JPH01165395A - 組換えタンパク質発現のための一時発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、トランスフェクションから約１日〜約２週間
の間に所望のタンパク質を発現し得る発現系を、組換え
ＤＮＡ技術を適用して開発することに関するものである
。さらに詳しくは、本発明は、所望のタンパク質を発現
させるための、安定な細胞質ｍＲＮＡを生成させ得る発
現ベクター、およびトランス−活性化（ｔｒａｎｓ−ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇ）タンパク質および／またはある種
の翻訳調節エフエクターを発現し得るベクターで宿主細
胞を形質転換することにより、所望のタンパク質の一時
的な生産を高めることに関するものである。また、本発
明は、選択した真核性宿主細胞を、そのようなベクター
でトランスフェクトし、所望のタンパク質の一時的な生
産を得ることに関するものである。

近年、組換え技術は真核性細胞に適用されるようになり
、特に、選択可能な表現型をコードしているヘテロロー
ガスＤＮＡによる哺乳類細胞の形質転換が行なわれてい
る［ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ。

Ｍ、　　）Ｃｅｌｌ　　　１１：２２３　　２３２（１
９７７）　コ。

また、真核性細胞を形質転換して真核性細胞核の染色体
ＤＮＡにヘテロローガス（異種の）ＤＮＡが組み込まれ
た形質転換体が得られることも示された。

真核性細胞培養の形質転換に成功し、所望のタンパク質
をコードしているＤＮＡ配列の発現に成功したという報
告がある。例えば、英国特許請求の範囲公開第７３．６
５９および７３，６５６号がある。これらの形質転換成
功例では、エンハンサ−類［グルラマン（Ｇｌｕｚｍａ
ｎ、　　Ｙ、）およびシエンク（Ｓ　ｈｅｎｋ、　Ｔ、
　）編、Ｅ　ｎｈａｎｃｅｒｓ　　ａｎｄ　　Ｅ　ｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ。

ｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９８３　）］、
プロモーター類［ハマーら（Ｈａｍｅｒ、　　Ｄ、　　
Ｈ，）、Ｃｅ１１２上：６９７（１９８０）］のような
５°調節シグナルと、３゛ポリアデニル化部位［ブラウ
トフット（Ｐ　ｒｏｄｆｏｏｔ、　　Ｎ。

Ｊ、）およびブラウンリー（Ｂ　ｒｏｗｎｌｅｅ＋　Ｇ
、　Ｇ、　）Ｎａｔｕｒｅ２６３：２１１（１９７６）
］のみを必要とする相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ類）の発現
ベクターを使用していた。

１９７７年に、真核性細胞内では、細胞質ｍＲＮＡとＤ
ＮＡが常に、相互に直線関係（ｃｏ　−１ｉｎｅａｒ）
にあるとは限らないということが見出された。

タンパク質をコードしているＤＮＡ配列はコードしてい
ない（非暗号）、−続き（ストレッチ）のＤＮＡで中断
されていることが分かった。遺伝子のＤＮＡには、最終
ｍＲＮＡには現れない−続きの塩基配列がある。−次ｍ
ＲＮＡ転写物は、非暗号化配列、即ち、タンパク質をコ
ードしていない配列を除去するよう「スプライシング」
されていることが観察された。これら、ＤＮＡ中の非暗
号化配列は、一般に、イントロン（従来は介在配列と称
した）と呼ばれており、暗号配列はエクソンとじて知ら
れている。ＲＮＡポリメラーゼは、全ＤＮＡ。

イントロンおよびエクソン両者の一次転写物を作成する
。この転写物は、イントロンを除去すると同時に、全エ
クソンを正しい順番に連結するようプロセッシングされ
る。上記の結果を与える機構を「スプライシング」とい
う。

数多くのスプリットまたはスプライスされた遺伝子が発
見された。実際、事実上、全ての哺乳類およびを推動物
の遺伝子、さらには、真核性微生物の遺伝子にもイント
ロンが存在する。イントロンはメツセージをコードする
領域内に限定されない。例えば、プラスミノーゲン活性
化因子ｍＲＮＡには、遺伝子の様々な箇所にある多数の
スプライス部位に加えて、暗号配列前方のリーダー領域
にも１個のイントロンが見出されている［フィッシャー
ら（Ｆ　１ｓｈｅｒ、　　Ｒ，）、Ｊ、　　Ｂｏｉｌ、
Ｃｈｅｍ。

２６０：１１２２（１９８５）］＝イフィンンが何故生
し、それが真核性遺伝子の一般的な特徴となっているの
か、ということについて、かなりの考察がなされている
［クリック（Ｃｒｉｃｋ、　Ｆ　、　）　Ｓ　ｃｉｅｎ
ｃｅ２０４．２６４（１９７９）およびシャープ（Ｓｈ
ａｒｐ。

Ｐ、　Ａ、　）Ｃｅｌｌλ旦、６４３−６４６（’１９
８１）］。

至る所にイントロンが存在しているので、組換え技術の
流れにおいてイントロンが研究されているということは
、驚くに値しない。例えば、ウサギβ−グロビンｃＤＮ
Ａ、転写の開始および終止に関連した領域、β−グロビ
ンｃＤＮＡ配列の５”側に位置する多数に分かれたリー
ダー配列のスプライシング部位、およびポリアデニル化
配列を含有させ、５Ｖ４Ｑベクターが構築された［ムリ
ガンら（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　　Ｒ，Ｃ，）Ｎａｔｕｒ
ｅ　　２７７％　　１０８−１１４（１９７９）］。こ
の組換えゲノムをサル腎細胞に感染させると、１６Ｓお
よび１９Ｓ後期ＲＮＡのリーダー領域およびβ−グロビ
ン暗号配列を含有するハイブリッドｍＲＮＡが生産され
ることが見出された。このハイブリッドｍＲＮＡは、実
質的な量のウサギβ−グロビンポリペプチドを産生じた
。ムリガンらはスプライシング能力を欠く突然変異体が
別々のｍＲＮＡを生産することができないという実験に
ついて論じている（前掲１０９頁）。

ＲＮＡスプライシングか遺伝子発現に果たす生理学的役
割を確立するために、ハマー（Ｈａｍｅｒ。

Ｄ、　　Ｈ，）およびレダー（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　）
［Ｃｅ１ｌ上８．１２９９−１３０２（１９７９）］は
、サル細胞にトランスフェクトされたＳＶ４０組換え体
のスプライス部位の位置および／または存在を操作して
いる。ハマーおよびレダー（前掲）は所望のタンパク質
をコードしている遺伝子内の１個のスプライス部位を用
いるか、所望のタンパク質をコードしている遺伝子の５
″に位置する第１のスプライス部位と、該遺伝子内にａ
在する第２のスプライス部位の、２つのスプライス部位
配列を用いた。

彼等は、少なくとも１個の機能的なスプライス連結部（
ジャンクション）を保持する全てのウィルスによって一
時的にＲＮＡが産生されることを見出した。彼等は、ス
プライソングは安定なＲＮＡ形成のための必要条件であ
ると結論した。グルメら（Ｇｒｕｓｓ、　　Ｐ、　　）
［ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７６　４３　１７−４３２１（１
９７９）］は、このことを確認すると共に、介在配列を
含有しないＳ　Ｖ　４　’Ｏ突然変異体を構築すると、
キャプンドタンパク質の生産が検出されないことを発見
した。これらの２つの報告は、ＲＮＡスプライシングが
組換え環境において重要であることを示唆するものであ
る。しかしながら、他の研究では、エンハンサ−および
プロモーター等の５″調節ングナル、および３゛ポリア
デニル化部位のみを用いてタンパク質を発現させ、スプ
ライシングを放棄している。実際、レディら（Ｒｅｄｄ
ｙ、　Ｕ、　　Ｂ、　、転写調節機構、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ
。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　Ｓ　ｕｐｐｌ、　　ユ　ＯＤ　
　　１５４（１９８６）コによる最近の研究では、発現
ベクター中にイントロンが含有されると、所望のタンパ
ク質の発現量が事実上、減少することが分かった。

エンハンサ−、プロモーターおよび３゛ポリアデニル化
部位のような標準的な組換え調節シグナルを用いた平明
な発現が常に成功するとは限らない。多くのｃＤＮＡの
直接発現に、スプライシング部位を含有しない５Ｖ４Ｑ
プロモーターか用いられた。β−ガラクトシダーゼ［ホ
ールら（Ｈａｌｌ、Ｃ，Ｖ、　）Ｊ、　Ｍｏ１．　　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓλ］、ヒトインター
フェロン［グレイら（Ｇｒａｙ、　　Ｐ、　Ｗ。

）、Ｎ　ａｔｕｒｅ　　λ旦５．５０３（１９８２）コ
、ヘマグルチニン［ゲッシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）Ｎａ
ｔｕｒｅ　　２９３　６２０（１９８１）］、］ヒトー
レシチンーコレステロールアシルトランスフェラーゼ［
マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ、Ｊ、）、ＰＮＡＳ３３．
２３３５（１９８６）］、ＤＨＦＲ［シモンセンら（Ｓ
　ｉｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ，Ｃ，）ＰＮＡＳ８０．２４９
５（１９８３）］、ヒトインターロイキン２［レオナー
ドら（Ｌ　ｅｏｎａｒｄ。

Ｗ、　　Ｔ、　）Ｎａｔｕｒｅ　　３上ユ、６２６（１
，９８４，）］、ｒａｓ　−２、カボンら（Ｃａｐｏｎ
、　　Ｄ、　　Ｊ、）　Ｎ　ａｔｕｒｅ３０４．１９８
３］、ｓｒｃ［スナイダーら（Ｓ　ｎｙｄｅｒ＋Ｍ、Ａ
、）Ｃｅｌｌ　　３２　８９１（１９８３）］およびＢ
型肝炎表面抗原［クロウリ−ら（Ｃｒｏｗｌｅｙ＋　Ｃ
。

Ｗ　）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　　Ｂｏｉｌ１４４　５
５（１９８３）］。

一時（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現系は、組換え技術の一
手段として用いられる。例えば、プロモーター配列、エ
ンハンサ−の効果、並びに転写制御の表現の分析は、−
時発現系を用いて容易に行うことができる。充分に特徴
づけられた一時発現系の１つに、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の発現系がある
［ゴーマンら（Ｇ　ｏｒｍａｎ。

Ｃ，Ｍ、　）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　　Ｂｏｉｌ、　　
２：１０４４　１０５１（１９８２）］。

ＤＮＡウィルスに感染した細胞によって生産される様々
なウィルス性タンパク質が、−時的に制御された溶菌ラ
イフサイクルの後期用に発現されるウィルス遺伝子を活
性化することが知られている［ケラ−ら（Ｋ　ｅｌｌｅ
ｒ、　　Ｊ　、　　Ｍ、　）、Ｃｅ１１．　３６：３８
１−３８９（１９８４）］。これらのタンパク質にはシ
ミアンウィルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原、アデノウィル
スＥｌａおよびＥｌｂタンパク質、ヘルペスウィルス前
初期（Ｉ　Ｅ）タンパク質ｆｌｆ２びにヒトおよびシミ
アンの免疫欠損ウィルスか含まれる［ベノイスト（Ｂ　
ｅｎｏｉｓｔ、　　Ｃ、）およびチャンバー（Ｃｈａｍ
ｂｅｒ、　　Ｐ、　）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、　）
２９０　：３０４−３１０（１９８１）］；　　ヒアリ
ング（Ｈｅａｒｉｎｇ、　　Ｐ）およびシエンク（Ｓｈ
ｅｎｋ、　　Ｔ、　）Ｃｅ１１．　３９：６５３−６６
２（１９８３）］：　０センら（Ｒｏｓｅｎ、　　Ｃ。

）Ｎａｔｕｒｅ　　３　１９　　５５５　　　５５６（
１９８６）コ、これらのタンパク質はシス（ｃｉｓ）−
作用要素によって活性化された有効なプロモーターを含
有する遺伝子の産物である。個々のタンパク質はまた、
他のウィルス性遺伝子の発現を賦活化し、そのウィルス
を、溶菌サイクルを通して増殖させる、トランス−活性
化機能をも有する。これら各タンパク質が、他のウィル
ス遺伝子の発現を増大することによって転写を活性化す
る作用は、個々のウィルス系で証明されている。この転
写活性化は、別々のプラスミドによるコトランスフェク
ションによってなされるので、「トランス−活性化（ｔ
ｒａｎｓ　−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）Ｊと呼ばれている
［パークら（Ｂ　ｅｒｋ＋　　Ａ　−Ｊ、　）Ｃｅｌｌ
　１７：９３５　９４４（１９７９）；ブラッディーら
（Ｂ　ｒａｄｙ＋　　Ｊ、）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：
２０４０−２０４４（１９８４）；　デイ’）ソンｃＤ
ｉｘｏｎ、　　Ｒ，Ａ、　　Ｆ、　）およびシェフｙ　
　（Ｓｈｅｆｆｅｒ。

Ｐ、Ａ、）Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３６：１８９−２０３（１
９８０）；　ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ＋　　Ｎ、　）お
よびシェンク（Ｓｈｅｎｋ、Ｔ、）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）
７’６：３６６５−３６６９（１９７９）］。Ｅｌａお
よびＥｌｂタンパク質を用いた一時発現によって得られ
た結果を示す幾つかのデーターは、これらのタンパク質
もまた、個々のウィルス系にとってホモローガスでない
、トランス−活性化プロモーターとなり得ることを示唆
している［グリーンら（Ｇｒｅｅｎ、　Ｍ。

Ｒ，）Ｃｅｌｌ　３５：１３７　１４８（１９８３）：
インペリアルら（Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ、　Ｍ、　　Ｒ，
）Ｃｅｌｌ　３５：１２７−１３６（１９８３）］。他
のデーターはＥｌｇが幾つかのエンハンサ−を抑制する
ことを暗示している［ボレリら（Ｂｏｒｅｌｌｉ、　　
Ｅ、　　Ｒ，）ＮａＬｕｒｅ（Ｌｏｎｄ、）３１２：６
０８　６１２（１９８４）］。

本発明の目的は、所望のタンパク質を生産し得る一時発
現系を提供することにある。また、本発明は、所望のタ
ンパク質を得るための連続生産を確立するのに要する時
間を不要にすることを目的とするものである。また本発
明は、トランスフェクションから約１日〜約２週間の間
に有用量の所望の組換えタンパク質を提供することを目
的とするものである。さらに本発明は、−時発現系に有
用な発現ベクターを提供することを目的とするものであ
る。さらにまた、本発明は、トランスフェクションから
約１日〜１４日間の間に所望のタンパク質を生産するた
めの一時発現系に用い得る宿主細胞を提供することを目
的とするものである。

また、本発明は、トランスフェクトされたＤＮＡを安定
化することにより、−時発現系における所望のタンパク
質の収量を向上させ得る、ある種のトランス−活性化因
子および／または翻訳調節エフェクターを提供すること
を目的とするものである。

発明の要約 本発明の目的は、所望のヘテロローガスタンパク質を真
核性宿主細胞内で生産する新規な方法、即ち、プロモー
ター、安定化配列、所望のヘテロローガスタンパク質を
コードしているＤＮＡ、およびポリアデニル化配列を含
む第１発現ベクターを構築し、真核性宿主細胞を第１発
現ベクターでトランスフェクトし、さらに、トランス−
活性化タンパク質エフェクターを産生ずるベクターで宿
主細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトされた
宿主細胞を、所望のタンパク質の生産に好適な条件下で
培養し、約２日〜約１４日の間に有用量の所望のタンパ
ク質を回収することからなる方法によって達成された。

本発明方法には、翻訳調節エフェクターを発現し得るベ
クターによる宿主細胞のトランスフェクションを付は加
えてもよい。本発明方法によれば、連続的な生産を確立
せずに、有用量の所望のタンパク質を提供し得るという
、顕著な利益が得られる。本発明方法は、かなり短期間
の間に、有用量のタンパク質を得ることができるという
著しい利点を有する。従って、本発明は、組換技術によ
り、トランスフェクション後約１〜約１４日の内に、所
望のヘテロローガスタンパク質を生産する方法を提供す
るものである。また本発明は、−時的な発現により、有
用量の所望のヘテロローガスタンパク質を生産するよう
トランスフェクトされた宿主細胞を提供するものである
。また、本発明は、ある特定のベクター成分と、ある種
のトランス−活性化タンパク質との相互作用を最適なも
のにする一時発現系を提供するものである。さらにまた
本発明は、翻訳調節エフェクターでトランスフェクトす
ることにより、−時発現系での発現を増大させることを
目的とするものである。

