ES2282994T3 - Procedimiento para la seleccion de celulas huesped de expresion elevada. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO DE SELECCION DE CELULAS HUESPED RECOMBINANTES, QUE EXPRESAN ALTOS NIVELES DE UNA PROTEINA DESEADA. DICHO METODO UTILIZA CELULAS HUESPED EUCARIOTICAS, QUE ALBERGAN UNA ESTRUCTURA DE ADN QUE COMPRENDE UN GEN SELECCIONABLE (PREFERIBLEMENTE UN GEN AMPLIFICABLE) Y UN GEN DE PRODUCTO SITUADO EN DIRECCION 3''RESPECTO AL GEN SELECCIONABLE. EL GEN SELECCIONABLE SE SITUA EN UN INTRON DEFINIDO POR UN SITIO DONADOR DE EMPALME Y UN SITIO ACEPTOR DE EMPALME, Y DICHO GEN Y EL PROODUCTO, ESTAN SOMETIDOS AL CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE UNA UNICA REGION REGULADORA DE LA TRANSCRIPCION. EL SITIO DONADOR DE EMPALME ES, GNERALMENTE, UN SITIO DONADOR DE EMPALME EFICIENTE, Y POR TANTO, REGULA LA EXPRESION DEL GEN DE PRODUCTO, UTILIZANDO LA REGION REGULADORA DE LA TRANSCRIPCION. LAS CELULAS TRANSFORMADAS SE CULTIVAN, DE FORMA QUE EXPRESEN EL GEN QUE CODIFICA PARA EL PRODUCTO, EN UN MEDIO SELECTIVO QUE CONTIENE UN AGENTE AMPLIFICADOR, DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTE PARA PERMITIR QUE SE PRODUZCA LA AMPLIFICACION, A CONSECUENCIA DE LO CUAL, BIEN SE RECUPERA EL PRODUCTO DESEADO, O BIEN SE IDENTIFICAN LAS CELULAS QUE TIENEN MULTIPLES COPIAS DEL GEN DE PRODUCTO.

Description

Procedimiento para la selección de células huésped de expresión elevada.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de elección de células huésped de expresión elevada, a un procedimiento de producción de una proteína de interés a elevados rendimientos y a un procedimiento de producción de células eucarióticas que presentan copias múltiples de una secuencia codificante de una proteína de interés.

Descripción de los antecedentes y técnica relacionada

El descubrimiento de procedimientos para introducir ADN en células huésped vivas en una forma funcional ha proporcionado la clave para la compresión de muchos procesos biológicos fundamentales, y ha hecho posible la producción de proteínas importantes y otras moléculas en cantidades comercialmente útiles.

A pesar del éxito general de estos procedimientos de transferencia génica, existen varios problemas frecuentes que podrían limitar la eficacia con la que puede introducirse un gen codificante de una proteína deseada en una célula huésped y expresarse en la misma. Un problema es llegar a conocer cuándo se ha transferido con éxito el gen hasta el interior de las células receptoras. Un segundo problema es distinguir entre aquellas células que contienen el gen y aquéllas que han sobrevivido a los procedimientos de transferencia pero que no contienen el gen. Un tercer problema es identificar y aislar aquéllas células que contienen el gen y que expresan niveles elevados de la proteína codificada por el gen.

En general, los procedimientos conocidos para introducir genes en células eucarióticas tienden a ser altamente ineficientes. De las células en un cultivo dado, sólo una proporción reducida incorpora y expresa ADN añadido exógenamente, y una proporción incluso menor mantiene establemente ese ADN.

La identificación de aquellas células que han incorporado un gen de producto codificante de una proteína deseada típicamente se consigue introduciendo en las mismas células otro gen, con frecuencia denominado gen seleccionable, que codifica un marcador seleccionable. Un marcador seleccionable es una proteína que resulta necesaria para el crecimiento o supervivencia de una célula huésped bajo las condiciones de cultivo particulares seleccionadas, tal como un enzima que proporciona resistencia a un antibiótico o a otro fármaco, o un enzima que compensa un defecto metabólico o catabólico en la célula huésped. Por ejemplo, entre los genes seleccionables utilizados con frecuencia en las células eucarióticas se incluyen los genes de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), la higromicina fosfotransferasa (hyg), dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (tk), neomicina, puromicina, glutamina sintetasa y asparagina sintetasa.

El procedimiento de identificación de una célula huésped que ha incorporado un gen, basado en la expresión por la célula huésped de un segundo gen incorporado codificante de un marcador seleccionable se denomina cotransfectación (o contransfección). En este procedimiento se introducen típicamente un gen codificante de un polipéptido deseado y un gen de selección en la célula huésped simultáneamente, aunque pueden introducirse secuencialmente. En el caso de la cotransfección simultánea, el gen codificante del polipéptido deseado y el gen seleccionable pueden encontrarse presentes en una sola molécula de ADN o en moléculas de ADN separadas antes de su introducción en las células huésped (Wigler et al., Cell 16:777, 1979). Las células que han incorporado el gen codificante del polipéptido deseado seguidamente se identifican o se aíslan cultivando las células bajo condiciones que permiten preferentemente el crecimiento o la supervivencia de aquellas células que sintetizan el marcador seleccionable codificado por el gen seleccionable.

El nivel de expresión de un gen introducido en una célula huésped eucariótica depende de múltiples factores, incluyendo el número de copia del gen, la eficiencia de transcripción, el procesamiento, estabilidad y eficiencia de traducción del ARN mensajero (ARNm). Por consiguiente, un nivel elevado de expresión de un polipéptido deseado típicamente implicará optimizar uno o más de esos factores.

Por ejemplo, el nivel de producción de proteína puede incrementarse uniendo covalentemente la secuencia codificante del gen a un promotor o intensificador "fuerte" que proporcionará niveles elevados de transcripción. Los promotores e intensificadores son secuencias de nucleótidos que interaccionan específicamente con proteínas en una célula huésped que se encuentran implicadas en la transcripción (Kriegler, Meth. Enzymol. 185:512, 1990; Maniatis et al., Science 236:1237, 1987). Los promotores se encuentran situados corriente arriba de la secuencia codificante de un gen y facilitan la transcripción del gen por la ARN polimerasa. Entre los promotores eucarióticos que han sido identificados como promotores fuertes para la expresión de nivel elevado se encuentran el promotor temprano de SV40, el promotor tardío mayor de adenovirus, el promotor de la metalotioneína-I de ratón, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous y el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV).

Los intensificadores estimulan la transcripción desde un promotor ligado. Al contrario que los promotores, los intensificadores se encuentran activos cuando se sitúan corriente abajo del sitio de inicio de transcripción o a distancias considerables del promotor, aunque en la práctica los intensificadores pueden solaparse física y funcionalmente con los promotores. Por ejemplo, todos los promotores fuertes indicados anteriormente también contienen intensificadores fuertes (Bendig, Genetic Engineering 7:91, Academic Press, 1988).

El nivel de producción de proteínas también puede incrementarse, incrementando el número de copia génica en la célula huésped. Un procedimiento para obtener un número de copia génica elevado es introducir directamente en la célula huésped múltiples copias del gen, por ejemplo utilizando un exceso molar elevado del gen de producto respecto al gen seleccionable durante la cotransfección (Kaufman, Meth. Enzymol. 185:537, 1990). Sin embargo, con este procedimiento, sólo una proporción reducida de las células cotransfectadas contendrá el gen de producto en un número de copia elevado. Además, debido a que no existe ningún procedimiento conveniente de aplicación general para distinguir estas células de las mayoría de las células que contienen menos copias del gen de producto, típicamente resultan necesarios procedimientos de cribado laboriosos y que requieren mucho tiempo para identificar los transfectantes deseados de elevado número de copia.

Otro procedimiento para obtener un número de copia elevado implica clonar el gen en un vector que sea capaz de replicarse autónomamente en la célula huésped. Entre los ejemplos de estos vectores se incluyen vectores de expresión de mamífero derivados de virus de Epstein-Barr o virus del papiloma bovino, y vectores plásmido de 2 micrómetros de levadura (Stephens y Hentschel, Biochem. J. 248:1, 1987; Yates et al., Nature 313:812, 1985; Beggs, Genetic Engineering 2:175, Academic Press, 1981).

Todavía otro procedimiento para obtener un número de copia génica elevado implica la amplificación génica en la célula huésped. La amplificación génica se produce naturalmente en las células eucarióticas a una frecuencia relativamente reducida (Schimke, J. Biol. Chem. 263:5989, 1988). Sin embargo, la amplificación génica también puede inducirse, o por lo menos seleccionarse, mediante la exposición de las células huésped a una presión selectiva apropiada. Por ejemplo, en muchos casos resulta posible introducir un gen de producto junto con un gen amplificable en una célula huésped y posteriormente seleccionar para la amplificación del gen marcador mediante la exposición de las células cotransfectadas a concentraciones secuencialmente crecientes de un agente selectivo. Típicamente el gen de producto se coamplifica con el gen marcador bajo estas condiciones.

