KR100196741B1 - 병아리 베타-액틴 유전자 프리모터를 함유한 외생 유전자 발현 벡타 - Google Patents

병아리 베타-액틴 유전자 프리모터를 함유한 외생 유전자 발현 벡타 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 외생 유전자 발현 벡타
제1도는 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 DNA서열을 나타낸 것이다.
제2도는 제한 효소 NcoI에 의해 인지된 DNA서열을 나타낸 것이다.
제3도는 제한 효소 NcoI으로 절단한 후의 DNA 서열을 나타낸 것이다.
제4도는 실시예 1에서 제조된 플라스미드 p28내의 프로모터 하류에 삽입된 HindIII링커의 위치를 나타낸 것이다.
제5도는 실시예에서 제조된 플라스미드 pAG-2내에 함유되어 있는 혼성 프로모터인, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터 및 토끼 β-글로빈 유전자를 포함하는 혼성 프로모터의 DNA서열을 나타낸 것이다.
제6도는 플라스미드 pAC-2 의 구조를 나타낸 것이다.
제7도는 플라스미드 pSAC-2 의 구조를 나타낸 것이다.
제8도는 플라스미드 pAS-2 의 구조를 나타낸 것이다.
제9도는 플라스미드 pAR-2 의 구조를 나타낸 것이다.
제10도는 플라스미드 pKCR의 구조를 나타낸 것이다.
제11도는 플라스미드 pAG-2의 구조를 나타낸 것이다.
제12도는 플라스미드 pS-1의 구조를 나타낸 것이다.
제13도는 플라스미드 pS-2의 구조를 나타낸 것이다.
제14도는 플라스미드 pAcS-2의 구조를 나타낸 것이다.
제15도는 플라스미드 pARS-2의 구조를 나타낸 것이다.
제16도는 플라스미드 pAGS-2의 구조를 나타낸 것이다.
본 발명은 동물 세포 내에서의 외생유전자의 발현을 위한 발현 벡타에 관한 것이며, 더욱 특별하게는, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터 또는 그의 변형된 프로모터를 함유하며 동물 세포내에서 임의의 외생유전자를 효과적으로 발현시키는데 사용되는 발현 벡타에 관한 것이다.
최근, 유전자 공학 기술의 진보에 따라, 유전자 공학 기술을 이용함으로써 유용한 물질을 생산하는 기술이 급속히 발전하고 있다.
유전자 공학 기술을 이용하는 외생유전자의 발현을 위해, 적합한 숙주세포 및 사용된 숙주세포에 적합한 발현 벡타가 사용된다.
발현을 위한 숙주세포로서, 이.콜리 및 효모와 같이 다루기에 용이한 미생물이 지금까지 널리 연구되어 왔다. 그러나, 최근에, 이들 미생물의 용도는 외생유전자의 일부분 발현에 있어서 어느 정도로 제한됨이 확인됨에 따라, 숙주세포로서 고등동물 배양 세포를 사용하는 발현계가 광범위하게 연구되고 있다.
다양한 동물 비루스성 유전자 프로모터 또는 동물세포 유전자 프로모터를 이용하는 발현계를 포함하여, 숙주세포로서 동물세포를 사용하는 발현계가 이미 보고된 바있다. 동물 비루스성 유전자 프로모터로는 SV40 유전자 프로모터, 아데노비루스 주 후기 유전자 프로모터, B형간염 비루스 유전자 프로모터등이 있다.
동물 세포 유전자 프로모터로는 티미딘키나아제(tk) 유전자 프로모터, 메탈로티오네인 유전자 프로모터, 인터페론 유전자 프로모터, 면역 글로불린 유전자 프로모터등이 있다.
상기 프로모터중, 특히 SV 40초기 유전자 프로모터, SV40 후기 유전자 프로모터 및 아데노비루스 주 후기 유전자 프로모터가 강력한 프로모터 활성을 지닌다고 알려져 있다. 그러나, 아직 공장 규모로 생산하기에는 불충분하여 더욱 강력하고 높게 발현 가능한 프로모터가 개발되고 있다.
이러한 상황하에, 본 발명자들은 강력하면서도 공장 규모로 임의의 외생 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡타를 개발하기 위해 집중적으로 연구한 결과, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유하는 발현벡타에 임의의 외생 유전자가 삽입되었을 때, 그외생 유전자를 통상의 프로모터 보다 훨씬 더 높은 수준으로 발현시킬 수 있다는 것을 알아냈다.
또한, 더욱 강력한 프로모터 및 그 프로모터를 함유하는 발현 벡타를 개발하기 위하여, 본 발명자들은 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 개선에 대해 계속 연구한 결과, 훨씬 더 강력한 프로모터 활성을 지닌 신규 혼성 프로모터 제조에 성공하였다.
이 신규 혼성 프로모터는 천연 병아리 β-액틴 유전자 프로모터 보다 수배 내지 약 10배 더 높은 발현 수준으로 외생 유전자를 발현시킬 수 있다는 것을 알아냈다.
즉, 본 발명은 동물 세포를 사용하는 발현계 내에서 매우 높은 수준으로 외생 유전자를 발현시킬 수 있는 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유하는 발현 벡타를 제공한다.
β-액틴은 모든 세포내에 존재하며 여러 가지 세포 기능에 관련되어 있다. β-액틴은 원생 동물로부터 인간을 포함하는 진핵 세포에 이르는 주 구조 단백질중 하나이며 그의 아미노산 서열은 서로 매우 상동적이다.
