DE68919140T2 - Hühner-beta-Actin-Genpromoter enthaltender Vektor zur Expression eines erwünschten Gens. - Google Patents

Hühner-beta-Actin-Genpromoter enthaltender Vektor zur Expression eines erwünschten Gens.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor zur effizienten Expression von gewünschten Genen in tierischen Zellen, besonders einen modifizierten Hühner- β-Actin-Genpromotor und eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau eines gewünschten Gens stromabwärts dieses Promotors.
  • Mit dem Fortschritt der gentechnischen Verfahren haben in den letzten Jahren die Verfahren zur Produktion von nützlichen Stoffen in Wirtszellen schnelle Fortschritte gemacht. Zur Expression eines gewünschten Gens unter Verwendung der gentechnischen Verfahren werden eine geeignete Wirtszelle und ein damit kompatibler Expressionsvektor verwendet. Als Wirtszelle zur Expression sind bisher Mikroorganismen ausgiebig untersucht worden, die, wie beispielsweise E. coli und Hefe, einfach gehandhabt werden können. Es bestätigte sich jedoch in den letzten Jahren, daß diese Mikroorganismen bei einem Teil der gewünschten Gene nur beschränkt zur Expression verwendet werden können, und daher wurde ein Expressionssystem, das gezüchtete Zellen von höheren Tieren als Wirtszellen verwendet, ausgiebig untersucht.
  • Ein derartiges Expressionssystem, das tierische Zellen als Wirtszellen verwendet, wurde bereits beschrieben, wobei ein Expressionssystem unter Verwendung einer Reihe von Tier-Virus-Genpromotoren oder Tierzellgenpromotoren eingeschlossen ist. Beispiele für Tier-Virus-Genpromotoren sind ein SV40-Genpromotor, ein Adenovirus-Hauptpromotor der späten Gene oder ein Hepatitis-B-Virus-Genpromotor. Beispiele für Genpromotoren von tierischen Zellen sind ein Promotor eines Thymidinkinase (tk)-Gens, Metallothioneingens, Interferongens oder eines Immunglobulingens.
  • Es wurde festgestellt, daß von den vorstehend beschriebenen Promotoren besonders der SV40-Promotor der frühen Gene, der SV40-Promotor der späten Gene und der Adenovirus-Hauptpromotor der späten Gene eine starke Promotoraktivität aufweisen. Sie sind jedoch für eine Produktion in industriellem Maßstab noch unzureichend, und daher wurden Anstrengungen unternommen, stärkere, höher exprimierbare Promotoren zu finden.
  • Daher ist das technische Problem, auf dem die vorliegende Erfindung beruht, die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der stark ist und jedes gewünschte Gen in industriellem Maßstab exprimieren kann. Dieses technische Problem wird gelöst, indem ein Expressionsvektor bereitgestellt wird, der einen modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotor und eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau eines exogenen oder gewünschten Gens stromabwärts dieses Promotors enthält. Wenn ein exogenes oder gewünschtes Gen in diesen Vektor eingebaut wird, kann es auf einem wesentlich höheren Niveau als mit üblichen Promotoren exprimiert werden. Das gewünschte Gen kann jedes gewünschte Gen sein, das entweder ein bereits in der Wirtszelle vorkommendes Gen ist, das auf einem hohen Niveau exprimiert werden soll, oder das im Hinblick auf die Wirtszelle exogen ist, d. h., in diesem nicht natürlich vorkommt. Die letzte Alternative ist bevorzugt.
  • Der modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor ist ein neuer Hybridpromotor, der durch Austausch einer die Spleiß-Akzeptorsequenz stromabwärts einer Position im Intron des Hühner-β-Actin-Genpromotors enthaltenden DNA-Sequenz konstruiert wird, wobei das Intron der DNA-Bereich von -909G (Guanin) bis -7G ist, wobei von A (Adenin) des ursprünglichen Translations-Initiationscodons (ATG) des Hühner-β-Actin-Strukturgens als +1 gezählt wird, gegen eine DNA-Sequenz, die eine andere Spleiß-Akzeptorsequenz enthält, wobei diese andere Spleiß-Akzeptorsequenz ein eine Spleiß- Akzeptorsequenz enthaltendes Fragment des Kaninchen-β-Globingens ist. Es ist festgestellt worden, daß dieser neue Hybridpromotor ein gewünschtes Gen mit einem bis zu 10fach höheren Expressionsniveau als der natürliche Hühner-β-Actin- Genpromotor exprimieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung liefert daher einen Expressionsvektor, der einen modifizierten Hühner-β-Actin- Genpromotor enthält, der ein gewünschtes Gen mit einem extrem hohen Niveau in einem tierische Zellen verwendenden Expressionssystem exprimieren kann.
  • Fig. 1 zeigt eine DNA-Sequenz eines Hühner-β-Actin- Genpromotors,
  • Fig. 2 zeigt eine DNA-Sequenz, die von dem Restriktionsenzym NcoI erkannt wird,
  • Fig. 3 zeigt eine DNA-Sequenz nach der Spaltung mit dem Restriktionsenzym NcoI,
  • Fig. 4 zeigt die Position eines HindIII-Linkers, der stromabwärts eines Promotors im in Beispiel 1 hergestellten Plasmid p28 eingebaut ist,
  • Fig. 5 zeigt eine DNA-Sequenz eines Hybridpromotors, der einen Hühner-β-Actin-Genpromotor und ein Kaninchen-β- Globingen enthält, wobei der Hybridpromotor im in Beispiel 8 hergestellten Plasmid pAG-2 enthalten ist,
  • Fig. 6 zeigt die Struktur des Plasmids pAc-2,
  • Fig. 7 zeigt die Struktur des Plasmids pSAc-2,
  • Fig. 8 zeigt die Struktur des Plasmids pAS-2,
  • Fig. 9 zeigt die Struktur des Plasmids pAR-2,
  • Fig. 10 zeigt die Struktur des Plasmids pKCR,
  • Fig. 11 zeigt die Struktur des Plasmids pAG-2,
  • Fig. 12 zeigt die Struktur des Plasmids pS-1,
  • Fig. 13 zeigt die Struktur des Plasmids pS-2,
  • Fig. 14 zeigt die Struktur des Plasmids pAcS-2,
  • Fig. 15 zeigt die Struktur des Plasmids pARS-2 und
  • Fig. 16 zeigt die Struktur des Plasmids pAGS-2.
