JP5913122B2 - 新規発現ベクター - Google Patents
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Description
[1]蛋白質を発現させるための発現ベクターであって、遺伝子発現制御部位、並びに、その下流に該蛋白質をコードする遺伝子、更に下流に内部リボソーム結合部位、および更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含んでなる、発現ベクター、
[2]該遺伝子発現制御部位が、サイトメガロウイルス由来のプロモーター、SV40初期プロモーター、伸長因子1プロモーターからなる群から選択されるものである、上記[1]の発現ベクター、
[3]該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルス、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ウシ腸内ウイルス、サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス、コクサッキーB型ウイルス、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子、ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子、ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルスまたは遺伝子の5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター、
[4]該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター。
[5]該内部リボソーム結合部位が、マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター、
[6]該内部リボソーム結合部位が、野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に、1又は2以上の変異を加えたものである、上記[1]ないし[5]のいずれかの発現ベクター、
[7]該内部リボソーム結合部位に開始コドンが複数存在し、そのうちの一部のものが破壊されてなる、上記[6]の発現ベクター、
[8]該内部リボソーム結合部位が、配列番号1の塩基配列を含むものである、上記 [5]の発現ベクター、
[9]該内部リボソーム結合部位が、配列番号2の塩基配列を含むものである、上記 [5]の発現ベクター、
[10]該内部リボソーム結合部位が、配列番号3の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、
[11]該内部リボソーム結合部位が、配列番号4の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、
[12]該内部リボソーム結合部位が、配列番号5の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、
[13]該内部リボソーム結合部位が、配列番号6の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、
[14]蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において、該内部リボソーム結合部位とは別に、内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、上記[1]ないし[13]のいずれかの発現ベクター、
[15]該遺伝子発現制御部位とは別に、遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、上記[1]ないし[13]のいずれかの発現ベクター、
[16]該薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子である、上記[14]又は上記[15]の発現ベクター、
[17]蛋白質をコードする該遺伝子が、ヒト由来の遺伝子である上記[1]ないし[16]のいずれかの発現ベクター、
[18]ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)、血液凝固因子、エリスロポエチン、インターフェロン、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、上記[17]の発現ベクター、
[19]ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素をコードする遺伝子である、上記[17]の発現ベクター、
[20]該リソソーム酵素が、α-ガラクトシダーゼA、イズロン酸2-スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガルスルファーゼ、α-L-イズロニダーゼ、酸性α-グルコシダーゼからなる群から選択されるものである、上記[19]の発現ベクター、
[21]ヒト由来の該遺伝子が、エリスロポエチンをコードする遺伝子である上記[17]の発現ベクター、
[22]上記[1]ないし[21]のいずれかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞、
[23]該哺乳動物細胞が、CHO細胞である上記[22]の細胞、
[24]上記[1]ないし[21]のいずれかの発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入するステップと、該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を、グルタミン合成酵素阻害剤の存在下又はグルタミン合成酵素阻害剤及び薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下、選択培養するステップとを含む、該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。
