JPH025884A - ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを組み込んだ外来遺伝子発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＵＬ上五且里±！ 本発明は、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーター
を有し、任意の外来遺伝子を効率よく発現させるための
動物細胞用外来遺伝子発現プラスミドに関する。

：ａ１ 遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利用
した有用物質の生産は近年急速に進歩してきている。遺
伝子組換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場合
には、適当な宿主細胞と、これに応じた発現ベクターが
用いられる。これまでは、大腸菌や酵母等の取扱いが容
易な微生物が発現の宿主細胞として広く研究されてきた
が、このような微生物では外来遺伝子の発現において一
部に限界があることが確認されてきており、近年では動
物細胞等の高等動物培養細胞を発現宿主細胞とした発現
系が盛んに研究されてきている。

これまでに知られている動物細胞を宿主とした発現系と
しては、多くの動物ウィルス遺伝子プロモーターおよび
動物細胞遺伝子プロモーターを用いた系が報告されてい
る。前者の例として、５ｖ４０遺伝子プロモーター、ア
デノウィルス主要後期遺伝子プロモーター、Ｂ型肝炎ウ
ィルス遺伝子プロモーター等が使用されている。また、
後者の例としてはチミジンキナーゼ（ｔＫ）遺伝子プロ
モーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーターインタ
ーフェロン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子
プロモーター等が使用されている。

上記プロモーターの中では、特にＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーター、ＳＶ４０後期遺伝子プロモーターおよびア
デノウィルス主要後期遺伝子プロモーターが強力なプロ
モーター活性を有するとされているが、工業的生産に用
いられるほど生産性が充分ではなく、さらに強力なプロ
モーター並びに高発現ベクターの開発が求められている
。

さらに、上記プロモーターのほとんどがウィルスあるい
は発癌ウィルス由来である。これは、高能率プロモータ
ーを追求すれば必然的に生体内での増殖発現が旺盛なウ
ィルス、特に発癌ウィルスにたどり着くのが現状である
。しかし、発癌ウィルスプロモーターの機能の全貌は理
解されておらず、不測の悪影響を原理的に避けるために
は正常細胞で機能している遺伝子にプロモーター活性を
求める必要がある。

このように遺伝子組換え技術を応用した有用物質の製造
を実用化するためには、強力かつ安全なプロモーターお
よびその利用技術の開発が望まれている。

１匪Ｌユ週 このような状況において、本発明者らはニワトリのβ−
アクチン遺伝子プロモーターを用いて外来遺伝子発現用
ベクターを構築し、これに種々の外来遺伝子を組み込ん
でその成果を調べたところ、いずれの外来遺伝子を組み
込んだ場合にも目的遺伝子産物を従来プロモーターより
非常に高く発現させることが可能であることを見いだし
本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明によればニワトリの健康な細胞で常に
高能率にて機能しているβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーを用いて外来遺伝子を発現させることを可能とするも
のである６本発明の好ましい態様である動物細胞用複製
開始領域（例えば５Ｖ４Ｑｏｒｉ）と組み合わせた発現
ベクターにおいては、最も強力であると言われる発癌ウ
ィルスＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを用いた市販の
発現プラスミドＰＣＨＩＩＯを用いて発現させた場合と
比較して、種々の外来遺伝子を約５０倍もの産生効率で
発現させることができる。

すなわち、本発明は動物細胞を用いた発現系において、
外来遺伝子を高発現させるととが可能なこれまで（こな
い強力な外来遺伝子発現ベクターを提供することを目的
とする。

β一アクチンは、あらゆる細胞に存在し多種の細胞機能
に関与している。また、プロトシアがらヒトに至る真核
生物の主要構成蛋白の一つであり、そのアミノ酸配列は
きわめて良く保存されている。

ニワトリ以外のβ−アクチン遺伝子プロモーターに関連
する発現系として、ヒトのβ−アクチン遺伝子プロモー
ターを用いた蛋白質の製造方法が知られている（Ｐ、　
ＧＵＮＮＩＮＧら：Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８４．４８３１−４８３５．１９
８７および角永武夫ら：特開昭６２−２６２９９５号）
、シかしながら、これらの報告によれば、そのプロモー
ター活性はＳＶ、４０初期遺伝子プロモーターと比較し
て、約１．７倍程度であり実用的には到底満足できるも
のではない。

