KR101890446B1

KR101890446B1 - 신규 발현 벡터

Info

Publication number: KR101890446B1
Application number: KR1020137014500A
Authority: KR
Inventors: 겐이치 다카하시
Original assignee: 제이씨알 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2018-08-21
Also published as: EP2639303A1; KR20130100182A; EP2639303B1; CN103201382A; EP2639303A4; WO2012063799A1; JP5913122B2; US20130244231A1; JPWO2012063799A1

Abstract

재조합체 단백질을 포유 동물 세포 내에서 효율적으로 발현시키기 위한 신규 발현 벡터, 그 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포, 및 그 포유 동물 세포의 제조 방법이 개시되어 있다. 당해 발현 벡터는 유전자 발현 제어 부위, 그리고, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 추가로 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어진다.

Description

신규 발현 벡터{NOVEL EXPRESSION VECTOR}

본 발명은 재조합체 단백질을 포유 동물 세포 내에서 효율적으로 발현시키기 위한 신규 발현 벡터에 관한 것으로, 상세하게는, 유전자 발현 제어 부위, 그 하류에 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 또한, 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 추가로 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 발현 벡터에 관한 것이다.

원하는 단백질을 코드하는 유전자를 삽입한 발현 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포를 사용하여, 재조합체 단백질을 제조하는 방법은 의약품 제조 등의 산업 분야에서 널리 보급된 기술이며, α-갈락토시다아제 A, 이즈론산2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, 갈설파아제, α-L-이즈로니다아제, 산성α-글루코시다아제 등의 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 혈액 응고 제 VII 인자, 혈액 응고 제 VIII 인자, 혈액 응고 제 IX 인자 등의 혈액 응고 인자, 에리스로포에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 각종 항체 의약 등이 이 기술을 이용하여 제조되고, 의약품으로서 시판되고 있다.

이 때, 발현 벡터로서 강력한 유전자 발현을 유도하는 유전자 제어 부위, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 신장 인자 1α(EF－1) 프로모터 등의 하류에, 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 삽입한 것을 사용하는 것이 일반적이다. 이와 같은 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는 발현 벡터에 삽입한 원하는 단백질을 발현하게 되지만, 그 발현량은 개개의 세포에 의해 상이하고 균일하지 않다. 따라서, 재조합체 단백질을 효율적으로 생산하기 위해서는, 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포로부터, 원하는 단백질의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하는 스텝이 필요하게 된다. 이 선택 스텝을 실시하기 위해서, 발현 벡터에는 선택 마커로서 기능하는 유전자가 삽입되어 있다.

선택 마커로서 가장 일반적인 것은 퓨로마이신, 네오마이신 등의 약제를 분해하는 효소 (약제 내성 마커) 이다. 포유 동물 세포는 일정 농도 이상의 상기 약제의 존재하에서 사멸한다. 그러나, 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는 발현 벡터에 삽입한 약제 선택 마커에 의해 상기 약제를 분해하고, 이것을 무독화 또는 약독화할 수 있으므로, 상기 약제 존재하에서도 생존 가능해진다. 따라서, 발현 벡터가 도입된 세포를, 상기 약제를 어느 일정 농도 포함하는 배지 중에서 배양하면, 약제 선택 마커를 고레벨로 발현하는 세포만이 증식하여, 그들이 선택되는 결과가 된다. 약제 선택 마커를 고레벨로 발현하는 세포는 발현 벡터에 동시에 삽입한 원하는 단백질을 코드하는 유전자도 고레벨로 발현하는 경향이 있으므로, 결과적으로, 원하는 단백질을 고레벨로 발현하는 포유 동물 세포가 얻어진다.