更に詳しくは、野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位は、配列番号5(5'-cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg-3')の塩基配列を含むものである。また、該塩基配列に変異を加えたものとしては、配列番号6(5'-cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatg-3')の塩基配列が挙げられる。
また、「グルタミン合成酵素阻害剤」というときは、上記グルタミン合成酵素の活性を阻害することができるものである限り特に限定はなく、いずれのものも用いることができるが、好ましくはメチオニンスルホキシミン(MSX)が挙げられる。
pEF/myc/nucベクター(インビトロジェン社)を,KpnIとNcoIで消化し,EF-1プロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo(インビトロジェン社)を,BglII及びEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に,T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して,pE-neoベクターを構築した(図1−1及び図1−2)。
発現ベクターpPGKIH(Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000) )を制限酵素(XhoI及びBamHI)で消化し、マウス脳心筋炎ウイルス(EMCV)に由来する内部リボソーム結合部位(IRES)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygr遺伝子)及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域(mPGKpA)を含む塩基配列IRES-Hygr-mPGKpA(5’-CTCGAGgaattcactccttcaggtgcaggcttgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaactggctcacaaataccactgagatcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcCGCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttcatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacgtggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagTCGAGaaattgatgatctattaagcaataaagacgtccactaaaatggaagtttttcctgtcatactttgttaagaagggtgagaacagagtacctacattttgaatggaaggattggagctacgggggtgggggtggggtgggattagataaatgcctgctctttactgaaggctctttactattgctttatgataatgtttcatagttggatatcataatttaaacaagcaaaaccaaattaagggccagctcattcctccactcacgatctatagatccactagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcGGATCC-3’;配列番号9。5’端の大文字で示された配列CTCGAGが「XhoIサイト」、その次に大文字で示されたCGCから始まる配列及びそれに続く小文字3文字(atg)からなる領域が「マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列」、該atgから始まる小文字で示された領域が「ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列」、その次の小文字で示されたaaaから始まる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域を含む塩基配列」、及び、3’端の大文字で示された配列GGATCCが「BamHIサイト」である。)のDNA断片を切り出した(なお、Hygr遺伝子に対応するアミノ酸配列は、配列番号10で示されたものである。)。このDNA断片をpBluescript SK(-) (Stratagene社)のXhoIとBamHI間に挿入し、これをpBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)とした(図3−1)。
pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)を鋳型としてプライマーIRES5’(5’-caactcgagcggccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttact-3’;配列番号11)及びプライマーIRES3’(5’-caagaagcttccagaggaactg-3’;配列番号12)を用いてPCRによりEMCVのIRESの一部を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(XhoI及びHindIII)で消化し、pBSK
(IRES-Hygr-mPGKpA) のXhoIとHindIII間に挿入し、これをpBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) とした(図3−2)。
pBSK(NotI-IRES-Hygro-mPGKpA)を制限酵素(NotI及びBamHI)で消化し、pE-hygrベクターのNotIとBamHI間に挿入し、これをプラスミドpE-IRES-Hygrとした(図3−3)。