병아리 β-액틴 유전자 프로모터 이외의 β-액틴 유전자 프로모터를 이용하는 발현계와 관련하여, 인간 β-액틴 유전자 프로모터를 함유하는 벡타를 이용하는 단백질 제조 공정이 공지되어 있다. [P. Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4831~4835(1987)]. 그러나, 이 보고에 따르면, 프로모터 활성도가 SV40 초기 유전자 프로모터 보다 약 1.7배 더 높으므로 실용적인 면에서는 아직 불충분하다. 최근에, 인간 β-액틴 유전자 프로모터의 프로모터 활성도가 여러 숙주 세포내에서 비교되었다. [Gene 65, 135~139(1988)]. 이 보고는 인간 β-엑틴 유전자 프로모터가 새앙쥐-유래된 세포내에서는 SV40 초기 프로모터보다 더욱 강력한 활성도를 나타내며, 인간 유래된 세포 또는 원숭이-유래된 세포내에서는 SV 40 초기 프로모터 보다 더 낮은 활성도를 나타낸다고 하고 있다.
반면, 본 발명의 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 잘 알려진 SV40초기 프로모터 보다 적어도 5 내지 10배 더 높은 프로모터 활성도를 나타내며 새앙쥐-유래된 세포(예, L세포) 뿐만 아니라 햄스터-유래된 세포(예, CHO 세포), 아프리카산 녹색 원숭이-유래된 세포(예, COS 세포)및 기타 동물세포 내에서 강력한 활성도를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 제1도의 DNA서열을 함유하는 유전자 단편이다. 병아리 β-액틴 유전자는 T. A. Kost 등에 의해 이미 클로닝되었다 [Nucleic Acids Research 11, No. 23, 8286~8287(1983)].
본 발명의 외생 유전자 발현을 위한 발현 벡타에 사용된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 대체적으로 G(구아닌) 및 C(시토신)의 함량이 높으며 TATA박스 [Ann. Res. Biochem., 50, 349~383(1981)] 및 CCAAT 박스[Nucleic Acids Research 8, 127~142(1980)]와 같은 특징적인 프로모터 서열을 함유하는 유전자 단편이다.
제1도에 나타낸 프로모터의 DNA 서열에 있어서, -909G 내지 -7G의 DNA영역이 메신저 RNA로의 전사 후 결실(스플라이싱)될 영역(인트론)이라고 생각된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 벡타에 삽입되는 병아리 β-액틴 유전자 프로모터로서, 그의 3'이 적어도-5위치의 시토신(C)까지를 함유하는 유전자 단편이 사용된다.
β-액틴의 고유구조 유전자의 개시 코오든(ATG)상류 DNA 서열중 일부(예, 약-30염기쌍까지)를 결실 시켜도 프로모터 활성에 거의 영향을 주지 않는다는 것은 일반적으로 알려져 있다.
그러나, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 경우, β-액틴의 고유 구조 유전자의 개시 코오든(ATG)으로부터 상류로 시토신(C)까지의 염기쌍, 즉 5염기쌍을 함유하는 프로모터를 사용함으로써 더 높은 수준으로 소망하는 외생 유전자를 발현시킬 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 증명되었다.
본 발명에 사용된 변형된 β-액틴 유전자 프로모터는 제2프로모터를 상기 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역내로 삽입시킴으로써 제조된 혼성 프로모터가 있다. 본 발명의 혼성 프로모터는 삽입된 제2프로모터가 β-액틴 유전자 프로모터에 대한 인헨서로 작용하여 β-액틴 유전자 프로모터는 또한 삽입된 제2프로모터에 대한 인헨서로 작용하는 상승 효과를 나타내면서 매우 높은 수준으로 외생 유전자를 발현시킬 수 있는 신규 프로모터이다. 본 명세서에서, 제2프로모터란 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 의미하며, 이 프로모터는 동물 세포내에서 작용한다. 바람직하게는, 동물세포내에 감염하는 비루스로 부터 유래된 프로모터 및 더욱 바람직하게는, SV 40 초기 프로모터, 라우스 사코마 비루스(Rous sarcoma virus)의 LTR 등이 상기 혼성 프로모터 제조에 사용된다.
이러한 본 발명의 혼성 단백직은 상당히 강력한 프로모터 활성도를 나타내며, 그 활성도는 그 자체가 강력한 프로모터 활성도를 지니는 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 활성도 보다 수배 내지 10배 더 높다.
상기에 설명한 혼성 프로모터는 제2프로모터를 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역내로 삽입 시킴으로써 제조될 수 있다. 이 경우, 제2프로모터의 삽입은 제2프로모터가 삽입되는 부위의 하류(3')로 부터 스플라이싱 수용체 용역에 이르는 범위의 DNA 서열내에 개시 코오든(ATG)이 존재하지 않는 것과 같은 방식으로 수행되어야 한다. 가장 바람직하게는, 제2프로모터가 병아리 β-액틴 유전자 프로모터내의 MboII 부위내로 삽입된다.
상기 기재된 바와 같이 제2프로모터가 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역 내로 삽입될 때, 삽입된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 그의 3'말단이 제1도의 적어도 -5의 위치에 있는 시토신(C)까지 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 변형된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 또한 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역 중간 부분으로 부터 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 그의 하류(3')까지의 모든 유전자를 결실 시키고, 여기에 다른 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 유전자를 결합 시킴으로써 제조된 혼성 프로모터가 있다. 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 그러한 외생 유전자로는, 예를 들어 토끼 β-글로빈 유전자로 부터의 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 유전자 단편이 있다. 이런 방식으로, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 스플라이싱 수용체 서열을 다른 스플라이싱 수용체 서열로 치환함으로써, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 프로모터 활성도가 더욱 증진될 수 있다.
다른 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 유전자를 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 프로모터에 결합 시키기 위하여, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역 중간 부분으로 부터 그의 하류 까지의 유전자를 결실 시키고 거기에 다른 스플라이싱 수용체 서열을 함유하는 유전자를 결합 시킨다. 이러한 결실 및 결합은 상기 기재된 MboII 부위에서 바람직하게 수행된다.