El gen amplificable más ampliamente utilizada para este fin es un gen DHFR, que codifica un enzima dihidrofolato reductasa. El agente de selección utilizado conjuntamente con un gen DHFR es el metotrexato (Mtx). Se cotransfecta una célula huésped con un gen de producto codificante de una proteína deseada y un gen DHFR, y los transfectantes se identifican cultivando en primer lugar las células en medio de cultivo que contiene Mtx. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza un gen DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub y Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. A continuación, las células transfectadas se exponen a cantidades sucesivamente más elevadas de Mtx. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR, y concomitantemente, de múltiples copias del gen de producto (Schimke, J. Biol. Chem. 263:5989, 1988; Axel et al., patente US nº 4.399.216; Axel et al., patente US nº 4.634.665. Entre otras referencias dirigidas a la cotransfección de un gen conjuntamente con un marcador genético que permite la selección y posterior amplificación se incluyen Kaufmann, en Genetic Engineering, editor J. Setlow (Plenum Press, New York), vol. 9, 1987; Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159:601, 1982; Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:165-175, 1981; Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5:1750-1759, 1985; Kaetzel y Nilson, J. Biol. Chem. 263:6244-6251, 1988; Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:261-264, 1986; Kaufman et al., EMBO J. 6:87-93, 1987; Johnston y Kucey, Science 242:1551-1554, 1988; Urlaub et al., Cell 33:405-412, 1983.

Para extender el procedimiento de amplificación de DHFR a otros tipos celulares, puede utilizarse un gen DHFR mutante que codifica una proteína con sensibilidad reducida al metotrexato, conjuntamente con células huésped que contienen un número normal de un gen DHFR de tipo salvaje endógeno (Simonsen y Levinson, Proc. Natl. ACad. Sci. USA 80:2495, 1983; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570, 1980; Haber y Schimke, Somatic Cell Genetics 8:499-508, 1982.

Alternativamente, pueden cotransfectarse células huésped con el gen de producto, un gen DHFR, y un gen seleccionable dominante, tal como un gen neo^{r} (Kim y Wold, Cell 42:129, 1985; Capon et al., patente US nº 4.965.199. Los transfectantes se identifican en primer lugar cultivando las células en medio de cultivo que contiene neomicina (o el fármaco relacionado G418) y los transfectantes identificados de esta manera seguidamente se seleccionan para la amplificación del gen DHFR y del gen de producto mediante la exposición a cantidades sucesivamente crecientes de Mtx.

Tal como se apreciará del presente comentario, la selección de células huésped recombinantes que expresan niveles elevados de una proteína deseada es un procedimiento multietapa. En la primera etapa, se seleccionan los transfectantes iniciales que han incorporado el gen de producto y el gen seleccionable. En etapas posteriores, los transfectantes iniciales se someten a selección adicional para la expresión de nivel elevado del gen seleccionable y después a cribado aleatorio para la expresión de nivel elevado del gen de producto. Para identificar las células que expresan niveles elevados de la proteína deseada, típicamente debe cribarse un gran número de transfectantes. La mayoría de los transfectantes produce niveles no máximos de la proteína deseada. Además, la resistencia a Mtx de los transformantes de DHFR la proporciona, por lo menos parcialmente, grados diversos de amplificación génica (Schimke, Cell 37:705-713, 1984). Los problemas ocasionados por la coexpresión del gen no seleccionada han sido informados por Wold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5684-5688, 1979. La inestabilidad del ADN amplificado ha sido informada por Kaufman y Schimke, Mol. Cell Biol. 1:1069-1076, 1981; Haber y Schimke, Cell 26:355-362, 1981; y Fedespiel et al., J. Biol. Chem. 259:9127-9140, 1984.

Se han descrito varios procedimientos para seleccionar directamente dichas células huésped recombinantes en una sola etapa. Una estrategia implica cotransfectar células huésped con un en de producto y un gen DHFR, y seleccionar aquellas células que expresan niveles elevados de DHFR mediante cultivo directo en medio que contiene una concentración elevada de Mtx. Muchas de las células expresadas de esta manera también expresan el gen de producto cotransfectado a niveles elevados (Page y Sydenham, Bio/Technology 9:64, 1991. Este procedimiento de selección en una sola etapa adolece de determinadas desventajas que limitan su utilidad. Las células de expresión elevada obtenidas mediante cultivo directo en medio que contiene un nivel elevado de un agente de selección pueden presentar características de crecimiento y estabilidad pobres, limitando de esta manera su utilidad para los procedimientos de producción de largo plazo (Page y Snyderman, Bio/Technology 9:64, 1991). La selección en una sola etapa para la resistencia de nivel elevado al Mtx puede producir células con un enzima DHFR resistente a Mtx alterado, o células que presentan propiedades de transporte de Mtx alteradas, y no células que contienen genes amplificados (Haber et al., J. Biol. Chem. 256:9501, 1981; Assaraf y Schimke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7154, 1987).

Otro procedimiento implica la utilización de vectores de expresión de ARNm policistrónico que contienen un gen de producto en el extremo 5' de la región transcrita y un gen seleccionable en el extremo 3'. Debido a que la traducción del gen seleccionable en el extremo 3' del ARN policistrónico es ineficiente, estos vectores manifiestan una traducción preferente del gen de producto y requieren niveles elevados de ARNm policistrónico para sobrevivir a la selección (Kaufman, Meth. Enzymol. 185:487, 1990; Kaufman, Meth. Enzymol. 185:53, 1990; Kaufman et al., EMBO J. 6:187, 1987). Por consiguiente, las células que expresan niveles elevados del producto proteína deseado pueden obtenerse en una sola etapa mediante el cultivo de los transfectantes iniciales en medio que contiene un agente de selección de utilización apropiada con el gen seleccionable particular. Sin embargo, la utilidad de estos vectores es variable debido a la influencia impredecible del marco de lectura del producto corriente arriba sobre la traducción del marcador seleccionable y debido a que el marco de lectura corriente arriba en ocasiones resulta delecionado durante la amplificación con metotrexato (Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982; Levinson, Methods in Enzymology, San Diego: Academic Press, Inc., 1990). Los vectores posteriores incorporaron un sitio interno de inicio de traducción derivado de miembros de la familia de los picornavirus que se encuentra situado entre el gen de producto y el gen seleccionable (Pelletier et al., Nature 334:320, 1988; Jang et al., J. Virol. 63:1651, 1989).

Un tercer procedimiento para la selección en una sola etapa implica la utilización de un constructo de ADN con un gen seleccionable que contiene un intrón dentro del cual se encuentra situado un gen codificante de la proteína de interés (ver la patente US nº 5.043.270 y Abrams et al., J. Biol. Chem. 264(24):14016-14021, 1989). En todavía otro procedimiento de selección en una sola etapa, se cotransfectan las células huésped con un gen seleccionable de intrón modificado y con un gen codificante de la proteína de interés (ver la patente WO nº 92/17566, publicada el 15 de octubre de 1992). El gen de intrón modificado se prepara insertando en la región transcrita de un gen seleccionable un intrón de longitud suficiente para que el intrón resulte correctamente procesado a partir del precursor de ARNm correspondiente a eficiencia reducida, de manera que la cantidad de marcador seleccionable producido a partir del gen seleccionable de intrón modificado sea sustancialmente inferior a la producida a partir del gen seleccionable de partida. Estos vectores ayudan a garantizar la integridad del constructo de ADN integrado, aunque el ligamiento transcripcional no se consigue debido a que el gen seleccionable y el gen de proteína se encuentran controlados por promotores separados.

Se han descrito otros vectores de expresión de mamífero que presentan unidades de transcripción única. Se han construido vectores retrovíricos (Cepko et al., Cell 37:1053-1062, 1984) en los que se inserta un ADNc entre los sitios donador y aceptor de empalme del virus endógeno de leucemia murina de Moloney (M-MuLV) que se encuentran seguidos por un gen de resistencia a la neomicina. Este vector se ha utilizado para expresar una diversidad de productos génicos tras la infección retrovírica de varios tipos celulares.

Teniendo en cuenta las desventajas anteriormente indicadas, es un objetivo de la presente invención incrementar el nivel de homogeneidad con respecto a los niveles de expresión de los clones estables transfectados con un gen de producto de interés, mediante la expresión de un marcador seleccionable (DHFR) y la proteína de interés a partir de un solo promotor.

Es otro objetivo proporcionar un procedimiento para seleccionar células huésped recombinantes estables que expresan niveles elevados de un producto proteína deseado, procedimiento que resulte de realización rápida y conveniente, y que reduzca el número de células transfectadas que resulte necesario cribar. Además, es un objetivo que resulte posible generar con rapidez niveles elevados de polipéptidos de una y dos unidades a partir de clones o bancos de células huésped transfectantes.

Es un objetivo adicional proporcionar vectores de expresión con preferencia para sucesos de integración activa (es decir, presentan una tendencia incrementada a generar transformantes en los que el constructo de ADN se inserta en una región del genoma de la célula huésped que resulta en la expresión de nivel elevado del gen de producto) y que puedan acoger una diversidad de genes de producto sin necesidad de ser modificados.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un constructo de ADN (molécula de ADN) que comprende un sitio de inicio transcripcional y un sitio de terminación transcripcional, un gen seleccionable que es un gen amplificable y un gen de producto proporcionado en orientación 3' respecto al gen seleccionable, una región reguladora transcripcional que regula la transcripción de tanto el gen seleccionable y del gen de producto, el gen seleccionable situado dentro de un intrón definido por un sitio donador de empalme y un sitio aceptor de empalme. El sitio donador de empalme preferentemente comprende una secuencia donadora de empalme efectiva tal como se define en la presente invención, regulando de esta manera la expresión del gen de producto utilizando la región reguladora transcripcional.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir un producto de interés que comprende cultivar una célula eucariótica que ha sido transfectada con el constructo de ADN indicado anteriormente, de manera que se expresa el gen de producto y se recupera el producto.

En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para producir células eucarióticas que presentan múltiples copias del gen de producto, que comprende transfectar células eucarióticas con el constructo de ADN indicado anteriormente (en el que el gen seleccionable es un gen amplificable), cultivando las células en un medio selectivo que comprende un agente de amplificación durante un tiempo suficiente para que se produzca la amplificación, y seleccionar células que presentan múltiples copias del gen de producto. Preferentemente la transfección de las células se consigue utilizando la electroporación.

