RU2716974C2 - Эукариотические экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы кластеров гена глобина - Google Patents
Эукариотические экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы кластеров гена глобина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2716974C2 RU2716974C2 RU2017134578A RU2017134578A RU2716974C2 RU 2716974 C2 RU2716974 C2 RU 2716974C2 RU 2017134578 A RU2017134578 A RU 2017134578A RU 2017134578 A RU2017134578 A RU 2017134578A RU 2716974 C2 RU2716974 C2 RU 2716974C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cluster
- human
- nucleic acid
- acid sequence
- expression
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 70
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 title claims description 27
- 108060003196 globin Proteins 0.000 title description 28
- 102000018146 globin Human genes 0.000 title description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 132
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 112
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 103
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 76
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 60
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 claims description 47
- 102100038617 Hemoglobin subunit gamma-2 Human genes 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 17
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 15
- 101001009007 Homo sapiens Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 10
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 9
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 8
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 8
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 5
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 claims description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003432 anti-folate effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940127074 antifolate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004052 folic acid antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 3
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 3
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 claims 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 abstract description 6
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010053584 alpha-Globins Proteins 0.000 description 4
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 4
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 108010038853 gamma-Globins Proteins 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102100034581 Dihydroorotase Human genes 0.000 description 2
- 108091000126 Dihydroorotase Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108091005879 Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OJCKRNPLOZHAOU-UGKRXNSESA-N (1r,2r)-2-[(2s,4e,6z,8r,9s,11r,13s,15s,16s)-7-cyano-8,16-dihydroxy-9,11,13,15-tetramethyl-18-oxo-1-oxacyclooctadeca-4,6-dien-2-yl]cyclopentane-1-carboxylic acid Chemical compound O1C(=O)C[C@H](O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@H](C)[C@@H](O)\C(C#N)=C/C=C/C[C@H]1[C@H]1[C@H](C(O)=O)CCC1 OJCKRNPLOZHAOU-UGKRXNSESA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- ZBYVTTSIVDYQSO-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-4-(hydroxyamino)-4-oxobutanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC(=O)NO ZBYVTTSIVDYQSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GEBBCNXOYOVGQS-BNHYGAARSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxyamino)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NO)O1 GEBBCNXOYOVGQS-BNHYGAARSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 6-azauridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=N1 WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 102000053640 Argininosuccinate synthases Human genes 0.000 description 1
- 108700024106 Argininosuccinate synthases Proteins 0.000 description 1
- 102100023927 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 1
- 102000030907 Aspartate Carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N Compactin Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(CO)OC2Oc3cc(O)c4C(=O)C(=COc4c3)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C(O)C1O VGMFHMLQOYWYHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108091005880 Hemoglobin F Proteins 0.000 description 1
- 108010081925 Hemoglobin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 1
- 108091005903 Hemoglobin subunit delta Proteins 0.000 description 1
- 108091005905 Hemoglobin subunit zeta Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710178477 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710154356 Hypoxanthine/guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108090000103 Relaxin Proteins 0.000 description 1
- 102000003743 Relaxin Human genes 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101000899180 Sus scrofa Hemoglobin subunit theta Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010029287 Threonine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 102100040537 Threonine-tRNA ligase 1, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000034127 bone morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229960000961 floxuridine Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 description 1
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- VLCYCQAOQCDTCN-ZCFIWIBFSA-N α-difluoromethylornithine Chemical compound NCCC[C@@](N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/473—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used alpha-Glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионным кластерам, содержащим коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина или сайт гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина и часть промотора человеческого гена Aγ-глобина. Полученные кластеры обеспечивают повышенный уровень экспрессии представляющих интерес белков или полипептидов при их рекомбинантном продуцировании в клетках-хозяевах млекопитающих. 4 н. и 28 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым экспрессионным кластерам, которые могут быть использованы для увеличения выхода продукта представляющего интерес белка. Экспрессионные кластеры содержат элементы регуляции экспрессии кластеров человеческого гена глобина, а в частности, промотор человеческого глобина Aγ и регуляторную область локуса кластера гена β-глобина или α-глобина. Настоящее изобретение, в частности, относится к экспрессионному кластеру, содержащему такие элементы регуляции экспрессии глобина.
Предшествующий уровень техники
Продуцирование рекомбинантных белков является главным аспектом современной биотехнологической промышленности. Оно приобретает все большее значение в ряде применений, требующих увеличения поступления на рынок больших количеств высококачественных белков. Пищевая промышленность, а особенно фармакология, представляют собой две главные области, где спрос на рекомбинантные белки постоянно растет. Для разработки коммерчески продуктивного способа необходима более высокая эффективность продуцирования, а следовательно, более низкая стоимость конечного продукта.
Однако, в настоящее время, важным фактором является высокое качество продукта и его пригодность для введения человеку. В настоящее время появляется все больше и больше областей применения, где требуется рекомбинантное продуцирование белков в эукариотических клетках, а в частности, в высших эукариотических клетках. В частности, белки, несущие посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование (гликопротеинов), значительно отличаются в зависимости от того были ли они экспрессированы в прокариотических клеточных системах, таких как E. coli, или в эукариотических клеточных системах, таких как, человеческие клеточные линии. Во многих случаях, эти различия значительно влияют на биологическую активность, а также на иммуногенность продуцируемых белков. Однако, многие экспрессионные системы, в которых используются высшие эукариотические клеточные линии, имеют довольно низкий уровень экспрессии нужного белка, что снижает выход и увеличивает стоимость рекомбинантного белка.
Поэтому, необходимо разработать новые средства и способы увеличения выхода продуцирования рекомбинантного белка, а особенно, при использовании эукариотических экспрессионных клеточных линий.
Описание сущности изобретения
Как было продемонстрировано в настоящем изобретении, некоторые элементы кластеров человеческого гена глобина могут быть объединены с получением экспрессионного кластера, позволяющего достигать стабильный и высокий уровень экспрессии представляющих интерес полипептидов в эукариотических клетках. В частности, комбинация специфических частей регуляторной области локуса кластера гена β-глобина или кластера гена α-глобина вместе с промотором Aγ-глобина, а также, но необязательно, с 3'-энхансером Aγ-глобина способствует образованию экспрессионного кластера с неожиданно высоким и стабильным уровнем экспрессии.
Поэтому, в своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к способу рекомбинантного продуцирования представляющего интерес полипептида, где указанный способ включает стадии:
(a) получения клетки-хозяина, содержащей экспрессионный кластер, включающий, функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена Aγ-глобина; и
(iii) кодирующую область, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид;
(b) культивирования клетки-хозяина в условиях, при которых клетка-хозяин экспрессирует представляющий интерес полипептид; и
(c) выделения представляющего интерес полипептида.
Во втором своем аспекте, настоящее изобретение относится к экспрессионному кластеру, содержащему функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена Aγ-глобина;
(iii) необязательно кодирующую область;
(iv) область терминации транскрипции; и
(v) энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина;
где экспрессионный кластер не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный человеческий Aγ-глобин.
В своих третьих аспектах, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему экспрессионный кластер согласно второму аспекту изобретения, и к клетке-хозяину, содержащей указанный экспрессионный кластер или указанный вектор.
Другие цели, признаки, преимущества и аспекты настоящего изобретения будут очевидны для специалиста из нижеследующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Однако, следует отметить, что нижеследующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, в которых описаны предпочтительные варианты применения, приводятся лишь в целях иллюстрации. Различные изменения и модификации, составляющие сущность и объем описанного изобретения, будут очевидны для специалиста из нижеследующего описания.
Определения
Используемые здесь нижеследующие общие термины имеют предпочтительно, значения, указанные ниже, если это не противоречит контексту описания, и если это не оговорено особо.
Используемый здесь термин «содержит», помимо его буквального смысла, также включает и, в частности, означает «состоит, по существу, из..» и «состоит из..». Таким образом, термин «содержит» относится к вариантам, где предмет изобретения, который «включает» конкретно перечисленные элементы и не содержит других элементов, а также к вариантам, где предмет изобретения, который «включает» конкретно перечисленные элементы, может содержать и/или действительно содержит другие элементы. Аналогичным образом, слово «имеет» следует понимать как слово «содержит», которое также подразумевает и, в частности, означает «состоит, по существу, из..» и «состоит из..».
Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» означает рибонуклеотидный или дезоксирибонуклеотидный полимер. Нуклеиновой кислотой может быть РНК или ДНК. Она может состоять из одной полимерной цепи, либо она может быть двухцепочечной. Нуклеиновая кислота может быть природной, рекомбинантной или синтетической. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, нуклеиновой кислотой является двухцепочечная ДНК.
«Экспрессионный кластер» представляет собой полученную или синтезированную конструкцию нуклеиновой кислоты с элементами нуклеиновой кислоты, способными осуществлять экспрессию структурного гена у хозяев, которые являются совместимыми с такими последовательностями. Экспрессионные кластеры включают по меньшей мере промотор и, необязательно, сигналы терминации транскрипции. Экспрессионный кластер обычно включает транскрибируемую нуклеиновую кислоту и промотор. Могут быть также использованы и дополнительные факторы, стимулирующие экспрессию, как описано в настоящей заявке. Так, например, экспрессионный кластер может также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальную последовательность, которая направляет секрецию экспрессируемого белка из клетки-хозяина. Экспрессионный кластер предпочтительно является частью экспрессионного вектора. Клетки-хозяева, используемые для экспрессии транскрибируемой нуклеиновой кислоты, трансформируют или трансфецируют экспрессионным вектором. Для отбора трансформированных клеток, содержащих эти конструкции, в экспрессионные векторы может быть соответствующим образом включен селективный маркерный ген. Специалисту в данной области известно, что этот векторный компонент может быть модифицирован без какого-либо значительного влияния на его функцию.
Термин «функционально присоединенный» означает, что два или более элементов экспрессионного кластера присоединены друг к другу так, что это приводит к координации их функций и к экспрессии кодирующей последовательности (например, кодирующей области). Так, например, промотор, функционально присоединенный к кодирующей последовательности, гарантированно обеспечивает экспрессию указанной кодирующей последовательности. Конструирование экспрессионного кластера согласно изобретению и сборка его различных элементов могут быть осуществлены методами, хорошо известными специалистам, а в частности, методами, описанными в руководстве Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Используемые здесь термины «вышерасположенный» и «нижерасположенный» относятся к положению элемента или последовательности нуклеиновой кислоты на молекуле нуклеиновой кислоты по отношению к другому элементу или к другой последовательности нуклеиновой кислоты на указанной молекуле нуклеиновой кислоты. Термин «вышерасположенный» относится к положению, расположенному ближе к 5'-концу молекулы нуклеиновой кислоты, а термин «нижерасположенный» относится к положению, расположенному ближе к 3'-концу молекулы нуклеиновой кислоты. В случае двухцепочечных нуклеиновых кислот, а в частности, ДНК, цепь нуклеиновой кислоты, которая используется в качестве матрицы для транскрипции РНК, такой как мРНК, то есть, смысловой цепи, применяется для определения 5'-конца и 3'-конца нуклеиновой кислоты. Следовательно, «вышерасположенный» указывает на направление к 5'-концу смысловой цепи, а «нижерасположенный» указывает на направление к 3'-концу смысловой цепи.
«Гомология» последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или аминокислотной последовательности-мишени означает, что указанные последовательности по меньшей мере на 75%, а более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны или идентичны указанной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или аминокислотной последовательности-мишени. «Гомологию» или «идентичность» аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности определяют предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением по всей длине последовательности-мишени или по всей длине указанной части последовательности-мишени. Настоящее изобретение, если оно относится к конкретной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, также, в основном, охватывает гомологи указанной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно. Гомолог последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или аминокислотной последовательности-мишени, в частности, представляет собой функциональный гомолог, который имеет такие же или, в основном, такие же функции и активности последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или аминокислотной последовательности-мишени, от которых они происходят.
«Промотор» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая осуществляет и регулирует транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты, функционально присоединенной к этой последовательности, а в частности, к кодирующей последовательности. Промотор содержит последовательность распознавания связывания РНК-полимеразы и включает последовательность или представляет собой последовательность, функционально присоединенную к сайту инициации транскрипции. Промотором может быть индуцибельный промотор, обладающий активностью только в присутствии (или в отсутствии) специфического сигнала, либо таким промотором может быть конститутивно активный промотор. Активность промотора может также регулироваться регуляторными элементами, такими как регуляторные области локуса и энхансерные элементы.
«Кодирующая последовательность» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую генный продукт, такой как полипептид или РНК.
«Часть» элемента нуклеиновой кислоты, в частности, содержит по меньшей мере 5 нуклеиновых кислот, а предпочтительно, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 нуклеиновых кислот указанного элемента нуклеиновой кислоты. «Часть» элемента нуклеиновой кислоты, в частности, содержит по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, а предпочтительно, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов указанного элемента нуклеиновой кислоты. В частности, эта часть содержит по меньшей мере 1%, а предпочтительно, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 7,5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 25% указанного элемента нуклеиновой кислоты. «Функциональная часть» элемента нуклеиновой кислоты представляет собой часть указанного элемента, способную осуществлять нужную функцию элемента. Так, например, функциональная часть регуляторной области локуса, промотора или 3'-энхансера способна модулировать, а в частности, повышать уровень экспрессии кодирующей области, к которой она функционально присоединена. Часть элемента нуклеиновой кислоты, в частности, означает функциональную часть указанного элемента нуклеиновой кислоты.
Используемые здесь термины «пептид» или «полипептид» означают полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере 5 аминокислот. Пептид или полипептид, предпочтительно, содержит по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 35 аминокислот. Используемые здесь термины «пептид» или «полипептид» также означают белки, включая пептиды, полипептиды и белки, которые были посттрансляционно модифицированны. В частности, термин пептид или полипептид включает гликозилированные пептиды и гликопротеины. Используемые здесь термины «пептид» или «полипептид» являются синонимами.
Часть пептида, полипептида или белка предпочтительно включает по меньшей мере 3 смежных аминокислот указанного пептида, полипептида или белка, а предпочтительно, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 смежных аминокислот указанного белка.
Термин «фармацевтическая композиция» и аналогичные термины, в частности, означают композицию, подходящую для введения человеку, то есть, композицию, содержащую компоненты, которые являются фармацевтически приемлемыми. Фармацевтическая композиция, предпочтительно, содержит активное соединение или его соль или пролекарство вместе с носителем, разбавителем или фармацевтическим наполнителем, таким как буфер, консервант и модификатор тоничности.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к экспрессионному кластеру, содержащему по меньшей мере часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена глобина и промотора человеческого Aγ-глобина.
Гемоглобин представляет собой металлопротеин, присутствующий в крови человека и животных и осуществляющий транспорт кислорода и диоксида углерода. Гемоглобин представляет собой мультисубъединичный глобулярный белок, состоящий из четырех субъединиц (глобинов), каждая из которых состоит из полипептидной цепи, тесно связанной с гемом, то есть, с группой, которая несет ион железа. Существует несколько различных типов субъединиц глобина, и состав субъединиц гемоглобина изменяется на протяжении всей жизни. Так, например, плод человека имеет гемоглобин F, состоящий из двух α-глобинов и двух γ-глобинов (α2γ2), а у взрослого человека преобладает гемоглобин А с двумя α-глобинами и двумя β-глобинами (α2β2). Различные полипептиды глобина экспрессируются кластерами человеческого гена глобина, ответственными за экспрессию различных субъединиц на различных стадиях развития человека. Кластер человеческого гена β-глобина содержит регуляторную область локуса и пять различных генов глобина, то есть, ген ε-, Gγ-, Aγ-, δ- и β-глобина. Аналогичным образом, кластер гена α-глобина также содержит регуляторную область локуса и гены ζ-, α2-, α1- и θ-глобина. На фигуре 1 представлена структура кластеров человеческого гена α- и β-глобина. Каждый отдельный ген глобина в генном кластере имеет свои собственные специфические промоторные и энхансерные последовательности, которые регулируют экспрессию кодирующией последовательности соответствующей субъединицы глобина. Однако, эти промоторы сами регулируются регуляторной областью локуса. В частности, регуляторная область локуса способна активировать или инактивировать промоторы, и этот паттерн активации изменяется на протяжении всей жизни. Обе регуляторные области локуса (одна в кластере гена α-глобина и одна в кластере гена β-глобина) регулируют экспрессию различных генов глобина в процессе развития организма, что позволяет получить специфический состав субъединиц различных белков гемоглобина.