본 발명의 동물 세포 내에서의 발현을 위한 발현 벡타는 상기 기재된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터 또는 그의 변형된 프로모터를 함유하며 또한 상기 프로모터의 하류에 외생 유전자가 삽입될 수 있는 적당한 제한 효소 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 구조를 지닌다. 그러한 제한 효소 부위는 일종의 제한 효소 인지 부위를 함유하거나 또는 여러 외생 유전자의 삽입을 촉진 시키기 위해 이종 이상의 제한 효소 인지 부위를 함유하기도 한다.
소망하는 외생 유전자를 더욱 효과적으로 발현 시키기 위하여, 본 발명의 발현 벡타는 발현될 구조 유전자의 삽입 부위 하류에 삽입된 폴리아데닐화 서열을 더 함유하기도 한다. 형질 전환 세포를 콜로닝하기 위하여, 적당한 표지 유전자가 또한 벡타내로 삽입되기도 한다.
본 발명의 발현 벡타는 이.콜리 에서의 클로닝을 위해 이.콜리로부터 유래된 유전자를 더 함유하기도 한다. 이.콜리로 부터 유래된 그러한 유전자로는 이.콜리 내의 복제 오리진, 콜로닝에서 선택 표지로서 작용하는 적당한 약품 내성 유전자(예, 암피실린, 테트라시이클린 등의 내성 유전자)등이있다. 플라스미드 pBR 322로부터 유래된 유전자를 벡타내로 삽입시킬 때, pBR 322의 복제 오리진(ori)주위에 존재하는 숙주 세포내의 벡타의 복제를 억제 시키는 독성 서열을 결실 시키는 것이 바람직하다[Nature 293, 79~81(1981)].
예를들어 COS 세포(아프리카산 녹색 원숭이 콩팥으로 부터 유래)와 같이 SV40의 거대 T항원을 생산하는 세포를 소망하는 외생 유전자의 발현을 위한 숙주 세포로 사용하는 경우, 동물 세포내에서 작용하는 복제 오리진(예, SV 40ori)이 또한 본 발명의 발현 벡타 내로 삽입되어 외생 유전자가 더욱 효과적으로 발현될 수 있기도 하다. 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 사용하는 본 발명의 바람직한 발현 벡타의 예로는 새앙쥐 L 세포가 숙주 세포로 사용되는 경우에 사용될 수 있는 pAc-2(제6도) 및 COS 세포가 숙주 세포로 사용되는 경우에 효과적으로 사용되는 pSAc-2(제7도)가 있다.
외생 유전자의 발현 효율을 증진 시키기 위하여, 디히드로플레이트 리덕타제(DHFR)유전자를 본 발명의 발현 벡타내로 삽입 시키기도 하며, 또는 선택적으로, DHFR발현 플라스미드와 함께 동시-감염(co-transfection)시키기도 한다. 이 경우, DHFR 유전자-결핍 세포가 숙주 세포로서 바람직하게 사용되며 배양 배지에 메토트렉세이트를 첨가하면 형질 전환 세포내의 유전자를 증식시켜, 그 유전자의 발현을 더욱 높이게 된다. 비록 이러한 DHFR 유전자를 이용하여 발현 효율을 증진시키는 방법이 이미 알려져 있기는 하지만, 발현 효율을 크게 개선하기 위하여 이 방법을 본 발명의 발현 β에 적용 시킬 수 있다.
β-액틴이 여러 동물 세포내에 존재하므로, 본 발명의 발현계는 매우 높은 발현 효율로써 광범위한 숙주세포에 사용 가능하여, 산업적 측면에서 매우 유용하다.
본 발명의 발현 벡타는 이제까지 이르지 못했던 매우 높은 발현 수준을 제공하여, 외생 유전자의 발현을 공장 규모로 생산하는 데에도 이용 가능하다.
본 발명은 이.콜리의 β-갈락토시다제 유전자 및 B형 간염 표면 항원(HBs)유전자를 외생 유전자로 사용하는 하기의 실시예에 의해 더욱 자세히 설명되지만, 본 발명이 이 실시예에 의해 제한된다고 해석해서는 안된다.
실시예에서, 파아지, 플라스미드, DNA, 여러효소, 이.콜리, 배양 세포등은 하기의 서적 및 잡지에 기재된 방법에 의해 처리한다:
1. MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL ed. by T. MANIATIS et al. (1982), COLD SPRING HARBOR LABORATORY
2. METHODS IN ENZYMOLOGY 65, ed, by L. GROSSMAN et al. (1980), ACADEMIC PRESS
3. DNA cloning ed, by D. M. Glover et al. (1985) IRL. PRESS
실시예에서, 하기의 약어가 사용된다.
CAT : 클로람페니콜 아세틸 전이 효소
lacZ : β-갈락토시다제(β-gal)의 구조 유전자
[실시예 1]
[발현벡타, pAc-2 및 pSAc-2의 제조]
(1) 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 프로모터 영역의 제조 : 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 제1액손(exon), 제1인트론(intron) 및 제2엑손의 일부를 함유하는 플라스미드 pAZ1037 과 이 플라스미드에 결합된 CAT 유전자[Nature 314, 286~289(1985)]를 제한 효소 NcoI(NEB#193)으로 분해한다. 제한 효소 NcoI은 제2도에 나타낸 바와 같이 6염기쌍 서열을 인지하고 그 서열을 절단하여 제3도에 나타낸 바와 같이 5'쪽으로 돌출된 서열을 만든다. 본 발명에서, 하기의 과정은 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 제1인트론 및 제2엑손간의 스플라이싱 영역이 발현 벡타로 사용될 때 올바로 작용하도록 수행한다.