また、最近、ヒトのβ−アクチン遺伝子のプロモーター
活性の強さを種々の宿主細胞を用いて比較した報告がな
されている（Ｇｅｎｅ　６５．１３５−１３９゜１９８
８　）　、　　これによれば、ヒトのβ−アクチン遺伝
子プロモーターは、マウス由来の細胞ではＳＶ４０初期
プロモーターよりかなり強い活性を示したが、ヒト由来
細胞やサル由来細胞においては、ＳＶ４０初期プロモー
ターより活性が低かったことを示している。

これに対して、本発明に用いられるニワトリのβ−アク
チン遺伝子プロモーターは、これまでによく知られて１
いるＳＶ４０初期プロモーターと比較して、少なくとも
５〜１０倍のプロモーター活性を有し、しかもマウス由
来細胞（例えばＬ細胞）のみならず、ハムスター由来細
胞（ＣＨＯ細胞等）、アフリカミドリザル由来細胞（Ｃ
Ｏ３細胞等）や他の動物細胞においても同様に強力なプ
ロモーター活性を有することが本発明により明らかにさ
れた。

ニワトリのβ−アクチン遺伝子とヒトのβ−アクチン遺
伝子とを比較すると、アミノ酸レベルでは９９．５％が
一致しており（３７６個のアミノ酸の中で２個だけ異な
る）、ＤＮＡレベルにおいても構造遺伝子領域では８８
πが一致している。一方、プロモーター領域のＤＮＡ配
列の比較をするとヒトとニワトリの間では５０．７％の
ホモロジーが観察されるのみであった。

本発明の中で用いられるニワトリβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターは、第１図に示した塩基配列を有する遺伝子
断片である。このようなニワトリβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターは、先にＴ、　Ａ。

Ｋｏｓｔらによってもクローニングされている（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　１１．　
Ｎｏ、２３．　８２８７−８２８６、１９８３）。

本発明の外来遺伝子発現ベクターに用いられるニワトリ
のβ−アクチン遺伝子プロモーターは、全体的にＧ（グ
アニン）Ｃ（シトシン）含量が高く、ＴＡＴＡボックス
（ＡＮＮ　ＲＥＳ　ＢＩＯＣＨＥＭ、　ｒ２ｆｉ。

３４９−３８３．１９８１）やＣＣＡＡＴボックス（Ｎ
ＵＣＬＥＣＩＡＣＤＳ　ＲＥＳ、　ａ、１２７−１４２
．１９８０＞などプロモーターに特徴的な配列が備わっ
ている遺伝子断片である。

第１図に示すプロモーターの塩基配列中−９０９の・ 位置のＧから−７の位置のＧまでのＤＮＡ領域はメツセ
ンジャーＲＮＡに転写された後で、削除（スプライス）
される遺伝子領域（イントロン）と考えられる。

本発明の好ましい態様としては、ベクターに組み込むニ
ワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターとして、その
３°端側は第１図に示す−５の位置のＣ（シトシン）ま
でを少なくとも有する導伝予断片が使用される０通常、
プロモーターの性状においては、本来の構造遺伝子開始
コドンＡＴＧの上流−４０ｂｐ程度まで一部配列を除去
してもそのプロモーター活性にはほとんど影響がないと
考えられているが、本発明に用いられるニワトリのβ−
アクチン遺伝子の場合、本来の開始コドンＡＴＧの５塩
基上流のＣ（シトシン）までをプロモーター領域として
残すことにより、目的の外来遺伝子をさらに高発現させ
ることが可能であることが本発明者らにより確認された
。