선택 마커로서 글루타민 합성 효소 (GS) 를 사용하는 발현 벡터도 알려져 있다 (특허문헌 1, 2 참조). 글루타민 합성 효소는 글루탐산과 암모니아로부터 글루타민을 합성하는 효소이다. 포유 동물 세포를 글루타민 합성 효소의 저해제인 일정 농도의 메티오닌술폭시민 (MSX) 존재하에서, 글루타민 결핍 배지에서 배양하면, 세포는 사멸한다. 그러나, 선택 마커로서 글루타민 합성 효소가 삽입된 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하면, 그 세포에서는, 글루타민 합성 효소의 발현 레벨이 상승하게 되므로, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능해진다. 이 때, MSX 의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이 현상은 포유 동물 세포의 게놈 내에 삽입된 그 발현 벡터가 게놈 내에서 중복하여 카피수를 늘림으로써 야기된다고 생각되고 있다. 즉, 카피수가 증가함으로써, 하나의 세포 중의 게놈 내에 있는 약제 선택 마커의 유전자수가 증가하게 되어, 상대적으로 유전자의 발현량이 증가한다. 이 때, 발현 벡터에 삽입한 원하는 단백질을 코드하는 유전자의 카피수도 중복하여 증가하므로, 원하는 단백질을 고레벨로 발현하는 포유 동물 세포가 얻어진다. 예를 들어, 특허문헌 1 에는, GS 발현 벡터와 메티오닌술폭시민 (MSX) 을 사용함으로써, DHFP (디하이드로엽산 환원 효소)/MTX (메토트렉세이트) 를 사용하는 경우보다, 높은 카피수를 달성할 수 있는 것이 기재되어 있다. 또, 특허문헌 2 에는, GS 유전자와 MSX 를 사용함으로써, 호스트 세포의 DNA 중에서, GS 유전자의 카피수의 증가에 부수하여, 이것과 다른 이형 유전자의 카피수도 증가시킬 수 있고, 이렇게 하여 원하는 폴리펩티드의 생산 레벨을 증대할 수 있는 것이 기재되어 있다.

이와 같이, 선택 마커를 포함하는 발현 벡터는 효율이 좋은 재조합체 단백질의 제조에 적합하여 널리 이용되고 있다. 발현 벡터 상에서, 원하는 단백질을 코드하는 유전자와 선택 마커를 코드하는 유전자는 일반적으로 각각 다른 유전자 제어 부위하에 삽입된다 (특허문헌 3 참조). 그러나, 하나의 유전자 제어 부위하에, 원하는 단백질과 선택 마커를 코드하는 유전자를 직렬로 삽입하여 발현시키는 방법도 알려져 있고 (특허문헌 4, 5, 6, 7 참조), 이 때, 원하는 단백질과 선택 마커를 코드하는 유전자의 사이에는, 내부 리보솜 결합 부위 (IRES : internal ribosome entry site) 등이 삽입되고, 이로써 하나의 유전자 제어 부위로부터 2 개의 유전자의 발현이 가능해진다. 내부 리보솜 결합 부위는 여러 가지 알려져 있고, 예를 들어, 피코르나 바이러스, 폴리오 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 닭전염성 파브리키우스 낭병 바이러스 유래의 것이 있다 (특허문헌 8, 9, 10 참조).

내부 리보솜 결합 부위를 응용한 발현 벡터로서, 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 선택 마커로서 단순 헤르페스바이러스 티미딘키나아제를 삽입한 발현 벡터 (특허문헌 11 참조), 2 이상의 내부 리보솜 결합 부위를 사용하여 3 종 이상의 유전자를 결합시킨 발현 벡터 (특허문헌 12 참조) 가 알려져 있다.

상기와 같이, 여러 가지의 발현 벡터의 개발에 의해, 포유 동물 세포를 사용하여 재조합체 단백질을 제조하는 방법이 에리스로포에틴 등의 의약품의 제조에 있어서 실용화되고 있지만, 그 제조 비용을 저감하기 위해, 보다 효율이 좋은 발현 벡터의 개발이 항상 요구되고 있다.

일본 공표특허공보 소63－502955호 일본 공표특허공보 평5－504050호 일본 공개특허공보 2009－273427호 일본 공개특허공보 소59－173096호 일본 공개특허공보 소60－199387호 일본 공표특허공보 평4－500004호 일본 공개특허공보 평8－256776호 일본 공표특허공보 평6－509713호 일본 공표특허공보 평8－502644호 일본 공개특허공보 평10－327871호 일본 공표특허공보 2008－539785호 일본 공표특허공보 2004－520016호

재조합체 단백질을 포유 동물 세포내에서 효율적으로 발현시키기 위한 신규 발현 벡터, 그 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포, 및 그 포유 동물 세포의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 향한 연구에 있어서, 본 발명자들은 유전자 발현 제어 부위, 그리고, 그 하류에 인간 글루코세레브로시다아제 등의 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 삽입한 발현 벡터를 사용하여, 포유 동물 세포를 형질 전환시킴으로써, 그 단백질을 코드하는 유전자를 고레벨로 발현시킬 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.