pE-IRES-Hygrを制限酵素(NotI及びBamHI)で消化してDNA断片(IRES-Hygr)を切り出し、pPGK-neoのNotIとBamHI間に挿入し、これをpPGK-IRES-Hygrとした(図3−5)。
M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000))を鋳型としてプライマーpuro5’(5’-gcttaagatgaccgagtacaagcccacg-3’;配列番号18)及びプライマーpuro3’(5’-cccatcgtgatggtcaggcaccgggcttgc-3’;配列番号19)を用いてPCRによりピューロマイシン耐性遺伝子(puro遺伝子)を含む塩基配列(5’-GcttaagATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAccatcacgatggG-3’;配列番号20。5’端から最初に小文字で示された配列cttaagが「AflIIサイト」、これに続く大文字で示されたATGから始まる配列が「ピューロマイシン耐性遺伝子(puro遺伝子)をコードする塩基配列」、及び、その次の小文字で示された配列が「BstXIサイト」である。)のDNA断片を増幅させた(なお、puro遺伝子に対応するアミノ酸配列は、配列番号21で示されたものである。)。このDNA断片を制限酵素(AflII及びBstXI)で消化し、発現ベクターpE-neoのAflIIとBstXI間に挿入し、これをpE-puroとした(図3−7)。
pE-puroを鋳型としてプライマーSV40polyA5’(5’-caacaagcggccgccctcgagttccctttagtgagggttaatgc-3’;配列番号22)及びプライマーSV40polyA3’(5’-cccctgaacctgaaacataaaatg-3’;配列番号23)を用いてPCRによりSV40後期ポリアデニル化領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(NotI及びHpaI)で消化し、発現ベクターpE-puroのNotIとHpaI間に挿入し、これをpE-puro(XhoI)とした(図3−8)。
pPGK-IRES-GS-ΔpolyAを制限酵素(NotI及びXhoI)で消化し、IRES-GS領域を含むDNA断片を切り出し、これを発現ベクターpE-puro(XhoI)のNotIとXhoI間に挿入し、これをpE-IRES-GS-puroとした(図3−9)。
発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型としてプライマーmIRES-GS5’(5’-acacgatgataagcttgccacaacc-3’;配列番号24)及びプライマーmIRES-GS3’(5’-ctccacgatatccctgccata-3’;配列番号25)を用いてPCRによりEMCVのIRESからGSにかけての領域を増幅させ、EMCVのIRESの5’側から2番目に位置する開始コドン(ATG)に変異を加えて破壊したDNA断片を増幅させた。発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型として、このDNA断片と上記のプライマーIRES5’を用いてPCRによりIRESからGSにかけての領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(NotI及びPstI)で消化し、切り出されたDNA断片を、発現ベクターpE-IRES-GS-puroのNotIとPstI間に挿入し、これをpE-mIRES-GS-puroとした(図4)。
発現ベクターpE-neoを鋳型としてプライマーSV40polyA5’-2(5’-actaactcgagttccctttagtg-3’;配列番号26)及びプライマーSV40polyA3’-2(5’-aacggatccttatcggattttaccac-3’;配列番号27)を用いてPCRによりSV40 polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(XhoI及びBamHI)で消化し、pE-mIRES-GS-puroのXhoIとBamHI間に挿入し、これをpE-mIRES-GSとした(図5)。
ヒト肝臓Quick Clone cDNA(Clontech社)を鋳型としてプライマーhGBA5’(5’-gcaatacgcgtccgccaccatggagttttcaagtccttccagagagg-3’;配列番号28)及びプライマーhGBA3’(5’-ggacgcggccgcgagctctcactggcgacgccacaggtagg-3’;配列番号29)を用いてPCRによりヒトグルコセレブロシダーゼ遺伝子(hGBA遺伝子)を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(MluI及びNotI)で消化し、pE-IRES-GS-puro、pE-mIRES-GS及びpE-mIRES-GS-puroのMluIとNotI間に挿入し、それぞれGBA発現ベクターpE-IRES-GS-puro(GBA)、pE-mIRES-GS(GBA)、及びpE-mIRES-GS-puro(GBA)とした。
pCI-neo (EPO)を鋳型としてプライマーhEPO5’(5’-aagacgcgtcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgc-3’;配列番号30)及びプライマーhEPO3’(5’-aagagcggccgctcatctgtcccctgtcctgcagg-3’;配列番号31)を用いてPCRによりhEPO遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素(MluI及びNotI)で消化し、pE-IRES-GS-puro及びpE-mIRES-GS-puroのMluIとNotI間に挿入し、それぞれhEPO発現ベクターpE-IRES-GS-puro(EPO)及びpE-mIRES-GS-puro(EPO)とした。
チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞のCHO-K1細胞に、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen社)を用いて、pE-IRES-GS-puro(GBA)、pE-mIRES-GS(GBA)、pE-mIRES-GS-puro(GBA)、pE-IRES-GS-puro(EPO)及びpE-mIRES-GS-puro(EPO)を、それぞれ導入した。これらの細胞を、選択培地を用いて選択培養し、hGBA発現形質転換細胞及びhEPO発現形質転換細胞を得た。
このとき、pE-IRES-GS-puro(GBA)、pE-mIRES-GS-puro(GBA)、pE-IRES-GS-puro(EPO)及びpE-mIRES-GS-puro(EPO)を導入した細胞の選択培養には、メチオニンスルホキシミン(SIGMA社)及びピューロマイシン(SIGMA社)を含むCD Opti CHO培地(Invitrogen社)を選択培地として使用し、pE-mIRES-GS(GBA)を導入した細胞の選択培養には、メチオニンスルホキシミン(SIGMA社)を含むCD Opti CHO培地(Invitrogen社)を選択培地として使用した。選択培養の際、メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて、最終的にメチオニンスルホキシミンの濃度を300μM、ピューロマイシンの濃度を10μg/mLとして、薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。この選択培養により、3種類のhGBA発現形質転換細胞と2種類のhEPO発現形質転換細胞を得た。
選択培養して得た形質転換細胞を、2×105個/mLの細胞密度で、300μMのメチオニンスルホキシミンと、10μg/mLのピューロマイシンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で、5%
CO2存在下で12日間培養した。培養温度は、培養開始から3日目までは37℃に、その後は30℃に設定した。培養、4、7、10及び12日目に培養上清をサンプリングし、細胞密度を測定した。但し、pE-mIRES-GS(GBA)を導入して得たhGBA発現形質転換細胞の培養は、300μMのメチオニンスルホキシミを含有する5mLのCD Opti CHO培地を使用して行った。
選択培養して得た形質転換細胞を、2×105個/mLの細胞密度で、300μMのメチオニンスルホキシミンと、10μg/mLのピューロマイシンを含有する5mLのCD Opti CHO培地で、5%
CO2存在下で7日間培養した。培養温度は、培養開始から3日目までは37℃に、その後は30℃に設定した。培養7日目に培養上清をサンプリングし、細胞密度を測定した。
GBA活性測定は、Pasmanik-Chor
M. et al., Biochem J 317, 81-88 (1996)に記載された方法を参考にして実施した。リン酸4-メチルウンベリフェリル(4-MUF、Sigma
Chemical Co.製)を希釈用緩衝液(0.125% ナトリウム−タウロコレート、0.15% Triton X-100、0.1% ウシ血清アルブミンを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.96))に溶解した後、段階希釈して、200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25及び3.125mM濃度の標準溶液を作製した。4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシド(Sigma Chemical Co.製)を、4mMの濃度となるように希釈用緩衝液に溶解し、これを基質溶液とした。検体は、必要に応じて、測定前に希釈用緩衝液を用いて希釈した。フルオロプレートF96に、4-MUF標準溶液又は検体を10μLずつ加えた後、基質溶液を70μL加えて混合した。37℃で1時間反応させた後、反応停止液として、50mM グリシン-NaOH緩衝液(pH10.6)を200μLずつ各ウェルに加えた後、フルオロプレートリーダーを用いて、励起波長355nm、検出波長460nmの条件にて蛍光強度を測定した。4-MUF標準溶液の蛍光強度から検量線を描き、各検体の蛍光強度を検量線に内挿して、活性(nmol/h/mL)を算出した。
組換え体hEPOを用いて免疫したウサギの血液から、常法によりウサギ抗hEPO抗体溶液を得た。なお、組換え体hEPOは、国際公開公報(WO2008/068879)
に記載された方法を参考にして作成した。ウサギ抗hEPO抗体溶液を96ウェルプレートに100μLずつ加え、4℃で1時間静置して抗体をプレートに固定させた。液を捨てた後、0.075%Tween20を含む1%BSA/TBS−T液(Tris:0.005M、NaCl:0.138M、KCl:0.0027M、pH 8.0)をプレートに100μLずつ加え、4℃で1時間静置してプレートをブロッキングした。液を捨て、プレートを0.075%Tween20を含むTBS−T液で3回洗浄した後、適当な濃度に希釈した検体をプレートに100μLずつ加え、37℃で1時間静置した。このとき、ローリー(Lowry)法により定量した自家製造のhEPOを希釈して1〜16ng/mLの濃度としたものを標準溶液として、検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て、プレートを前記と同様にして洗浄後、HRP標識したマウス抗hEPOモノクロナール抗体(R&D社製)を2次抗体としてプレートに100μLずつ加え、37℃で1時間静置した。プレートを前記と同様にして洗浄後、HRP基質(プロメガ社)を加え、37℃で15分間静置した後、塩酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定して、標準溶液の吸光度との比較から検体中のhEPO濃度を求めた。
