzima converte 2-oxoglutarato em L-glutamato.
[00612] Atividades de glutamato desidrogenase também foram descritas a partir de Clostridium propionicum e Thermotoga maritima.
[00613] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma glutamato desidrogenase selecionada de glutamato desidrogenase GDH2 dependente de NAD de Saccharomyces cerevisiae, glutamato desidrogenase GDH2 dependente de NAD Arabidopsis thaliana, glutamato desidrogenase GDH1 dependente de NAD de Arabidopsis thaliana, glutamato desidrogenase dghA dependente de NAD de Peptoniphilus asaccharolyticus, glutamato desidrogenase gdhA dependente de Halobacterium salinarum, glutamato desidrogenase de Thermotoga marítima, glutamato desidrogenase 1 (GLUD1) de Homo sapiens, glutamato desidrogenase 2 (GLUD2) de Homo sapiens, glutamato desidrogenase de Bacillus subtilis e glutamato desidrogenase GDH1 de Solanum lycopersicum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P33327, UniProt ID Q38946, UniProt ID Q38946, UniProt ID P28997, UniProt ID P29051, UniProt ID P00367, UniProt ID P49448 e UniProt ID P93541. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 461927, acesso TAIR AT5G07440, acesso TAIR AT5G18170, acesso GenBank M76403.1, acesso GenBank X63837.1, Gene ID 2746, Gene ID 2747 e acesso GenBank U48695.1.
Acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10)
[00614] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: acetaldeído + coenzima A + NAD+ θ acetil-CoA + NADH + H+
[00615] mhpF de E. coli codifica uma acetaldeído desidrogenase de acilação. MhpF é ativo como um monômero; a etapa de limitação de taxa da reação parece ser transtioesterificação. MhpF está envolvido em síntese de n-butanol em uma reversão engenheirada da via de oxidação β. A expressão de MhpE é acoplada de forma translacional a MhpF, e a interação entre as duas proteínas parece ser necessária para a solubilidade de MhpE.
[00616] AdhE de E. coli é uma proteína homopolimérica com três funções catalíticas dependentes de Fe2+: álcool desidrogenase, acetaldeído desidrogenase dependente de coenzima A e piruvato formato-liase desativase. No entanto, a existência da atividade de piruvato formato-liase desativase de AdhE tem sido debatida. A estrutura homopolimérica de AdhE é incomum pelo fato que 20-60 subunidades são dispostas helicoidalmente para formar ultraestruturas similares a bastonetes. Sob condições fermentativas, AdhE catalisa a redução de acetil-CoA em acetaldeído e o último composto em etanol. Aerobicamente, na direção reversa, AdhE pode catalisar a oxidação do acetaldeído em acetil-CoA. A expressão de adhE parece ser regulada nos níveis transcripcional e translacional e, possivelmente, no nível pós- traducional. Expressão de adhE é aproximadamente 10 vezes maior durante crescimento anaeróbico do que durante crescimento aeróbico. AdhE de E. coli B foi parcialmente purificado e caracterizado em trabalho inicial. Ele foi mais tarde purificado até homogeneidade a partir de E. coli B e sua atividade de aldeído desidrogenase ligada à coenzima A foi submetida a uma análise cinética detalhada. Um mecanismo pingpong bi-uni-uni-uni foi proposto. AdhE de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium mostrou 70% de identidade de sequência de aminoácidos com aquela de E. coli. Ele tinha um Km menor para substratos de álcool e algumas diferenças na especificidade de substrato comparado com a enzima de E. coli. No campo da engenharia metabólica, deleção de adhE é um fator determinante na produção de compostos tais como succinato, D-lactato e poli-hidroxialcanoatos.
[00617] ADH1 de Chlamydomonas reinhardtii codifica uma função dupla álcool desidrogenase/acetaldeído desidrogenase. Ele parece ser ativo sob condições anóxicas e participa de duas vias de produção de etanol anaeróbicas diferentes em Chlamydomonas.
[00618] DmpF é uma acetaldeído desidrogenase de acilação de Pseudomonas sp. As duas etapas finais da via de metaclivagem em Pseudomonas sp. CF600 envolvem a conversão de (S)-4-hidróxi-2- oxopentanoato em piruvato e acetil-CoA pelas enzimas 4-hidróxi-2- oxovalerato aldolase e acetaldeído desidrogenase (acilação). Estudos bioquímicos demonstraram que essas duas enzimas compreendem um heterodímero bifuncional de aldolase-desidrogenase e sugerem que o produto da reação da aldolase, acetaldeído, é transferido para o sítio ativo de desidrogenase por meio de um mecanismo de canalização. Isso minimiza o risco para as células representado pelo acetaldeído tóxico.
[00619] A presença do produto do gene todI em F1 dePseudomonas putida foi sugerida pelo padrão de expressão de proteína de construtos de plasmídeo. A sequência de aminoácidos prevista do produto do gene todI mostrou uma identidade muito alta com outros produtos do gene de aldeído desidrogenase de acilação bacteriana.
[00620] O gene adhE de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 codifica uma enzima multifuncional que tem ambas atividades álcool desidrogenase e acetaldeído desidrogenase. Ambas atividades são necessárias para a formação de butan-1-ol e etanol durante a gênese do solvente. O gene adhE é parte do operon sol, que está localizado no megaplasmídeo pSOL1. Expressão do gene de um plasmídeo em Clostridium acetobutylicum ATCC 824 resultou em atividades elevadas de butanol desidrogenase dependente de NADH, acetaldeído desidrogenase e butiraldeído desidrogenase dependentes de NAD e um pequeno aumento em etanol desidrogenase dependente de NADH. Complementação de um mutante deficiente em atividades de butiraldeído desidrogenase, acetoacetato descarboxilase e acetoacetil- coenzima A:acetato/butirato:coenzima A-transferase, que não produz nem butanol nem acetona, pelo gene adhE resultou rm formação de butanol restaurada sem qualquer formação de acetona ou qualquer aumento significante em produção de etanol, sugerindo que o papel principal da enzima é em formação de butanol, provendo ambos uma atividade butanal desidrogenase (convertendo butanoil-CoA em butan- 1-al) e atividade butanol desidrogenase. Ainda, inativação do gene reduziu drasticamente produção de butanol (em 85%), dando suporte a esse papel. Um outro gene do plasmídeo pSOL1, adhE2, codifica um segundo aldeído /álcool desidrogenase multifuncional envolvido em produção de butanol. No entanto, essa enzima é produzida apenas sob condições alco-hologênicas e não é expressa em condições solvogênicas. O gene da cepa ATCC 824 foi originalmente chamado aad.
[00621] Atividades da acetaldeído desidrogenase também foram descritas em Leuconostoc mesenteroides, Pelobacter acetylenicus e Pseudomonas putida. Aldeído desidrogenase dependente de CoA de Leuconostoc mesenteroides parcialmente purificada não pôde ser separada de um álcool desidrogenase ligado a NAD que copurificou com ela. A enzima era específica para NAD e não poderia usar NADP. Enquanto acetaldeído e 1-propanal foram os melhores substratos, a enzima também poderia usar butan-1-al (31% da atividade com acetaldeído) e isobutanal (14%).
[00622] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase selecionada de mhpF de E. coli, AdhE de E. coli, ADH1 de Chlamydomonas reinhardtii, acetaldeído desidrogenase dependente de CoA de Leuconostoc mesenteroides, acetaldeído desidrogenase de Pelobacter acetylenicus, Pseudomonas sp. dmpF, aldeído desidrogenase de acetilação todl de Pseudomonas putida, acetaldeído desidrogenase cmtH de Pseudomonas putida e álcool/aldeído desidrogenase AdhE de Clostridium acetobutylicum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P77580, UniProt P0A9Q7, UniProt ID A8JI07, UniProt ID Q52060, UniProt ID Q51949 e UniProt ID P33744. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 945008, Gene ID 945837, Gene ID 5729132, acesso GenBank X60835.1, acesso GenBank U09250. 1 e Gene ID 1116167.
Etanolamina amônia liase (EC 4.3.1.7)
[00623] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: amônio + acetaldeído θ etanolamina
[00624] A etanolamina amônia-liase (EAL) permite que E. coli utilize a etanolamina como a única fonte de nitrogênio e carbono na presença de vitamina B12 externa. EAL é uma enzima dependente de adenosilcobalamina que é espontaneamente inativada por seu substrato e pode ser reativada por EutA. A enzima foi primeiro estudada na cepa não-K-12 NCIB 8114. Estruturas de cristal de uma forma N- terminal truncada, mas ativa da enzima em complexos ambos binários e ternários com o cofator e substrato foram resolvidas. A enzima é composta por um hexâmero de 2 dímeros (αβ), com a subunidade α contendo o sítio ativo e o cofator de cobalamina ligado na interface entre as subunidades α e β. Os autores propõem um mecanismo de reação que é consistente com um mecanismo anteriormente descrito para rearranjos dependentes de adenosilcobalamina. O curso estereoquímico da reação foi modelado com base em estruturas de cristal, explicando a aparente falta de estereoespecificidade da enzima. A produção de EAL é reprimida por catabólitos e é induzida pela presença simultânea de etanolamina e do cofator adenosilcobalamina. A etanolamina amônia-liase compreende duas subunidades, α (EutB) e β (EutC).
[00625] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina amônia liase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima de E. coli tendo atividade de etanolamina amônia liase. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de etanolamina amônia liase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P0AEJ6 e UniProt ID P19636. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de etanolamina amônia liase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 946924 e Gene ID 946925.
Serina aminase (EC 2.6.1.-)
[00626] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: L-Serina + NH4+ ^ (S)-2,3-diaminopropanoato
[00627] Em algumas modalidades, enzima tendo atividade de serina aminase pode ser uma serina-glioxilato transaminase. Em outras modalidades, enzima tendo atividade de serina aminase pode ser uma serina-piruvato transaminase (vide acima).
[00628] Serina-glioxilato aminotransferase catalisa a transferência do grupo α-amino de L-serina em glioxilato, formando glicina e hidroxipiruvato. Nos metiltrofos do ciclo da serina, essa enzima desempenha dois papéis importantes: a formação de um aceitador (glicina) para uma unidade de um carbono e a conversão de L-serina em hidroxipiruvato na via assimilatória. Essa é a primeira serina- glioxilato aminotransferase microbiana a ser purificada, e alguns anos depois o gene que a codifica foi identificado também.
[00629] Serina: glioxilato aminotransferase codificado por AGT1 de Arabidopsis thaliana é um homodímero. A proteína recombinante purificada tem a atividade mais alta com a transaminação serina:glioxilato. Ela também catalisou transaminação de alanina: glioxilato e transaminação de serina:piruvato com atividade específica muito menor.
[00630] sgaA é presumido ser o gene codificando serina-glioxilato aminotransferase no cromossomo de Methylobacterium extorquens. Embora o produto do gene clonado não tenha sido expresso, complementação de mutação foi usada para investigar seu papel. Mutações nesse gene aboliram a capacidade de crescer em compostos C1 e complementação dos mutantes por uma versão intacta clonada do fragmento do gene restaurou a atividade. Ainda, a sequência sgaA é similar a várias aminotransferases.
[00631] Em modalidades adicionais, uma enzima tendo atividade de serina aminase pode ser uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a fosfoserina aminotransferase são serC ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 230. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase, uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 229. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase é PSAT1 de Homo sapiens ou seu homólogo. Em uma modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID Q9Y617. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 29968.
[00632] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina aminase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma serina glioxilato aminotransferase AGT1 de Arabidopsis thaliana, serina-glioxilato aminotransferase GM2 sgaA de Hyphomicrobium metilovorum e sgaA de Methylobacterium extorquens. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina-glioxilato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID Q56YA5 e UniProt ID O08374. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina-glioxilato aminotransferase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de acesso TAIR AT2G13360, acesso GenBank D86125.1 e acesso GenBank L27235.1.
[00633] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina aminase é uma serina-piruvato aminotransferase. Em algumas modalidades, a serina-piruvato aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com AGXT1 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a serina-piruvato aminotranserase é AGXT1 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a serina-piruvato aminotranserase é AGXT1 ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma serina-piruvato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 244. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma serina-piruvato aminotranserase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 243.
[00634] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina aminase é enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase selecionada de AGX1 de Saccharomyces cerevisiae, AGXT2 de Homo sapiens, AOAT1 de Arabidopsis thaliana e AOAT2 de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P43567, UniProt ID Q9BYV1, UniProt ID Q9LR30 e UniProt ID Q9S7E9. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 850514, Gene ID 64902, acesso TAIR AT1G23310 e acesso TAIR AT1G70580.
[00635] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina aminase é uma enzima tendo atividade de alanina transaminase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina transaminase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina transaminase selecionada de glutamato-piruvato aminotransferase de de E. coli alaA, glutamato-piruvato aminotransferase alaB de E. coli, glutamato-piruvato aminotransferase alaC de E. coli, alanina aminotransferase 1 (GPT) de Homo sapiens, alanina aminotransferase 2 de Homo sapiens, alanina transaminase de Arenicola marina, triptofano aminotransferase TAA1 de Arabidopsis thaliana, AOAT1 de Arabidopsis thaliana, AOAT2 de Arabidopsis thaliana, alanina aminotransferase de Candida maltosa, alanina aminotransferase Clostridium propionicum, alanina aminotransferase aat de Pyrococcus furiosus, alanina transaminase de Megathyrsus maximus e alanina transaminase de Panicum miliaceum AlaAt-2. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase compreendem uma sequência de aminoácido selecionada de UniProt ID P0A959, UniProt ID P77434, UniProt ID P24298, UniProt ID Q8TD30, UniProt ID Q9S7N2, UniProt ID Q9LR30, UniProt ID Q9S7E9, UniProt ID Q9P9M8 e UniProt ID P34106. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 946772, Gene ID 946850, Gene ID 2875, Gene ID 84706, Gene ID 843393, acesso TAIR AT1G23310, acesso TAIR AT1G70580, acesso GenBank AF163769.1 e acesso GenBank X69421.1.
2,3-diaminopropionato amônia-liase (EC 4.3.1.15)
[00636] A presente invenção descreve enzimas que podem catalisar a reação que segue: 2 amônio + piruvato θ 2,3-diaminopropanoato + H2O
[00637] 2,3-Diaminopropionato amônia-liase não é estereoespecífica e catalisa a eliminação α, β de ambos os estereoisômeros D e L de 2,3- diaminopropionato. A enzima também exibe atividade fraca em relação à D-serina e não exibe atividade em relação à L-serina, D-β-Cl-alanina ou L-β-Cl-alanina.
[00638] A enzima é homodimérica e contém um grupo prostético piridoxal 5'-fosfato, pertencente à família do tipo II de dobra de enzimas contendo PLP. As estruturas de cristal da apo- e holoenzima e da enzima em complexo com um intermediário de reação e substrato foram resolvidas. As propriedades cinéticas de mutantes em resíduos de sítio ativo foram analisadas e um mecanismo de reação foi proposto.
[00639] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com 2,3-diaminopropionato amônia-liase ygeX de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase é ygeX de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P66899. Em modalidades adicionais, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947012.
Derivação de glioxilato
[00640] O ciclo de glioxilato, uma variação do ciclo de ácido tricarboxílico, é uma via anabólica ocorrendo em plantas, bactérias, protistas e fungos. O ciclo do glioxilato se concentra na conversão de acetil-CoA em succinato para a síntese de carboidratos. Em micro-organismos, o ciclo de glioxilato permite que células utilizem compostos de carbono simples como uma fonte de carbono quando fontes complexas tal como a glicose não estão disponíveis. O ciclo é geralmente suposto estar ausente em animais, com a exceção de nematoides nos estágios iniciais de embriogênese. Nos últimos anos, no entanto, a detecção de malato sintase e isocitrato liase, enzimas- chave envolvidas no ciclo do glioxilato, em alguns tecidos animais levantou questões sobre a relação evolutiva de enzimas em bactérias e animais e sugere que os animais codificam enzimas alternativas do ciclo que diferem em função da malato sintase e isocitrato liase conhecidas em espécies não metazoárias.
[00641] O ciclo de glioxilato utiliza cinco das oito enzimas associadas ao ciclo do ácido tricarboxílico: citrato sintase, aconitase, succinato desidrogenase, fumarase e malato desidrogenase. Os dois ciclos diferem pelo fato que no ciclo de glioxilato, isocitrato é convertido em glioxilato e succinato pela isocitrato liase em vez de em α-cetoglutarato. Isso ignora as etapas de descarboxilação que ocorrem no ciclo do TCA, permitindo que compostos de carbono simples sejam usados na síntese posterior de macromoléculas, incluindo glicose. Glioxilato é subsequentemente combinado com acetil-CoA para produzir malato, catalisado pela malato sintase. Malato é também formado em paralelo a partir de succinato pela ação da succinato desidrogenase e fumarase.
[00642] Os ácidos graxos de lipídios são comumente usados como uma fonte de energia por vertebrados uma vez que ácidos graxos são degradados por meio de oxidação beta em moléculas de acetato. Esse acetato, ligado ao grupo tiol ativo da coenzima A, entra no ciclo do ácido cítrico (ciclo do TCA) onde é totalmente oxidado para dióxido de carbono. Essa via permite então que células obtenham energia a partir de gordura. Para utilizar acetato da gordura na biossíntese de carboidratos, o ciclo de glioxilato, cujas reações iniciais são idênticas às do ciclo de TCA, é usado.
[00643] Organismos contendo parede celular, tais como plantas, fungos e bactérias, requerem quantidades muito grandes de carboidratos durante crescimento para a biossíntese de polissacarídeos estruturais complexos, tais como celulose, glucanos e quitina. Nesses organismos, na ausência de carboidratos disponíveis (por exemplo, em certos ambientes microbianos ou durante a germinação de sementes em plantas), o ciclo de glioxilato permite a síntese de glicose a partir de lipídios por meio de acetato gerado na e-oxidação de ácido graxo.
[00644] O ciclo de glioxilato ignora as etapas do ciclo do ácido cítrico em que o carbono é perdido na forma de CO2. As duas etapas iniciais do ciclo do glioxilato são idênticas às do ciclo do ácido cítrico: acetato ^ citrato ^ isocitrato. Na próxima etapa, catalisada pela primeira enzima do ciclo de glioxilato, isocitrato liase, isocitrato sofre clivagem em succinato e glioxilato (o último dá seu nome ao ciclo). Glioxilato se condensa com acetil-CoA (uma etapa catalisada pela malato sintase), produzindo malato. Ambos malato e oxaloacetato podem ser convertidos em fosfoenolpiruvato, que é o produto da fosfoenolpiruvato carboxicinase, a primeira enzima em gliconeogênese. O resultado líquido do ciclo do glioxilato é, portanto, a produção de glicose a partir de ácidos graxos. Succinato gerado na primeira etapa pode entrar no ciclo do ácido cítrico para formar oxaloacetato.
Biossíntese de MEG (ou ácido glicólico), ou MEG (ou GA) e um ou mais coprodutos usando um micro-organismo recombinante
[00645] Conforme discutido acima, em um aspecto, a presente invenção provê um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas que produz um ou mais produtos derivados de D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário de pentose-fosfato. Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em uma modalidade adicional, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina ou uma combinação dos mesmos. Em ainda uma modalidade adicional, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA).
[00646] Portanto, em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade que converte um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em uma conversão sem perdas em intermediário de pentose-fosfato e compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma atividade de pentose-fosfato aldolase que converte o intermediário de pentose- fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfago (G3P).
[00647] Em algumas modalidades, o intermediário de pentose- fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5- fosfato. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase tem atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade D- xilulose-5-fosfato aldolase.
[00648] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 148 e 150. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA, ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 147 e 149. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com deoC de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase é deoC de E. coli.
[00649] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transaldolase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 152 e 154. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 151 e 153.
[00650] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase é rpe de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157.
[00651] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose- 5-fosfato isomerase é rpiB de E. coli. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 155.
[00652] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreendendo expressão de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase e uma atividade de D-ribose-5- fosfato aldolase, compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, Em algumas modalidades, a enzima 3-fosfato desidrogenase endógena é gapA, fosfoglicerato cinase é pgk e a fosfoglicerato mutase é gpmA ou gpmM.
[00653] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase é selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 212, 214, 216 e 218. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 211, 213, 215 e 217.
[00654] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 220 e 222. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 219 e 221.
[00655] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreendendo expressão de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase, uma atividade de fosfato acetiltransferase, uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase e uma atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma enzima 6- fosfofrutocinase endógena. Em algumas modalidades, a enzima 6- fosfofrutocinase endógena é pfkA e/ou pfkB.
[00656] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilose isomerase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylA de E. coli ou Pyromyces sp. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilose isomerase é selecionada de xylA de E. coli e xylA de Pyromyces sp. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 95 e 144. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 93, 94 e 143. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é xylB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose A 5-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 145.
[00657] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase. Em uma modalidade, a pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com fbp de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é fbp de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase converte D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato. Em outras modalidades, a D- frutose é convertida em frutose 1,6-bisfosfato por enzimas endógenas no micro-organismo recombinante.
[00658] Em algumas modalidades de qualquer um dos microorganismos recombinantes descritos acima, o micro-organismo recombinante compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato- 1-desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. Em modalidades adicionais, a glicose 6-fosfato-1- desidrogenase é zwf, a 6-fosfogluconolactonase é pgl e a 6- fosfogluconato desidrogenase é gnd.
[00659] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do microorganismo recombinante. Em outras modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos de monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos.
[00660] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase e a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase permite uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato e a conversão subsequente de D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído.
[00661] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz MEG ou ácido glicólico (GA) através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em algumas modalidades, MEG é produzido através da redução do glicolaldeído por uma enzima tendo atividade da glicolaldeído redutase em uma via C2. Em outras modalidades, GA é produzido através da oxidação de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase em uma via C2.
[00662] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de MEG ou GA é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de 3 - fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato redutase, uma atividade de glicolaldeído redutase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de glicerato descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase e uma atividade de glioxilato redutase.
[00663] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz MEG através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e produz um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em outras modalidades, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e um ou mais compostos da via da serina. Em algumas modalidades preferidas, o um composto ou mais compostos da via da serina são selecionados de serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e etilenodiamina (EDA).
[00664] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase e uma atividade de acetoacetato descarboxilase e o um ou mais coprodutos compreendem acetona.
[00665] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase e uma atividade de álcool desidrogenase secundária e o um ou mais coprodutos compreende isopropanol.
[00666] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de álcool desidrogenase secundária e uma atividade de desidratase, e o um ou mais coprodutos compreendem propeno.
[00667] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase, uma atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase, uma atividade de metilglutaconil-CoA hidratase, uma atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase, uma atividade de metilcrotonil-CoA hidratase, uma atividade de 3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase, uma atividade de 3HIV cinase, uma atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase e uma atividade de 3HIV descarboxilase e o um ou mais coprodutos compreendem isobuteno.
[00668] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase e uma atividade de glicerato 2-cinase e o um ou mais coprodutos compreendem L-serina.
[00669] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de transferase, uma atividade de formaldeído desidrogenase, uma atividade de formato desidrogenase, uma atividade associada com sistema de clivagem de glicina, uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de glicolato desidrogenase, uma atividade de alanina-glioxilato aminotransferase, uma atividade de alanina transaminase, uma atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H e um ou mais coprodutos compreendem glicina. Em uma outra modalidade, a atividade associada ao sistema de clivagem de glicina compreende uma enzima ou proteína selecionada de uma glicina descarboxilase (proteína P), uma aminometiltransferase (proteína T), uma di-hidrolipoamida desidrogenase (proteína L) e uma proteína H.
[00670] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de 3-fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de acetaldeído desidrogenase e uma atividade de etanolamina amônia liase e um ou mais coprodutos compreendem monoetanolamina (MEA).
[00671] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina desidrogenase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase, uma atividade de aminoacetaldeído transaminase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase, uma atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina desidrogenase, uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de aldeído oxidase, uma atividade de O-acetil transferase, uma atividade de N-acetiserina desidrogenase, uma atividade de transaminase, uma atividade de desacetilase, uma atividade de serina aminase e uma atividade de 2,3-diaminopropanoato amônia liase e o um ou mais coprodutos compreendem etilenodiamina (EDA).
[00672] Em algumas modalidades de qualquer um dos microorganismos recombinantes descritos acima, o micro-organismo recombinante compreende ainda uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em um glicolaldeído redutase, uma glicolaldeído desidrogenase, uma lactato desidrogenase ou combinação das mesmas.
[00673] Em uma modalidade, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2. Em uma outra modalidade, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada para produzir ATP.
[00674] Em uma modalidade, formação de biomassa em excesso é minimizada e produção de MEG ou ácido glicólico ou MEG e um ou mais coprodutos é maximizada.
[00675] Açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose 5- fosfato e conversão subsequente de intermediário D-ribose 5-fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato.
[00676] Na presente invenção, açúcares pentose e/ou hexose são convertidos em um intermediário de pentose-fosfato, um intermediário da via da pentose fosfato não oxidativa. O intermediário de pentose- fosfato, D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato, então serve como um substrato para uma D-pentose-fosfato aldolase, tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose- 5-fosfato aldolase ou atividade de D-xilulose-5-fosfato aldolase, para produzir glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato, compostos que podem então ser convertidos mais em MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00677] Na presente invenção, açúcares pentose e/ou hexose são convertidos em D-ribose 5-fosfato, um intermediário da via da pentose fosfato não oxidativa. O intermediário D-ribose 5-fosfato serve então como um substrato para uma D-ribose 5-fosfato aldolase para produzir glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato, compostos que podem então ser convertidos mais em MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00678] [A] Portanto, em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de produzir glicolaldeído e D- gliceraldeído 3-fosfato (G3P) por meio de um intermediário de pentose- fosfato de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante expressa um ou mais dos e (a) a (h) que seguem: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transcetolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D- gliceraldeído-3-fosfato em D-eritrose-4-fosfato e D- xilulose-5-fosfato, respectivamente, e/ou que catalisa uma conversão reversível de D- gliceraldeído-3-fosfato de (b) e D-sedoeptulose-7-fosfato de (b) em pentose-fosfato e D-xilulose-5-fosfato, respectivamente; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transaldolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D- eritrose-4-fosfato de (a) para D-gliceraldeído-3- fosfato e D- sedoeptulose-7-fosfato, respectivamente; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribulose-5- fosfato 3-epimerase que catalisa uma interconversão de D-xilulose-5- fosfato de (a) e/ou (f) e D- ribulose-5-fosfato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase que catalisa uma interconversão de D-ribulose-5-fosfato de (c) e D-ribose-5-fosfato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose 1,6- bisfosfatase que catalisa a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D- frutose 6-fosfato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade pentose-5-fosfato aldolase que catalisa a conversão de pentose-5-fosfato de (a) e/ou (d) em glicolaldeído e D-gliceraldeído- 3-fosfato; em que o micro-organismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e/ou uma fosfoglicerato cinase e/ou uma fosfoglicerato mutase; em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante, e em que glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) são produzidos.