図面の簡単な記載 第１図は第■因子の生産細胞系統（セルライン）を樹立
するために用いられた第■因子発現ベクター、ｐＦ８ｃ
Ｉｓの構築模式図である。

第２図は、第■因子の生産細胞系統（セルライン）を樹
立するために用いられた第■因子発現ベクター、ｐＦ３
ＳＣＩＳの構築模式図である。

第３図はトランスフェクション後のイムノパーオキシダ
ーゼ染色の結果を示す写真の模写図であって、（Ａ）は
ｐＦ８ＣＩＳによるトランスフェクション後、（Ｂ）は
ｐＦ８ＳＣＩＳによるトランスフェクション後の結果を
示す。

第４図は第■因子変異体の生産細胞系統を樹立するため
に用いられた第■因子変異体発現ベクター、ｐＦ８ｃＩ
ｓ９０８０の構築模式図である。

第５図は、活性化プロティンＣによる蛋白分解的開裂に
耐性を有する第■因子をコードしているｃＤＮＡを含有
する発現ベクター、ｐＦ８ＣＩＳ−３３６Ｅの構築模式
図である。

第６図は、活性化プロティンＣによる蛋白分解的開裂に
耐性を有する第■因子の融合タンパク質をコードしてい
るｃＤＮＡを含有する発現ベクター、ｐＦ８９０８０−
３３６Ｅの構築模式図である。

第７図は、プロレラキシンの生産細胞系統（セルライン
）を樹立するために用いられたブロレラキシン発現ベク
ター、ｐｃ［ＨＲＸの構築模式図である。

第８図は、プロレラキシンの生産細胞系統（セルライン
）を樹立するために用いられたプロレラキシン発現ベク
ター、ｐｃＩｓＲＸの構築模式図である。

第９図は、ｔ−ＰＡの生産細胞系統（セルライン）を樹
立するために用いられたｔ−ＰＡ発現ベクター、ｐｃＩ
Ｈｔ−ＰＡの構築模式図である。

第１０図は、ｐＦ８ｃＩｓの部分配列式である。

サイトメガロウィルスのエンハンサ−、プロモーター（
ヌクレオチド１−７３２）、安定化配列、即ち、スプラ
イス供与イントロン配列、Ｉｇ可変領域のイントロンお
よびスプライス受容配列（ヌクレオチド７３３−９００
）を含有する発現ベクターのＤＮＡ配列である。

第１１図は、ｐＦ８８ｃＩｓの部分配列式である。ＳＶ
４　Ｑエンハンサ−およびプロモーター（ヌクレオチド
１−３６０）、サイトメガロウィルスの供与およびイン
トロン配列、１ｇ可変領域のイントロンおよびスプライ
ス受容配列を含む安定化配夕１バヌクレオチド３６１−
５８０）を含有する発現ベクターのＤＮＡ配列である。

第１２図は、ｐＦ８ＣＳＳＳの部分配列式である。サイ
トメガロウィルスのエンハンサ−プロモーターおよびリ
ーダー（ヌクレオチドｌ−７３２）、操作されたスプラ
イス供与および受容配列を含む安定化配列（ヌクレオチ
ド７３３−７３ｉ３）およびリーダーの残余を含有する
発現ベクターのＤＮＡ配列である。

第１３図は、ｔ−ＰＡの生産細胞系統（セルライン）を
樹立するために用いられたｔ−ＰＡ発現ベクター、ｐｃ
ｒｓｔ−ｐＡの構築模式図である。

詳細な記述 定義および一般的な方法 本明細書中、「ヌクレオチド配列」という語句は、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡ配列の５°から３°へのりん酸ジエスエ
テル結合中の一連のヌクレオチドを含有する核酸を指す
。ＤＮＡの場合、ヌクレオチド配列は１本鎖または２本
鎖のいずれであってよい。

同様に、ｒＤＮＡ配列」という語句は、１本鎖または２
本鎖の両方を指す。

「所望のヘテロローガスタンパク質」という語句は、宿
主細胞内で発現させることが望まれるタンパク質である
が、正常な状態では宿主細胞自身は生産しないか、また
は極く少量しか生産しない夕ンパク質であり、しかも、
通常は、細胞の連続的な存在にとって不要なタンパク質
を指す。そのようなタンパク質には、プレーアミノ酸配
列または成熟アミノ酸配列を含有する分子、並びに所望
のタンパク質と共通の生物学的活性を顕し得るアミノ酸
変異体またはグリコジル化変異体（天然のアレル変異体
をも含む）が包含される。そのようなタンパク質には、
例えば、成長ホルモン、インシュリン、第■因子、組織
プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子αおよびβ
、リンホトキシン、エンケファリナーゼ、ヒト血清アル
ブミン、ムレリアン（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物質、
レラキシン、組織因子タンパク質、インヒビン、エリス
ロボエチン、イシターフエロンα、β、γ、過酸化物デ
・イスムターゼ、崩壊促進因子、ＡＩＤＳエンベロープ
の１部ようなウィルス抗原、並びにインターロイキンが
ある。

「スプライシング」という語句は、−時転写物のプロ七
ソシングの間に、ＲＮＡの１またはそれ以上の−続きの
内部配列（ストレッチ）が除去されて一個の機能的なＲ
ＮＡ分子が生成される機構を指す。スプライシングは、
イントロンをループ状にして取り出し、イントロンの５
°末端（供与部位と称する）とイントロンの３゛末端（
受容部位と称する）とを連結することで開始されると考
えられている。イントロンーエキリン連結部の塩基配列
を比較すると、各イントロンの５″末端の最初の２塩基
がＧＴ、３“末端の最後の２塩基がＡＧというコンセン
サス配列が見出される。

本明細書中、［スプライスされたｍＲＮＡＪという語句
は、１またはそれ以上のＲＮＡの内部配列が除去される
ことにより、あるいは、転写された際に、スプライシン
グに供されたと同様の特性を有するｍＲＮＡであるが、
実際には、何らのヌクレオチド配列も除去されていない
ｍＲＮＡを与え得るＤＮＡを構築することにより、生産
されたｍＲＮＡを指す。

「安定化配列」という語句は、スプライス供与−イント
ロン−受容配列をコードしているか、あるいはスプライ
スされたｍＲＮＡと同様の機能的なｍＲＮＡを与えるよ
う、供与および受容配列と完全にコンセンサスな配列あ
るいはその１部、並びに受容／供与連結部の適切なヌク
レオチドをコードしていることのいずれかに基づいて、
スプライスされたｍＲＮＡを与え得るＤＮＡ配列を指す
。安定化配列は、所望のヘテロローガスタンパク質をコ
ードしている遺伝子のリーダー配列中に置かれる。「リ
ーダー配列」という語句は、ｍＲＮＡのＣＡＰ部位と、
ＡＵＧ翻訳開始シグナルの間の５゜非翻訳領域内の領域
を指す。

「コンセンサス配列」という語句は、本明細書中、エク
ソン−イントロン境界（または供与配列）に見出される
配列：ＣＡＧ／ＧＴＡＡＧＴおよび、イＡ　　　　　　
　　　Ｇ ントロンーエクソン境界（または受容配列）に見出され
る配列：　（Ｔ）ｎＮＣＡＧ／Ｇを指す［マウントＴ （Ｍｏｕｎｔ、　　Ｓ、　　Ｍ、　　）Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ上追工乙４５９−４
７２（１９８２）］。特定の位置に個々の塩基が現れる
頻度を分析することにより、供与配列および受容配列の
ためのコンセンサス配列が得られる。また、イントロン
は、ＧＴで始まり、ＡＧで終わることが知られている［
ブリースナツバら（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ、　　Ｒ，）
ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）ヱ５４８５３−４８５７（１９７８
）］。複数のスプラインシングが起こる、多数に分かれ
たリーダー配列のあるものにおいては、適切なプロセッ
シングを達成するために、初期遺伝子機能に係る因子が
さらに必要とされることも分かっている［バビスら（Ｂ
ａｂｉｓｓ、　　Ｌ、　　Ｅ、　）Ｍｏ１．　ａｎｄ　
　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｏｉｌ、５（１０）、２５５２−２５５８（１９８５
）］。当業者は、供与および受容コンセンサス配列、複
数のスプラインシングが起こる、初期遺伝子機能の必要
な多数に分かれたリーダー配列、並びに本発明に従った
コンセンサスなスプライシング配列に関するルールにつ
いての知識を用い、所望のタンパク質のための特定の安
定化配列を選択することができる。

「調節（コントロール）領域」という語句は、真核性遺
伝子の５′および３°末端の、転写または翻訳に関与す
る特異的な配列を指す。実際、全ての真核性遺伝子が、
転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に、Ａ
Ｔに富んだ配列を有する。

転写開始部位の７０〜８０塩基上流に見出される他の配
列はＣＸＣＡＡＴ領域（ここにＸは何であってもよい）
である。大多数の真核性遺伝子の３′末端にはＡＡＴＡ
ＡＡ配列があり、これは転写されたｍＲＮ　Ａの３°末
端にポリアデニル化テールを付与するためのシグナル配
列であるらしい。

「プロモーター」という語句は、ＲＮＡ合成を開始する
ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるヌクレオチドセ
グメントを指す。哺乳類宿主細胞内でベクターからの転
写をコントロールするのに好ましいプロモーターは様々
な供給源、例えばウィルス由来のゲノム、即ち、ポリオ
ーマ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アゾンウィ
ルス、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）のごときレトロウ
ィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよび最も好ましくはサイト
メガロウィルス、またはベーターアクチンプロモーター
の如きヘテロローガスな哺乳類起源から得られる。ＳＶ
４０ウィルスの早期および後期プロモーターは５Ｖ４Ｑ
ウイルスの複製起源をも含有している５Ｖ４Ｑ制限断片
（フラグメント）として都合よく得られる［ファイヤー
ズら（Ｆｉｅｒ’ｓ）、１９７８°゛ネイチヤー”２７
３：　　１１３］。ヒトサイトメガロウィルスの前初期
プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として好都
合に得られる［グリーンナラエイら（Ｇｒｅｅｎａｗａ
ｙ、　Ｐ、　　Ｊ　、　）、　Ｇｅｎｅｌ　３゜３５５
−３６０（１９７８）］。Ｒ３ＶプＲ３−ターおよびエ
ンハンサ−はｐＲ３ＶＣａｔ制限断片からＨｉｎｄＩＩ
［−Ｎｄｅｌ消化により得られる［ゴーマン（Ｇｏｒｍ
ａｎ、　Ｃ，）　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　７０．６７７７（１
９８２）］。勿論、宿主細胞またはその近縁種からのプ
ロモーターも本発明には有用である。

「エンハンサ−」は通常約１Ｏ−３００ｂｐのシス−作
用性ＤＮＡ要素であって、プロモーターに作用し、その
転写を増大する要素（エレンメント）である。高等な真
核生物からの、所望のヘテロローガスタンパク質をコー
ドしているＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサ−配
列を挿入することにより増大される。エンハンサ−゛は
、比較的、方向性や位置に非依存性であり、転写単位の
５°側［レイミンスら（Ｌｅｉｍｉｎｓ、Ｌ、）ＰＮＡ
Ｓ７８．９９３（１９８１）］および３°［ラスキーら
（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、　　Ｌ、）Ｍａｉｌ、　　Ｃｅ１ｌ
　　Ｂ　ｉｏ、　　３、ｌ　１０８（１９８３）］、ま
たはイントロンの中［パネルジー（Ｂ　ａｎｅｒｊｉ、
　Ｊ　。

Ｌ、　）Ｃｅｌ１３３．７２９（１９８３）］または暗
号配列の中［オスポーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｔ、　　Ｆ
、　）Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏ、　　４．１２９３（１９８４）］
に見出されている。今日、哺乳類遺伝子由来の多くのエ
ンハンサ−が知られている（グロビン、エラスターセ、
アルブミン、α−フェトプロティンおよびイン７ユリン
）。しかしながら、一般に、真核細胞ウィルス由来のエ
ンハンサ−を用いることになろう。その様な例としてＳ
Ｖ４０の複製起源（ｂｐ　１００〜２７０）の後期部位
に存在するエンノ＼ンサー、サイトメガロウィルスの初
期プロモーターのエンハンサ−、ポリオーマ−の複製起
源の後期部位に存在するエンハンサ−１並びにアデノウ
ィルスのエンハンサ−が含まれる。

真核性宿主細胞（酵母、真菌、植物、動物、ヒトまたは
他の多核生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクタ
ーはｍＲＮＡの発現に影響する、転写の終止に必要な配
列をも含有している。これらの領域は、所望のヘテロロ
ーガスなタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域
内のポリアデニル化セグメントとして転写される。３′
非翻訳領域もまた、転写終止部位を包含している。

発現ベクターは、選択遺伝子、選択可能なマーカーとも
称する、を含有していてよい。選択遺伝子はベクターで
形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタン
パク質であって、ときには第２タンパク質と呼ばれるタ
ンパク質をコードしている。哺乳類細胞にとって好適な
選択マーカー類を例示すると、ジヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼまたはネオマイシンであ
る。そのような選択マーカーが哺乳類宿主細胞にうまく
導入されると、形質転換された宿主細胞は、選択圧の下
に置かれた場合に生き残ることができる。選択方法には
、明確に区別される、広範な２種類（カテゴリー）の方
法がある。第１カテゴリーは、細胞代謝に基盤を置いて
おり、補充培地から独立して増殖する能力を持たない変
異細胞系統を用いる方法である。例として、ＣＨＯＤＨ
ＦＲ＝細胞およｄマウスＬＴＫ−細胞の２つがある。こ
れらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンのような栄養
物の添加なしに増殖する能力を持たない。

これらの細胞は、ヌクレオチド合成経路を完結するのに
必要なある種の遺伝子を欠くために、この不足するヌク
レオチドが補充培地に供給されないと生存することがで
きないのである。培地に補充する方法に代えて、無傷の
ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子
を欠いている細胞に導入し、それらの増殖における要求
を変化させる方法がある。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺
伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、補充のない
培地では生き残ることができない。従って、これらの細
胞を直接選択するには補充栄養の非存在下で細胞を増殖
させる必要がある。

第２のカテゴリーはあらゆる細胞型に適用可能であって
、変異細胞系統を用いる必要がない選択計画方法、即ち
、優性選択法である。通常、これらの方法には、宿主細
胞の増殖を阻害する薬物を用いる。新規な遺伝子を含有
する細胞は薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択
において生き残るであろう。その様な顕著な薬物を用い
る選択法には、ネオマイシン［サザーン（Ｓ　ｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　　Ｐ　）およびバーブ（Ｂ　ｅｒＬ　　Ｐ　
、）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　　２０９．１４２２（１’９
８０］またはハイグロマイシン［サジエンら（Ｓｕｇｄ
ｅｎ、　　Ｂ、）、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　　Ｂ　ｉ
ｏｌ。

互：４１〇二４１３（１９８５）］を用いる。上記の３
例では適当な薬物、それぞれ、ネオマイシン（Ｇ４１８
またはジエネチシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸
）またはハイグロマイシンに対する耐性を伝えるために
、真核性のコントロール下、細菌性遺伝子を使用してい
る。以下の実験で最も頻繁に用いられる好ましい選択試
薬は、特にＣＨＯＤＨＦＲ−細胞に関係がない限り、Ｇ
４．１８ジエネチシンである。この場合には、ＤＨＦＲ
生産の直接選択が用いられる。

「増幅」という語句は、細胞の染色体ＤＮＡの、単離さ
れた領域が増加または複製されることを意味する。増幅
は、選択物質、例えばＤＨＦＲを不活化するメトトレキ
セート（ＭＴＸ）のような物質の存在下で達成される。

ＤＨＦＲ遺伝子の増幅、またはＤ　ＨＦ　Ｒ遺伝子の連
続的なコピー作成により、多量のＭＴＸの存在下でも、
多量のＤＨＦＲが産生されることになる。より多くのＭ
ＴＸを添加することで、内因性ＤＨＦＲが存在していて
も、増幅圧が課される。所望のタンパク質をコードする
ＤＮＡと、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡまたは増幅遺伝
子を有するプラスミドで哺乳類宿主細胞をコトランスフ
ェクトし、同時組込みを起こさせることにより、所望の
遺伝子の増幅を達成することができる。より多量のＭＴ
Ｘ濃度下で連続的に循環して増殖し得る細胞を選択する
だけで、より多（のＤＨＦＲを必要とする細胞、その要
求は選択遺伝子の複製によりかなえられるが、を確保す
ることができる。所望のタンパク質をコードする遺伝子
を、増幅可能な遺伝子と一緒に同時組込みする限り、こ
の遺伝子の複製により、所望のタンパク質をコードする
遺伝子の複製が増大されることになる。その結果、所望
のタンパク質をコードしている遺伝子（即ち、増幅され
た遺伝子）のコピー数が増加し、所望のタンパク質が多
く発現されることになる。