Регуляторные области локуса содержат несколько сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I (HS), ответственных за активацию и инактивацию промоторов. Было обнаружено, что, например, HS2 кластера гена β-глобина регулирует активность промотора Aγ-глобина. HS2 кластера гена β-глобина может быть дополнительно подразделен на коровую область и модуляторные субдомены. Коровой областью является часть HS2, которая, главным образом, ответственна за активацию промотора глобина. Модуляторные субдомены M1-M5 позитивно или негативно модулируют эффект корового домена. Коровая область расположена между модуляторными субдоменами M1 и M2, а за ними следуют M1-M5. В частности, M1 и M2 также усиливают активирующий эффект коровой области на промоторе Aγ-глобина.
В настоящее время известно, что использование экспрессионных элементов кластеров человеческого гена глобина позволяет достичь стабильного и высокого уровня экспрессии целевого продукта, такого как представляющий интерес полипептид в эукариотических клетках, а в частности, в клетках крови человека или в клетках, происходящих от этих клеток. Настоящее изобретение относится к экспрессионному кластеру, содержащему по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого Aγ-глобина и по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена α-глобина или β-глобина. Экспрессионный кластер также содержит кодирующую область, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид и/или сайт клонирования для введения такой кодирующей области. Экспрессионный кластер может также включать энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина. Регуляторная область локуса, промотор и 3'-энхансер расположены в экспрессионном кластере так, что они могут модулировать, а в частности, осуществлять и усиливать экспрессию кодирующей области. Экспрессионный кластер может также включать область терминации транскрипции, где осуществляется терминация транскрипции кодирующей области. Элементы экспрессионного кластера, в частности, функционально присоединены друг к другу.
Конкретные примеры экспрессионного кластера включают последовательность нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NN: 1-5 или состоят из этой последовательности. Соответствующие экспрессионные элементы также представлены на фигуре 2, где показаны различные элементы экспрессионных кластеров. В частности, HS4, HS3, HS2 и HS40 представляют собой части регуляторной области локуса кластера человеческого α-глобина или β-глобина. За этой регуляторной областью локуса показана функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина (Aγ-Prom). За этой областью расположена кодирующая последовательность или сайт клонирования для введения кодирующей последовательности (CS) и область терминации транскрипции, включая сигнал полиаденилирования (γpA). На конце экспрессионного кластера расположена функциональная часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина (Aγ-Enh).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, экспрессионный кластер не содержит интрона 2 β-глобина, а в частности, любого интрона гена β-глобина или любого другого гена глобина.
Промотор человеческого
A
γ-глобина
В экспрессионном кластере используется функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина для осущетвления и регуляции экспрессии кодирующей области, а в частности, представляющего интерес полипептида. Функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина, в частности, расположена выше кодирующей области. Она функционально присоединена к кодирующей области и обеспечивает транскрипцию и регуляцию транскрипции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина включает сайт инициации транскрипции, где происходит инициация транскрипции пре-мРНК. Кроме того, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина может также включать по меньшей мере часть 5'-нетранслируемой области (5'-UTR), а в частности, по меньшей мере часть 5'-UTR человеческого гена Aγ-глобина. В конкретных вариантах осуществления изобретения, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина включат по меньшей мере часть человеческого гена Aγ-глобина, которая осуществляет транскрипцию мРНК человеческого Aγ-глобина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина содержит CCAAT-бокс. В частности, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина включает, или состоит из них, нуклеотиды (-299)-(-26), а в частности, нуклеотиды (-299)-(+36), нуклеотид (-384)-(-26) или нуклеотиды (-384)-(+36) по отношению к сайту инициации транскрипции человеческого гена Aγ-глобина. В частности, функциональная часть промотора человеческого Aγ-глобина включает последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1123-1542 SEQ ID NO: 1 и, по существу, состоит из нее. Можно также использовать более короткие фрагменты промотора человеческого Aγ-глобина, которые являются еще функциональными. Специалист в данной области может самостоятельно определить подходящие функциональные части промотора человеческого Aγ-глобина. В частности, методы определения активности промоторной последовательности известны специалистам и описаны ниже в примерах.
Альтернативно, гомолог указанной функциональной части промотора человеческого Aγ-глобина может быть использован в соответствии с настоящим изобретением. Указанный гомолог, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, а более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен одной из последовательностей нуклеиновой кислоты, определенной выше, по всей ее длине. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гомолог имеет такую же функцию и/или активность или, по существу, такую же функцию и/или активность, как и функциональная часть промотора Aγ-глобина, от которого она происходит, и в частности, обеспечивает уровнь экспрессии кодирующей области, составляющий по меньшей мере 75%, а предпочтительно, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% от уровня экспрессии, достигаемого с использованием функциональной части промотора Aγ-глобина, от которой она происходит, в одних и тех же условиях.
Регуляторная область локуса
Регуляторная область локуса функционально присоединена к промоторной области и способна модулировать, а в частности, усиливать активность функциональной части промотора человеческого Aγ-глобина. Регуляторная область локуса, в частности, расположена выше промотороной области.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения используется регуляторная область локуса или функциональная часть кластера человеческого гена β-глобина. Как известно специалистам, регуляторная область локуса человеческого гена β-глобина включает четыре эритроид-специфических сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I, обозначаемых HS1-HS4 и расположенных на 6-20 т.п.н. выше первого гена глобина этого генного кластера, то есть, гена ε-глобина. В частности, HS2 отвественнен за регуляцию экспрессии генов глобина, и считается, что он включает главный функциональный компонент регуляторной области локуса. HS2 регуляторной области локуса человеческого β-глобина подразделяется на коровый элемент и дополнительные модуляторные субдомены, где коровый элемент расположен между модуляторными субдоменами M1 и M2. Коровый элемент представляет собой минимальную область регуляторной области локуса β-глобина, которая способна усиливать промоторную активность промотора человеческого Aγ-глобина.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, регуляторная область локуса включает коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина. В частности, коровый элемент HS2 кластера человеческого гена β-глобина имеет последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, регуляторная область локуса включает или состоит из них, коровый элемент HS2 и два смежных модуляторных субдомена M1 и M2, то есть, элемент M1-кор-M2 HS2 кластера человеческого гена β-глобина. Указанный элемент M1-кор-M2 может иметь последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 742-995 SEQ ID NO: 1. Следовательно, он включает коровую область HS2, имеющую последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления изобретения, регуляторная область локуса включает по меньшей мере функциональную часть сайта гиперчувствительности 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 741-1109 SEQ ID NO: 1. Эта функциональная часть HS2 включает элемент M1-кор-M2 и дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенную непосредственно ниже.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, регуляторная область локуса, которая включает по меньшей мере функциональную часть HS2 кластера человеческого гена β-глобина, также содержит по меньшей мере часть сайта гиперчувствительности 3 (HS3) кластера человеческого гена β-глобина. В частности, HS3 или его часть расположены выше HS2 или его части в регуляторной области локуса экспрессионного кластера. HS3 или его часть, в частности, содержат последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 310-735 SEQ ID NO: 1 или состоят из нее. Кроме того, регуляторная область локуса может также включать сайт гиперчувствительности 4 (HS4) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, которые, в частности, расположены выше HS2 и HS3, если они присутствуют. В некоторых вариантах осуществления изобретения, HS4 или его часть включают последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 13-294 SEQ ID NO: 1 или состоят из нее. Следовательно, регуляторная область локуса экспрессионного кластера согласно изобретению может включать, в направлении к 3'-концу, но необязательно, по меньшей мере часть HS4, необязательно, по меньшей мере часть HS3, и по меньшей мере функциональную часть HS2 кластера человеческого гена β-глобина. В альтернативных вариантах осуществления изобретения, регуляторная область локуса не содержит сайта гиперчувствительности 3 (HS3) кластера человеческого гена β-глобина.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, регуляторная область локуса имеет последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательностей в положениях 13-1109 SEQ ID NO: 1, в положениях 20-819 SEQ ID NO: 2, в положениях 18-386 SEQ ID NO: 3 и в положениях 13-266 SEQ ID NO: 4.