  • β-Actin ist in allen Zellen vorhanden und steht mit zahlreichen Zellfunktionen im Zusammenhang. Es ist eines der Hauptstrukturproteine, die bei Protozoen und Eukaryoten vorkommen, wobei Menschen eingeschlossen sind, und ihre Aminosäuresequenzen sind extrem homolog.
  • Im Zusammenhang mit einem Expressionssystem, in dem ein sich von dem Hühner-β-Actin-Genpromotor unterscheidender β-Actin-Genpromotor verwendet wird, ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins unter Verwendung eines Vektors bekannt, der einen menschlichen β-Actin-Genpromotor enthält [P. Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 4831- 4835]. Die Promotoraktivität in dieser Veröffentlichung übersteigt jedoch die des SV40-Promotors der frühen Gene um etwa das 1,7fache, dies ist jedoch unter praktischen Gesichtspunkten auch noch unzureichend. Kürzlich ist die Promotoraktivität des menschlichen β-Actin-Genpromotors in verschiedenen Wirtszellen verglichen worden [Gene 65 (1988), 135-139]. Diese Veröffentlichung zeigt, daß der menschliche β-Actin-Genpromotor in Mauszellen eine ziemlich starke Aktivität im Vergleich zum frühen SV40-Promotor zeigte, in vom Menschen oder Affen stammenden Zellen jedoch eine niedrigere Aktivität als der frühe SV40-Promotor.
  • Im Gegensatz dazu zeigt der erfindungsgemäße modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor eine Promotoraktivität, die die des bekannten frühen SV40-Promotors um mindestens das 5- bis 10fache übersteigt und eine starke Aktivität nicht nur in von der Maus stammenden Zellen (z. B. L-Zellen), sondern auch in vom Hamster stammenden Zellen (z. B. CHO-Zellen), von afrikanischen Meerkatzen stammenden Zellen (z. B. COS-Zellen) und weiteren tierischen Zellen zeigt.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor ist ein Genfragment, das einen Teil der DNA-Sequenz von Fig. 1 enthält. Ein Hühner-β- Actin-Genfragment ist bereits von T. A. Kost et al. [Nucleic Acids Research 11 Nr. 23 (1983), 8286-8287] cloniert worden.
  • Der im erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendete modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor zur Expression eines gewünschten Gens enthält ein Genfragment, das insgesamt einen hohen Gehalt an G (Guanin) und C (Cytosin) aufweist und Sequenzen enthält, die für einen Promotor charakteristisch sind, wie die TATA-Box [Ann. Res. Biochem. 50 (1981), 349-383] und die CCAAT-Box [Nucleic Acids Research 8 (1980), 127-142].
  • In der DNA-Sequenz des in Fig. 1 dargestellten Promotors ist die DNA-Region von -909 G bis -7 G eine Region (Intron), die nach der Transkription in Messenger-RNA entfernt (gespleißt) wird.
  • Der erfindungsgemäße modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor wird hergestellt, indem eine die Spleiß-Akzeptorsequenz stromabwärts einer Position im Intron des Hühner- β-Actin-Genpromotors enthaltende DNA-Sequenz ausgetauscht wird, wobei das Intron der DNA-Bereich von -909G (Guanin) bis -7G ist, wobei von A (Adenin) des ursprünglichen Translations-Initiationscodons (ATG) des Hühner-β-Actin-Strukturgens als +1 gezählt wird, gegen eine DNA-Sequenz, die eine andere Spleiß-Akzeptorsequenz enthält, wobei diese andere Spleiß-Akzeptorsequenz ein eine Spleiß-Akzeptorsequenz enthaltendes Fragment des Kaninchen-β-Globingens ist. Durch den Austausch der Spleiß-Akzeptorsequenz des modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotors gegen eine andere Spleiß-Akzeptorsequenz kann die Promotoraktivität des modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotors verbessert werden.
  • Ein derartiger Austausch wird vorzugsweise an der MboII-Stelle des Hühner-β-Actin-Genpromotors durchgeführt.
  • Der bevorzugte erfindungsgemäße Expressionsvektor enthält ferner eine geeignete Restriktionsenzymstelle stromabwärts des modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotors, in die ein gewünschtes Gen eingebaut werden kann. Eine derartige Restriktionsenzymstelle kann eine Erkennungsstelle eines einzigen Restriktionsenzyms sein oder Erkennungsstellen für zwei oder mehrere Restriktionsenzyme zur Erleichterung eines Einbaus von verschiedenen gewünschten Genen enthalten. Zur effizienteren Expression des gewünschten Gens kann der erfindungsgemäße Expressionsvektor ferner eine Polyadenylierungssequenz enthalten, die stromabwärts der Stelle für die Aufnahme des zu exprimierenden Strukturgens eingebaut ist. Zur Clonierung einer Transformante kann außerdem ein geeignetes Markergen in den Vektor eingebaut werden.
  • Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann zur Clonierung in E. coli ferner ein Gen enthalten, das von E. coli stammt. Ein derartiges von E. coli stammendes Gen schließt beispielsweise einen Replikationsursprung für E. coli und ein geeignetes Arzneimittelresistenzgen ein, das bei der Clonierung als ein Selektionsmarker wirkt (z. B. ein Ampicillin- oder Tetracyclinresistenzgen). Beim Einbau eines vom Plasmid pBR322 stammenden Gens in den Vektor wird vorzugsweise eine toxische Sequenz, die eine Replikation des Vektors in einer Wirtszelle hemmt und etwa am Replikationsursprung (ori) von pBR322 liegt, entfernt [Nature 293 (1981), 79-81].
  • Wenn eine Zelle, die das große SV40-T-Antigen produziert, beispielsweise eine COS-Zelle (von der Niere einer afrikanischen Meerkatze stammend), als Wirtszelle zur Expression des gewünschten Gens verwendet wird, kann ferner ein Replikationsursprung, der in dieser tierischen Zelle wirkt (z. B. der ori von SV40), in den erfindungsgemäßen Expressionsvektor eingebaut werden. Dies erhöht die Effizienz der Expression des gewünschten Gens.
  • Zur Verbesserung der Expressionseffizienz eines gewünschten Gens kann außerdem ein Dihydrofolatreductase (DHFR)-Gen in den erfindungsgemäßen Expressionsvektor eingebaut oder alternativ eine Cotransfektion mit einem DHFR- Expressionsplasmid durchgeführt werden. Dann wird vorzugsweise eine DHFR-Gen-defiziente Zelle als Wirtszelle verwendet, und ein Zusatz von Methotrexat zum Kulturmedium amplifiziert das Gen in einer transformierten Zelle, was eine höhere Expression des Gens bewirkt. Obwohl die Verwendung eines DHFR-Gens zur Verbesserung der Expressionseffizienz bereits bekannt ist, kann es auch bei einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendet werden, so daß die Expressionseffizienz wesentlich verbessert wird.
  • Da β-Actin in zahlreichen tierischen Zellen vorhanden ist, ist das erfindungsgemäße Expressionssystem für ein breites Spektrum von Wirtszellen mit einer sehr hohen Expressionseffizienz, die von einem industriellen Standpunkt nützlich ist, verwendbar.
  • Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann ein äußert hohes Expressionsniveau, das bisher niemals erreicht worden ist, liefern und zur Expression eines gewünschten Gens selbst in industriellem Maßstab verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Beispiele, in denen das β-Galactosidasegen von E. coli und ein Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBs)-Gen als gewünschtes Gen verwendet werden, genauer erläutert, der Schutzbereich der Erfindung sollte jedoch nicht als darauf beschränkt ausgelegt werden.
  • Phagen, Plasmide, DNA, verschiedene Enzyme, E. coli, gezüchtete Zellen und ähnliches wurden in den Beispielen durch Verfahren, die in den nachstehend beschriebenen Lehrbüchern und Fachzeitschriften beschrieben sind, behandelt:
  • 1. Molecular Cloning A Laboratory Manual, hrsg. von Maniatis et al. (1982), Cold Spring Harbor Laboratory
  • 2. Methods In Enzymology 65, hrsg. von L. Grossman et al. (1980), Academic Press
  • 3. DNA cloning, hrsg. von D. M. Glover et al. (1985) IRL. Press
  • Die nachstehend beschriebenen Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet.
  • CAT: Chloramphenicolacetyltransferase
  • lacZ: β-Galactosidase (β-Gal)-Strukturgen
    • Beispiel 1 (Konstruktion der Expressionsvektoren pAc-2 und pSAc-2 (1) Herstellung einer Promotorregion eines Hühner-β-Actin- Genpromotors
  • Plasmid pAZ1037, das ein erstes Exon, ein erstes Intron und einen Teil eines zweiten Exons eines Hühner-β- Actin-Genpromotors und ein daran gebundenes CAT-Gen [Nature 314 (1985), 286-289] enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym NcoI (NEB #193) gespalten. Das Restriktionsenzym NcoI erkennt eine Sequenz von sechs Basenpaaren, wie in Fig. 2 dargestellt, und spaltet die Sequenz, wobei eine Sequenz mit 5'-überstehenden Enden, wie in Fig. 3 dargestellt, erhalten wird. In der vorliegenden Erfindung wurden die nachstehend beschriebenen Verfahren so durchgeführt, daß der Spleißbereich zwischen dem ersten Intron und dem zweiten Exon des Hühner-β-Actin-Genpromotors korrekt funktioniert, wenn er als Expressionsvektor verwendet wird.
  • Das heißt, die NcoI-gespaltene DNA wurde mit S1- Nuclease (Takara #2410A) gespalten, um den 5'-überstehenden Bereich sowie ein angrenzendes Basenpaar zu entfernen. In dieser Reaktion wurde eine DNA-Probe (10 ug) 1 bis 4 Minuten bei 37ºC in einer Lösung (80 ul) aus 30 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,6, 100 mM NaCl und 1 mM ZnSO&sub4; mit 150 Einheiten S1-Nuclease behandelt.