[1] 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 유전자 발현 제어 부위, 그리고, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 발현 벡터,

[2] 그 유전자 발현 제어 부위가 사이토메갈로 바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 신장 인자 1 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 상기 [1] 의 발현 벡터,

[3] 그 내부 리보솜 결합 부위가 피코르나 바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B 형 바이러스, 인간 면역 글로불린 중사슬 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비트랙스 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 바이러스 또는 유전자의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것인 상기 [1] 또는 [2] 의 발현 벡터,

[4] 그 내부 리보솜 결합 부위가 피코르나 바이러스과의 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것인 상기 [1] 또는 [2] 의 발현 벡터.

[5] 그 내부 리보솜 결합 부위가 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것인 상기 [1] 또는 [2] 의 발현 벡터,

[6] 그 내부 리보솜 결합 부위가 야생형의 내부 리보솜 결합 부위의 염기 배열에 1 또는 2 이상의 변이를 추가한 것인 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 발현 벡터,

[7] 그 내부 리보솜 결합 부위에 개시 코돈이 복수 존재하고, 그 중의 일부의 것이 파괴되어 이루어지는 상기 [6] 의 발현 벡터,

[8] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 1 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[9] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 2 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[10] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 3 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[11] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 4 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[12] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 5 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[13] 그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 6 의 염기 배열을 포함하는 것인 상기 [5] 의 발현 벡터,

[14] 단백질을 코드하는 그 유전자와 그 내부 리보솜 결합 부위 사이의 영역 또는 글루타민 합성 효소를 코드하는 그 유전자의 하류의 영역에 있어서, 그 내부 리보솜 결합 부위와는 별도로, 내부 리보솜 결합 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어지는 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 발현 벡터,

[15] 그 유전자 발현 제어 부위와는 별도로, 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어지는 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 발현 벡터,

[16] 그 약제 내성 유전자가 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자인 상기 [14] 또는 상기 [15] 의 발현 벡터,

[17] 단백질을 코드하는 그 유전자가 인간 유래의 유전자인 상기 [1] 내지 [16] 중 어느 한 발현 벡터,

[18] 인간 유래의 그 유전자가 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 혈액 응고 인자, 에리스로포에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 및 항체를 코드하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 상기 [17] 의 발현 벡터,

[19] 인간 유래의 그 유전자가 리소좀 효소를 코드하는 유전자인 상기 [17] 의 발현 벡터,

[20] 그 리소좀 효소가 α-갈락토시다아제 A, 이즈론산2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, 갈설파아제, α-L-이즈로니다아제, 산성α-글루코시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 상기 [19] 의 발현 벡터,

[21] 인간 유래의 그 유전자가 에리스로포에틴을 코드하는 유전자인 상기 [17] 의 발현 벡터,

[22] 상기 [1] 내지 [21] 중 어느 한 발현 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포,

[23] 그 포유 동물 세포가 CHO 세포인 상기 [22] 의 세포,

[24] 상기 [1] 내지 [21] 중 어느 한 발현 벡터를, 포유 동물 세포에 도입하는 스텝과, 그 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포를, 글루타민 합성 효소 저해제의 존재하 또는 글루타민 합성 효소 저해제 및 약제 내성 유전자에 대응하는 약제의 존재하, 선택 배양하는 스텝을 포함하는, 그 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 형질 전환 세포의 제조 방법.

본 발명에 의하면, 포유 동물 세포 내에서, 원하는 재조합체 단백질을 효율적으로 발현시키기 위한 발현 벡터를 얻을 수 있다. 그 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하고, 이어서 선택 배양함으로써, 그 재조합체 단백질을 효율적으로 생산하는 형질 전환 세포를 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 형질 전환 세포를 사용하면, 그 재조합체 단백질의 제조 비용을 대폭 저감할 수 있다.