В другом варианте осуществления изобретения, регуляторная область локуса содержит по меньшей мере функциональную часть сайта гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина. Часть HS40, в частности, включает или состоит из него, коровый элемент HS40, который может иметь последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 24-278 SEQ ID NO: 5. В частности, HS40 или его часть включают последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 7-372 SEQ ID NO: 5 или состоит из нее.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения может быть использована регуляторная область локуса, включающая последовательность нуклеиновой кислоты или состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, которая гомологична одной из последовательностей вышеуказанных регуляторных областей локуса. В частности, указанный гомолог имеет последовательность, которая по меньшей мере 90%, а предпочтительно, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична одной из вышеуказанных последовательностей регуляторных областей локуса по всей длине и/или имеет такую же или почти такую же функцию, как и регуляторная область локуса, от которой она происходит. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, регуляторная область локуса гомолога обеспечивает уровень экспрессии кодирующей области, который составляет по меньшей мере 75%, а предпочтительно, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% от уровня экспрессии, достигаемого с использованием регуляторной области локуса, от которой она происходит, в одних и тех же условиях.
Кодирующая область
Кодирующая область экспрессионного кластера включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие представляющий интерес продукт, а в частности, представляющий интерес полипептид, который экспрессируется в экспрессионном кластере. Экспрессия последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующей области регулируется промоторной областью и, следовательно, функционально присоединена к этой области. При введении экспрессионного кластера, необязательно присутствующего в векторе, в подходящую клетку-хозяина, указанная клетка-хозяин продуцирует продукт, а в частности, полипептид, кодируемый последовательностями нуклеиновой кислоты кодирующей области.
Кодирующая область экспрессионного кластера, в частности, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид, или состоит из этой последовательности.
Представляющим интерес полипептидом может быть любой полипептид, включая белки. Такой полипептид может иметь любое происхождение, включая полипептиды млекопитающих и человеческие полипептиды, а также искусственные полипептиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полипептид включает один или более сайтов гликозилирования и, в частности, представляет собой гликозилированный полипептид, такой как гликопротеин или его часть; антитела или их производные или части; пептидные гормоны; гонадотропины, такие как FSH (фолликуло-стимулирующий гормон), CG (хорионический гонадотропин), LH (лютеинизирующий гормон) и TSH (тиреотропный гормон), включая все их изоформы и варианты; эритропоэтин; факторы свертывания крови, такие как фактор VII, VIII, IX или фактор фон Виллебранда; лизосомные ферменты и цитокины. Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть выбран из группы, состоящей из любых белковых молекул группы цитокинов и их рецепторов, например, факторов некроза опухоли TNF-альфа и TNF-бета; ренина; человеческого гормона роста и бычьего гормона роста; рилизинг-фактора гомона роста; паратиреоидного гормона; стереотропного гормона; липопротеинов; альфа-1-антитрипсина; A-цепи и B-цепи инсулина; гонадотропинов, например, фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), тиротропина и человеческого хорионического гонадотропина (hCG); кальцитонина; глюкагона; факторов свертывания крови, таких как фактор VIIIC, фактор IX, фактор VII, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; факторов, препятствующих свертыванию крови, таких как белок C; натрийуретического фактора предсердий; поверхностно-активного вещества легких: активаторов плазминогена, таких как урокиназа, человеческий активатор плазминогена мочи и активатор плазминогена тканевого типа; бомбезина; тромбина; гемопоэтического фактора роста; энкефаллиназы; воспалительного белка человеческих макрофагов; сыворотчного альбумина, такого как альбумин человеческой сыворотки; мюллеровского ингибирующего фактора; А-цепи и В-цепи релаксина; прорелаксина; пептида, ассоциированного с мышиным гонадотропином; васкулярного эндотелиального фактора роста; рецепторов гормонов или факторов роста; интегрина; белка A и D; ревматоидных факторв; нейротропных факторов, таких как нейротропный фактор кости, нейротропин -3, -4, -5, -6 и фактор-бета роста нервных тканей; тромбоцитарного фактора роста; фактора роста фибробластов; эпидермального фактора роста; трансформирующего фактора роста, такого как TGF-альфа и TGF-бета; инсулинподобного фактора роста -l и -II; белков, связывающихся с инсулинподобным фактором роста; белков CD, таких как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтина (EPO); остеогенных факторов; иммунотоксинов; белка морфогенеза кости; интерферона, такого как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующих факторов (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкинов (IL), например, IL-1 - IL-12; супероксид-дисмутазы; Т-клеточных рецепторов; поверхностных мембранных белков; фактора, ускоряющего разложение; антител и иммуноадгезинов; гликофорина A; и белков-муцинов, таких как MUC1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, представляющий интерес полипептид представляет собой антитело или его часть или производное. В частности, представляющим интерес полипептидом может быть тяжелая цепь или легкая цепь антитела или его части. Кроме того, представляющим интерес полипептидом может быть часть или производное антитела, выбранные из группы, состоящей из (i) Fab-фрагментов, одновалентных фрагментов, состоящих из вариабельной области и первого константного домена каждой тяжелой и легкой цепи; (ii) F(ab)2-фрагментов, двухвалентных фрагментов, содержащих два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагментов, состоящих из вариабельной области первого константного домена CH1 тяжелой цепи; (iv) Fv-фрагментов, состоящих из вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи одной ветви антитела; (v) scFv-фрагментов, Fv-фрагментов, состоящих из одной полипептидой цепи; (vi) (Fv)2-фрагментов, состоящих из двух Fv-фрагментов, ковалентно связанных друг с другом; (vii) вариабельного домена тяжелой цепи и (viii) мультиантител, состоящих из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, ковалентно связанных друг с другом так, чтобы ассоциация вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи могла быть только межмолекулярной, но не внутримолекулярной. В тех вариантах, где экспрессионный кластер включает кодирующую область, кодирующую антитело или его часть или производное, регуляторная область локуса, в частности, содержит по меньшей мере часть HS2 кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно, по меньшей мере часть HS2 и по меньшей мере HS3 кластера человеческого гена β-глобина, или по меньшей мере часть HS2 и по меньшей мере часть HS4 кластера человеческого гена β-глобина, а в частности, по меньшей мере часть HS2 и по меньшей мере часть HS3 и по меньшей мере часть HS4 кластера человеческого гена β-глобина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодирующая область кодирует более, чем один полипептид, а в частности, два полипептида. В этих вариантах осуществления изобретения, кодирующая область может содержать две или более отдельных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые транскрибируются в отдельные мРНК, каждая из которых имеет свой собственный сайт инициации транскрипции, сайт терминации транскрипции и сигнал полиаденилирования. Альтернативно, кодирующая область может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в мРНК, включающую две или более отдельных кодирующих последовательностей нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует отдельный полипептид. В этих вариантах осуществления изобретения, кодирующая область может включать один или более внутренних сайтов связывания с рибосомой, каждый из которых кодирует каждую последовательность нуклеиновой кислоты. Эти внутренние сайты связывания с рибосомой осуществляют трансляцию более, чем одного полипептида из одного транскрипта. В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодирующая область кодирует два полипептида, а в частности, тяжелую цепь и легкую цепь антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодирующая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, который, в частности, включает внеклеточный сигнал локализации. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, может представлять собой лишь кодирующую последовательность кодирующей области, либо она может присутствовать помимо других кодирующих последовательностей, таких как последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описанный выше полипептид. Сигнальный пептид, в частности, индуцирует секреторную экспрессию представляющего интерес полипептида, кодируемого кодирующей областью. Сигнальный пептид может отщепляться от остального полипептида в процессе экспрессии. Сигнальный пептид, в частности, расположен выше других кодирующих последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащихся в кодирующей области, или выше сайта клонирования, в частности, в начале кодирующей области. Кроме того, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, расположена в одной рамке считывания с другими кодирующими последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащимися в кодирующей области.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, кодирующая область включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодирующая область не содержит репортерного гена или селективного маркерного гена. В других вариантах осуществления изобретения, кодирующая область не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок глобин или его часть, включающие по меньшей мере 20 смежных аминокислот белка глобина.
Сайт клонирования
В некоторых вариантах осуществления изобретения, экспрессионный кластер включает сайт клонирования для интеграции последовательности нуклеиновой кислоты. Сайт клонирования может присутствовать в экспрессионном кластере вместо кодирующей области и может служить для введения указанной последовательности нуклеиновой кислоты в экспрессионный кластер. Кроме того, сайт клонирования может присутствовать в экспрессионном кластере помимо кодирующей области, а в частности, в тех вариантах осуществления изобретения, где кодирующая область содержит только последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид.