  • Nach der Behandlung der DNA mit S1-Nuclease wurde die behandelte DNA außerdem mit T4-DNA-Polymerase (Takara #2040A) behandelt, um den Einzelstranganteil der DNA zu modifizieren, und mit T4-DNA-Ligase (Takara #2011A) wurde daran zur Zyklisierung eine synthetisierte DNA pCCAAGCTTGG mit phosphorylierten 5'-Enden (pHindIII-Linker, NEB #1050) ligiert. Der E. coli-Stamm HB101 wurde mit der erhaltenen DNA-Lösung transformiert. Nach der Isolierung einer einzelnen Kolonie wurde eine Plasmid-DNA aus den transformierten Zellen gewonnen und mit den Restriktionsenzymen HindIII (NEB #104) und NarI (NEB #191) gespalten. Eine 6 % Acrylamid- Gelelektrophorese wurde durchgeführt und ein Clon, der ein DNA-Fragment mit einer geeigneten Größe enthielt, selektiert. Das DNA-Fragment wurde in die SalI-KpnI-Stelle des Phagenvektors M13mp19 (NEB #400-19) cloniert und eine DNA- Sequenz in der Nähe der HindIII-Stelle durch das Didesoxyverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5477] ermittelt, um den gewünschten Clon zu überprüfen.
  • Der so erhaltene Plasmidclon p28, wie in Fig. 4 dargestellt, wies eine DNA-Sequenz auf, die vom Spleißbereich bis zum Strukturgen des natürlichen Hühner-β-Actin-Gens reicht und eine Struktur aufweist, in der ein Gen am 3'-Ende vom Initiationscodon (ATG) entfernt und eine HindIII-Stelle eingebaut wurde. Nach dem gleichen Verfahren wurden ferner Clon p29, in dem bis zu zwei Basenpaare stromaufwärts des ATG entfernt sind, und Clon p3, in dem bis zu 20 Basenpaare stromaufwärts des ATG entfernt sind, erhalten.
    • (2) Konstruktion des Expressionsvektors pAc-2
  • Plasmid pSV2-cat, das einen Spleißbereich für die frühe SV40-Transkription und ein Polyadenylierungssignal enthielt [Molecular Cell Biology 2 (1982), 1044-1051], wurde mit dem Restriktionsenzym MflI (Takara #1070A) gespalten. Die gespaltenen Stellen wurden mit T4-DNA-Polymerase modifiziert und mit T4-DNA-Ligase ein phosphorylierter HindIII- Linker angefügt. Das erhaltene Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI (NEB #136) weiter gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Acrylamidgelelektrophorese unterzogen, wonach ein HindIII- BamHI-Fragment von etwa 900 bp extrahiert wurde. Das Plasmid p28, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren (1) erhalten worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase, aus Kälberdarm (Takara #2250A), dephosphoryliert. Anschließend wurde es mit T4-DNA-Ligase an das vorstehend beschriebene HindIII-BamHI-Fragment von etwa 900 bp ligiert, wobei ein ringförmiges Plasmid pAc-2 (Fig. 6) erhalten wurde.
    • (3) Konstruktion des Expressionsvektors pSAc-2
  • Das gleiche Plasmid pSV2-cat, wie es im vorstehend beschriebenen Verfahren (2) verwendet wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen AccI (NEB #161) und SphI (NEB #182) gespalten und die Spaltstellen wurden durch T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Diese wurden mit T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines phosphorylierten XbaI-Linkers (NEB #1032) ligiert und zyklisiert, wobei Plasmid pSV-cat-delE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9537-9541] erhalten wurde.
  • Das Plasmid pSV-cat-delE wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und die Spaltstellen wurden mit T4-DNA-Polymerase modifiziert. Diese wurden mit T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines phosphorylierten XhoI-Linkers (NEB #1030) ligiert und zyklisiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (NEB #101) und Xhol (NEB #146) weiter gespalten und die gespaltenen Fragmente einer 1 % Agarosegelelektrophorese unterzogen, wonach ein EcoRI- XhoI-Fragment von etwa 2 kbp extrahiert wurde. Das im vorstehend beschriebenen Verfahren (2) gebildete Plasmid pAc-2 wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und EcoRI gespalten, wonach ein XhoI-EcoRI-Fragment von etwa 2,2 kbp erhalten wurde, mit dem das vorstehend beschriebene EcoRI- XhoI-Fragment von etwa 2 kbp ligiert wurde, wobei ein ringförmiges Plasmid pSAc-2 (Fig. 7) erhalten wurde.
    • Beispiel 2 (Konstruktion der β-Galactosidase- Expressionsplasmide pAc-lacZ und pSAc-lacZ) (1) Herstellung eines β-Galactosidase-Genfragments
  • Plasmid pcH110 [Pharmacia #27-4508-01], das das vollständige, β-Galactosidase codierende lacZ-Gen enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,8 kbp zu erhalten. Dieses Fragment enthielt einen Spleißbereich und einen Polyadenylierungsbereich vom Transkript der frühen SV40-Gene.
    • (2) Konstruktion des Plasmids pAc-2
  • Plasmid p28, das in Beispiel 1 (1) konstruiert wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die Spaltstellen wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Anschließend wurde es an das im vorstehend beschriebenen Verfahren (1) erhaltene HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,8 kbp ligiert, wobei Plasmid pAc-lacZ erhalten wurde.
  • Gemäß dem gleichen Verfahren wurden die Plasmide pAc- lacZ(29) und pAc-lacZ(3) aus den in Beispiel 1 (1) erhaltenen Plasmiden p29 bzw. p3 konstruiert.
    • (3) Konstruktion von pSAc-lacZ
  • Das in Beispiel 1 (3) konstruierte Plasmid pSAc-2 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die Spaltstellen wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Anschließend wurde es mit T4-DNA-Ligase an das im vorstehend beschriebenen Verfahren (1) erhaltene HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,8 kbp ligiert, wobei ein ringförmiges Plasmid pSAc-lacZ erhalten wurde.
    • Beispiel 3 (Konstruktion des Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Expressionsvektors pSAc-HBs)
  • Ein Plasmid pAs101, das einen reprimierbaren Promotor der sauren Phosphatase enthält und nach der Transformation von Hefe HBsAg produzieren kann (japanische Patentveröffentlichung Nr. 55951/1984), wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Acrylamidgelektrophorese unterzogen, wonach ein das HBsAg-Gen enthaltendes DNA-Fragment von etwa 1,3 kbp extrahiert wurde.