所望のヘテロローガスなタンパク質を高等な真核生物に
発現させるのに好適な宿主細胞として、ヒト胚腎細胞系
統［２９３、グラハムら（Ｇ　ｒ　ａ　ｈ　ａ　ｍ　＋
Ｆ、　　Ｌ、　）、Ｊ、　Ｇｅｎ、　　Ｖｉｒｏｌ、　
　３６：５９（１９７７）、ジャックリックス（Ｊ　Ｂ
ｃｋｌｉｃｋｓ）培地中に懸濁して増殖するよう適応さ
せた２９３細胞のクローンを２９３ｓというコおよびＪ
Ｗ２［ライタツカ−ら（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、　　Ｊ、
　　Ｌ、　）　Ｍ、　　Ｃ，Ｂ、　　４　：１　ｔｏ−
１１６（１９８４）］等、トランス作用をするＥｌａお
よびＥｌｂタンパク質を産生ずる細胞系統を挙げること
ができる。これらの２つの細胞系統は内因性のトランス
−作用タンパク質ＥｌａおよびＥｌｂを生産するように
形質転換されているが、他の宿主細胞を、これらの、あ
るいは同等のトランス作用タンパク質で形質転換し、本
発明の教示に従って宿主細胞として用いることができる
と考えられる。そのような宿主細胞には、例えば、ベビ
ーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ］；
チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ［ウララブ
（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャッシン（Ｃｈａｓｉｎ）　
Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　（Ｕ　Ｓ　Ａ）７ユ：４．２１６（１
９８０）；マウスセロトリ細胞［ＴＭ４、マザー（Ｍａ
ｔｈｅｒ。

Ｊ、Ｐ、）Ｂｉｏｌ、　　Ｒｅｐｒｏｄ、２３：２４３
　２５１（１９８０）］；サル腎細胞（ＣＶＩ　　ＡＴ
ＣＣＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲ
Ｏ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト類がん細
胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤ
ＣＫＳＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細
胞（ＢＲＬ　　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　　１４４２）：
ヒト肺細胞（Ｗ　１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト
肝細胞（ＨｅｐＧ２、）（Ｂ　　８０６５）；マウス乳
がん（ＭＭＴ　　０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）
；ラット肝がん細胞（ＨＴＣ，Ｍｌ、５４）［バウマン
ら（Ｂａｕｍａｎｎ、Ｈ，）Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏ
ｌ、　　８５．１−８（１９８０）］；ＴＲ１細胞［マ
ザーら（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ　、　Ｐ、）Ａｎｎａｌｓ
　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　３８旦：４４
−６８（１９８２）］、およびヒトＫＢ細胞［バビスら
（Ｂａｂｉｓｓ、Ｌ、　　Ｅ、　）Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ
、　　’４６：４５４−４６５（１９８３）］がある。

宿主細胞を、グルタミンを添加し、抗生物質を含有しな
いＦ１２　：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）（５０：５０）中
で培養した。

「トランス−活性化因子」という語句は、例えばシミア
ンウィルス（または５ｖ４０）Ｔ抗原［ロケンら（Ｌｏ
ｅｋｅｎ、　Ｍ、　　Ｒ，）、Ｍ、Ｃ，Ｂ、６：２０２
０（１９８６）；ロピンスら（Ｒｏｂｂｉｎｓ、　　Ｐ
、　　Ｄ、　）、Ｍ、Ｃ，Ｂ、６：１２８３（１９８６
）；ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ、　　Ｊ、　Ｍ、　）および
アルウィン（Ａ　１ｗ１ｎｅ、　　Ｊ　。

）、Ｍ、　Ｃ，Ｂ、互＋１８５９（１９８５）］、アデ
ノウィルスＥｌａおよびＥｌｂタンパク質［ロケン（Ｌ
ｏｅｋｅｎ、　Ｍ、　　Ｒ，）（１９８６）前掲：　ト
リースマ−（Ｔｒｉｅｓｍｅｒ、　　Ｒ，ＸＩ　９８３
）同上；ガイノーら（Ｇａｙｎｏｒ、　　Ｒ，Ｂ、　）
、ＰＮＡＳ　　８ユニ１１９３（１９８４）；インペリ
アルら（Ｉ　ｍｐｅｒｉａｌｅ、　Ｍ、Ｊ　、　）、前
掲］およびヘルペスウィルス前初期（Ｉ　Ｅ）タンパク
質［エベレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ、　　Ｒ，Ｄ、　）Ｅ
ＭＢＯＪ、３：３１３５（１９８４）、パーソンら（Ｐ
ｅｒｓｓｏｎ、　　Ｒ，Ｈ，）Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　
　５４：４１４（１９８５）］等のウィルス初期タンパ
ク質、ｆｏｓ［セトヤマら（Ｓｅｔｏｙａｍａ、　Ｃ）
ＰＮＡＳ　　８３：３１２３（１９８６、）］およびヒ
トおよび免疫不全シミアンウィルス（ｔａｔ、ウィルス
にコードされているトランス−活性化因子）［ローセン
ら（Ｒｏｓｅｎ、　Ｃ１）Ｎａｔｕｒｅ３↓９：５５５
−５５９（１９８６）］を指す。

これらのタンパク質は有効なプロモーターを有する遺伝
子の産物である。各トランス−活性化因子の転写活性化
機能は、他のウィルス遺伝子の発現を増大することにあ
る。これらのトランス−活性化因子は自身のウィルス遺
伝子にホモローガスでないプロモーターをも活性化し得
る。上記のトランス−活性化因子は現在既知のものであ
るが、他のウィルス系に由来する他のトランス−活性化
因子も本発明に包含される。

「翻訳調節エフェクター」という語句は、ある種のＲＮ
Ａ、例えば、所望のヘテロローガスタンパク質をコード
するＲＮＡの翻訳を有効なものとする、ウィルスに随伴
するＲＮＡを指す。エプスタイン−バールウィルス（Ｅ
ＢＶ）［ファツト（Ｂ　ｈａｔ。

Ｒ，Ａ、）およびチマバヤ（Ｔ　ｈｉｍｍａｐｐａｙａ
、　　Ｂ　。

Ｊ、）Ｖｉｒｏｌ、５６：７５０（１９８５）］および
ＨＢＶ［アウーフィエロら（Ａｕ−Ｆｉｅｒｏ、　　Ｂ
、　）Ａｂｓｔｒａｃｔ　　Ｃｏｎｆ’ｅｒｅｎｃｅ　
　ｏｎ　　ＳＶ４０　　Ｐｏｌｙｍａ　　ａｎｄＡｄｅ
ｎｏｖｉｒｕｓ［ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ
）、Ｅｎｇｌａｎｄ、　　１９８７年７月、８８頁頁中
中類似したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ　（ｐｏｌ　ｍ　
）転写物か存在しており、これらは同様の翻訳調節作用
を有するらしいしチマパヤら（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ
、　　Ｂ、　）　Ｃｅ１ｌ　３上：５４３（１９８２）
、スベンソン（Ｓ　ｖｅｎｓｏｎ、　　Ｃ、）およびア
クスジャービ（Ａｋｕｓｊａｒｖｉ、　　Ｇ、　）ＥＭ
ＢＯＪ、４：９５７（１９８５）、シュナイダーら（Ｓ
ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　　Ｒ，）Ｃｅｌｌ　３７　：２９
１（１９８４）］。

そのようなＲＮＡの作用機序に関する示唆が示されてい
る［ライチェルら（Ｒｅｉｃｈｅｌ、　　Ｐ　、　　Ａ
　、　）　Ｎ　ａｔｕｒｅ　　３１３：１９６（１９８
５）、キタジュースキーら（Ｋｉｔａｊｅｗｓｋｉ、　
　Ｊ、　）Ｃｅｌｌ　　４５：］９５（１９８６）、お
よびオーマレ−ら（０’Ｍａｌｌｅｙ、　　Ｒ，’）Ｃ
ｅｌｌ　　４４：３９１（１９８６）］。

「形質転換」とは、ＤＮＡを生物内に導入し、その結果
、ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは染色体内に組
込まれて複製することを意味する。

特に明示しない限り、本発明における宿主細胞の形質転
換にはグラハム（Ｇｒａｈａｍ、　　Ｆ、　）およびフ
ァン・デルーｘブ（Ｆａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　）
、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　５２：４５６−４５７（１９７
３）の方法を用いる。

宿主細胞を、本発明の発現ベクターで形質転換し、プロ
モーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝子の増
幅に好適なように改良された通常の栄養培地で培養する
ことができる。温度およびｐＨ等の培養条件は、先に発
現の選択に用いたものと同じであり、当業者には明らか
である。

「トランスフェクション」という語句は、実際になんら
かの暗号配列が発現されるか否かには関係なく、宿主細
胞に発現ベクタ・−が取り込まれることを意味する。当
業者は多くのトランスフェクション法を知っており、そ
れらには、例えば、ＣａＰＯ４法および電気穿孔法があ
る。宿主細胞内で、このベクターの機能が生起されたと
ことを示すなんらかの徴候が認められたならば、通常、
トランスフェクションは成功といえる。しかしながら、
本発明においては、トランスフェクションの成功とは、
幾世代にも渡って、所望のヘテロローガスなタンパク質
が宿主培養から安定かつ連続的に発現されることを意味
するものとする。

「−時発現」とは、本発明方法を用い、トランスフェク
ションから約１日〜２週間の間に増幅されていない発現
が起きることを意味する。特定の所望のヘテロローガス
なタンパク質の一時発現のために最適な時間は、例えば
、所望の特定のヘテロローガスタンパク質、トランス作
用タンパク質、翻訳調節エフェクター、および宿主細胞
等の幾つかの因子によって変動する。既にトランスフェ
クトされている機能、即ち特定のプラスミドが転写され
、翻訳されて所望のタンパク質が生産されると、−時発
現が起きる。この期間に、細胞内のプラスミドＤＮＡは
核内に移行する。ＤＮＡは非組込み状態にあり、核内で
遊離している。細胞に取り込まれたプラスミドの転写は
、この期間中に起こる。次いで、所望のヘテロローガス
タンパク質を一時的に生産する能力を有すると同定され
たベクターを用いて安定で連続的な生産細胞を樹立する
。−時発現とは、トランスフェクション後、短期間、約
１日〜約２週間、好ましくは、１日から約７日間、最も
好ましくは、約１日から４日間の期間を指すが、この期
間は、上記の因子によって変動し得る。トランスフェク
ション後、プラスミドＤＮＡは、細胞分裂によって分解
または希釈される。細胞クロマチンへのランダム組込み
も起きる。本発明の一時発現法により、有用量の所望の
タンパク質を生産し得る、安定な、ＤＮＡがトランスフ
ェクトされた形質転換細胞を製造することができる。

所望のヘテロローガスタンパク質が発現された・か否か
を迅速に評価するために、トランスフェクトされた細胞
のイムノパーオキシダーゼ染色に基く分析法が開発され
た［ゴーマンら（Ｇｏｒｍａｎ、　ＣＮ、　）Ｃｅｌ１
４２．５１９−５２２（１９８５）］。

この分析法に用いるために、ヘテロローガスタンパク質
に特異的なモノクローナル抗体をスクリーニングした。

ベクターを含有する宿主細胞を染色して親細胞系統と比
較し、特異的なタンパク質を産生ずる細胞をスクリーニ
ングした。バックグラウンドが最小であり、最強のシグ
ナルを与えるモノクローナル抗体を選択した。所望のタ
ンパク質を産生ずる能力について試験するために一時ト
ランスフエクションを行った。ＣａＰＯ４法［ゴーマン
（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ、　）によって改良されたグラ
ハム（Ｇ　ｒａｈａｍ）およびファン・デル・ウヴ（Ｖ
ａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｂ）の方法、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ２
２土、５５１−５５３（１９８３）］を用いて細胞（Ｃ
ｏｓ、２９３、ＣＨＯ，、ＢＨＫＳＴＭ４）をトランス
フェクトした。

試験すべき特定のタンパク質ベクターの沈殿１！Ｑにつ
いて１０μｇ用いた。沈殿を、細胞上に３−４時間放置
した。次いで、細胞を平均１分間グリセロールショック
に付した。トランスフェクションから３６時間後、アセ
トン−メタノール（５０：５０）で細胞を固定化し、り
ん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。希釈していな
いモノクローナル抗体上清、または１０％ウシ胎児血清
を含有するＰＢＳで、ｌ／３０００に希釈した精製抗体
のいずれかを用いて染色を行った。第１抗体を、２時間
、細胞上に維持した。この間、プレートを緩やかに振と
うした。１０分間に５回細胞を洗浄した。使用した第２
抗体はウサギの抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）
である。これをＰＢＳ＋ウシ胎児血清で１／１５０に希
釈した。２時間インキュベーションした後、再び一連の
洗浄を繰り返した。パーオキシダーゼ試薬を発現させる
ために、オルトジアニシジン（ｏｒｔｈｏ−ｄｉａｎｓ
ｉｄｉｎｅ）を基質として用いた。オルトジアニシジン
のエーテル飽和溶液を１／１０．０００希釈の過酸化水
素を含有するＰＢＳで１／１００に希釈した。この基質
を室温で２時間、または４°Ｃで一夜、細胞上に維持し
た。

この方法により、所望のタンパク質をコードしている広
範囲に及ぶ様々なベクターを、所望のタンパク質の発現
を指令する能力に関して迅速にスクリーニングした。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
または語句を説明する。

“プラスミド”は小文字のｐを先頭にし、モして／また
は大文字および／または数字を続けることによって表わ
される。本発明の出発物質であるプラスミドは市販され
ているか、または非制限的な施設から一般に入手可能で
あり、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから
、公知の方法に従って組立てることができる。更に、そ
の他の同等なプラスミドも当業者には知られており、通
常の技術者にとって自明であろう。

ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある部位
、即ち、制限部位に対してのみ作用する酵素で触媒的に
開裂することを指す。本発明において用いる様々な制限
酵素は市販されており、その反応条件、コファクター、
およびその他必要なものは、当業者既知のごとくにして
用いた。分析目的のためには、通常、プラスミドまたは
ＤＮＡ断片１μｇと約２単位の酵素を、緩衝液約２０μ
ａ中で用いる。プラスミドの構築のためにＤＮＡ断片を
単離する目的の場合には、通常、さらに多量の緩衝液中
で、ＤＮＡ５〜１０１１ｇを酵素２０〜４０単位により
消化する。特定の制限酵素にとって適切な緩衝液および
基質の同は製造者により明示されている。一般に、イン
キュベーション時間は３７°Ｃで１時間が採用されるが
、供給者の教示に従って変わり得る。消化後、反応混合
物を直接ゲルに適用して所望の断片を単離する。

「脱りん酸化」とは、細菌性アルカリホスファターゼ（
ＢＡＰ）処理により、５°末端のりん酸が除去されるこ
とを意味する。この工程により、他のＤＮＡ断片の制限
酵素切断部位への挿入の妨げとなり得る、ＤＮＡ断片の
両制限末端が「閉環」または閉じたループを形成するこ
とを防止する。脱りん酸化の方法および試薬は常法通り
である［マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ　）
、ＣＳＩ−ＩＬ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　　
Ｃｔｏｎｉｎｇ　　　　１　３　３　−　１　３　４　
頁コ。

ＢＡＰを用いる反応は、酵素製品中に存在している可能
性のあるエキソヌクレアーゼの作用を抑制するために、
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ中、６８°Ｃにおいて行なわれる
。反応は１時間行なわれる。反応後、ＤＮＡ断片をゲル
精製する。

「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法で化学的に合
成され、次いで、ポリアクリルアミドゲルで精製されて
いてよい一本領ポリゾオキシヌクレオチドまたは二本鎖
相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を指す。

「ライゲーション（結合）」とは、２個の２本鎖核酸断
片の間にホスホジエステル結合を形成する工程を言う（
Ｔ、マニアティスら、前掲、ｐｉ　４６）。

特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべき適当な等モル量のＤＮ
Ａ断片０．５μｇ当たりＴ４　ＤＮＡリガーゼ（“リガ
ーゼ゛′）１０単位を用いて行う。

「充填（フィリング）」または「平滑末端化（プランテ
ィング）」とは、制限酵素で開裂した核酸の粘着末端の
一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。

このことにより、粘着末端が消滅して平滑末端が形成さ
れる。この工程は、１個またはほんの少数の他の制限酵
素によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断
末端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレア
ーゼで形成された末端または他の充填後の粘着末端に適
合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段であ
る。一般に、平滑末端化は、目的とするＤＮＡ２〜１５
μ９を、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレ／つ断片８単位と
４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート各２５
０μＭの存在下、Ｉ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＱ、、１＋＋＋
Ｍジチオトレイトール、５０ｍＭ　　ＮａＣ（１，１０
ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）バッファーの混液中、３７°
Ｃでインキュベートすることにより行われる。