Сайт клонирования, присутствующий в экспрессионном кластере, является подходящим для введения кодирующей области, а в частности, нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, в экспрессионный кластер. Подходящие сайты клонирования и методы введения фрагментов нуклеиновой кислоты в другие молекулы нуклеиновой кислоты, такие как экспрессионные кластеры или векторы, хорошо известны специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт клонирования содержит по меньшей мере одну, а в частности, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре или по меньшей мере пять последовательностей распознавания рестриктирующих ферментов. Подходящие рестриктирующие ферменты и распознающие их последовательности известны специалистам. Репрезентативными рестриктирующими ферментами являются EcoRI, EcoRV, HindIII, BamHI, XbaI, PvuI, KpnI, BstXI, XmaI, SmaI, NotI, XhoI и ClaI. Репрезентативная последовательность нуклеиновой кислоты множественного сайта клонирования представлена последовательностью нуклеиновой кислоты в положениях 1559-1664 SEQ ID NO: 1.
Область терминации транскрипции
В некоторых вариантах осуществления изобретения, экспрессионный кластер включает область терминации транскрипции. Область терминации транскрипции функционально присоединена к промоторной области и осуществляет терминацию транскрипции кодирующей области. Эта область расположена ниже кодирующей области и/или сайта клонирования.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, область терминации транскрипции содержит сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования. Сигналом полиаденилирования может быть любой сигнал полиаденилирования, способный индуцировать полиаденилирование пре-мРНК в эукариотических клетках, а в частности, в человеческих клетках. Он может содержать последовательность нуклеиновой кислоты или состоять из последовательности нуклеиновой кислоты в положениях 1725-1730 SEQ ID NO: 1 или ее гомолога.
Энхансерная область
В некоторых вариантах осуществления изобретения, экспрессионный кластер содержит энхансерную область, а в частности, 3'-энхансерную область. 3'-энхансерная область расположена ниже кодирующей области и/или сайта клонирования и ниже области терминации транскрипции, если она присутствует. Эта область функционально присоединена к промоторной области и усиливает экспрессию кодирующей области. Энхансерная область, в частности, содержит по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина или состоит из нее. В некоторых вариантах осуществления изобретения, энхансерная область содержит последовательность нуклеиновой кислоты или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты в положениях 2136-2881 SEQ ID NO: 1 или ее гомолога. В некоторых вариантах осуществления изобретения, энхансерная область гомолога обеспечивает уровень экспрессии кодирующей области, который составляет по меньшей мере 75%, а предпочтительно, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% от уровня экспрессии, достигаемого с использованием энхансерной области, от которой она происходит, в одних и тех же условиях.
Вектор, содержащий экспрессионный кластер
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к к вектору, содержащему экспрессионный кластер согласно изобретению. Таким вектором может быть любой вектор, подходящий для переноса экспрессионного кластера в клетку-хозяина. Подходящие векторы известны специалистам. В частности, данный вектор адаптирован для переноса в эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, а в частности, человеческие клетки.
Помимо экспрессионного кластера, вектор может включать и другие элементы. Так, например, вектор может включать один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один из селективных маркеров является подходящим для отбора клеток-хозяев, содержащих данный вектор, в частности, эукариотических клеток-хозяев, таких как клетки-хозяева млекопитающих, а в частности, человеческие клетки-хозяева, от клеток-хозяев, не содержащих этого вектора. Подходящими примерами селективных маркеров являются гены, которые сообщают резистентность к соединению-антибиотику. Кроме того, вектор может содержать элементы, подходящие для его амплификации в прокариотических клетках-хозяевах, таких как клетки E. coli. Такими элементами являются, например, ориджин репликации, такой как Col E1 Ori и, прокариотический селективный маркер, такой как ген, сообщающий резистентность к бактерициду, например, к ампициллину.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектор представляет собой кольцевую или линейную двухцепочечную ДНК, а в частности, кольцевую двухцепочечную ДНК.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектор включает экспрессионный кластер с кодирующей областью, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид.
Селективный маркерный ген
В некоторых вариантах осуществления изобретения, вектор также содержит селективный маркерный ген. Селективный маркерный ген необязательно должен быть функционально присоединен к элементам экспрессионного кластера. Селективный маркерный ген позволяет осуществлять отбор клеток-хозяев, которые содержат данный вектор. Клетки, содержащие данный вектор, предпочтительно, культивируют в присутствии соответствующего селективного агента, который подавляет или ингибирует пролиферацию клеток, не содержащих селективного маркерного гена.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, селективный маркерный ген представляет собой амплифицированный селективный маркерный ген, который позволяет осуществлять амплификацию маркерного гена и ко-амплификацию экспрессионного кластера, присутствующего в этом же векторе. При использовании амплифицированного селективного маркерного гена, амплификация селективного маркера, в частности, в трансфицированных клетках, в частности, достигается путем поэтапного культивирования клеток в присутствии возрастающих концентраций селективного агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, селективный маркерный ген кодирует дигидрофолат-редуктазу (DHFR), такую как антифолат-резистентный вариант DHFR, а соответствующим селективным агентом является антифолат, такой как метотрексат.
Другими примерами подходящих амплифицируемых селективных маркерных генов и их соответствующих селективных агентов являются ген резистентности к неомицину (например, аминогликозид-фосфотрансфераза) и генетицин (G418); пуромицин-N-ацетилтрансфераза и пуромицин; металлотионеин и кадмий; CAD (карбомоил-фосфатсинтетаза: аспартат-транскарбамилаза: дигидрооротаза) и N-фосфоацетил-L-аспартат; аденозин-дезаминаза и Xyl-A- или аденозин, 2'-дезоксикоформицин; AMP (аденилат)-дезаминаза и аденин, азасерин, коформицин; UMP-синтаза и 6-азауридин, пиразофуран; IMP 5'-дегидрогеназа и микофеноловая кислота; ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза и микофеноловая кислота с ограниченным количеством ксантина; мутантная HGPRTаза или мутантная тимидинкиназа и гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT); тимидилат-синтетаза и 5-фтордезоксиуридин;; P-гликопротеин 170 (MDR1) и адриамицин, винкристин, колхицин; рибонуклеотид-редуктаза и афидиколин; глутамин-синтетаза и метионин-сульфоксимин (MSX); аспарагин-синтетаза и β-аспартилгидроксамат, альбизин, 5'-азацитидин; аргининосукцинат-синтетаза и канаванин; орнитин-декарбоксилаза и α-дифторметилорнитин; HMG-CoA-редуктаза и компактин; N-ацетилглюкозаминил-трансфераза и туникамицин; треонил-тРНК-синтетаза и боррелидин; и Na+K+-АТФаза и убаин.
Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный кластер или вектор
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный кластер согласно изобретению или вектор согласно изобретению. Клеткой-хозяином может быть любая клетка, подходящая для трансфекции экспрессионным кластером или вектором, а в частности, подходящая для продуцирования представляющего интерес полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин происходит от клеточной линии со стабильной экспрессией. Клеткой-хозяином, в частности, является эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающего, а в частности, клетка человека или происходящая от нее клетка. В частности, клеткой-хозяином является клетка крови, такая как лейкоцит, клетка-предшественник крови или клетка лейкоза или клетка, происходящая от этих клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клеткой-хозяином является клетка лейкоцитарного происхождения.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин происходит от клеток человеческого миелоидного лейкоза. Конкретными примерами клеток-хозяев являются K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X, GT-5s и клетки, происходящие от любой из указанных клеток-хозяев. K562 представляет собой клеточную линию человеческого миелоидного лейкоза, имеющуюся в Американской коллекции типовых культур (ATCC CCL-243). Остальные клеточные линии происходят от клеток K562 и были отобраны на специфические признаки гликозилирования. Клеточные линии, происходящие от K562, могут быть культивированы и могут поддерживаться в хорошо известных условиях, подходящих для K562. Все эти клеточные линии, за исключением клеток K562, были депонированы в соответствии с Будапештским договором. Информацию о депонировании можно найти в конце описания.
Репрезентативные клетки-хозяева также описаны, например, в WO 2008/028686. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетку-хозяина оптимизируют по экспрессии гликопротеинов, имеющих специфический паттерн гликозилирования. В частности, встречаемость кодонов в кодирующей области и/или в промоторе и в других элементах экспрессионного кластера или вектора является совместимой с типом используемых клеток-хозяев, а в частности, оптимизирована по этому типу.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, клеткой-хозяином является выделенная клетка-хозяин. В конкретных вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин не присутствует в организме человека или животного.