  • Andererseits wurde das in Beispiel 1 (3) konstruierte Plasmid pSAc-2 mit dem Restriktionsenzym Sall (Takara #1080A) gespalten und die Spaltstellen wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Anschließend wurde es mit T4-DNA-Ligase an das vorstehend erhaltene, das HBsAg-Gen enthaltende DNA-Fragment von etwa 1,3 kbp ligiert, wobei ein ringförmiges HBsAG-Expressionsplasmid pSAc-HBs erhalten wurde.
  • Anschließend wurde ein Kontrollexpressionsplasmid pSVE-HBs zur Bestimmung der Expression von HBsAG im nachstehend beschriebenen Verfahren konstruiert.
  • Das vorstehend beschriebene Plasmid pAS101 (10 ug) wurde 4 Stunden bei 37ºC mit dem Restriktionsenzym XhoI (10 E) gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden einer 0,75 % Agarosegelelektrophorese unterzogen. Eine 1,3 kbp Bande, die ein HBsAg-Gen enthielt, wurde aus dem Agarosegel geschnitten und in einen Dialyseschlauch gegeben, der erneut einer Elektrophorese unterzogen wurde. Nach der Elution der DNA aus dem Gelfragment wurde nur die DNA-Lösung dem Dialyseschlauch entnommen und die DNA durch eine Ethanolfällung extrahiert. Das extrahierte DNA-Fragment, das das HBsAg-Gen (1 ug) enthielt, wurde 30 Minuten bei 37ºC mit T4-DNA- Polymerase (1 E) behandelt. Eine Behandlung mit Phenol und eine Ethanolfällung wurden zur Extraktion der DNA durchgeführt.
  • Andererseits wurde Plasmid pKSV-10, das einen SV40- Promotor der frühen Gene (Pharmacia #27-4926-01) (1 ug) enthielt, mit dem Restriktionsenzym BglII (1 E) 1 Stunde bei 37ºC gespalten. Die DNA wurde durch eine Phenolbehandlung und Ethanolfällung extrahiert. Die extrahierte DNA wurde in der gleichen vorstehend beschriebenen Weise mit T4-DNA- Polymerase behandelt. Ein Gemisch aus dem HBsAg-Genfragment (500 ng), das durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen worden war, und pKSV-10 (50 ng) wurde in Gegenwart von T4-DNA-Ligase (1 E) 12 Stunden bei 4ºC behandelt. E. coli HB101 wurde mit diesem Reaktionsgemisch transformiert. Ein Plasmid wurde aus der Transformante extrahiert, wobei Plasmid pSVE-HBs erhalten wurde, bei dem das HBsAg-Gen in pKSV-10 eingebaut worden war.
    • Beispiel 4 (Produktion der β-Galactosidase in COS- und L- Zellen)
  • COS- oder L-Zellen wurden auf runden 100 mm-Petrischalen mit 1 x 10&sup6; Zellen/Gefäß plattiert und jeweils 20 ug der nachstehend beschriebenen Plasmide durch das Calciumphosphatverfahren gemäß dem üblichen Verfahren in diese Wirtszellen eingeführt.
  • Die Zellen wurden 24 Stunden mit Calciumphosphatgel in Kontakt gebracht und die Züchtung 24 Stunden in 10 % FCS- DME fortgesetzt. Die Zellen wurden durch eine Trypsinbehandlung vom Gefäß entfernt und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert. Das Pellet wurde in F- T-Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM EDTA) (200 ul) suspendiert und ein Gefrier-Auftau-Verfahren dreimal wiederholt, wonach zentrifugiert wurde, um einen Überstand zu gewinnen.
  • 10 ul des so erhaltenen Zellextrakts (200 ul) wurden verwendet und die β-Gal-Aktivität gemessen. Die Messung der β-Gal-Aktivität wurde durchgeführt, indem in der üblichen Weise eine Veränderung der Absorbtion bei 420 nm in Verbindung mit einer Farbentwicklung von ONPG (o-Nitrophenyl-β- D-galactopyranosid) nachgewiesen wurde. Tabelle 1 zeigt relative Werte, wobei der Wert der Absorbtion, den der Zellextrakt von COS-Zellen oder L-Zellen zeigte, die mit dem einen frühen SV40-Promotor enthaltenden Plasmid pCH110 (Pharmacia #27-4508-01) transformiert worden waren, 1 ist. Tabelle 1 β-Gal-Aktivität Plasmid COS-Zelle L-Zelle
  • Wie in Tabelle 1 dargestellt, zeigten die Plasmide pAc-lacZ und pSAc-lacZ, die den Hühner-β-Actin-Genpromotor enthielten, in L-Zellen Werte, die die des Plasmids pCH110, das den SV40-Promotor der frühen Gene enthielt, um das 3- bis 5fache überstiegen. Da der SV40-ori wirksam funktionierte, zeigte das Plasmid pSAc-lacZ in GaS-Zellen Werte, die die des Plasmids pcH110 um das 50fache überstiegen.