[00679] [B] Portanto, em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de produzir glicolaldeído e D- gliceraldeído 3-fosfato (G3P) por meio de intermediário D-ribose 5- fosfato, ribulose 5-fosfato ou xilulose 5-fosfato de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante expressa um ou mais dos (a) a (h) que seguem: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transcetolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D- gliceraldeído-3-fosfato em D-eritrose-4-fosfato e D-xilulose-5-fosfato, respectivamente, e/ou que catalisa uma conversão reversível de D- gliceraldeído-3-fosfato de (b) e D-sedoeptulose-7-fosfato de (b) para D- ribose-5-fosfato e D-xilulose-5-fosfato, respectivamente; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transaldolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D- eritrose-4-fosfato de (a) para D-gliceraldeído-3-fosfato e D- sedoeptulose-7-fosfato, respectivamente; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribulose-5- fosfato 3-epimerase que catalisa uma interconversão de D-xilulose-5- fosfato de (a) e/ou (f) e D- ribulose-5-fosfato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase que catalisa uma interconversão de D-ribulose-5-fosfato de (c) e D-ribose-5-fosfato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose 1,6- bisfosfatase que catalisa a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D- frutose 6-fosfato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de D-ribose 5- fosfato, ribulose 5-fosfato ou xilulose 5-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribose-5-fosfato, ribulose 5-fosfato ou xilulose 5-fosfato de (a) e/ou (d) em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato; em que o micro-organismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e/ou uma fosfoglicerato cinase e/ou uma fosfoglicerato mutase; em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante, (i) em que glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) são produzidos.
[00680] [C] Em uma outra modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de produzir glicolaldeído e D- gliceraldeído 3-fosfato (G3P) por meio de um intermediário D-ribose 5- fosfato de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante expressa um ou mais dos que seguem de (a) a (j): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase que catalisa uma conversão reversível de D- frutose-6-fosfato em D-eritrose-4-fosfato e acetil-fosfato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase que catalisa uma conversão reversível de acetil-fosfato de (a) em acetil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transaldolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D- eritrose-4-fosfato de (a) em D-gliceraldeído-3- fosfato e D-sedoeptulose- 7-fosfato, respectivamente; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transcetolase que catalisa uma conversão reversível de D-gliceraldeído-3-fosfato de (c) e D-sedoeptulose-7-fosfato de (c) em D-ribose-5-fosfato e D-xilulose- 5-fosfato, respectivamente; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribulose-5- fosfato 3-epimerase que catalisa uma interconversão de D-xilulose-5- fosfato de (d) e/ou (h) e D- ribulose-5-fosfato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase que catalisa uma interconversão de D-ribulose-5-fosfato de (e) e D-ribose-5-fosfato; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilulose 5- cinase que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose 1,6- bifosfatase que catalisa a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D- frutose 6-fosfato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribose-5-fosfato de (d) e/ou (f) em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato; em que o micro-organismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfofrutocinase; em que um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via de pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante, em que o acetil-CoA produzido na etapa (b) pode ser usado para produzir um ou mais coprodutos selecionados de ácido glicólico, acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e um ou mais compostos da via da serina; e em que glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) são produzidos.
[00681] Em algumas modalidades, o ramo oxidativo da via da pentose fosfato é excluído ou inativado para otimizar o fluxo de açúcares em direção à entrada não oxidativa na via da pentose fosfato.
[00682] [D] Portanto, em uma modalidade, o micro-organismo recombinante da modalidade [A], modalidade [B] ou modalidade [C] compreende opcionalmente ainda uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicose 6-fosfato-1-desidrogenase que catalisa a conversão de glicose-6-fosfato em 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona; (ii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconolactonase que catalisa a conversão de 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona em gluconato-6-fosfato; e (iii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconato desidrogenase que catalisa a conversão de gluconato-6-fosfato em D-ribulose-5-fosfato.
[00683] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em outras modalidades, a transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em algumas modalidades, a transcetolase é tktA de E. coli. Em outras modalidades, a transcetolase é tktB de E. coli.
[00684] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 148 e 150. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 147 e 149.
[00685] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 152 e 154. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 151 e 153.
[00686] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de ribose-5- fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA ou rpiB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiB de E. coli.
[00687] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiA ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 155. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiB ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 254. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando um a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 253.
[00688] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de ribulose- 5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é rpe de E. coli.
[00689] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é rpe ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157.
[00690] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve.
[00691] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são selecionadas de BDP_1006, xfp, xpkA ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 212, 214, 216 e 218. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 211, 213, 215 e 217.
[00692] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum.
[00693] Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é pta ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 220 e 222. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 219 e 221.
[00694] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase, incluindo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade de D- xilulose-5-fosfato aldolase, é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com deoC de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase é deoC de E. coli.
[00695] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma enzima endógena ou exógena tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose. Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de xilose isomerase é exógena. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pyromyces sp. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de xilose isomerase é xylA ou seu homólogo. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 95 e 144. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de xilose isomerase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 93, 94 e 143.
[00696] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é xylB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose A 5-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 145.
[00697] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com fbp de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é fbp de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de frutose 1,6- bisfosfatase converte D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato. Em outras modalidades, a D-frutose é convertida em frutose 1,6-bisfosfato por enzimas endógenas no micro-organismo recombinante. Vias de produção de MEG ou ácido glicólico ou MEG e coproduto
[00698] Em algumas modalidades, os intermediários de glicolaldeído e gliceraldeído-3-fosfato produzidos a partir da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente a modalidade [D]) são usados em vias de produção C2 de MEG (ou ácido glicólico) conhecidas, que são acopladas às vias C3, como descrito abaixo, para coproduzir MEG adicional (ou ácido glicólico) e/ou um ou mais coprodutos.
[00699] Em algumas modalidades, MEG é produzido por meio de uma via C2 que usa uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase para converter glicolaldeído em MEG. Em uma outra modalidade, ácido glicólico (GA) é produzido por meio de uma via C2 que usa enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase para oxidar glicolaldeído a GA.
[00700] [E] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B ] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]) expressa ainda: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído em MEG, em que o microorganismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase, e em que MEG é produzido.
[00701] [F] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro- organismo recombinante capaz de produzir ácido glicólico (GA) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o microorganismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B ] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente a modalidade [D]) , expressa ainda: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em GA, em que o micro-organismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando um glicolaldeído redutase, e em que GA é produzido.
[00702] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de E. coli e S. cerevisiae. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafB (dkgB) e/ou yqhE (dkgA) ou seus homólogos. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são yqhD. Em algumas modalidades, o yqhD compreende uma mutação G149E. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
[00703] Em uma modalidade, a enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com aldA de E. coli (SEQ ID NO: 289). Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase é aldA de E. coli.
Produção de MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C2 e MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C3
[00704] Em um aspecto, MEG (ou ácido glicólico) é produzido a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose pela transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em glicolaldeído e intermediários G3P, seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C2 e uma conversão de G3P em MEG (ou ácido glicólico) por uma via C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00705] Em algumas modalidades, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de produzir MEG (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] ou modalidade [F] para a produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, compreende ainda uma via ou mais vias de biossíntese C3 para a produção de MEG (ou ácido glicólico). As vias de biossíntese C3 para a produção de MEG são, por exemplo, como descrito no WO 2010/076324 (Metabolic Explorer), aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00706] Em algumas modalidades, a via de biossíntese C3 para a produção de MEG compreende três reações enzimáticas começando com transformação do precursor 3-fosfoidroxipiruvato (precursor para serina). Primeiro, uma atividade de fosfatase permite a conversão de fosfo-hidroxipiruvato em hidroxipiruvato. O hidroxipiruvato é então transformado em glicolaldeído com uma atividade de 2-ceto ácido descarboxilase. Finalmente, uma atividade da hidroxialdeído redutase permite a conversão do glicolaldeído em etilenoglicol. Uma outra via para a produção de etilenoglicol começa a partir da L-serina como precursor. Primeiro, uma transaminase ou uma atividade de aminoácido oxidase permite a conversão de serina em hidroxipiruvato. As próximas duas etapas para converter hidroxipiruvato em glicolaldeído e depois em MEG são similares à primeira via descrita acima.
[00707] Em uma modalidade preferida, a invenção provê um micro-organismo recombinante compreendendo uma via ou mais vias de biossíntese C3 para produção de MEG. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante, particularmente uma bactéria, contém pelo menos um gene codificando um polipeptídeo com atividade de 2- ceto ácido descarboxilase e um gene codificando um polipeptídeo com atividade de hidroxialdeído redutase. Esses genes podem ser exógenos ou endógenos e podem ser expressos cromossomicamente ou extracromossomicamente.
[00708] Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações nas quais a disponibilidade do intermediário 3- fosfoglicerato é aumentada. Preferivelmente, o aumento é conseguido atenuando o nível de expressão de genes codificando fosfoglicerato mutases, em particular um ou ambos os genes gpmA e pgmI. Isso pode ser feito substituindo o promotor de tipo selvagem desses genes por um promotor mais fraco, ou pelo uso de um elemento que desestabiliza o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. Se necessário, a atenuação completa dos genes também pode ser obtida pela deleção das sequências de DNA correspondentes.
[00709] Em uma outra modalidade, o micro-organismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações nas quais o fluxo na via de biossíntese de serina é estimulado. Isso pode ser obtido aumentando o nível de expressão de 3-fosfoglicerato desidrogenase e/ou fosfoserina aminotransferase, codificadas pelos genes serA e serC, respectivamente. Aumento do nível de expressão da 3-fosfoglicerato desidrogenase e/ou fosfoserina aminotransferase pode ser realizado introduzindo promotores artificiais que conduzem a expressão dos genes serA e/ou serC, aumentando o número de cópias na célula ou introduzindo mutações nos genes serA e/ou serC que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. A expressão do gene serA também pode ser aumentada pela substituição do gene lrp do tipo selvagem (codificando a proteína reguladora responsiva à leucina) por um alelo mutado de lrp (como o alelo de lrp-1 correspondendo a uma substituição GLU 114 ASP na proteína lrp) levando à ativação constitutiva da transcrição do gene serA.
[00710] Em uma modalidade particular da invenção, mutações podem ser introduzidas no gene serA que reduzem a sensibilidade da proteína SerA à serina inibidora de feed-back (alelos dessensibilizados a feed-back) e então permitem uma atividade aumentada na presença de serina. Exemplos de alelos dessensibilizados, i.e. alelos insensíveis a feed-back, foram descritos na EP 0 931 833 (Ajinomoto) ou EP 0 620 853 (Wacker).
[00711] Em uma outra modalidade, o micro-organismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações em que fluxo para a via de biossíntese de hidroxipiruvato é estimulado. Esse resultado pode ser obtido aumentando o nível de expressão de serina transaminase ou serina oxidase (para a via começando da serina como precursor), ou aumentando a expressão da 3-fosfoidroxipiruvato fosfatase. Aumento do nível de expressão de serina oxidase pode ser realizado pela introdução e superexpressão do gene codificando L- aminoácido oxidase de R. opacus, ou pela introdução de mutações no gene que aumentam a atividade da proteína correspondente. Um aumento na expressão de serina transaminase pode ser realizado pela introdução de promotores artificiais que conduzem a expressão do gene serC de E. coli, aumentando o número de cópias na célula ou introduzindo mutações no gene serC que aumentam a atividade de a proteína correspondente. Um aumento da expressão de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase pode ser realizado introduzindo promotores artificiais que conduzem a expressão do gene yeaB ou gene serB de E. coli, aumentando o número de cópias na célula ou introduzindo mutações no gene yeaB ou no gene serB que aumentam a atividade das proteínas correspondentes. Um aumento da expressão de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase também pode ser realizado pela introdução e superexpressão do gene GPP2 de S. cerevisiae ou pela introdução de mutações no gene GPP2 que aumentam a atividade da proteína correspondente.
[00712] Em uma modalidade adicional da invenção, o micro organismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações para apresentar um nível atenuado de conversão de glicolaldeído em outros compostos diferentes de etilenoglicol. Isso pode ser obtido atenuando o nível de enzimas de consumo de glicolaldeído tal como hidroxitreonina aldolase (codificada por UaE) ou glicoladeído desidrogenase (codificada por aldA, aldB). Atenuação desses genes pode ser feita substituindo o promotor natural por um promotor de resistência menor ou por elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. Se necessário, atenuação completa do gene também pode ser obtida através de uma deleção da sequência de DNA correspondente.
[00713] Em uma modalidade adicional da invenção, a eficiência de importação de açúcar é aumentada, ou usando um sistema de importação de açúcar que não depende de fosfoenolpiruvato (PEP) como doador de fósforo tal como galP que é conhecido transportar glicose ou provendo mais fosfoenolpiruvato (PEP) para o sistema açúcar-fosfotransferase. Existem vários meios que podem ser usados para aumentar a disponibilidade de PEP em um micro-organismo. Em particular, isso pode ser realizado atenuando a reação PEP ^ piruvato. Preferivelmente, pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykF, codificando piruvato cinase, é atenuado na dita cepa para obter esse resultado. Uma outra maneira de aumentar a disponibilidade de PEP é favorecer a reação piruvato ^ PEP. Isto pode ser conseguido aumentando a atividade da fosfoenolpiruvato sintase que catalisa a reação acima. Essa enzima é codificada pelo gene ppsA. Portanto, no micro-organismo, a expressão do gene ppsA é preferivelmente aumentada. Ambas as modificações podem estar presentes no microorganismo simultaneamente.
[00714] Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações para apresentar um nível atenuado de conversão de serina em outros compostos diferente de etilenoglicol. Esse resultado pode ser obtido atenuando o nível de enzimas que consomem serina tais como serina desaminases (codificadas por sdaA, sdaB e/ou tdcG), serina transacetilase (codificada por cysE), triptofano sintase (codificada por trpAB) ou serina hidroximetiltransferase (codificada por glicA). Esses genes podem ser atenuados substituindo o promotor natural por um promotor de resistência menor or ou por elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. Se necessário, atenuação completa do gene também pode ser obtida através de uma deleção da sequência de DNA correspondente.
[00715] Em uma modalidade adicional da invenção, o microorganismo recombinante, particularmente uma bactéria, compreende modificações para apresentar um nível atenuado de conversão de hidroxipiruvato em outros compostos diferentes de glicolaldeído. Esse resultado pode ser obtido atenuando o nível de enzimas de consumo de hidroxipiruvato tal como hidroxipiruvato redutase (codificado por ghrA) ou hidroxipiruvato isomerase (codificado por hyi). Esses genes podem ser atenuados pela substituição do promotor natural por um promotor de resistência menor ou por elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. Se necessário, atenuação completa do gene também pode ser obtida por uma deleção da sequência de DNA correspondente.
[00716] Em algumas modalidades, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de produzir MEG (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] ou modalidade [F] para produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, compreende ainda uma via ou mais vias de biossíntese C3 para a produção de MEG (ou ácido glicólico). As vias de biossíntese de C3 para a produção de MEG são, por exemplo, como descrito no WO 2011/130378 (Genomatica), aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00717] Em algumas modalidades, a invenção provê um microorganismo recombinante compreendendo uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima da via do etilenoglicol expressa em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma serina aminotransferase, uma serina oxidorredutase (desaminação), uma hidroxipiruvato descarboxilase, um glicolaldeído redutase, uma serina descarboxilase, uma etanolamina aminotransferase, uma etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma hidroxipiruvato redutase ou uma glicerato descarboxilase.
[00718] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica as enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma serina aminotransferase ou uma serina oxidorredutase (desaminação); uma hidroxipiruvato descarboxilase e um glicolaldeído redutase.
[00719] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma serina aminotransferase ou uma serina oxidorredutase (desaminação); uma hidroxipiruvato redutase e uma glicerato descarboxilase.
[00720] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma serina descarboxilase; uma etanolamina aminotransferase ou uma etanolamina oxidorredutase (desaminação) e um glicolaldeído redutase.
[00721] Em algumas modalidades, a invenção provê um microorganismo recombinante compreendendo uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima da via do etilenoglicol expressa em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma hidroxipiruvato descarboxilase, glicolaldeído redutase, uma hidroxipiruvato redutase, uma glicerato descarboxilase, uma 3-fosfoglicerato fosfatase e um glicerato cinase.
[00722] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma hidroxipiruvato redutase; uma hidroxipiruvato descarboxilase e um glicolaldeído redutase.
[00723] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma 3-fosfoglicerato fosfatase ou um glicerato cinase; uma hidroxipiruvato redutase; uma hidroxipiruvato descarboxilase e um glicolaldeído redutase.
[00724] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima da via do etilenoglicol expressa em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma glicerato descarboxilase.
[00725] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante compreende uma via do etilenoglicol tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando enzimas da via do etilenoglicol expressas em uma quantidade suficiente para produzir etilenoglicol, a via do etilenoglicol incluindo uma 3-fosfoglicerato fosfatase ou um glicerato cinase e uma glicerato descarboxilase.
[00726] Em algumas modalidades, a invenção provê um microorganismo recombinante compreendendo uma via do etilenoglicol, em que o micro-organismo recombinante compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codificando uma enzima ou proteína que converte um substrato em um produto selecionado do grupo consistindo em serina em hidroxipiruvato, hidroxipiruvato em glicolaldeído, glicolaldeído em etilenoglicol, serina em etanolamina, etanolamina em glicolaldeído, 3-fosfoglicerato em glicerato, glicerato em hidroxipiruvato, hidroxipiruvato em glicerato e glicerato em etilenoglicol. Um versado na técnica entenderá que esses são meramente exemplares e que qualquer um dos pares substrato-produto descritos aqui adequados para produzir um produto desejado e para o qual uma atividade apropriada está disponível para a conversão do substrato no produto pode ser prontamente determinado por um versado na técnica com base nos presentes ensinamentos. Assim, a invenção provê um microorganismo recombinante contendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima ou proteína, onde a enzima ou proteína converte os substratos e produtos de uma via do etilenoglicol.
[00727] Embora geralmente descrito aqui como um micro-organismo recombinante que contém uma via do etilenoglicol, é compreendido que a invenção provê ainda um micro-organismo recombinante compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima da via do etilenoglicol expressa em uma quantidade suficiente para produzir um intermediário de uma via do etilenoglicol. Portanto, em adição a um micro-organismo recombinante contendo uma via do etilenoglicol que produz etilenoglicol, a invenção provê adicionalmente um micro-organismo recombinante compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno codificando uma enzima da via do etilenoglicol, em que o organismo microbiano produz um intermediário da via do etilenoglicol, por exemplo, hidroxipiruvato, etanolamina, glicolaldeído ou glicerato.
[00728] Em algumas modalidades, uma serina aminotransferase ou serina oxidorredutase (desaminação) catalisa a conversão de serina em hidroxipiruvato. Em algumas modalidades, uma hidroxipiruvato descarboxilase catalisa a conversão de hidroxipiruvato em glicolaldeído. Em algumas modalidades, um glicolaldeído redutase catalisa a conversão de glicolaldeído em etilenoglicol. Em algumas modalidades, uma serina descarboxilase catalisa a conversão de serina em etanolamina. Em algumas modalidades, uma etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação) catalisa a conversão de etanolamina em glicolaldeído. Em algumas modalidades, uma hidroxipiruvato redutase catalisa a conversão de glicerato em hidroxipiruvato. Em algumas modalidades, uma glicerato descarboxilase catalisa a conversão de glicerato em etilenoglicol. Em algumas modalidades, uma 3-fosfoglicerato fosfatase ou glicerato cinase catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato.
[00729] Em algumas modalidades, MEG (ou ácido glicólico) é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do D-ribose-5 -fosfato intermediário em glicolaldeído e intermediários G3P, seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em MEG (ou ácido glicólico) por uma via C3.
[00730] [K] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante de modalidade [A] ou da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente a modalidade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] ou modalidade [F] para a produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (h): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (b) em L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou serina oxidase que catalisa a conversão de L-serina de (d) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) ou (e) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em MEG; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em ácido glicólico; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em 3-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo recombinante, e em que MEG (ou ácido glicólico) é produzido.
[00731] [L] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro- organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante de modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] ou modalidade [F] para a produção de MEG (ou ácido glicólico) em um Via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (j): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase ou uma enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase ou uma enzima tendo atividade de serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de etanolamina de (e) em glicolaldeído; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicerato descarboxilase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em MEG; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em MEG; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em ácido glicólico; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de de glicólise endógena no micro-organismo recombinante, e em que MEG (ou ácido glicólico) é produzido.
[00732] Em algumas modalidades, um 2-ceto ácido descarboxilase, um hidroxipiruvato descarboxilase ou um 2-oxoglutarato descarboxilase converte hidroxipiruvato em glicolaldeído. Em algumas modalidades, a enzima que converte hidroxipiruvato em glicolaldeído é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com Kivd, dxs ou SucA. Em algumas modalidades, a 2-ceto ácido descarboxilase é Kivd de Lactococcus lactis. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 2-ceto ácido descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 224. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 2-ceto ácido descarboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 223. Em algumas modalidades, a 2- oxoglutarato descarboxilase é SucA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 2-oxoglutarato descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 226. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a 2-oxoglutarato descarboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 225.
[00733] Em algumas modalidades, a hidroxi aldeído redutase pode ser um glicolaldeído redutase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com yqhD ou FucO. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de E. coli e S. cerevisiae. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafB (dkgB) e/ou yqhE (dkgA) ou seus homólogos. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são yqhD. Em algumas modalidades, o yqhD compreende uma mutação G149E. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
[00734] Em algumas modalidades, a 3-fosfoglicerato desidrogenase pode ser uma 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase ou uma 2-oxoglutarato redutase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfo-hidroxipiruvato redutase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com serA. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase é serA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfo-hidroxipiruvato redutase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 228. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 227.
[00735] Em algumas modalidades, a 3-fosfoserina aminotransferase pode ser uma L-serina transaminase, uma serina aminotransferase ou uma serina-piruvato aminotransferase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfoserina aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com serC. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfoserina aminotransferase é serC de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-fosfoserina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 230. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfoserina aminotransferase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 229.
[00736] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase é AGXT1 de Homo sapiens. Em ainda outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 244. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 243.
[00737] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3- fosfo-hidroxipiruvato fosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com yeaB (nudL). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase é yeaB (nudL) de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 232. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 231.
[00738] Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com serB. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase é serB de E. coli. Em ainda outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 234. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo a atividade de fosfoserina a fosfatase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 233.
[00739] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2- cinase converte 2-fosfoglicerato em glicerato. Em algumas modalidades, a enzima que converte 2-fosfoglicerato em glicerato é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com phoA, glxK ou garK. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase é phoA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 246. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 2- fosfoglicerato-fosfatase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 245. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase é glxK de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 250. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 249. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase é garK de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 252. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 251.
[00740] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato fosfatase ou uma enzima tendo atividade de glicerato-3- cinase converte 3-fosfoglicerato em glicerato. Em algumas modalidades, a enzima que converte 3-fosfoglicerato em glicerato é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com phoA ou GLYK. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase é phoA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 246. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- fosfoglicerato fosfatase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 245. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase é GLYK de Arabidopsis thaliana. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-3- cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 248. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 247.
[00741] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase converte glicerato em hidroxipiruvato. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicerato em hidroxipiruvato é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ghrB. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase é ghrB de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a atividade da enzima hidroxipiruvato redutase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 242. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a atividade da enzima hidroxipiruvato redutase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 241.
[00742] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase converte L-serina em etanolamina. Em algumas modalidades, a enzima que converte L-serina em etanolamina é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SDC. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de serina descarboxilase é SDC de Arabidopsis thaliana. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 236. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de serina descarboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 235.
[00743] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase ou uma enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) converte etanolamina em glicolaldeído. Em algumas modalidades, a enzima que converte etanolamina em glicolaldeído é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com alaA ou tynA. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase é alaA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 240. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 239. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) é tynA de E. coli. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 238. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 237.
[00744] Em outro aspecto, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em um ou mais coprodutos por meio de uma via C3.
Coprodução de MEG por meio de uma via C2 e acetona, isopropanol, propeno e/ou isobuteno por meio de uma via C3
[00745] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em acetona por meio de uma via C3.
[00746] [M] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e acetona a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil- CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetil-CoA:acetoacetato- CoA transferase ou uma enzima tendo atividade de acetato:acetoacetil- CoA hidrolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (a) em acetoacetato; e/ou (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (b) em acetona; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [A] ou da modalidade [B] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG (ou ácido glicólico) e acetona são coproduzidos.
[00747] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em isobuteno por meio de uma via C3.