通常、３０分後にフェノールおよびクロロホルムで抽出
し、エタノール沈澱に付すことによりインキュベーショ
ンを終了する。

「ノーザーン」ブロッティングとは、既知の、標識した
オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片とのハイブリザイ
ゼーションにより、細胞性ｍＲＮＡの存在を確認する方
法である。本発明においては、特に明記しない限り、／
−ザーン分析とは、マニアティスの記載のごとく、変性
剤（７％ホルムアルデヒド）の存在下、１％アガロース
ゲル上でｍＲＮＡを電気泳動的に分離し、標識した断片
とのニトロセルロース上でのハイブリザイゼーションに
付すことを意味するものとする［マニアティスら、前掲
、２０２頁］。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

ただし、これらの実施例は単なる例示にすぎず、本発明
を制限するものとみなされるべきでない。

実施例１−時発現系の一般的方法 ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）をコードしているプラスミドＣＭＶエンハン
サープロモーターおよびスプライス供与領域を含有する
全領域［実施例３．１．ａ）１）に記載］をｐｕｃ８（
Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ。

）にクローニングした。ＨｐａＵ平滑−ＢａｍＨＩリン
カ−でｐＵＣ８構築物からＣＭＶプロモーターを切り取
り、Ｈ４ｎｄｌｌｌ消化し、それを、利用可能なりロー
ニング部位の増加およびｃａｐ部位から１２０ｂｐ３’
側のスプライス供与配列を除去するために、Ｉ）ＵＣｌ
３（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ、　
）にクローニングした（ｐＵＣ，ＣＭＶと称する）。

５Ｖ４０Ｔ抗原のスプライスおよびポリアデニル化部位
を含有するＣＡＴ暗号領域をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ
ｒ断片としてｐＳＶ２ＣＡＴ［ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ
、Ｃ，）ら、Ｍｏ１．　　Ｃｅｌ　１．　　Ｂ　ｉｏｌ
、前掲１にサブクローニングし、次いで、ｐｕｃ、ＣＭ
Ｖベクターに挿入してｐＵＣ，ＣＭＶＣＡＴを得た。ｐ
ＵＣ。

ＣＭＶＣＡＴをＡａｔｌｌで切断し、ＣＭ　Ｖ　ｘンハ
ンサーの大部分を欠失しているベクター、ｐＣＭＶｐｒ
ｏを構築した。この３′突出をｐｏｌ　Ｉで充填し、ベ
クターをＢａｍＨＩで切断した。得られた断片を、ｐＵ
Ｃ１８（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ
）のＳａ＋ａｒおよびＢａｍＨ１部位にサブクローニン
グした。このベクターは、ＣＭＶ　　ＴＡＴＡボックス
領域の上流１００ｂｐを含有しているので、ＣΔＡＴボ
ックスおよびＧＣに富む領域を保存している。比較のた
めに、ＳＶ４０のエンハンサ−およびプロモーターを含
有するベクター（ｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔ）（ゴーマンら
、Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、　　Ｂ　ｉｏｌ、前掲）または
５ｖ４０プロモーターのみを含有するベクター（ｐＳ　
Ｖ　１ｃａｔ）（ゴーマンら、前掲）を単独で用いた。

ＣＭＶエンハンサ−およびＳ■４０プロモーターを含有
するベクター（ｐＣＭ　Ｖ　Ｓ　Ｖ　ｃａｔ、構築方法
は後述）およびＳＶ４０エンハンサ−およびＣＭＶプロ
モーターを含有するベクター（ｐＳ　Ｖ　ＣＭ　Ｖ　ｃ
ａｔ、構築方法は後述）の２ベクターをさらに構築した
。

ＣＡＴトランスフェクション実験の間に用いる内部対照
プラスミドは、Ｒ３Ｖ　　ＬＴＲの３°にクローニング
されたｈＧＨをコードするＤＮＡ（ｐＵＣ８にクローニ
ングされたＥｃｏＲＩ断片から得た、米国特許第４，３
４２，８３２号参照）を含有している。このベクター、
ｐＲｓＶｈＧＨには肝炎表面抗原のボＩＪ　Ａ付加部位
が用いられている。

５Ｖ４Ｑエンハンサ−およびＣＭＶプロモーターを含有
するｐＳＶＣＭＶｃａｔの構築には、上記のｐＣＭＶｐ
ｒｏを用いた。ｐＵＣＩ８の唯一のＫｐｎ１部を切断し
、３′突出をＤＮＡポリメラーゼｌにより、記載の方法
に従って充填した。ＣＭＶプロモーターの５′に隣接し
たこの充填部位に５Ｖ４ｏエンハンサ−を挿入した。こ
のエンハンサ−は、ｐＳＶ２ｃａｔから、２３４　ｂｐ
Ｎｃｏｌ　−Ｐｖｕｌｌ断片として得た。Ｎｃｏｌ末端
の５°突出をフレノウ反応によって充填した後、平滑末
端ライゲーションを行い、ベクターｐＳＶＣＭＶｃａｔ
を得た。

ＣＭＶエンハンサ−および５ｖ４０プロモーターを含有
するプラスミドを構築するために、ｐＳＶ２ｃａｔ（ゴ
ーマンら、１９８２、前掲）をｓ　ｐｈ　ｒおよびＡｃ
ｃＩで消化した。生じた３′突出末端を、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのホロエンザイム中に存在するエキソヌクレア
ーゼ活性を用いて充填した。

ＣＭＶエンハンサ−を含有する４８２ｂｐ断片を、ＳＶ
４０プロモーターの５”側に隣接するこの領域に挿入し
た。この４８２ｂｐ断片は、ｐＵＣ，ＣＭＶのＢａｎＩ
およびＨｉｎｄ［による消化で得た。

フレノウ反応によってＢａｍ１部位を充填した後、断片
をｐｓＵ２ｃａｔ由来の断片とライゲーションしてｐＣ
ＭＶＳＶｃａｔを得た。

２９３細胞中で高レベルに一時発現させるために、一連
のＣＭＶ始動（ｄｒｉｖｅ）ｈＧ　Ｈベクターを構築し
た。Ｃ１ａｌ、Ｘｂａｌ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、および
ＨｐａＩ制限酵素認識部位をコードしているポリリンカ
ーを伴った第■因子ｃＤＮＡを配することにより、下記
実施例３に記載のプロトタイプベクターｐＦ８ｃＩｓを
改良した。ｈＧＨＤＮＡを、平滑末端化したＥｃｏＲＩ
断片として、平滑末端化したＸｈｏ１部位にサブクロー
ニングした。このシリーズの第１番目のベクター、ｐｃ
［５ｈＧ）Ｉは、ｈＧＨｃＤＮＡの３°側にＳＶ４０ポ
リＡ付加部位、次いで、５Ｖ４Ｑ−マウスデヒドロ葉酸
還元酵素（ＤＨＦＲ）転写単位を含有している。ｐｃＩ
ｓ４ｈＧＨは、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターー複製起源−
ＤＨＦＲ領域の全部を欠失しているので、５Ｖ４ＱＴ抗
原の存在下では、哺乳類細胞中で複製し得ない。ｐｃ　
Ｉ　Ｓ　５ｈＧＨはＳＶ４０を保持しているが、Ｄ）Ｉ
ＦＲのｃＤＮＡおよび肝炎表面抗原ポリＡ付加部位が除
去されている。複製を可能にするＳＶ４０複製起源を維
持し、ＤＨＦＲ遺伝子の除去を増すことにより、発現を
増大することができる。

ｂ）アデノウィルス遺伝子ベクター Ｅ１ａＤＮＡ［ゼーラーら（Ｚｅｒｌｅｒ、Ｂ、　）Ｍ
、　　Ｃ。

Ｂ、７・８２１（１９８７）］を、アアデノウィルスＤ
ＮからｐＵｃ８にサブクローニングし、ｐＵｃ。

ＥＩＡを得た。このプラスミドは、Ｅｌａの１２Ｓおよ
び１３ＳメツセージのｃＤＮＡを含有している。Ｅｌｂ
ＤＮＡを含有するプラスミドはルーレイ（Ｒｕｌｅｙ、
　Ｈ，Ｅ、　　）（Ｎａｔｕｒｅ、　　３０４　：６０
２（１９８３）により報告されている。ｐＵＣ，ＶＡは
ＶＡ　　ＲＮＡ遺伝子（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　
ＢｉｏｌａｂＳから入手可能）を含有するアデノウィル
スのＳｍａｌ−ＨｉｎｄＩＩ［断片をｐＵｃ１９にサブ
クローニングすることにより作成された。

ＳＶ４０　　Ｔ抗原はリオら（Ｒｉｏ、Ｄ、Ｃ，）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅλ又ヱ：２３（１９８５）が記載しているよ
うに、複製の研究に用いられた。このプラスミドをｐＲ
３ＶＴｓと表示した。

ｃ）トランスフェクション トランスフェクションにはＣａＰＯ４法を用いた。

ＣＡＴトランスフェクションは、沈殿０．５ｉ＆にＤＮ
Ａ５μｇを用い、６０ｍｍの皿でトランスフェクトして
行った。この５μｇの内、０．５〜１μｇはＣＡＴをコ
ードしているＤＮＡであって、１１００ｎはｐＲ３Ｖｈ
ＧＨであり、残るＤＮＡはｐＵＣプラスミドを構成する
担体であった。トランスフェクションの３６時間後、上
清のｈＧＨレベル（ａ１３１Ｆ　）をイムノラジオメト
リック・アッセイ（Ｉ　ＲＭＡ）（市販品から入手可能
）で測定し、ＣＡＴア１．セイのための細胞リゼイト（
溶液）を調製するために細胞を収穫した。ゴーマンら（
Ｇｏｒｍａｎ）のＣＩ４クロラムフェニコール（ＣＭ）
を用いる方法、またはノーディーンら（Ｎｏｒｄｅｅｎ
、Ｓ、　　Ｋ、　）［ＤＮＡ６：１７３（１９８７）］
が改良したＨ３酢酸ナトリウムを用いる方法［クロムブ
ルッゲら（Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ）　Ｎ　ａｔｕｒｅ
２４１：２３７（１９７３）］のいずれかによってＣＡ
Ｔ活性を測定した。各試料について測定されたｈＧ）ｌ
の基礎レベルに従い、トランスフェクション効率の変異
に対してＣＡＴ活性を標準化した。

ｈＧＨプラスミドｌＯμｇとｐＵＣ，ＶＡ　　ＤＮＡ１
０５μｇを含有する沈殿１ＭＱでトランスフェクトする
ことにより１００ｍｍの培養皿でｈＧＨを−時生産した
。グリセールショックの後、４〜７２時間上清を分析す
ることにより、発現の経時変化を求めた。これらの上清
はＩＲＭＡで分析された。

実施例２　トランス−活性化因子の発現に対する影響 ２９３１１１胞での５Ｖ−４Ｑエンハンサ−プロモータ
ー領域の発現はエンハンサ−非依存性のようである。Ｓ
Ｖ４０エンハンサ−を含有させることによる、ＲＮＡ合
成への付加的な作用は認められない。５Ｖ４Ｑおよびポ
リオーマイムノグロビンエンハンサ−の両者に結合し、
抑制するトランス−活性化因子が、Ｅｌａ含有細胞中に
存在していると思われる［ボレリーら（Ｂｏｒｅｌｌｉ
、　　Ｅ、　）Ｎａｔｕｒｅ　　３１２：６０８（１９
８４）、ベルシッチ（Ｖｅｌｃｉｃｈ、　　Ａ、　）お
よびシッフ（Ｚ　ｉｆｆ、　　Ｅ、　）Ｃｅｌｌ　４０
ニア０５（１９８５）、ヘンら（Ｈｅｎ、　　Ｒ，）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３９１（１９８５）、Ｈｅｎ
、　Ｒ，らＮａｔｕｒｅ　３２１：２４９（１９８６）
］。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のロングターミナル
リピート（ＬＴＲ）による転写もまた、２９３細胞およ
びＪＷ２細胞中、あるいはＥｌａの存在下では抑制され
る。ＲＳＶ　ＬＴＲは、霊長類細胞中で、極めて効率良
＜ＲＮＡ合成を指令することが知られている［ゴーマン
ら（Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ，）ＰＮＡＳ　　７９：６７７
７（１９８２）、Ｇ　ｏｒｍａｎ、　　Ｃ、らＳ　ｃｉ
ｅｎｃｅλ２１：５５１（１９８３）］。しかしながら
、表１から分かるように、Ｒ３ＶプロモーターからのＣ
ＡＴの相対的な発現レベルは、他の霊長類細胞での発現
に比較して２９３細胞およびＪＷ２細胞では、はるかに
低くなっている。Ｅｌａの存在下、および非存在下、Ｃ
ｖｌ細胞内でｐＲ３ＶｈＧＨを用いて行ったコトランス
フェクション実験では、Ｅｌａの存在下におけるｈＧＨ
レベルは１／２０倍に減少した。ｐＲ３ＶｈＧＨ１００
ｎｇでトランスフェクトし、ｃｖ−１細胞中のｈＧＨを
分析したところ、平均濃度は５８　ｎ９／　ｙＱであっ
た。これらのトランスフェクションに、１μ９のＥｌａ
を含有するプラスミドを用いると、濃度は３　ｎｇ／　
ｍＱに減少した。

人↓　ＣＭＶプロモーターが好適な株の分析細胞型 エンハ　ブロモ　ＣＨＯＣＶＩ　２９３　　Ｈｅ１ａ　
ＢＨＫ　ＪＷ２ンサー　−ター ＣＭＶ　　　ＣＭＶ　　　１００１００１００　１００
１００　１００ＳＶ４０　　　ＳＶ４０　　６７　８７
　２０　　５　６０　２６ＣＭＶ　　　ＳＶ４０　１３
０　８７　４０　１８１２０　４８ＳＶ４０　　　ＣＭ
Ｖ　　　４０　８３　８５　２５　１５　１０８Ｒ３Ｖ
　　　ＲＳＶ　　　７６　６６　４６　７３　６０　３
２表１において、ＣＡＴ活性データは、ＣＩ４クロラム
フェニコール法（ゴーマンら、１９８２）テ測定し、各
細胞系統における相対的ＣＡＴ発現を、ＣＭＶエンハン
サー−プロモーター転写要素（エレメント）含有プラス
ミドでトランスフェクトした細胞の抽出物によるＣＭア
セチル化物の比率（％）と比較した。これらのデータは
４回の別個の反復トランスフェクションの結果を表して
いる。用イした細胞系統間のトランスフェクション効果
における潜在的な相違の故に、比較は、特定の細胞系統
における様々なベクターからの発現レベルに限定されな
ばならなかった。

ＣＭＶエンハンサ−は様々な細胞型において強力なエン
ハンサ−であることが示されている（Ｂ。

５ｈａｒＬら、１９８５前掲）。驚くべきことに、ＣＭ
■プロモーターは、強い種特異性を示し、特にハムスタ
ー細胞において極めて弱く、霊長類細胞系統、とりわけ
ヒト細胞において極めて強力であることを見出した（表
１）。５Ｖ４Ｑエンハンサ−の存在下（第２および第４
行）、ハムスター細胞系統において５Ｖ４Ｑプロモータ
ーはＣＭＶプロモーターの約４倍も強力である。このこ
とは表１の第１行および第３行のデータからも確認され
る。ＣＭＶプロモーターは、２９３、ＨＥＬＡおよびＪ
Ｗ２の３つの全ヒト細胞系統において有効であった。絶
対的なＣＡＴ活性はｊ■胞型によって異なる。

発現は、ｃｖｌ、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞よりも２９３
細胞において大きい。ＣＨＯ，、ＣＶｌおよび２９３細
胞は相対的に同じ効率でトランスフェクトされているの
で、このＣＡＴタンパク質の■は単にトランスフェクシ
ョン効果の相違によるものではない。

アデノウィルス初期遺伝子のトランス−活性化因子の、
ＣＭＶエンハンサ−およびプロモーターの発現に及ぼす
影響を調へた。５Ｖ４Ｑ、ポリオーマまたはＲ３Ｖにお
ける観察結果と異なり、ＣＭＶエンハンサー−プロモー
ター単位の一致した抑制は認められなかった（表２）。

しかしながら、。

ＣＭＶプ０モーターは、Ｃ１ａとのコトランスフェクシ
ョンによってトランス−活性化されることが認められた
。発現の増大は平均１２倍である。

表２　エンハンサ−およびプロモーターに対するＥｌａ
の影響 火胸　　　　　　　　　十Ｅｌａ ＳＶ４０　　　ＳＶ４０　　７０　７２　　３　　２　
　（２９＜）ＣＭＶ　　　ＳＶ４０　　７０　６５　９
０　８６　　（１，３＞）ＳＶ４０　　　ＣＭＶ　　　
　５０　　６６　４０　４５　　（１，５＜）ＣＭＶ　
　　ＣＭＶ　　　１００　１１１Ｑ　　１５５　１３７
　　（１，４＞）ＣＭＶ　　　２３　１２　３７Ｑ　　
１２４　　（１３＞）表２二〇ＡＴ活性は、トリチル化
アセチルＣ。