本発明の動物細胞用発現ベクターの基本的な構造として
は、上述のニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーター
を有することを最大の特徴とし、プロモーター下流に外
来遺伝子を組み込む、ことが可能な適当な制限酵素切断
部位を有する。このような制限酵素切断部位は、ひとつ
の制限酵素による認識部位があれば足りるが、種々の外
来遺伝子を組み込み易くするために２つ以上の制限酵素
による認識部位を有することも可能である。また、本発
明の発現ベクターには、目的の外来遺伝子を効率よく発
現させるために、発現させる構造遺伝子を組み込んだ際
にその下流に位置するようポリアデニレーション配列が
組み込まれる。さらに形質転換動物細胞をクローニング
するために適当なマーカー遺伝子を組み込むことが好ま
しい。

また、このような本発明の発現ベクターは、大腸菌での
クローニングを行い易くするために大腸菌プラスミド由
来の遺伝子を有する。そのような大腸菌プラスミド由来
遺伝子としては、大腸菌体内で複製するためのｏｒｉ、
並びにクローニングの際に選択マーカーとなりうる適当
な薬剤耐性遺伝子、例えばアンピシリンや、テトラサイ
クリン等に対する耐性遺伝子が挙げられる。また、この
ような遺伝子としてプラスミドｐＢＲ３２２由来の遺伝
子を組み込む場合には、ｐＢＲ３２２複製開始点（ｏｒ
ｉ）の近くにある、宿主細胞での複製を阻害する毒性配
列を除去することが好ましい。

また、目的の外来遺伝子を発現させる宿主細胞としてＳ
Ｖ４０のラージＴ抗原を産生ずる細胞、例えばＣＯ３（
アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いる場合には、
上記の発現ベクターに動物細胞内で機能する複製開始点
（例えばＳＶ４０　ｏｒ＋＞を組み込むことによりさら
に効率よく外来遺伝子を発現させることが可能となる。

そのような本発明の好ましい発現ベクターの一例として
、マウスＬ細胞を宿主とした場合に使用可能なｐＡｃ−
２（第５図）および、ＣＯＳ細胞を宿主とした場合に効
果的なｐｓＡｃ−２＜第６図）が挙げられる。

さらに、外来遺伝子の発現効率を上げるためには、ジヒ
ドロ葉酸還元化酵素（ＤＦＩＦＲ）　Ｉｔ伝子を本発明
の発現ベクターに組み込むことも可能であり、または、
形質転換の際にＩ））ＩＦＲ発現プラスミドと共に形質
転換することもできる。この場合には、宿主細胞として
はＤ　１１　Ｐ　Ｒ遺伝子欠損細胞を用いることが望ま
しく、培地中にメトトレキセートを添加することで形質
転換体内の遺伝子を増幅させ、より高い発現量を得るこ
とが可能となる。このようなりＩＩＰＲ遺伝子を用いた
発現効率アップの手法は、すでに知られている手法であ
るが、本発明の発現ベクターに応用すれば、飛躍的に発
現効率を向上させることが可能となる。

β−アクチンは多種の動物細胞に存在することから、本
発現系は高能率であるばかりでなく、宿主域が広く、安
全な、従って産業上の有用性がきわめて高い発現系であ
るといえる。

本発明の動物細胞用発現ベクターは、これまでにない極
めて高発現が可能な動物細胞用発現ベクターであり、工
業的レベルの生産においても十分利用可能な新規な外来
遺伝子発現系を提供するものである。ニワトリのβ−ア
クチン遺伝子プロモーターのこのような特質は未だ知ら
れておらず、本発明により初めて確認されたものであり
、本発明が産業界にもたらす技術的利益は非常に大きな
ものであると評価される。

以下、本発明の発現ベクターが実際に非常に有用である
ことを示す一例として大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子並びにＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子
を用いた場合の実施例に沿って本発明をさらに詳細に説
明する。

実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々の酵素
、大腸菌、培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる雑
誌、載置を参考とした。

１、遺伝子操作実験法、高木置敷、編著（１９８０）、
講談社 ２、遺伝子操作マニュアル、高木置敷、編著（１９８２
）、講談社 ３、　！４０ＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　Ａ　ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、　Ｔ、ＭＡＮＩＡＴ
ＩＳら編、　（１９８２）、　Ｃ０ＬＤ　５ＰＲＩＮＧ
１（ＡＲＢＯＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ。