[00748] [N] Em algumas modalidades, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e isobuteno da partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (d): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou enzima tendo atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (a) em acetoacetato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (b) em acetona; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-hidróxi- isovalerato sintase que catalisa a conversão de acetona de (c) e acetil- CoA em 3-hidróxi-isovalerato (3HIV); ou em que o micro-organismo recombinante expressa um ou mais dos que seguem de (e) a (j): (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril- CoA sintase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (e) e acetil- CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG- CoA); (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilglutaconil- CoA hidratase que catalisa a conversão de HMG-CoA de (f) em 3- metilglutaconil-CoA; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilcrotonil- CoA carboxilase que catalisa a conversão de 3-metilglutaconil-CoA de (g) em 3-metilcrotonil-CoA; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase que catalisa a conversão de 3-metilcrotonil-CoA de (h) em 3- hidroxiisovaleril-CoA; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-hidroxiisovaleril- CoA tioesterase que catalisa a conversão de 3-hidroxiisovaleril-CoA de (i) em 3HIV; em que o micro-organismo recombinante expressa ainda (a1) e (a2) e/ou (b1) selecionado de: (k) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3HIV cinase que catalisa a conversão de 3HIV de (d) ou (j) em 3HIV-3-fosfato; (l) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase que catalisa a conversão de 3HIV-3-fosfato de (a1) em isobuteno; (m) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3HIV descarboxilase que catalisa a conversão de 3HIV de (d) ou (j) em isobuteno; (n) que o intermediário G3P produzido da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e isobuteno são coproduzidos.
[00749] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em isopropanol por meio de uma via C3.
[00750] [O] Em uma modalidade, os micro-organismos recombinantes da modalidade [M] e/ou [N] (codificando a atividade [EE]) opcionalmente expressam ainda pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade da álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona em isopropanol.
[00751] Em algumas modalidades, a álcool desidrogenase tem pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma álcool desidrogenase de Clostridium sp. Em outras modalidades, a álcool desidrogenase é uma álcool desidrogenase selecionada de adh de Clostridium beijerinckii e adh de Clostridium carboxidivorans. Em uma modalidade adicional, a álcool desidrogenase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 138 e 140. Em ainda uma outra modalidade, a álcool desidrogenase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136, 137 e 139.
[00752] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em propeno por meio de uma via C3.
[00753] [P] Em uma outra modalidade, os micro-organismos recombinantes da modalidade [O] (codificando a atividade [EE]) compreendem opcionalmente ainda pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
[00754] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para a coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de 3-hidróxi- isovalerato sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um micro-organismo selecionado de Mus sp., Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. e Polaromonas sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de 3-hidróxi- isovalerato sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de Mus musculus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus crispatus e Polaromonas naphthalenivorans. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-hidróxi-isovalerato sintase são selecionadas de Hmgcs1, ERG13, PksG e/ou Pnap_0477 ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-hidróxi-isovalerato sintase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 105, 107, 109 e 111. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-hidróxi-isovalerato sintase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 104, 106, 108 e 110.
[00755] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Saccharomyces sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase é HmgS ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 123. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 122.
[00756] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para a coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de metilglutaconil- CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de metilglutaconil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilglutaconil-CoA hidratase é liuC ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilglutaconil-CoA hidratase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 125. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilglutaconil-CoA hidratase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 124.
[00757] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de metilcrotonil- CoA carboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Pseudomonas aeruginosa. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase é liuB e/ou liuD ou seus homólogos. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 127 e 129. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 126 e 128.
[00758] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de metilcrotonil- CoA hidratase é uma 3-cetoacil-CoA tiolase. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase é uma enoil- CoA hidratase. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase é fadA e/ou fadB ou seu homólogos. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 131 e 133. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de metilcrotonil- CoA hidratase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 130 e 132.
[00759] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de 3- hidroxiisovaleril-CoA tioesterase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-hidroxiisovaleril-CoA tioesterase é tesB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3-hidroxiisovaleril-CoA tioesterase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 135. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3- hidroxiisovaleril-CoA tioesterase compreende uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 134.
[00760] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de 3HIV cinase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Thermoplasma sp. e Picrophilus sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de 3HIV cinase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Thermoplasma acidophilum e Picrophilus torridus. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV cinase é TA1305 e/ou PTO1356 ou seu homólogo. Em algumas modalidades, o TA1305 compreende uma mutação L200E. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV cinase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 113, 115 e 117. Em ainda outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV cinase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 112, 114 e 116.
[00761] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Streptococcus sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de Streptococcus mitis e Streptococcus gordonii. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV-3- fosfato descarboxilase compreendem smi_1746 e/ou mvaD ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 119 e 121. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 118 e 120.
[00762] Em uma modalidade de qualquer via revelada acima para coprodução de isobuteno, a enzima tendo atividade de 3HIV descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Streptococcus sp., Thermoplasma sp. e Picrophilus sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de 3HIV descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Streptococcus gordonii, Thermoplasma acidophilum e Picrophilus torridus. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de descarboxilase 3HIV compreendem mvaD, TA1305 e/ou PTO1356 ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV descarboxilase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 113, 117 e 121. Em ainda uma outra modalidade, a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de 3HIV descarboxilase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 112, 116 e 120.
Coprodução de MEG por meio de uma via C2 e um ou mais compostos da via da serina por meio de uma via C3
[00763] Em algumas modalidades, a produção de MEG por meio de uma via C2 é acoplada à produção de um composto ou mais compostos da via da serina por meio de uma via C3. Em uma modalidade, um composto ou mais compostos da via da serina se relacionam com a via biossintética de L-serina. Em uma outra modalidade, um composto ou mais compostos da via da serina são L-serina (Ser), glicina (Gly), monoetanolamina (MEA) e/ou etilenodiamina (EDA) (FIG. 6).
Produção de monoetileno glicol (MEG) ou ácido glicólico por meio de uma via C2
[00764] Como discutido acima, todos os métodos de produção de MEG (ou ácido glicólico) atualmente conhecidos usando glicose como matéria-prima têm baixo potencial de rendimento. Esta é uma desvantagem intrínseca da bioquímica de como glicose é degradada em MEG, com uma descarboxilação ocorrendo por molécula de MEG (ou ácido glicólico) produzida para todas as vias propostas e conhecidas. No entanto, uma descarboxilação por MEG é demais para atingir o redox neutro e, então, rendimento ótimo.
[00765] Para produzir MEG na presente invenção, um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são convertidos em um intermediário de pentose-fosfato por meio de uma entrada não oxidativa na via de pentose fosfato de uma maneira que preserva o potencial de rendimento, como descrito acima. O intermediário de pentose-fosfato, em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5-fosfato, D- ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato, é então convertido em glicolaldeído e G3P por meio de uma enzima com atividade de pentose de fosfato aldolase, em que a aldolase tem atividade de D-ribose-5- fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade de D-xilulose-5-fosfato aldolase. O intermediário glicolaldeído é reduzido a MEG, consumindo um NADH. Alternativamente, glicolaldeído pode ser oxidado por uma glicolaldeído desidrogenase em ácido glicólico. O composto C3 G3P é ainda oxidado em um ou mais dos compostos da via da L-serina Ser, Gly, MEA ou EDA, produzindo NADH.
[00766] Para reduzir os requisitos de ATP e otimizar o potencial de rendimento, D-xilose é preferivelmente importada por um simportador H+/xilose, tal como XylE de E. coli, ou um facilitador independente de energia, passivo, ao invés de um transportador ativo do tipo ABC, tal como XylFGH de E. coli, que utiliza 1 ATP por molécula transportada. Enquanto um simportador não consome ATP diretamente, sua degradação do gradiente de prótons é equivalente à utilização de cerca de 0,1 ATP. Em todas as equações que seguem, esse consumo indireto de ATP bem como ATP necessário para manutenção da célula não são contabilizados.
Amônia (NH3)
[00767] Amônia é um composto de nitrogênio e hidrogênio com a fórmula NH3, que serve como um precursor para alimentos e fertilizantes bem como um bloco de construção para a síntese de produtos farmacêuticos e produtos de limpeza comerciais. Amônia está presente como um cátion de amônio quando é carregada positivamente, cuja fórmula química é NH4+.
[00768] A presente invenção ensina que amônia ou um composto similar é utilizado como fonte de nitrogênio. Quando a amônia ou um composto similar é usado como fonte de nitrogênio, ele é fixado em matéria orgânica, por exemplo, glutamato. Em uma modalidade, quando 2-oxoglutarato é geralmente formado em glutamato, a amônia é fixada e esse processo consome um NADH.
Produção de L-serina (Ser)
[00769] Ser é produzido pela via natural por meio da 3-fosfoserina ou uma variação da mesma. Em uma modalidade, G3P produzido a partir da conversão de D-ribose 5-fosfato por uma D-ribose 5-fosfato aldolase é convertido por glicólise endógena no micro-organismo em 3-fosfo-D- glicerato (3-fosfoglicerato). 3-fosfoglicerato é convertido em 3-fosfo- hidroxipiruvato por uma D-3-fosfoglicerato desidrogenase (EC 1.1.1.95). O 3-fosfo-hidroxipiruvato é então convertido em 3-fosfoserina por uma 3-fosfoserina aminotransferase (EC 2.6.1.52). A 3-fosfoserina é então convertida em L-serina por uma fosfoserina fosfatase (EC 3.1.3.3).
[00770] Em algumas modalidades, a reação de 3-fosfoglicerato em L-serina é a que segue: 3-fosfo-D-glicerato + NAD+ + L-glutamato + H2O ^ L-serina + NADH + 2-oxoglutarato + fosfato
[00771] Considerando a produção de dois NADH de G3P para 3- fosfo-hidroxipiruvato e um NADH necessário para fixação de NH3, produção de Ser produz exatamente um NADH em excesso, que é necessário para a coprodução equimolar de um MEG (ou ácido glicólico).
[00772] Em algumas modalidades, a produção de MEG e L-serina está muito perto do potencial de rendimento máximo termodinâmico usando a conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em um intermediário de pentose-fosfato, seguido pela conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e então seguido pela coprodução de MEG por meio da redução de glicolaldeído e L-serina por meio de uma via ou mais vias C3 do intermediário G3P. Em algumas modalidades, o potencial de rendimento termodinâmico é 14% melhor para a coprodução de MEG e L-serina por meio das vias descritas no presente pedido comparado com produção de L-serina feita a partir de glicose pela via C3 padrão, natural. Coprodução: (pentose ou hexose) + NH3 ^ MEG + Ser + 0 ATP * Y (via) = (0,371 + 0,629) g/g = 1,00 g (MEG + Ser)/g ((pentose ou hexose) + NH3), 96% de Y (max) (calor de combustão) = 1,044 g/g Via padrão: glicose +2 NH3 ^ 2 Ser +2 NADH +0 ATP Y (via) = 0,981 g (Ser)/g ((pentose ou hexose) + 2NH3), 84% de Y (max) (calor de combustão) = 1,164 g/g
[00773] * Transporte de simporte passivo ou H+ de D-xilose, uma pentose, é presumido. Consumo indireto de ATP para um simportador H+ ou ATP necessário para manutenção celular não é contabilizado.
[00774] Em algumas modalidades, MEG e L-serina são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conver-são do intermediário de pentose-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de interme-diário G3P em L-serina por uma via ou mais vias C3.
[00775] [Q] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e L-serina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais do que segue de (a) a (h): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (d) em L-serina; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (b) e/ou (c) em hidroxipiruvato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (e) e/ou (g) em L-serina; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e L-serina são produzidos. Produção de glicina (Gly)
[00776] Gly é produzida por vias naturais, por exemplo, via Ser ou suas variações.
[00777] Em uma modalidade, Gly é produzida por meio de uma via baseada em Ser. Na via baseada em Ser, o 5,10-metileno tetra- hidrofolato (M-THF) é produzido a partir de THF e a L-serina é convertida em glicina por uma serina hidroximetiltransferase. O M-THF é utilizado na biossíntese de vários compostos celulares, por exemplo, em reações de metilação.
[00778] Em uma modalidade preferida, M-THF também pode ser usado para produzir mais dois NADH ou um NADH e um H2: M-THF + H2O θ THF + formaldeído (EC 2.1.2.-; transferases tais como hidroximetil-, formil- e transferases relacionadas que transferem um grupo de carbono), oxidação subsequente de formaldeído (EC 1.2.1.46; formaldeído desidrogenase) em formato e NADH, e oxidação adicional de formato em CO2 e NADH (formato desidrogenase, FDH) ou CO2 e H2 (complexo de formato de hidrogeno-liase).
[00779] Em algumas modalidades, esta reconstituição de THF, se feita parcialmente, pode ser usada para gerar apenas NADH suficiente para realizar uma outra rota de biossíntese de glicina distinta. Em uma modalidade, a rota por meio do do sistema de clivagem de glicina, que utiliza M-THF, NH3, CO2 e NADH para sintetizar glicina diretamente, pode ser usada juntamente com a produção de glicina à base de serina para utilizar o excesso de M-THF gerado para gerar mais glicina.
[00780] O sistema de clivagem de glicina (GCV) é um complexo de múltiplas enzimas que catalisa a oxidação reversível da glicina, produzindo dióxido de carbono, amônia, 5,10-metilenotetra-hidrofolato (M-THF) e um nucleotídeo de piridina reduzido: Glicina + THF + NAD+ θ M-THF + CO2 + NH3 + NADH + H+
[00781] Tetraidrofolato serve como um recipiente para unidades de um carbono geradas durante clivagem da glicina para formar o grupo metileno. O sistema GCV consiste em quatro componentes de proteína, a proteína P, a proteína H, a proteína T e a proteína L. A proteína P (EC 1.4.4.2, glicina desidrogenase (descarboxilação)) catalisa a liberação de CO2 da glicina dependente de piridoxal fosfato, deixando uma porção de metilamina. A porção metilamina é transferida para o grupo ácido lipoico da proteína H, que está ligada à proteína P antes da descarboxilação de glicina. A proteína T (EC 2.1.2.10, aminometiltransferase) catalisa a liberação de NH3 do grupo metilamina e transfere a unidade C1 restante para THF, formando 5,10-mTHF. A proteína L (EC 1.8.1.4, di-hidrolipoil desidrogenase) então oxida o componente ácido lipoico da proteína H e transfere os elétrons para o NAD+, formando NADH.
[00782] O mesmo conjunto de enzimas é algumas vezes referido como glicina sintase quando é operado na direção reversa para formar glicina. Na bactéria anaeróbica, Clostridium acidiurici, o sistema de clivagem da glicina opera principalmente na direção da síntese de glicina.
[00783] Alternativamente, em uma outra modalidade, glicina também pode ser produzida por meio de transaminação de glioxilato por alanina- glioxilato aminotransferase (EC 2.6.1.44). Embora em organismos tal como Saccharomyces cerevisiae essa via seja expressa apenas durante crescimento em fontes de carbono não fermentáveis tal como etanol ou acetato, essa via pode ser prontamente superexpressa em qualquer micro-organismo. A alanina doadora de grupo amino é reconstituída por transaminação com glutamato (alanina transaminase, EC 2.6.1.2), que por sua vez é reconstituído por fixação de amônia por uma desidrogenase glutamato dependente de NADH ou NADPH (EC 1.4.1.2 ou EC 1.4.1.3). Em uma modalidade, essa via da glicina evita o intermediário L-serina e não leva à produção de M-THF, mas, em vez disso, produz diretamente dois equivalentes de redução, tal como NADH.
[00784] Em algumas modalidades, a produção de MEG e glicina está muito perto do potencial de rendimento máximo termodinâmico usando a conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido pela conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D- gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e então seguido pela coprodução de MEG por meio de redução de glicolaldeído e glicina por meio de uma via ou mais vias C3 a partir do intermediário G3P. Em algumas modalidades, o potencial de rendimento termodinâmico é 37% melhor para coprodução de MEG (ou ácido glicólico) e glicina por meio das vias descritas no presente pedido comparado com produção de glicina feita a partir de glicose pela via C3 natural, padrão.
[00785] Coprodução, via da serina: (pentose ou hexose) + NH3 + THF -> MEG + Gly + M-THF +0 ATP *
[00786] Coprodução, via da serina, supondo reconstituição de THF por meio de formato e usando FDH: (pentose ou hexose) + NH3 -> MEG + Gly + 2 NADH +0 ATP *
[00787] Coprodução, via do glioxilato: (pentose ou hexose) + NH3 -> MEG + Gly + 2 NAD(P)H +0 ATP * Y (via) = (0,371 + 0,449) g/g = 0,820 g (MEG + Gly)/g ((pentose ou hexose) + NH3), 81% de Y (max) (calor de combustão) = 1,013 g/g
[00788] Coprodução, via de serina, supondo reconstituição parcial de THF por meio do e formato e síntese de FDH mais síntese de glicina por meio de sistema de clivagem de glicina: Reconstituição parcial de THF através da produção de NADH: M-THF - > 2/3 M-THF +1/3 THF +2/3 NADH
[00789] Utilização de M-THF remanescente e NADH gerado para sistema de clivagem de glicina: 2/3 M-THF +2/3 NADH +2/3 NH3 +2/3 CO2 -> 2/3 Gly (pentose ou hexose) +5/3 NH3 +2/3 CO2 -> MEG +5/3 Gly +0 ATP * y (via) = (0,348 + 0,698) g/g = 1,046g/g, 97% de y(max) = 1,076g/g Via padrão: glicose +2 NH3 +2 THF-> 2 Gly +2 M-THF +2 NADH +0 ATP Y (via) = 0,701 g (Gly)/g (glicose + 2NH3), 59% de Y (max) (calor de combustão) = 1,197 g/g
[00790] *Transporte passivo ou por simporte de H+ de D-xilose, uma pentose, é presumido. Consumo indireto de ATP para um simportador de H+ ou ATP necessário para manutenção da célula não é contabilizado.
[00791] Em algumas modalidades, MEG e glicina são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em glicina por meio de uma via ou mais vias C3.
[00792] [R] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (e): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase que catalisa a conversão de L-serina e tetraidrofolato (THF) em glicina e 5,10-metileno tetraidrofolato (M-THF); (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transferase que catalisa a conversão de M-THF de (a) em formaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de formaldeído de (b) em formato e NADH; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de formato desidrogenase que catalisa a conversão de formato de (c) em CO2 e NADH; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma proteína do sistema de clivagem de glicina que catalisa a conversão de M-THF de (a), CO2, NH3 e NADH de (c) ou (d) em glicina e THF; em que THF é reconstituído a partir das etapas (b) a (e), em que opcionalmente formato de (c) é oxidado mais em CO2 e H2 por um complexo de formato de hidrogenilase, e em que MEG e glicina são produzidos.
[00793] [S] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (k): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (b) em L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou serina oxidase que catalisa a conversão de L-serina de (d) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) ou (e) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em ácido glicólico; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolato desidrogenase que catalisa a conversão de ácido glicólico de (g) em glioxilato; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase que catalisa a conversão de glioxilato de (h) e alanina em glicina e piruvato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase que catalisa a conversão de piruvato de (i) e glutamato em alanina e 2-oxoglutarato; (k) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H que catalisa a conversão de 2- oxoglutarato de (j) e amônia em glutamato; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [A] ou da modalidade [B] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, em que o glioxilato para a etapa (i) vem opcionalmente de derivação de glioxilato no micro-organismo, em que alanina e glutamato são reconstituídos a partir das etapas (j) e (k), e em que MEG e glicina são coproduzidos.
[00794] [T] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente a modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (l): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase ou serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase ou enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de etanolamina de (e) em glicolaldeído; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em ácido glicólico; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolato desidrogenase que catalisa a conversão de ácido glicólico de (g) em glioxilato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase que catalisa a conversão de glioxilato de (i) e alanina em glicina e piruvato; (k) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase que catalisa a conversão de piruvato de (j) e glutamato em alanina e 2-oxoglutarato; (l) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H que catalisa a conversão de 2- oxoglutarato de (k) e amônia em glutamato; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato por meio de glicólise endógena no micro-organismo, em que o glioxilato para a etapa (j) vem opcionalmente de derivação de glioxilato no micro-organismo, em que alanina e glutamato são reconstituídos a partir das etapas (k) e (l), e em que MEG e glicina são coproduzidos.
[00795] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase converte L-serina em glicina. Em algumas modalidades, a enzima que converte L-serina em glicina é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com glyA de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A825. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947022.
[00796] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de transferase que transfere grupos de um carbono é usada para converter M-THF em formaldeído. Transferases tais como hidroximetil-, formil- e transferases relacionadas podem ser usadas. Exemplos de hidroximetil- , formil- e transferases relacionadas incluem glicina hidroximetiltransferase, fosforibosilglicinamida formiltransferase, fosforribosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferase, glicina formimidoiltransferase, glutamato formiminotransferase, D-alanina-2 hidroximetiltransferase, desoxicitidilato 5-hidroximetiltransferase, metionil-tRNA formiltransferase, aminometiltransferase, 3-metil-2- oxobutanoato hidroximetiltransferase e UDP-4-amino-4-desóxi-L- arabinose formiltransferase.
[00797] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase é usada para converter formaldeído em formato e NADH. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma formaldeído desidrogenase selecionada de ALD2 de Saccharomyces cerevisiae, ALD3 de Saccharomyces cerevisiae, ALDH3A2 de Homo sapiens e ALDH9A1 de Homo sapiens. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P47771, UniProt ID P54114, UniProt ID P51648 e UniProt ID P49189. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 855206, Gene ID 855205, Gene ID 224 e Gene ID 223.
[00798] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de formato desidrogenase é usada para converter formato em CO2 e NADH. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de formato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de formato de desidrogenase selecionada do grupo consistindo em fdhF de E. coli (chlF, FDH-H), FDH-N de E. coli, FDH-O de E. coli, FDH1 de Candida boidinii, fdhF de Corynebacterium glutamicum, formato desidrogenase dependente de NAD+ de Cupriavidus oxalaticus, formato desidrogenase dependente de NAD+ de Gottschalkia acidurici, Fdh1 de Methylobacterium extorquens, formato desidrogenase de Methylosinus trichosporium e formato desidrogenase fdh dependente de NAD+ de Moraxella sp. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima ou subunidade de uma enzima associada à atividade de formato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P07658, UniProt ID P0AEK7, UniProt ID P0AAJ3, UniProt ID P24183, UniProt ID P32176, UniProt ID P0AAJ5, UniProt ID P0AEL0, UniProt ID O13437, UniProt ID Q8NSY6, UniProt ID Q8KTI7, UniProt ID Q8KTI8 e UniProt ID O08375. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima ou subunidade de uma enzima associada à atividade de formato desidrogenase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 948584, Gene ID 946038, Gene ID 948794, Gene ID 946035, Gene ID 948394, Gene ID 948395, Gene ID 948383, acesso GenBank AJ011046.2, Gene ID 1021531, acesso GenBank AF489516 e acesso GenBank Y13245.1.
[00799] Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas do sistema de clivagem de glicina são usadas para produzir glicina a partir de M-THF, CO2, NH3 e NADH. Em algumas modalidades, as proteínas do sistema de clivagem de glicina compreendem: i) proteína P (uma proteína contendo piridoxal fosfato) ou glicina descarboxilase (EC 1.4.4.2), ii) proteína T ou aminometil-transferase (EC 2.1.2.10), iii) proteína L ou di-hidrolipoamida desidrogenase (EC1.8.1.4) e iv) uma proteína transportadora chamada proteína H (uma proteína contendo ácido lipoico). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicina descarboxilase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvP de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicina descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P33195. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glicina descarboxilase compreende uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947394. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de aminometiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvT de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de aminometiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P27248. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de aminometiltransferase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947390. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de di-hidrolipoamida desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com lpd de E. coli (lpdA, subunidade E3). Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de di-hidrolipoamida desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A9P0. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de di-hidrolipoamida desidrogenase compreendem uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 944854. Em algumas modalidades, a proteína H é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com gcvH de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína H compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P0A6T9. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína H são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947393.
[00800] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de glicolato desidrogenase é usada para converter ácido glicólico em glioxilato. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de glicolato desidrogenase selecionada de GLC de glicolato desidrogenase de E. coli e glicolato desidrogenase de Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima ou subunidade de enzima associada à atividade de glicolato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P0AEP9, UniProt ID P52073, UniProt ID P52074 e UniProt ID Q94AX4. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima ou subunidade de enzima associada à atividade de glicolato desidrogenase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 947353, Gene ID 2847718, Gene ID 2847717 e acesso GenBank Y13245.1.
[00801] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase é usada para converter glioxilato em glicina. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina- glioxilato aminotransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato de aminotransferase selecionada de AGX1 de Saccharomyces cerevisiae, AGXT2 de Homo sapiens, AOAT1 de Arabidopsis thaliana e AOAT2A de rabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P43567, UniProt ID Q9BYV1, UniProt ID Q9LR30 e UniProt ID Q9S7E9. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 850514, Gene ID 64902, acesso TAIR AT1G23310 e acesso TAIR AT1G70580.
[00802] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de alanina transaminase é usada para reconstituir alanina a partir de piruvato e glutamato. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de alanina transaminase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de alanina transaminase selecionada de glutamato-piruvado aminotransferase alaA de E. coli, glutamato-piruvato aminotransferase alaB de E. coli, glutamato-piruvato aminotransferase alaC de E. coli, alanina aminotransferase 1 (GPT) de Homo sapiens, alanina aminotransferase 2 de (GPT2) de Homo sapiens, alanina transaminase de Arenicola marina, triptofano aminotransferase TAA1 de Arabidopsis thaliana, AOAT1 de Arabidopsis thaliana, AOAT2 de Arabidopsis thaliana, alanina aminotransferase de Candida maltosa, alanina aminotransferase de Clostridim propionicum, alanina aminotransferase aat de Pyrococcus furiosus, alanina transaminase de Megathyrsus maximus e alanina transaminase AlaAT-2 de Panicum miliaceum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase compreendem uma sequência de aminoácido selecionada de UniProt ID P0A959, UniProt ID P77434, UniProt ID P24298, UniProt ID Q8TD30, UniProt ID Q9S7N2, UniProt ID Q9LR30, UniProt ID Q9S7E9, UniProt ID Q9P9M8 e UniProt ID P34106. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de alani-na transaminase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 946772, Gene ID 946850, Gene ID 2875, Gene ID 84706, Gene ID 843393, acesso TAIR AT1G23310, acesso TAIR AT1G70580, acesso GenBank AF163769.1 e acesso GenBank X69421.1.