도 1a 는 pE-neo 벡터의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 1b 는 pE-neo 벡터의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 2a 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 2b 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 2c 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3a 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3b 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3c 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3d 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3e 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3f 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3g 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3h 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 3i 는 pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 4 는 pE-mIRES-GS-puro 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 5 는 pE-mIRES-GS 의 구축 방법의 흐름을 나타내는 도면.
도 6a 는 발현 벡터 (pE-mIRES-GS (GBA)) 로 형질 전환한 hGBA 발현 세포의, 생세포 밀도를 나타내는 도면.
도 6b 는 발현 벡터 (pE-mIRES-GS (GBA) 로 형질 전환한 hGBA 발현 세포의, 글루코세레브로시다아제의 발현량 (GBA 활성) 을 나타내는 도면.
도 7a 는 발현 벡터 (pE-IRES-GS-puro (GBA) 및 pE-mIRES-GS-puro (GBA)) 로 형질 전환한 hGBA 발현 세포의, 생세포 밀도를 나타내는 도면.
도 7b 는 발현 벡터 (pE-IRES-GS-puro (GBA) 및 pE-mIRES-GS-puro (GBA)) 로 형질 전환한 hGBA 발현 세포의, 인간 글루코세레브로시다아제의 발현량 (GBA 활성) 을 나타내는 도면.
도 8a 는 발현 벡터 (pE-IRES-GS-puro (EPO) 및 pE-mIRES-GS-puro (EPO)) 로 형질 전환한 hEPO 발현 세포의, 생세포 밀도를 나타내는 도면.
도 8b 는 발현 벡터 (pE-IRES-GS-puro (EPO) 및 pE-mIRES-GS-puro (EPO)) 로 형질 전환한 hEPO 발현 세포의, 인간 에리스로포에틴의 발현량을 나타내는 도면.

본 발명에 있어서, 「유전자 발현 제어 부위」란, 그 하류에 존재하는 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 상의 영역을 말하며, 일반적으로 프로모터 또는 프로모터 유전자라고 칭해지는 것이다. 유전자 발현 제어 부위는 생체 내에서 발현하는 유전자의 거의 모든 상류측에 존재하고, 그 전사의 빈도를 조절하는 것으로, 그 염기 배열은 다양하다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 유전자 발현 제어 부위는 그 하류에 삽입한 유전자의 전사를 포유 동물 세포 내에 있어서 강력하게 유도할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스 (SMV) 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터 등의 바이러스 유래의 프로모터, 및 신장 인자 1α(EF-1) 프로모터 등이다.

본 발명에 있어서, 「내부 리보솜 결합 부위」란, mRNA 사슬의 내부에 존재하는, 리보솜이 직접 결합하고 또한 캡 구조 비의존성으로 번역을 개시할 수 있는 영역 (구조), 또는 전사됨으로써 그 영역을 일으키는 DNA 사슬의 영역 (구조) 이다. 또, 본 발명에 있어서, 「내부 리보솜 결합 부위를 코드하는 유전자」란, 전사됨으로써 그 영역을 발생하는 DNA 사슬의 영역 (구조) 이다. 내부 리보솜 결합 부위는, 일반적으로, IRES (internal ribosome entry site) 라고 칭해지고, 피코르나 바이러스과의 바이러스 (폴리오 바이러스, 라이노 바이러스, 마우스 뇌심근염 바이러스 등), 구제역 바이러스, A 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B 형 바이러스 등의 바이러스의 5' 비번역 영역, 인간 면역 글로불린 중사슬 결합 단백질, 초파리 안테나페디아, 초파리 울트라비트랙스 등의 유전자의 5' 비번역 영역에 발견되고 있다. 피코르나 바이러스의 경우, 그 IRES 는 mRNA 의 5' 비번역 영역에 존재하는 약 450 bp 로 이루어지는 영역이다. 여기서 「바이러스의 5' 비번역 영역」이란, 바이러스의 mRNA 의 5' 비번역 영역, 또는 전사됨으로써 그 영역을 발생하는 DNA 사슬의 영역 (구조) 이다.