    • Beispiel 5 (Herstellung von HBsAg in Gas-Zellen)
  • COS-Zellen (1 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung) wurden auf einer Falcon-Platte mit 6 Vertiefungen für die Züchtung von Zellen plattiert und gemäß dem üblichen DEAE-Dextranverfahren die nachstehend beschriebenen Plasmid-DNAs (jeweils 5 ug) mit dem CellPhect Transfektions-Kit (Pharmacia) in die Zellen eingeführt. Drei Tage nach der Einführung der DNA wurde der Kulturüberstand gesammelt und mit dem HBsAg- Nachweis-Kit "Auslia II" (Dainabbott) die HBsAg-Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigte das Plasmid pSAc-HBs, das den Hühner-β-Actin-Genpromotor enthielt, Werte, die die des Plasmids pSVE-HBs, das den SV40-Promotor der frühen Gene enthielt, um das 3- bis 5fache überstiegen. Tabelle 2 Plasmid HBsAg-Aktivität (Cpm)
    • Beispiel 6 (Herstellung eines Expressionsvektors der einen Hybridpromotor aus dem Hühner-β-Actin-Genpromotor und dem SV40-Promotor der frühen Gene enthält; pSA-lacZ und pAS-2)
  • Das in Beispiel 1 (2) verwendete Plasmid pSV2-cat wurde mit den Restriktionsenzyinen PvuII (Takara #1076A) und HindIII gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um ein den frühen SV40-Promotor enthaltendes PvuIII-HindIII-Fragment von etwa 340 bp herzustellen. Das PvuII-HindIII-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase an seinen Enden modifiziert und mit T4-DNA-Ligase ein phosphorylierter XbaI-Linker angefügt. Nach der Spaltung der ligierten Moleküle mit dem Restriktionsenzym XbaI (Takara #1093A) wurden die gespaltenen Fragmente einer 6 % Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um ein XbaI-XbaI-Fragment von etwa 350 bp herzustellen.
  • Das Plasmid pSAc-2, das in Beispiel 1 (3) konstruiert wurde, wurde mit den Restriktionsenzvmen XbaI und PstI gespalten und die gespaltenen Fragmente einer 1 % Agarose- Gelelektrophorese unterzogen, um ein XbaI-PstI-Fragment von etwa 1,6 kbp herzustellen. Dieses Fragment wurde mit dem Restriktionsenzyin MboII (NEB #148) gespalten, die Spaltstellen wurden mit T4-DNA-Polymerase modifiziert und mit T4- DNA-Ligase wurde ein phosphorylierter XbaI-Linker angefügt. Die ligierten Moleküle wurden mit den Restriktionsenzymen XhoI und HindIII gespalten und die gespaltenen Fragmente einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein XhoI- HindIII-Fragment von etwa 1,3 kbp herzustellen.
  • Das in Beispiel 2 konstruierte Plasmid pAc-lacZ wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und HindIII gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein XhoI-HindIII-Fragment von etwa 5,8 kbp herzustellen. Dieses Fragment wurde mit dem vorstehend beschriebenen XhoI-HindIII-Fragment von etwa 1,3 kbp vermischt und nach einer Spaltung mit dem Restriktionsenzym XbaI wurden die Fragmente durch T4-DNA-Ligase ligiert, um ein ringförmiges Plasmid pAc-lacZ-XbaI zu konstruieren.
  • Dieses Plasmid pAc-lacZ-XbaI wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten und das vorstehend beschriebene XbaI-XbaI-Fragment von etwa 350 bp mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid pAS-lacZ zu konstruieren.
  • Das in Beispiel 1 (2) konstruierte Plasmid pAc-2 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose- Gelelektrophorese unterzogen, um ein HindIII-BamHI-Fragment von etwa 900 bp zu extrahieren, das den Spleißbereich und das Polyadenylierungssignal des frühen SV40-Promotors enthielt.
  • Das Plasmid pAS-lacZ wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,7 kbp herzustellen. An dieses HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,7 kbp wurde mit T4-DNA-Ligase das vorstehend beschriebene HindIII- BamHI-Fragment von etwa 900 bp ligiert, um Plasmid pAS-2 (Fig. 8) zu konstruieren.
    • Beispiel 7 (Herstellung eines Expressionsvektors, der einen Hybridpromotor aus dem Hühner-β-Actin-Genpromotor und dem RSV-LTR-Promotor enthält; pAR-lacZ und pAR-2)
  • Das Plasmid pRSV-cat, das LTR von RSV [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 6777-6781] enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Nrul (NEB #192) und TaqI (NEB #149) gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um ein NruI-TaqI- Fragment von etwa 340 bp herzustellen. Dieses NruI-TaqI- Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase an seinen Enden modifiziert und ein phosphorylierter XbaI-Linker angefügt. Nach der Spaltung der ligierten Moleküle mit dem Restriktionsenzym XbaI wurde das gespaltene Fragment einer 6 % Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um ein XbaI-XbaI- Fragment von etwa 350 bp herzustellen.
  • Das in Beispiel 6 konstruierte Plasmid pAc-lacZ-XbaI wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten und das vorstehend beschriebene XbaI-XbaI-Fragment von etwa 350 bp mit T4-DNA-Ligase daran ligiert, um Plasmid pAR-lacZ zu konstruieren.
  • Das Plasmid pAR-lacZ wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,7 kbp herzustellen. An dieses HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,7 kbp wurde das in Beispiel 6 hergestellte HindIII-BamHI-Fragment von etwa 900 bp mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid pAR-2 (Fig. 9) zu konstruieren.
    • Beispiel 8 (Herstellung eines Expressionsvektors, der einen Hybridpromotor aus dem Hühner-β-Actin-Genpromotor und dem Kaninchen-β-Globin-Gen enthält; pAG-lacZ und pAG-2)
  • Das Plasmid pKCR, das ein Kaninchen-β-Globingen von der Mitte des zweiten Exons bis zur Mitte des dritten Exons enthielt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527-1531] (Fig. 10), wurde mit dem Restriktionsenzym Apal (NEB #ApaI) gespalten, die Spaltstellen wurden mit T4-DNA-Polymerase modifiziert und ein phosphorylierter XbaI-Linker wurde mit T4-DNA-Ligase angefügt. Diese ligierten Moleküle wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und die Spaltstellen mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I (NEB #210) modifiziert. Daran wurde mit T4-DNA-Ligase ein pHindIII- Linker (NEB #1022) ligiert, und die ligierten Moleküle wurden mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII gespalten, worauf eine 6 % Acrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt wurde, um ein XbaI-HindIII-Fragment von etwa 90 bp herzustellen, das eine Spleiß-Akzeptorstelle im zweiten Intron des Kaninchen-β-Globingens enthielt.