Ａの再生分析においてＨ３酢酸ナトリウムを用いて測定
された。直線性を確かにするために、３０分および１時
間にタイムポイントをおいて分析を行った。データは、
Ｅｔａ非添加時における、ＣＶ−１中でのＣＭＶ対照単
位との比較による相対的なＣＡＴ単位として表されてい
る。この対照値を１００に設定した。実験１では、この
値は１５５．８２８ｃｐｍであり、実験２では、この値
は５５５．３００ｃｐｍである。これらのプラスミドを
Ｅｌａと一緒にコトランスフエクトした場合の発現の変
化は、最右欄に（）で囲んで記載されている。

（〈）は総発現の減少、（〉）は総発現の増加を示す。

Ｅｌａ領域は、５個（５）の別々の情報即ち、タンパク
質をフードしている［ペリコーデットら（Ｐｅｒｒｉｃ
ｏｕｄｅｔ、　Ｍ、　　Ｇ、　）Ｎａｔｕｒｅ　２８１
　：５９４　（１９２９）、ウルフェンダールら（Ｕｌ
ｆｅｎｄａｌｌ、　　Ｐ。

Ｊ、Ｘ１９８７）前掲１３０頁、ステフェン（Ｓｔｅｐ
ｈｅｎｓ、　　Ｃ，）およびバーロウ（Ｈａｒｌｏｗ、
　　Ｅ、　）Ａｂｓｔｒａｃｔ、　Ｐｏｌｙｏｍａ　　
Ａｎｄ　　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　　Ｃｏｎｆｅｒｅｎ
ｃｅ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ、　
１９８７　）］。これらのメツセージの内、２つにコー
ドされているタンパク質の転写活性化作用を調べた。全
Ｅｌａ領域、並びに１２３および１３Ｓが夫々コードし
ているタンパク質の効果を調べた。ＣＡＴをコードする
様々なプラスミドと、全Ｅｌａ領域、１２Ｓをコードす
るｃＤＮＡまたは１３ＳをコードするＣＤＮＡを含有す
るプラスミドとでＣＶ１サル腎細胞をコトランスフエク
トした［ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ。

Ｂ、　　Ｅ、　）Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　５６．４０
６（１９８５）］。

既述のごとく、ｈＧＩ（遺伝子を含有する少量の内部対
照プラスミドを含有させて用いた。Ｅｌａの１２Ｓおよ
び１３Ｓメツセージをコードしている別々のプラスミド
でＣＶＩ細胞をコトランスフェクトすると、１２Ｓをコ
ードしているタンパク質は、ＣＭＶエンハンサ−の存在
下での発現に殆んど効果を示さなかった。このメツセー
ジはある種のエンハンサ−を抑制するようである。表３
は、１３ＳｃＤＮＡのコトランスフェクションが、ＣＭ
Ｖ指令による転写に強力な正の作用を有し、ＣＡＴ活性
を７−１５倍に増大させることを示している。発現増大
の最大は１５倍増であって、プロモーター単独の、エン
ハンサ−を含有しない構築物において見られた。全Ｅｌ
ａ領域がトランスフェクンヨンに包含されていると、Ｃ
ＭＶのエンハンサ−＋プロモーターの組み合わせに必要
最低限の効果が得られる。しかしながら、このような条
件下、プロモーター単独では１６倍の増大かみられた。

表３　　ＣＭＶエンハンサ−およヒプロモーターに特異
的なＥｌａタンパク質の作用の分析Ａ；ＣＶ１１［［１
胞のコトランスフエクションに用いたもの エンハ＋ブロモ　ブロモ−ター ンサー　−ター ＰＩＪＣ１９１００２１ １２Ｓ　　　　　　ｌ　１８（１）　　　　　　３３（
１，５）１３ｓ　　　　　　６９４（７）　　　　　３
１２（１４）全Ｅｌａ　　　　　１２３（１，２）　　
　　３４５（１６）表３＝上記の実験において、ＣＭ■
エンハンサ−＋プロモーター領域に対するＥｌａタンパ
ク質の共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）効果を調
べるために、ｐＣＭＶｃａｔを用い、ＣＭＶプロモータ
ー単独に対する効果を調べるためにｐＣＭＶｐｒｏを用
いた。Ｃｖ１細胞を、ＣＡＴプラスミド５００　ｎｇ、
適当なＥｌａプラスミド２．５μｇＳｐＲ３ＶｂＧＨｔ
ｏ。

ｎｇｓおよびｐＵｃ１９を加えてＤＮＡを５μｇとし、
コトランスフェクトした。抽出物１００μｆ２中２５μ
ｇのＣＡＴ活性をＨ３酢酸ナトリウム法で分析した。分
析は４０分間行った。１００＝１２４８９９　ｃｐｍｏ ２９３細胞におけるトランス−活性化実験はＥｌａの役
割に焦点が向けられていた。しかしながら、これらの細
胞はＥｌｂタンパク質をも産生ずることが知られている
（Ｇ　ｒａｈａｍ、　Ｆ　、　　ら、前掲、１９７７）
。発現におけるＥｌｂタンパク質の役割を定めるために
Ｅｌｂ発現プラスミドのコトランスフエクション実験を
行った。これらの実験において、再度ＣＶｌ細胞を用い
、ＣＡＴプラスミド単独でのトランスフェクション、Ｅ
ｌｂとＣＡＴプラスミドとのコトランスフェクション、
または、最後にＥｌａおよびＥｌｂの両者とＣＡＴプラ
スミドのコトランスフェクションのいずれかの後、ＣＡ
Ｔ活性を調べた。表４から分かるように、Ｅ１ｂ単独と
のコトランスフェクションによす、ＣＡＴレベル４−１
０倍増大した。再び、最大の増加は、ＣＭＶプロモータ
ーのみを用い、ＣＡＴ発現を指令するエンハンサ−を欠
＜　ｐＣＭ　Ｖ　ｐｒｏコトランスフェクションにおい
て認められた。Ｅｔａ単独ではある種のベクターに否定
的な（負の）影響を認めた前記の結果（表２）と対照的
に、ＥｌａおよびＥｌｂのコトランスフエクンヨンは、
全ベクターに正の影響をおよぼした（表４）。ＣＭＶプ
ロモーターで指令される発現を用いるベクターにおいて
、６倍から３０倍の著しい相加作用が見られた。

［４ＣＡＴ発現に対するＥｌｂ領域の作用エンハ　ブロ
モ　単独　Ｅｌｂ　　　ＥＩａ＋　Ｅｌｂンサー　−タ
ー ＳＶ４０　　　ＳＶ４０　　　７０　　４１６（６）　
　　２７３（４）ＣＭＶ　　　ＳＶ４０　　６７　２５
４（４）　　　２００（３）ＳＶ４０　　　ＣＭＶ　　
　　５０　　５４３（１１）　　　３３９（７）ＣＭＶ
　　　　ＣＭＶ　　　　１００　　３８５（４）　　　
５９４（６）ＣＭＶ　　　　２３　　２６７（１１）　
　　４８９（２０）表４：ＣＡＴ　ＤＮＡｌｌ１ｇ、ｐ
Ｒ３ＶｈＧＨ１００ｎｇおよびｐＵ　Ｃ１９Ｄ　Ｎ　Ａ
を加えて５μｇとし、ＣＶ１細胞をトランスフェクトし
た。Ｈ’酢酸ナトリウム法のために、１００μｇの抽出
物の内、数μρを用いた。分析は　分間行なわれた。デ
ータは、ｐｃＭＶｃａｔベクターにおける発現に対する
相対的な値として表されている。１ｏｏ＝１５５゜８２
８ｃｐｍｏ　（）内の値は、アデノウィルス遺伝子との
コトランスフェクションに際して各ベクターに認められ
た倍率の変化を表している。

プラスミドの安定性の測定 転写活性化に果たす役割をＥｌｂ単独に帰す報告は殆ん
ど無い。しかしながら、Ｅｌｂタンパク質、殊に１９に
タンパク質が宿主細胞およびウィルスＤＮＡの両者の有
効であることも示されているしホワイトら（Ｗｈｉｔｅ
、　Ｅ、　　）　１９８６、−ＭＣＢ　６：３７６３　
；ビルダーら（Ｐ　１ｌｄｅｒ、　Ｓ　、　　Ｊ、）１
９８４、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５２：６６４；サブラマニア
ンら（Ｓ　ｕｂｒａｍａｎｉａｎ、　Ｔ、　）　１９８
４、Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　５２：３３６；タケモリ
ら（Ｔａｋｅｍｏｒｉ、　Ｎ、　）　ｌ　９８４、Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ、５２ニア９３Ｊ。この行程は殆んど理解さ
れておらず、この効果が検出されるためにはＥ１ａタン
パク質の同時発現（コエクスプレソション）を必要とし
、複雑である。従って、本発明者らは、これらの初期ア
デノウィルス遺伝子の一方または両方の存在下において
も、プラスミドＤＮＡが分解により抵抗性を有するが否
かに疑問を抱いた。

ｐＲ３ＶｈＧＨＤＮＡをＥｌａおよびＥｌｂを含有する
２つの細胞系統、およびこれらの遺伝子を欠く細胞系統
、例えばＣＶｌ、Ｃｏ５７、Ｈｅ１ａ。

またはＫＢ細胞にトランスフェクトした後、Ｈｉｒを法
［ハート（Ｈｉｒｔ、　Ｂ、　　Ｉ　、　　）Ｍｏ１．
　　Ｂ　ｉｏｌ、　　２６．３６５（１９６７）］でプ
ラスミドＤＮＡを単離するために、４時間から８０時間
までの様々な時間に細胞を収穫した。細胞の外表面に残
存するＤＮＡをＤＮａｓｅ処理によって除去した。トラ
ンスフェクション後様々な時間におけるｐＲ３ＶｈＧＨ
ＤＮＡの存在を、ｈＧＨ特異プローブを用いたサザーン
ブロッティングによって測定した。２つのサル細胞系統
、即ちＣ■１およびその誘導体Ｃｏ５７は、２４時間の
Ｈｉｒｔ法で検出可能なプラスミドを含有していた。興
味深いことに、Ｃｏ５７細胞内でのＴ抗原の発現は、複
製の非存在下でのこのプラスミドＤＮＡの維持になんら
影響を及ぼさなかった。

このプラスミドＤＮＡは、Ｈｅ１ａ細胞内で４時間安定
であった。２９３．２９３ｓおよびＪＷ２細胞中では、
プラスミドＤＮＡは７２時間まで検出可能であった。こ
れらの細胞はすべてアデノウィルスのＥｌａおよびＥｌ
ｂ両領域を発現する。それらの形態学的表現型は非常に
異なっているので、これらの細胞内に存在するアデノウ
ィルスタンパク質は、これらの細胞系統における上皮性
ＤＮＡの安定性の増大に寄与しているのかもしれない。

実施例３　第■因子発現ベクター １０発現ベクターの構築 ヒト第■因子をコードするｃＤＮＡを用い、トランスフ
ェクトされた哺乳類細胞内で第■因子タンパク質の発現
を指令するプラスミドを構築した［ウッドら（Ｗｏｏｄ
、　　Ｗ、　　）Ｎａｔｕｒｅ　［Ｌｏｎｄ、　　］３
１λ：３３０−３３７（１９８４）］。これら、形質転
換された哺乳類細胞は約０．１４　ｍＵ／ｙ（ｌの第■
囚子を分泌した。本発明方法は、第■因子の収率を著し
く増大し、連続的に生産する方法を提供するものである
。

ａ）ｐＦ８ｃＩｓ サイトメガロウィルスのエンハンサ−［ポジヤードら（
Ｂｏｓｈａｒｔ、　　Ｍ、　　）Ｃｅｌｌ　　土↓　５
２０（１９８５）］およびプロモーター［トムセンら（
Ｔｈｏｍｓｅｎ、　　Ｄ、　　Ｒ，）、ＰＮＡＳ８↓６
５９−６６３（１９８４）］、サイトメガロウィルスの
スプライス供与部位およびイントロンの一部［ステルン
ベルグら（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、　　Ｒ，Ｍ、　）Ｔ、
　ｏｆ　　Ｖｉｒｏｌ、　　４９１９０−１９９（１９
８４）］、Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライス受
容部位、第■因子をコードするｃＤＮＡおよびＳＶ４０
ポリアデニル化部位を含有するベクターｐＦ３ＣＩＳを
構築した。

第■因子のための細胞系統を樹立するために用いた第■
因子発現ベクターの構築模式図を第１図に示す。構築に
用いた３部分について、以下に詳しく説明する。

１）ｊ％終ベクターのアンピシリン耐性マーカーおよび
複製起源は、プラスミドｐＭＬ［ラスキー（Ｌｕｓｋｙ
、　Ｍ、　）およびボッチエン（Ｂ　ｏｃｈｅｎ、　Ｍ
、　）Ｎａｔｕｒｅ　２９３　７９（１９８１）］の変
異体である出発プラスミドｐＵｃ１３ｐＭＬから導かれ
た。ｐＵＣ１３ｐＭＬは、ｐＵｃ１３［ベイラ（Ｖｅ＋
ｒａ＋Ｊ。

）およびメノシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　　Ｊ　、　）
Ｇｅｎｅ　１９　：２５９（１９８２）］のポリリンカ
ーをｐＭＬのＥｃ。

Ｒ１および＋（ｉｎｄＩ１１部位に移すことにより構築
された。第２の出発プラスミドｐＵＣ８ＣＭＶは、ＣＭ
Ｖエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス供与配
列の供給源である。ｐＬＩｃ８ｃＭＶは、第１７図に示
すように、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびス
プライス供与配列のためのヌクレオチド１〜７３２をｐ
ＵＣ８の平滑末端化したＰｓｔｌおよびＳ　ｐｈ　１部
位に挿入することにより構築された［ビエラおよびメッ
シング、前掲）。ＢａｍＨＩ粘着末端に合成り　ａｍＨ
ｌ　−ｔ（１ｎｄＩＩｌリンカ−（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｎ
ｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏｌａｂｓから購入可）をライゲ
ートしてＨ４ｎｄｌ１１部位を創成した。このライゲー
ションの後、Ｈ１ｎｄＩ［［−Ｈｉｎｃ　ＩＩ消化を行
った。

この消化により、ＣＭｖエンハンサ−、プロモーター、
およびスプライス供与部位を含有する約８００ｂｐ断片
を得た。ゲル単離の後、この８００ｂｐ断片をｐＵｃ１
３ＭＰＬの２９００ｂｐ片（ｐｉｅｃｅ）にライゲート
した。ｐＦ３ｃｒｓの構築に必要な断片は、上記の中間
体プラスミドをＳ　ａＱ　ＩおよびＨｉｎｄｌＩ［で消
化して得た。この３１２Ｓｂｐ片はアンピシリン耐性マ
ーカー、ｐＵｃ１３ｐＭＬ由来の複製起源、エンハンサ
−、プロモーターおよびスプライス供与部位を含むＣＭ
Ｖのための調節配列を含有していた。

２）第１図の中央部分に示した合成オリゴマーを用いて
Ｉｇ可変領域のイントロンおよびスプライス受容配列を
構築した。ＩｇＧイントロンおよびスプライス受容部位
のために以下の配列を有する９９ｍｅｒおよび３０ｍｅ
ｒを化学合成した［ボスウェルら（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ）
　１９８１１゜１　　”ＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡ
ＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡ・・・３１　　　Ｇ
ＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡ
ＴＧＡ・・・６０　　　ＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴ
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴ・・・８８　　　ＧＴＣ
ＣＡＣＴＣＣＣＡＧ３゜１　　”ＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧ
ＴＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡ”ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（フレノウフラグメント）によって合成物
を充填し、二本鎖断片を得た［ワーテル（Ｗａｒｔｅｌ
ｌ、　　Ｒ，Ｍ、　）およびレズニコフ（Ｗ、　　Ｓ　
、　　Ｒｅｚｎｉｋｏｆ「）、Ｇｅｎｅ９　３０７（１
９８０）］。

次いで、これをＰｓｔｌおよびＨｉｎｄＩ［［で二重消
化した。この合成リンカ−をｐＵｃ１３のＰｓｔｌおよ
びＨｉｎｄＩ［［部位にクローニングした［ベイラ（Ｖ
ｅｉｒａ、　　Ｊ、　）およびメノシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、　　Ｊ、　）Ｇｅｎｅ　１９　２５９（１９８２
）］。合成オリゴマヌクレオチドを含有するクローン（
ｐＵＣＩｇ、’　１０と表示）をＰｓｔｌで消化した。

Ｐｓｔｌ−Ｃ１ａｌリンカ−を用いて、このフラグメン
トに１個のＣｌａｌ部位を付加した。ＨｉｎｄｌＩＩ消
化の後、１ｇイントロンの一部とｒｇ可変領域スプライ
ス受容部位とを含有する１１８ｂｐ断片をゲル上で単離
した。