上記のとおり、遺伝子発現制御部位として伸長因子1αプロモーター(EF-1p)、蛋白質をコードする遺伝子としてヒトグルコセレブロシダーゼ(hGBA)遺伝子、内部リボソーム結合部位として配列番号4に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位(EMCV-mIRES)、及びグルタミン合成酵素をコードする遺伝子(GS遺伝子)をこの順で組み込んだ発現ベクターであるpE-mIRES-GS (GBA)を導入したCHO細胞を、選択培地で培養して、培地中のhGBAの活性を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して4回(バルク1〜4)行った。細胞密度は、4回とも培養7日目にはほぼ2.5×106個/mLに達した(図6−1)。一方、培地中のhGBA活性は、バルク2では培養10日目に30μmol/h/mLに達し(図6−2)、pE-mIRES-GS (GBA)を用いてCHO細胞を形質転換することにより、hGBAを高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。但し、バルク1及び3では、培地中のhGBAの活性は極めて低く、pE-mIRES-GS (GBA)を用いた場合、選択培地で培養後の細胞に、hGBAの発現量の低い細胞がかなりの割合で含まれることが示唆された。
実験は独立して2回(バルク1〜2)行った。細胞密度は、2回とも培養7日目にはほぼ2〜3×106個/mLに達した(図8−1右側)。一方、培地中のhEPO濃度は、培養7日目にhEPOの活性が8〜18μg/mLに達し(図8−2右側)、pE-IRES-GS-puro(EPO)を用いてCHO細胞を形質転換することにより、hEPOを高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。
2 mPGKプロモーター
3 配列番号1に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位(EMCV-IRES)
3a 配列番号4に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位(EMCV-mIRES)
4 mPGKのポリアデニル化領域(mPGKpA)
5 EF-1p及び第一イントロンを含む塩基配列
6 SV40後期ポリポリアデニル化領域
7 SV40初期プロモーターを含む領域
8 合成ポリポリアデニル化領域
9 サイトメガロウイルスプロモーターを含む領域
10 グルタミン合成酵素遺伝子
Claims (13)
- 蛋白質を発現させるための発現ベクターであって、遺伝子発現制御部位、並びに、その下流に該蛋白質をコードする遺伝子、更に下流に内部リボソーム結合部位、および更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含んでなり、
該遺伝子発現制御部位が,伸長因子1プロモーターであり、
該内部リボソーム結合部位が、マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来するものであって且つ野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に1又は2以上の変異を加えることにより5’側から2番目又は3番目の開始コドンが破壊されたものであり、
更に、該遺伝子発現制御部位とは別に、遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、
発現ベクター。 - 破壊された開始コドンが該野生型の内部リボソーム結合部位における5’側から2番目目のものである、請求項1の発現ベクター。
- 該内部リボソーム結合部位が、配列番号4の塩基配列を含むものである、請求項1の発現ベクター。
- 該内部リボソーム結合部位が、配列番号6の塩基配列を含むものである、請求項1の発現ベクター。
- 該薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子である、請求項1ないし4の何れかの発現ベクター。
- 蛋白質をコードする該遺伝子が、ヒト由来の遺伝子である請求項1ないし5の何れかの発現ベクター。
- ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)、血液凝固因子、エリスロポエチン、インターフェロン、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、請求項6の発現ベクター。
- ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素をコードする遺伝子である、請求項6の発現ベクター。
- 該リソソーム酵素が、α-ガラクトシダーゼA、イズロン酸2-スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガルスルファーゼ、α-L-イズロニダーゼ、酸性α-グルコシダーゼからなる群から選択されるものである、請求項8の発現ベクター。
- ヒト由来の該遺伝子が、エリスロポエチンをコードする遺伝子である請求項6の発現ベクター。
- 請求項1ないし10の何れかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
- 該哺乳動物細胞が、CHO細胞である請求項11の細胞。
- 請求項1ないし10の何れかの発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入するステップと、該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を、グルタミン合成酵素阻害剤の存在下又はグルタミン合成酵素阻害剤及び薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下、選択培養するステップとを含む、該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。
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