４、　　ＭＥＴＩ（ＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＩ４０ＬＯ
ＧＹ、　　６５巻、Ｌ　　ＧＲＯ８Ｓ１４簡、ら編、　
（１９８０）、　ＡＣＡＤＥＭＩＣＰＲＥＳＳ実施例中
には次の略号を用いた。

ＣＡＴ：　クロラムフェニコール・アセチル・トランス
フェラーゼ １ａｃＺ：　　β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ　）
構造遺伝子 （１）ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター領域の
調製 ニワトリのβ−アクチン遺伝子の第１エクソン、第１イ
ントロン及び第２エクソンの一部と、それに融合した形
で続＜　ＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドｐＡＺＬＱ３
７　ＣＮＡＴｔｌＲＥ、　３ｉＡ、　？２８６〜２８９
　（１９８５）］を制限酵素Ｎｃｏｌ　（ＮＥＢ　＃１
９３）で消化した。　　ＮｃｏＩは、第２図に示す６塩
基対の配列を認識し、その切断面は、第３図に示したよ
うな５°末端が突出した配列となる０本発明においては
、発現ベクターとして使用する際にニワトリβ−アクチ
ン遺伝子の第１イントロンと第２エクソンの閏のスプラ
イス部位が正確に機能することを目的として以下の操作
を行った。

すなわち、Ｎｅｏ　Ｉ消化後のＤＮＡを修飾酵素Ｓ１ヌ
クレアーゼ（フカ５＃２４１０Ａ　）で処理し、５′末
端突出部位及びそのとなりの１塩基対のみを削除した。

この反応は、３０＋ｓＭ酢酸ナトリウム、　ｐ）［４，
６，１００！ＩＭ　ＮａＣ１゜１ｍＭ　Ｚｎ５Ｏａ溶液
８０Δ中、サンプルＤＮＡ１０ＩｔｇをＳ１ヌクレア一
ゼ１５０単位を用い、３７℃で１〜４分間行った。

このようにしてＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理した後
、修飾酵素ＴＪ　ＤＮＡポリメラーゼ（クカラ＃２０４
０Ａ）を作用させて一本鎖ＤＮＡ部分を修飾し、５゛末
端がリン酸化された合成りＮＡ　ｐＣＣＡＡＧＣＴＴＧ
Ｇ　（ｐ旧ｎｄｍリンカ−１ＮＥＢ　　＃１０５０）　
　と共に、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（タカラ＃２０１１
Ａ）を用いて連結環状化した。得られたＤＮＡ溶液で大
腸菌＋ｔＢｉｏｔ株を形質転換し、単一のコロニを分離
した後、形質転換体中のプラスミドＤＮＡを回収し、制
限酵木Ｈｉｎｄｍ　（ＮＥＢ＃１０４　）およびＮａｒ
Ｉ（ＮＥＢ＃１９１　）で消化し、６％アクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、適当なサイズのＤＮＡ断片が検出
されたクローンをまず選択し、そのＤＮＡ断片をファー
ジベクターＭ１３ｍｐ１９　（ＮＥＢ＃４００−１９＞
のＳａｌ　Ｉ　−）［ｐｎ　１部位にクローニングし、
旧ｎｄｍ部位付近の塩基配列をジデオキシ法（ＰＲＯＮ
　Ａ　Ｓ、　７Ａ、　５４６３−５４６７、１９７７）
　）により決定し、目的とするクローンのスクリーニン
グを行った。

このようにして得られたプラスミドクローンｐ２８は、
第４図に示すように、本来のニワトリβ−アクチン遺伝
子のスプライシング部位から構造遺伝子にかけての塩基
配列を保持しており、かつ開始コドン＾ＴＧより３°側
の遺伝子が除去され、新たに旧ｎｄｌｌｆ部位が導入さ
れている。また、この時同様にしてさらにＡＴＧ上流の
２塩基までが除去されたクローンｐ２９および上流２０
塩基までが除去されたｐ３を得た。