Tras la transfección de las células huésped, la mayoría de los transfectantes no llegan a mostrar el fenotipo seleccionable característico de la proteína codificada por el gen seleccionable, aunque inesperadamente una proporción reducida de los transfectantes sí manifiestan el fenotipo seleccionable, y entre esos transfectantes, la mayoría se observa que expresan niveles elevados del producto deseado codificado por el gen de producto. De esta manera, la invención proporciona un procedimiento mejorado para la selección de células huésped recombinantes que expresan niveles elevados de un producto deseado, procedimiento que resulta útil con una amplia diversidad de células huésped eucarióticas y evita los problemas inherentes a la tecnología existente de selección de células.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-1D ilustra esquemáticamente diversos constructos de ADN comprendidos dentro del alcance de la invención. Las flechas grandes representan el gen seleccionable y el gen de producto, la V formada por las líneas discontinuas muestra la región del ARN precursor interna al sitio donador de empalme 5' (SD) y el sitio aceptor de empalme 3' (SA) que se extrae de los vectores que contienen un SD funcional. La región reguladora transcripcional, gen seleccionable, gen de producto y sitio de terminación transcripcional se ilustran en la Figura 1A. La Figura 1B ilustra los constructos de ADN del Ejemplo 1. Se ilustran las diversas secuencias donadoras de empalme, es decir, la secuencia donador de empalme ras de tipo salvaje (ras WT), la secuencia donadora de empalme de ras mutante (ras MUTANTE) y la secuencia donadora de empalme no funcional (\ding{115}GT). Las sondas utilizadas para el análisis de transferencia northern en el Ejemplo 1 se muestran en la Figura 1B. La Figura 1C ilustra los constructos de ADN del Ejemplo 2, y la Figura 1D ilustra el constructo de ADN del Ejemplo 3 utilizado para la expresión de V_{H} anti-IgE.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente el constructo de ADN de control utilizado en el Ejemplo 1.

Las Figuras 3A-Q ilustran la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 1) del vector de expresión DHFR/intrón- (SD de ras WT)-tPA del Ejemplo 1.

La Figura 4 es un gráfico de columnas que muestra el número de colonias que se forman en medio selectivo tras la electroporación de ADNs miniprep linearizados por duplicado que se habían preparado a partir de tres vectores mostrados en la Figura 1B (es decir con secuencia donadora de empalme ras de tipo salvaje [ras WT], secuencia donadora de empalme ras mutante [ras MUTANTE] y secuencia donadora de empalme no funcional [\DeltaGT]) y del vector de control que presenta DHFR bajo control del promotor de SV40 y tPA bajo el control del promotor de CMV (ver la Figura 2). Las células se seleccionaron en medio libre de nucleósidos y se contaron con un contador automático de colonias.

Las Figuras 5A-C son gráficos de columnas que ilustran la expresión de tPA a partir de pools y clones estables generados a partir de los vectores mostrados en la Figura 1B. En la Figura 5A, se mezclaron más de 100 clones de cada transfección de vector, se sembraron en placas de 24 pocillos, y se sometieron a ensayo mediante ELISA de tPA "a nivel de saturación". En la Figura 5B, se sometieron a ensayo mediante ELISA de tPA "a nivel de saturación" veinte clones seleccionados aleatoriamente derivados de cada uno de los vectores. En la Figura 5C, los pools indicados en la Figura 5A (excepto el pool \DeltaGT) se expusieron a Mtx 200 nM para seleccionar para la amplificación de DHFR y después se agruparon y se sometieron a ensayo para la expresión de tPA.

Las Figuras 6A-P ilustran la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 2) del vector de expresión DHFR/intrón- (SD de ras WT)-TNFr-IgG del Ejemplo 2.

Las Figuras 7A-B son gráficos de columnas que ilustran la expresión de TNFr-IgG utilizando vectores dicistrónicos o de control (ver el Ejemplo 2). Se construyeron vectores que contenían TNFr-IgG (aunque aparte de ello idénticos a aquellos descritos para la expresión de tPA en el Ejemplo 1), se introdujeron en células dp12.CHO mediante electroporación, se agruparon y se sometieron a ensayo para la expresión de producto antes (Figura 7A) y después (Figura 7B) de someterse a amplificación en Mtx 200 nM.

La Figura 8 ilustra esquemáticamente el constructo de ADN utilizado para la expresión de la V_{L} de anti-IgE en el Ejemplo 3.

Las Figuras 9A-O ilustran la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 3) del vector de expresión de V_{H} de anti-IgE del Ejemplo 3.

Las Figuras 10A-Q ilustran la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 4) del vector de expresión de V_{L} de anti-IgE del Ejemplo 3.

La Figura 11 es un gráfico de columnas que ilustra la expresión de anti-IgE en el Ejemplo 3.

Se construyeron vectores de expresión de cadena pesada (V_{H}) y ligera (V_{L}), se coelectroporaron en células CHO y los clones se seleccionaron y se sometieron a ensayo para la expresión de anticuerpos. Además, se establecieron pools y se evaluaron con respecto a la expresión antes y después de la selección en Mtx a 200 nM y 1 \muM.

Descripción de las realizaciones preferentes Definiciones

El "constructo de ADN" dado a conocer en la presente invención comprende una molécula de ADN de origen no natural que puede proporcionarse aislada o integrada en otra molécula de ADN, por ejemplo en un vector de expresión o como el cromosoma de una célula huésped eucariótica.

La expresión "gen seleccionable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ADN que codifica un marcador seleccionable necesario para el crecimiento o supervivencia de una célula huésped bajo las condiciones de cultivo celular particulares seleccionadas. Por consiguiente, una célula huésped que se transforme con un gen seleccionable será capaz de crecer o de sobrevivir bajo determinadas condiciones de cultivo celular, en las que una célula huésped no transfectada no será capaz de crecer o de sobrevivir. Típicamente un gen seleccionable proporcionará resistencia a un fármaco o compensará un defecto metabólico o catabólico en la célula huésped. Se proporcionan ejemplos de genes seleccionables en la tabla siguiente (ver también Kaufman, Methods in Enzymology 185:537-566, 1990, para una revisión de los mismos).

TABLA 1

1

2

Según la presente invención, el gen seleccionable es un gen amplificable. Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "gen amplificable" se refiere a un gen que se amplifica (es decir, se generan copias adicionales del gen que sobreviven en forma intracromosómica o extracromosómica) bajo determinadas condiciones. El gen amplificable habitualmente codifica un enzima (es decir, un marcador amplificable) que resulta necesario para el crecimiento de las células eucarióticas bajo dichas condiciones. Por ejemplo, el gen puede codificar DHFR que se amplifica cuando una célula huésped transformada con el mismo se cultiva en Mtx. Según Kaufman, los genes seleccionables en la Tabla 1 proporcionada anteriormente también pueden considerarse genes amplificables. Un ejemplo de un gen seleccionable que generalmente no se considera que sea un gen amplificable es el gen de resistencia a la neomicina (Cepko et al., supra).

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "medio selectivo" se refiere a la solución nutritiva utilizada para cultivar células eucarióticas que presentan el gen seleccionable y por lo tanto incluye un "agente de selección". Los medios comercialmente disponibles, tales como F-10 de Ham (Sigma), medio mínimo esencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ([DMEM], Sigma) son soluciones nutritivas ejemplares. Además, puede utilizarse cualquiera de los medios indicados en Ham y Wallace, Meth. Enz. 58:44, 1979; Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255, 1980; patentes US nº 4.767.704, nº 4.657.866, nº 4.927.762 o nº 4.560.655; patentes WO nº 90/03430, nº 87/00195; patentes US nº Re. 30.985 o nº 5.122.469) como medios de cultivo. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según resulte necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas, que resultarían conocidas por los expertos en la materia. La solución nutritiva preferente comprende suero de feto bovino.

La expresión "agente de selección" se refiere a una sustancia que interfiere con el crecimiento o supervivencia de una célula huésped que es deficiente en un gen seleccionable particular. Se presentan ejemplos de agentes de selección en la Tabla 1 anteriormente proporcionada. El agente de selección preferentemente comprende un "agente de amplificación" que se define para los fines de la presente invención como un agente para amplificar copias del gen amplificable, tal como Mtx si el gen amplificable es DHFR. Ver la Tabla 1 para ejemplos de agentes de amplificación.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "sitio de inicio transcripcional" se refiere al ácido nucleico en el constructo de ADN correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor ARNm, sitio generalmente proporcionada en el extremo 5' del constructo de ADN o contiguo al mismo.

La expresión "sitio de terminación transcripcional" se refiere a una secuencia de ADN, normalmente representada en el extremo 3' del constructo de ADN, que causa que la ARN polimerasa termine la transcripción.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "región reguladora transcripcional" se refiere a una región del constructo de ADN que regula la transcripción del gen seleccionable y el gen de producto. La región reguladora transcripcional normalmente se refiere a una secuencia de promotor (es decir, una región de ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción) que puede se constitutiva o inducible y, opcionalmente, un intensificador (es decir, un elemento de ADN que actúa en cis, habitualmente de entre aproximadamente 10 y 300 pb, que actúa sobre un promotor incrementando su transcripción).

Tal como se utiliza en la presente invención, "gen de producto" se refiere a ADN que codifica una proteína deseada o producto polipéptido. Puede utilizarse cualquier gen de producto que es capaz de expresión en una célula huésped, aunque los procedimientos de la invención resultan particularmente adecuados para obtener la expresión de nivel elevado de un gen de producto que no sea también un gen seleccionable o amplificable. Por consiguiente, la proteína o polipéptido codificada por un gen de producto típicamente será uno que no resulte necesario para el crecimiento o la supervivencia de una célula huésped bajo las condiciones de cultivo celular particulares seleccionadas. Por ejemplo, los genes de producto convenientemente codifican un péptido, o pueden codificar una secuencia polipeptídica de aminoácidos para la que la longitud de cadena resulte suficiente para producir niveles más elevados de estructura terciaria y/o cuaternaria.