즉, NcoI-분해된 DNA를 SI 누클레아제(Takara #2410A)로 처리하여 5' 돌출 영역 및 거기에 인접한 한 개만의 염기쌍을 결실 시킨다. 이 반응에서, 시료DNA(10㎍)는 30mM 소듐 아세테이트, pH 4.6, 100mM NaCl, ImM ZnSo4용액(80μl)내의 SI 누클레아제 150units로 37℃에서 1 내지 4분간 처리한다.
DNA를 SI 누클레아제로 처리한 후, 처리된 DNA를 T4 DNA 플리머라제(Takara #2040A)로 더 처리하여 DNA의 단일 가닥 부분을 변형 시키고 여기에 T4 DNA 리가아제(Takara #2011A)로 인산화된 (pHindIII 링커, NEB #1050)합성 DNA pCCAAGCTTGG 5' 말단을 결합시켜 고리화한다. 이.콜리 HB101 균주를 수득한 DNA 용액을 사용하여 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 분리한 후, 형질 전환된 세포 내의 플라스미드 DNA를 추출하여 제한 효소 HindIII (NEB #104) 및 NarI(NEB#191)으로 분해한다. 6%아크릴 아미드 겔 전기 영동을 수행하여 적당한 크기의 DNA단편이 함유된 클론을 고른다. DNA단편을 파아지 벡타 M13mp 19(NEB #400-19)의 SalI-KpnI 부위내로 클로닝하고 HindIII 부위 근방의 DNA 서열을 디데옥시 방법 [Proc. N. A. S. 74, 5463~5477(1977)]에 의해 결정하여 소망하는 클론을 선별한다.
그리하여 수득한 플라스미드 클론 p28 은 제4도에 나타나 있듯이 천연 병아리 β-액틴 유전자의 스플라이싱 영역으로 부터 구조 유전자 까지에 걸친 DNA서열을 보유하고 있으며 개시 코오든(ATG)으로 부터의 3'말단에 있는 유전자가 결실되고 거기에 HindIII 부위가 삽입된 구조를 갖고 있다. 동일한 과정에 따라서, ATG 상류로 2염기쌍까지 결실된 클론 p29 및 ATG 상류로 20염기쌍까지 결실된 클론 P3을 또한 수득한다.
(2) 발현 벡타, pAc-2의 제조 :
SV40 초기 전사용 스플라이싱 영역 및 폴리아데닐화 시그날을 함유한 플라스미드 pSV2-cat(Molecular cell Biology 2, 1044~1051(1982)]을 제한 효소 MflI(Takara #1070A)으로 분해한다. 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형시키고 거기에 T4 DNA 리가아제로 인산화된 HindIII 링커를 결합시킨다.
수득한 플라스미드를 제한 효소 HindIII 및 BamHI(NEB #136)으로 더 분해시키고 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기 영동하여 약 900bp의 HindIII-BamHI 단편을 추출한다. 상기 과정(1)에서 제조된 플라스미드 p28 을 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 분해하고 송아지 장으로 부터 유래된 알칼리성 포스파타제 (Takara #2250A)로 탈인산화 시킨다. 이것을 T4 DNA 리가아제로 약 900bp의 상기 HindIII-BamHI 단편에 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pAc-2 (제6도)를 수득한다.
(3) 발현 벡타, pSAc-2의 제조 :
상기 과정(2)에서 사용된 동일한 플라스미드 pSV2-cat을 제한 효소 AccI(NEB #161) 및 SphI(NEB #182)으로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 무딘-말단 으로 만든다. 이것을 T4 DNA 리가아제로 인산화된 XbaI 링커(NEB #1032)존재하에 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pSV-cat-delE를 제조한다. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9537~9541(1986)].
이 플라스미드 pSV-cat-delE를 제한 효소 HindIII로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형시킨다.
이것을 T4 DNA 리가아제로 인산화된 xhoI 링커(NEB #1030) 존재하에 결합시켜 고리화한다. 수득한 플라스미드를 제한 효소 EcoRI(NEB # 101) 및 xhoI(NEB # 146)으로 더 분해 하고 절단된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동시켜 약 2kbp의 EcoRI-XhoI 단편을 추출한다. 상기 과정(2)에서 제조된 플라스미드 pAc-2를 제한 효소 XhoI 및 EcoRI으로 분해하여 약 2.2kbp의 XhoI-EcoRI 단편을 수득하고, 여기에 약 2kbp의 상기 EcoRI-XhoI 단편을 결합시켜 고리화함으로써 플라스미드 pSAc-2(제7도)를 제조한다.
[실시예 2]
[β-갈락토시다제 발현 플라스미드 pAc-1acZ 및 pSAc-1acZ의 제조]
(1) β-갈락토시다제 유전자 단편의 제조 :
β 갈락토시다제를 코오딩하는 1acZ 유전자 전체를 함유하는 플라스미드 pCH 110[Pharmacia #27-4508-01]을 제한효소 HindIII 및 BamHI으로 분해하고 절단된 단편을 1%아가로스 겔 전기영동하여 약 3.8kbp의 HindIII-BamHI 단편을 제조한다. 이 단편은 SV 40초기 유전자 전사체의 스플라이싱 영역 및 폴리아데실화 영역을 함유한다.
(2) 플라스미드 pAc-2의 제조:
실시예 1(1)에서 제조된 플라스미드 p28을 제한 효소 HindIII 및 BamHI으로 분해하고 절단된 부위를 송아지 장으로 부터 유래된 알칼리성 포스파타제로 탈인산화 시킨다. 이것에 상기 과정(1)에서 수득한 약 3.8kbp의 HindIII-BamHI단편을 결합시켜 플라스미드 pAc-lacZ를 수득한다.