[00803] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade da glutamato desidrogenase é usada para reconstituir glutamato a partir de amônia e 2-oxoglutarato. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase selecionada de glutamato desidrogenase dependente de NAD GDH2de Saccharomyces cerevisiae, glutamato desidrogenase dependente de NAD GDH2 de Arabidopsis thaliana, glutamato desidrogenase dependente de NAD GDH1 de Arabidopsis thaliana, glutamato desidrogenase dependente de NAD gdhA de Peptoniphilus asaccharolyticus, glutamato desidrogenase dependente de NAD gdhA de Halobacterium salinarum, glutamato desidrogenase de Thermotoga maritima, glutamato desidrogenase 1 (GLUD1) de Homo sapiens, glutamato desidrogenase 2 (GLUD2) de Homo sapiens, glutamato desidrogenase de Bacillus subtilis e glutamato desidrogenase de GDH1 Solanum lycopersicum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P33327, UniProt ID Q38946, UniProt ID Q38946, UniProt ID P28997, UniProt ID P29051, UniProt ID P00367, UniProt ID P49448 e UniProt ID P93541. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 461927, acesso TAIR AT5G07440, acesso TAIR AT5G18170, acesso GenBank M76403.1, acesso GenBank X63837.1, Gene ID 2746, Gene ID 2747 e acesso GenBank U48695.1. Produção de monoetanolamina (MEA)
[00804] MEA pode ser produzida por meio de descarboxilação de Ser ou transaminação de glicolaldeído.
[00805] Em algumas modalidades preferidas, as serina descarboxilases são utilizadas, uma vez que elas são encontradas naturalmente, isto é, em vias de biossíntese de colina em plantas, e a transaminação de um intermediário de glicolaldeído criaria uma linha cruzada entre a via MEG e MEA.
[00806] Alternativamente, em uma outra modalidade, MEA pode ser formada por etanolamina amônia liase (EC 4.3.1.7) a partir de acetaldeído e amônia: Acetaldeído + NH3 θ etanolamina
[00807] Nesse caso, o MEA não é formado por meio da via de biossíntese de Ser, mas sim a partir de acetil-CoA e sua redução em acetaldeído por acetaldeído desidrogenase. Embora a situação redox não mude, essa via produz +1 ATP contra a via baseada em Ser. Ela também evita o intermediário tóxico Ser, mas possui o acetaldeído intermediário tóxico e volátil.
[00808] Em algumas modalidades, a produção de MEG e MEA está muito próxima do potencial de rendimento máximo termodinâmico usando a conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido pela conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em intermediários glicolaldeído e D- gliceraldeído-3-fosfato (G3P), e então seguido pela coprodução de MEG por meio da redução de glicolaldeído e MEA por meio de uma via ou mais vias C3 do intermediário G3P. Em algumas modalidades, o potencial de rendimento termodinâmico é 15% melhor para coprodução de MEG e MEA por meio das vias descritas no presente pedido comparado com a produção de MEA feita a partir de glicose por vias similares naturais ou publicadas.
[00809] Coprodução, via de Ser: (pentose ou hexose) + NH3 -> MEG + MEA +0 ATP * Coprodução, via de acetaldeído: (pentose ou hexose) + NH3 -> MEG + MEA +1 ATP * Y (via) = (0,371 + 0,365) g/g = 0,736 g (MEG + MEA)/g ((pentose ou hexose) + NH3), 98% de Y (max) (calor de combustão) = 0,749 g/g Via padrão: glicose +2 NH3 -> 2 MEA +2 NADH +0 ATP Y (via) = 0,570 g (MEA)/g (glicose + 2NH3), 85% de Y (max) (calor de combustão) = 0,669 g/g
[00810] *Transporte passivo ou de simporte de H+ de D-xilose, uma pentose, é presumido. Consumo indireto de ATP para um simportador de H+ ou ATP necessário para manutenção celular não é contabilizado.
[00811] Em algumas modalidades, MEG e MEA são coproduzidos a par-tir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em MEA por meio de uma via ou mais vias C3.
[00812] [U] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (i): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (d) em L-serina; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (b) e/ou (c) em hidroxipiruvato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (e) e/ou (g) em L-serina; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina de (f) e/ou (h) em MEA; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00813] [V] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (f): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase ou serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade transaminase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (e) em MEA; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [A] ou da modalidade [B] é convertido em 3-fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00814] [W] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) para B): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetaldeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina amônia liase que catalisa a conversão de acetaldeído e amônia em MEA; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00815] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase é usada para reduzir acetil-CoA em acetaldeído. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase selecionada de mhpF de E. coli, Adh de E. coli, ADH1 de Chlamydomonas reinhardtii, acetaldeído desidrogenase dependente de CoA de Leuconostoc mesenteroides, acetaldeído desidrogenase de Pelobacter acetylenicus, dmpF de Pseudomonas sp., aldeído desidrogenase de acilação todl de Pseudomonas putida, acetaldeído desidrogenase cmtH de Pseudomonas putida e álcool/aldeído desidrogenase AdhE de Clostridium acetobutylicum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P77580, UniProt P0A9Q7, UniProt ID A8JI07, UniProt ID Q52060, UniProt ID Q51949 e UniProt ID P33744. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase compreendem uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 945008, Gene ID 945837, Gene ID 5729132, acesso GenBank X60835.1, acesso GenBank U09250.1 e ID do gene 1116167.
[00816] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de etanolamina amônia liase é usada para converter acetaldeído e amônia em MEA. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de etanolamina amônia liase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma etanolamina amônia liase de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de etanolamina amônia liase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de UniProt ID P0AEJ6 e UniProt ID P19636. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma subunidade de etanolamina amônia liase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de Gene ID 946924 e Gene ID 946925. Produção de etilenodiamina (EDA)
[00817] O EDA pode ser produzida por qualquer uma das vias A a E descritas no documento WO 2014/049382, que é aqui incorporado em sua totalidade (FIG. 7).
[00818] Em algumas modalidades, MEG e EDA são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários de D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em EDA por meio de uma via ou mais vias C3.
[00819] [X] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina desidrogenase que catalisa a conversão de L-serina em 2-aminomalonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase que catalisa a conversão de 2- aminomalonato semialdeído de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transamilase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que 2-aminomalonato semialdeído pode ser opcionalmente convertido em aminoacetaldeído através de uma reação espontânea, e em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00820] De acordo com esse aspecto da invenção, o microorganismo recombinante superexpressa pelo menos um dos genes codificando enzimas exibindo atividade de serina desidrogenase e aminoacetaldeído transaminase. Esses genes podem ser genes endógenos ou genes exógenos.
[00821] A primeira reação da conversão da L-serina em semialdeído 2-aminomalonato é catalisada por uma enzima serina desidrogenase. Essa enzima pertence à família grande de enzimas de álcool desidrogenases também chamadas aldeído redutases. Várias enzimas são conhecidas exibir atividade da serina desidrogenase. Em uma modalidade da invenção, essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica (Chowdhury e outros, 1996, Yao e outros, 2010, Tchigvintsev e outros, 2012, Fujisawa e outros , 2003, Hawes e outros, 1996 e Lokanath e outros, 2005), incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: mmsB de Pseudomonas putida, de Synechococcus PCC6301 ou de Bacillus cereus; hibdh de Pseudomonas putida E23; PA0743 de Pseudomonas aeruginosa; ydfG de Escherichia coli ou de Bacillus brevis ou de Bacillus subtilis; sdh de Agrobacterium tumefaciens; hibadh de Rattus norvegicus ou de Thermus thermophilus HB8; yiaY de Escherichia coli.
[00822] Em uma modalidade preferida da invenção, a serina desidrogenase é codificada por ydfG de Escherichia coli ou mmsB de Pseudomonas putida ou yiaY de Escherichia coli. Preferivelmente, essas enzimas são otimizadas por mutação dos genes de codificação, a fim de melhorar sua eficiência catalítica de L-serina em 2- aminomalonato semialdeído.
[00823] Em uma outra modalidade da invenção, a enzima serina desidrogenase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para serina e atividade de serina desidrogenase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à L-serina. Preferivelmente, essas enzimas podem ser escolhidas dentre 3-hidróxi-isobutirato desidrogenases e serina desidrogenases. Mais preferivelmente, elas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados aos, genes aqui: gldA de Escherichia coli ou de Leuconostoc citreum ou de Symbiobacterium thermophilum; yqhE de Escherichia coli; yafB de Escherichia coli; alr de Leishmania donovani; sakR1 de Synechococcus sp; yhdN de Bacillus subtilis; ytbE de Bacillus subtilis; AKR4C9 de Arabidopsis thaliana; fucO de Escherichia coli. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00824] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica a fim de obter enzima tendo especificidade melhorada para o substrato L-serina e/ou permitindo convertê-la em 2-aminomalonato semialdeído com uma atividade melhorada. A seleção das enzimas evoluídas é realizada expressando as enzimas evoluídas no micro-organismo da invenção ou in vitro com L-serina como substrato e detectando o produto 2- aminomalonato semialdeído.
[00825] A segunda reação da conversão do 2-aminomalonato semialdeído em aminoacetaldeído é realizada espontaneamente na célula (Fujisawa e outros, 2003). Em outra modalidade da invenção, a segunda reação de conversão de 2-aminomalonato semialdeído em aminoacetaldeído é catalisada por uma enzima tendo atividade de 2- aminomalonato semialdeído descarboxilase. Essa enzima não é encontrada naturalmente. Portanto, ela é obtida através da evolução de uma enzima conhecida ou pela avaliação de bibliotecas metagenômicas. A atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase é realizada com um aminoácido descarboxilase evoluído ou uma de ceto ácido descarboxilase evoluído que catalisa a descarboxilação de aminoácidos ou ceto ácidos. Preferivelmente um aminoácido descarboxilase evoluído é escolhido. Mais preferivelmente, a aminoácido descarboxilase evoluída é escolhido dentre histidina descarboxilase, serina descarboxilase, aspartato descarboxilase, diaminobutanoato descarboxilase, omitina descarboxilase. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: sdc de Arabidopsis thaliana; panD de Aquifex aeolicus ou de Bacillus subtilis; GAD ou GAD2 ou GAD3 ou GAD4 ou GAD5 de Arabidopsis thaliana; GAD ou GAD2 ou OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; gadA ou gadB ou panD ou speC ou speF de Escherichia coli; SCC105.13 de Streptomyces coelicolor; gadB de Mannheimia succiniciproducens; bdb de Haloferax volcanii; odc1 de Lactobacillus sp; kivD de Lactococcus lactis subsp. Lactis; kdcA de Lactococcus lactis; OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; speC ou speF de Escherichia coli; SPE1 de Saccharomyces cerevisiae. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, o gene sdc de Arabidopsis thaliana é usado para obter a atividade de 2- aminomalonato semialdeído descarboxilase.
[00826] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica a fim de obter enzimas tendo especificidade para o substrato 2-aminomalonato semialdeído e permitindo sua conversão em aminoacetaldeído. A seleção da enzima evoluída é realizada expressando a enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com 2-aminomalonato semialdeído como substrato e quantificando o produto aminoacetaldeído.
[00827] A última reação da conversão do aminoacetaldeído em etilenodiamina é catalisada por uma aminoacetaldeído transaminase. Essa enzima não é encontrada naturalmente. Portanto, ela é obtida através da evolução de uma enzima conhecida ou pela avaliação de bibliotecas metagenômicas. Em uma modalidade da invenção, a atividade da aminoacetaldeído transaminase é realizada com uma transaminase ou aminotransferase evoluída que catalisa a troca de um grupo amino de uma molécula com um grupo oxo em outra molécula. Preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida entre fosfoserina aminotransferase ou aspartato aminotransferase ou glutamato aminotransferase. Mais preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida dentre as aminotransferases usando glutamato como doador de grupo amino. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: serC de Escherichia coli ou de Bacillus subtilis ou de Corynebacterium glutamicum; GOT1 de Sus scrofa; patA de Escherichia coli; ygjG de Brucella canis; rocD de Rhizobium NGR 234 ou de Streptomyces avermitilis; SCO1284 de Streptomyces coelicolor; AGT ou AGT2 ou AGT3 ou GGT1 de Arabidopsis thaliana; AGXT de Bos Taurus. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, os genes serC de Escherichia coli ou GOT1 de Sus scrofa são usados para obter a atividade da aminoacetaldeído transaminase.
[00828] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica de modo a obter enzimas com especificidade para o substrato aminoacetaldeído e permitindo a sua conversão em etilenodiamina. A seleção da enzima evoluída é feita através da expressão da enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com aminoacetaldeído como substrato e através da detecção do produto etilenodiamina.
[00829] Em uma outra modalidade da invenção, as enzimas aminoacetaldeído transaminase podem ser isoladas de cepas que crescem em etilenodiamina como única fonte de carbono e nitrogênio. Para esse propósito, culturas de enriquecimento de amostras ambientais em etilenodiamina são cultivadas em meio mínimo com etilenodiamina como única fonte de nitrogênio e carbono. Bibliotecas metagenômicas são geradas a partir dessas culturas e avaliadas quanto à presença de enzimas aminoacetaldeído transaminase. Essa abordagem permite isolamento do gene correspondendo à atividade de enzima e é bem conhecida dos especialistas no campo.
[00830] De acordo com um aspecto específico da invenção, o micro-organismo da modalidade [X] é engenheirado para superexpressar pelo menos um dos genes que seguem: gene ydfG ou gene mmsB ou gene yiaY, codificando a serina desidrogenase; e/ou um gene serC evoluído ou gene GOT1, codificando a atividade da aminoacetaldeído transaminase.
[00831] [Y] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2 , expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina desidrogenase que catalisa a conversão de L-serina em 2-aminomalonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase que catalisa a conversão de 2- aminomalonato semialdeído de (a) em 2,3-diaminopropanoato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de 2,3-diaminopropanoato de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00832] De acordo com esse aspecto da invenção, o microorganismo recombinante superexpressa pelo menos um dos genes codificando enzimas exibindo atividade de serina desidrogenase, 2- aminomalonato semialdeído transaminase e 2,3-diaminopropanoato descarboxilase. Esses genes podem ser genes endógenos ou genes exógenos.
[00833] A primeira reação de conversão de L-serina em 2- aminomalonato semialdeído é catalisada por uma enzima serina desidrogenase. Essa enzima pertence à família grande de enzimas de álcool desidrogenases, também chamadas de aldeído redutases. Várias enzimas são conhecidas exibir atividade de serina desidrogenase. Em uma modalidade da invenção, a serina desidrogenase é escolhida dentre essas enzimas conhecidas. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica (Chowdhury e outros, 1996, Yao e outros, 2010, Tchigvintsev e outros, 2012, Fujisawa e outros, 2003, Hawes e outros , 1996 e Lokanath e outros, 2005), incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: mmsB de Pseudomonas putida, de Synechococcus PCC6301 ou de Bacillus cereus; hibdh de Pseudomonas putida E23; PA0743 de Pseudomonas aeruginosa; ydfG de Escherichia coli ou de Bacillus brevis ou de Bacillus subtilis; sdh de Agrobacterium tumefaciens; hibadh de Rattus norvegicus ou de Thermus thermophilus HB8; yiaY de Escherichia coli.
[00834] Em uma modalidade preferida da invenção, a serina desidrogenase é codificada por ydfG de Escherichia coli ou mmsB de Pseudomonas putida ou yiaY de Escherichia coli. Preferivelmente, essas enzimas são otimizadas por mutação dos genes de codificação a fim de melhorar sua eficiência catalítica de L-serina em 2- aminomalonato semialdeído.
[00835] Em uma outra modalidade da invenção, a enzima serina desidrogenase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para serina e atividade de serina desidrogenase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à L-serina. Preferivelmente essas enzimas podem ser escolhidas dentre 3-hidróxi-isobutirato desidrogenases e serina desidrogenases. Mais preferivelmente, elas são codificados por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, presentes genes: gldA de Escherichia coli ou de Leuconostoc citreum ou de Symbiobacterium thermophilum; yqhE de Escherichia coli; yafB de Escherichia coli; alr de Leishmania donovani; sakR1 de Synechococcus sp.; yhdN de Bacillus subtilis; ytbE de Bacillus subtilis; AKR4C9 de Arabidopsis thaliana; fucO de Escherichia coli. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00836] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica a fim de obter enzima tendo especificidade melhorada para o substrato L-serina e/ou permitindo convertê-la em 2-aminomalonato semialdeído com uma atividade melhorada. A seleção das enzimas evoluídas é realizada expressando as enzimas evoluídas no micro-organismo da invenção ou in vitro com L-serina como substrato e detectando o produto semialdeído 2-aminomalonato.
[00837] A segunda reação de conversão do 2-aminomalonato semialdeído em 2,3-diaminopropanoato é catalisada por uma 2- aminomalonato semialdeído transaminase. Essa enzima não é encontrada naturalmente. Portanto, ela é obtida através da evolução de uma enzima conhecida ou pela avaliação de bibliotecas metagenômicas. A atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase é realizada com uma transaminase ou aminotransferase evoluída que catalisa a troca de um grupo amino de uma molécula com um grupo oxo de uma outra molécula. Preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida dentre fosfoserina aminotransferase ou aspartato aminotransferase ou glutamato aminotransferase. Mais preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida dentre aminotransferase usando glutamato como doador de grupo amino. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados aos, genes listados aqui: serC de Escherichia coli ou de Bacillus subtilis ou de Corynebacterium glutamicum; GOT1 de Sus scrofa; patA de Escherichia coli; ygjG de Brucella canis; rocD de Rhizobium NGR 234 ou de Streptomyces avermitilis; SCO1284 de Streptomyces coelicolor; AGT ou AGT2 ou AGT3 ou GGT1 de Arabidopsis thaliana; AGXT de Bos Taurus. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, genes serC de Escherichia coli ou GOT1 de Sus scrofa são usados para obter a atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase.
[00838] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos dos versados na técnica a fim de obter enzimas tendo especificidade melhorada para o substrato semialdeído 2-aminomalonato e/ou permitindo convertê-lo em 2,3- diaminopropanoato com uma atividade melhorada. A seleção da enzima evoluída é feita expressando a enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com 2-aminomalonato semialdeído como substrato e quantificando o produto 2,3-diaminopropanoato.
[00839] A terceira reação de conversão de 2,3-diaminopropanoato em etilenodiamina é catalisada por uma enzima tendo atividade de 2,3- diaminopropanoato descarboxilase. Essa enzima não é encontrada naturalmente. Portanto, ela é obtida através da evolução de enzima conhecida ou pela avaliação de bibliotecas metagenômicas. A atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase é realizada com um aminoácido descarboxilase evoluído ou uma ceto ácido descarboxilase evoluído que catalisa a descarboxilação de aminoácidos ou ceto ácidos. Preferivelmente um aminoácido descarboxilase evoluída é escolhido. Mais preferivelmente um aminoácido descarboxilase evoluído é escolhida dentre histidina descarboxilase, serina descarboxilase, aspartato descarboxilase, diaminobutanoato descarboxilase, omitina descarboxilase. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: sdc de Arabidopsis thaliana; padC ou yclB de Bacillus subtilis; ubiD de Campylobacter jejuni ou de Escherichia coli; PAD1 ou GAD1 ou SPE1 de Saccharomyces cerevisiae; panD de Aquifex aeolicus ou de Bacillus subtilis; GAD ou GAD2 ou GAD3 ou GAD4 ou GAD5 de Arabidopsis thaliana; GAD ou GAD2 ou OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; gadA ou gadB ou panD ou speC ou speF de Escherichia coli; SCC105.13 de Streptomyces coelicolor; gadB de Mannheimia succiniciproducens; bdb de Haloferax volcanii; odc1 de Lactobacillus sp.; kivD de Lactococcus lactis subsp. Lactis; kdcA de Lactococcus lactis; OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; speC ou speF de Escherichia coli; SPE1 de Saccharomyces cerevisiae. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, o gene sdc de Arabidopsis thaliana é usado para obter a atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase.
[00840] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos do versado na técnica de modo a obter enzimas tendo especificidade melhorada para o substrato 2,3- diaminopropanoato e/ou permitindo convertê-lo em etilenodiamina com uma atividade melhorada. A seleção da enzima evoluída é realizada expressando a enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com 2,3-diaminopropanoato como substrato e quantificando o produto etilenodiamina. De acordo com um aspecto específico da invenção, o micro-organismo da modalidade [Y] é engenheirado para superexpressar: gene ydfG, gene yiaY ou gene mmsB, codificando a serina desidrogenase; e/ou gene serC ou gene GOT1 evoluído, codificando a atividade da de 2-aminomalonato semialdeído transaminase; e/ou gene sdc evoluído de Arabidopsis thaliana, codificando a 2,3-diaminopropanoato descarboxilase.
[00841] [Z] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e codificando a atividade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2 , expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina desidrogenase que catalisa a conversão de etanolamina de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00842] De acordo com esse aspecto da invenção, o microorganismo recombinante superexpressa pelo menos um dos genes codificando enzimas exibindo atividade de serina descarboxilase, etanolamina desidrogenase e aminoacetaldeído transaminase. Esses genes podem ser genes endógenos ou genes exógenos.
[00843] A primeira reação de conversão de L-serina em etanolamina é catalisada por uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase. Esse grupo de enzimas catalisa a descarboxilação da L-serina em etanolamina. Em uma modalidade preferida da invenção, a serina descarboxilase é codificada por sdc de Arabidopsis thaliana (Rontein e outros, 2001, W02007/144346). A conversão de L-serina em etanolamina pela serina descarboxilase, codificada por sdc de Arabidopsis thaliana, é revelada em particular no pedido de patente W02007/144364, que é aqui incorporado a título de referência. Preferivelmente, essas enzimas são otimizadas por mutação dos genes de codificação, a fim de melhorar sua eficiência de conversão de L- serina em etanolamina.
[00844] Em uma modalidade da invenção, a atividade da serina descarboxilase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para serina e atividade melhorada de serina descarboxilase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à etanolamina. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: GAD1 ou SPE1 de Saccharomyces cerevisiae; panD de Aquifex aeolicus ou de Bacillus subtilis; GAD ou GAD2 ou GAD3 ou GAD4 ou GAD5 de Arabidopsis thaliana; GAD ou GAD2 ou OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; gadA ou gadB ou panD ou speC ou speF de Escherichia coli; SCC105.13 de Streptomyces coelicolor; gadB de Mannheimia succiniciproducens; bdb de Haloferax volcanii; odc1 de Lactobacillus sp.; OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; speC ou speF de Escherichia coli; SPE1 de Saccharomyces cerevisiae. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00845] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica a fim de obter enzimas tendo especificidade melhorada para o substrato L-serina e permitindo convertê-lo em etanolamina com uma atividade melhorada. A seleção da enzima evoluída é realizada expressando a enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com L-serina como substrato e quantificando o produto etanolamina.
[00846] A segunda reação de conversão de etanolamina em aminoacetaldeído é catalisada por uma enzima etanolamina desidrogenase. Enzimas naturais tendo essa atividade não são descritas na técnica anterior; no entanto, algumas enzimas têm baixa atividade catalítica. Portanto, é vantajoso evoluir essas enzimas com baixa atividade catalítica para enzimas evoluídas com atividade melhorada. Enzimas úteis também podem ser obtidas através de avaliação de bibliotecas metagenômicas.
[00847] Em uma modalidade da invenção, a atividade da etanolamina desidrogenase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para etanolamina e atividade de etanolamina desidrogenase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à etanolamina. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: mmsB de Pseudomonas putida ou de Synechococcus PCC6301 ou de Bacillus cereus; hibdh de Pseudomonas putida E23; PA0743 de Pseudomonas aeruginosa; ydfG de Escherichia coli ou de Bacillus brevis ou de Bacillus subtilis; sdh de Agrobacterium tumefaciens; hibadh de Rattus norvegicus ou de Thermus thermophilus HB8; gldA de Escherichia coli ou de Leuconostoc citreum ou de Symbiobacterium thermophilum; yqhE de Escherichia coli; yafB de Escherichia coli; aladh de Enterobacter aerogenes; alr de Leishmania donovani; sakR1 de Synechococcus sp.; yhdN de Bacillus subtilis; ytbE de Bacillus subtilis; yiaY de Escherichia coli; AKR4C9 de Arabidopsis thaliana; fucO de Escherichia coli. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, os genes fucO de Escherichia coli ou yiaY de Escherichia coli são usados para obter a atividade da etanolamina desidrogenase.
[00848] Evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica de modo a obter enzimas possuindo especificidade melhorada para o substrato etanolamina e/ou permitindo convertê-lo em aminoacetaldeído com uma atividade melhorada. A seleção de enzimas evoluídas é feita através da expressão das enzimas evoluídas no micro-organismo da invenção ou in vitro com etanolamina como substrato e pela quantificação do produto aminoacetaldeído.
[00849] A última reação de conversão de aminoacetaldeído em etilenodiamina é catalisada por uma aminoacetaldeído transaminase. Essa enzima não é encontrada naturalmente. Portanto, ela é obtida pela evolução de enzima conhecida ou pela avaliação de bibliotecas metagenômicas. Em uma modalidade da invenção, a atividade da aminoacetaldeído transaminase é realizada com uma transaminase ou aminotransferase evoluída que catalisa a troca de um grupo amino de uma molécula com um grupo oxo em uma outra molécula. Preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida dentre fosfoserina aminotransferase ou aspartato aminotransferase ou glutamato aminotransferase. Mais preferivelmente, a aminotransferase evoluída é escolhida dentre a aminotransferase usando glutamato como doador de grupo amino. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: serC de Escherichia coli ou de Bacillus subtilis ou de Corynebacterium glutamicum; GOT1 de Sus scrofa; patA de Escherichia coli; ygjG de Brucella canis; rocD de Rhizobium NGR 234 ou de Streptomyces avermitilis; SCO1284 de Streptomyces coelicolor; AGT ou AGT2 ou AGT3 ou GGT1 de Arabidopsis thaliana; AGXT de Bos Taurus. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado. Preferivelmente, genes serC de Escherichia coli ou GOT1 de Sus scrofa são usados.