Entre los ejemplos de polipéptidos o proteínas bacterianos se incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa. Entre los ejemplos de polipéptidos o proteínas de mamífero se incluyen moléculas, tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana, y la hormona de crecimiento bovina; el factor de liberación de hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; antitripsina alfa-1; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona folículo-estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrands; factores anticoagulación, tales como la Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina, factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada tras su activación, normalmente expresado y secretado por células T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica, tal como la albúmina de suero humano; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neutrofina 3, 4, 5 ó 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-\beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento fibroblástico, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4 o TGF-\beta5: factor I y II de crecimiento similar a la insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD, tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogénica ósea (BMP); un interferón, tal como interferón-alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas membranales de superficie; factor acelerador d degradación; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; proteínas quiméricas, tales como inmunoadhesinas y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente indicados.

El gen de producto preferentemente no consiste de una secuencia antisentido para inhibir la expresión de un gen presente en el huésped. Las proteínas preferentes en la presente invención son proteínas terapéuticas, tales como TGF-\beta, TGF-\alpha, PDGF, EGF, FGF, IGF-I, ADNasa, activadores del plasminógeno, tales como t-PA, factores de coagulación, tales como factor tisular y factor VIII, hormonas, tales como la relaxina y la insulina, citoquinas, tales como IFN-\gamma, proteínas quiméricas, tales como receptor de TNF-inmunoadhesina IgG (TNFr-IgG) o anticuerpos, tales como anti-IgE.

El término "intrón" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos presente dentro de la región transcrita de un gen o dentro de un precursor de ARN mensajero, secuencia de nucleótidos que es capaz de resultar extraída, o procesada, a partir del precursor de ARN mensajero por una célula huésped previamente a la traducción. Los intrones adecuados para la utilización en la presente invención se preparan convenientemente mediante cualquiera de entre varios procedimientos que son bien conocidos en la técnica, tales como la purificación a partir de un ácido nucleico de origen natural o la síntesis de novo. Los intrones presentes en muchos genes eucarióticos de origen natural han sido identificados y caracterizados (Mount, Nucl. Acids Res. 10:459, 1982). Los intrones artificiales que comprenden sitios de empalme funcionales también han sido descritos (Winey et al., Mol. Cell Biol. 9:329, 1989; Gatermann et al., Mol. Cell Biol. 9:1526, 1989). Los intrones pueden obtenerse a partir de ácidos nucleicos de origen natural, por ejemplo mediante digestión de un ácido nucleico de origen natural con una endonucleasa de restricción adecuada, o mediante clonación por PCR utilizando cebadores complementarios a las secuencias en los extremos 5' y 3' del intrón. Alternativamente, pueden prepararse intrones de secuencia y longitud definidas de manera sintética utilizando diversos procedimientos de la química orgánica (Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154:287, 1985; Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14:5399, 1986).

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "sitio donador de empalme" o "SD" se refiere a la secuencia de ADN inmediatamente circundante al límite exón-intrón en el extremo 5' del intrón, donde el "exón" comprende el ácido nucleico 5' respecto al intrón. Muchos sitios donadores de empalme han sido caracterizados y Ohsima et al., J. Mol. Biol. 195:247-259, 1987, proporciona una revisión de los mismos. La expresión "una secuencia donadora de empalme eficiente" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un sitio donador de empalme en la que la eficiencia de procesamiento de los precursores de ARN mensajero con la secuencia donadora de empalme se encuentra comprendida entre aproximadamente 80% y 99%, y preferentemente entre 90% y 95% según determinación mediante PCR cuantitativa. Entre los ejemplos de secuencias donadoras de empalme eficientes se incluyen la secuencia donadora de empalme ras de tipo salvaje (WT) y la secuencia GAC:GTAAGT del Ejemplo 3. Pueden seleccionarse fácilmente otras secuencias donadoras de empalme eficientes utilizando las técnicas para medir la eficiencia de procesamiento dada a conocer en la presente invención.

Las expresiones "PCR" y "reacción en cadena de la polimerasa" tal como se utiliza en la presente invención se refieren al procedimiento de amplificación in vitro descrito en la patente US nº 4.683.195 (publicada el 28 de julio de 1987). En general, el procedimiento de PCR implica ciclos repetidos de síntesis de extensión de cebador, utilizando dos cebadores de ADN capaces de hibridarse preferentemente con un molde de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos que debe amplificarse. El procedimiento de PCR puede utilizarse para clonar secuencias de ADN específicas a partir del ADN genómico total, ADNc transcrito a partir de ARN celular y ADNs víricos o plasmídicos (Wang y Mark, en: PCR Protocols, páginas 70-75, Academic Press, 1990; Scharf, en: PCR Protocols, páginas 84-98; Kawasaki y Wang, en: PCR Technology, páginas 89-97, Stockton Press, 1989). Puede utilizarse la reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (PCR-RT) para analizar muestras de ARN que contienen mezclas de transcritos de ARNm procesados y no procesados. Los cebadores etiquetados fluorescentemente diseñados para abarcar el intrón se utilizan para amplificar dianas tanto procesadas como no procesadas Los productos de amplificación resultantes seguidamente se separan mediante electroforesis en gel y se cuantifican midiendo la emisión fluorescente de la banda o bandas apropiadas. Se lleva a cabo una comparación para determinar la cantidad de transcritos procesados y no procesados presentes en la muestra de ARN.

Una secuencia donadora de empalme preferente es una "secuencia donadora de empalme de consenso". Las secuencias de nucleótidos circundantes a los sitios de empalme de intrón, secuencias que se encuentran altamente conservadas evolutivamente, se denominan "secuencias donadoras de empalme de consenso". En los ARNm de los eucariotas superiores, el sitio de empalme 5 se encuentra dentro de la secuencia de consenso AG:GUAAGU (en la que los dos puntos indican el sitio de corte y ligación). En los ARNm de levadura, el sitio de empalme 5' está limitado por la secuencia de consenso :GUAUGU (Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55:1119, 1986).

La expresión "sitio aceptor de empalme" o "SA" se refiere a la secuencia inmediatamente circundante al límite intrón-exón en el extremo 3' del intrón, en el que "exón" comprende el ácido nucleico 3' respecto al intrón. Muchos sitios aceptores de empalme han sido caracterizados, y Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195:247-259, 1987, proporcionan una revisión de los mismos. El sitio aceptor de empalme preferente es un sitio aceptor de empalme eficiente que se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un sitio aceptor de empalme en el que la eficiencia de procesamiento de los precursores de ARN mensajero con el sitio aceptor de empalme se encuentra comprendida entre aproximadamente 80% y 99%, y preferentemente entre 90% y 95%, según determinación mediante PCR cuantitativa. El sitio aceptor de empalme puede comprender una secuencia de consenso. En los ARNm de los eucariotas superiores, el sitio aceptor de empalme 3' se encuentra dentro de la secuencia de consenso (U/C)_{11}NCAG:G. En los ARNm de levadura, el sitio aceptor de empalme 3' está limitado por la secuencia de consenso (C/U)AG: (Padgett et al., supra).

Tal como se utiliza en la presente invención, "cultivar durante un tiempo suficiente para permitir que se produzca la amplificación" se refiere al acto de cultivar físicamente las células huésped eucarióticas que han sido transformadas con el constructo de ADN en medios de cultivo celular que contienen el agente de amplificación, hasta que el número de copia del gen amplificable (y preferentemente también el número de copia del gen de producto) en las células huésped se ha incrementado respecto a las células transformadas previamente a este cultivo.

El término "expresión" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a la transcripción o a la traducción que se produce dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un gen de producto en una célula huésped puede determinarse a partir de la cantidad del ARNm correspondiente que se encuentra presente en la célula, o de la cantidad de la proteína codificada por el gen de producto que es producida por la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de un gen de producto deseablemente se cuantifica mediante hibridación northern (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, páginas 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)). La proteína codificada por un gen de producto puede cuantificarse mediante ensayo de la actividad biológica proteína o utilizando ensayos que son independientes de esta actividad, tales como transferencia western o radioinmunoensayo utilizando anticuerpos capaces de reaccionar con la proteína (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, páginas 18.1 a 18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).

Modos para llevar a cabo la invención

Se proporcionan procedimientos y composiciones para incrementar la estabilidad y/o número de copia de una secuencia transcrita con el fin de permitir la producción de niveles elevados de una secuencia de ARN de interés. En general, los procedimientos de la presente invención implican transfectar una célula huésped eucariótica con un vector de expresión que comprende tanto un gen de producto codificante de un polipéptido deseado y un gen seleccionable (preferentemente un gen amplificable).

Pueden obtenerse genes seleccionables y genes de producto a partir de ADN genómico, ADNc transcrito a partir de ARN celular, o mediante síntesis in vitro. Por ejemplo, se criban bibliotecas con sondas (tales como anticuerpos u oligonucleótidos de aproximadamente 20 a 80 bases) diseñadas para identificar el gen seleccionable o el gen de producto (o la proteína o proteínas codificadas en el mismo). El cribado del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionable puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar tal como se describe en los capítulos 10 a 12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo de aislar el gen seleccionable o el gen de producto es utilizar metodología de PCR tal como se describe en la sección 14 de Sambrook et al., supra.