본 발명에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위는, 포유 동물 세포 내, 특히 차이니즈 햄스터의 난소에서 유래하는 세포 (CHO 세포) 내에서, 내부 리보솜 결합 부위로서 기능하는 것인 한 특별히 한정은 없고, 어느 것이나 사용할 수 있다. 그들 중, 바람직하게는 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 보다 바람직하게는 피코르나 바이러스과의 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 더욱 바람직하게는 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위는 야생형의 염기 배열을 갖는 것을 그대로 사용할 수 있다. 또, 이들 야생형의 내부 리보솜 결합 부위의 염기 배열에, 1 또는 2 이상의 변이 (예를 들어, 치환, 결손, 또는/및 삽입 등을 말한다.) 를 추가한 변이형의 내부 리보솜 결합 부위도, 포유 동물 세포내 (특히 CHO 세포 내) 에서 내부 리보솜 결합 부위로서 기능하는 것인 한, 어느 것이나 사용할 수 있다. 또, 2 이상의 내부 리보솜 결합 부위를 융합시킨 키메라형의 내부 리보솜 결합 부위도 사용할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서는, 내부 리보솜 결합 부위의 제어하에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자 (GS 유전자) 를 배치함으로써, GS 유전자의 발현량을 조절할 수 있다. 이러한 조절에 의해, GS 유전자의 발현량을, 선택 배양에 있어서 충분한 선택압이 얻어지는 일정한 범위의 양으로 조절하면, 후술하는 바와 같이, 재조합체 단백질을 고레벨로 발현하는 포유 동물 세포를 선택하는 것이 가능해진다.

GS 유전자의 발현량을 조절하는 경우, 여러 가지의 내부 리보솜 결합 부위 중에서, GS 유전자의 발현량을 보다 증가시키거나 또는 보다 감소시키는 내부 리보솜 결합 부위를 적절히 선택하여 사용함으로써, 당해 목적을 달성할 수 있다. 또, 내부 리보솜 결합 부위에 변이를 추가함으로써, 당해 목적을 달성할 수도 있다. 이 경우에 있어서, 당해 변이를 추가하는 장소 등에 특별히 한정은 없고, 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 존재하는 GS 유전자의 발현량을, 일정한 범위의 양으로 조절할 수 있는 한 어떠한 것이어도 된다.

예를 들어, GS 유전자의 발현량을 감소시키는 목적으로 변이를 추가하는 경우, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 존재하는 번역 개시점으로서 사용할 수 있는 복수의 개시 코돈 (ATG) 이 타겟이 될 수 있다. 예를 들어, 이들 개시 코돈을, 변이에 의해 파괴함으로써, 이들 개시 코돈에 대해 인프레임에 삽입된 GS 유전자의 발현량을 감소시킬 수 있다. 여기에, 「파괴」란, 어느 유전자 배열에 변이를 추가함으로써, 당해 유전자 배열이 본래 갖는 기능을 발휘시키지 않게 하는 것을 말한다. 예를 들어, 야생형의 마우스 뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합 부위의 3' 말단에는, 3 개의 개시 코돈 (ATG) 이 존재하고 있고, 그 배열을 배열 번호 1 (5'- ATGataatATGgccacaaccATG-3' ： 개시 코돈은 명시를 위해 대문자로 나타냈다.) 로 나타낸다. 이 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 존재하는 GS 유전자의 발현량을 감소시키는 경우, 변이를 추가하여 파괴하는 개시 코돈은 바람직하게는 5' 측으로부터 2 번째 및 3 번째의 개시 코돈이며, 보다 바람직하게는 2 번째의 개시 코돈이다. 따라서, 이와 같은 변이를 추가한 내부 리보솜 결합 부위로서는, 예를 들어, 그 3' 말단이 배열 번호 2 (5'-atgataatnnngccacaaccnnn-3' ： n 은 임의의 염기) 혹은 배열 번호 32 (5'-atgataannnngccacaaccnnn-3' ： n 은 임의의 염기) 의 염기 배열인 것, 또는 배열 번호 3 (5'-atgataatnnngccacaaccatg-3' ： n 은 임의의 염기) 혹은 배열 번호 33 (5'-atgataannnngccacaaccatg-3' ： n 은 임의의 염기) 의 염기 배열인 것을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 그 3' 말단이 배열 번호 4 (5'-atgataagcttgccacaaccatg-3'；) 의 염기 배열인 내부 리보솜 결합 부위이며, 변이에 의해 5' 측으로부터 2 번째의 개시 코돈이 파괴된 것이다.