Клетка-хозяин может быть транзиентно или стабильно трансфецирована экспрессионным кластером или вектором согласно изобретению. Стабильную трансфекцию предпочтительно осуществляют в частности, путем интеграции экспрессионного кластера в геном клетки-хозяина. Методы трансфекции для стабильной или транзиентной трансфекции хорошо известны специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетку-хозяина трансфецируют вектором, который содержит экспрессионный кластер с кодирующей областью, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид.
Способ продуцирования
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу рекомбинантного продуцирования представляющего интерес полипептида, где указанный способ включает стадии:
(a) получения клетки-хозяина, содержащей экспрессионный кластер, включающий, функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена Aγ-глобина; и
(iii) кодирующую область, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид;
(b) культивирования клетки-хозяина в условиях, при которых клетка-хозяин экспрессирует представляющий интерес полипептид; и
(c) выделения представляющего интерес полипептида.
Клетка-хозяин, в частности, содержит экспрессионный кластер, определенный в настоящей заявке и имеющий один или более определенных здесь элементов.
Условия, подходящие для культивирования клеток-хозяев и экспрессии представляющего интерес полипептида, зависят от конкретной клетки-хозяина, вектора и экспрессионного кластера, используемых в этом способе. Специалист в данной области может легко определить подходящие условия, и условия для множества клеток-хозяев уже описаны в литературе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетку-хозяина трансфецируют вектором, содержащим экспрессионный кластер, а также селективный маркерный ген. В этих вариантах осуществления изобретения, условия культивирования в стадии (b) могут включать присутствие соответствующего селективного агента в клеточной культуральной среде.
Выделение представляющего интерес полипептида, в частности, означает отделение представляющего интерес полипептида от остальных компонентов клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения, кодирующая область экспрессионного кластера также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид для секреторной экспрессии, а в стадии (b), представляющий интерес полипептид секретируется клеткой-хозяином. В этих вариантах осуществления изобретения, стадия (c), в частности, включает отделение клеточной культуральной среды, содержащей представляющий интерес полипептид, от клеток-хозяев, например, путем центрифугирования, и отделение представляющего интерес полипептида от некоторых или большинства компонентов клеточной культуральной среды, например, хроматографическими методами. Подходящие методы и средства для выделения представляющего интерес полипептида известны специалистам и могут быть легко выбраны самим специалистом.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ продуцирования представляющего интерес полипептида, после проведения стадии (c), также включает стадию
(d) приготовления представляющего интерес полипептида в виде фармацевтической композиции.
Приготовление представляющего интерес полипептида в виде фармацевтической композиции, в частности, включает обмен буферного раствора или компонентов буферного раствора композиции, содержащей представляющий интерес полипептид. Кроме того, стадия приготовления может включать лиофилизацию представляющего интерес полипептида. В частности, представляющий интерес полипептид переносят в композицию, содержащую только фармацевтически приемлемые ингредиенты.
Указанные здесь числовые интервалы являются инклюзивными в пределах определенного интервала. Указанные здесь заголовки не рассматриваются как ограничения различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут быть представлены со ссылкой на описание как единое целое. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, описанный здесь предмет изобретения, включающий некоторые стадии, если он относится к способам, и некоторые ингредиенты, если он относится к композициям, означает предмет изобретения, состоящий из соответствующих стадий или ингредиентов. При этом предпочтительно выбрать и объединить конкретно описанные здесь аспекты и варианты и конкретный предмет изобретения, относящийся к соответствующей комбинации конкретных вариантов изобретения, также являющихся частью настоящего описания.
Чертежи
На фигуре 1 представлена структура кластеров человеческого гена глобина, включающих регуляторную область локуса (LCR) с различными сайтами гиперчувствительности к ДНКазе (HS) и с различными генами глобина. A: кластер человеческого гена β-глобина на хромосоме 11; B: кластер человеческого гена α-глобина на хромосоме 16.
На фигуре 2 представлены элементы репрезентативных экспрессионных кластеров, используемых в векторах pHBG1A-E. HS: сайт гиперчувствительности к ДНКазе; Aγ-Prom: промотор гена Aγ-глобина; CS: кодирующая последовательность/сайт клонирования; γpA: сигнал полиаденилирования гена Aγ-глобина; Aγ-ENh: 3'-энхансер гена Aγ-глобина.
На фигуре 3 указан выход белка фактора VII, полученный после транзиентной трансфекции различными векторами, содержащими кодирующую последовательность фактора VII. Векторы, содержащие экспрессионные кластеры, представленные на фигуре 2 вместе с кодирующей последовательностью фактора VII, введенной в сайт клонирования, и с геном, кодирующим DHFR как амплифицируемый селективный маркер, были транзиентно перенесены в клетки NM-H9D8. Общий выход фактора VII был определен после культивирования. pEFdhfrmut(-): контрольный вектор с кодирующей последовательностью фактора VII. Представлены результаты трех независимых экспериментов.
На фигуре 4 проиллюстрировано сравнение стабильной трансфекции вектора согласно изобретению и контрольного вектора, кодирующего антитело. Клетки NM-H9D8-E6Q12 были стабильно трансфецированы контрольным вектором pEF или вектором pHB согласно изобретению. Оба вектора содержат последовательность, кодирующую антитело и ген, кодирующий DHFR как амплифицируемый селективный маркер. Для амплификации вектора в клетках, давление отбора, то есть, концентрацию селективного агента метотрексата в культуральной среде постадийно увеличивали. На графике проиллюстровано максимальное давление отбора, которое было возможным для соответствующего вектора по прошествии определенного времени культивирования. Более высокое возможное давление отбора (концентрация метотрексата) указывает на более высокую степень амплификации вектора в трансфецированных клетках, что будет приводить к повышению уровня продуцирования представляющего интерес белка.
На фигуре 5 проиллюстрирована продуктивность пула стабильно трансфецированных клеток, представленных на фигуре 4. Продуцирование антитела в пикограммах на клетку в день представлено для различных давлений отбора вектора согласно изобретению и контрольного вектора.
На фигуре 6 проиллюстрировано повышение продуктивности стабильно трансфецированных клеток, представленных на фигуре 4, путем амплификации вектора благодаря давлению отбора. Продуцирование антитела в пикограммах на клетку в день представлено для различных давлений отбора исходного клеточного пула, клеточного пула после амплификации и одиночных клеточных клонов после амплификации. A: контрольный вектор pEF; B: вектор pHB согласно изобретению.
Примеры
Пример 1:
Конструирование векторов, содержащих промотор человеческого
A
γ-глобина и элементов регуляторных областей локуса кластеров человеческого гена глобина
Для конструирования векторов глобина, энхансерные и промоторные области родительского вектора (например, pEF, имеющего ген резистентности к пуромицину или неомицину или ген dhfr в качестве селективного маркера) удаляли. Промотор человеческого Aγ-глобина, сигнал полиаденилирования и 3'-энхансерные области и различные конструкции регуляторных областей локуса кластеров человеческого гена глобина синтезировали и клонировали в вектор в соответствующих сайтах. На фиг. 2 представлены репрезентативные конструкции экспрессионных кластеров сконструированных векторов. Затем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид, вводили в сайт клонирования.
Пример 2:
Транзиентная трансфекция векторов глобина
Транзиентную трансфекцию осуществляли с использованием липофектамина® LTX и реагента Plus™ в соответствии с инструкциями производителей. Вкратце, 2 × 105 клеток высевали в 6-луночные планшеты во время их логарифмической фазы роста. Плазмидную ДНК разводили в редуцированной сывороточной среде Opti-MEM I и в Plus™-реагенте. По истечении времени инкубирования (15 минут) к раствору добавляли липофектамин® LTX. После дополнительного инкубирования (30 минут), смесь погружали в клеточную суспензию. Экспрессию анализировали через 72 часа с помощью ELISA. Более высокие титры белка были достигнуты с использованием векторов pHBG1Cdhfr, pHBG1Ddhfr и pHBG1Edhfr, но не вектора pEFdhfrmut(-) (фиг. 3).
Пример 3:
Стабильная трансфекция векторов глобина
Трансфекцию клеточной линии NM-H9D8 осуществляли путем нуклеофекции (Nucleofector™ Technology, Amaxa) с использованием плазмидной ДНК двух экспрессионных плазмид, кодирующих тяжелую и легкую цепь антитела, соответственно (обе плазмиды были линеаризованы), согласно инструкциям производителей. Для отбора и амплификации антитело-продуцирующих пулов, метотрексат и пуромицин добавляли в возрастающих концентрациях, и пулы скринировали на секрецию активных молекул антитела.