Un procedimiento preferente de poner en práctica la presente invención es utilizar secuencias oligonucleótidas cuidadosamente seleccionadas para cribar bibliotecas de ADNc de diversos tejidos que es conocido que contienen el gen seleccionable o el gen de producto. Las secuencias oligonucleótidas seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente inequívocas para que se minimicen los falsos positivos.

El oligonucleótido generalmente se marca de manera que pueda detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que se está cribando. El procedimiento preferente de marcaje es la utilización de ATP marcado con ^{32}P con polinucleótido quinasa, como es bien conocido en la técnica, para marcar radioactivamente el oligonucleótido. Sin embargo, pueden utilizarse otros procedimiento para marcar el oligonucleótido, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la biotinilación o el marcaje enzimático.

Ocasionalmente, el ADN codificante del gen seleccionable y del gen de producto se encuentra precedido por ADN codificante de una secuencia de señal que presenta un sitio de corte especifico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector de expresión, o puede ser una parte del gen seleccionable o del gen de producto que se inserta en el vector de expresión. Si se utiliza una secuencia de señal heteróloga, preferentemente es una que resulte reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para la secreción en levadura, la secuencia de señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, estando descritos estos últimos en la patente US nº 5.010.182, publicada el 23 de abril de 1991) o el líder de fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicanas (patente EP nº 362.179, publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en la patente WO nº 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, la secuencia de señal nativa de la proteína de interés es satisfactoria, aunque pueden resultar adecuadas otras secuencias de señal de mamífero, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como líderes secretorios víricos, por ejemplo la señal gD de Herpes simplex. El ADN para esta región precursora se encuentra ligado en el mismo marco de lectura que el gen seleccionable o que el gen de producto.

Tal como se muestra en la Figura 1ª, el gen seleccionable se proporciona en el extremo 5' del constructo de ADN y a este gen seleccionable le sigue el gen de producto. Por lo tanto, el mensaje de longitud completa (no procesado) contendrá DHFR como el primer marco de lectura abierto y por lo tanto generará proteína DHFR para permitir la selección de los transfectantes estables. El mensaje de longitud completa no se espera que genere cantidades apreciables de la proteína de interés debido a que el segundo AUG en el mensaje dicistrónico es un iniciador ineficiente de traducción en las células de mamífero (Kozak, J. Cell Biol. 115:887-903, 1991).

El gen seleccionable se encuentra situado dentro de un intrón. Los intrones son secuencias de nucleótidos no codificantes, normalmente presentes dentro de muchos genes eucarióticos, que se eliminan de los precursores ARNm nuevamente transcritos en un procedimiento multietapa denominado colectivamente empalme.

Se cree que un mecanismo único es responsable del empalme de los precursores ARNm en células de mamífero, vegetales y de levadura. En general, el procedimiento de empalme requiere que los extremos 5' y 3' del intrón se corten correctamente y los extremos resultantes del ARNm se unan con exactitud, de manera que se produce un ARNm maduro con el marco de lectura apropiado para la síntesis de proteína. El análisis de una diversidad de genes mutantes de origen natural y construidos sintéticamente ha demostrado que los cambios de nucleótidos en muchas de las posiciones dentro de las secuencias de consenso en los sitios de empalme 5' y 3' presenta el efecto de reducir o eliminar la síntesis de ARNm maduro (Sharp, Science 235:766, 1987; Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55:1119, 1986; Green, Ann. Rev. Genet. 20:671, 1986). Los estudios mutacionales también han demostrado que las estructuras secundarias de ARN que implican sitios de empalme pueden afectar a la eficiencia del empalme (Solnick, Cell 43:667, 1985; Konarska et al., Cell 42:165, 1985).

La longitud del intrón también puede afectar a la eficiencia del empalme. Realización mutaciones por deleción de diferentes tamaños dentro del intrón grande del gen de la beta-globina de conejo, Wieringa et al. determinaron que la longitud mínima del intrón necesaria para el empalme correcto es de aproximadamente 69 nucleótidos (Cell 37:915, 1984). Algunos estudios similares del intrón de la región E1A del adenovirus han demostrado que una longitud de intrón de aproximadamente 78 nucleótidos permite que se produzca un empalme correcto, aunque con una eficiencia reducida. El incremento de la longitud del intrón hasta 91 nucleótidos restaura la eficiencia normal del empalme, mientras que el truncado del intrón a 63 nucleótidos elimina el empalme correcto (Ulfendahl et al., Nucl. Acids Res. 13:6299, 1985).

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Para que resulte útil en la invención, el intrón debe presentar una longitud que permita que el procesamiento del intrón a partir del ARNm resulte eficiente. La preparación de intrones de diferentes longitudes es una cuestión rutinaria, implicando procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como síntesis de novo o la mutagénesis por deleción in vitro de un intrón existente. Típicamente, el intrón presentará una longitud de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, debido a que los intrones que son más cortos que esta longitud tienden a procesarse menos eficientemente. El límite superior para la longitud del intrón puede ser de hasta 30 kB o más. Sin embargo, como proposición general, el intrón presenta una longitud generalmente inferior a aproximadamente 10 kB.

El intrón se modifica para contener el gen seleccionable no presente normalmente dentro del intrón utilizando cualquiera de los diversos procedimientos conocidos para modificar un ácido nucleico in vitro. Típicamente, se introduce un gen seleccionable en un intrón en primer lugar cortando el intrón con una endonucleasa de restricción, y después uniendo covalentemente los fragmentos de restricción resultantes con el gen seleccionable en la orientación correcta para la expresión de la célula huésped, por ejemplo mediante ligación con un enzima ADN ligasa.

El constructo de ADN es dicistrónico, es decir, el gen seleccionable y el gen de producto se encuentran ambos bajo el control transcripcional de una sola región reguladora transcripcional. Tal como se ha indicado anteriormente, la región reguladora transcripcional comprende un promotor. Entre las secuencias promotoras adecuadas para la utilización con huéspedes levadura se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otros enzimas glucolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968, y Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfogliceratomutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotores para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión de levadura se describen adicionalmente en Hitzeman et al., patente EP nº 73.657A. Los intensificadores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura.

Las secuencias de control de expresión son conocidas para los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos presentan una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia situada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en la que X puede ser cualquier nucleótido.

La transcripción de gen de producto a partir de vectores en células huésped de mamífero se encuentra controlada por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus de polioma, virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferentemente virus 40 del simio (SV40) a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, y a partir del promotor asociado normalmente con el gen de producto, con la condición de que estos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Mulligan y Berg, Science 209:1422-1427, 1980; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402, 1981). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) se obtiene convenientemente en forma de fragmento E de restricción HindIII (Greenaway et al., Gene 18:355-360, 1982). Se da a conocer un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamífero utilizando el virus del papiloma bovino como vector en la patente US nº 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la patente US nº 4.601.978. Ver también Gray et al., Nature 295:503-508, 1982 sobre la expresión de ADNc codificante de interferón inmunológico en células de mono; Reyes et al., Nature 297:598-601, 1982 sobre la expresión del ADNc del \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5166-5170, 1982, sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en cultivo de células de ratón y de conejo, y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781, 1982, sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

Preferentemente, la región reguladora transcripcional en eucariotas superiores comprende una secuencia intensificadora. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición, al encontrarse en orientación 5' (Lainins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993, 1981) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3:1108, 1983) respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell 33:729, 1983), así como dentro de la secuencia codificante misma (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4:1293, 1984). En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb de 100 a 270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus (CMV), el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus (ver también Yaniv, Nature 297:17-18, 1982) sobre los elementos intensificadores para la activación de promotores eucarióticos). El intensificador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' del gen de producto, pero preferentemente se sitúa en un sitio 5' respecto al promotor.

El constructo de ADN presenta un sitio de inicio transcripcional después de la región reguladora transcripcional y una región de terminación transcripcional después del gen de producto (ver la Figura 1A). Estas secuencias se proporcionan en el constructo de ADN utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica.

El constructo de ADN normalmente forma parte de un vector de expresión que puede presentar otros componentes, tales como un origen de replicación (es decir, una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas) y, si se desea, uno o más genes seleccionables adicionales. La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificantes y de control deseadas utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se cortan, se ajustan y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Generalmente, en los vectores de clonación, el origen de replicación es uno que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son bien conocidas. El origen de replicación del plásmido 2\mu es adecuado para la levadura y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para los vectores de clonación en las células de mamífero. Generalmente, el componente origen de replicación no resulta necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 típicamente puede utilizarse sólo porque contiene el promotor temprano).

La mayoría de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en por lo menos una clase de organismos, pero pueden transfectarse en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y después el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero para la expresión, aunque no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

Para el análisis de confirmación de las secuencias correctas en los plásmidos, los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante restricción y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309, 1981, o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499, 1980.

El vector de expresión con el constructo de ADN preparado tal como se ha comentado anteriormente se transforma en una célula huésped eucariótica. Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión de los vectores de la presente invención son células de levadura o de eucariotas superiores.

Los microbios eucarióticos, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes adecuados para vectores que contienen el gen de producto. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el utilizado más frecuentemente de entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, se encuentran disponibles comúnmente y resultan útiles en la presente invención varios otros géneros, especies y cepas, tales como S. pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737, 1983), Yarrowia (patente EP nº 402.226), Pichia pastoris (patente EP nº 183.070), Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983, Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983;
Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984, y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985).