더욱 상세하게는, 야생형의 마우스 뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합 부위는 배열 번호 5 (5'-cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttgg aataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg-3') 의 염기 배열을 포함하는 것이다. 또, 그 염기 배열에 변이를 추가한 것으로서는, 배열 번호 6 (5'-cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgc ttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatg-3') 의 염기 배열을 들 수 있다.

또, 야생형 및/또는 변이형의 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 존재하는 GS 유전자의 발현량을, 다른 방법으로 조절할 수도 있다. 예를 들어, GS 유전자의 발현량을 감소시키는 경우, 이들 내부 리보솜 결합 부위의 개시 코돈에 대해 아웃 오브 프레임에 GS 유전자를 삽입하는 것이나, 내부 리보솜 결합 부위와 그 하류에 존재하는 GS 유전자의 사이에, 전사 혹은 번역을 저해하는 염기 배열을 도입하는 것에 의해서도, 그 유전자의 발현량을 감소시킬 수 있다. 전사를 저해하는 염기 배열은 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 삽입한 GS 유전자의 전사를 저해하는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 폴리머라아제 부가 시그널 (5'-aataaa-3') 등이 있다. 또, 번역을 저해하는 염기 배열은 내부 리보솜 결합 부위의 하류에 삽입한 그 유전자의 번역을 저해하는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 리딩스루를 유도하는 스톱 코돈 등, 올바른 번역을 저해하는 것 등이 있다.

본 발명에 있어서, 「글루타민 합성 효소」라고 할 때는, 글루탐산과 암모니아로부터 글루타민을 합성할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없고, 포유 동물, 파충류, 조류, 양서류, 인시목 (Lepidoptera) 에 속하는 누에 (Bombyx mori), 밤나방 (Spodoptera frugiperda), 자벌레 (Geometridae) 등, 쌍시목 (Diptera) 에 속하는 초파리 (Drosophila) 등의 곤충, 원핵생물, 선충, 효모, 방선균, 사상균, 자낭균, 탄자균 및 식물 유래를 포함하여 어떠한 생물 유래의 것이어도 되는데, 바람직하게는 포유 동물의 것이며, 인간 또는 차이니즈 햄스터 유래의 것 (특히, CHO 세포 유래의 것) 을 바람직하게 사용할 수 있다.

또, 「글루타민 합성 효소 저해제」라고 할 때는, 상기 글루타민 합성 효소의 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없고, 어느 것이나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 메티오닌술폭시민 (MSX) 을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 발현 벡터에 GS 유전자에 더하여, 추가의 선택 마커 유전자를 도입할 수 있다. 그 추가의 선택 마커 유전자는 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포에 약제 내성을 부여할 수 있는 유전자 (약제 내성 유전자) 이다. 본 발명에 있어서, 약제 내성 유전자로서 사용할 수 있는 유전자는 포유 동물 세포에 약제 내성을 부여할 수 있는 유전자인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 세포에 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티사이딘, 네오마이신 등의 약제에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자이다. 여기에 있어서, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티사이딘, 네오마이신 등의 약제는 각각 「약제 내성 유전자에 대응하는 약제」이다. 이들의 약제 내성 유전자 중, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 약제 내성 유전자는 재조합체 단백질이 제어를 받는 유전자 발현 제어 부위와는 다른 유전자 발현 제어 부위 (제 2 유전자 발현 제어 부위) 를 형성하고, 그 하류에 삽입함으로써 발현량을 제어할 수 있다. 이 경우, 그 제 2 유전자 발현 제어 부위는, 약제 내성 유전자의 발현량을, 선택 배양에 있어서 충분한 선택압이 얻어지는 일정한 범위의 양으로 조절할 수 있는 것이 사용된다. 즉, 약제 내성 유전자의 발현량을 비교적 억제함으로써, 발현 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포의 약제에 대한 감수성을 높일 수 있고, 이로써, 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 고레벨로 발현하고, 그 재조합체 단백질을 고레벨로 생산하는 포유 동물 세포의 선택이 가능해진다.