（２）動物細胞用発現ベクターｐＡｃ−２の構築ＳＶ４
０初期プロモーターのスプライシング部位及びポリアデ
ニレーションシグナルを含むプラスミドｐｓＶ２−ｃａ
ｔ　［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
、　　２．　　ｐ１０４４１０５１（１９８２）　］を
制限酵素Ｍｆｌｌ（クカラ＃１０７０Ａ）で消化し、Ｔ
４ＤＮ＾ポリメラーゼで末端を修復した後、リン酸化し
た旧ｎｄｍリンカ−をＴ４　ＤＮＡリガーゼによって結
合させた。これをさらに旧ｎｄｍ及びＢａ＋＊ＨＩ（Ｎ
ＥＢ＃１３６　＞で消化し、６％アクリルアミドゲル電
気泳動を行って約９００ｂｐの旧ｎｄｍ　−ＢａｍＨＩ
断片を抽出した０次に（１）で構築したＰ２８を制限酵
素器ｎｄｍ及びＢａ５ＨＩで消化し、仔牛小腸由来アル
カリホスファターゼ（クカラ＃２２５０Ａ）の作用によ
り脱リン酸化した。これと前述した約９θＯｂＰの旧ｎ
ｄｌｌ［−Ｂａｓａｌ断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで
連結環状化し、プラスミドｐＡｃ−２（第５図参照）を
得た。

（３）動物細胞用発現ベクターｐｓＡｃ−２の構築（２
）でも使用したプラスミドｐｓＶ２−ｃａｔを制限酵素
Ａｃｃｌ　（ＮＥＢ＃１６１）及び５ｐｈＩ　（ＮＥＢ
＃１８２）で消化し、末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑にし、リン酸化Ｘｂａ　Ｉリンカ−（ＮＥＢ、＃
１０３２　＞存在下、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連
結環状化することにより、プラスミドｐｓＶ−ｃａｔ−
ｄｅｌｌｉ　［Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｌ。

ＵＳＡ、　１１．９５３７〜９５４１　（１９８６）１
を得た。

このｐｓＶｃａｔ−ｄｅｌＢを旧ｎｄｍで消化し、Ｔ４
　ＤＮＡポリメラーゼで末端を修復した後、リン酸化Ｘ
ｈｏ　Ｉリンカ−（Ｎ１！Ｂ＃１０３０）　）存在下Ｔ
４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結環状化した。さらに制
限酵素ＥｃｏＲＩ　（ＮＥＢ＃１０１）　及びＸｈｏｌ
　（ＮＥ　Ｂ＃１４６）　テ消化し、１にアガロースゲ
ル電気泳動を行って約２ｋｂＰ（７）　ＥｃｏＲＩ　−
Ｘｈｏ　１断片を抽出した。（２）で構築したプラスミ
ドｐＡｃ−２を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで消
化することにより得られる約２．２ｋｂｐ　Ｘｈｏ　Ｉ
　−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
、先の約２ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片と連
結環状化させ、プラスミドｐｓＡｃ−２（第６図）を得
た。

（１）β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の調製β−ガラ
クトシダーゼをコードしている１ａｃＺ遺伝子全領域を
含むプラスミドｐｃＨ１１０Ｃファルマシア＃２７−４
５０８−０１　）を制限酵素器ｎｄ１１Ｆ及びＢａｗｌ
　Ｉで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により約３
．８ｋｂｐの旧ｎｄｍ　−Ｂａ＋ｉＨＩフラグメントを
調製した。なお、このフラグメントの中には、ＳＶ４０
初期遺伝子転写物のスプライシング部位及びポリアデニ
レーション部位も含まれている。

（２）プラスミドｐＡｃ−１ａｃＺの構築実施例１（１
）で構築したプラスミドＰ２８を、制限酵素器ｎｄｍ及
びＢａｍＨＩで消化し、仔牛小腸由来アルカリホスファ
ターゼを用いて脱リン酸化した。

これに実施例２（１）で得た約３．８ｋｂ　Ｈｉｎｄｍ
　−Ｂａ＋＋Ｈ１フラグメントを加えてＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼで連結環状化させることによりプラスミドｐＡｃ
−１＾ｃＺを構築した。