Las células huésped adecuadas para la expresión del gen de producto se derivan organismos multicelulares. Estas células huésped son capaces de actividades complejas de procesamiento y glucosilación. Como regla general, puede utilizarse cualquier cultivo celular eucariótico superior, procedente de cultivo de vertebrado o de invertebrado. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y células huésped de insecto permisivos correspondientes, tales como células huésped de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Lucow et al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et al., en: Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., editores, vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), páginas 277 a 279; y Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985. Se encuentran a disposición del público una diversidad de dichas cepas víricas, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden utilizarse como el virus según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Típicamente, se transfectan células vegetales mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que han sido previamente manipuladas para contener el gen de producto. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el gen de producto se transfiere al huésped célula vegetal de manera que se resulte transfectado y exprese, bajo las condiciones apropiadas, el gen de producto. Además, se encuentran disponibles secuencias reguladoras y de señal compatibles con las células vegetales, tal como el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias de señal de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:561, 1982). Además, algunos segmentos de ADN aislados de la región corriente arriba del gen 780 de ADN-T son capaces de activar o de incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en plantas en tejido vegetal que contiene ADN recombinante. Patente EP nº 321.196 publicada el 21 de junio de 1989.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en las células de vertebrado, y la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario en años recientes (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores, 1973). Son ejemplos de líneas celulares de mamífero huésped útiles la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977); las células renales de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980); células CHO.dp12 (patente EP nº 307.247 publicada el 15 de marzo de 1989); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 144); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (HepG2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos de la presente invención y cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.

Se utiliza la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 23:315, 1983 y la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin estas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero han sido descritos por Axel en la patente US nº 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977 y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como la inyección nuclear o mediante fusión de protoplasto.

En la realización preferente, el ADN se introduce en las células huésped utilizando la electroporación (ver Andreason, J. Tiss. Cult. Meth. 15:56-62, 1993, para una revisión de las técnicas de electroporación que resultan útiles para poner en práctica la invención reivindicada. Se ha descubierto que las técnicas de electroporación para introducir el constructo de ADN en las células huésped resultan preferibles a las técnicas de precipitación con fosfato de calcio en la medida en que estas últimas podrían provocar la rotura del ADN y la formación de concatámeros.

Las células huésped de mamífero utilizadas para expresar el gen de producto en la presente invención pueden cultivarse en una diversidad de medios, tal como se comenta en la sección de definiciones anterior. El medio contiene el agente de selección utilizado para seleccionar las células huésped transformadas que han incorporado el constructo de ADN (como elemento intracromosómico o extracromosómico). Para conseguir la selección del as células eucarióticas transformadas, las células huésped pueden cultivarse en placas de cultivo celular y colonias individuales que expresan el gen seleccionable (y de esta manera el gen de producto) pueden aislarse y cultivarse en medio de cultivo hasta el agotamiento de los nutrientes. A continuación, las células huésped se analizan para la transcripción y/o transformación tal como se comenta posteriormente. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son aquéllas utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

La amplificación y/o expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern, transferencia northern convencionales para cuantificar la transcripción en ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Pueden utilizarse diversos marcajes, más frecuentemente isótopos radioactivos, particularmente 32P. Sin embargo, también pueden utilizarse otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como el sitio para la unión a avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia diversidad de marcajes, tales como radionucleidos, fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo con el dúplex unido a una superficie, de manera que al formarse el dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Alternativamente, la expresión génica puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de un cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del gen de producto. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguida de la reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado, en el que los marcajes habitualmente son visualmente detectables, tales como marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes, y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible adecuada para la utilización en la presente invención se describe en Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75:735-738, 1980.

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En la realización preferente, el ARNm se analiza mediante PCR cuantitativa (para determinar la eficiencia de empalme) y la expresión de proteínas se mide utilizando ELISA tal como se describe en el Ejemplo 1 en la presente memoria.

El producto de interés preferentemente se recupera del medio de cultivo como polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de los lisados de células huésped cuando se expresa directamente sin una señal secretoria. Cuando el gen de producto se expresa en una célula recombinante que no es de origen humano, el producto de interés se encuentra completamente libre de proteínas o de polipéptidos de origen humano. Sin embargo, resulta necesario purificar el producto de interés de las proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas respecto al producto de interés. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los residuos celulares particulados. Seguidamente, el producto de interés se purifica de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, por ejemplo mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía en resina de sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; electroforesis en gel utilizando, por ejemplo Sephadex G-75; cromatografía en columnas de plasminógeno para unir el producto de interés y columnas de proteína A-sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a título de ilustración únicamente y no pretenden limitar la invención en modo alguno

Ejemplo 1 Producción de tPA utilizando los vectores de expresión dicistrónicos

Se buscó incrementar el nivel de homogeneidad con respecto a los niveles de expresión de clones estables mediante la expresión de un marcador seleccionable (tal como DHFR) y la proteína de interés a partir de un solo promotor. Estos vectores desvían la mayor parte del transcrito a la expresión de producto, ligándola simultáneamente a una proporción fija a la expresión de DHFR a través del procesamiento diferencial.

Se construyeron vectores que se derivaron del vector pRK (Suva et al., Science 237:893-896, 1987) que contiene un intrón entre el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) y el ADNc que codifica el polipéptido de interés. El intrón de pRK es de 139 nucleótidos de longitud, presenta un sitio donador de empalme derivado del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMVIE) y un sitio aceptor de empalme procedente de un gen de región variable (V_{H}) de cadena pesada de IgG (Eaton et al., Biochem. 25:8343, 1986).

Los vectores de DHFR/intrón se construyeron insertando un línker EcoRV en el sitio BSTX1 presente en el intrón de pRK7. Se insertó un fragmento de 830 pares de bases que contenía un fragmento codificante de DHFR de ratón para obtener vectores de expresión de DHFR-intrón que diferían únicamente en la secuencia que comprende el sitio donador de empalme. Estas secuencias se alteraron solapando la mutagénesis por PCR para obtener secuencias con sitios donadores de empalme correspondientes en los exones 3 y 4 de genes Ras normales y mutantes. También se utilizó la PCR para destruir el sitio donador de empalme.

Se insertó un fragmento de ADNc de DHFR de ratón (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499, 1983) en el intrón de este vector 59 nucleótidos más abajo del sitio donador de empalme. El sitio donador de empalme de este vector se alteró mediante mutagénesis para modificar la proporción entre mensaje procesado a no procesado en las células transfectadas. Anteriormente se había demostrado que un solo cambio de nucleótido (G a A) convirtió un sitio donador de empalme relativamente eficiente en el gen ras normal en un sitio de empalme eficiente (Cohen et al., Nature 334:119-124, 1988). Este efecto ha sido demostrado en el contexto del gen ras y ha sido confirmado cuando estas secuencias se transfirieron en constructos de hormona de crecimiento humana (Cohen et al., Cell 58:461-472, 1989). Además, se construyó un sitio de empalme 5' no funcional (GT CA) como control (\DeltaGT). Se insertó un polilínker 35 nucleótidos más abajo del sitio de empalme 3' para aceptar el ADNc de interés. Un vector que contenía tPA (Pennica et al., Nature 301:214-221, 1983) se linearizó más abajo del sitio de poliadenilación antes de introducirlo en células CHO (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161, 1984).

Se introdujeron plásmidos de ADN que contenían DHFR/intrón, tPA y (a) ras de tipo salvaje (ras WT), ver la Figura 3 (SEC ID nº 1), (b) ras mutante, o (c) sitio donador de empalme no funcional (\DeltaGT) en células CHO DHFR-negativas mediante electroporación. Se linearizaron cada uno de los vectores de intrón más abajo del sitio de poliadenilación mediante tratamiento con endonucleasa de restricción. El vector de control se linearizó más abajo del segundo sitio de poliadenilación. Los ADNs se precipitaron con etanol tras la extracción con fenol/cloroformo y se resuspendieron en 20 \mul de Tris EDTA 1/10. A continuación, se incubaron 10 \mug de ADN con 10^{7} células CHO.dp12 (patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) en 1 ml de PBS sobre hielo durante 10 minutos antes de la electroporación a 400 voltios y 330 \muf utilizando un electroporador celular BRL.

Las células se introdujeron nuevamente en hielo durante 10 minutos antes de sembrarse en placas en medio no selectivo. Tras 24 horas, las células se alimentaron con medio libre de nucleósidos para seleccionar los clones DHFR^{+} estables, que se agruparon. Los clones DHFR^{+} agrupados se lisaron y se prepararon los ARNm.

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Para preparar el ARNm, se extrajo el ARN de 5 x 10^{7} células que se cultivaron a partir de pools de más de 200 clones derivados de la transfección estable de los tres vectores, la construcción esencial de los cuales se muestra en la Figura 1B y a partir de células CHO no transfectadas. Se purificó el ARN sobre oligo-DT celulasa (Collaborative Biomedical Products). A continuación, se sometieron 10 \mug de ARNm a transferencia northern, que implicó correr el ARNm en un gel de 1,2% de agarosa y 6,6% de formaldehído, y transferirlo a un filtro de nilón (membrana Stratagene Duralon-UV), prehibridado, sondeado y lavado siguiendo las instrucciones del fabricante.

El filtró se sondeó secuencialmente utilizando sondas (mostradas en la Figura 1B) que podían detectar: (a) el mensaje de longitud completa, (b) el mensaje de tanto longitud completa como procesado, o (c) beta-actina. El sondeo con la sonda larga demostró que el vector que contenía el sitio donador de empalme eficiente (es decir ras WT) generaba predominantemente un ARNm del tamaño predicho para el producto procesado, mientras que los otros dos vectores dieron lugar principalmente a un ARNm de un tamaño que correspondía al del mensaje no procesado. La sonda de DHFR detectó sólo el mensaje de longitud completa y demostró que el vector derivado de sitio donador de empalme ras WT generaba muy poco mensaje de longitud completa con el que proporcionar un fenotipo DHFR-positivo.