３）構築方法の第３の部分は肝炎表面抗原の３′末端を
、５Ｖ４Ｑの初期領域のポリアデニル化部位および転写
終止部位で置換することである。ＳＶ４０配列を有スル
ヘクター、ｐＵＣ，ＳＶ４０をｐＵｃ８のＢａｍＨ１部
位に挿入した（ビエラおよびメッシング、前掲）。次い
で、ｐＵＣ，５Ｖ４ＱをＥｃｏＲＩおよびＨｐａｌで消
化した。５Ｖ４Ｑポリアデニル化部位のみを含有する１
４３ｂｐ断片をこの消化物からゲル単離した。ｐＳＶＥ
、８ｃｌＤの消化後、さらに２つの断片がゲル単離され
た（欧州特許公開Ｎｏ、１６０，４５７）。ＥｃｏＲＩ
およびＣ１ａｌ消化により生成した４、８ｋｂ断片はＳ
■４Ｑ−ＤＨＦＲ転写単位、ｐＭＬの複製起源およびア
ンピシリン耐性マーカーを含有している。Ｃ１ａｌおよ
びＨｐａＩ消化で生成された７５５ｋｂ断片は第■因子
のｃＤＮＡを含有している。３成分ライゲーションによ
ってｐＳＶＥ、８ｃ２４Ｄを得た。

この中間体プラスミドをＣ１ａ＋および５ａｌｌで消化
し、ＳＶ４０ポリアデニル化部位および転写終止部位、
次いで、５Ｖ４０ＤＨＦＲ転写単位を伴った第■因子の
ｃＤＮＡを含有する９６１１ｂｐ断片を得た。

ｐＦ８ｃＩｓを得るための最後の３成分ライゲーション
には以下の断片を用いた。ａ）複製起源、アンピシリン
耐性マーカー並びにＣＭＶエンハンサ−、プロモーター
およびスプライス供与を含有する３　Ｌ　２３ｂｐＳａ
ｌＩ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片、ｂ）１ｇイントロンおよび
スプライス受容を含有する１１８ｂｐＨ１ｎｄＩＩＩ　
−Ｃｌａ　Ｉ断片、およびＣ）第■因子のｃＤＮＡ、Ｓ
Ｖ４０ポリアデニル化部位および５ｖ４０ＤＨＦＲ転写
部位を含有する９　６１１ｂｐＣ１ａｌＳ　ａｌ　Ｉ断
片。発現ベクターｐＦ８ＣＩＳの配列の１部を第１０図
に示す。

ｂ）ｐＦ８Ｃ３ＳＳ サイトメガロウィルスのエンノ＼ンサーおよびプロモー
ター、合成（ｅｎｇ　１ｎｅｅｒｅｄ）安定化配列、第
■因子をコードしているｃＤＮＡおよびＳＶ４０のポリ
アデニル化部位を含有するベクターｐＦ３Ｃ８ＳＳを構
築した。供与および受容配列を含めて全イントロン領域
を切除し、合成安定化配列で置き換えた。安定化配列は
成熟ｍＲＮＡ、次いて、スプライシング部位の配列を含
有する合成２本漬オリゴマーである。安定化配列をｐＦ
８ｃＩｓの唯一の５ａｃＩ［−Ｃｌａｌ部位に粗挿入し
た。

合成オリゴマーの配列式を以下に示す。

鉦■ ５’　ＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＴＴＧＧＡＡＣ
ＧＣＧ３°ＣＧＣＣＧＧＣＣＣＴＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣ
ＣＴＴＧＣＧＣ５°ＧＡＴＴＣＣＣＣＧＴＧＣＣＡＡＧ
ＡＧＴＧＡＣ呵ＧＴＣＴＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣ
ＴＣＡＣＴＧＣＣΔＣ八５’　ＣＣΔＣＴＣＣＣＡＣＧ
ＴＣＣＡＡＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＧＴＧ　ＣＡＧＧＴ
ＴＧＡＣＧ５’　ＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡＴ３’
ＴＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣ５’ｑハＩ 合成オリゴマーは、供与および受容のコンセンサススプ
ライス配列の適切なヌクレオチドを含有している。スプ
ライス供与配列とスプライス受容配列との連結部は下線
で示されている。このベクターは、イントロン部分を欠
如し、合成安定化配列で置換されていることを除いて、
前記のｐＦ８ＣＩＳベクターと類似している。この構築
物は、最近に転写されたｍＲＮＡからの非暗号化領域の
実際のスプライシングが除去されている。合成安定化配
列を含有する発現ベクターｐＦ８ｃｓｓｓの配列の１部
を第１２図に示す。

ｃ）ＳＶ４０エンハンサ−およヒプロモーター、サイト
メガロウィルスのスプライス供与部位およびイントロン
の１部、１ｇイントロンおよびスプライス受容部位、第
■因子をコードしているｃＤＮＡ並びに５Ｖ４Ｑのポリ
アデニル化部位および転写終止部位をコードしているベ
クターｐＦｇｃＩｓを構築した。ｐＦ８ｃＩｓの構築模
式図を第２図に示す。

このベクターは３成分ライゲーションを用いて構築され
た。このライゲーションに、用いた３つの各断片の調製
を以下に示す。

第１・断片はＳＶ４０初期領域プロモーターおよびエン
ハンサ−並びにプラスミドｐＭＬ由来のアンピシリン耐
性マーカーの半分を含有している。

３断片の第１断片の出発プラスミドはｐＡＭＬ３Ｐ、８
Ｃ１（欧州特許公開Ｎｏ、１６０，４５７）である。こ
のプラスミドをＳ　ａｃ　ｌで切断した。ＤＮＡポリメ
ラーゼＩの全酵素を用いてＳ　ａｃ　Ｉで生成されたこ
の３°突出を充填した。この反応の後、プラスミドをＰ
ｖｕＩで切断した。所望の４３４ｂｐ断片をアクリルア
ミドゲルから単離した。

この構築に用いた第２および第３の断片は前記のプラス
ミドｐＦ８ＣＩＳから単離された。

断片２はＣＭＶ前初期遺伝子由来のスプライス供与およ
びその下流のイントロンの１部並びに上記のごとくにし
て合成されたイントロンおよびスプライス受容を含有し
ている。ｐＦ３ｃＩｓをＳａｃ■で切断し、生成した３
°突出をＤＮＡポリメラーゼＩを用いて充填した。この
反応に続いてＣ１ａ■で開裂した。ｐＦ８ｃＩｓにおい
てＣ］ａＩ部位を囲む配列は、該プラスミドをメチル化
十株中で増殖させると開裂を妨害するので、ｐＦ８ｃＩ
ｓの調製はｄａｍ−株ＧＭ４８内で行なわれた［マリナ
ス（Ｍａｒｉｎｕｓ、Ｍ、　Ｇ、　）およびマリス（Ｍ
ａｒｉｓ、Ｎ。

Ｒ、）　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、１上１．１１４３−１
１５０（１９７３）、並びにガイヤー（Ｇｅｉｅｒ、Ｇ
、　　Ｅ、　）およびマドリッド（Ｍａｄｒｉｄ、　Ｐ
　、　）　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ。

２５４．１４０８−１４１３（１９７９）。Ｓａｃ［Ｉ
およびＣ］ａＩ部位はいずれもこのベクター内の唯一の
部位なので、２３１ｂｐ断片は容易にアガロースゲルか
ら単離される。

第３の断片は第■因子のｃＤＮＡ、ＳＶ４０初期領域ポ
リアデニル化部位、５Ｖ４０−ＤＨＦＲＨＦ型位、ｐＭ
Ｌ複製起源、およびアンピシリン遺伝子の半分を含有し
ている。ｐＦ　８ＣＩ　Ｓ（ｄａｍ→をＣ１ａｌおよび
Ｐ　ｖｕ　Ｉで切断し、１１３０８ｂｐ断片を調製した
。

３成分ライゲーションによってＳ　ａｃ　ＩおよびＳａ
ｃ［［部位が破壊され、Ｃｌａｌ部位が保存され、Ｐｖ
ｕ１部位にａｍｐ’遺伝子が再構築されたｐＦ８３ＣＩ
ｓが創成された。発現ベクターｐＦ３’５ｃｌｓのヌク
レオチド配列の１部を第１１図に示す。

実施例４−時発現 形質転換細胞のイムノバーオキシターゼ染色に基づいて
第■因子の発現を検定した。ゴーマン等（Ｇｏｒｍａｎ
　ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）　４２．５１９−
５２６（１９８５）。第■因子の発現についてベクター
を試験するために、この検定を行なった。この検定で使
用するために、第■囚子に特異的な１２種のモノクロー
ナル抗体をスクリーニングした。

第■因子を産生ずる細胞をスクリーニングするために、
ＢＨＫ３１Ａ３Ｂ細胞（ヨーロッパ特許公開第１６０，
４５７号）を染色し、元のＢＨＫラインと比較した。モ
ノクローナル抗体ＢＨ６は最少型のバックグラウンドで
最も強いシグナルを与えることかわかった。形質転換を
行ない、第■因子の一時発現を評価した。ＣａＰＯ４法
を使用し、細胞（Ｃｏｓ、　２９３、ＣＨＯ，ＢＨＫ、
ＴＭ４）をトランスフェクトした。１０マイクログラム
／ミリリットルの第■因子ベクター沈澱を試験した。沈
澱を細胞上に３−４時間維持した。次いで、細胞に平均
１分間、グリセロールショックを与えた。

３６時間後、トランスフェクトした細胞をアセトン−メ
タノール（５０：５０）で固定し、リン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）で洗浄した。非希釈ＢＨ６上澄液、または１
０％ウシ胎児血清を含有しているＰＢＳ中、１　：　３
０００に希釈した精製ＢＨ６抗体を使用し、細胞を染色
した。この第１の抗体を細胞上に２時間維持した。この
間、プレートを低速振盪機に置いた。細胞を１０分間で
５回洗浄した。第２の抗体であるウサキ抗−マウスＩｇ
Ｇ［ダコバッツ（Ｄ　ａｋｏｐａｔｔｓ）］を、ＰＢＳ
＋ウシ胎児血清中、１：１５０の希釈度で希釈した。２
時間インキュベートした後、更に一連の洗浄を行なった
。

パーオキシダーゼ試薬を発現させるための基質として、
オルト−ジアニシジン［シグマ（Ｓ　ｉｇｍａ）］を使
用した。オルト−ジアニシジンの飽和エタノール溶液を
、１／１００００希釈の過酸化水素を含有するＰＢＳで
１：１００に希釈した。この基質を細胞上、室温で２時
間または４°Ｃで一夜維持した。

この方法によって、第■因子の発現を導く第■因子ベク
ターについてスクリーニングを行なった。

この方法は第■因子の一時的な発現を示した。トランス
フェクションから３６時間後の染色は、ベクターが転写
され、ｍＲＮＡが翻訳されたか否かの指標となる。

ｐＦ８（、Ｉｓは、少なくとも５種の異なった細胞系統
、即ちＣＯＳ、２９３、ＣＨＯ，ＴＭ４およびＢＨＫで
第■因子の一時発現を導いた。第３図Ａは、ＣＨＯ細胞
におけるベクターｐＦ８ｃＩＳの一時発現を示す。

ｐＦ３３ｃＩｓは、ｐＦ３Ｃ（Ｓと同程度に効果的に第
■因子の一時発現を導くことかわかった。

第３図Ｂは、ＣＨＯ細胞におけるベクターｐＦ８ｓｃｔ
ｓの一時発現を示す。ＣＭＶエンハンサ−およびプロモ
ーターは類似の５Ｖ４Ｑエンハンサ−およびプロモータ
ーによって完全に置き換えることができるので、第■因
子の産生は特異的な転写開始シグナルに依存するのでは
なく、ベクター中の安定化配列部位の様な、調節領域の
その他の部分に依存する。

細胞をトランスフェクトして産生細胞系統を樹立すると
同時に、各細胞ハ１１のプレートを一時発現について検
定した。第■囚子について一時発現をスクリーニングし
たところ、２タイプの細胞が得られた：トランスフエク
ションの３６時間後、第■因子についてポジティブに染
色された細胞型（カテゴリー１）、および検出し得る第
■因子の一時発現を有していない細胞型（カテコリー２
）。各カテゴリーを構成する宿主細胞を以下に示す：カ
ナコリー１　　　　カテゴリー２ ＣＨＯＭＤＣＫ ２９３　　　　　　　　ＢＲＬ ＢＨＫ　　　　　　　　Ｈｅｌａ ＴＭ４　　　　　　　　　Ｖｅｒ。

ＨＴ　ＣＷ　１３８ ｃｏｓ　　　　　　　　ｃｖ　Ｉ ｅｐＧ２ ＲＩ 上記の様に、他の調節領域を維持しながら１ｇ可変領域
イントロンおよび供与および受容部位を欠失させると、
第■因子の一時発現が得られない。

このデータから、発現のためには少なくとも１個のスプ
ライス供与−イントロン−受容配列が必要であるらしい
。

別の実験は、安定化配列の位置が重要であることを示す
。例えば第■因子をコードしているｃＤＮＡに対する３
″にイントロンが位置すると、第■因子を発現すること
ができなかった。天然の第■因子スプライス部位、即ち
コード領域内のスプライス部位を含むように構築された
ベクターも発現しないことがわかった。ＣＭＶスプライ
ス供与配列、およびＣＭＶ配列および合成１ｇ可変領域
イントロンからなるキメライントロン、および受容配列
を含有するスプライス供与−受容配列は、第■因子の連
続産生を与える細胞系統の樹立を導く安定化配列の例で
ある。

実施例５　変異型筒■囚子発現ベクターより有効なタン
パクを獲得するための１つのアブローチは、加工である
。即ち、ＤＮＡレベルで遺伝子内の変化を誘導すること
によって、細胞培養中で、タンパク機能が１−＋ｊ異的
に改変された変異体を製造することができる。３種の変
異体を製造した。天然の第■因子−本領３００，０００
ダルトンタンハクを、９０．　ＯＯＯおよび８０，００
０ダルトンのサブユニットに切断し、次いて、５０゜０
ＯＯ１４３，０００および７３，０００ダルトンの活性
サブユニットに切断する。アミノ酸７４２から１６４８
のＢ領域は明白な機能を有していない。ベハール等（Ｖ
ｅｈａｒ、　Ｇ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー
（Ｎ　ａｔｕｒｅ）　３↓λ、３３０−３３７（１９８
４）。

突然変異体を発現するために、完全長の組み換え第■因
子タンパクの発現について記載された細胞系と同一の系
を使用した。

Ｉ）Ｆ８ＣＩ３９０８０ 第■囚子融合タンパクを発現するために使用した真核性
発現ベクターは、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭ　Ｖ
　）前初期遺伝子のエンハンサ−（ポジヤード等（Ｂｏ
ｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、）、前掲）およびプロモータ
ー（トムセン等（Ｔｈｏｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）、前
掲）；この遺伝子の転写開始部位の３゛に位置するスプ
ライス供与配列（ポジヤード等（Ｂｏｓｈａｒｔ　ｅｔ
　ａｌ、）、前掲、ステンハーグ等（Ｓ　ｔｅｎｂｅｒ
ｇ　ｅＬａｌ、）、前掲）：およびマウス免疫グロブリ
ン可変領域からの合成スプライス受容部位（ボスウェル
等（Ｂ　ｏｔｈｗｅｌ　１ｅｔａ１．）、前掲）を含有
している。新規な暗号領域の３゛末端は、５Ｖ４Ｑ初期
ポリアデニル化配列および転写終止部位と接している（
ライアース等（Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ、）、前掲）。

ベクターは、増幅可能なマーカー、ＳＶ４０−ＤトＩＦ
Ｒ中云写ユニットを含有している。

第■囚子融合タンパク９０ｋａ＋　１４２ａａ＋８０ｋ
ｄをフードしている発現ベクター、即ちｐＦ３ＣＩＳ９
０８０の構築を第４図に示す。プラスミドｐｓＶＥ、８
ｃＩＤ（ヨーロッパ特許公開第１６０゜４５７号）を出
発物質とし、５ｓｔＩＩで切断し、Ｓｌで粘着末端を平
滑化し、更に±ｐａ、Ｉて切断し、２個の平滑末端を再
うイゲーノヨンすることによって、３″非翻訳領域で短
い欠失を起こし、ｐＳＶＥ。