Пулы, трансфецированные плазмидами pHB, могут быть амплифицированы за более короткий период времени (фиг. 4) и дают более высокие уровни белка (фиг. 5), что может подтверждать наличие отдельных клеточных клонов, соответственно (фиг. 6).
Идентификация депонированного биологического материала
Клеточные линии DSM ACC 2606 и DSM ACC 2605 были депонированы в DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DE), Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG, Robert-Rössle-Str. 10, 13125 Berlin (DE) 14 августа, 2003. Эти биологические материалы указаны под названием «гликотоп», поскольку они были в свое время переуступлены компанией Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG компании Glycotope GmbH.
Клеточные линии DSM ACC 2806, DSM ACC 2807, DSM ACC 2856, DSM ACC 2858 и DSM ACC 3078 были депонированы в DSMZ - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE), Glycotope GmbH, Robert-Rössle-Str. 10, 13125 Berlin (DE) на даты, указанные в нижеследующей таблице.
Название клеточной линии | Номер доступа | Депозитор | Дата депонирования |
NM-F9 | DSM ACC 2606 | Nemod Biotherapeutics | 14 августа, 2003 |
NM-D4 | DSM ACC 2605 | Nemod Biotherapeutics | 14 августа, 2003 |
NM-H9D8 | DSM ACC 2806 | Glycotope GmbH | 15 сентября 2006 |
NM-H9D8-E6 | DSM ACC 2807 | Glycotope GmbH | 5 октября, 2006 |
NM-H9D8-E6Q12 | DSM ACC 2856 | Glycotope GmbH | 8 августа, 2007 |
GT-2x | DSM ACC 2858 | Glycotope GmbH | 7 сентября, 2007 |
GT-5s | DSM ACC 3078 | Glycotope GmbH | 28 июля, 2010 |
Claims (44)
1. Способ рекомбинантного продуцирования представляющего интерес полипептида, где указанный способ включает стадии:
(a) получения клетки-хозяина млекопитающего, которая не является клеткой эмбриона человека и клеткой зародышевой линии и содержит экспрессионный кластер, который для возможности экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, представляющий интерес, включает по направлению транскрипции функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина, где регуляторная область локуса или его функциональная часть содержит коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 последовательности SEQ ID NO: 1, или где регуляторная область локуса или его функциональная часть содержит сайт гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 24-278 последовательности SEQ ID NO: 5;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена Aγ-глобина или его гомолога, где промоторная область или ее функциональная часть содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1123-1542 последовательности SEQ ID NO: 1; и
(iii) кодирующую область, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид;
(b) культивирования клетки-хозяина в условиях, при которых клетка-хозяин экспрессирует представляющий интерес полипептид; и
(c) выделения представляющего интерес полипептида.
2. Способ по п. 1, где кодирующая область экспрессионного кластера также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид для секреторной экспрессии, и где в стадии (b) представляющий интерес полипептид секретируется клеткой-хозяином.
3. Способ по п. 1, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает элемент M1-кор-M2 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 742-995 SEQ ID NO: 1.
4. Способ по п. 3, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает по меньшей мере часть сайта гиперчувствительности 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 741-1109 SEQ ID NO: 1.
5. Способ по п. 1, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера также включает сайт гиперчувствительности 3 (HS3) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 310-735 SEQ ID NO: 1, и/или сайт гиперчувствительности 4 (HS4) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 13-294 SEQ ID NO: 1.
6. Способ по п. 1, где промоторная область экспрессионного кластера содержит сайт инициации транскрипции и, необязательно, по меньшей мере часть 5'-нетранслируемой области человеческого гена Aγ-глобина.
7. Способ по п. 1, где экспрессионный кластер также включает область терминации транскрипции.
8. Способ по п. 7, где область терминации транскрипции включает сигнал полиаденилирования, предпочтительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1725-1730 SEQ ID NO: 1 и сайт терминации транскрипции.
9. Способ по п. 1, где экспрессионный кластер также включает энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина, функционально присоединенную к другим элементам экспрессионного кластера.
10. Способ по п. 9, где энхансерная область экспрессионного кластера содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 2136-2881 SEQ ID NO: 1.
11. Способ по п. 1, где представляющим интерес полипептидом является гликопротеин или его часть.
12. Способ по п. 1, где представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из антител или их производных или частей, включающих тяжелую цепь или легкую цепь антитела; гонадотропинов, таких как FSH (фолликуло-стимулирующий гормон), CG (хорионический гонадотропин), LH (лютеинизирующий гормон) и TSH (тиреотропный гормон); эритропоэтина; и факторов свертывания крови, таких как фактор VII, VIII, IX или фактор фон Виллебранда.
13. Способ по п. 1, где экспрессионный кластер стабильно трансфецирован в клетку-хозяина.
14. Способ по п. 1, где клетка-хозяин была трансфецирована вектором, содержащим экспрессионный кластер и селективный маркерный ген, а предпочтительно амплифицируемый селективный маркерный ген, и где условия культивирования в стадии (b) включают присутствие соответствующего селективного агента в клеточной культуральной среде.
15. Способ по п. 14, где селективный маркерный ген кодирует дигидрофолат-редуктазу (DHFR), предпочтительно антифолат-резистентный вариант DHFR, а соответствующим селективным агентом является антифолат, предпочтительно метотрексат.
16. Способ по п. 1, где клеткой-хозяином является клетка крови, предпочтительно лейкоцит, предшественник клетки крови или клетка лейкоза или происходящая от них клетка.
17. Экспрессионный кластер, который для возможности экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, представляющий интерес, содержит по направлению транскрипции функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина, где регуляторная область локуса или его функциональная часть содержит коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 последовательности SEQ ID NO: 1, или где регуляторная область локуса или его функциональная часть содержит сайт гиперчувствительности 40 (HS40) кластера человеческого гена α-глобина, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 24-278 последовательности SEQ ID NO: 5;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена Aγ-глобина, где промоторная область или ее функциональная часть содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1123-1542 последовательности SEQ ID NO: 1;
(iii) необязательно, кодирующую область;
(iv) область терминации транскрипции, содержащаую последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1725-1730 последовательности SEQ ID NO:1; и
(v) энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена Aγ-глобина, где энхансерная область или ее функциональная часть содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 2136-2881 последовательности SEQ ID NO: 1;
где экспрессионный кластер не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный человеческий Aγ-глобин.
18. Экспрессионный кластер по п. 17, где регуляторная область локуса включает элемент M1-кор-M2 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 742-995 SEQ ID NO: 1.
19. Экспрессионный кластер по п. 18, где регуляторная область локуса включает по меньшей мере часть сайта гиперчувствительности 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 741-1109 SEQ ID NO: 1.
20. Экспрессионный кластер по п. 17, где регуляторная область локуса также включает сайт гиперчувствительности 3 (HS3) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 310-735 SEQ ID NO: 1, и/или сайт гиперчувствительности 4 (HS4) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 13-294 SEQ ID NO: 1.
21. Экспрессионный кластер по п. 17, где промоторная область содержит сайт инициации транскрипции и, необязательно, по меньшей мере часть 5'-нетранслируемой области человеческого гена Aγ-глобина.
22. Экспрессионный кластер по п. 17, где область терминации транскрипции включает сигнал полиаденилирования и сайт терминации транскрипции.
23. Экспрессионный кластер по п. 17, также включающий сайт клонирования, который содержит по меньшей мере одну последовательность распознавания рестриктирующего фермента.
24. Экспрессионный кластер по п. 17, где кодирующая область включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид.
25. Экспрессионный кластер по п. 24, где представляющим интерес полипептидом является гликопротеин или его часть.
26. Экспрессионный кластер по п. 24, где представляющим интерес полипептидом является антитело, тяжелая цепь или легкая цепь антитела или его часть.
27. Экспрессионный кластер по п. 17, где кодирующая область включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид для секреторной экспрессии.
28. Вектор для введения экспрессионного кластера в клетку-хозяина, содержащий экспрессионный кластер по п. 17.
29. Вектор по п. 28, также содержащий один или более селективных маркерных генов.
30. Вектор по п. 28, адаптированный для стабильной трансфекции эукариотической клетки.