又、全く同様にして、実施例１（１）で示したＰ２９及
びｐ３からｐＡｃ−１ａｃＺ（２９）及びｐＡｃ−１ａ
ｃＺ（３）を構築した。

（３）プラスミドｐｓＡｃ−１ａｃＺの構築実施例１〈
３）で構築したプラスミドｐｓＡｃ−２を制限酵素器ｎ
ｄＩ［＋及びＢａｍＨＩで消化し、修生小腸由来アルカ
リホスファターゼで脱リン酸化した。これに２（１）で
得た約３．８ｋｂｐ　Ｉｌｌｎｄｍ　−ＢａｍＨＩ　Ｉ
フラグメントを加えてＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結環状
化させることによりプラスミドｐＳＡｃ−１ａｃＺを構
築した。

酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモーターを有し、
酵母を形質転換することによりＨＢｓＡｇを産生するこ
とのできるプラスミドｐＡｓ１０１　（特公昭６１−５
５９５１　）を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで消化し、６ｘアク
リルアミドゲル電気泳動によりｌｌＢｓＡｇ遺伝子を含
む約１．３ｋｂｐのＩＶ＾断片を抽出した。

又、１（３）で構築したプラスミドｐｓＡｃ−２を制限
酵素５ａｌｌ（タカラ＃１０８０Ａ）で消化した後、修
生小腸由来アルカリホスファターゼの作用により脱リン
酸化した。これを前述のＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１゜
３ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
連結環状化することにより、ｌｌＢｓＡｇ発現プラスミ
ドｐｓＡｃ−ＨＢＳを構築した。

次に、ｐｓＡｃ−ＨＢｓの発現量評価のための参照発現
ベクターｐｓＶＥｓは以下のごとく構築した。

前述ｐＡｓ１０１　（１０μ９　）をＸｈｏ　Ｉ　（Ｉ
Ｑｕ）で３７℃４時間反応させ、　　０．７５１Ｆアガ
ロースゲルにて電気泳動させる。ＨＢｓ遺伝子を含む１
．３Ｋｂのバンドをアガロースゲルから切り出し、透析
チューブ′に入れ再び電気泳動させる。ゲル断片からＤ
ＮＡが溶出されたのち、透析チューブよりＤＮＡ溶液の
みを取り出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出する
。抽出したＨＢｓ遺伝子を含むＤＮＡ断片１μ９を７４
ＤＮＡポリメラーゼ（１ｕ）で３７℃３０分間反応させ
る。フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽
出する。

一方、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを持つプラスミ
ドｐ）［５Ｖ−１０（ファルマシア＃２７−４９２６−
０１　）１μ９をＢｇｌＩ［（Ｉｕ）で３７℃１時間反
応させる。フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮ
Ａを抽出する。抽出したＤＮＡを上記と同様に７４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理を行う、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反
応により末端を平滑末端に変換したｌｌＢｓ遺伝子断片
５００ｎｇと　ｐＫｓＶ−１０５０ｎｇとをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（１ｕ）で４℃１２時間反応させる。この反応
液と大腸菌１１ＢＩ旧を形質転換させる。形質転換体か
らプラスミドを抽出し、ＰＫＳＶ−１０にＩ（Ｂｓ遺伝
子が挿入されたプラスミドｐＳｌ／ＥＳ１を得ることが
できた。

１００ｍ＋＊円形シャーレに、ＣＯ５−細胞又はＬ−細
胞ｌＸｌ０’細胞／ｄｉｓｈをまき、常法に従いリン酸
カルシウム法により下記プラスミドＩ）Ｎ＾各２０μ９
をこれらの宿主細胞に導入した。

リン酸カルシウム−ＤＮＡゲルを細胞と２４時間接触さ
せた後、更に１（１％Ｆｃｓ−ＤＭＥで２４時間培養し
た。トリプシン処理により細胞をｄ　ｉｓｈからはがし
、低速遠心によりベレッティングした後、Ｆ−Ｔ　ｂｕ
ｆｆｅｒ　（２５０ｍＭショ糖、１０ｎＭＴｒｌｓ−Ｈ
ＣＩ、ＰＨ７，５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）２００ＩＡに
懸濁し、凍結融解を３回繰り返した後遠心し、上清を回
収した。

