JP2776085B2 - ベクター - Google Patents
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- JP2776085B2 JP2776085B2 JP3245134A JP24513491A JP2776085B2 JP 2776085 B2 JP2776085 B2 JP 2776085B2 JP 3245134 A JP3245134 A JP 3245134A JP 24513491 A JP24513491 A JP 24513491A JP 2776085 B2 JP2776085 B2 JP 2776085B2
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えＤＮＡ技術によ
り真核細胞を用いて異種タンパク質を製造する場合に有
用な、外来遺伝子挿入部位を有するベクター、そのベク
ターに異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
む外来遺伝子が挿入された発現ベクター、およびその発
現ベクターを利用し真核細胞を用いて異種タンパク質を
製造する方法に関する。特に、本発明は、酵母 S.pombe
の細胞内において発現しうる発現ベクターとその利用に
関するものである。
り真核細胞を用いて異種タンパク質を製造する場合に有
用な、外来遺伝子挿入部位を有するベクター、そのベク
ターに異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
む外来遺伝子が挿入された発現ベクター、およびその発
現ベクターを利用し真核細胞を用いて異種タンパク質を
製造する方法に関する。特に、本発明は、酵母 S.pombe
の細胞内において発現しうる発現ベクターとその利用に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、組換えＤＮＡの宿主として大腸
菌、枯草菌、及び酵母サッカロミセスセレビジエなどが
汎用されてきた。このような宿主に、目的とする異種タ
ンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む発現ベクタ
ーを導入し、この発現系を用いて目的とするタンパク質
を多量に製造する方法が広く検討され、既に一部のタン
パク質の製造に実用化されている。
菌、枯草菌、及び酵母サッカロミセスセレビジエなどが
汎用されてきた。このような宿主に、目的とする異種タ
ンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む発現ベクタ
ーを導入し、この発現系を用いて目的とするタンパク質
を多量に製造する方法が広く検討され、既に一部のタン
パク質の製造に実用化されている。
【０００３】遺伝子組換え技術を使用した有用物質の大
量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポイ
ントとなる。従って、宿主の選択範囲を広げておくこと
は重要である。現在では、上記宿主・ベクター系以外に
もいくつかの系が知られている[Candida maltosa (J.Ba
cteriol.,167,561(Takagi ら))、Bacillus amyloliquef
aciens、Acetobacter aceti 、Corynebacterium giutum
icum、Pseudomonas putidaなど］。
量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポイ
ントとなる。従って、宿主の選択範囲を広げておくこと
は重要である。現在では、上記宿主・ベクター系以外に
もいくつかの系が知られている[Candida maltosa (J.Ba
cteriol.,167,561(Takagi ら))、Bacillus amyloliquef
aciens、Acetobacter aceti 、Corynebacterium giutum
icum、Pseudomonas putidaなど］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、宿主の選
択肢をさらに広げるため、宿主としてシゾサッカロミセ
ス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）［以下、S.
pombe という］を用いることを検討した。S.pombe は分
裂酵母 Schizosaccharomyces属の酵母である。本酵母は
酵母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知られ
ており、例えばその糖鎖については動物細胞のものと類
似していることが報告されている。
択肢をさらに広げるため、宿主としてシゾサッカロミセ
ス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）［以下、S.
pombe という］を用いることを検討した。S.pombe は分
裂酵母 Schizosaccharomyces属の酵母である。本酵母は
酵母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知られ
ており、例えばその糖鎖については動物細胞のものと類
似していることが報告されている。
【０００５】目的とする外来の構造遺伝子でコードされ
たタンパク質としてはヒト型タンパク質が望まれること
が多い。しかし、従来の酵母発現系で製造されたタンパ
ク質は、糖鎖を有しないかヒト型タンパク質と糖鎖の相
異が大きく、ヒト体内で免疫反応を起こし易く、またヒ
ト体内で不安定であることが多かった。
たタンパク質としてはヒト型タンパク質が望まれること
が多い。しかし、従来の酵母発現系で製造されたタンパ
ク質は、糖鎖を有しないかヒト型タンパク質と糖鎖の相
異が大きく、ヒト体内で免疫反応を起こし易く、またヒ
ト体内で不安定であることが多かった。
【０００６】一方、ある宿主細胞において外来遺伝子を
効率よく発現させるために、転写開始に必要な遺伝子シ
グナルであるプロモーターとしてより高活性なものを選
択したり、発現ベクターのコピー数を増大させる手段が
行われてきた。しかしながら、S.pombe において高い活
性を有するプロモーターについては知られておらず、S.
pombe を宿主としたベクター系の開発は遅れていた。
効率よく発現させるために、転写開始に必要な遺伝子シ
グナルであるプロモーターとしてより高活性なものを選
択したり、発現ベクターのコピー数を増大させる手段が
行われてきた。しかしながら、S.pombe において高い活
性を有するプロモーターについては知られておらず、S.