31. Клетка-хозяин млекопитающего, не являющаяся клеткой эмбриона человека и клеткой зародышевой линии, для получения белка, представляющего интерес, содержащая экспрессионный кластер по п. 17.
32. Клетка-хозяин по п. 31, представляющая собой клетку крови, предпочтительно лейкоцит, предшественник клетки крови или клетку лейкоза или происходящую от них клетку.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LU92686 | 2015-03-31 | ||
EP15161922.8 | 2015-03-31 | ||
EP15161922 | 2015-03-31 | ||
LU92686 | 2015-03-31 | ||
PCT/EP2016/056926 WO2016156404A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-03-30 | Eukaryotic expression vectors comprising regulatory elements of the globin gene clusters |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017134578A RU2017134578A (ru) | 2019-04-04 |
RU2017134578A3 RU2017134578A3 (ru) | 2019-08-29 |
RU2716974C2 true RU2716974C2 (ru) | 2020-03-17 |
Family
ID=55699621
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017134578A RU2716974C2 (ru) | 2015-03-31 | 2016-03-30 | Эукариотические экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы кластеров гена глобина |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10184135B2 (ru) |
EP (1) | EP3277807B1 (ru) |
JP (1) | JP6861637B2 (ru) |
KR (1) | KR102598130B1 (ru) |
CN (1) | CN108012545B (ru) |
AU (1) | AU2016239324B2 (ru) |
CA (1) | CA2978659C (ru) |
DK (1) | DK3277807T3 (ru) |
ES (1) | ES2764457T3 (ru) |
LT (1) | LT3277807T (ru) |
RU (1) | RU2716974C2 (ru) |
WO (1) | WO2016156404A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
CA3057862A1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-10-04 | Bluebird Bio, Inc. | Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies |
WO2019113321A1 (en) * | 2017-12-06 | 2019-06-13 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Globin gene therapy for treating hemoglobinopathies |
CN115125270A (zh) * | 2021-03-22 | 2022-09-30 | 华东师范大学 | 一种α-珠蛋白过表达载体及其应用 |
TW202413647A (zh) * | 2022-06-10 | 2024-04-01 | 俄羅斯聯邦商拜奧卡德聯合股份公司 | 具有啟動子活性之核酸及其用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6524851B1 (en) * | 1998-10-01 | 2003-02-25 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Hybrid nucleic acid molecules and vectors including β-globin regulatory elements |
WO2010046493A2 (en) * | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Université de Lausanne | Gene transfer vectors comprising at least one isolated dna molecule having insulator and or boundary properties and methods to identify the same |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8718779D0 (en) * | 1987-08-07 | 1987-09-16 | Grosveld F G | Dna sequence & expression vector |
WO1991005041A1 (en) * | 1989-09-26 | 1991-04-18 | Townes Tim M | Erythroid-specific gene expression system |
US20040133934A1 (en) * | 1996-03-06 | 2004-07-08 | Townes Tim M. | Transgenic animals that produce human hemoglobin |
ES2582028T3 (es) * | 2001-06-29 | 2016-09-08 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Vector que codifica el gen de la globulina humana y uso del mismo en el tratamiento de hemoglobinopatías |
NZ575974A (en) | 2006-09-10 | 2012-03-30 | Glycotope Gmbh | Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies |
-
2016
- 2016-03-30 JP JP2017548439A patent/JP6861637B2/ja active Active
- 2016-03-30 ES ES16715272T patent/ES2764457T3/es active Active
- 2016-03-30 KR KR1020177029139A patent/KR102598130B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-30 LT LTEP16715272.7T patent/LT3277807T/lt unknown
- 2016-03-30 DK DK16715272.7T patent/DK3277807T3/da active
- 2016-03-30 WO PCT/EP2016/056926 patent/WO2016156404A1/en active Application Filing
- 2016-03-30 EP EP16715272.7A patent/EP3277807B1/en active Active
- 2016-03-30 CN CN201680016315.2A patent/CN108012545B/zh active Active
- 2016-03-30 CA CA2978659A patent/CA2978659C/en active Active
- 2016-03-30 RU RU2017134578A patent/RU2716974C2/ru active
- 2016-03-30 AU AU2016239324A patent/AU2016239324B2/en active Active
- 2016-03-30 US US15/559,272 patent/US10184135B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6524851B1 (en) * | 1998-10-01 | 2003-02-25 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Hybrid nucleic acid molecules and vectors including β-globin regulatory elements |
WO2010046493A2 (en) * | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Université de Lausanne | Gene transfer vectors comprising at least one isolated dna molecule having insulator and or boundary properties and methods to identify the same |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHUNG J. H. et al. A 5′ element of the chicken β-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila, Cell, 1993, V. 74, N. 3, p.505-514. * |
HANAWA H. et al. Extended β-globin locus control region elements promote consistent therapeutic expression of a γ-globin lentiviral vector in murine β-thalassemia, Blood, 2004, V. 104, N. 8, p.2281-2290. * |
HANAWA H. et al. Extended β-globin locus control region elements promote consistent therapeutic expression of a γ-globin lentiviral vector in murine β-thalassemia, Blood, 2004, V. 104, N. 8, p.2281-2290. CHUNG J. H. et al. A 5′ element of the chicken β-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila, Cell, 1993, V. 74, N. 3, p.505-514. ДРАЧКОВА И. А. и др. Влияние полиморфизмов ТАТА-бокса промотора гена β-глобина человека, ассоциированных с β-талассемией, на взаимодействие ТАТА-связывающего белка, Вестник ВОГиС, 2010, V. 14, N. 4, p.698-705. * |
ДРАЧКОВА И. А. и др. Влияние полиморфизмов ТАТА-бокса промотора гена β-глобина человека, ассоциированных с β-талассемией, на взаимодействие ТАТА-связывающего белка, Вестник ВОГиС, 2010, V. 14, N. 4, p.698-705. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180094279A1 (en) | 2018-04-05 |
CN108012545A (zh) | 2018-05-08 |
AU2016239324A1 (en) | 2017-09-21 |
RU2017134578A3 (ru) | 2019-08-29 |
KR102598130B1 (ko) | 2023-11-02 |
AU2016239324B2 (en) | 2022-04-21 |
BR112017018538A2 (pt) | 2018-04-17 |
JP6861637B2 (ja) | 2021-04-21 |
EP3277807B1 (en) | 2019-12-11 |
JP2018510633A (ja) | 2018-04-19 |
EP3277807A1 (en) | 2018-02-07 |
CA2978659C (en) | 2023-05-16 |
WO2016156404A1 (en) | 2016-10-06 |
US10184135B2 (en) | 2019-01-22 |
LT3277807T (lt) | 2020-01-10 |
CA2978659A1 (en) | 2016-10-06 |
CN108012545B (zh) | 2022-08-30 |
DK3277807T3 (da) | 2020-01-20 |
RU2017134578A (ru) | 2019-04-04 |
ES2764457T3 (es) | 2020-06-03 |
KR20170132784A (ko) | 2017-12-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2716974C2 (ru) | Эукариотические экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы кластеров гена глобина | |
ES2282994T3 (es) | Procedimiento para la seleccion de celulas huesped de expresion elevada. | |
US8957196B2 (en) | Vector and expression cell line for mass production of recombinant protein and a process of producing recombinant protein using same | |
JP5913122B2 (ja) | 新規発現ベクター | |
US20050069979A1 (en) | Cell culture process | |
EP2848687B1 (en) | Novel expression vector | |
EP2808341B1 (en) | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells | |
JP2008536506A (ja) | mCMVプロモーターおよびhCMV主要最初期遺伝子を含む哺乳類発現ベクター | |
CN116218782A (zh) | 细胞选择和修饰细胞代谢的方法 | |
US5627033A (en) | Mammalian expression vectors | |
US9163257B2 (en) | Expression vector and methods of producing high levels of proteins | |
CA2753813C (en) | Methods for selecting eukaryotic cells expressing a heterologous protein | |
WO2016003368A1 (en) | Optimized vectors for the production of recombinant proteins | |
EP1144611B1 (en) | Method for recombinant protein production in mammalian cells comprising co-expression with fetuin | |
RU2697273C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы | |
BR112017018538B1 (pt) | Método in vitro para produzir de forma recombinante um polipeptídeo de interesse, bem como cassete de expressão | |
US20170233695A1 (en) | Cell Culture Media Composition and Methods of Producing Thereof | |
CN112442504B (zh) | 一种重组草鱼白介素-12活性蛋白的制备方法 |