[00850] A evolução dessas enzimas é realizada através de meios e métodos bem conhecidos por um versado na técnica a fim de obter enzimas tendo especificidade melhorada para o substrato aminoacetaldeído e/ou permitindo convertê-lo em etilenodiamina com uma atividade melhorada. A seleção da enzima evoluída é feita através da expressão da enzima evoluída no micro-organismo da invenção ou in vitro com aminoacetaldeído como substrato e pela detecção do produto etilenodiamina.
[00851] Em outra modalidade da invenção, as enzimas aminoacetaldeído transaminase podem ser isoladas de cepas que crescem em etilenodiamina como fonte de carbono e nitrogênio única. Para esse propósito, culturas de enriquecimento de amostras ambientais em etilenodiamina são cultivadas em meio mínimo com etilenodiamina como fonte de nitrogênio e carbono única. Bibliotecas metagenômicas são geradas a partir dessas culturas e avaliadas quanto à presença de enzimas aminoacetaldeído transaminase. Essa abordagem permite isolar o gene correspondente à atividade de enzima e é bem conhecida dos especialistas no campo.
[00852] De acordo com um aspecto específico da invenção, o micro-organismo da modalidade [Z] é engenheirado para superexpressar: um gene sdc de Arabidopsis thaliana, codificando uma serina descarboxilase; e/ou genes fucO ou yiaY de Escherichia coli, codificando a atividade da etanolamina desidrogenase; e/ou um gene serC ou gene GOT1 evoluído, codificando atividade da aminoacetaldeído transaminase.
[00853] [AA] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente a modalidade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2 , expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase que catalisa a conversão de L-serina em glicina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aldeído oxidase que catalisa a conversão de glicina de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00854] Preferivelmente, o gene glyA de Escherichia coli é usado para obter a atividade da serina hidroximetiltransferase.
[00855] A enzima aldeído oxidase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para glicina e atividade de aldeído oxidase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à glicina. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: aldH1 de Aquifex aeolicus; dhaS de Anoxybacillus flavithermus; Aldh de Apis mellifera; aldX, aldY, dhaS, ycbD, yfmT ou ywdH de Bacillus subtilis; prr de Escherichia coli; ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6 de Saccharomyces cerevisiae; betB de Roseobacter denitrificans; AAur_0650 da Arthrobacter aurescens. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00856] Conversão de aminoacetaldeído em etilenodiamina por uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase. Essa enzima é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para aminoacetaldeído e atividade de transaminase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares a aminoacetaldeído. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: serC de Escherichia coli ou de Bacillus subtilis ou de Corynebacterium glutamicum; GOT1 de Sus scrofa; patA de Escherichia coli; ygjG de Brucella canis; rocD de Rhizobium NGR 234 ou de Streptomyces avermitilis; SCO1284 de Streptomyces coelicolor; AGT ou AGT2 ou AGT3 ou GGT1 de Arabidopsis thaliana; AGXT de Bos Taurus. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00857] De acordo com um aspecto específico da invenção, o micro- organismo da modalidade [AA] é engenheirado para superexpressar um gene serC ou gene GOT1 evoluído, codificando a atividade da aminoacetaldeído transaminase.
[00858] [BB] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente modalidade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2 , expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (e): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de aminoácido N-acetil transferase ou atividade de O-acetil transferase que catalisa a conversão de L-serina em N-acetilserina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de N-acetilserina desidrogenase que catalisa a conversão de N-acetilserina de (a) em N- acetilmalonato semialdeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade transaminase que catalisa a conversão de N-acetilmalonato semialdeído de (b) em acetilaminopropanoato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade desacetilase que catalisa a conversão de acetilaminopropanoato de (c) em 2,3- diaminopropanoato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de 2,3- diaminopropanoato de (d) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00859] A primeira etapa de conversão da modalidade [BB] pode ser uma atividade de Aminoácido N-acetil transferase ou atividade de O- acetil transferase, uma vez que a transformação de O em N é espontânea. Preferivelmente, o gene argA de Escherichia coli é usado para obter a atividade do aminoácido N-acetiltransferase.
[00860] Uma enzima tendo atividade de N-acetilserina desidrogenase é obtida através de evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para N-acetilserina e atividade de N-acetilserina desidrogenase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares à N- acetilserina. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: mmsB de Pseudomonas putida ou de Synechococcus PCC6301 ou de Bacillus cereus; hibdh de Pseudomonas putida E23; PA0743 de Pseudomonas aeruginosa; ydfG de Escherichia coli ou de Bacillus brevis ou de Bacillus subtilis; sdh de Agrobacterium tumefaciens; hibadh de Rattus norvegicus ou de Thermus thermophilus HB8; gldA de Escherichia coli ou de Leuconostoc citreum ou de Symbiobacterium thermophilum; yqhE de Escherichia coli; yafB de Escherichia coli; aladh de Enterobacter aerogenes; alr de Leishmania donovani; sakR1 de Synechococcus sp.; yhdN de Bacillus subtilis; ytbE de Bacillus subtilis; yiaY de Escherichia coli; AKR4C9 de Arabidopsis thaliana; fucO de Escherichia coli. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00861] Uma enzima tendo uma atividade de transaminase para converter N-acetilmalonato semialdeído em acetilaminopropanoato pode ser obtida através da evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para N-acetilmalonato semialdeído e atividade de N-acetilmalonato semialdeído transaminase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares a N- acetilmalonato semialdeído. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: serC de Escherichia coli ou de Bacillus subtilis ou de Corynebacterium glutamicum; GOT1 de Sus scrofa; patA de Escherichia coli; ygjG de Brucella canis; rocD de Rhizobium NGR 234 ou de Streptomyces avermitilis; 2SCG18.31c de Streptomyces coelicolor; AGT ou AGT2 ou AGT3 ou GGT1 de Arabidopsis thaliana; AGXT de Bos Taurus. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00862] Preferivelmente o gene argE de Escherichia coli é usado para obter a atividade desacetilase para converter acetilaminopropanoato em 2,3-diaminopropanoato.
[00863] Uma enzima tendo atividade de aminoácido descarboxilase ou atividade de ceto ácido descarboxilase para converter 2,3- diaminopropanoato em etilenodiamina pode ser obtida através da evolução de enzimas a fim de modificar sua especificidade de substrato e/ou sua eficiência catalítica para obter uma enzima que exibe especificidade para 2,3-diaminopropanoato e atividade de aminoácido descarboxilase ou ceto ácido descarboxilase. Essas enzimas são selecionadas dentre o grupo de enzimas tendo o mesmo tipo de atividade catalítica em substratos quimicamente similares ao 2,3- diaminopropanoato. Essas enzimas são codificadas por genes escolhidos dentre uma lista de genes bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos, genes listados aqui: sdc de Arabidopsis thaliana; padC ou yclB de Bacillus subtilis; ubiD de Campylobacter jejuni ou de Escherichia coli; PAD1 ou GAD1 ou SPE1 de Saccharomyces cerevisiae; panD de Aquifex aeolicus ou de Bacillus subtilis; GAD ou GAD2 ou GAD3 ou GAD4 ou GAD5 de Arabidopsis thaliana; GAD ou GAD2 ou OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; gadA ou gadB ou panD ou speC ou speF de Escherichia coli; SCC105.13 de Streptomyces coelicolor; gadB de Mannheimia succiniciproducens; bdb de Haloferax volcanii; odc1 de Lactobacillus sp.; kivD de Lactococcus lactis subsp. Lactis; kdcA de Lactococcus lactis; OAZ1 ou ODC1 de Bos Taurus; speC ou speF de Escherichia coli; SPE1 de Saccharomyces cerevisiae. Qualquer polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos codificados por esses genes pode ser usado.
[00864] Em uma modalidade adicional da invenção, o método é realizado com um micro-organismo em que a biossíntese de serina é otimizada. Essa otimização é revelada em particular no pedido de patente WO 2007/144346, que é aqui incorporado a título de referência.
[00865] Alternativamente, em uma outra modalidade, EDA pode ser produzido através do processo que segue: Ser pode ser diretamente aminado em (S)-2,3-diaminopropanoato por serina aminase (EC 2.6.1.), então descarboxilado em EDA, por exemplo, por uma enzima da família de L-2,4-diaminobutirato ou ornitina descarboxilases (FIG. 7). No entanto, se essa enzima com atividade (S)-2,3-diaminopropanoato descarboxilase não for específica, ela também pode atuar sobre outros aminoácidos ou a própria serina.
[00866] Em algumas modalidades, EDA pode ser produzido através do processo que segue: o intermediário (S)-2,3-diaminopropanoato também pode ser produzido por aminação direta de piruvato usando (S)- 2,3-diaminopropanoato amônia liase (EC 4.3.1.15) (FIG. 7) 2,3-diaminopropanoato + H2O θ 2 NH3 + piruvato
[00867] Em algumas modalidades, a produção de MEG e EDA está muito perto do potencial de rendimento máximo termodinâmico usando a conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido pela conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em intermediários glicolaldeído e D- gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e então seguido pela coprodução de MEG por meio da redução de glicolaldeído e EDA por meio de uma via ou mais vias C3 do G3P intermediário. Em algumas modalidades, o potencial de rendimento termodinâmico é 14% melhor para coprodução de MEG e EDA por meio das vias descritas no presente pedido comparado com a produção de EDA feita a partir de glicose por vias naturais ou similares publicadas. Coprodução: (pentose ou hexose) +2 NH3 -> MEG + EDA +0 ATP * Y (via) = (0,337 + 0,326) g/g = 0,663 g (MEG + EDA)/g ((pentose ou hexose) + 2NH3), 97% de Y (max) (calor de combustão) = 0,687 g/g Via padrão: glicose +4 NH3 -> 2 EDA +2 NADH +0 ATP Y (via) = 0,484 g (EDA)/g (glicose + 4NH3), 85% de Y (max) (calor de combustão) = 0,571 g/g
[00868] * Transporte passivo ou de simporte H+ de D-xilose, uma pentose, é presumido. Consumo indireto de ATP para um simportador H+ ou ATP necessário para manutenção celular não é contabilizado.
[00869] [CC] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente modalidade [D]) e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2 , expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (b): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de serina aminase que catalisa a conversão de L-serina em (S)-2,3-diaminopropanoato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de (S)-2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de (S)-2,3- diaminopropanoato de (a) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00870] [DD] Em uma modalidade, o pedido se refere a um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [A], da modalidade [B] ou da modalidade [C] (e compreendendo opcionalmente modalidade [D]), e tendo adicionalmente modalidade [E] para produção de MEG em uma via C2, expressa ainda um ou mais dos que seguem de (a) a (b): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de (S)-2,3- diaminopropanoato amônia liase que catalisa a conversão de piruvato e amônio em (S)-2,3-diaminopropanoato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de (S)-2,3-diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de (S)-2,3-diaminopropanoato de (a) em EDA; em que G3P é convertido em piruvato por meio da glicólise endógena no micro-organismo recombinante e em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00871] Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase é usada para converter piruvato e amônio em (S)-2,3-diaminopropanoato. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com ygeX 2,3-diaminopropionato amônia-liase de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase é ygeX de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2,3-diaminopropionato amônia-liase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada em UniProt ID P66899. Em outras modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima tendo atividade de 2,3- diaminopropionato amônia-liase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada em Gene ID 947012.
[00872] Em uma modalidade de qualquer aspecto revelado acima, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas a partir de um micro-organismo selecionado de E. coli e S. cerevisiae. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são selecionadas de gldA, GRE2, GRE3, yqhD, ydjG, fucO, yafB (dkgB) e/ou yqhE (dkgA) ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são yqhD. Em algumas modalidades, o yqhD compreende uma mutação G149E. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 20, 23, 25, 28, 30 e 32. Em ainda uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 26, 27, 29 e 31.
[00873] Em uma modalidade de qualquer aspecto revelado acima, a enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium sp., Bacillus sp., E. coli, Saccharomyces sp. e Marinobacter sp. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosaccharolyticum, Bacillus cereus, E. coli, Saccharomyces cerevisiae e Marinobacter hydrocarbonoclasticus. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico são thlA, atoB e/ou ERG10 ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 35, 37 e 40. Em ainda uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33, 34, 36, 38 e 39.
[00874] Em uma modalidade de qualquer aspecto revelado acima, a enzima tendo atividade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado de Clostridium sp. e E. coli. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de E. coli. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase é atoA e/ou atoD ou seu homólogo. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de acetil-CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de Clostridium acetobutylicum. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é ctfA e/ou ctfB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 43, 46, 97, 99, 101 e 103 . Em ainda uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 41, 42, 44, 45 , 96, 98, 100 e 102.
[00875] Em uma modalidade de qualquer aspecto revelado acima, a enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium sp., Bacillus sp., Chromobacterium sp. e Pseudomonas sp. Em uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase é codificada por uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico obtidas de um micro-organismo selecionado do grupo consistindo em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa, Chromobacterium violaceum e Pseudomonas putida. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase é adc ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 49 e 52. Em ainda uma outra modalidade, a enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada de o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51.
[00876] [EE] Em outra modalidade, o micro-organismo recombinante selecionado da modalidade [D] ou modalidade [E], compreende opcionalmente ainda uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando um glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído em monoetilenoglicol (MEG); (ii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e (iii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma lactato desidrogenase que catalisa a conversão de piruvato em lactato.
[00877] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante que produz ácido glicólico compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase para evitar a conversão de glicolaldeído em monoetilenoglicol (MEG) e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de glicolaldeído em ácido glicólico (GA). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada pelo gene fucO ou seu homólogo.
[00878] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante que produz MEG (ou ácido glicólico) ou, MEG e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase para evitar a produção de ácido glicólico de glicolaldeído e, em vez disso, desviar a reação em direção à conversão de glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é codificada pelo gene aldA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase é parcial, em que alguma função da glicolaldeído desidrogenase ainda está presente e uma quantidade de ácido glicólico ainda é produzida.
[00879] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante que produz MEG (ou ácido glicólico) ou, opcionalmente, MEG (ou ácido glicólico) e um ou mais coprodutos, compreende uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma lactato desidrogenase para prevenir a produção de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desviar a reação para produção de um ou mais coprodutos. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene ldhA ou seu homólogo.
[00880] Combinações não limitantes de qualquer uma das modalidades de micro-organismos recombinantes e métodos descritos aqui são incluídas como parte da presente invenção.
Micro-organismo Recombinante
[00881] A invenção provê micro-organismos que podem ser engenheirados para expressar várias enzimas endógenas ou exógenas.
[00882] Em várias modalidades descritas aqui, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo eucariótico. Em algumas modalidades, o micro-organismo eucariótico é uma levedura. Em modalidades exemplares, a levedura é um membro de um gênero selecionado do grupo consistindo em Yarrowia, Candida, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Pachysolen, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula e Myxozyma.
[00883] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo procariótico. Em modalidades exemplares, o micro-organismo procariótico é um membro de um gênero selecionado do grupo consistindo em Escherichia, Clostridium, Zymomonas, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterim e Brevibacterium.
[00884] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é usado para produzir monoetilenoglicol (MEG) ou ácido glicólico (GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, aqui descritos.
[00885] Deste modo, em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de produção de MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos, usando um micro-organismo recombinante descrito aqui. Em uma modalidade, o método compreende cultivo do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo uma matéria-prima que fornece uma fonte de carbono até que MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos, seja produzido. Em uma modalidade adicional, o MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos, é recuperado. A recuperação pode ser através de métodos conhecidos na técnica tais como destilação, separação de gás com base em membrana, extração com solvente e adsorção em leito expandido.
[00886] Em algumas modalidades, a matéria-prima compreende uma fonte de carbono. Em várias modalidades descritas aqui, a fonte de carbono pode ser selecionada de açúcares, glicerol, álcoois, ácidos orgânicos, alcanos, ácidos graxos, lignocelulose, proteínas, dióxido de carbono e monóxido de carbono. Em uma modalidade exemplar, a fonte de carbono é um açúcar. Em algumas modalidades, o açúcar compreende um açúcar ou mais açúcar pentose e/ou hexose. Em outras modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos de monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos. Em modalidade exemplar adicional, o açúcar é glicose ou oligômeros de glicose do mesmo. Em outras modalidades, os oligômeros de glicose são selecionados de frutose, sacarose, amido, celobiose, maltose, lactose e celulose. Em ainda modalidades adicionais, os açúcares compreendem D-xilose, D-galactose, D- manose, D-arabinose, L-arabinose, D-frutose ou uma combinação dos mesmos.
Métodos de produção de um micro-organismo recombinante que produz ou acumula MEG (ou ácido glicólico), ou MEG e um ou mais coprodutos
[00887] Em outro aspecto, a invenção provê um método de produção de um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído usando um micro-organismo recombinante de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende cultivo do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo um ou mais açúcares pentose e/ou hexose provendo uma fonte de carbono até que um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído sejam produzidos. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em modalidades adicionais, um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina (EDA) ou uma combinação dos mesmos. Em ainda modalidades adicionais, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA).
[00888] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método de produção de um micro-organismo recombinante que produz ou acumula um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário de pentose-fosfato, em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose- 5-fosfato, compreendendo: introduzir no ou expressar no microorganismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no intermediário de pentose- fosfato; introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão do intermediário D-ribose-5- fosfato em G3P e glicolaldeído; introduzir ou expressar no microorganismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais produtos a partir do glicolaldeído em uma via C2; e introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais produtos de G3P em uma via ou mais vias C3; e culturar o micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose para produzir ou acumular um ou mais produtos. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Em modalidades adicionais, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L- serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina (EDA) ou uma combinação dos mesmos. Em ainda modalidades adicionais, o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA). Em algumas modalidades, o glicolaldeído é oxidado para GA por um glicolaldeído desidrogenase.
[00889] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante que produz ou acumula um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário de pentose-fosfato, compreendendo: introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo uma atividade que converte um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em um intermediário de pentose-fosfato de conversão sem perdas e compreendendo pelo menos uma enzima tendo uma pentose- fosfato aldolase, em que a enzima tem atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade de D- xilulose-5-fosfato aldolase, que converte o intermediário D-ribose-5- fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P).
[00890] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 148 e 150. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktA ou seu homólogo. Em algumas modalidades, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é tktB ou seu homólogo. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 147 e 149. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com deoC de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase é deoC de E. coli.
[00891] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos enzima tendo atividade de transaldolase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de transaldolase é talB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 152 e 154. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de transaldolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 151 e 153.
[00892] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribulose- 5-fosfato 3-epimerase é rpe de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 157.
[00893] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5- fosfato isomerase é rpiA de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiB de E. coli. Em outras modalidades, a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é rpiB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificado por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 155.
[00894] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, uma atividade de ribose-5 -fosfato isomerase e uma atividade D-ribose-5-fosfato aldolase. Em outras modalidades, o método compreende ainda introduzir no microorganismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato mutase. Em algumas modalidades, a enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase endógena é gapA, a fosfoglicerato cinase é pgk e a fosfoglicerato mutase é gpmA ou gpmM.
[00895] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium dentium BDP_1006, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é selecionada do grupo consistindo em BDP_1006 de Bifidobacterium dentium, xfp de Bifidobacterium lactis, xpkA de Lactobacillus paraplantarum e xfp de Bifidobacterium breve. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 212, 214, 216 e 218. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 211, 213, 215 e 217.
[00896] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase. Em algumas modalidades, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 220 e 222. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOs: 219 e 221.
[00897] Em algumas modalidades, o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de frutose- 6-fosfato fosfocetolase, uma atividade de fosfato acetiltransferase, uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, atividade de ribose-5- fosfato isomerase e atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase. Em outras modalidades, o método compreende ainda introduzir no microorganismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em uma enzima 6-fosfofrutocinase endógena. Em algumas modalidades, a enzima 6-fosfofrutocinase endógena é pfkA e/ou pfkB.
[00898] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o método compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos uma enzima tendo atividade de xilose isomerase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylA de E. coli ou Pyromyces sp. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilose isomerase é selecionada de xylA de E. coli e xylA de Pyromyces sp. Em ainda uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 95 e 144. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a xilose isomerase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 93, 94 e 143. Em algumas modalidades, a pelo menos enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Em uma outra modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é xylB de E. coli. Em uma outra modalidade, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose 5-cinase compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade adicional, a uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando a D-xilulose A 5-cinase são codificadas por uma sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 145.
[00899] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o método compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante pelo menos enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase. Em uma modalidade, a pelo menos enzima tendo atividade de frutose 1,6- bisfosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com fbp de E. coli. Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é fbp de E. coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase converte D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato. Em outras modalidades, D-frutose é convertida em frutose 1,6-bisfosfato por enzimas endógenas no microorganismo recombinante.
[00900] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos acima, o método compreende ainda introduzir no micro-organismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato-1-desidrogenase, 6 -fosfogluconolactonase e 6- fosfogluconato desidrogenase. Em modalidades adicionais, a glicose 6- fosfato-1-desidrogenase é zwf, a 6-fosfogluconolactonase é pgl e a 6- fosfogluconato desidrogenase é gnd.
[00901] Em algumas modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do microorganismo recombinante. Em outras modalidades, o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos de monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos.
[00902] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase e a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase permite uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentoses e/ou hexose em intermediários de pentose-fosfato e a conversão subsequente de pentose-fosfato em G3P e glicolaldeído.
[00903] Em algumas modalidades, os métodos permitem a produção de MEG ou ácido glicólico (GA) através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em algumas modalidades, MEG é produzido através da redução de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade da glicolaldeído redutase em uma via C2. Em outras modalidades, GA é produzido através da oxidação de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade da glicolaldeído desidrogenase em uma via C2.
[00904] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de MEG ou GA é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato redutase, uma atividade de glicolaldeído redutase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de glicerato descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase e uma atividade de glioxilato redutase.
[00905] Em algumas modalidades, os métodos permitem a produção de MEG através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Em outras modalidades, o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e um ou mais compostos da via da serina. Em algumas modalidades preferidas, o um composto ou mais compostos da via da serina são selecionados de serina, glicina, monoetanolamina (MEA) e etilenodiamina (EDA).
[00906] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase e uma atividade de acetoacetato descarboxilase e o um ou mais coprodutos compreendem acetona.
[00907] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase e uma atividade de álcool desidrogenase secundária e o um ou mais coprodutos compreendem isopropanol.
[00908] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de álcool desidrogenase secundária e uma atividade de desidratase, e o um ou mais coprodutos compreendem propeno.
[00909] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil- coenzima A acetiltransferase, uma acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase atividade, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase, uma atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase, uma atividade de metilglutaconil-CoA hidratase, uma atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase, uma atividade de metilcrotonil-CoA hidratase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato-CoA tioesterase, uma atividade de 3HIV cinase, uma atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase e uma atividade de 3HIV descarboxilase, e o um coproduto ou mais coproduto compreendem isobuteno.
[00910] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de hidroxipiruvato, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3- cinase e uma atividade de glicerato 2-cinase, e o um ou mais coprodutos compreendem L-serina.
[00911] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de transferase, uma atividade de formaldeído desidrogenase, uma atividade de formato desidrogenase, uma atividade associada com o sistema de clivagem de glicina, uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de glicolato desidrogenase, uma atividade de alanina-glioxilato aminotransferase, uma atividade de alanina transaminase, uma atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H e o um ou mais coprodutos compreendem glicina. Em uma outra modalidade, a atividade associada ao sistema de clivagem de glicina compreende uma enzima ou proteína selecionada de uma glicina descarboxilase (proteína P), uma aminometiltransferase (proteína T), uma di-hidrolipoamida desidrogenase (proteína L) e uma proteína H.
[00912] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3 -fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de 3-fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de acetaldeído desidrogenase e uma atividade de etanolamina amônia liase e um ou mais coprodutos compreendem monoetanolamina (MEA).
[00913] Em algumas modalidades, a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina desidrogenase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase, uma atividade de aminoacetaldeído transaminase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase, uma atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina desidrogenase, uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de aldeído oxidase, uma atividade de N-acetil transferase ou atividade de O-acetil transferase, uma atividade de N-acetilserina desidrogenase, uma atividade de transaminase, uma atividade de desacetilase, uma atividade de serina aminase e uma atividade de 2,3-diaminopropanoato amônia liase, e o um ou mais coprodutos compreendem etilenodiamina (EDA).
[00914] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos acima, o método compreende ainda a introdução no microorganismo recombinante de uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em um glicolaldeído redutase, uma glicolaldeído desidrogenase, uma lactato desidrogenase ou uma combinação das mesmas.
[00915] Em uma modalidade, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2. Em uma outra modalidade, pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada para produzir ATP.
[00916] Em uma modalidade, formação de biomassa em excesso é minimizada e produção de MEG ou ácido glicólico ou MEG e um ou mais coprodutos é maximizada.
[00917] Açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose- fosfato e conversão subsequente de intermediário de pentose-fosfato em glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato
[00918] Na presente invenção, açúcares pentose e/ou hexose são convertidos em pentose-fosfato, um intermediário da via da pentose fosfato não oxidativa, em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato. O intermediário de pentose-fosfato serve então como um substrato para uma pentose-fosfato aldolase, em que a aldolase tem atividade de D- ribose-5-fosfato aldolase, atividade de D-ribulose-5-fosfato aldolase ou atividade de D-xilulose-5-fosfato aldolase para produzir glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato, compostos que podem então ser convertidos mais em MEG ou GA, ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00919] [mA] Portanto, em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) através de um intermediário de pentose-fosfato de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (h): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transcetolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D-gliceraldeído-3- fosfato em D-eritrose-4-fosfato e D- xilulose-5-fosfato, respectivamente, e/ou que catalisa uma conversão reversível de D-gliceraldeído-3-fosfato de (b) e D-sedoeptulose-7-fosfato de (b) para D-ribose-5-fosfato e D- xilulose-5-fosfato, respectivamente; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transaldolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D-eritrose-4-fosfato de (a) para D-gliceraldeído-3- fosfato e D-sedoeptulose-7-fosfato, respectivamente; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase que catalisa uma interconversão de D-xilulose-5-fosfato de (a) e/ou (f) e D- ribulose-5-fosfato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase que catalisa uma interconversão de D-ribulose-5-fosfato de (c) e D- ribose-5-fosfato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase que catalisa a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribose-5-fosfato de (a) e/ou (d) em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato; em que o método compreende opcionalmente ainda introdução de uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, uma fosfoglicerato cinase e/ou uma fosfoglicerato mutase; em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via de pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante, e em que glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) são produzidos.