pombe を宿主としたベクター系の開発は遅れていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者はこのような現
状に鑑み、S.pombe 細胞内で機能するプロモーターを開
発する必要があると考え、各種プロモーターを検索し
た。その結果、検索したプロモーターの内、動物細胞ウ
イルス由来のプロモーター、特にサイトメガロウイルス
プロモーター、に強いプロモーター活性を認めた。
状に鑑み、S.pombe 細胞内で機能するプロモーターを開
発する必要があると考え、各種プロモーターを検索し
た。その結果、検索したプロモーターの内、動物細胞ウ
イルス由来のプロモーター、特にサイトメガロウイルス
プロモーター、に強いプロモーター活性を認めた。
【０００８】本発明は、このS.pombe 細胞内で機能する
プロモーターを少なくとも２つ有し、しかもS.pombe 細
胞内で発現される異種タンパク質をコードする構造遺伝
子領域を含む外来遺伝子が挿入される挿入部位を有する
S.pombe 形質転換用の下記のベクターである。
プロモーターを少なくとも２つ有し、しかもS.pombe 細
胞内で発現される異種タンパク質をコードする構造遺伝
子領域を含む外来遺伝子が挿入される挿入部位を有する
S.pombe 形質転換用の下記のベクターである。
【０００９】サイトメガロウイルス由来のプロモーター
領域、他の動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、
およびプロモーター領域の下流に存在する外来遺伝子挿
入部位を含むベクターである、S.pombe 形質転換用のベ
クター。
領域、他の動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、
およびプロモーター領域の下流に存在する外来遺伝子挿
入部位を含むベクターである、S.pombe 形質転換用のベ
クター。
【００１０】本発明は、また、上記ベクターの外来遺伝
子挿入部位に異種タンパク質をコードする構造遺伝子領
域を含む外来遺伝子が挿入されてなる発現ベクター、お
よびその発現ベクターを有するＳ．ｐｏｍｂｅからなる
異種タンパク質を発現しうる形質転換体である。
子挿入部位に異種タンパク質をコードする構造遺伝子領
域を含む外来遺伝子が挿入されてなる発現ベクター、お
よびその発現ベクターを有するＳ．ｐｏｍｂｅからなる
異種タンパク質を発現しうる形質転換体である。
【００１１】本発明は、さらに、上記発現ベクターを有
するＳ．ｐｏｍｂｅを培養して異種タンパク質を産生さ
せ、この異種タンパク質を回収することを特徴とするタ
ンパク質の製造方法である。
するＳ．ｐｏｍｂｅを培養して異種タンパク質を産生さ
せ、この異種タンパク質を回収することを特徴とするタ
ンパク質の製造方法である。
【００１２】本発明において、外来遺伝子とは宿主細胞
が本来有していない遺伝子をいい、この外来遺伝子は異
種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を有してい
る。異種タンパク質とは宿主細胞が本来有していない構
造遺伝子領域でコードされたタンパク質であり、特にヒ
ト細胞が産生しかつ生理活性を有するタンパク質が好ま
しい。
が本来有していない遺伝子をいい、この外来遺伝子は異
種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を有してい
る。異種タンパク質とは宿主細胞が本来有していない構
造遺伝子領域でコードされたタンパク質であり、特にヒ
ト細胞が産生しかつ生理活性を有するタンパク質が好ま
しい。
【００１３】本発明のベクターは (1) S.pombe の細胞内において機能する複製開始点を有
するか有せず、 (2) サイトメガロウイルス由来のプロモーター領域と他
の動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、および (3) 上記プロモーター下流に設けられた外来遺伝子挿入
部位、を含み、さらに好ましくは、 (4) サッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cere
visiae）のLEU2またはURA3遺伝子、および／または (5) 上記プロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝
子、
するか有せず、 (2) サイトメガロウイルス由来のプロモーター領域と他
の動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、および (3) 上記プロモーター下流に設けられた外来遺伝子挿入
部位、を含み、さらに好ましくは、 (4) サッカロミセス セレビジエ（Saccharomyces cere
visiae）のLEU2またはURA3遺伝子、および／または (5) 上記プロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝
子、
【００１４】を含むことによって特徴づけられるものが
好ましい。さらに、本発明の（発現）ベクターは、大腸
菌内でのプラスミド調製などを容易にするために、大腸
菌内でも複製、選択ができるようなＤＮＡ領域を持つも
の（すなわち、シャトルベクターとして使用しうるも
の）が好ましい。本発明においてベクターは複製開始点
を有していても有していなくてもよい。Ｓ．ｐｏｍｂｅ
の形質転換技術においてよく知られているように（たと
えば、Ｋ．Ｓａｋａｉ ｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏ
ｌ．４，６５１−６５６（１９８４））、複製開始点を
有しない発現ベクターと複製開始点を有する第２のベク
ターとを同じ細胞内に導入することによって相同的組換
え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎ）により発現ベクターを発現させることができること
より、本発明においても複製開始点を有しないベクター
を用いることができる。
好ましい。さらに、本発明の（発現）ベクターは、大腸
菌内でのプラスミド調製などを容易にするために、大腸
菌内でも複製、選択ができるようなＤＮＡ領域を持つも