  • Das in Beispiel 6 konstruierte Plasmid pAc-lacZ-XbaI wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose- Gelelektrophorese unterzogen, um ein XbaI-HindIII-Fragment von etwa 7 kbp herzustellen. Daran wurde das vorstehend beschriebene XbaI-HindIII-Fragment von etwa 90 bp ligiert, um Plasmid pAG-lacZ zu konstruieren.
  • Dieses Plasmid pAG-lacZ wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 1 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,3 kbp herzustellen. An dieses HindIII-BamHI-Fragment von etwa 3,3 kbp wurde das vorstehend hergestellte HindIII-BamHI-Fragment von etwa 900 bp mit T4-DNA-Ligase ligiert, um Plasmid pAG-2 (Fig. 11) zu konstruieren.
    • Beispiel 9 (Konstruktion des Expressionsvektors, der den SV40-ori enthält; pAcS-lacZ, pAcS-2, pARS-lacZ, pARS-2, AGS-lacZ und pAGS-2)
  • Das in Beispiel 1 (2) verwendete Plasmid pSV2-cat wurde mit den Restriktionsenzymen HpaI (NEB #105) und HindIII gespalten, die Spaltstellen wurden mit T4-DNA-Polymerase modifiziert und mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein ringförmiges Plasmid pS-1 (Fig. 12) herzustellen.
  • Dieses Plasmid pS-1 wurde mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten, die Spaltstellen wurden mit T4-DNA- Polymerase modifiziert und daran wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (NEB #1021) mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein ringförmiges Plasmid pS-2 (Fig. 13) herzustellen.
  • Dieses Plasmid pS-2 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Acrylamid-Gelelektrophore unterzogen, um ein BamHI-BamHI- Fragment von etwa 350 bp zu erhalten, das einen Replikationsursprung von SV40 und ein Polyadenylierungssignal der frühen SV40-Transkription enthält.
  • Das in Beispiel 2 konstruierte Plasmid pAc-lacZ wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und das vorstehend beschriebene BamHI-BamHI-Fragment von etwa 350 bp mit T4- DNA-Ligase daran ligiert, um das ringförmige Plasmid pAcS- lacZ zu konstruieren.
  • Das in Beispiel 1 (2) konstruierte Plasmid pAc-2 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und das vorstehend beschriebene BamHI-BamHI-Fragment von etwa 350 bp mit T4-DNA-Ligase daran ligiert, um das ringförmige Plasmid pAcS-2 (Fig. 14) zu konstruieren.
  • Das in Beispiel 7 konstruierte Plasmid pAR-lacZ wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und daran das vorstehend beschriebene BamHI-BamHI-Fragment von etwa 350 bp mit T4-DNA-Ligase ligiert, um das ringförmige Plasmid pARS- lacZ zu konstruieren.
  • In der gleichen vorstehend beschriebenen Weise wurden das Plasmid pARS-2 (Fig. 15) aus dem in Beispiel 7 konstruierten Plasmid pAR-2, das Plasmid pAGS-lacZ aus dem in Beispiel 8 konstruierten Plasmid pAG-lacZ bzw. das Plasmid pAGS-2 (Fig. 16) aus dem in Beispiel 8 konstruierten Plasmid pAG-2 konstruiert.
    • Beispiel 10 (Herstellung von β-Galactosidase mit dem Expressionsvektor, der den modifizierten Hühner-β-Actin- Genpromotor enthält)
  • COS- oder L-Zellen wurden auf runden 100 mm-Petrischalen mit 1 x 10&sup6; Zellen/Gefäß plattiert und jeweils 20 ug von verschiedenen Plasmid-DNAs (pcH110, pAS-lacZ, pAR-lacZ, pAG-lacZ, pAcS-lacZ, pARS-lacZ und pAGS-lacZ) durch das Calciumphosphatverfahren gemäß dem üblichen Verfahren in diese Wirtszellen eingeführt.
  • Die Zellen wurden 24 Stunden mit dem Calciumphosphatgel in Kontakt gebracht und die Züchtung wurde 24 Stunden in 10 % FCS-DME fortgesetzt. Die Zellen wurden durch eine Trypsinbehandlung vom Gefäß entfernt und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert. Das Pellet wurde in F-T-Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, und 10 mM EDTA) (200 ul) suspendiert und einem dreimaligen Gefrier-Auftau-Prozeß unterworfen, wonach zentrifugiert wurde, um einen Überstand zu gewinnen.
  • 10 ul des so erhaltenen Zellextrakts (200 ul) wurden verwendet und die β-Gal-Aktivität wurde gemessen. Die Messung der β-Gal-Aktivität wurde durchgeführt, indem eine Veränderung der Absorbtion bei 420 nm in Verbindung mit einer Farbentwicklung von ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid) in der üblichen Weise nachgewiesen wurde. Tabelle 3 zeigt einen relativen Wert, wobei der Wert der Absorbtion, den der Zellextrakt von COS-Zellen oder L-Zellen zeigte, die mit dem, einen frühen SV40-Promotor enthaltenden Plasmid pCH110 (Pharmacia #27-4508-01) transformiert waren, 1 ist. Tabelle 3 β-Gal-Aktivität Plasmid COS-Zelle L-Zelle
  • Wie in Tabelle 3 dargestellt, zeigte der das lacZ-Gen enthaltende Expressionsvektor, der den erfindungsgemäßen Hybridpromotor enthielt, im Vergleich zum Expressionsplasmid (pAc-lacZ), das den natürlichen Hühner-β-Actin-Genpromotor enthielt, eine äußerst hohe Expression.