[00920] [mB] Em outra modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) por meio de um intermediário de pentose-fosfato de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método compreende introduzir ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (j): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6- fosfato em D-eritrose-4-fosfato e acetil-fosfato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase que catalisa uma conversão reversível de acetil-fosfato de (a) em acetil-CoA; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transaldolase que catalisa uma conversão reversível de D-frutose-6-fosfato e D-eritrose-4-fosfato de (a) em D-gliceraldeído-3- fosfato e D-sedoeptulose-7-fosfato, respectivamente; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transcetolase que catalisa uma conversão reversível de D-gliceraldeído-3-fosfato de (c) e D- sedoeptulose-7-fosfato de (c) em D-ribose-5-fosfato e D-xilulose-5- fosfato, respectivamente; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase que catalisa uma interconversão de D-xilulose-5-fosfato de (d) e/ou (h) e D- ribulose-5-fosfato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase que catalisa uma interconversão de D-ribulose-5-fosfato de (e) e D- ribose-5-fosfato; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilose isomerase que catalisa a conversão de D-xilose em D-xilulose; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase que catalisa a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bifosfatase que catalisa a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6-fosfato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase que catalisa a conversão de D-ribose-5-fosfato de (d) e/ou (f) em glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato; em que o método compreende opcionalmente ainda introdução de uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfofrutocinase; em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante, em que o acetil-CoA produzido na etapa (b) pode ser usado para produzir um produto ou mais coprodutos selecionados de ácido glicólico, acetona, isopropanol, propeno, isobuteno e um ou mais compostos da via da serina; e em que glicolaldeído e D-gliceraldeído 3-fosfato (G3P) são produzidos.
[00921] Em algumas modalidades, o ramo oxidativo da via da pentose fosfato é excluído ou inativado para otimizar o fluxo de açúcares em direção à entrada não oxidativa na via da pentose fosfato.
[00922] [mC] Portanto, em uma modalidade, o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] compreende ainda opcionalmente introdução de uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicose 6-fosfato-1-desidrogenase que catalisa a conversão de glicose-6-fosfato em 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona; (ii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconolactonase que catalisa a conversão de 6-fosfo-D-glucono-1,5-lactona em gluconato-6-fosfato; e (iii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma 6-fosfogluconato desidrogenase que catalisa a conversão de gluconato-6-fosfato em D-ribulose-5-fosfato. Vias de produção de MEG ou ácido glicólico ou MEG e coproduto
[00923] Em algumas modalidades, os intermediários glicolaldeído e gliceraldeído-3-fosfato produzidos a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]) são usados em vias de produção de C2 de MEG (ou ácido glicólico) conhecidas, que são acoplados às vias C3, como descrito abaixo, para coproduzir mais MEG (ou ácido glicólico) e/ou um ou mais coprodutos.
[00924] Em algumas modalidades, MEG é produzido por meio de uma via C2 que usa uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase para converter glicolaldeído em MEG. Em uma outra modalidade, ácido glicólico (GA) é produzido por meio de uma via C2 que usa uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase para oxidar glicolaldeído em GA.
[00925] [mD] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído em MEG, em que o microorganismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase, e em que MEG é produzido.
[00926] [mE] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir ácido glicólico (GA) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante: pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em GA, em que o microorganismo recombinante compreende opcionalmente ainda uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando um glicolaldeído redutase, e em que GA é produzido.
Produção de MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C2 e MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C3
[00927] Em um aspecto, MEG (ou ácido glicólico) é produzido a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose pela transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e G3P, seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG (ou ácido glicólico) por meio de uma via C2 e uma conversão de G3P em MEG (ou ácido glicólico) por uma via C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00928] Em algumas modalidades, o pedido se refere a um método de produção de micro-organismo combinante capaz de produzir MEG (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] ou modalidade [mE] para a produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, compreende ainda uma via ou mais vias de biossíntese C3 para a produção de MEG (ou ácido glicólico).
[00929] [mK] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] ou modalidade [mE] para produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (h): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (b) em L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou serina oxidase que catalisa a conversão de L-serina de (d) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) ou (e) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em MEG; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em ácido glicólico; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo recombinante, e em que o MEG (ou ácido glicólico) é produzido.
[00930] [mL] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de produzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] ou modalidade [mE] para produção de MEG (ou ácido glicólico) em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (j): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase ou uma enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase ou uma enzima tendo atividade de serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de etanolamina de (e) em glicolaldeído; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicerato descarboxilase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em MEG; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em MEG; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em ácido glicólico; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo recombinante, e em que MEG (ou ácido glicólico) é produzido.
[00931] Em outro aspecto, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em um ou mais coprodutos por meio de uma via C3.
Coprodução de MEG através de uma via C2 e acetona, isopropanol, propeno e/ou isobuteno através de uma via C3
[00932] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2, e uma conversão do intermediário G3P em acetona por meio de uma via C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5- fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00933] [mM] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e acetona a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no microorganismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou uma enzima tendo atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (a) em acetoacetato ; e/ou (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (b) em acetona; em que o intermediário G3P produzido da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG (ou ácido glicólico) e acetona são coproduzidos.
[00934] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2, e uma conversão do intermediário G3P em isobuteno por meio de uma via C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5- fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00935] [mN] Em algumas modalidades, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e isobuteno a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o método da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no microorganismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (d): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetil- CoA:acetoacetato-CoA transferase ou uma enzima tendo atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (a) em acetoacetato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetoacetato descarboxilase que catalisa a conversão de acetoacetato de (b) em acetona; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-hidróxi- isovalerato sintase que catalisa a conversão de acetona de (c) e acetil- CoA em 3-hidróxi-isovalerato (3HIV); ou em que o método compreende introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (e) a (j): (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroximetilglutaril- CoA sintase que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA de (e) e acetil- CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA); (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilglutaconil- CoA hidratase que catalisa a conversão de HMG-CoA de (f) em 3- metilglutaconil-CoA; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilcrotonil- CoA carboxilase que catalisa a conversão de 3-metilglutaconil-CoA de (g) em 3-metilcrotonil-CoA; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de metilcrotonil-CoA hidratase que catalisa a conversão de 3-metilcrotonil-CoA de (h) em 3- hidroxiisovaleril-CoA; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-hidroxiisovaleril- CoA tioesterase que catalisa a conversão de 3-hidroxiisovaleril-CoA de (i) em 3HIV; em que o método compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante (a1) e (a2) e/ou (b1) selecionado de: (k) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3HIV cinase que catalisa a conversão de 3HIV de (d) ou (j) em 3HIV-3-fosfato; (l) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase que catalisa a conversão de 3HIV-3-fosfato de (a1) em isobuteno; (m) ) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de descarboxilase 3HIV que catalisa a conversão de 3HIV de (d) ou (j) em isobuteno; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e isobuteno são coproduzidos.
[00936] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário D-ribose-5-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão de intermediário G3P em isopropanol por meio de uma via C3.
[00937] [mO] Em uma modalidade, os métodos das modalidades [mM] e/ou [mN] (compreendendo opcionalmente modalidade [mEE]), compreende opcionalmente ainda introdução no ou expressão no micro-organismo recombinante de pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de álcool desidrogenase secundária que catalisa a conversão de acetona em isopropanol.
[00938] Em algumas modalidades, MEG é produzido a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2, e uma conversão do intermediário G3P em propeno por meio de uma via C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5- fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00939] [mP] Em uma outra modalidade, o método da modalidade [mO] (compreendendo opcionalmente modalidade [mEE]), compreende opcionalmente ainda pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de desidratase que catalisa a conversão de isopropanol em propeno.
Coprodução de MEG por meio de uma via C2 e um ou mais compostos da via serina por meio de uma via C3
[00940] Em algumas modalidades, MEG e L-serina são coproduzidos a partir de transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em glicolaldeído e intermediários D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em L-serina por meio de uma via ou mais vias C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00941] [mQ] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e L-serina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2 compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (h): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (d) em L-serina; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (b) e/ou (c) em hidroxipiruvato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (e) e/ou (g) em L-serina; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e L-serina são produzidos.
[00942] Em algumas modalidades, MEG e glicina são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em glicina por meio de uma via ou mais vias C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00943] [mR] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (e): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase que catalisa a conversão de L-serina e tetraidrofolato (THF) em glicina e 5,10-metileno tetraidrofolato (M-THF); (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de transferase que catalisa a conversão de M-THF de (a) em formaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de formaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de formaldeído de (b) em formato e NADH; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de formato desidrogenase que catalisa a conversão de formato de (c) em CO2 e NADH; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma proteína do sistema de clivagem de glicina que catalisa a conversão de M-THF de (a), CO2, NH3 e NADH de (c) ou (d) em glicina e THF; em que THF é reconstituído a partir das etapas (b) a (e), em que opcionalmente o formato de (c) é ainda oxidado em CO2 e H2 por um complexo de formato de hidrogenilase, e em que MEG e glicina são produzidos.
[00944] [mS] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (k): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (b) em L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina transaminase ou serina oxidase que catalisa a conversão de L-serina de (d) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) ou (e) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) em ácido glicólico; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolato desidrogenase que catalisa a conversão de ácido glicólico de (g) em glioxilato; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase que catalisa a conversão de glioxilato de (h) e alanina em glicina e piruvato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase que catalisa a conversão de piruvato de (i) e glutamato em alanina e 2-oxoglutarato; (k) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H que catalisa a conversão de 2- oxoglutarato de (j) e amônia em glutamato; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, em que alanina e glutamato são reconstituídos a partir das etapas (j) e (k), e em que MEG e glicina são coproduzidos.
[00945] [mT] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e glicina a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o micro-organismo recombinante da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (l): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina aminotransferase ou serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de L-serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina aminotransferase ou uma enzima tendo atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de etanolamina de (e) em glicolaldeído; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (f) e/ou (g) em ácido glicólico; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade glicolato desidrogenase que catalisa a conversão de ácido glicólico de (g) em glioxilato; (j) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina-glioxilato aminotransferase que catalisa a conversão de glioxilato de (i) e alanina em glicina e piruvato; (k) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de alanina transaminase que catalisa a conversão de piruvato de (j) e glutamato em alanina e 2-oxoglutarato; (l) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H que catalisa a conversão de 2- oxoglutarato de (k) e amônia em glutamato; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, em que alanina e glutamato são reconstituídos a partir das etapas (k) e (l), e em que MEG e glicina são coproduzidos.
[00946] Em algumas modalidades, MEG e MEA são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em MEA por meio de uma via ou mais vias C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato. [mU] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (i): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em 3-fosfo- hidroxipiruvato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou enzima tendo atividade de glicerato 3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato 2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina aminotransferase que catalisa a conversão de 3-fosfoidroxipiruvato de (a) em fosfo-L-serina; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase que catalisa a conversão de 3-fosfo- hidroxipiruvato de (a) em hidroxipiruvato; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de fosfoserina fosfatase que catalisa a conversão de fosfo-L-serina de (d) em L-serina; (g) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (b) e/ou (c) em hidroxipiruvato; (h) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (e) e/ou (g) em L-serina; (i) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina de (f) e/ou (h) em MEA; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00947] [mV] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (f): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase e/ou uma enzima tendo atividade de glicerato-2-cinase que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em glicerato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase e/ou enzima tendo atividade de glicerato-3-cinase que catalisa a conversão de 3-fosfoglicerato em glicerato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato redutase que catalisa a conversão de glicerato de (a) e/ou (b) em hidroxipiruvato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina-piruvato aminotransferase ou serina oxidorredutase (desaminação) que catalisa a conversão de L-serina em hidroxipiruvato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de hidroxipiruvato descarboxilase que catalisa a conversão de hidroxipiruvato de (c) e/ou (d) em glicolaldeído; (f) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade transaminase que catalisa a conversão de glicolaldeído de (e) em MEA; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em 3- fosfoglicerato e/ou 2-fosfoglicerato através de glicólise endógena no micro-organismo, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00948] [mW] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e MEA a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (b): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de acetaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de acetil-CoA em acetaldeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina amônia liase que catalisa a conversão de acetaldeído e amônia em MEA; em que o intermediário G3P produzido a partir da modalidade [mA] ou da modalidade [mB] é convertido em acetil-CoA através de glicólise endógena no micro-organismo recombinante, e em que MEG e MEA são coproduzidos.
[00949] Em algumas modalidades, MEG e EDA são coproduzidos a partir da transformação sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose-fosfato, seguido por uma conversão do intermediário de pentose-fosfato em intermediários glicolaldeído e D-gliceraldeído-3-fosfato (G3P), seguido por uma conversão do intermediário glicolaldeído em MEG por meio de uma via C2 e uma conversão do intermediário G3P em EDA por meio de uma via ou mais vias C3. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00950] [mX] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introduzir no ou expressar no recombinante micro-organismo um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina desidrogenase que catalisa a conversão de L-serina em 2- aminomalonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2- aminomalonato semialdeído descarboxilase que catalisa a conversão de 2-aminomalonato semialdeído de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que o 2-aminomalonato semialdeído pode ser opcionalmente convertido em aminoacetaldeído por uma reação espontânea, e em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00951] [mY] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda a introdução no ou expressão no microorganismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina desidrogenase que catalisa a conversão de L-serina em 2- aminomalonato semialdeído; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2- aminomalonato semialdeído transaminase que catalisa a conversão de 2-aminomalonato semialdeído de (a) em 2,3-diaminopropanoato; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de 2,3- diaminopropanoato de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00952] [mZ] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introdução no ou expressão no micro-organismo recombinante de um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina descarboxilase que catalisa a conversão de L-serina em etanolamina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de etanolamina desidrogenase que catalisa a conversão de etanolamina de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00953] [mAA] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introdução no ou expressão no micro-organismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (c): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de serina hidroximetiltransferase que catalisa a conversão de L-serina em glicina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aldeído oxidase que catalisa a conversão de glicina de (a) em aminoacetaldeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de aminoacetaldeído transaminase que catalisa a conversão de aminoacetaldeído de (b) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00954] [mBB] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda introdução no ou expressão no micro-organismo recombinante de um ou mais dos que seguem de (a) a (e): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de aminoácido N-acetil transferase ou atividade de O-acetil transferase que catalisa a conversão de L-serina em N-acetilserina; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de N-acetilserina desidrogenase que catalisa a conversão de N-acetilserina de (a) em N- acetilmalonato semialdeído; (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade transaminase que catalisa a conversão de N-acetilmalonato semialdeído de (b) em acetilaminopropanoato; (d) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade desacetilase que catalisa a conversão de acetilaminopropanoato de (c) em 2,3- diaminopropanoato; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de 2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de 2,3- diaminopropanoato de (d) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00955] [mCC] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda a introdução no ou expressão no microorganismo recombinante de um ou mais dos que seguem de (a) a (b): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de serina aminase que catalisa a conversão de L-serina em (S)-2,3- diaminopropanoato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de (S)-2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de (S)-2,3- diaminopropanoato de (a) em EDA; em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00956] [mDD] Em uma modalidade, o pedido se refere a um método de produção de um micro-organismo recombinante capaz de coproduzir monoetilenoglicol (MEG) (ou ácido glicólico) e etilenodiamina (EDA), a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose e uma fonte de nitrogênio, em que o método da modalidade [mA] ou modalidade [mB] (e compreendendo opcionalmente modalidade [mC]), e tendo adicionalmente modalidade [mD] para produção de MEG em uma via C2, compreende ainda a introdução no ou expressão no microorganismo recombinante um ou mais dos que seguem de (a) a (b): (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo uma atividade de (S)-2,3- diaminopropanoato amônia liase que catalisa a conversão de piruvato e amônio em (S)-2,3-diaminopropanoato; (b) pelo menos uma molécula de ácido nucleico endógena ou exógena codificando uma enzima tendo atividade de (S)-2,3- diaminopropanoato descarboxilase que catalisa a conversão de (S)-2,3- diaminopropanoato de (a) em EDA; em que G3P é convertido em piruvato por meio de glicólise endógena no micro-organismo recombinante e em que MEG e EDA são coproduzidos.
[00957] [mEE] Em uma outra modalidade, o método da modalidade [mD] ou modalidade [mE] compreende ainda opcionalmentea introdução de uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando um glicolaldeído redutase que catalisa a conversão de glicolaldeído em monoetilenoglicol (MEG); (ii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma glicolaldeído desidrogenase que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico; e (iii) uma mutação de deleção, inserção ou perda de função em um gene codificando uma lactato desidrogenase que catalisa a conversão de piruvato em lactato.
Engenharia de Enzima
[00958] As enzimas no micro-organismo recombinante podem ser engenheiradas para melhorar um ou mais aspectos do substrato para conversão de produto. Exemplos não limitantes de enzimas que podem ser engenheiradas adicionalmente para uso em métodos da invenção incluem uma D-ribose-5-fosfato aldolase, uma transcetolase, uma transaldolase, uma aldeído redutase, uma acetoacetil coenzima A hidrolase, uma xilose isomerase, uma 3-fosfoglicerato-desidrogenase, um fosfoserina aminotransferase, uma 3-fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma fosfoserina fosfatase, uma serina transaminase, uma hidroxipiruvato descarboxilase, uma 3-fosfoidroxipiruvato redutase, uma glicoaldeído desidrogenase, uma serina oxidorredutase (desaminação) ou serina-piruvato aminotransferase, um serina descarboxilase, uma etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma glicerato descarboxilase, uma hidroxipiruvato redutase, uma 3-fosfoglicerato fosfatase, uma 2-fosfoglicerato fosfatase, uma glicerato 3-cinase, uma glicerato 2-cinse, uma mevalonato difosfato descarboxilase e suas combinações. Essas enzimas podem ser engenheiradas para atividade catalítica melhorada, seletividade melhorada, estabilidade melhorada, tolerância a várias condições de fermentação melhorada (temperatura, pH, etc.) ou tolerância a vários substratos metabólicos melhorada, produtos, subprodutos, intermediários, etc. O termo "atividade catalítica melhorada" como usado aqui com relação a uma atividade de enzima particular se refere a um nível mais alto de atividade de enzima do que aquele medido em relação a uma enzima não engenheiradas comparável.
[00959] Evolução direcionada é um termo usado para descrever toda a gama de técnicas de biologia molecular que permitem que processos evolutivos naturais sejam imitados no laboratório. Para enzimas, isso geralmente envolve a mutagênese aleatória de um ou mais genes de partida, seguido por uma etapa de triagem ou seleção para isolar ou enriquecer variantes enzimáticas com melhorias em uma ou mais propriedades desejáveis. O processo pode ser iterado até que o nível desejado de mudança seja alcançado ou até que nenhuma mudança adicional seja elicitada. Uma ampla gama de ferramentas e técnicas foi desenvolvida durante mais de duas décadas para encurtar o processo dos milhões de anos levados pela natureza para apenas semanas ou meses no laboratório. As estratégias mais comuns imitam os mecanismos de evolução que ocorrem na natureza, tal como PCR propensa a erros (epPCR), que introduz mutações pontuais aleatórias em uma população de produtos de DNA, e técnicas de embaralhamento DNA, que permitem recombinação aleatória tipicamente entre genes pais com > 70% de homologia. Técnicas posteriores acessaram uma gama mais ampla de aminoácidos através de de saturação ou mutagênese de cassete direcionada a sítios pré-escolhidos ou em sítios distribuídos aleatoriamente, e permitiram a recombinação aleatória de genes não homólogos. Técnicas adicionais podem criar inserções e deleções aleatórias de códons, embaralhar domínios ou exons, ou regiões de loop, e produzir uma biblioteca de truncamentos aleatórios.
[00960] Por exemplo, métodos de engenharia têm sido usados para alterar a estabilidade, especificidade de substrato e estereoespecificidade de aldolases para produzir enzimas excelentes para processos biocatalíticos. A termoestabilidade e tolerância a solvente da frutose-1,6-bisfosfato aldolase (FBP-aldolase) foram aumentadas usando embaralhamento do DNA familiar dos genes fda de Escherichia coli e Edwardsiella ictaluri. Uma variante de quarta geração foi identificada, a qual exibiu uma meia-vida média 280 vezes maior a 53 ° C do que qualquer um dos pais. A mesma variante também exibiu atividade aumentada em vários solventes orgânicos polares e não polares (Hao e Berry, 2004. Protein Eng Des Sel 17:689-697).
[00961] Como um outro exemplo, acetoacetil coenzima A hidrolase pode converter acetoacetil-CoA em acetoacetato. No entanto, a hidrolase é não específica pelo fato de que ela também reage com a mesma magnitude de ordem com acetil-CoA, que é o substrato necessário para formação de acetoacetil-CoA pela enzima tiolase. Assim, para criar acetoacetil-CoA hidrolases mais eficientes, essas enzimas foram engenheiradas para ter atividade pelo menos 10x maior para o substrato de acetoacetil-CoA do que para o substrato de acetil- CoA, substituindo vários resíduos de ácido glutâmico na subunidade beta da enzima que é importante para catálise (WO 2015/042588).
[00962] Como um outro exemplo, a enzima YqhD de E. coli é um aldeído redutase de substrato amplo com atividade de redutase dependente de NADPH para mais de 10 substratos de aldeído e é uma enzima útil para produzir combustíveis e produtos químicos biorrenováveis (Jarboe, 2010. Applied Microbiology and Biotechnology, 89:249). Embora a atividade da enzima YqhD seja benéfica por meio de sua eliminação de aldeídos tóxicos, a enzima é também dependente de NADPH e contribui para depleção de NADPH e inibição de crescimento de organismos. A PCR propensa a erros de YqhD foi realizada a fim de melhorar a produção de 1,3-propanodiol a partir de 3- hidroxipropionaldeído (3-HPA). Esta engenharia direcionada produziu dois mutantes, D99QN147H e Q202A, com Km diminuído e kcat aumentado para certos aldeídos, particularmente 3-HPA (Li e outros 2008, Prog. Nat. Sci. 18(12): 1519-1524). A atividade catalítica melhorada do mutante D99QN147H está de acordo com o que é conhecido sobre a estrutura de YqhD (Sulzenbacher e outros, 2004. J. Mol. Biol. 342(2):489-502), uma vez que ambos resíduos Asp99 e Asn147 interagem com NADPH. O uso do mutante D99QN147H aumentou a produção de 1,3-propanodiol de 3-HPA 2 vezes. As enzimas YqhD mutantes com eficiência catalítica aumentada (Kcat/Km aumentada) em relação a NADPH também foram descritas no WO 2011012697 A2, que é aqui incorporado em sua totalidade.
[00963] Como um outro exemplo, xilose isomerase é uma enzima dependente de metal que catalisa a interconversão de açúcares aldose e cetose, principalmente entre xilose em xilulose e glicose em frutose. Ela tem afinidade menor com açúcares lixose, arabinose e manose. Os grupos hidroxila de açúcares podem definir a preferência de substrato de açúcar isomerases. O aspartato no resíduo 256 de Thermus thermophilus xilose isomerase foi substituído por arginina (Patel e outros, 2012. Protein Engineering, Design & Selection, vol. 25, no. 7, pp. 331-336). Essa xilose isomerase mutante exibiu um aumento em especificidade para D-lixose, L-arabinose e D-manose. A eficiência catalítica do mutante de xilose isomerase D256R também foi maior para esses 3 substratos comparado com a enzima do tipo selvagem. Foi tomado como hipótese que a arginina no resíduo 256 na enzima mutante pode desempenhar um papel na reação catalítica ou influenciar mudanças em orientação do substrato.
[00964] Como um outro exemplo, a enzima xilitol desidrogenase desempenha um papel na utilização da xilose juntamente com xilose redutase. Xilose redutase (XR) reduz xilose em xilitol e então xilitol desidrogenase (XDH) reoxida xilitol para formar xilulose. No entanto, uma vez que XR prefere NADPH como cossubstrato, enquanto XDH usa exclusivamente NAD+ como cossubstrato, um problema de reciclagem de cossubstrato é encontrado. Uma solução é engenheirar XDH de modo que sua especificidade de cossubstrato seja alterada de NAD+ para NADP+ (Ehrensberger e outros, 2006. Structure 14: 567-575). Uma estrutura de cristal da holoenzima de Gluconobacter oxydans revelou que Asp38 é amplamente responsável pela especificidade NAD+ de XDH. Asp38 interage com as hidroxilas da adenosina ribose e Met39 empilha sobre o anel de purina e também está localizado próximo da 2 'hidroxila. Um mutante duplo (D38S/M39R) XDH foi construído, que utilizou exclusivamente NADP+ sem perda de atividade de enzima.
[00965] Como um outro exemplo, a enzima mevalonato difosfato descarboxilase (MVD) é uma enzima dependente de ATP que catalisa a fosforilação/descarboxilação de (R)-mevalonato-5-difosfato em isopentenil pirofosfato (IPP) na via do mevalonato (MVA). Na via clássica do MVA, MVD catalisa a etapa final, onde ele produz IPP a partir de (R)-mevalonato-5-difosfato (MVAPP) em uma reação irreversível dependente de ATP. MVAPP é fosforilado primeiro, e consequente descarboxilação ocorre com a liberação concomitante de fosfato inorgânico. Com o mesmo mecanismo, MVDs clássicos também catalisam a conversão do 3-hidróxi-isovalerato (3-HIV) não fosforilado em isobuteno. Variantes de mevalonato difosfato (MDP) descarboxilase tendo atividade melhorada em conversão de 3-fosfonoxiisovalerato em isobuteno são descritas, por exemplo, no WO 2012052427 e WO 2015004211, cada um dos quais é aqui incorporado em sua totalidade.
Engenharia Metabólica - Superexpressão de Enzima ou Sub- regulagem /deleção de enzima para Fluxo de Via Aumentada
[00966] Em várias modalidades descritas aqui, as enzimas exógenas e endógenas no micro-organismo recombinante que participam das vias de biossíntese descritas aqui podem ser superexpressas.