の（すなわち、シャトルベクターとして使用しうるも
の）が好ましい。本発明においてベクターは複製開始点
を有していても有していなくてもよい。Ｓ．ｐｏｍｂｅ
の形質転換技術においてよく知られているように（たと
えば、Ｋ．Ｓａｋａｉ ｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏ
ｌ．４，６５１−６５６（１９８４））、複製開始点を
有しない発現ベクターと複製開始点を有する第２のベク
ターとを同じ細胞内に導入することによって相同的組換
え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎ）により発現ベクターを発現させることができること
より、本発明においても複製開始点を有しないベクター
を用いることができる。
【００１５】上記他の動物細胞ウイルスとしては、前記
SV40 が好ましいが、充分なプロモーター活性を有する
プロモーター領域を有する動物細胞ウイルスである限り
必ずしもこれに限られるものではない。
SV40 が好ましいが、充分なプロモーター活性を有する
プロモーター領域を有する動物細胞ウイルスである限り
必ずしもこれに限られるものではない。
【００１６】上記ウイルスプロモーター下流に設けた外
来遺伝子挿入部位は外来の遺伝子を導入するための部位
であり、種々の制限酵素切断部位を含む遺伝子領域であ
る。制限酵素切断部位は市販の適当な合成リンカーを導
入することによって容易に作ることができる。外来遺伝
子は異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
み、この構造遺伝子領域を細胞内で発現させることによ
り異種タンパク質が産生される。
来遺伝子挿入部位は外来の遺伝子を導入するための部位
であり、種々の制限酵素切断部位を含む遺伝子領域であ
る。制限酵素切断部位は市販の適当な合成リンカーを導
入することによって容易に作ることができる。外来遺伝
子は異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
み、この構造遺伝子領域を細胞内で発現させることによ
り異種タンパク質が産生される。
【００１７】上記LEU2遺伝子とURA3遺伝子は、本ベクタ
ーをロイシンまたはウラシル要求性の細胞に導入しロイ
シンまたはウラシル要求性を解除した形質転換体を選択
するために通常必要とされる。この操作を行うことによ
り希望する遺伝子を導入したベクターを持った酵母を容
易に得ることが可能になる。
ーをロイシンまたはウラシル要求性の細胞に導入しロイ
シンまたはウラシル要求性を解除した形質転換体を選択
するために通常必要とされる。この操作を行うことによ
り希望する遺伝子を導入したベクターを持った酵母を容
易に得ることが可能になる。
【００１８】さらに、異種タンパク質発現量を高める目
的で発現ベクターコピー数を増大させるために、ベクタ
ーにネオマイシン耐性遺伝子を導入することが好まし
い。この発現ベクターを導入した酵母に対し G418(ネオ
マイシン）選択を行えば、ネオマイシン耐性遺伝子を多
く含む酵母のみが選択される。これにより、それを行わ
ない場合に比較して数倍の発現ベクターコピー数増加が
期待される。
的で発現ベクターコピー数を増大させるために、ベクタ
ーにネオマイシン耐性遺伝子を導入することが好まし
い。この発現ベクターを導入した酵母に対し G418(ネオ
マイシン）選択を行えば、ネオマイシン耐性遺伝子を多
く含む酵母のみが選択される。これにより、それを行わ
ない場合に比較して数倍の発現ベクターコピー数増加が
期待される。
【００１９】プラスミドの構築、調製を行うためには大
腸菌を宿主とするのが簡便なため大腸菌中でも複製、調
製が可能であることが望ましい（すなわち、本発明のベ
クターや発現ベクターはシャトルベクターであることが
好ましい）。このシャトルベクターを構築するために使
用する大腸菌中で複製可能なベクターとしては種々の公
知ベクターを利用することができる。
腸菌を宿主とするのが簡便なため大腸菌中でも複製、調
製が可能であることが望ましい（すなわち、本発明のベ
クターや発現ベクターはシャトルベクターであることが
好ましい）。このシャトルベクターを構築するために使
用する大腸菌中で複製可能なベクターとしては種々の公
知ベクターを利用することができる。
【００２０】外来の構造遺伝子領域でコードされる異種
タンパク質としては、生理活性を有するタンパク質、特
にヒトに対して有用な生理活性を有するタンパク質が好
ましい。さらには、大腸菌を宿主とする組換えＤＮＡ技
術によっては製造の困難な糖鎖を有するタンパク質、す
なわち糖タンパク、が好ましい。生理活性を有する糖タ
ンパクとしては、例えばヒト由来リポコルチンＩ、アル
ギナーゼ、ＩＬ−６などがある。
タンパク質としては、生理活性を有するタンパク質、特
にヒトに対して有用な生理活性を有するタンパク質が好
ましい。さらには、大腸菌を宿主とする組換えＤＮＡ技
術によっては製造の困難な糖鎖を有するタンパク質、す
なわち糖タンパク、が好ましい。生理活性を有する糖タ
ンパクとしては、例えばヒト由来リポコルチンＩ、アル
ギナーゼ、ＩＬ−６などがある。
【００２１】ヒト由来リポコルチンＩはフォスフォリパ
ーゼＡ2 の活性を抑制する作用を有する分子量約３〜４
万の糖タンパクであり、ステロイドの有害な副作用なし
に抗炎症効果を有する医薬として期待されている。この
ヒトリポコルチンＩを組換えＤＮＡ技術により大腸菌等
を宿主として製造する方法が知られている（例えば、特
表昭62-501679 号公報参照）。しかし、この大腸菌を使
用する方法はヒトリポコルチンＩの発現量が低いことが
報告されている。ヒトリポコルチンＩの遺伝子を導入し
た本発明の発現ベクターを使用することにより、ヒトリ
ポコルチンＩの発現量を大幅に向上することができる。
ーゼＡ2 の活性を抑制する作用を有する分子量約３〜４
万の糖タンパクであり、ステロイドの有害な副作用なし
に抗炎症効果を有する医薬として期待されている。この
ヒトリポコルチンＩを組換えＤＮＡ技術により大腸菌等
を宿主として製造する方法が知られている（例えば、特
表昭62-501679 号公報参照）。しかし、この大腸菌を使
用する方法はヒトリポコルチンＩの発現量が低いことが
報告されている。ヒトリポコルチンＩの遺伝子を導入し