８ｃ９を得た。このプラスミドをＣ１ａＩおよびＳ計■
て切断し、Σ旦１、ｑハＩに１００３１ｂｐ断片をクロ
ーニングした。６７６１　ｂｐプロモーターは、Ｉ）Ａ
ＭＬ３Ｐ、Ｄ２２（ヨーロッパ特許公開第１６０．４５
７号）の断片を含有している。第■囚子の遺（Ｈ子内に
充填されたＴ　ｔｈｌｌ　１１と充填されたＢａｍＨＩ
（アミノ酸１５６３）部位をライゲートすることによっ
て第■因子遺伝子で融合を行なった。第５図は、ｐＡＭ
ｌ、、　３　Ｐ、　８ｃ　１．　（ヨーロッパ特許公開
第１６０．．４．５７号）の２５１６ｂｐ断片とｐＡＭ
Ｌ３Ｐ、８ｃ９の１．］９９１ｂｐ断片とのライゲート
による、融合領域を含有するｐＡＭＬ　３　Ｐ、　８Ｌ
１９の構築を示す。この融合をＤＮＡ配列決定によって
確認した。融合領域を含有している４７２２ｂｐＣハＩ
−入恒［断片を、ＣＭＶプロモーター−エンハンサ−発
現ベクターを含有しているｐＦ８ＣＩｓの５８２８　ｂ
ｐ堕ｌ−巧Ｉ断片にクローニングした。ＣＭ　Ｖ断片は
、メチル化がＣｌａｌ部位における切断を妨害しない大
腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｌ）のｄａｍ一体から得た。

実施例ｑ　発現結果 実施例４に記載の方法を、ヌクレオチド７９６から１５
６２を欠失させた第■囚子変異体、ｐＦ８ＣＩＳ９０８
０の発現に適用した。９０ｋｄ＋１４２ａａ＋８０ｋｄ
融合タンパクは、完全長タンパクより高レベルで発現さ
れる。しかしながら、融合タンパクの発現能には細胞型
間でかなりの差かある。

以下のデータは、適当な宿主細胞を選択することによっ
て所望の融合タンパクか商業的に利用し得る量で連続産
生されることを証明する。ｐＦ８ＣＩＳ９０８０でトラ
ンスフェクトされたＴＭ４１１１１胞は、融合タンパク
の一時的および安定な発現の両者を示した。ｐＦ８ｃＩ
ｓ９０８０てトランスフェクト レベルにおいて、完全長筒■囚子に比較して５倍の増加
を示した。ｌｏｏｎＭメトトレキセートでは、プールし
た融合第■因子のクローンは１２ｍＵ／１０’細胞／日
を産生した。ＨＴ　Ｃ♀１１胞は、融合第■因子の発現
において、完全長第１Ｖｌ囚子と同程度の増加を示した
。

２９３細胞では、融合タンパク第■因子の発現は、完全
長筒■因子の発現に比較して非常に高い。

融合タンパクベクター、ｐＦ８ｃＩｓ９０８０で形質転
換された２９３細胞では、通常、８５ｍＵ／１０４細胞
／日の非増幅数レベルが達成された。

完全長筒■因子の発現レベルは融合筒■因子より低（，
２，５ｍＵ／１０’細胞／日を産生じた。調節シグナル
はｐＦ３ｃＩｓおよびｐＦ８ｃＩｓ９０８０で同一なの
で、発現レベルの差は完全長メツセージおよび／または
タンパクを産生ずる細胞の能力にあるに違いない。

実施例７　活性化プロティンＣに耐性な第■因子変異体
の発現ベクター 血漿タンパクである活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）は、
制限タンパク分解によってヒト第■因子を不活化するこ
とがわかっている。この不活化切断の可能な部位の１つ
は、３３６位のアルギニンである。３３６位のアルギニ
ンを、例えばリジンまたはグルタミン酸の如き他のアミ
ノ酸に変えることができる。３３６位が不活化の部位で
あるか否かを決定するために、２個のベクタニ、ｐＦ８
ＣＩＳ３３６ＥおよびｐＦ８ｃｒｓ９０８０−３３６Ｅ
を構築した。イン・ビトロでの突然変異誘発［ノリス等
（Ｎｏｒｒｉｓ、に、　ｅｔ　ａｌ、）、ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）土工、５１０３−５１１２（１９８
３）コを使用し、３３６位のアルギニンをグルタミン酸
に突然変異させたく第５図）。突然変異誘発のために、
ｐＦ８ＣＩＳからの７９２ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ　　）（
ｐｎｌ断片を、ｍ１３のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｋｐｎ１部位
に挿入した。この断片に突然変異を誘発するために、以
下に示す１８ｂｐオリゴマーを使用した。

Ｐ　　Ｑ　　Ｌ　　Ｅ　　Ｍ　　ＫＮ ５°ＣＣＣＡＡ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＡ　Ａ　
３’＊ 鎖を伸長させた後、二本鎖の突然変異したＭ１３クロー
ンをＡｃｃｌおよびＫｐｎｌで切断した。７７８ｂｐ断
片をゲルによって精製した。プラスミドｐＦ８ｃＩｓを
大腸菌ＧＭ４８のｄａｍ−株で増殖さセタ。Ｐｓｔｌ−
Ｃ１ａＩリンカ−は第１図に示される配列を有するので
、プラスミドを上記の如きメチル化プラスの細菌株で増
殖させると、ｐＦ８ＣＩｓのＣｌａｌ部位は切断されな
いであろう。２個の断片、即ち１０ｋｂＫｐｎ１部分的
−〇ｌａｌ断片および１１０８ｂｐＣ１ａＩ−Ａｃｃｌ
断片をｄａｍ−ｐＦ　８ＣＩＳＤＮＡから単離した。天
然の第■因子配列を突然変異した配列で置き換えるため
には、３成分ライゲーションが必要であった。第５図参
照。

ｐＦ８９０８０−３３６Ｅの構築は、第６図に示される
ように、他の３成分ライゲーションによって行なった。

３３６Ｅ変異アミノ酸を含有している１１１５ｂｐジ凹
Ｉ−旦１、■断片を移し、ｐＦ８ｃ＋５９０８０から単
離した８　９１ｂｐｓａｃｌｌ−３ｐｅｒ断片および８
５６４ｂｐＢｇｌＩＩ−ΣａｃＩ［断片とライゲーショ
ンして別の変異融合タンパクを作り出した。

これらのタンパク両変異体は、２９３細胞中で発現され
た。この突然変異を有する完全長筒■因子は２．８ｍＵ
／１０’細胞／日で発現されたが、融合変異体は１５ｍ
Ｕ／１０’細胞／日で発現された。

実施例８　プロレラキシン発現ベクター１、ｐｃ［’Ｈ
ＲＸ ベクダー、ｐＣＩＨＲＸは、サイトメガロウィルスエン
ハンサ−およびプロモーター、サイトメガロウィルスス
プライス供与部位、ｒｇ可変領域スプライス受容部位、
Ｈ２ブレブロレラキシンをコードしているｃＤ　Ｎ　Ａ
、および肝炎表面抗原ポリアデニル化および転写終止部
位を含有している。

第７図はブロレラキシンベクターの構築のための工程を
示す。前記と同じ１ｇ可変領域からのイントロンおよび
スプライス受容配列を維持した。６７７ｂｐのプレプロ
レラキシンｃＤＮＡは、これらの５′プロセツシングシ
グナルの次に位置した。

５′調節シグナルはｐＦＢｃ−ｒｓと同一であったが、
ポリアデニル化領域および終止配列シグナルはＳＶ４０
ではなく、肝炎表面抗原遺伝子から得た。

まず、中間体プラスミド、ｐＣｌａＲＸを構築した。プ
ラスミドｐｓＶＥＲＸ（ヨーロッパ特許出願公開第０２
６０１４８号参照）をＨｉｎｄｌＩ［で切断し、プレー
プロレラキシンｃＤＮＡ、次いでＢ型肝炎表面抗原（Ｈ
ＢｓＡｇ）３″ポリアデニル化部位を含有している１７
００ｂｐ断片を単離した。ＫｐｎＩ部位はＨＢｓＡｇポ
リアデニル化部位の３°側、このベクター中、ＤＨＦＲ
ｃＤＮＡを発現させるために使用した５Ｖ４Ｑ初期プロ
モーターの開始点の５゛側である。

このＨｉｎｄｌｌｒ断片を、Ｈｉｎｄｌｌ［部位で直線
化されたｐＭＬに挿入した。細菌性アルカリホスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）で処理して閉環を最小にした。アンピシ
リン耐性コロニーをスクリーニングし、プレープロレラ
キシン遺伝子の５°末端がｐＭＬの幼１部位の次に位置
するように遺伝子が挿入されているクローンを単離した
。

中間体プラスミド、ｐｃｌＡＲＸをＣ１ａｌおよびＫｐ
ｎｌで切断し、プレーブロレラキシン遺伝子、次に肝炎
表面抗原３′ポリアデニル化配列を含有する１３６０ｂ
ｐ断片を単離した。この断片を、ｐことによって得た５
１４３ｂｐ断片にライゲートした。

２．１）ＣＩＳＲＸ ポリアデニル化配列の選択がメツセンジャーＲＮＡの５
′プロセツシングに影響する［ウィルソンおよびネウ゛
インス（Ｗｉｌｓｏｎ　＆　Ｎｅｖｉｎｓ）、前掲］こ
とが知られているので、ｐＣＩＨＲＸ中の３”肝炎ポリ
アデニル化配列をｐｓＶ４０ポリアデニル化配列で直配
列えた。ｐＣＩＳＲＸの構築のための工程を第８図に示
す。この構築のための２個の出発ベクターは、ｐｃＩＨ
ＲＸおよびｐＦ８ｃＩｓである。後者のベクターはｐｃ
ＩＨＲＸと同じ５°側節配列を有しているが、第■因子
のｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有し
ている。

５ａｃｌＩを使用してｃＤＮＡの３′を切断した。得ら
れた３°突出部分をＴ４ポリメラーゼによって平滑末端
化した。次いで、ｐｃＩＨＲＸをＢ↓Ｈ１で切断した。

この部位は、レラキシン遺伝子の５゛末端からキメライ
ントロンを分離する。ＢａｍＨＩ処理物から８６１ｂｐ
断片をゲル単離した。ｐＦ８ＣＩＳから、ＳＶ４０ポリ
アデニル化部位、ＤＨＦＲ１転写ユニット、細菌の複製
起源およびａｍｐｒ遺伝子、並びにＣＭＶエンハンサ−
およびプロモーターおよびスプライス供与部位を単離し
た。

これらの要素は２５２５ｂｐＳａｌ　Ｉ−Ｂａｎ…Ｉ断
片および３１１３ｂｐＨｐａＩ−ジａｌｌ断片の、２個
の断片として単離された。以ａｍＨＩ−災ａｃＩ！（平
滑末端化）断片、比匹■−ジ鮭Ｉ断片およびＳａｌＩ−
ＢａｍＨＩ断片を３成分ライゲーンヨンし、ｐＣＩＳＲ
Ｘを得た。

実施例９　ブロレラキシンの発現 ２個のレラキシン発現ベク９−１ｐｃ　Ｉ　ＨＲＸおよ
びｐｃｌｓＲＸの発現能を、数種の抗しラキシン抗体を
用い、前記のイムノパーオキシダーゼ法で検定した。３
種のウサギポリクローナル抗体および３種のマウスモノ
クローナル抗体を、ｐＳＶＥＲＸでトランスフェクトし
たＣＯ８細胞で試験した。１つのモノクローナル、ＲＸ
−ｒはバックグラウンドを全く伴わずに強いくセ色を与
えることがわかった。

本発明の２個のベクター、ｐｃＩＨＲＸおよびｐＣＩＳ
ＲＸをプロレラキシンの発現について試験し、ｐＳＶＥ
ＲＸと比較した。ｐｃＩＨＲＸおよびｐＣＩＳＲＸベク
ターは、ポリアデニル化配列が異なっている。ｐｃＩＨ
ＲＸは肝炎表面抗原ポリアデニル化配列を含有していた
が、ｐｃＴｓＲＸはＳＶ４０初期領域ポリアデニル化配
列を含有していた。

２９３、ＴＭ４およびＣＨＯ細胞を、ｐＲ３Ｖｎｅｏ　
１μ９、サケ精子担体５μ９、およびプラスミド、ｐｓ
ＶＥＲＸ、ｐｃ　Ｉ　ＨＲＸおよびｐｃ　Ｉ　ＳＲＸ　
４μ９を含有している総ＤＮＡ　１０μ９でトランスフ
ェクトした。細胞に、前記の如くにしてグリセロールシ
ョックを与えた。トランスフェクションから３６時間後
、細胞を固定し、Ｉ　Ｈ６で染色して、プロレラキシン
を産生じている形質転換細胞を調べた。ポジティブな染
色細胞は、ｐＣＩＨＲＸおよびｐＣＩＳＲＸで形質転換
した２９３およびＴＭ４細胞に見られた。プロレラキ／
ン産生細胞をスクリーニングするために、複製（ｄｕｐ
ｌｉｃａｔｅ）プレートのＣＨＯ，２９３および７Ｍ４
細胞を分割し、前記の染色プロトコールに付した。

発現結果は以下の表に示され、これから、プロレラキシ
ンをコードしているＤＮＡの５′に安定化配列を含有し
ているベクターは参照プラスミドであるｐＳＶＥＲＸよ
り有意に高いレベルのプロレラキシンを産生ずることが
わかる。安定な発現の場合、プロレラキシンの培地の検
定は細胞の総数に基づいた。

プロレラキシンの一時発現 細胞型　プラスミド　タンパクのｆｉｔ（ｎｇ／ｍ１）
ＣＨＯｐＳＶＥＲＸ　　　　　　　Ｏ，４ｐｃ［ＨＲＸ
　　　　　　　０．９ ｐｃＩｓＲＸ　　　　　　　３ ７Ｍ４　　ｐＳＶＥＲＸ　　　　　　　Ｏ，４ｐｃＩＨ
ＲＸ　　　　　　　２ ｐｃＩｓＲＸ　　　　　　１０ ２９３　　ｐＳＶＥＲＸ　　　　　　　Ｑ、４ｐｃＩＨ
ＲＸ　　　　　１００ ｐｃＩｓＲＸ　　　　　’２００ 実施例ＩＱｔ−ＰＡ発現ベクター １、ｐＣＩＨｔ−ＰＡ サイトメガロウィルスのエンハンサ−及びプロモーター
、サイトメガロウィルスのスプライス供与部位およびイ
ントロン、１ｇ可変領域のスプライス受容部位、ｔ−Ｐ
ＡをコードしているｃＤＮＡ（ペニカ等（Ｐｅｎｎｉｃ
ａ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）−ジ
」」４．２１４（１９８３））、および肝炎表面抗原ポ
リアデニル化および転写終止部位を含有しているベクタ
ー、ｐＣＩＨｔ−ＰＡを構築した。

第９図は、ｔ−ＰＡベクター構築のための工程を示す。

先ず、ｔ−ＰＡｃＤＮＡをｐＭＬにクローニングし、遺
伝子の５“末端にＣｌａＩ部位を得た。これを行なうた
めに、ｐＳ　Ｖｐａ−ＤＨＦ　Ｒ（または、英国特許第
２，１１９，８０４Ｂ号ではｐＥＴＰＦＲと呼ばれる）
由来の３２３８　ｂｐＨ１ｎｄｌｌｌ断片をｐＭＬのＨ
ｉｎｄ［１部位に挿入した。その５゛末端がＣｌａｌ部
位に並列しているｃＤＮＡを有するクローンについて、
コロニーをスクリーニングした。中間体プラスミド、ｐ
ｃＬＡｔ−ＰＡと表示、を第９図に示す。３′ポリアデ
ニル化領域が後続するｔ−ｐＡｃＤＮＡを２８７０ｂｐ
のＣ１ａｌ−Ｋｐｎｒ断片として単離した。この断片を
ｐＦ８ＣＩＳの５１４６ｂｐ断片にライゲートした。Ｃ
ＸＳベクターのこのｑ田１−に門１断片は、５°調節領
域、５Ｖ４０−ＤＨＦＲ転写ユニット、アンピシリンｋ
ｌ　性遺伝子およびｐＭ！−由来の調製起源領域を与え
た。ｐＣｌｌ−１ｔ−ＰＡは、所望のヘテロローガスな
遺伝子をコードしているｃＤＮＡ以外は上記のｐｃＩＨ
ＲＸに類似している。

ＣＨＯおよび２９３細胞をｐＳ　ＶｐａＤ　ＨＦ　Ｒ，
ｐＣＭ　Ｖ　ｔ　−Ｐ　ｋおよびｐｃＨＴＬ−ＰＡでト
ー１＋７スフエクトし、ｔ−ＰＡの発現レベルを比較し
た。

前者２ベクターは安定化配列を含有しておらず、本発明
に従って構築されたｔ−ＰＡをコードしているｃＤＮＡ
を含有するベクター、ｐｃＩＨｔ−ＰＡの対照としては
たらいた。培養された各形質転換２９３細胞からの培地
を検定し、以下の結果を得た：　ｐＳＶｐａＤＨＦＲか
ら３０　ｎｇ／ｍｌ　；　ｐＣＭＶｔ−ＰＡから２００
ｎｇ／ｍｌ　；およびｐｃＩＨｔ−ＰＡから４２０ｎｇ
／ｍｌのｔ−ＰＡを得た。