[00967] Os termos "superexpresso" e "superexpressão" se referem a um nível elevado (por exemplo, nível aberrante) de mRNAs codificando uma(s) proteína(s) e/ou a níveis elevados de proteína(s) em células comparado com células similares correspondentes não modificadas expressando níveis basais de mRNAs ou tendo níveis basais de proteínas. Em modalidades particulares, mRNA(s) ou proteína(s) pode(m) ser superexpresso(s) em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes, 12 vezes, 15 vezes ou mais em micro-organismos modificados para exibir gene mRNA, proteína e/ou atividade aumentado.
[00968] Em algumas modalidades, um micro-organismo recombinante da invenção é gerado a partir de um hospedeiro que contém capacidade enzimática de sintetizar substratos tais como D- ribose-5-fosfato, glicolaldeído, D-gliceraldeído-3-fosfato, D-xilulose, D- ribulose, D-ribulose-1-fosfato, D-xilulose-1-fosfato, D-ribulose-5-fosfato, D-xilulose-5-fosfato, D-xilonolactona, D-xilonato, 2-ceto-3-desóxi- xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato, acetoacetil-CoA, acetoacetato ou 3-hidróxi-isovalerato. Em algumas modalidades, pode ser útil aumentar a síntese ou acúmulo de, por exemplo, D-ribose-5-fosfato, glicolaldeído, D-gliceraldeído-3-fosfato, D-xilulose, D-ribulose, D- ribulose-1-fosfato, D-xilulose-1-fosfato, D-ribulose-5-fosfato, D-xilulose- 5-fosfato, D-xilonolactona, D-xilonato, 2-ceto-3-desóxi-xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato, acetoacetil-CoA, acetoacetato ou 3- hidróxi-isovalerato, para aumentar a produção de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00969] Em algumas modalidades, pode ser útil aumentar a expressão de enzimas endógenas ou exógenas envolvidas nas vias de biossíntese de MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, para aumentar o fluxo de, por exemplo, D-ribose-5-fosfato, glicolaldeído, D- gliceraldeído-3-fosfato, D-xilulose, D-ribulose, D-ribulose-1-fosfato, D- xilulose-1-fosfato, D-ribulose-5-fosfato, D-xilulose-5-fosfato, D- xilonolactona, D-xilonato, 2-ceto-3-desóxi-xilonato, glicolaldeído, DHAP, piruvato acetoacetil-CoA, acetoacetato ou 3-hidróxi-isovalerato, resultando assim em síntese ou acúmulo aumentado de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00970] Síntese ou acúmulo aumentado pode ser realizado através de, por exemplo, superexpressão de ácidos nucleicos codificando uma ou mais das enzimas da via de biossíntese dos MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, descritas acima. Superexpressão de uma enzima ou enzimas da via de biossíntese de MEG ou (GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, pode ocorrer, por exemplo, através da expressão aumentada de um gene ou genes endógenos, ou através da expressão, ou expressão aumentada, de um gene ou genes exógenos. Portanto, organismos de ocorrência natural podem ser prontamente modificados para gerar micro-organismos não naturais de produção de, MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, através da superexpressão de uma molécula ou mais moléculas de ácido nucleico codificando uma enzima da via de biossíntese de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos. Ainda, um organismo de ocorrência não natural pode ser gerado através de mutagênese de um gene endógeno que resulta em um aumento em atividade de uma enzima nas vias de biossíntese MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00971] Munido com a presente invenção, o versado na técnica será capaz de construir prontamente os micro-organismos recombinantes descritos aqui, uma vez que os micro-organismos recombinantes da invenção podem ser construídos usando métodos bem conhecidos na técnica como exemplificado acima para expressar exogenamente pelo menos um ácido nucleico codificando uma enzima da via de biossíntese um MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, em quantidades suficientes para produzir MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00972] Métodos para construir e testar os níveis de expressão de um hospedeiro de MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, de ocorrência não natural podem ser realizados, por exemplo, através de métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados descritos em, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubo e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999).
[00973] Uma variedade de mecanismos conhecidos na técnica pode ser usada para expressar, ou superexpressar, genes exógenos ou endógenos. Por exemplo, um vetor ou vetores de expressão podem ser construídos para abrigar um ou mais ácidos nucleicos codificando enzimas da via de biossíntese de MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, conforme exemplificado aqui operavelmente ligados a sequências de controle de expressão funcionais no organismo hospedeiro. Os vetores de expressão aplicáveis para uso nos organismos hospedeiros microbianos da invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores fágicos, vetores virais, epissomas e cromossomos artificiais, incluindo vetores e sequências de seleção ou marcadores operáveis para integração estável em um cromossomo hospedeiro. Genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos que, por exemplo, fornecem resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências auxotróficas ou fornecem nutrientes críticos que não estão no meio de cultura. Sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e induzíveis, intensificadores da transcrição, terminadores da transcrição e similares que são bem conhecidos na técnica. Quando dois ou mais ácidos nucleicos de codificação exógena devem ser coexpressos, ambos ácidos nucleicos podem ser inseridos, por exemplo, em um único vetor de expressão ou em vetores de expressão separados. Para expressão de vetor único, os ácidos nucleicos de codificação podem ser operavelmente ligados a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados a sequências de controle de expressão diferentes, tais como um promotor induzível e um promotor constitutivo. A transformação de sequências de ácido nucleico exógenas envolvidas em uma via metabólica ou sintética pode ser confirmada usando métodos bem conhecidos na técnica.
[00974] Como será compreendido por aqueles versados na técnica, pode ser vantajoso modificar uma sequência de codificação para aumentar sua expressão em um hospedeiro particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos tipicamente usa um subconjunto desses códons. Os códons que são utilizados com mais frequência em uma espécie são chamados códons ótimos, e aqueles não utilizados com muita frequência são classificados como códons raros ou de baixo uso. Os códons podem ser substituídos para refletir o uso de códons preferido do hospedeiro, um processo às vezes chamado "otimização de códons" ou "controle de tendência de códons de espécies".
[00975] Sequências de codificação otimizadas contendo códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular (vide também, Murray e outros (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508) podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou produzir transcritos de RNA recombinante tendo propriedades desejáveis, tal como uma meia-vida mais longa, comparado com s transcritos produzidos a partir de uma sequência não otimizada. Códons de parada da tradução também podem ser modificados para refletir a preferência do hospedeiro. Por exemplo, códons de parada típicos para S. cerevisiae e mamíferos são UAA e UGA, respectivamente. O códon de parada típico para plantas monocotiledôneas é UGA, enquanto insetos e E. coli comumente usam UAA como o códon de parada (Dalphin e outros (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
[00976] Os versados na técnica reconhecerão que, devido à natureza degenerada do código genético, uma variedade de sequências de ácido nucleico pode ser usada para codificar uma dada enzima da invenção. As sequências de ácido nucleico codificando as enzimas biossintéticas são referidas aqui apenas para ilustrar uma modalidade da invenção, e a invenção inclui quaisquer sequências de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos e proteínas das enzimas da presente invenção. De maneira similar, um polipeptídeo pode tolerar tipicamente uma ou mais substituições, deleções e inserções de aminoácidos em sua sequência de aminoácidos sem perda ou perda significante de uma atividade desejada. A invenção inclui tais polipeptídeos com sequências de aminoácidos diferentes das proteínas específicas descritas aqui, contanto que os polipeptídeos modificados ou variantes tenham a atividade anabólica ou catabólica enzimática do polipeptídeo de referência. Ainda, as sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico aqui mostradas apenas ilustram modalidades da invenção.
[00977] Sequências de controle de expressão são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, sítios de entrada de ribossomo internos (IRES) e similar, que proveem a expressão da sequência de polinucleotídeos em uma célula hospedeira. As sequências de controle de expressão interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas em transcrição (Maniatis e outros, Science, 236: 1237-1245 (1987)). Sequências de controle de expressão exemplares são descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990).
[00978] Em várias modalidades, uma sequência de controle de expressão pode ser operavelmente ligada a uma sequência polinucleotídica. Por "operavelmente ligado" quer dizer que uma sequência de polinucleotídeos e uma sequência(s) de controle de expressão são conectadas de modo a permitir a expressão de genes quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras transcripcionais) estão ligadas à sequência(s) de controle de expressão). Promotores operavelmente ligados estão localizados a montante da sequência de polinucleotídeos selecionada em termos da direção da transcrição e tradução. Intensificadores operavelmente ligados podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante do polinucleotídeo selecionado.
[00979] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam uma reação em uma via que compete com a via de biossíntese para a produção de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00980] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas no ramo oxidativo da via da pentose fosfato. Em algumas modalidades, a manipulação evita a conversão de glicose-6-fosfato através do ramo oxidativo da via da pentose fosfato e, em vez disso, desvia a glicose-6-fosfato através do ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir um intermediário de pentose-fosfato necessário para produção de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose- 5-fosfato. Em algumas de tais modalidades, a uma ou mais enzimas endógenas são selecionadas de glicose 6-fosfato-1-desidrogenase, 6- fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. Em modalidades adicionais, a glicose 6-fosfato-1-desidrogenase é zwf, a 6- fosfogluconolactonase é pgl e a 6-fosfogluconato desidrogenase é gnd.
[00981] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Em algumas modalidades, a manipulação impede a conversão de gliceraldeído 3-fosfato em 1,3- bisfosfo-D-glicerato e, em vez disso, permite que o gliceraldeído 3- fosfato seja convertido em xilulose-5-fosfato (com uma conversão simultânea de frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato) por uma transcetolase e, assim, produzir um intermediário de pentose-fosfato necessário para a produção de MEG (ou GA), ou MEG e um ou mais coprodutos, e fornecer mais eritrose-4-fosfato para o ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir mais um intermediário de pentose-fosfato. Em algumas modalidades, a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é gapA. Em que o intermediário de pentose-fosfato é D- ribose-5-fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato.
[00982] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade da 6-fosfofrutocinase. Em algumas modalidades, a manipulação evita a conversão de frutose-6-fosfato em 1,6-bifosfato e, em vez disso, permite que a frutose-6-fosfato seja convertida em eritrose-4-fosfato e acetil- fosfato por uma frutose-6-fosfato fosfocetolase, e fornecer mais eritrose- 4-fosfato para o ramo não oxidativo da via da pentose fosfato para produzir ainda um intermediário de pentose-fosfato necessário para a produção de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos. Em algumas modalidades, a 6-fosfofrutocinase é pfkA e/ou pfkB.
[00983] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico. Em algumas de tais modalidades, a enzima que catalisa a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico é uma glicolaldeído desidrogenase. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a glicolaldeído desidrogenase é codificada pelo gene aldA ou seus homólogos. Em algumas modalidades, a manipulação evita a produção de ácido glicólico a partir de glicolaldeído e, em vez disso, desvia a reação em direção à conversão de glicolaldeído em MEG. Em algumas modalidades, a deleção, interrupção, mutação e/ou redução na atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico é parcial, em que alguma função glicolaldeído desidrogenase ainda está presente e uma quantidade de ácido glicólico ainda é produzida.
[00984] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de piruvato em lactato. Em algumas dessas modalidades, a enzima que catalisa a conversão de piruvato em lactato é uma lactato desidrogenase. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a lactato desidrogenase é codificada pelo gene ldhA ou seus homólogos. Em algumas modalidades, manipulação evita a produção de lactato a partir do piruvato e, em vez disso, desvia a reação em direção à produção de MEG (ou GA) ou MEG e um ou mais coprodutos.
[00985] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é manipulado para excluir, interromper, mutar e/ou reduzir a atividade de uma ou mais enzimas endógenas que catalisam a conversão de glicolaldeído em monoetilenoglicol (MEG) e, em vez disso, desviar a reação para a conversão de glicolaldeído em ácido glicólico (GA). Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase é codificada pelo gene fucO ou seu homólogo.
[00986] A descrição detalhada acima foi dada para clareza de compreensão apenas e nenhuma limitação desnecessária deve ser entendida a partir daí, uma vez que as modificações serão óbvias para aqueles versados na técnica.
[00987] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será compreendido que são possíveis modificações adicionais e esse pedido pretende cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente invenção como estando dentro da prática conhecida ou comum dentro da técnica à qual a invenção pertence e podendo ser aplicados às características essenciais estabelecidas acima e como segue no escopo das reivindicações anexas.
[00988] As invenções, incluindo as reivindicações, figuras e/ou desenhos, de toda e qualquer patente, pedido de patente e publicação citados aqui são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.
EXEMPLOS Exemplo 1 Geração de construtos marcados com 6-his para variantes DERA, pentose cinases e aldeído desidrogenase
[00989] Para construções de desóxi-ribose-5-fosfato aldolase (DERA), os genes de tipo selvagem codificando DERA de Escherichia coli (EcDERA ou EcdeoC, número de acesso UniProt P0A6L0) (SEQ ID NO: 255) e de Bacillus caldolyticus (BcDERA ou BcdeoC, número de acesso UniProt A0A2H5KL15) (SEQ ID NO: 286) foram sintetizados por GenScript (Hong Kong, China) com otimização de códon com base no códon de E. coli para o BcDERA (SEQ ID NO: 287). Os dois fragmentos de DNA foram clonados no plasmídeo pET28.
[00990] Com base na sequência de DERA publicada (Heine, A. e outros (2001). “Observation of covalent intermediates in na enzyme mechanism at atomic resolution”. Science 294: 369-374) [1], a mutagênese sítio-dirigida foi realizada para substituir a cisteína na posição 47 por uma arginina (C47N) na sequência de aminoácidos EcDERA ou na posição equivalente, C37, em BcDERA (para criar C37N) conforme determinado pelo alinhamento da proteína (FIG. 8). Esses sítios foram escolhidos para melhorar a atividade de DERA porque C47 de EcDERA e C47 de BcDERA estão localizados perto do sítio ativo. A mutagênese sítio-direcionada foi realizada usando iniciadores na Tabela 2 (o códon mutado está sublinhado) e o Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (da Thermo Scientific) de acordo com o procedimento do fabricante. Como um controle negativo, uma DERA inativa foi construída pela mutação da lisina catalítica na posição 201 em EcDERA ou na posição equivalente 181 em BcDERA, por uma asparagina (mutação K201N para EcDERA ou K181N para BcDERA) usando os iniciadores na Tabela 2. Todas as sequências do tipo selvagem e a introdução de mutações específicas foram analisadas e validadas por sequenciação (Eurogentec).
[00991] As pentose cinases, ribocinase (rbsK) (SEQ ID NO: 290), xilulocinase (Xuk) (SEQ ID NO: 291) e ribulocinase (AraB) (SEQ ID NO: 288) foram obtidas usando DNA genômico do organismo de origem e iniciadores de PCR na Tabela 2. A aldeído desidrogenase foi obtida usando DNA genômico de E. coli e os iniciadores na Tabela 2.Tabela 2. Origem do DNA e Iniciadores Usados na Obtenção de Genes-alvo
Expressão e Purificação de Proteína
[00992] Células de Escherichia coli recém-preparadas (DE3, New England Biolabs) foram usadas para expressão de proteínas. Culturas bacterianas foram iniciadas em OD 600 nm de 0,05 a partir de uma pré- cultura durante a noite em meio rico em LB (extrato de levedura 5 g/L, triptona 10 g/L, NaCl 10 g/L) suplementado com canamicina a 50 μg/mL. A expressão da proteína foi então induzida quando a OD600nm atingiu 0,6/0,8 pela adição de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo (IPTG) ao meio de cultura. As culturas foram realizadas a 30 °C e expressão foi induzida durante 4 horas. Seguindo a expressão, as células de E. coli foram colhidas por centrifugação e os peletes celulares foram mantidos a -20°C até o uso. Para recuperar e purificar as proteínas expressas, peletes congelados foram ressuspensos em gelo em tampão de ligação (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM) e sonicados (4 ciclos de 30 segundos ligado/30 segundos desligado, energia 30% com uma microponta, modelo FB505 da Fisher Scientific) e então centrifugados a 20.000g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi misturado com solução em pasta His Spintrap TALON (Merck) para purificar a proteína his marcada de acordo com a recomendação do fabricante. Toda a pureza da proteína foi verificada em SDS-PAGE e mostrou uma banda principal no tamanho esperado, sugerindo uma proteína > 90% pura. A proteína purificada em tampão de eluição foi trocada usando 10 kDa Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck) por HEPES 50 mM, pH 7, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM para ensaios enzimáticos de proteína DERA ou HEPES 60 mM, pH 7,5, KCl 60 mM, MgCl2 3 mM para os ensaios enzimáticos da proteína PGM3.
Ensaio de atividade de pentose cinase in vitro
[00993] As pentose cinases (ribocinase (rbsK), ribulocinase (AraB) e xilulocinase (XuK)) que foram purificadas como descrito acima foram ensaiadas em suas respectiva pentose através de acoplamento enzimático de ADP produzido para oxidação de NADH usando piruvato cinase e lactato desidrogenase (FIG. 9 e FIG. 14). A mistura de reação continha HEPES 50 mM, pH 7, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, quantidade apropriada de açúcar cinase, ATP 2 mM, NADH 0,25 mM, faixa de concentração de pentose, fosfo-enol-piruvato 2 mM, piruvato cinase comercialmente disponível (PK) e lactato desidrogenase (LDH) a 2U/mL (todos os produtos foram adquiridos da Merck).
[00994] Os resultados do ensaio mostrando curvas de Michaelis- Menten com um substrato de pentose para rbsK, xilulocinase (XuK) ou AraB estão nas FIG. 10, FIG. 11 e FIG. 12, respectivamente. A taxa inicial é representada em gráfico como uma função da concentração de substrato. Os resultados indicam que cada uma das cinases expressas e purificadas mostrou atividade cinase em seus respectivos substratos de pentose.
Ensaio de atividade variante de DERA in vitro
[00995] O ensaio enzimático in vitro de variantes de DERA foi realizado através do método de acoplamento enzimático. A FIG. 13 mostra o esquema para o ensaio de DERA realizado usando o substrato natural de DERA, 2-desóxi-ribose-5P. A FIG.14 mostra o esquema para o ensaio de DERA realizado usando substratos de pentose-5P derivados de uma reação de cinase a montante. Os ensaios foram monitorados medindo a oxidação de NADH em OD 340nm resultante da conversão de di-hidroxiacetona 3-P (DHAP) em glicerol-3P por glicerol- 3-P desidrogenase (GPDH). As reações foram seguidas espectrofotometricamente a 37°C.
[00996] Para reações usando o substrato natural, as misturas continham HEPES 50 mM, pH 7,0: KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, NADH 0,25 mM, 2-desóxi-ribose-5P 5 mM, triose fosfato isomerase (TPI) comercialmente disponível e glicerol-3-P desidrogenase (GPDH) a 2 U/mL e quantidade apropriada de proteína variante DERA.
[00997] Para reações que usando substratos de pentose-5P derivados de cinase, a pentose era ribose, ribulose ou xilulose. Os ensaios foram realizados de acordo com o esquema da FIG. 14 e as misturas continham HEPES 50 mM, pH 7,0: KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, NADH 0,25 mM, triose fosfato isomerase (TPI) comercialmente disponível, glicerol-3-P desidrogenase (GPDH) a 2 U/mL, uma quantidade apropriada de proteína variante DERA, pentose 5 mM (ribose, ribulose ou xilulose), uma quantidade apropriada da cinase específica (isto é, rbsK, AraB ou Xuk) e ATP a 2,5-5 mM.
[00998] Os ensaios in vitro para variantes de DERA demonstram o impacto das mutações na proteína DERA sobre a atividade enzimática para o substrato natural, 2-desóxi-ribose-5P. Os resultados mostrando a cinética de Michaelis-Menten para cada atividade da variante de DERA são mostrados nas FIG. 15, FIG. 16, FIG. 17, FIG. 18, FIG. 19 e FIG. 20. Atividades específicas para as enzimas DERA do tipo selvagem de uma fonte comercialmente disponível (FIG. 15), enzima EcDERA do tipo selvagem sintetizada (FIG. 16) e enzima BcDERA sintetizada (FIG. 17) foram determinadas. A variante de EcDERA C47N sintetizada (FIG. 18) reteve atividade reduzida em relação à enzima EcDERA do tipo selvagem. Da mesma forma, a variante de BcDERA C47N sintetizada (FIG. 19) reteve atividade reduzida em relação à enzima BcDERA do tipo selvagem. A variante de EcDERA K201N de controle negativo, como esperado, não apresentou atividade (FIG. 20).
[00999] A Tabela 3 mostra resultados dos ensaios in vitro para variantes de DERA demonstrando o impacto das mutações na proteína DERA sobre conversão enzimática de substratos de ribose-5P, ribulose- 5P e xilulose-5P gerados por pentose cinases a montante em gliceraldeído- 3P e subsequente conversão em DHAP e glicerol-3P. Os resultados sugerem que as formas mutadas de DERA reduzem a taxa de produção de gliceraldeído-3P e subsequente conversão em DHAP e glicerol-3P.Tabela 3. Resultados demonstrando atividade de DERA sobre intermediários-alvo pentose-5-P e o impacto de mutações de DERA sobre conversão de pentose-5P em glicoaldeído e G3P. Atividade específica DERA das proteínas DERA. O Vmax foi estimado com uma concentração de substrato inicial de 5 mM.
Ensaio enzimático in vitro para a dA
[001000] A proteína AldA foi testada em seu substrato natural, glicolaldeído, de acordo com o esquema na FIG. 21 monitorando diretamente a formação de NADH. A mistura de reação continha HEPES 50 mM, pH 7, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, quantidade apropriada de proteína aldA, NAD+ 2,5 mM, glicolaldeído 5 mM, (NAD+ foi comprado da Merck).
[001001] Os resultados na FIG. 22 demonstram que atividade específica da enzima aldA recombinante retém atividade para conversão de glicoaldeído em glicolato.
Validação in vitro de produção de GA a partir de intermediários pentose e pentose-5P usando DERA
[001002] Esse ensaio enzimático foi projetado para validar a produção in vitro de ácido glicólico a partir de uma pentose (ribose, ribulose ou xilulose) e intermediários pentose-5P (ribose-5P, ribulose-5P ou xilulose-5P) através do uso e dependência da enzima DERA e suas variantes (FIG. 23). O ensaio enzimático foi configurado em uma mistura de reação de tampão HEPES 50 mM, pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, NADH 3 mM, ATP*Mg 15 mM e pentose (ribose, ribulose ou xilulose) 20 mM. A mistura de reação foi completada com adição de ribocinase purificada (para reações contendo ribose), ribulocinase (para reações contendo ribulose) ou xilulocinase (para reações contendo xilulose) cada uma a 0,2 mg/mL, e aldeído desidrogenase purificado (aldA) a 0,25 mg/mL, uma mistura de TPI e GPDH a 2 U/mL (TPI/GPDH da Merck) e proteína DERA purificada a 2,5 mg/mL. A reação foi realizada durante 24 horas a 37°C. Seguindo a reação, as concentrações de pentose e glicolato foram determinadas através de cromatografia líquida de alto desempenho usando o sistema Thermo Fisher Scientific (Courtaboeuf, França) equipado com um detector de RI, com um detector de UV a 205 nm e uma coluna Phenomenex (Rezex H +) a 50 ° C usando H2SO4 2,5 mM como fase móvel a 0,5 mL/min. Os resultados do experimento de validação in vitro são dados nas Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6. Para a produção de glicolato a partir de xilulose ou ribulose de acordo com o esquema na FIG. 23, a variante EcDERA C47N aumentou a produção de glicolato comparado com EcDERA do tipo selvagem. Para a produção de glicolato a partir de xilulose, ribulose ou ribose, a BcDERA C37N reteve produção reduzida de glicolato comparado com BcDERA do tipo selvagem. Como esperado, as variantes de controle negativo EcDERA K201N e BcDERA K181N não retiveram capacidade significante para produzir glicolato a partir de pentose. Os resultados demonstram a produção in vitro de ácido glicólico a partir de açúcares pentose, isto é, a partir de ribose, ribulose e xilulose, através do uso de candidatos à enzima DERA. Portanto, os resultados também demonstraram atividade de DERA sobre intermediários-alvo pentose- 5P, tais como como D-ribose-5P, D-ribulose-5P e D-xilulose-5P, validando a capacidade de DERA em converter tais intermediários pentose-5P em glicoaldeído e G3P.Tabela 4. Resultados do ensaio de validação in vitro para produção de GA a partir de xilulose Tabela 5. Resultados do ensaio de validação in vitro para produção de GA a partir de ribuloseTabela 6, Resultados do ensaio de validação in vitro para produção de GA a partir de ribose
Exemplo 2 Ensaio in vitro para produção de ácido glicólico usando DERA em E. coli
[001003] Para avaliar a viabilidade do uso de DERA para produção de ácido glicólico (GA) in vivo, um ensaio foi desenvolvido com base no uso de uma cepa de E. coli de triagem com o genótipo MG1655 ΔtktA-ΔtktB. Como descrito na FIG. 24, tal cepa não pode crescer em xilose por si só, por causa da deleção de genes da transcetolase tktA (GenBank Gene ID: 947420) e tktB (GenBank Gene ID: 945865). No entanto, uma cepa expressando uma proteína DERA ativa pode usar pentoses fosforiladas em carbono 5 (pentose-5P) para produzir glicolaldeído e gliceraldeído-3-fosfato. O glicolaldeído e o gliceraldeído-3-fosfato podem entrar na derivação de glioxilato e na glicólise para apoiar o crescimento da cepa. Consequentemente, atividade DERA in vivo na cepa de triagem está diretamente correlacionada com crescimento celular.