た本発明の発現ベクターを使用することにより、ヒトリ
ポコルチンＩの発現量を大幅に向上することができる。
【００２２】
【実施例】次に本発明を実施例をもって具体的に説明す
るが、実施例は具体的認識を得るために挙げたものであ
り、本発明を限定するものではない。
るが、実施例は具体的認識を得るために挙げたものであ
り、本発明を限定するものではない。
【００２３】［実施例１］ベクターの製造 (1) ars （複製開始点）を含まない cDNA ベクターを用
いた形質転換方法 酵母ベクター；pAU5（ars、stb、URA3） pAL7（ars、stb、LEU2）、及び DNA ベクター；pcD、 pcD2、 pcD4 、
いた形質転換方法 酵母ベクター；pAU5（ars、stb、URA3） pAL7（ars、stb、LEU2）、及び DNA ベクター；pcD、 pcD2、 pcD4 、
【００２４】は公知の方法（K.Okazaki et.al.,Nucleic
Acids Research,Vol.18,6485-6489,(1990) 、K.Okayam
a et.al.,Molecular Cellular Biology,Vol.3,280-289,
(1983)）で調製した（図１に得られたこれらベクターの
ベクター構成図を示す）。
Acids Research,Vol.18,6485-6489,(1990) 、K.Okayam
a et.al.,Molecular Cellular Biology,Vol.3,280-289,
(1983)）で調製した（図１に得られたこれらベクターの
ベクター構成図を示す）。
【００２５】酵母ベクターpAU5、pAL7をpstIで切断した
ものを調製し、これを重量で１に対してcDNAベクター２
の割合で公知の酵母の形質転換方法によって、以下の方
法を用いて形質転換体を得ることができた。
ものを調製し、これを重量で１に対してcDNAベクター２
の割合で公知の酵母の形質転換方法によって、以下の方
法を用いて形質転換体を得ることができた。
【００２６】宿主としてロイシン要求性株、S.pombe 1e
ul-32h-(ATCC-38399) を用いた。この宿主細胞を最少培
地にて (0.5 〜１) ×107 cells/mlになるまで生育さ
せ、集菌、洗菌後109 cells/mlとなるように、0.1M LiO
Ac（酢酸リチウム)(pH 5）で懸濁し、30℃で60分間イン
キュベートした。
ul-32h-(ATCC-38399) を用いた。この宿主細胞を最少培
地にて (0.5 〜１) ×107 cells/mlになるまで生育さ
せ、集菌、洗菌後109 cells/mlとなるように、0.1M LiO
Ac（酢酸リチウム)(pH 5）で懸濁し、30℃で60分間イン
キュベートした。
【００２７】その後、ＤＮＡを上記懸濁液に 100μｌあ
たり１μｇ、50％(w/v) ポリエチレングリコール(PEG40
00) 水溶液を290 μｌ加えてよく撹拌した後、30℃で60
分間、43℃で15分間インキュベートし、室温で10分放置
した。遠心によりPEG を除去した後、適当量の培養液に
懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は 105／μｇ
( ＤＮＡ) 以上であった。
たり１μｇ、50％(w/v) ポリエチレングリコール(PEG40
00) 水溶液を290 μｌ加えてよく撹拌した後、30℃で60
分間、43℃で15分間インキュベートし、室温で10分放置
した。遠心によりPEG を除去した後、適当量の培養液に
懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は 105／μｇ
( ＤＮＡ) 以上であった。
【００２８】(2) ars を含むベクターの構築と形質転換 酵母ベクター pAU5 または pAL7 を XcaI で切断し、ブ
ラント化した後pstIで切断した。一方、pcD 、pcD2、 p
cD4 ベクターを salI で切断し、ブラント化した後pstI
で切断した。次いで、前者と後者の切断されたベクター
を結合した（図２はこのベクターの構築方法を示すフロ
ーシートである）。
ラント化した後pstIで切断した。一方、pcD 、pcD2、 p
cD4 ベクターを salI で切断し、ブラント化した後pstI
で切断した。次いで、前者と後者の切断されたベクター
を結合した（図２はこのベクターの構築方法を示すフロ
ーシートである）。
【００２９】その結果、pcDAL、pcDAU、pcD2AL、pcD2AU、
pcD4AL、pcD4AU（名称は両ベクター名の結合で表わす）
を得た。これらのベクターを１μｇ用いて、(1) と同様
に形質転換を行った。
pcD4AL、pcD4AU（名称は両ベクター名の結合で表わす）
を得た。これらのベクターを１μｇ用いて、(1) と同様
に形質転換を行った。
【００３０】［実施例２］ロイシン要求性株、S.pombe
1eul-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells/m
lになるまで生育させた。集菌、洗菌後107 cells/mlに
なるように 0.1MLiOAc(pH5)に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。その後、上記懸濁液 100μｌに、pA
L7を PstI で切断したもの１μｇ、 pcD4AT ２μｇをTE
（トリスEDTA) 15μｌに加えたもの、および50％(w/v)
PEG4000 水溶液 290μｌを加え、よく混合した後、30℃
で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にインキュ
ベートし、遠心により PEGを除去した後、培養液１mlに
懸濁した。
1eul-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells/m
lになるまで生育させた。集菌、洗菌後107 cells/mlに
なるように 0.1MLiOAc(pH5)に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。その後、上記懸濁液 100μｌに、pA
L7を PstI で切断したもの１μｇ、 pcD4AT ２μｇをTE