このようにして得られた細胞抽出液２００ＩＡから！Ｏ
Ａを分取し、β−ｇａｌ活性の測定に用いた。β−ｇａ
ｌ活性は、常法に従い、０ＮＰＧ　（ｏ−ＮｌＴＲ０Ｐ
ＨＥＮＹＬ−β−Ｄ−ＧＡＬＡＣＴＯＰＹＲＡＮＯ９Ｉ
ＤＥ　”）の発色に伴う４２０ｎｍの吸光度の変化を調
べることによって行った。その際ＳＶ４０初期プロモー
ターを用いたプラスミドルｃ旧１０［ファルマシア＃２
７−４５０８−０１１によって形質転換されたＣＯ３−
細胞又はＬ−細胞の細胞抽出液が示した吸光度を１とし
たときの相対的な値を表１に示した。

表　　１ プラスミド Ｃ０８−ｃｅｌｌ −ｃｅｌｌ ■　ｐＣ旧、１０　　　　　　　　　　１．０　　　　
　　　　１．０■　ｐＡｃ−１ａｃＺ　　　　　　　　
　４．０　　　　　　　　５．０■　ｐＡｃ−１ａｃＺ
（３）　　　　　　　１．２■　ｐＡｃ−１ａｃＺ（２
９）　　　　　　２．７■　ｐｓＡｃ−１ａｃＺ　　　
　　　　　５７．２　　　　　　　　３．０■　ｐｓＡ
ｃ−２０，０１０，０１ その結果、ニワトリβ−アクチンのプロモーターを用い
たｐＡｃ−１ａｃＺおよびｐｓＡｃ−１ａｃＺは、Ｌ−
細胞において、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを用い
た　ｐｃＨｌｌｏより３〜５倍高い値を示した。また、
Ｓ　Ｖ　４０ｏｒ＋が有効に機能しているために、Ｃｏ
Ｓｍ胞においてｐｓＡｃ−１λｃＺはｐＣＣｌＯ２り５
０倍以上高い値を示した。

０−　　　　いたＨＢｓ ファルコン細胞培養６穴プレートに、１ｘｌＯ’４１１
胞／穴のＣＯ５−細胞をまき、常法通りＤＥＡＥ−Ｄｅ
ｘｔｒａｎ法により下記プラスミドＤＮＡ各５μ９を導
入した。　　Ｃｅ１ｌＰｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ｉｏｎ　Ｗｉｔ　（ファルマシア）を用いて、ＤＮＡ導
入後３日後の培養上清を分取し、ＨＢｓＡｇ検出キット
「オースリアＩｌ」（グイナボット社製）を用いてＨＢ
ｓＡｇ活性を測定したく表２）。

その結果、ニワトリβ−アクチンプロモーターを用いた
ｐｓＡｃ−）ＩＢｓは、ＳＶ４０初期遺伝子プロモータ
ーを用いたｐｓＶＩ＋−１１８ｓの３〜５倍高い値を示
した。