동일한 과정에 따라서, 실시예 1(1)에서 수득한 플라스미드 p29 및 p3으로 부터 플라스미드 pAc-lacZ(29) 및 pAc-lacZ(3)을 각각 제조한다.
(3) pSAc-lacZ의 제조 :
실시예 1(3)에서 제조한 플라스미드 pSAc-2를 제한 효소 HindIII-BamHI 으로 분해하고 절단된 부위를 송아지 장으로 부터 유래된 알칼리성 포스파타제로 탈인산화 시킨다.
이것에 상기 과정(1)에서 수득한 약 3.8kbp의 HindIII-BamHI단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pSAc-lacZ를 제조한다.
[실시예 3]
[B형 간염 표면 항원(HBsAg)발현 벡타 pSAc-HBs의 제조]
억제 가능한 산 포스파타제 프로모터를 함유하며 효모의 형질 전환 후 HBsAg을 생산할 수 있는 플라스미드 pAS101(일본국 특허 제2공보 제55951/1984호)을 제한 효소 XhoI으로 분해하고 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기 영동시켜 약 1.3kbp의 HBsAg 유전자를 함유하는 DNA 단편을 추출한다.
한편, 실시예 1(3)에서 제조한 플라스미드 pSAc-2를 제한효소 SalI(Takara # 1080A)으로 분해하고 절단된 부위를 송아지 장으로 부터 유래된 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다.
이것을 HBsAg 유전자를 함유하는 약 1.3kbp의 상기 DNA단편에 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 고리화하여 HBsAg 발현 플라스미드 pSAc-HBs 를 제조한다.
다음, 하기 과정에서 HBsAg의 발현 평가를 위해 대조 발현 플라스미드 pSVE-HBs를 제조한다.
상기 플라스미드 pAS101 (10㎍)을 37℃에서 제한효소 XhoI(10U)으로 4시간 반응시키고 수득한 단편을 0.75% 아가로스 겔 전기영동 시킨다. HBsAg 유전자를 함유하는 1.3kb 밴드를 아가로스 겔로 부터 분리하여 투석 튜브내에 넣고 다시 전기 영동 시킨다. 겔 단편으로 부터 DNA를 용출한후, 투석 튜브로 부터 DNA용액만을 취하여 에탄올 침전에 의해 DNA를 추출한다. HBsAg유전자를 함유하는 추출된 DNA단편 (1㎍)을 37℃에서 T4 DNA 폴리머라제(1U)로 30분간 반응 시킨다. 페놀처리 및 에탄올 침전을 수행하여 DNA를 추출한다.
한편, SV40초기 유전자 프로모터를 함유하는 플라스미드 pKSV-10(Pharmacia #27-4926-01)(1㎍)을 제한 효소 BglII(1U)로 37℃ 에서 1시간 반응 시킨다. 페놀 처리 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 추출한다. 추출된 DNA를 상기 기재된 바와 동일한 방법으로 T4 DNA 폴리머타제로 처리한다. T4 DNA 폴리머타제 반응으로 무딘-말단이된 HBsAg 유전자 단편(500ng) 및 pKSV-10(50ng) 의 혼합물을 T4 DNA 리가아제(1U)의 존재하에 4℃에서 12시간 반응시킨다.
이 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜리 HB101을 형질 전환시킨다.
형질 전환체로 부터 플라스미드를 추출하여 HBsAg 유전자가 pKSV-10내로 삽입된 플라스미드 pSVE-HBs를 수득한다.
[실시예 4]
[cos 세포 및 L-세포 내에서 β-갈락토시다제의 생산]
cos 세포 또는 L-세포를 100mm 둥근 페트리 접시상에 1×106세포/접시로 깔고 통상적인 방법에 따르는 칼슘 포스 페이트 방법에 의해 이들 숙주 세포내로 하기 플라스미드 DNA를 20㎍ 씩 각각 도입 시킨다.
세포를 칼슘 포스페이트-겔과 24시간 접촉 시키고 10% FCS-DME 내에서 24시간 더 배양한다. 트립신 처리로 세포를 접시로 부터 벗겨내고 저-속 원심분리에 의해 펠릿으로 만든다. 펠릿을 F-T완충용액(250mM 설탕, 10mM 트리스HCl, pH 7.5, 10mM EDTA)(200㎕)내에 현탁 시키고 동결-해동 과정을 3회 반복한 후, 원심분리하여 상층액을 회수한다.
그리하여 수득한 세포 추출물 (200㎕)중 10㎕를 사용하여, β-gal활성도를 측정한다. β-gal 활성도의 측정은 통상의 방법인 ONPG(o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드)의 색 발생에 따른 420nm에서의 흡광도 변화를 탐지하여 수행한다. 표 1은 SV 40초기 프로모터 [Pharmacia # 27-4508-01]를 함유하는 플라스미드 pCH 110으로 형질 전환된 COS-세포 또는 L-세포의 세포 추출물에 의해 나타난 흡광도를 1로 인한 상태치를 나타낸다.
Figure kpo00002
표 1에 나타나 있듯이, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 플라스미드 pAc-lacZ 및 pSAc-lacZ는 SV40 초기 유전자 프로모터를 함유한 플라스미드 pCH110 보다 L-세포내에서 3 내지 5배 더 높은 수치를 나타낸다. SV 40ori 가 효과적으로 작용하므로, 플라스미드 pSAc-lacZ가 플라스미드 pCH110보다 COS-세포 내에서 50배 더 높은 수치를 나타낸다.
[실시예 5]
[COS 세포내에서 HBsAg 의 생산]
COS-세포(1×10 세포/웰)를 세포 배양용 팔콘(Falcon) 6-웰 플레이트상에 깔고, 통상적인 DEAE-덱스트란 방법에 따라, 하기의 플라스미드 DNA(각 5㎍)를 세포내로 도입한다.