（トリスEDTA) 15μｌに加えたもの、および50％(w/v)
PEG4000 水溶液 290μｌを加え、よく混合した後、30℃
で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にインキュ
ベートし、遠心により PEGを除去した後、培養液１mlに
懸濁した。
【００３１】その懸濁液を200mｌフラスコ中に培養液９
mlとともに加えて32℃で30分間、室温で60分間インキュ
ベートした後、0.3ml を最少寒天培地に塗布した。２日
後、形質転換体が 105／μg(pAL7) の割合で出現した。
mlとともに加えて32℃で30分間、室温で60分間インキュ
ベートした後、0.3ml を最少寒天培地に塗布した。２日
後、形質転換体が 105／μg(pAL7) の割合で出現した。
【００３２】［実施例３］実施例２で得た形質転換体を
３％グルコース、0.5 ％イースト抽出液、25μg/mlのG4
18を含む培地50mlで２日間培養後、集菌、洗菌し、250m
M トリス塩酸（pH8.0）に懸濁し、超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。同様にしてS.pombe leul
-32h-、及びpAL7+pcDCAT で形質転換した株とpAL7+pcD4
CATで形質転換した株を上記培地からG418を除いた培地
で同様に生育させ細胞抽出液を調製した。
３％グルコース、0.5 ％イースト抽出液、25μg/mlのG4
18を含む培地50mlで２日間培養後、集菌、洗菌し、250m
M トリス塩酸（pH8.0）に懸濁し、超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。同様にしてS.pombe leul
-32h-、及びpAL7+pcDCAT で形質転換した株とpAL7+pcD4
CATで形質転換した株を上記培地からG418を除いた培地
で同様に生育させ細胞抽出液を調製した。
【００３３】各細胞抽出液中のタンパク質10μｇに、４
mMアセチルCoA. 18 μｌ、水１μｌ、および14Ｃ−クロ
ラムフェニコールを加え、37℃で１時間インキュベート
した後、400 μｌのEtOAc(酢酸エチル) を加え上層を抽
出した。遠心乾固させた後25μｌのEtOAc に再び溶かし
TLC にスポットし、クロロホルム／メタノール（＝95／
5)の展開溶媒にて展開、オートラジオグラフ15時間で C
AT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）アッセイを行った。
mMアセチルCoA. 18 μｌ、水１μｌ、および14Ｃ−クロ
ラムフェニコールを加え、37℃で１時間インキュベート
した後、400 μｌのEtOAc(酢酸エチル) を加え上層を抽
出した。遠心乾固させた後25μｌのEtOAc に再び溶かし
TLC にスポットし、クロロホルム／メタノール（＝95／
5)の展開溶媒にて展開、オートラジオグラフ15時間で C
AT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）アッセイを行った。
【００３４】その結果のチャートを図３に示す。レーン
１はコントロールでベクターを含まない宿主酵母を用い
た結果、レーン２はSV40プロモーターを持つ形質転換体
での結果、レーン３はサイトメガロウイルスプロモータ
ー、レーン４はサイトメガロウイルスプロモーターを含
む菌体をG418存在下で培養した形質転換体での結果を示
す。
１はコントロールでベクターを含まない宿主酵母を用い
た結果、レーン２はSV40プロモーターを持つ形質転換体
での結果、レーン３はサイトメガロウイルスプロモータ
ー、レーン４はサイトメガロウイルスプロモーターを含
む菌体をG418存在下で培養した形質転換体での結果を示
す。
【００３５】［実施例４］ヒト由来リポコルチンＩを含
む発現ベクターの作製方法 ヒト繊維芽細胞由来の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリ
ー（pcD ベクター）を公知の方法により調製した。
む発現ベクターの作製方法 ヒト繊維芽細胞由来の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリ
ー（pcD ベクター）を公知の方法により調製した。
【００３６】すでに知られている（Nature,320,77, (19
86) ) ヒトリポコルチンＩの遺伝子配列のうち、タンパ
ク質のＮ端側アミノ酸配列をコードする遺伝子配列（AT
GGCAATGGTATCAGAATTCCTCAAGCAGGCCTGGTTTATTGAAAATGAの
50塩基）をＤＮＡプローブとして上述のライブラリーか
らリポコルチンＩの遺伝子をコロニーハイブリダイゼイ
ション法により取得し、塩基配列を決定することによ
り、リポコルチンＩタンパク質全長をコードするもので
あることを確認した。取得したクローンをpcD lipoI と
名付けた。
86) ) ヒトリポコルチンＩの遺伝子配列のうち、タンパ
ク質のＮ端側アミノ酸配列をコードする遺伝子配列（AT
GGCAATGGTATCAGAATTCCTCAAGCAGGCCTGGTTTATTGAAAATGAの
50塩基）をＤＮＡプローブとして上述のライブラリーか
らリポコルチンＩの遺伝子をコロニーハイブリダイゼイ
ション法により取得し、塩基配列を決定することによ
り、リポコルチンＩタンパク質全長をコードするもので
あることを確認した。取得したクローンをpcD lipoI と
名付けた。
【００３７】pcD lipoI をBamHI で切断することによ
り、リポコルチンＩ遺伝子を切り出した。一方公知の方
法で調製したpcD4CATをBamHI で切断し、CAT 遺伝子を
除去後ライゲーションし、pcD4を作製した。pcD4をBamH
I で部分切断し、平滑末端化した後ライゲーションして
pcD4 Bを作製した。pcD4 BをBamHI で切断し、アルカリ
フォスファターゼ処理したものと、pcD lipoI から得た
リポコルチンＩ遺伝子断片とをライゲーションすること
によりpcD4 lipoIを得た。図４はこのベクターの構築方
法を示すフローシートである。
り、リポコルチンＩ遺伝子を切り出した。一方公知の方
法で調製したpcD4CATをBamHI で切断し、CAT 遺伝子を