Exclusão de tktA e tktB
[001004] Deleção de tktA e tktB foi realizada sequencialmente na cepa de tipo selvagem MG1655de Escherichia coli. Em primeiro lugar, a deleção de tktA e tktB foi realizada através de transdução de acordo com o procedimento padrão (Thomason, L.C. e outros (2007) E. coli genome manipulation by P1 transduction. Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 1: Unidade 1 17) usando uma cepa MG1655 ΔtktA::KanR JW5478 e uma cepa MG1655 ΔtktB::KanR JW2449, ambas obtidas da coleção de deleção de gene único Keio (Baba, T., e outros (2006) “Construction of E. coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutations: the Keio collection”. Mol. Sys. Biol. 2: 2006 0008). Transformantes foram selecionados em ágar LB suplementado com 100 μg/ml de canamicina e identificados através de PCR de colônia e sequenciamento. Remoção do marcador antibiótico foi ainda realizada através de recombinação específica de regiões FTR, usando recombinação Flp, como descrito anteriormente na literatura (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L. (2000) “One- step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645). A cepa resultante foi chamada DERA_screening_01: MG1655 ΔtktA-ΔtktB.
Obtenção de um mutante DERA C47N
[001005] DERA de E. coli (número de acesso UniProt P0A6L0) foi sintetizado pela GenScript (Hong Kong, China) e clonada em um vetor pET28. Mutagênese sítio-dirigida foi então usada para introduzir a mutação pontual de acordo com os iniciadores descritos na Tabela 7, usando o Phusion Site-Directed Mutagenesis® Kit(Thermo ScientificTM), de acordo com o procedimento do fabricante. O mutante EcDERA C47N (SEQ ID NO: 294) foi posteriormente confirmado através de sequenciação.Tabela 7: Oligonucleotídeos usados para mutagênese sítio- dirigida. O site mutado está em negrito.
Construção de plasmídeo para expressão de DERA em cepa de triagem com base em crescimento celular
[001006] Para expressar DERA na cepa de triagem, um plasmídeo pZS21 (Expressys) foi primeiro modificado substituindo o promotor PLtetO-1 por um promotor constitutivo J23119 (SEQ ID NO: 293) ou um J23101 (SEQ ID NO: 292) (http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson). Ambos promotores J23119 e J23101 foram obtidos como fragmentos de genes sintéticos, sintetizados pela GeneWiz® (Leipzig, Alemanha). Os promotores sintéticos foram amplificados por PCR, usando iniciadores detalhados na Tabela 8. Eles foram subsequentemente clonados no plasmídeo pZS21 linearizado através de restrição enzimática com AatII e KpnI, usando o NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs) de acordo com o protocolo do fabricante. Construção foi confirmada através de PCR e sequenciação. Os plasmídeos resultantes foram respectivamente chamados pZS2-J23119 e pZS2-J23101.
[001007] A fim de expressar um número maior de cópias de DERA, os dois plasmídeos foram modificados com uma origem de replicação p15A, recuperada de um plasmídeo pZA21 (Expressys). Um fragmento contendo promotor e marcador de canamicina de pZS2-J23119 (ou pZS2-J23101) foi amplificado através de PCR, junto com um fragmento contendo a origem de p15A e o sítio de clonagem múltiplo de pZA21, usando iniciadores descritos na Tabela 8. In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante para recombinar os fragmentos de DNA em plasmídeos funcionais. Os plasmídeos resultantes foram respectivamente chamados pZA2-J23119 e pZA2-J23101.
[001008] A variante EcDERA C47N foi amplificada através de PCR usando plasmídeos descritos na Tabela 8. Ela foi subsequentemente clonada ou em pZA2-J23119 ou pZA2-J23101 linearizada através de restrição enzimática com KpnI, usando In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante. Construção foi confirmada através de PCR e sequenciação. Os plasmídeos resultantes foram chamados pZA2-J23119-DERA (SEQ ID NO: 295) e pZA2- J23101-DERA (SEQ ID NO: 296), respectivamente.Tabela 8. Oligonucleotídeos usados para a construção de plasmídeos pZS2-J23119, pZS2-J23101, pZA2-J23119, pZA2-J23101, pZA2-J23119-DERA e pZA2-J23101-DERA. As regiões de ligação estão sublinhadas.
Ensaio in vivo para crescimento de MG1655 ΔtktA-ΔtktB usando variante DERA C47N de E. coli'
[001009] A cepa de triagem DERA_screening_01 (MG1655 ΔtktA- ΔtktB) foi transformada por eletroporação ou com plasmídeo pZA2- J23119-DERA ou pZA2-J23101-DERA, ou com vetor vazio sozinho usando procedimentos padrão (Woodall, C.A. E.coli Plasmid Vectors. Methods in Molecular BiologyTM. 2003, vol. 235. doi: 10.1385/1-59259409-3: 55). As cepas resultantes foram cultivadas em meio de xilose M9 (20g/L de xilose) por 50 horas. Canamicina foi adicionada com uma concentração final de 100 μg/mL. O crescimento foi monitorado por OD600.
[001010] Os resultados do ensaio de crescimento são mostrados na FIG. 25. As cepas MG1655 ΔtktA-ΔtktB contendo pZA2-J23119-DERA (J23119 DERA) ou pZA2-J23101-DERA (J23101 DERA) mostraram ambas crescimento aumentado comparado com seus respectivos controles. J23119 DERA mostrou maior crescimento comparado com J23101 DERA. Juntos, os resultados sugerem que a variante EcDERA C47N expressa na cepa MG1655 ΔtktA-ΔtktB pode permitir crescimento quando cultivada em meios mínimos de xilose.
MODALIDADES ENUMERADAS
[001011] Modalidade 1. Um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais vias bioquímicas que produz um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário de pentose-fosfato; em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase. Modalidade 2. O micro-organismo recombinante da modalidade 1, em que o intermediário de pentose-fosfato é D-ribose-5- fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato e em que a enzima tem atividade de D-ribose-5 -fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose- 5-fosfato aldolase. Modalidade 3. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Modalidade 4. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente em que o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina ou uma combinação dos mesmos. Modalidade 5. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA). Modalidade 6. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase. Modalidade 7. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com tktA ou tktB de E. coli. Modalidade 8. O micro-organismo recombinante de acordo com qualquer modalidade anterior, em que a pelo menos enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% identidade de sequência com deoC de E. coli. Modalidade 9. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transaldolase. Modalidade 10. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de transaldolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com talA ou talB de E. coli. Modalidade 11. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase. Modalidade 12. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpe de E. coli. Modalidade 13. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Modalidade 14. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com rpiA ou rpiB de E. coli. Modalidade 15. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato mutase. Modalidade 16. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é gapA, a fosfoglicerato cinase é pgk e a fosfoglicerato mutase é gpmA e/ou gpmM. Modalidade 17. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase. Modalidade 18. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase selecionada de Bifidobacterium dentium BDP_1006, Bifidobacterium lactis xfp, Lactobacillus paraplantarum xpkA e Bifidobacterium breve xfp. Modalidade 19. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais vias bioquímicas compreendem expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase. Modalidade 20. Micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase selecionada de pta de E. coli e pta de Clostridium acetobutylicum. Modalidade 21. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma enzima 6-fosfofrutocinase endógena. Modalidade 22. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a 6-fosfofrutocinase é pfkA e/ou pfkB. Modalidade 23. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante compreende ainda uma atividade excluída ou diminuída em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato- 1-desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. Modalidade 24. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a glucose 6-fosfato-1- desidrogenase é zwf, a 6-fosfogluconolactonase é pgl e a 6- fosfogluconato desidrogenase é gnd. Modalidade 25. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilose isomerase e expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase. Modalidade 26. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylA de E. coli ou Pyromyces sp. Modalidade 27. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com xylB de E. coli. Modalidade 28. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o micro-organismo recombinante compreende ainda expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase. Modalidade 29. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase é codificada por uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência ou pelo menos 90% de identidade de sequência com fbp de E. coli. Modalidade 30. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um intermediário ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante. Modalidade 31. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos por monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos. Modalidade 32. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose- 6-fosfato fosfocetolase e a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de pentose-fosfato aldolase permite uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário D-ribose-5-fosfato e a conversão subsequente de D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído. Modalidade 33. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que MEG ou GA é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Modalidade 34. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que MEG é produzido através da redução de glicolaldeído por enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase na via C2. Modalidade 35. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que GA é produzido através da oxidação de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase na via C2. Modalidade 36. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de MEG ou GA é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de 3-fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de 3-fosfoidroxipiruvato redutase, uma atividade de glicolaldeído redutase, uma atividade de glicolaldeído-desidrogenase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou serina- piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou atividade de etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de glicerato descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase e uma atividade da glioxilato redutase. Modalidade 37. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que MEG é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e um ou mais coprodutos são produzidos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Modalidade 38. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 são selecionadas de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil- CoA:acetoacetato transferase ou atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase e uma atividade de acetoacetato descarboxilase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem acetona. Modalidade 39. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil- CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase e uma atividade de álcool desidrogenase secundária, e em que um ou mais coprodutos compreendem isopropanol. Modalidade 40. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil- CoA:acetoacetato transferase ou atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de álcool desidrogenase secundária e uma atividade de desidratase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem propeno. Modalidade 41. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil- CoA:acetoacetato transferase ou atividade de acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase, uma atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase, uma atividade de metilglutaconil-CoA hidratase, uma atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase, uma atividade de metilcrotonil-CoA hidrtase, uma atividade de 3-hidróxi- isovaleril-CoA tioesterase, uma atividade de 3HIV cinase, uma atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase e uma atividade de 3HIV descarboxilase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem isobuteno. Modalidade 42. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase e uma atividade de glicerato 2- cinase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem L-serina. Modalidade 43. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de transferase, uma atividade de formaldeído desidrogenase, uma atividade de formato desidrogenase, uma atividade associada ao sistema de clivagem de glicina, uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de glicolato desidrogenase, uma atividade de alanina-glioxilato aminotransferase, uma atividade de alanina transaminase, uma atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H e em que o um ou mais coprodutos compreendem glicina. Modalidade 44. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a atividade associada ao sistema de clivagem de glicina compreende uma enzima ou proteína selecionada de uma glicina descarboxilase (proteína P), uma aminometiltransferase (proteína T), uma di-hidrolipoamida desidrogenase (proteína L) e uma proteína H. Modalidade 45. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de 3-fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de acetaldeído desidrogenase e uma atividade de etanolamina amônia liase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem monoetanolamina (MEA). Modalidade 46. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a pelo menos uma enzima para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 é selecionada de pelo menos uma enzima tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina desidrogenase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase, uma atividade de aminoacetaldeído transaminase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase, uma atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina desidrogenase, uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de aldeído oxidase, uma atividade de N-acetil transferase ou O-acetil transferase, uma atividade de N-acetilserina desidrogenase, uma atividade de transaminase, uma atividade de desacetilase, uma atividade de serina aminase e um atividade de 2,3-diaminopropanoato amônia liase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem etilenodiamina (EDA). Modalidade 47. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante compreende ainda uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em um glicolaldeído redutase, uma glicolaldeído desidrogenase, uma lactato desidrogenase ou uma combinação das mesmas. Modalidade 48. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é utilizada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2. Modalidade 49. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada para produzir ATP. Modalidade 50. O micro-organismo recombinante de qualquer modalidade precedente, em que a formação de biomassa em excesso é minimizada e a produção de MEG ou GA ou MEG e um ou mais coprodutos é maximizada. Modalidade 51. Método de produção de um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído usando um micro-organismo recombinante de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o método compreende cultivo do micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo um ou mais açúcares pentose e/ou hexose provendo uma fonte de carbono até que um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído sejam produzidos. Modalidade 52. O método de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Modalidade 53. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina (EDA) ou uma combinação dos mesmos. Modalidade 54. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA). Modalidade 55. Um método de produção de um micro-organismo recombinante que produz ou acumula um ou mais produtos derivados de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose por meio de um intermediário D- ribose-5-fosfato, compreendendo: introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no intermediário D-ribose-5-fosfato; introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão do intermediário de pentose- fosfato em G3P e glicolaldeído; introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais produtos a partir de glicolaldeído em uma via C2; e introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais produtos de G3P em uma via ou mais vias C3; e cultivar o micro-organismo recombinante em um meio de cultura contendo o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose para produzir ou acumular um ou mais produtos. Modalidade 56. O método de qualquer modalidade precedente, em que o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos. Modalidade 57. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina ou uma combinação dos mesmos. Modalidade 58. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais produtos são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA). Modalidade 59. O método de qualquer modalidade precedente, em que o glicolaldeído é oxidado em ácido glicólico por uma glicoladeído desidrogenase. Modalidade 60. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a conversão do um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no intermediário de pentose- fosfato são selecionados de uma ou mais enzimas tendo atividade de transcetolase, uma transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3- epimerase e uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Modalidade 61. O método de qualquer modalidade precedente, em que o método compreende ainda introduzir no micro- organismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir atividade em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (gapA), fosfoglicerato cinase (pgk) e fosfoglicerato mutase (gpmA e/ou gpmM). Modalidade 62. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a conversão do um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no intermediário de pentose- fosfato são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase, uma atividade de fosfato acetiltransferase, uma atividade de transcetolase, uma atividade de transaldolase, uma atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase e uma atividade de ribose-5-fosfato isomerase. Modalidade 63. O método de qualquer modalidade precedente, em que o método compreende ainda introduzir no micro-organismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir a atividade em uma enzima 6-fosfofrutocinase (pfkA e/ou pfkB) endógena. Modalidade 64. O método de qualquer uma das modalidades 54-62, em que a uma ou mais enzimas para a conversão do intermediário de pentose-fosfato em G3P e glicolaldeído é uma ou mais enzimas tendo uma atividade de D-ribose-5-fosfato aldolase. Modalidade 65. Método de qualquer modalidade precedente, em que o método compreende ainda: introduzir no micro-organismo recombinante uma ou mais modificações para diminuir ou excluir atividade em uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato-1-desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase. Modalidade 66. O método de qualquer modalidade precedente, em que a glicose 6-fosfato-1-desidrogenase é zwf, a 6- fosfogluconolactonase é pgl e a 6-fosfogluconato desidrogenase é gnd. Modalidade 67. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o método compreende ainda: introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas tendo atividade de xilose isomerase para a conversão de D-xilose em D-xilulose; e introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas tendo atividade de xilulose 5-cinase para a conversão de D-xilulose em D-xilulose-5-fosfato. Modalidade 68. O método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o micro-organismo recombinante compreende ainda: introduzir no ou expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas tendo atividade de frutose 1,6- bifosfatase para a conversão de D-frutose 1,6-bifosfato em D-frutose 6- fosfato, em que a D-frutose é convertida em frutose 1,6-bifosfato por enzimas endógenas no micro-organismo recombinante. Modalidade 69. Método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são capazes de ser convertidos em um ou mais intermediários na via da pentose fosfato não oxidativa do micro-organismo recombinante. Modalidade 70. Método de qualquer modalidade precedente, em que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose são compreendidos por monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos. Modalidade 71. O método de qualquer modalidade precedente, em que a expressão de uma ou mais enzimas tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase e expressão de uma ou mais enzimas tendo atividade de pentose-fosfato aldolase permitem uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em intermediário de pentose- fosfato e a conversão subsequente de D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído. Modalidade 72. O método de qualquer modalidade precedente, em que MEG ou GA é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Modalidade 73. O método de qualquer modalidade precedente, em que MEG é produzido através da redução de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade de glicolaldeído redutase. Modalidade 74. O método de qualquer modalidade precedente, em que GA é produzido através da oxidação de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase. Modalidade 75. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção de MEG ou GA são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato redutase, uma atividade de glicolaldeído redutase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de glicerato descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase e uma atividade de glioxilato redutase. Modalidade 76. O método de qualquer modalidade precedente, em que MEG é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e um ou mais coprodutos são produzidos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3. Modalidade 77. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P na uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase e uma atividade de acetoacetato descarboxilase, e em que o um produto ou mais coprodutos compreendem acetona. Modalidade 78. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase e uma atividade de álcool desidrogenase secundária, e em que o um ou mais coprodutos compreendem isopropanol. Modalidade 79. O método de qualquer modalidade precedente, em que uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade do acetoacetato descarboxilase, uma atividade da álcool desidrogenase secundária e uma atividade da desidratase, e em que o um produto ou mais coprodutos compreendem propeno. Modalidade 80. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P na uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma enzima ou mais tendo uma atividade selecionada de uma atividade de tiolase ou acetil coenzima A acetiltransferase, uma atividade de acetil-CoA:acetoacetato transferase ou acetato:acetoacetil-CoA hidrolase, uma atividade de acetoacetato descarboxilase, uma atividade de 3-hidróxi-isovalerato (3HIV) sintase, uma atividade de hidroximetilglutaril-CoA sintase, uma atividade de metilglutaconil-CoA hidratase, uma atividade de metilcrotonil-CoA carboxilase, uma atividade de metilcrotonil-CoA hidratase, uma atividade de 3-hidróxi-isovaleril-CoA tioesterase, uma atividade de 3HIV cinase, uma atividade de 3HIV-3-fosfato descarboxilase e uma atividade de 3HIV descarboxilase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem isobuteno. Modalidade 81. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais coprodutos através da conversão de G3P na uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo- hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase e uma atividade de glicerato 2-cinase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem L-serina. Modalidade 82. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P em uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de transferase, uma atividade de formaldeído desidrogenase, uma atividade de formato desidrogenase, uma atividade associada ao sistema de clivagem de glicina, uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3-fosfo-hidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de serina transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina aminotransferase ou etanolamina oxidorredutase (desaminação), uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, um atividade de 2-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato 3-cinase, uma atividade de glicerato 2-cinase, uma atividade de glicolaldeído desidrogenase, uma atividade de glicolato desidrogenase, uma atividade de alanina-glioxilato aminotransferase, atividade de alanina transaminase, atividade de glutamato desidrogenase dependente de NAD(P)H e em que o um ou mais coprodutos compreendem glicina. Modalidade 83. Método de qualquer modalidade precedente, em que a atividade associada ao sistema de clivagem de glicina compreende uma enzima ou proteína selecionada de uma glicina descarboxilase (proteína P), uma aminometiltransferase (proteína T), uma di-hidrolipoamida desidrogenase (proteína L) e uma Proteína H. Modalidade 84. O método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P na uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase, uma atividade de 3-fosfoserina aminotransferase, uma atividade de 3- fosfoidroxipiruvato fosfatase, uma atividade de fosfoserina fosfatase, uma atividade de transaminase, uma atividade de hidroxipiruvato descarboxilase, uma atividade de serina oxidorredutase (desaminação) ou atividade de serina-piruvato aminotransferase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de hidroxipiruvato redutase, uma atividade de 3-fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de 2- fosfoglicerato fosfatase, uma atividade de glicerato de 3-cinase, uma atividade de glicerato de 2-cinase, uma atividade de acetaldeído desidrogenase e uma atividade de etanolamina amônia liase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem monoetanolamina (MEA). Modalidade 85. Método de qualquer modalidade precedente, em que a uma ou mais enzimas para a produção do um ou mais coprodutos através da conversão de G3P na uma via ou mais vias C3 são selecionadas de uma ou mais enzimas tendo uma atividade selecionada de uma atividade de serina desidrogenase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído descarboxilase, uma atividade de aminoacetaldeído transaminase, uma atividade de 2-aminomalonato semialdeído transaminase, uma atividade de 2,3-diaminopropanoato descarboxilase, uma atividade de serina descarboxilase, uma atividade de etanolamina desidrogenase, uma atividade de serina hidroximetiltransferase, uma atividade de aldeído oxidase, uma atividade de N-acetil transferase ou atividade de O-acetil transferase, uma atividade de N-acetilserina desidrogenase, uma atividade de transaminase, uma atividade de desacetilase, uma atividade de serina aminase e uma atividade de 2,3-diaminopropanoato amônia liase, e em que o um ou mais coprodutos compreendem etilenodiamina (EDA). Modalidade 86. Método de qualquer modalidade precedente, em que o método compreende ainda introdução no micro-organismo recombinante de uma ou mais modificações para diminuir ou excluir atividade em um glicolaldeído redutase, uma glicolaldeído desidrogenase, uma lactato desidrogenase ou uma combinação das mesmas. Modalidade 87. O método de qualquer modalidade precedente, em que pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2. Modalidade 88. Método de qualquer modalidade precedente, em que pelo menos uma porção do NADH em excesso produzido na via C3 é utilizada para produzir ATP. Modalidade 89. Método de qualquer modalidade precedente, em que a formação de biomassa em excesso é minimizada e a produção de MEG ou GA ou MEG e um ou mais coprodutos é maximizada.

Claims (18)

1. Micro-organismo recombinante caracterizado por superexpressar pelo menos uma molécula de ácido nucleico de uma sequência de nucleotídeos selecionada de pelo menos uma das SEQ ID No: 255 e SEQ ID No: 286, codificando uma enzima com atividade D-ribose-5-fosfato aldolase (DERA), caracterizado pelo fato de que o micro-organismo produz um ou mais intermediários de pentose-fosfato a partir de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose, em que o um ou mais intermediários de pentose-fosfato são selecionados de D-ribose-5- fosfato, D-ribulose-5-fosfato ou D-xilulose-5-fosfato, em que dita enzima converte o um ou mais intermediários de pentose-fosfato para gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e glicolaldeído, em que dito micro-organismo recombinante produz um ou mais produtos a partir do G3P e glicolaldeído, em que o um ou mais são selecionados de monoetilenoglicol (MEG) e ácido glicólico (GA), em que dito micro-organismo recombinante ainda compreende um gene deletado ou inativado codificando uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de glicose 6-fosfato-1- desidrogenase, 6-fosfogluconolactonase e 6-fosfogluconato desidrogenase, em que o gene da glicose 6-fosfato-1-desidrogenase é zwf, o gene da 6-fosfogluconolactonase é pgl e o gene da 6- fosfogluconato desidrogenase é gnd, e em que superexpressar se refere a um nível elevado de mRNAs codificando DERA e/ou a níveis elevados de DERA em células comparado com micro-organismos não modificados expressando níveis basais de mRNAs ou tendo níveis basais de DERA.
2. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante coproduz MEG ou GA e um ou mais coprodutos, em que o um ou mais coprodutos são selecionados de acetona, isopropanol, propeno, L-serina, glicina, monoetanolamina (MEA), etilenodiamina ou uma combinação dos mesmos.
3. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo expressa pelo menos enzima tendo atividade de transcetolase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase é codificada por uma sequência de nucleotídeos de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 147 ou SEQ ID NO: 149; o micro-organismo expressa pelo menos enzima tendo atividade de transadolase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de transadolase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 151 ou SEQ ID NO: 153; e o micro-organismo expressa pelo menos enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de ribulose-5-fosfato 3-epimerase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 157.
4. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima tendo atividade DERA compreende uma mutação de cisteína para asparagina na posição correspondente a posição 47 da SEQ ID NO: 256.
5. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima tendo atividade DERA compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 298.
6. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose-5-fosfato isomerase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de ribose- 5-fosfato isomerase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 155 ou SEQ ID NO: 253.
7. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante compreende ainda um gene deletado ou inativado codificando uma ou mais enzimas endógenas selecionadas de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase e fosfoglicerato mutase, em que o gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é gapA, o gene da fosfoglicerato cinase é pgk e o gene da fosfoglicerato mutase é gpmA e/ou gpmM.
8. Micro-organismo recombinante de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase é codificada por uma sequência da SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215 ou SEQ ID NO: 217; e o micro-organismo expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase, em que a pelo menos enzima tendo atividade de fosfato acetiltransferase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 219 ou SEQ ID NO: 221.
9. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante compreende ainda um gene deletado ou inativado codificando uma enzima 6-fosfofrutocinase endógena, em que o gene da 6-fosfofrutocinase é pfkA e/ou pfkB.
10. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-xilose e o micro-organismo recombinante expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de xilose isomerase e expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de xilulose 5-cinase, em que a pelo menos enzima tendo atividade de xilose isomerase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 ou SEQ ID NO: 143; e em que a pelo menos enzima tendo atividade de xilulose 5- cinase é codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 145.
11. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem D-frutose e o micro-organismo recombinante expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de frutose 1,6-bisfosfatase.
12. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais açúcares pentose e/ou hexose compreendem monômeros, oligômeros ou uma combinação dos mesmos.
13. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase e expressa pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase, em que a pelo menos uma enzima tendo atividade de transcetolase e/ou atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase e a expressão de pelo menos uma enzima tendo atividade de D-ribose 5-fosfato aldolase permite uma conversão sem perdas de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose em D-ribose-5-fosfato e a conversão subsequente de D-ribose-5-fosfato em G3P e glicolaldeído.
14. Micro-organismo recombinante de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que MEG ou GA é produzido através da conversão de glicolaldeído em uma via C2 e através da conversão de G3P em uma ou mais vias C3, em que MEG é produzido através da redução de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade da glicolaldeído redutase na via C2 e em que GA é produzido através da oxidação de glicolaldeído por uma enzima tendo atividade de glicolaldeído desidrogenase na via C2.
15. Micro-organismo recombinante de acordo a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção do NADH produzido na via C3 é usada como uma fonte de equivalentes de redução na via C2 e em que pelo menos uma porção do NADH produzido na via C3 é usada para produzir ATP.
16. Método de produção de um ou mais produtos selecionados de MEG e GA, caracterizado pelo fato de que o método compreende o cultivo do micro-organismo recombinante como definido na reivindicação 1 em um meio de cultura contendo um ou mais açúcares pentoses e/ou hexose até que um ou mais produtos sejam produzidos.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante coproduz monoetilenoglicol (MEG) e um ou mais coprodutos.
18. Método de produção do micro-organismo recombinante como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a conversão de um ou mais açúcares pentose e/ou hexose no um ou mais intermediários de pentose-fosfato; superexpressar no micro-organismo recombinante a enzima possuindo atividade DERA para a conversão do um ou mais intermediários de fosfato de pentose em G3P e glicolaldeído; expressar no micro-organismo recombinante uma ou mais enzimas para a produção de um ou mais produtos a partir do G3P e do glicolaldeído.
BR112021015626-7A 2019-02-20 2020-02-20 Microorganismo recombinante superexpressando uma enzima tendo atividade d-ribose-5-fosfato aldolase, método de produção do mesmo e método de produção de um ou mais produtos selecionados de monoetilenoglicol e ácido glicólico BR112021015626B1 (pt)

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