DNA 도입후 3일째에, 그 시기에 해당하는 배양 상층액을 셀펙트 감염 키트(CellPhect Transfection Kit)(Pharmacia)로 회수하고 HBsAg 검출 키트 Auslia II(Dainabbott 사제품)로 HBsAg 활성도를 측정한다. 그 결과가 표 2에 나타나 있다.
표 2에 나타나 있는 바와 같이, 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 플라스미드 pSAc-HBs 는 SV 40초기 유전자 프로모터를 함유한 플라스미드 pSVE-HBs 보다 3 내지 5배 더 높은 수치를 나타낸다.
Figure kpo00003
[실시예 6]
[병아리 β-액틴 유전자 프로모터 및 SV 40 초기 프로모터의 혼성 프로모터를 함유한 발현벡타 : pSA-lacZ 및 pAS-2의 제조]
실시예 1(2)에서 사용된 플라스미드 pSV2-cat 을 제한 효소 PvuII(Takara # 1076A) 및 HindIII로 분해하고 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기영동하여 SV 40 초기 프로모터를 함유한 약 340bp의 PVuII-HindIII 단편을 제조한다. PVuII-HindIII 단편의 종단을 T4 DNA 폴리머라제로 변형 시키고 여기에 T4 DNA 리가아제로 인산화된 XbaI링커를 결합시킨다. 결찰물을 제한 효소 XbaI (Takara # 1093A)으로 분해한 후, 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기 영동하여 약 350bp의 XbaI-XbaI 단편을 제조한다.
실시예 1(3)에서 제조된 플라스미드 pSAc-2를 제한 효소 XbaI 및 PstI 으로 분해하고 절단된 단편을 1%아가로스 겔 전기 영동하여 약 1.6kbp의 XbaI-PstI단편을 제조한다.
이 단편을 제한 효소 MboII(NEB # 148)로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형하여 여기에 T4 DNA 리가아제로 인산화된 XbaI 링커를 결합 시킨다. 결찰물을 제한 효소 XhoI 및 HindIII로 분해하고 절단된 단편을 1%아가로스 겔 전기영동하여 약 1.3kbp의 Xhoi-HindIII 단편을 제조한다.
실시예 2에서 제조된 플라스미드 pAc-lacZ를 제한 효소 XhoI 및 HindIII로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 약 5.8kbp의 XhoI-HindIII 단편을 제조한다. 이 단편을 약 1.3kbp의 상기 XhoI-HindIII 단편과 혼합하고, 제한 효소 XbaI으로 분해한 후 T4 DNA 리가아제로 서로 결찰시켜 고리화하여 플라스미드 pAc-lacZ-XbaI을 제조한다.
이 플라스미드 pAc-lacZ-XbaI 을 제한 효소 XbaI 으로 분해하고 여기에 T4 DNA 리가아제로 약 350bp의 상기 XbaI-XbaI 단편을 결합시켜 플라스미드 pAs-lacZ를 제조한다.
실시예 1(2)에서 제조된 플라스미드 pAc-2를 제한 효소 HindIII 및 BamHI 으로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스겔 전기영동하여 SV40 초기 프로모터의 스플라이싱 영역 및 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 약 900bp 의 HindIII-BamHI 단편을 추출한다.
플라스미드 pAs-lacZ를 제한 효소 HindIII 및 BamHI 으로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스겔 전기영동하여 약 3.7kbp의 HindIII-BamHI 단편을 제조한다. 약 3.7kbp의 이 HindIII-BamHI 단편에 T4 DNA 리가아제로 약 900bp의 상기 HindIII-BamHI 단편을 결합시켜 플라스미드 pAS-2(제8도)를 제조한다.
[실시예 7]
[병아리 β-액틴 유전자 프로모터 및 RSV-LTR 프로모터의 혼성 프로모터를 함유한 발현 벡타 ; pAR-lacZ 및 pAR-2의 제조]
RSV의 LTR을 함유한 플라스미드 pRSV-cat[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 6777~6781(1982)]을 제한 효소 NruI(NEB # 192) 및 TaqI(NEB # 149)로 분해하고 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기영동하여 약 340bp의 NruI-TaqI 단편을 제조한다. 이 NruI-TaqI 단편의 종단을 T4 DNA 폴리머라제로 변형하여 여기에 인산화된 XbaI 링커를 결합 시킨다. 결찰물을 제한 효소 XbaI 으로 분해한 후, 절단된 단편을 6%아크릴아미드 겔 전기 영동하여 약 350bp의 XbaI-XbaI 단편을 제조한다.
실시예 6에서 제조된 플라스미드 pAc-lacZ-XbaI을 제한 효소 XbaI으로 분해하고 여기에 T4 DNA 리가아제로 약 350bp의 상기 XbaI-XbaI 단편을 결합시켜 플라스미드 pAR-lacZ를 제조한다.
플라스미드 pAR-lacZ를 제한 효소 HindIII alc BamHI 으로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 약 3.7kbp의 HindIII-BamHI단편을 제조한다. 약 3.7kbp의 이 HindIII-BamHI단편에 실시예 6에서 제조한 약 900bp의 HindIII-BamHI단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 플라스미드 pAR-2(제9도)를 제조한다.