La Figura 4 muestra el número de colonias DHFR-positivas tras electroporaciones por duplicado con los tres vectores de intrón indicados anteriormente y de un vector convencional que presenta un promotor de CMV que regula tPA y un promotor de SV40 que regula DHFR (ver la Figura 2). El incremento del número de colonias se produjo en paralelo al incremento del mensaje de longitud completa acumulado con la modificación de los sitios donadores de empalme. El vector convencional genera colonias eficientemente y no es significativamente diferente del constructo \DeltaGT.

El nivel de expresión de tPA se determinó sembrando células en 1 ml de F12:DMEM (50:50 con 5% de FBS) en placas de 24 pocillos hasta casi confluencia. El crecimiento de las célula continuó hasta agotar el medio. A continuación, se sometió a ensayo el medio mediante ELISA para la producción de tPA. Brevemente, se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación de ELISA con anticuerpo anti-tPA, se añadieron muestras de medio a los pocillos, seguido de lavado. A continuación, se cuantificó la unión del antígeno (tPA) utilizando anticuerpo anti-tPA marcado con peroxidasa de rábano picante (HRPO).

La Figura 5A ilustra los títulos de proteína tPA secretada tras agrupar los clones de cada grupo mostrado en la Figura 4. Aunque el número de colonias se incrementó con un debilitamiento de la función donadora de empalme, se observó lo contrario con respecto a la expresión de tPA. Los niveles de expresión eran consistentes con los productos ARN que se observaron; a medida que se procesa más mensaje dicistrónico, una cantidad creciente de mensaje contendrá tPA como el primer marco de lectura abierto, resultando en una expresión incrementada de tPA. Una mutación de GT a CA en el sitio donador de empalme resulta en una abundancia de colonias DHFR-positivas que expresan niveles indetectables de tPA, resultando posiblemente de la utilización ineficiente del segundo AUG. Se subraya que la Figura 5A también muestra que los niveles de expresión obtenidos de uno de los vectores dicistrónicos (con SD de ras WT) eran aproximadamente tres veces superiores que los obtenidos con el vector de control que contiene un promotor/intensificador de CMV que regula tPA, un promotor/intensificador de SV40 que controla DHFR, y señales de poliadenilación de SV40 que controlan la expresión de tPA y DHFR.

Además, se investigó la homogeneidad de la expresión en los pools. La Figura 5B muestra que la totalidad de los 20 clones generados por los vectores dicistrónicos de sitio donador de empalme ras WT expresaban niveles detectables de tPA, mientras que únicamente 4 de 20 clones generados por el vector de control expresaban tPA. Ninguno de los clones transfectados con el vector no procesado (\DeltaGT) expresó niveles de tPA detectables mediante ELISA. Este resultado es consistente con observaciones anteriores de que relativamente pocos clones generados por vectores convencionales sintetizan niveles útiles de proteína.

Se incrementó la expresión de tPA tras la amplificación con metotrexato de los pools. La Figura 5C muestra que se incrementó marcadamente (en 8,4 y en 7,7 veces) la expresión de dos de los pools derivados de vector dicistrónico (es decir, sitios SD de ras WT y de ras mutante), mientras que el pool generado por el vector convencional se incrementó sólo ligeramente (2,8 veces) al someter cada uno a Mtx 200 nM. Se obtuvo un incremento global de 9 veces utilizando el mejor vector dicistrónico (SD de ras WT) frente al vector convencional tras la amplificación. El crecimiento del pool amplificado de expresión más elevada en medio de producción rico en nutrientes rindió títulos de 4,2 \mug/ml de tPA.

Se demostró que la manipulación de la secuencia donadora de empalme altera la proporción entre mensaje procesado y mensaje de longitud completa y el número de colonias que se forman en medio selectivo. También se demostró que los vectores de expresión dicistrónicos generan clones que expresan niveles elevados de proteínas recombinantes. Inesperadamente, resultó posible aislar expresores elevados que presentaban el sitio donador de empalme eficiente de ras WT mediante selección para las células DHFR^{+} a pesar de la eficiencia con la que el gen DHFR se procesa a partir de los precursores de ARN formados en estas células.

Ejemplo 2 Producción de TNFr-IgG utilizando vectores de expresión dicistrónicos

Para demostrar la aplicabilidad general de este enfoque, se evaluó un segundo producto en el sistema de vector dicistrónico que contenía, como el ADN de interés, una inmunoadhesina (TNFr-IgG) capaz de unirse a factor de necrosis tumoral (TNF) (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539, 1991). Los experimentos descritos en el Ejemplo 1 anteriormente se repitieron esencialmente excepto en que el gen de producto codificaba la inmunoadhesina TNFr-IgG. Se introdujeron plásmidos de ADN que contenían un ADNc de TNFr-IgG y (a) ras de WT, ver la Figura 6 (SEC ID nº 2), (b) ras mutante, o (c) sitio donador de empalme no funcional (\DeltaGT) se introdujeron en las células CHO.dp12 tal como se ha comentado en el Ejemplo 1. Ver la Figura 1C para una ilustración de los constructos de ADN.

Se descubrió que el número de colonias DHFR-positivas generadas por tres de estos vectores era similar al observado con los constructos de tPA. La expresión de TNFr-IgG también fue comparable a la observada con los constructos de tPA (Figura 7A). La amplificación de pools de dos de los constructos mostró un marcado incremento de la expresión de la inmunoadhesina (9,6 y 6,8 veces) (Figura 7B). Los mejores de estos pools amplificados expresaron 9,5 \mug/ml al cultivarlos en medio de producción rico en nutrientes.

De esta manera, nuevamente se demostró que los vectores de expresión dicistrónicos generan clones que expresan niveles elevados de proteínas recombinantes. Además, al contrario de lo esperado, se descubrió que el aislamiento de células huésped DHFR^{+} de expresión de producto elevada resultaba posible utilizando un sitio donador de empalme eficiente (es decir, el sitio donador de empalme de ras WT).

Ejemplo 3 Producción de anticuerpo utilizando un vector de expresión dicistrónico

Se evaluó la utilidad de este sistema para la expresión de anticuerpo mediante el ensayo de la producción de un anticuerpo dirigido contra IgE (Presta et al., Journal of Immunology 151:2623-2632, 1993). Además, se sometió a ensayo la flexibilidad del sistema con respecto al inicio de la transcripción mediante la sustitución del promotor/intensificador de CMV presente en los vectores anteriores, con el promotor/intensificador derivado de la región temprana del virus SV40 (Griffin, B., Structure and Genomic Organization of SV40 and Polyoma Virus, en: J. Tooze [Editor] DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). La cadena pesada del anticuerpo se insertó más abajo de DHFR, tal como se ha descrito en los constructos anteriores de tPA y de TNFr-IgG. Además, se construyó una nueva secuencia de sitio donador de empalme (GAC:GTAAGT) en el vector que correspondía al sitio donador de empalme de consenso más estrechamente que los sitios donadores de empalme presentes en los vectores sometidos a ensayo en los Ejemplos 1 y 2. Se muestra el vector de expresión resultante en las Figuras 1D y 9.

Se descubrió que dicho vector producía menos colonias que los vectores anteriormente sometidos a ensayo, y produjo predominantemente un producto de ARN procesado. Se construyó un segundo vector para que la cadena ligera del anticuerpo estuviese bajo el control del promotor/intensificador de SV40 y poli-A, y el gen de resistencia a la higromicina B bajo el control del promotor/intensificador de CMV y poli-A de SV40. Estos vectores se linearizaron en sitios HpaI únicos más abajo de la señal poli-A, se mezclaron en una proporción de vector de cadena ligera a vector de cadena pesada de 10:3 y se electroporaron en células CHO utilizando un protocolo optimizado (tal como se comenta en los Ejemplos 1 y 2).

La Figura 11 muestra los niveles de anticuerpo expresados por clones y pools tras la selección en higromicina B seguido de la selección para la expresión de DHFR. La totalidad de los 20 clones analizados expresó niveles elevados de anticuerpo al cultivarlos en medio rico en nutrientes y presentó diferencias entre ellos de sólo un factor de cuatro. Se generó un pool de clones productores de anticuerpo y se sometió a ensayo poco después de su establecimiento. Se cultivó el pool continuamente durante 6 semanas sin reducción significativa de la productividad, demostrando que su estabilidad era suficiente para generar cantidades de gramos de proteína en su cultivo a gran escala.

El pool se sometió a amplificación con metotrexato a 200 nM y a 1 \muM y alcanzó un incremento de más de 2 veces del título de anticuerpo. El pool resistente a Mtx 1 \muM alcanzó un título de 41 mg/l al cultivarlo bajo condiciones óptimas en cultivo en suspensión.

Se examinó la estructura del anticuerpo expresado. Las proteínas expresadas por el pool resistente a metotrexato 200 nM y por un clon de expresión bien caracterizado generado por vectores convencionales (Presta et al., supra, 1993) se marcaron metabólicamente con S^{35} cisteína y S^{35} metionina. En particular, se marcaron metabólicamente placas celulares confluyentes de 35 mm con 50 \muCi cada una de S-35-metionina y de S-35-cisteína (Amersham) en suero libre de cisteína y F12:DMEM libre de metionina. Tras una hora, se añadió medio de producción rico en nutrientes y se permitió que las proteínas marcadas se "marcasen" en el medio durante seis horas adicionales. Las proteínas se corrieron en SDS/PAGE al 12% (NOVEX) no reducido o tras su reducción con B-mercaptoetanol. Los geles secos se expusieron a película durante 16 horas. También se marcaron células CHO de control.