２、ｐｃ　Ｉ　５ｔ−ＰＡ サイトメガロウィルスエンハンサ−およびプロモーター
、サイトメガロウィルススプライス供与部位およびイン
トロン、ｒｇ可変領域スプライス受容部位、ｔ−ＰＡを
コードしているｃＤＮＡおよびｐｓＶ４０ポリアデニル
化配列を含有しているベクター、ｐｃｌｓｔ−ＰＡを構
築した。

この構築のための出発ベクターはｐｃＩＨｔ−ＰＡおよ
びｐＦ３ｃｌｓである（第１３図参照）。後者のベクタ
ーはｐｃＩＨＬ　　ＰＡと同じ５°調節配列を有してい
るが、第■因子のｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル
化部位を含有している。Ｓａｃ■を使用してｔ−ＰＡ　
ｃＤＮＡの３°を切断した。

得られた３°突出末端をＴ４ポリメラーセによって平滑
末端化だ。次いで、ｐＣＴＨｔ−ＰＡをＣ１ａ■で切断
した。この部位はｔ−ＰＡの５゛末端からキメライント
ロンを分離する。Ｃ１ａｌ処理物から２８７０ｂｐ断片
をゲルによって単離した。ＳＶ４０ポリアデニル化部位
、ＤＨＦＲ，転写調節部位、細菌の複製起源およびａｍ
ｐｒ遺伝子、並びにＣＭＶエンハンサ−およびプロモー
ターおよびスプライス供与部位をｐＦ８ｃＩｓから単離
した。これらの要素は、２５２５ｂｐ刈Ｉ−ＣハＩ断片
および３１１３Ｈｐａｌ−３ａｌｌ断片として単離され
た。

ジ肥■（プラント）−免ハＩ断片、比匹Ｉ−ジ１■断片
およびＳ　ａｌ　Ｉ　　Ｃｌａ　Ｉ断片の３成分ライゲ
ーンヨンによってｐｃｌｓｔ−ＰＡを得る。

２９３およびＣＨＯ細胞をｐｃＩＨｔ−ＰＡおよびｐｃ
ｌｓｔ−ＰＡで形質転換することによって、ｔ−ＰＡの
発現レベルを比較した。培養した各形質転換細胞からの
培地を検定し、以下の結果を得たニ 一時発現（ｔ　−Ｐ　Ａ　ｎｇ／　ｍｌ）ＣＨＯＣＩＳ
　　　　５５ ＣＩＨ１５ ２９３ＣＩＳ　　　３０００ ＣＩＨ１３００ 実施例１１　タンパク産生レベルの一時発現ＣＭＶで指
令されるＣＡＴベクターによって２９３細胞中で、高レ
ベルのＣＡＴ活性が産生されたので、本発明者等はトラ
ンスフエクンヨンから数日内に有用な量の所望のヘテロ
ローガスなタンパクを得るために、この系を使用した。

２個のパラメーターを使用してタンパク産生の一時レベ
ルを操作した。複製を増大させることによって、２９３
および２９３Ｓ細胞におけるプラスミドコピー数を増加
させた。これらの細胞中で、所望のタンパクをコードし
ているメツセージの翻訳を増大させるために、アデノウ
ィルスＶＡ　ＲＮＡ遺伝子、翻訳調節エフェクターを使
用したくシンマバヤ等（Ｔ　ｈｉｍｍａｐｐａｙａ、　
Ｂ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、前掲、１９８２）。

Ｃｏ５７細胞およびＣＶ１細胞における発現データに基
き、コピー数を増大させることにより発現を増大させる
ために実験を行なった。５Ｖ４Ｑ複製起源含有プラスミ
ドは２９３細胞中で高コピー数に複製することが知られ
ている。（レポコウスキー等（Ｌｅｂｏｋｏｗｓｋｉ、
　Ｊ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）３１７．　１６９（１９８５））：（ルイスおよび
マンレイ（Ｌｅｗｉｓ、　Ｅ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｍａｎ
ｌｅｙ。

Ｊ、、　　ネイチャ　（Ｎａｔｕｒｅ）３１７，１７２
（１９８５戸。２９３細胞における５Ｖ４Ｑベクターの
複製の間、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターから非常に僅かの
転写が起こる。本発明者等は、２９３細胞中で有用な複
製発現系を導くように複製および転写の調節部位を分離
し得るか否かを調べた。その結果、本発明者等は、ＳＶ
４０初期プロモーターを用いて、転写と複製とが組み合
わせられている時には転写が起こらず、非常にわずかの
タンパクしか検出されないということを確認した。使用
されるエンハンサ−に関係なく、ＳＶ４０プロモーター
起源領域を使用するベクターについて、これは真実であ
った。ｐＲ３ＶＴｓとコトランスフエクトした時、上記
の５Ｖ４０−３Ｖ４０ベクターもＣＭＶ−３Ｖ４Ｑベク
ターも測定し得るレヘルのタンパクを産生じなかった。

これらのコトランスフェクションでは、非常に高いプラ
スミドコピー数が容易に達成されたが、タンパクを発現
しなかった。しかしなから、ベクター、ｐｃＩｓｈＧＨ
またはｐｃ　Ｉ　Ｓ　５ｈＧＨにおける如く、転写の部
位から５Ｖ４Ｑ複製起源を分離した時、プラスミドコピ
ーは増加し、ｈＧＨの発現は容易に検出された。

第５表は複製を伴うか伴わないＣＶＩおよび２９３細胞
におけるｈＧＨの発現の比較を示す。これらのデータは
トランスフヱクション後数日で高レベルのｈＧＨタンパ
クが産生されたことを示す。

３白目までに、２９３細胞の培地中に１０−１５マイク
ログラム／ｍｌのｈＧＨが発現される。この実験ではＴ
抗原の存在下での発現の時間的経過および上限は少し異
なるが、これらの高レベルのタンパク産生は２９３細胞
における複製に依存しない。ＣＶＩ細胞では、得られる
ｈＧＨの最も高い力価は２マイクログラム／＋ｎｌであ
り、この発現レベルはＴ抗原に依存する複製に関連する
。２９３細胞から製せられたハート（Ｈ１ｒｔ）抽出Ｄ
ＮＡのサザーンプロットの分析は、プラスミドＤＮＡの
量は複製のために非常に増加したことを示す。しかしな
から、高レベルのタンパク産生は、このコピー数の増加
に伴って増加したのではなく、変化がないように見える
。

第５表　Ｔ抗原同時形質転換による発現の比較紳ｊνＷ
　　旦　　　　　−Ｔ　　　　　　　＋ＴＣＶＩ　　　
１　　　　２５０　　　　５０’０３　　　１５０　　
．３００ ２９３ｓ　　　Ｌ　　　　　３２０　　　　４６０第５
表において、ｈＧＨレベルはＩ　ＲＭＡで検定したナノ
グラム／ｍｌで表わされている。これらのデータを得る
ために、１００ｍｍデイツシュを１０マイクログラムの
ｐｃｒｓｈｃＨでトランスフェクトした。細胞を１０ｍ
１の培地に維持し、検定のために１００マイクロリツト
ルずつを採取した。

２９３細胞が、転写され得る量のＤＮＡで飽和されたか
否かを調べるために、実験を行った。本発明のベクター
でトランスフェクトされたＤＮＡの安定性の増大は、Ｄ
ＮＡ飽和を意味している。

種々の細胞型で、トランスフェクション効率を満たすの
に必要な総ＤＮＡの量を調べた。本明細書記載の全ての
細胞系統は、至適発現のために１０マイクログラム／ｍ
ｌの総ＤＮＡの沈澱を必要とした。２９３および２９３
ｓ細胞は、トランスフェクションを成功させるために必
要なりＮＡの基本的なレベルにおいて、その他の細胞型
と異なっていなかった。しかしながら、ｈＧＨ産生を満
たすためには、この１０マイクログラム／ｍｌのうちの
少量がｈＧＨ特異的ＤＮＡであることだけが必要とされ
る。第６表は２９３ｓ細胞が、合計１０マイクログラム
の内わずか０．６マイクログラムのみがｐｃｒｓｈＧＨ
ベクターであるものでトランスフェクトされた場合に、
高レベルのｈＧＨが産生されるということを示している
。このレベルのＤＮＡでは、トランスフェクションから
２日後に４゜５マイクログラム／ｌｌ１ｌのｈＧＨが分
泌された。２９３細胞では挿入されたＤＮＡが非常に安
定なので、発現レベルを飽和状態に持続しておくために
は、比較的僅かのＤＮＡでよい。

ｉ６人　ｈＧＨの発現レベルに対するＤＮＡ濃度の影響 ＤＮＡの量（マイクログラム） ０．２　　　０．６　　　　１　　　　５　　　１０第
１日　　９ｇ　　　２００　　２８０　　４６０　１３
８０第２日　６９０　　４２００　　５１００　　５６
００　４５００第６表において、ｈＧＨレベルはナノグ
ラム／ｍｌである。２９３または２９３ｓの１００ｍｍ
デイツシュを総ＤＮＡ１０マイクログラムの一定量で形
質転換した。ｐｃＩｓｈＧＩｒの量は示される如く、種
々である；１０マイクログラムを完全に行うためのキャ
リヤーとしてｐＵｃ１９ＤＮＡを使用した。

アデノウィルスのＶＡ　ＲＮＡ遺伝子で同時形質転換す
ることによって一時的に産生されるタンパクの量を増加
させるための実験を行なった。−時的なトランスフェク
ション、特に２９３細胞においては、−時的に生成され
るＲＮＡの翻訳は、これらの遺伝子の付加によって促進
され得ることがわかった。本発明者等は、第７表に、Ｖ
Ａ　ＲＮＡ遺伝子の付加によって実際にｈＧＨレベルが
１０マイクログラム／ｉｔから１９マイクログラム／ｍ
ｌに高められることを示す。この発現レベルを達成する
ために必要なＶＡ　ＲＮＡ　ＤＮＡの至適量は、５マイ
クログラム／ｍｌ沈澱であった。ＶＡＲＮＡ遺伝子の同
時形質転換によって見られるｈＧＨ発現の上限は、Ｔ抗
原の存在下で産生されるｈＧＨの最も高いレベルと同等
である。Ｔ抗原およびＶＡ　ＲＮＡ遺伝子の作用が相加
的でないことがわかったのは興味深い。この−時的な系
によって産生されるタンパクの量はトランスフェクショ
ンの数日後に突然変異タンパクの検定を行うのに充分で
ある。第７表かられかる様に、第■因子変異体およびｔ
−ＰＡについて、同様の実験を行なった。

鼻り嚢　発現に対するＶＡ　ＲＮＡの効果＋ＶＡ　ＲＮ
Ａ　　　　　１５０　　　５００　　２０００ｔＰＡ　
　　　　　　　　　　　　２００　　　　６００＋ＶＡ
　ＲＮＡ　　　　　６００　　１２００ｈＧ　Ｈ１００
００５６００ ＋ＶＡ　　ＲＮＡ　　　　　　１９０００　　　１２０
００る。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＦ８ｃＩｓの構築模式図、第２図はｐＦ８３
ＣＩＳの構築模式図、第３図（Ａ）はｐＦ８ＣＩＳによ
るトランスフェクションＬ　（Ｂ）はｐＦ８ＳＣＩＳに
よるトランスフェクション後のイムノパーオキシダーゼ
染色の結果の写真の模写図、第４図はｐＦ８ＣＩｓ９０
８０の構築模式図、第５図はｐＦ８ＣＩＳ３３６Ｅの構
築模式図、第６図はｐＦ　８９０８０３３６　Ｅの構築
模式図、第７図はｐｃＩＨＲｘの構築模式図、第８図は
ｐＣｒ　ｓＲＸの構築模式図、第９図はｐＣＩＨｔＰ’
Ａの構築模式図、第１０図は、ｐＦ８ｃＩｓの部分配列
式の模式図、第１１図は、ｐＦ８３ｃＩｓの部分配列式
の模式図、第１２図は、ｐＦ３Ｃ３ＳＳの部分配列式の
模式図、第１３図は、ｐｃｒｓｔＰＡの構築模式図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核性宿主細胞内で所望のヘテロローガスタンパク
   質を生産する方法であって、 ａ）トランス−活性化タンパク質をコードするベクター
   で真核性宿主細胞をトランスフェクトし、ｂ）以下の要
   素： １）プロモーターの下流にあり、所望のヘテロローガス
   タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの上流に
   ある安定化配列、 ２）該安定化配列の下流にある、所望のタンパク質のア
   ミノ酸配列をコードしているＤＮＡ、および、 ３）その下流が転写終止部位であるポリアデニル化配列
   をコードしているＤＮＡ を含有する二本鎖ＤＮＡ配列を有する発現ベクターで真
   核性宿主細胞をトランスフェクトし、ｃ）トランスフェ
   クトされた真核性宿主細胞を所望のタンパク質の生産に
   好適な条件下で培養し、さらに ｄ）トランスフェクションから約１日〜約１４日の間に
   所望のタンパク質を回収することからなる方法。 ２、トランス−活性化タンパク質がＥｌｂである請求項
   １記載の方法。 ３、トランス−活性化タンパク質がＴ抗原である請求項
   １記載の方法。 ４、トランス−活性化タンパク質がＥｌａである請求項
   １記載の方法。 ５、トランス−活性化タンパク質がＥｌａおよびＥｌｂ
   である請求項１記載の方法。 ６、トランス−活性化タンパク質がＥｌｂおよびＴ抗原
   である請求項１記載の方法。 ７、プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスの前初
   期遺伝子由来のプロモーターである請求項１記載の方法
   。 ８、プロモーターがシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）
   由来のプロモーターである請求項１記載の方法。 ９、プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由
   来のプロモーターである請求項１記載の方法。 １０、発現ベクターがエンハンサーを含有している請求
   項７記載の方法。 １１、エンハンサーがプロモーターの上流に位置してい
   る請求項１０記載の方法。 １２、エンハンサーがヒトサイトメガロウイルスの前初
   期遺伝子由来のエンハンサーである請求項１０記載の方
   法。 １３、発現ベクターがエンハンサーを含有している請求
   項８記載の方法。 １４、エンハンサーがプロモーターの上流に位置してい
   る請求項１３記載の方法。 １５、エンハンサーがシミアンウイルス（ＳＶ４０）由
   来のエンハンサーである請求項１３記載の方法。 １６、発現ベクターがエンハンサーを含有している請求
   項９記載の方法。 １７、エンハンサーがプロモーターの上流に位置してい
   る請求項１６記載の方法。 １８、エンハンサーがラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由
   来のエンハンサーである請求項１７記載の方法。 １９、トランス−活性化タンパク質がＥ１ｂである請求
   項１２記載の方法。 ２０、トランス−活性化タンパク質がＥ１ａである請求
   項１２記載の方法。 ２１、トランス−活性化タンパク質がＥ１ｂおよびＥ１
   ａである請求項１２記載の方法。 ２２、トランス−活性化タンパク質がＥ１ｂおよびＴ抗
   原である請求項１２記載の方法。 ２３、翻訳調節エフェクターを生産するベクターで真核
   性宿主細胞をトランスフェクトする工程をも含む請求項
   １記載の方法。 ２４、翻訳調節エフェクターがＶＡ　ＲＮＡである請求
   項２４記載の翻訳調節。 ２５、真核性宿主細胞が、内因性のトランス−活性化タ
   ンパク質を生産するよう、既に形質転換されているもの
   である請求項１記載の方法。 ２６、真核性宿主細胞がヒト胚腎細胞（２９３）である
   請求項１記載の方法。 ２７、真核性宿主細胞がＪＷ２である請求項１記載の方
   法。 ２８、真核性宿主細胞内で所望のヘテロローガスタンパ
   ク質を生産する方法であって、 ａ）トランス−活性化タンパク質をコードするベクター
   で真核性宿主細胞をトランスフェクトし、ｂ）以下の要
   素： １）プロモーターの下流にあり、所望のヘ テロローガスタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡの上流にある安定化配列、 ２）該安定化配列の下流にある所望のタンパク質のアミ
   ノ酸配列をコードしているＤＮＡ、および、 ３）その下流が転写終止部位であるポリアデニル化配列
   をコードしているＤＮＡ を含有する二本鎖ＤＮＡ配列を有する発現ベクターで真
   核性宿主細胞をトランスフェクトすることからなる方法
   。 ２９、請求項２９記載の方法で形質転換された宿主細胞
   。 ３０、ヒト胚腎細胞（２９３）である請求項３０記載の
   宿主細胞。 ３１、ＪＷ２である請求項３０記載の宿主細胞。