    • Beispiel 11 (Herstellung von HBsAg mit dem Expressionsvektor, der den modifizierten Hühner-β-Actin- Genpromotor enthielt) (1) Konstruktion der HBsAg-Expressionsplasmide pAS-HBs, DAG- HBs, pAcS-HBs, pARS-HBs und pAGS-HBs
  • Das in Beispiel 3 verwendete Plasmid pAS101 (10 ug) wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI (10 E) 4 Stunden bei 37ºC behandelt und die gespaltenen Fragmente wurden einer 6 % Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Eine das HBs-Gen enthaltende 1,3 kbp-Bande wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch gegeben und einer weiteren Elektrophorese unterzogen. Nach der Elution der DNA aus dem Gelfragment wurde die DNA-Lösung aus dem Dialyseschlauch entfernt und die DNA durch eine Ethanolfällung extrahiert. Die extrahierten DNA-Fragmente (1 ug), die das HBsAg-Gen enthielten, wurden 30 Minuten bei 37ºC mit T4-DNA- Polymerase (1 E) behandelt. Anschließend wurden zur Extraktion der DNA eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt.
  • Anschließend wurden sechs verschiedene, in den Beispielen 6 bis 9 konstruierte Plasmide (pAS-2, pAR-2, pAG-2, pAcS-2, pARS-2 und pAGS-2) mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und die gespaltenen Fragmente mit der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Daran wurde mit der T4-DNA-Ligase das vorstehend beschriebene, das HBsAg-Gen enthaltende DNA-Fragment von etwa 1,3 kbp ligiert, um die ringförmigen HBsAg-Expressionsplasmide pAS-HBs, pAR-HBs, pAG-HBs, pAcS-HBs, pARS-HBs bzw. pAGS-HBs zu konstruieren.
  • Als Bezugsexpressionsplasmid zur Bestimmung der HBsAg-Expression wurde das in Beispiel 3 konstruierte Plasmid pSVES-HBs verwendet.
    • (2) Expression von HBs in COS-Zellen
  • COS-Zellen wurden auf einer Falcon-Platte mit 6 Vertiefungen zu 1 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung für die Züchtung von Zellen plattiert und gemäß dem üblichen DEAE-Dextranverfahren (CellPhect Transfektions-Kit (Pharmacia)) jeweils 5 ug der nachstehend beschriebenen Plasmid-DNAs in die Zellen eingeführt. Drei Tage nach der Einführung der DNA wurde der Kulturüberstand entfernt und mit dem HBsAg-Nachweis-Kit "Auslia II" (Dainabbott) die HBsAg-Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Plasmid HBsAg-Aktivität (Cpm)
  • Wie in Tabelle 4 dargestellt, zeigten die Expressionsplasmide, die den modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotor enthielten, eine höhere HBsAg-Aktivität als das Plasmid pSVE-HBs, das den SV40-Promotor der frühen Gene enthielt.

Claims (9)

1. Expressionsvektor zur Expression eines gewünschten Gens in einer tierischen Zelle, enthaltend einen modifizierten Hühner-β-Actin-Genpromotor und eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau eines gewünschten Gens stromabwärts dieses Hühner-β-Actin-Genpromotors, wobei der modifizierte Hühner-β-Actin-Genpromotor ein Hybridpromotor ist, hergestellt durch den Austausch einer die Spleiß- Akzeptorsequenz stromabwärts einer Position im Intron des Hühner-β-Actin-Genpromotors enthaltenden DNA-Sequenz, wobei das Intron der DNA-Bereich von -909G (Guanin) bis -7G ist, wobei von A (Adenin) des ursprünglichen Translations-Initiationscodons (ATG) des Hühner-β-Actin-Strukturgens als +1 gezählt wird, gegen eine DNA-Sequenz, enthaltend eine andere Spleiß-Akzeptorsequenz, wobei diese andere Spleiß-Akzeptorsequenz ein eine Spleiß-Akzeptorsequenz enthaltendes Fragment des Kaninchen-β-Globingens ist.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, außerdem ein von einem E. coli-Plasmid stammendes Gen enthaltend.
3. Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei das von dem E. coli-Plasmid stammende Gen ein ein Resistenzgen gegen einen Arzneistoff und einen in E. coli wirksamen Replikationsursprung enthaltendes Genfragment ist.
4. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, außerdem einen SV-40 Spleißbereich der frühen Transkription und einen Polyadenylierungsbereich enthaltend.
5. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei außerdem der SV 40-Replikationsursprung (SV 40 ori) eingefügt ist.
6. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, außerdem ein in einer Wirtszelle, vorzugsweise in einer tierischen Zelle, zu exprimierendes gewünschtes Gen enthaltend.
7. Mikroorganismus, transformiert mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, der eine tierische Zelle ist.
9. Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens in einer Wirtszelle, umfassend den Einbau des gewünschten Gens in einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 an der darin für den Einbau des gewünschten Gens bereitgestellten Restriktionsenzymstelle, Einschleusen des Vektors in eine tierische Zelle und Züchten der erhaltenen transformierten tierischen Zelle unter geeigneten Bedingungen.
DE68919140T 1988-06-24 1989-06-23 Hühner-beta-Actin-Genpromoter enthaltender Vektor zur Expression eines erwünschten Gens. Expired - Lifetime DE68919140T2 (de)

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