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La mayoría de la proteína anticuerpo se segrega con un peso molecular de aproximadamente 155 kilodaltons, consistente con una molécula de anticuerpo apropiadamente ligada con disulfuro con 2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas. Tras la reducción, el peso molecular se desplaza a 2 proteínas de abundancia aproximadamente igual de 22,5 y 55 kilodaltons. La proteína generada de este pool no puede distinguirse del anticuerpo producido por el clon de expresión bien caracterizado, sin incremento aparente de cadena pesada o ligera libre expresada por el pool.

Conclusión

El sistema de expresión eficiente descrito en la presente invención utiliza vectores que consisten de elementos de promotor/intensificador seguidos de un intrón que contenía la secuencia codificante de marcador seleccionable, seguido del ADNc de interés y de una señal de poliadenilación.

Se sometieron a ensayo varias secuencias de sitio donador de empalme para su efecto sobre el número de colonias y la expresión del ADNc de interés. Se utilizó un sitio donador de empalme no funcional, sitios donadores de empalme que se encuentran en un intrón entre los exones 3 y 4 de las formas mutante (ras mutante) y normal (ras WT) del gen Ras de Harvey y otro sitio SD eficiente (ver el Ejemplo 3). Los vectores se diseñaron para dirigir la expresión de transcritos primarios dicistrónicos. Dentro de una célula transfectada algunos de los transcritos conservan la longitud completa, mientras que el resto son procesados extrayendo la secuencia codificante de la DHFR. Cuando el sitio donador de empalme se debilita o resulta destruido, se observa un incremento del número de colonias.

Los niveles de expresión mostraron el patrón inverso, generando los sitios donadores de empalme más eficientes los niveles más elevados de tPA, de inmunoadhesina TNF4 o de VH de anti-IgE.

La homogeneidad de la expresión de los clones generados por los vectores de DHFR-intrón sitio donador de empalme ras se comparó con clones generados a partir de un vector convencional con un promotor/intensificador y una señal de poliadenilación separadas para cada DHFR y tPA. El vector de intrón DHFR da lugar a colonias que son mucho más homogéneas con respecto a la expresión que aquéllas generadas por el vector convencional. Los clones no expresantes derivados del vector convencional pueden ser el resultado de roturas en el dominio de tPA o de TNFr-IgG del plásmido durante la integración en el genoma, o el resultado de la metilación de elementos promotores Busslinger et al., Cell 34:197-206, 1983; Watt et al., Genes and Development 2:1136-1143, 1988) de control de la expresión de tPA o de TNFr-IgG. El silenciamiento de un promotor mediante metilación, o roturas en los vectores de DHFR-intrón muy probablemente los incapacitaría para proporcionar un fenotipo DHFR-positivo.

Se descubrió que los pools generados por los vectores DHFR-intrón podían amplificarse en metotrexato y que incrementan la expresión en un factor de 8,4 (tPA) o de 9,8 (TNFr-IgG). Los pools de los vectores convencionales se incrementaron sólo en 2,8 y en 3,0 veces para tPA y TNFr-IgG al amplificarlos de manera similar. Los pools amplificados resultaron en niveles de tPA 9 veces más elevados y niveles de TNFr-IgG 15 veces más elevados en comparación con los pools amplificados con el vector convencional.

Sin limitarse a ninguna teoría en particular, el incremento de expresión de los pools resistentes a metotrexato derivados de los vectores dicistrónicos probablemente se debe al ligamiento transcripcional de DHFR y producto; cuando las células se seleccionan para la expresión incrementada de DHFR, sobreexpresan consistentemente el producto. Los enfoques convencionales carecen de ligamiento de expresión de marcador seleccionable y ADNc y, por lo tanto, la amplificación con metotrexato frecuentemente da lugar a la sobreexpresión de DHFR sin incremento concomitante de la expresión de producto.

Se obtuvo un incremento adicional de 4 y 6,3 veces al transferir pools amplificados de tPA y de TNFr-IgG desde los medios utilizados para las selecciones y las amplificaciones a un medio de producción rico en nutrientes.

En el Ejemplo 3, el vector de expresión presentaba un sitio donador de empalme de correspondencia más estrecha con la secuencia donadora de empalme de consenso y presentaba inserción corriente arriba de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IgE humanizado. Este vector se linearizó y se co-electroporó con un segundo vector linearizado que expresaba el gen de resistencia a la higromicina y la cadena ligera del anticuerpo cada uno bajo el control de su propio promotor/intensificador y señales de poli-A. Se utilizó un exceso de vector de expresión de cadena ligera sobre el vector de expresión dicistrónico de cadena pesada para inclinar la expresión en favor de la cadena ligera. Se generaron clones y un pool tras las selecciones con higromicina B y con DHFR. Se descubrió que los clones expresaban niveles elevados relativamente consistentes de anticuerpo, al igual que el pool. El pool de 1 \muM alcanzó un título de 41 mg/l al cultivarlo bajo condiciones óptimas en cultivo en suspensión.

Se evaluó el anticuerpo anti-IgE mediante marcaje metabólico seguido de SDS/PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras y se descubrió que no podía distinguirse de la proteína expresada por una línea celular clonal altamente caracterizada. Es de particular importancia el resultado de que no se observase ninguna cadena ligera libre en el pool respecto al clon.

Se ha desarrollado un sistema de expresión estable para las células CHO que produce niveles elevados de proteínas recombinantes rápidamente y con menos esfuerzo que el requerido por otros sistemas de expresión. El sistema de vector genera clones estables que expresan niveles consistentemente elevados, reduciendo de esta manera el número de clones que deben cribarse para obtenerse una línea clonal altamente productiva. Alternativamente, se han utilizado pools para generar convenientemente niveles moderados a elevados de proteína. Este enfoque puede resultar particularmente útil cuando debe expresarse y compararse varias proteínas relacionadas.

Sin limitarse a esta teoría, resulta posible que los vectores que presenten sitios donadores de empalme muy eficientes generen clones muy productivos debido a que muy poco transcrito queda sin procesar, de manera que sólo los sucesos de integración que conducen a la generación de niveles elevados de ARN producen suficiente proteína DHFR para dar lugar a colonias en medio selectivo. El nivel elemento de mensaje procesado de estos clones seguidamente se traduce en cantidades abundantes de la proteína de interés. Los pools de clones preparados concurrentemente mediante la introducción de vectores convencionales expresaron niveles inferiores de proteína y eran inestables con respecto a la expresión de largo plazo, y la expresión no pudo incrementarse apreciablemente al someter las células a amplificación con metotrexato.

El sistema desarrollado en la presente invención es versátil en que permite generar con rapidez niveles elevados de polipéptidos de una o múltiples subunidades a partir de clones o pools de transfectantes estables. ESte sistema de expresión combina las ventajas de los sistemas de expresión transitorios (generación rápida y no laboriosa de cantidades investigativas de proteína), con el desarrollo simultáneo de líneas celulares de producción estables altamente productivas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: GENENTECH, INC.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS HUÉSPED DE EXPRESIÓN ELEVADA

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIA: 4

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: EUA

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(F)

ZIP: 94080

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: 5,25 pulgadas, disquete de 360 Kb

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(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: patin (Genentech)

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/286740

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-AGOSTO-1994

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(viii)

DATOS DEL CESIONARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Lee, Wendy M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 00.000

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 798PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 415/225-1994

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(B)

TELEFAX: 415/952-9881

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(C)

TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 7360 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

3

5

6

7

8

9

10

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 6889 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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11

12

13

14

15

16

17

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 6557 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

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18

19

20

21

22

23

24

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 7305 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

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25

26

27

28

29

30

31

Claims (17)

1. Constructo de ADN que comprende un sitio de inicio transcripcional, un sitio de terminación transcripcional, un gen seleccionable, un gen de producto proporcionado en orientación 3' respecto al gen seleccionable, una región reguladora transcripcional que regula la transcripción tanto del gen seleccionable como del gen de producto, estando situado el gen seleccionable dentro de un intrón que presenta un sitio donador de empalme en orientación 5' respecto al intrón, en el que el sitio de la secuencia donadora de empalme regula la expresión del gen de producto utilizando la región reguladora transcripcional y el gen seleccionable es un gen amplificable.

2. Constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que el sitio donador de empalme comprende una secuencia donadora de empalme de consenso.

3. Constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que el sitio donador de empalme comprende la secuencia GACGTAAGT.

4. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen amplificable es DHFR.

5. Constructo de ADN según la reivindicación 1, en el la región reguladora transcripcional comprende un promotor y un intensificador.

6. Vector que comprende el constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Vector según la reivindicación 6 que es capaz de replicación en un huésped eucariótico.

8. Célula huésped eucariótica que comprende el vector según la reivindicación 6 ó 7.

9. Célula huésped eucariótica que comprende el constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Célula huésped eucariótica que comprende el constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 integrado en un cromosoma de la célula huésped.

11. Célula huésped según la reivindicación 10 que es una célula de mamífero.

12. Procedimiento para producir un producto de interés, que comprende cultivar la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 de manera que expresen el gen de producto, y recuperar el producto a partir del cultivo de la célula huésped.

13. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende recuperar el producto del medio de cultivo.

14. Procedimiento para producir un producto de interés que comprende cultivar la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, de manera que expresen el gen de producto en un medio selectivo que comprende un agente de amplificación durante tiempo suficiente para permitir que se produzca la amplificación, y recuperar el producto.

15. Procedimiento para producir células eucarióticas que presentan múltiples copias de un gen de producto que comprende transformar células eucarióticas con el constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, cultivar las células en un medio selectivo que comprende un agente de amplificación durante un tiempo suficiente para que se produzca la amplificación, y seleccionar las células que presentan múltiples copias del gen de producto.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el constructo de ADN se introduce en las células eucarióticas mediante electroporación.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, que comprende además cultivar las células seleccionadas de manera que expresen el gen de producto, y recuperar de las células seleccionadas el producto de interés.