除去後ライゲーションし、pcD4を作製した。pcD4をBamH
I で部分切断し、平滑末端化した後ライゲーションして
pcD4 Bを作製した。pcD4 BをBamHI で切断し、アルカリ
フォスファターゼ処理したものと、pcD lipoI から得た
リポコルチンＩ遺伝子断片とをライゲーションすること
によりpcD4 lipoIを得た。図４はこのベクターの構築方
法を示すフローシートである。
【００３８】［実施例５］ロイシン要求性株、S.Pombe
leu1-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells／
mlになるまで生育させた。集菌、洗菌後109 cells/mlに
なるように0.1M LiOAc(pH5) に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。
leu1-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells／
mlになるまで生育させた。集菌、洗菌後109 cells/mlに
なるように0.1M LiOAc(pH5) に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。
【００３９】その後、上記懸濁液100 μｌに、pAL7をPs
tIで切断したもの１μｇ、実施例４で得た pcD4 lipoI
２μｇ、TE 15 μｌを加え、さらに50％(w/v)PEG4000水
溶液を 290μｌ加えよく混合した後30℃で60分間、43℃
で15分間、室温で10分間の順にインキュベートし、遠心
によりPEG を除去、培養液１mlに懸濁した。200 mlフラ
スコ中に培養液９mlとともに加えて32℃で30分間、室温
で60分間インキュベートした後、0.3 mlを最少寒天培地
に塗布した。２日後形質転換体が105/μｇ（pAL7）の割
合で出現した。
tIで切断したもの１μｇ、実施例４で得た pcD4 lipoI
２μｇ、TE 15 μｌを加え、さらに50％(w/v)PEG4000水
溶液を 290μｌ加えよく混合した後30℃で60分間、43℃
で15分間、室温で10分間の順にインキュベートし、遠心
によりPEG を除去、培養液１mlに懸濁した。200 mlフラ
スコ中に培養液９mlとともに加えて32℃で30分間、室温
で60分間インキュベートした後、0.3 mlを最少寒天培地
に塗布した。２日後形質転換体が105/μｇ（pAL7）の割
合で出現した。
【００４０】［実施例６］実施例４で得た形質転換体を
２％グルコース、１％イースト抽出液、２％ペプトン、
からなる培地50mlにて32℃で一晩培養後、その培養液か
ら５×107cells程度の菌体をとり、１％イースト抽出
液、２％ペプトン、２％グルコース、200 μｇ／mlのG4
18を含む培地にて37℃で24時間培養した。培養後、集
菌、洗菌し、生理食塩水に懸濁し超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。この細胞抽出液をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析したところ分
子量 36Kのタンパク質のバンドが確認され、クーマシー
ブリリアントブルー染色によれば全タンパク質の５％に
相当するものと認められた。
２％グルコース、１％イースト抽出液、２％ペプトン、
からなる培地50mlにて32℃で一晩培養後、その培養液か
ら５×107cells程度の菌体をとり、１％イースト抽出
液、２％ペプトン、２％グルコース、200 μｇ／mlのG4
18を含む培地にて37℃で24時間培養した。培養後、集
菌、洗菌し、生理食塩水に懸濁し超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。この細胞抽出液をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析したところ分
子量 36Kのタンパク質のバンドが確認され、クーマシー
ブリリアントブルー染色によれば全タンパク質の５％に
相当するものと認められた。
【００４１】この 36KのバンドがヒトリポコルチンＩで
あることを確認する目的でウェスタンブロットを行っ
た。 36KバンドはヒトリポコルチンＩに特異的に反応す
る抗体により特異的に染色された。対照としてヒトリポ
コルチン遺伝子を含まないベクターを持つS.pombe 細胞
抽出液を解析したが、ヒトリポコルチン抗体により染色
されるバンドは認められなかった。
あることを確認する目的でウェスタンブロットを行っ
た。 36KバンドはヒトリポコルチンＩに特異的に反応す
る抗体により特異的に染色された。対照としてヒトリポ
コルチン遺伝子を含まないベクターを持つS.pombe 細胞
抽出液を解析したが、ヒトリポコルチン抗体により染色
されるバンドは認められなかった。
【００４２】図５にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動図（クーマシーブリリアントブルー染色(1)(2)）、
及びウェスタンブロット観察図（(3)(4)）を示す。 (1)(3);対照となるプラスミドpcD4 Xで形質転換したS.p
ombe (2)(4);pcD4 lipoIにて形質転換したS.pombe
泳動図（クーマシーブリリアントブルー染色(1)(2)）、
及びウェスタンブロット観察図（(3)(4)）を示す。 (1)(3);対照となるプラスミドpcD4 Xで形質転換したS.p
ombe (2)(4);pcD4 lipoIにて形質転換したS.pombe
【００４３】［実施例７］実施例５で発現されたヒトリ
ポコルチンは以下のようにして精製した。実施例６で得
た細胞抽出液を、0.15M NaClと1mM CaCl2 を含む20mMト
リス塩酸(pH7.5)に透析し、Uchida & Filburn ( J.Bio
l.Chem.259、12311 (1984))の方法によって作製したポリ
アクリルアミド固定化フォスファチジルセリンと混ぜ、
４℃、1 時間放置した。遠心後（8,000 G 、15min)、残
渣を、0.15M NaClと１mM CaCl2を含む20mMトリス塩酸(p
H7.5) にて洗い、さらに5mM EDTAと0.15M NaClを含む20