[실시예 8]
[병아리 β-액틴 유전자 프로모터 및 토끼 β-글로빈 유전자의 혼성 프로모터를 함유한 발현 벡타 ; pAG-lacZ 및 pAG-2의 제조]
토끼 β-글로빈 유전자의 제2엑손 중간부터 제3엑손 중간 까지를 함유한 플라스미드 pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 1527~1531(1981)](제10도)를 제한 효소 ApaI (NEB # ApaI)으로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형하여 여기에 T4 DNA 리가아제로 인산화된 XbaI 링커를 결합 시킨다. 이 결찰물을 제한 효소 EcoRI 으로 분해하고 절단된 부위를 DAN폴리머라제 I 큰 단편 (NEB # 210)으로 변형 시킨다. 여기에 pHindIII 링커(NEB # 1022)를 T4 DNA 리가아제로 결합 시키고 결찰물을 제한 효소 XbaI 및 HindIII로 분해한 후 6% 아크릴아미드 겔 전기 영동하여 토끼 β-글로빈 유전자의 제2인트론 내에 스플라이싱 수용체 부위를 함유한 약 90bp의 XbaI-HindIII 단편을 제조한다.
실시예 6에서 제조된 플라스미드 pAc-lacZ-XbaI 을 제한 효소 XbaI 및 HindIII 로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스 겔 전기 영동하여 약 7kbp의 XbaI-HindIII 단편을 제조한다. 여기에 약 90bp의 상기 XbaI-HindIII 단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 플라스미드 pAG-lacZ를 제조한다.
이 플라스미드 pAG-lacZ를 제한 효소 HindIII 및 BamHI으로 분해하고 절단된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동하여 약 3.3kbp의 HindIII-BamHI 단편을 제조한다. 약 3.3kbp의 이 HindIII-BamHI 단편에 상기 제조된 약 900bp의 HindIII-BamHI단편을 T4 DNA리가아제로 결합시켜 플라스미드 pAG-2(제11도)를 제조한다.
[실시예 9]
[SV 40ori 를 함유한 발현 벡타 ; PAcS-lacZ, pAcS-2, pARS-lacZ, pARS-2, pAGS-lacZ 및 pAGS-2의 제조]
실시예 1(2)에서 사용된 플라스미드 pSV2-cat을 제한 효소 HpaI(NEB # 105) 및 HindIII로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형하여 T4 DNA 리가아제로 서로 결찰시켜 고리화하여 플라스미드 pS-1(제12도)을 제조한다.
이 플라스미드 pS-1을 제한 효소 SphI으로 분해하고 절단된 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 변형하며 여기에 T4 DNA 리가아제로 인산화된 BamHI 링커(NEB # 1021) 를 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pS-2(제13도)를 제조한다.
이 플라스미드 pS-2를 제한 효소 BamHI으로 분해하고 절단된 단편을 6% 아크릴아미드 겔 전기 영동하여 SV 40 초기 전사의 폴리아데닐화 시그날을 함유한 약 350bp의 BamHI-BamHI단편을 수득한다.
실시예 2에서 제조된 플라스미드 pAc-lacZ를 제한 효소 BamHI으로 분해하고 여기에 약 350bp의 상기 BamHI-BamHI 단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 고리화하여 폴라스미드 pAcS-lacZ를 제조한다.
실시예 1(2)에서 제조된 플라스미드 pAc-2를 제한 효소 BamHI으로 분해하고 여기에 약 350bp의 상기 BamHI-BamHI 단편을 T4 DNA리가아제로 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pAcS-2(제14도)를 제조한다.
실시예 7에서 제조된 플라스미드 pAR-lacZ를 제한 효소 BamHI으로 분해하고 여기에 약 350bp의 상기 BamHI-BamHI 단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 고리화하여 플라스미드 pARS-lacZ를 제조한다.
상기 기재한 바와 동일한 방식으로, 실시예 7에서 제조된 플라스미드 pAR-2로부터 플라스미드 pARS-2 (제15도), 실시예 8에서 제조된 플라스미드 pAG-lacZ로 부터 플라스미드 pAGS-lacZ, 및 실시예 8에서 제조된 플라스미드 pAG-2로 부터 플라스미드 pAGS-2(제16도)가 각각 제조된다.
[실시예 10]
[변형된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 발현 벡타를 이용한 β-갈락토시아제의 생산 ]
COS 세포 또는 L-세포를 100mm 둥근 페트리 접시에 1×10 세포/접시로 깔고 통상의 방법에 따르는 칼슘 포스페이트 방법에 의해 여러 플라스미드 (pCH 110, pAS-lacZ, pAR-lacZ, pAG-lacZ, pAcS-lacZ, pARS-lacZ, pAGS-lacZ)DNA 각 20㎍씩을 이들 숙주 세포내로 도입한다.
세포를 칼슘 포스페이트-겔과 24시간 접촉시키고 10% FCS-DME 내에서 24시간 더 배양한다. 트립신 처리로 세포를 접시로 부터 벗겨내고 저-속 원심분리에 의해 펠릿으로 만든다. 펠릿을 F-T 완충용액(250mM 설탕, 10mM 트리스-HCl, pH7.5, 10mM EDTA)(200㎕)내에 현탁시키고 동결-해동 과정을 3회 반복한 후, 원심분리하여 상충액을 회수한다.
그리하여 수득한 세포 추출물 (200㎕)중 10㎕를 사용하여 β-gal 활성도를 측정한다. β-gal 활성의 측정은 통상의 방법인 ONPG(o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드)의 색 발생에 따른 420nm에서의 흡광도 변화를 탐지하여 수행한다. 표 3은 SV40 초기 프로모터 [Pharmacia #27-4508-01]를 함유하는 플라스미드 pCH 110으로 형질 전환된 COS-세포 또는 L-세포의 세포 추출물에 의해 나타난 흡광도를 1로한 상대치를 나타낸다.
Figure kpo00004
표 3에 분명히 나타나 있듯이, lacZ 유전자가 본 발명의 혼성 프로모터를 함유한 발현 벡타내로 삽입된 플라스미드가 천연 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 발현 플라스미드(pAc-lacZ)에 비해 매우 높은 발현을 나타낸다.