表　　２ プラスミド　　　　　ｔｌ１３ｓ抗原活性（ｃｐ園）■
　ｐＶＥｓｌ １、１００ ■　　ｐｓＡｃ−ＩＩＢｓ ６、８００ ■　ｐｓＡｃ−２

【図面の簡単な説明】

第１図は、ニワトリのβ−アクチンプロモーターの塩基
配列を示す。 第２図は、制限酵素Ｎｃｏｌが認識する配列を示す。 第３図は、制限酵素ＮｃｏＩの切断面を示す。 第４図は、実施例１で構築したプラスミドＰ２８、ｐ２
９及びｐ３におけるプロモーター下流域に組み込んだ旧
ｎｄｍリンカ−の位置を示す。 第５図は、プラスミドｐＡｃ−２の構造を示す。 第６図は、プラスミドｐｓＡｃ−２の構造を示す。 第１図　その１ ＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡ
ＴＴＴＴＧ　ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴ
Ｔ　ＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡ　ＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧ　Ｃ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧ
ＣＧＧＧ　ＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧ　ＧＣＧＡＧＧＧＧＣ
Ｇ−１１１１−ＩＩｏｌ　　　　　−１０９１−１０８
１ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧ　ＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧ　ＧＴ
ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣ＾ＧＡＧＣＧＧＣＧ
ＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴ　ＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧ　
ＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ　ＧＣＣＣ
ＴＡＴＡＡＡ　ＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧ　ＣＧＣＧＧＣＧ
ＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴ　ＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴ　
ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣ
ＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡ
　ＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＴ
ＧＡＧＣＧＧＧ　ＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴ　ＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧ　
ＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧ　ＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴ第 図 その２ ＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧ　ＣＣＴＴ
ＡＡＡＧＧＧ　ＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧ
ＴＧ　ＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧ　ＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧ　
ＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ　ＣＧＴＧ
ＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧ　ＧＣＣＣＧＣＧＣ
ＴＧ−Ｏｒ　　　　　　−７０１−６９）　　　　　　
−６＆１ＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴ　ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧ
　ＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣ
ＧＣＴＣＣＧ　ＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧ　ＡＧＧＧＧＡＧ
ＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧ
ＴＧＣＧＧＧＧＧ　ＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧ　ＧＧＡＡＣ
ＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧ　ＧＧＴＧＴＧＴＧＣ
Ｇ　ＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧ　ＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴ
ＧＧＧＣＧＣＧＧ　ＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴ　ＧＴＡＡＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧ
　ＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡ　ＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴ　ＴＣ
ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴ
ＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧ　ＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣ
ＧＧＧＧＧＧＴＧＧ　ＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　ＧＧＧＴ
ＧＣＣＧＧＧ　ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ第 図 その３ ＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧ　ＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧ　ＣＴＣ
ＧＧＧＧＧＡＧ　ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧ
ＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴ　ＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴ
ＧＧＴＡ　ＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧ　ＡＧＧＧＣＧＣＡＧ
ＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴ　ＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧ
ＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧ
ＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧ
ＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡ
ＧＧ　ＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧ　ＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣ
ＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ　ＴＣＣＣＣ
ＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧ
　ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧ　ＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴ　ＴＣ
ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧ　ＣＧＧＧＧＴ
ＴＣＧＧ　ＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴ　ＧＴＧＡＣＣＧＧＣ
Ｇ第 図 ｉｎｄ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを有
   し、そのプロモーター下流に外来遺伝子を組み込むこと
   が可能な制限酵素部位を有することを特徴とする動物細
   胞用発現プラスミド。
2. （２）β−アクチン遺伝子プロモーターが、下記の遺伝
   子配列の全体またはプロモーター活性を有するその遺伝
   子断片である前記第（１）項記載のプラスミド。 【遺伝子配列があります】
3. （３）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターの３
   ’端が、少なくとも本来のβ−アクチン構造遺伝子翻訳
   開始コドン（ＡＴＧ）より５塩基上流のシトシン（Ｃ）
   までの遺伝子を有する前記第（２）項のプラスミド。
4. （４）大腸菌プラスミド由来の遺伝子を有する前記第（
   １）項記載のプラスミド。
5. （５）大腸菌由来の遺伝子が、アンピシリン、テトラサ
   イクリンもしくはカナマイシン等の耐性遺伝子およびｐ
   ＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域（ｐＢＲ３２
   ２　ｏｒｉ）を含む前記第（４）項のプラスミド。
6. （６）ＳＶ４０ウイルス由来の遺伝子を有する前記第（
   １）項記載のプラスミド。
7. （７）ＳＶ４０由来の遺伝子が、ＳＶ４０初期転写のス
   プライシング部位およびポリアデニレーション部位を含
   んでいる前記第（６）項のプラスミド。
8. （８）ＳＶ４０複製開始領域（ＳＶ４０　ｏｒｉ）を組
   み込んだ前記第（１）項記載のプラスミド。
9. （９）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターの下
   流の制限酵素部位を２つ以上有する第（１）項のプラス
   ミド。
10. （１０）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを
    有し、そのプロモーター下流に外来遺伝子を組み込むこ
    とが可能な制限酵素部位を有する動物細胞用発現アラス
    ミドに外来遺伝子を組み込み、これを動物細胞に導入し
    て得られた形質転換動物細胞を培養することを特徴とす
    る外来遺伝子の発現方法。