mMトリス塩酸(pH7.5) に懸濁した。４℃、30分放置後、
遠心（8,000 G 、20min ）し、上清を5mM NH4OAc（酢酸
アンモニウム)(pH 8.6）にて透析した。
ポコルチンは以下のようにして精製した。実施例６で得
た細胞抽出液を、0.15M NaClと1mM CaCl2 を含む20mMト
リス塩酸(pH7.5)に透析し、Uchida & Filburn ( J.Bio
l.Chem.259、12311 (1984))の方法によって作製したポリ
アクリルアミド固定化フォスファチジルセリンと混ぜ、
４℃、1 時間放置した。遠心後（8,000 G 、15min)、残
渣を、0.15M NaClと１mM CaCl2を含む20mMトリス塩酸(p
H7.5) にて洗い、さらに5mM EDTAと0.15M NaClを含む20
mMトリス塩酸(pH7.5) に懸濁した。４℃、30分放置後、
遠心（8,000 G 、20min ）し、上清を5mM NH4OAc（酢酸
アンモニウム)(pH 8.6）にて透析した。
【００４４】透析後、5mM NH4OAc(pH 8.6)で平衡化した
Mono Qカラム（ファルマシア）にかけ未吸着画分を集
め、さらにそれを10mM NH4OAc(pH6.0)に透析したのち、
10mMNH4OAc(pH6.0)で平衡化したMono Sカラム（ファル
マシア）にかけ０〜0.4M NaCl の直線勾配により溶出さ
せ0.07M NaClで溶出されてくる画分を集めた。これによ
りヒトリポコルチンＩを精製することができた。純度は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％−20％ア
クリルアミドゲル（TEFCO)) により検定することができ
クーマシーブリリアントブルー染色により36K の位置に
唯一のバンドを確認した。
Mono Qカラム（ファルマシア）にかけ未吸着画分を集
め、さらにそれを10mM NH4OAc(pH6.0)に透析したのち、
10mMNH4OAc(pH6.0)で平衡化したMono Sカラム（ファル
マシア）にかけ０〜0.4M NaCl の直線勾配により溶出さ
せ0.07M NaClで溶出されてくる画分を集めた。これによ
りヒトリポコルチンＩを精製することができた。純度は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％−20％ア
クリルアミドゲル（TEFCO)) により検定することができ
クーマシーブリリアントブルー染色により36K の位置に
唯一のバンドを確認した。
【００４５】
【発明の効果】酵母S. pombe内で発現することができる
新規なベクターを構築することができ、しかもそのベク
ターを用いてS. pombeにより効率よく異種タンパク質を
産生させることができた。
新規なベクターを構築することができ、しかもそのベク
ターを用いてS. pombeにより効率よく異種タンパク質を
産生させることができた。
【図１】実施例に用いたベクターのベクター構成図
【図２】本発明のベクターの構築方法を示すフローシー
ト
ト
【図３】ＣＡＴアッセイの結果を示すチャート
【図４】外来遺伝子領域を含むベクターの構築方法を示
すフローシート
すフローシート
【図５】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図およ
びウェスタンブロット観察図
びウェスタンブロット観察図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 熊谷 博道 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社 中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−285786（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−1394（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−501679（ＪＰ，Ａ) 特公 昭61−50961（ＪＰ，Ｂ２) ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵ ＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ ＩＣＳ，ＶＯＬ．66，（1990），Ｐ. 201−206 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/14 - 1/19 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】サイトメガロウイルス由来のプロモーター
領域、他の動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、
およびプロモーター領域の下流に存在する外来遺伝子挿
入部位を含むベクターである、酵母シゾサッカロミセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）形質転換用の
ベクター。 - 【請求項２】他の動物細胞ウイルス由来のプロモーター
領域が、SV40由来のプロモーター領域である、請求項１
記載のベクター。 - 【請求項３】ベクターが、さらに、ネオマイシン耐性遺
伝子領域、LEU2遺伝子領域、およびURA3遺伝子領域の少
なくとも１種を含む、請求項１または２記載のベクタ
ー。 - 【請求項４】請求項１、２または３記載のベクターの外
来遺伝子挿入部位に異種タンパク質をコードする構造遺
伝子領域を含む外来遺伝子を挿入してなる、酵母シゾサ
ッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
形質転換用の発現ベクター。 - 【請求項５】異種タンパク質をコードする構造遺伝子領
域が、ヒトリポコルチンＩをコードする遺伝子領域であ
る、請求項４記載の発現ベクター。 - 【請求項６】請求項４記載の発現ベクターを導入した酵
母シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）からなる、異種タンパク質を発現しうる形質転