[실시예 11]
[변형된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 발현 벡타를 이용한 HBsAg의 생산]
(1) HBsAg-발현 플라스미드 pAS-HBs, pAG-HBs, pAcS-HBs, pARS-HBs 및 pAGS-HBs 의 제조
실시예 3에서 사용된 플라스미드 pAS101(10㎍)을 37℃에서 제한 효소 XhoI(10U)으로 4시간 반응 시키고 절단된 단편을 6% 아가로스 겔 전기 영동한다. HBs 유전자를 함유한 1.3kb 밴드를 아가로스 겔로부터 도려내어 투석 튜브에 넣고 전기 영동을 더 실시한다. DNA를 겔 단편으로 부터 용출시킨 후, 투석 튜브로부터 DNA용액만을 취하여 에탄올 침전으로 DNA를 추출한다. HBsAg 유전자를 함유하는 추출된 DNA단편(1㎍)을 37℃에서 T4 DNA 폴리머라제(1U)로 30분간 반응시킨다. 그리고 나서, 페놀 처리 및 에탄올 침전을 수행하여 DNA를 추출한다.
다음, 실시예 6 내지 9에서 제조된 6종의 플라스미드(pAS-2,pAR-2,pAG-2,pAcS-2,pARS-2 및 pAGS-2)를 제한효소 SalI 으로 분해하고 절단된 단편을 송아지 장으로 부터 유래된 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다. 여기에 HBsAg유전자를 함유한 약 1.3kbp의 상기 DNA단편을 T4 DNA 리가아제로 결합시켜 고리화하여 발현 플라스미드 pAS-HBs, pAR-HBs, pAG-HBs, pAcS-HBs, pARS-HBs 및 pAGS-HBs를 각각 제조한다.
HBsAg 발현을 평가를 위한 참고 발현 플라스미드로서, 실시예 3에서 제조된 플라스미드 pSVES-HBs를 사용한다.
(2) COS-세포내에서 HBs의 발현 :
COS-세포를 세포 배양용 팔콘 6-웰 플레이트상에 1×10 세포/웰로 깔고, 통상의 방법에 따라, 하기 플라스미드 DNAs 각 5㎍씩을 DEAE-덱스트란 방법에 의해 세포내로 도입시킨다.
DNA도입후 3일째에 배양 상충액을 셀펙트 형질 감염 키드(Pharmacia)로 분리하고 HBsAg 검출 키드 Auslia II (Dainabbott 사 제품)로 HBsAg 활성도를 측정한다. 그 결과가 표 4에 나타나 있다.
Figure kpo00005
표 4에 나타나 있듯이, 변형된 병아리 β-액틴 유전자 프로모터를 함유한 발현 플라스미드가 SV 40 초기 유전자 프로모터를 함유한 플라스미드 pSVE-HBs 보다 더 높은 HBsAg 활성도를 나타낸다.

Claims (11)

  1. 병아리 β-액틴 유전자 프로모터와 상기 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 하류(downstream)쪽에 외생 유전자의 삽입을 위한 제한 효소 부위를 함유하는, 동물 세포에서의 외생 유전자의 발현을 위한 발현 벡타로서, 상기 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 3'말단이 적어도 β-액틴의 기본 구조 유전자의 개시 코돈(ATG)부터 다섯 염기쌍 상류(upstream)쪽에 위치한 시토신(C)까지의 서열을 포함하는 상기 β-액틴의 기본 구조 유전자의 유전자 단편을 포함하고, 그 병아리 β-액틴 유전자 프로모터는 상기 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역 내로 제2프로모터의 삽입을 통해 형성된 혼성 프로모터이거나, 또는 상기 병아리 β-액틴 유전자 프로모터의 인트론 영역의 중간부터 스플라이싱 수용체 서열을 포함하는 그것의 하류까지의 3'말단 유전자를 제거하고, 거기에 토끼 β-글로빈 유전자에 함유된 스플라이싱 수용체 서열을 포함하는 유전자 단편 함유 유전자를 연결시킴으로써 구축되는 혼성 프로모터임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  2. 제1항에 있어서, 상기의 제2프로모터는 동물 세포에서 감염성이 있는 비루스에서 유래된 프로모터임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 제2프로모터는 SV 40 유전자에서 유래된 프로모터임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  4. 제3항에 있어서, 상기의 제2프로모터는 SV 40초기 프로모터임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 제2프로모터는 라우스 육종 비루스의 LTR임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 인트론 영역은 병아리 β-액틴 구조 유전자의 초기 번역-개시 코톤(ATG)의 A(아데닌)을 +1로 하여 -909G(구아닌)부터 -7G 까지의 DNA 영역임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이.콜리(E. coli) 플라스미드로부터 유래된 유전자를 더 포함함을 특징으로 하는 발현 벡타.
  8. 제7항에 있어서, 이.콜리 플라스미드 유래의 상기 유전자는 약물 내성 유전자 및 이.콜리에서 기능할 수 있는 복제 원점을 포함하는 유전자 단편임을 특징으로 하는 발현 벡타.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, SV 40초기 전사 스플라이싱 영역과 폴리아데닐화 영역을 더 포함함을 특징으로 하는 발현 벡타.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, SV 40 복제 원점(SV 40 ori)이 추가로 삽입된 것을 특징으로 하는 발현 벡타.
  11. 제1항 내지 제10항의 어느 한 항에 기재된 발현 벡타내로 외생 유전자를 그 외생 유전자의 삽입을 위한 제한 효소 부위에 삽입시키는 단계, 상기 벡타를 동물 세포내로 도입하는 단계, 및 얻어진 형질전환 세포를 배양하는 단계로 구성되는 외생 유전자 발현 방법.
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