換体。 - 【請求項７】請求項５記載の発現ベクターを導入した酵
母シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）からなる、ヒトリポコルチンＩを発現しうる形
質転換体。 - 【請求項８】請求項６記載の形質転換体を培養して異種
タンパク質を産生させ、この異種タンパク質を回収する
ことを特徴とするタンパク質の製造方法。 - 【請求項９】請求項７記載の形質転換体を培養してヒト
リポコルチンＩを産生させ、このヒトリポコルチンＩを
回収することを特徴とするヒトリポコルチンＩの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3245134A JP2776085B2 (ja) | 1990-09-14 | 1991-08-30 | ベクター |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24280690 | 1990-09-14 | ||
| JP2-242806 | 1990-09-14 | ||
| JP3245134A JP2776085B2 (ja) | 1990-09-14 | 1991-08-30 | ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0515380A JPH0515380A (ja) | 1993-01-26 |
| JP2776085B2 true JP2776085B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=26535935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3245134A Expired - Lifetime JP2776085B2 (ja) | 1990-09-14 | 1991-08-30 | ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2776085B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2014030644A1 (ja) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995009914A1 (fr) * | 1993-10-05 | 1995-04-13 | Asahi Glass Company Ltd. | Vecteur de multiclonage, vecteur d'expression, et production d'une proteine exogene au moyen dudit vecteur d'expression |
| EP2341139B1 (en) | 2008-10-01 | 2016-05-04 | Asahi Glass Company, Limited | Host, transformant, method for producing the transformant, and method for producing heterogeneous protein containing o-glycoside type sugar chain |
| KR20110117101A (ko) | 2009-01-27 | 2011-10-26 | 아사히 가라스 가부시키가이샤 | 스키조사카로미세스·폼베의 형질 전환 방법 및 형질 전환체, 그리고 이종 단백질의 제조 방법 |
| JP5772594B2 (ja) | 2009-08-21 | 2015-09-02 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
| CN103180442A (zh) | 2010-11-05 | 2013-06-26 | 旭硝子株式会社 | 裂殖酵母属酵母的转化体及其制造方法 |
| WO2012128260A1 (ja) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 |
| EP3072955B1 (en) | 2013-11-22 | 2019-01-09 | JMTC Enzyme Corporation | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62501A (ja) * | 1985-03-07 | 1987-01-06 | Daicel Chem Ind Ltd | セルロ−スアセテ−トの製造方法 |
-
1991
- 1991-08-30 JP JP3245134A patent/JP2776085B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ，ＶＯＬ．６６，（１９９０），Ｐ．２０１−２０６ |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| US8329448B2 (en) | 2005-08-03 | 2012-12-11 | Asahi Glass Company, Limited | Yeast host, transformant and method for producing heterologous proteins |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2014030644A1 (ja) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター |
| US9765347B2 (en) | 2012-08-20 | 2017-09-19 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant of Schizosaccharomyces pombe mutant and cloning vector |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0515380A (ja) | 1993-01-26 |
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