또, 본 발명에 있어서, 약제 내성 유전자는, 그 상류에 제 2 내부 리보솜 결합 부위를 통하여, 재조합체 단백질을 코드하는 유전자와 내부 리보솜 결합 부위 사이의 영역 또는 GS 유전자의 하류의 영역에 삽입할 수 있다. 이로써, 약제 내성 유전자의 발현량을 제 2 내부 리보솜 결합 부위에 의해 제어할 수 있다. 이 경우, 제 2 내부 리보솜 결합 부위로서, GS 유전자의 상류의 내부 리보솜 결합 부위와 동일한 것을 사용해도 되고, 또 다른 것을 사용해도 된다. 또, 제 2 내부 리보솜 결합 부위는 상기의 여러 가지의 내부 리보솜 결합 부위로부터 임의로 선택할 수 있다. 제 2 리보솜 결합 부위에 관해서도, 상기 서술과 마찬가지로, 적당한 것을 선택하거나 혹은 변이를 추가하거나 하는 것 등에 의해, 약제 내성 유전자의 발현량을 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터에 삽입되는 재조합체 단백질을 코드하는 유전자의 동물종은 인간을 포함하는 포유 동물 유래의 것을 포함하며, 특별히 한정은 없다. 예를 들어, 그 유전자는, 본 발명의 벡터를 의료용 의약품의 제조에 사용할 때는, 대체로 인간 유래의 것이 되고, 가축용의 의약품의 제조에 사용할 때도, 대체로 치료 대상으로 하는 가축 유래의 유전자의 것이 된다. 또, 그 원하는 단백질을 코드하는 유전자의 종류에도 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, α-갈락토시다아제 A, 이즈론산2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, 갈설파아제, α-L-이즈로니다아제, 산성α-글루코시다아제 등의 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 혈액 응고 제 VII 인자, 혈액 응고 제 VIII 인자, 혈액 응고 제 IX 인자 등의 혈액 응고 인자, 에리스로포에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 또는 각종 항체 의약을 코드하는 유전자이며, 보다 바람직하게는 리소좀 효소 및 에리스로포에틴을 코드하는 유전자이며, 더욱 바람직하게는 글루코세레브로시다아제 및 에리스로포에틴을 코드하는 유전자이다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터가 도입되는 포유 동물 세포는 목적의 재조합체 단백질을 발현할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 생체로부터 취출한 장기, 근조직, 피부 조직, 결합 조직, 신경 조직, 혈액, 골수 등으로부터 채취된 세포의 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 계대 배양해도 형질이 안정되도록 주화(株化)된 세포 중 어느 것이어도 된다. 또, 세포는 정상 세포, 암화 세포 중 어느 것이어도 된다. 특히 바람직하게 사용할 수 있는 세포는 차이니즈 햄스터의 난소에서 유래하는 CHO 세포, 인간의 섬유아세포 및 아프리카 그린 원숭이의 신(腎) 선유아세포에서 유래하는 COS 세포이다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터의 포유 동물 세포에 대한 도입은 포유 동물 세포 내에 있어서 재조합체 단백질을 코드하는 유전자가 발현되도록 하는 목적에서 실시하는 것이며, 이 목적을 달성할 수 있는 한 어떠한 방법을 사용해도 된다. 발현 벡터는 통상적으로 고리형의 플라스미드이지만, 이것은 고리형인 상태이어도, 또는 제한 효소로 절단하여 직선형으로 한 후이어도 세포에 도입할 수 있다.

발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포 (발현 벡터 도입 세포) 는 글루타민 합성 효소 저해제 (예를 들어, MSX 등) 를 첨가한 글루타민 불포함 또는 저글루타민 배지 (해당하는 경우에는, 추가로 약제 내성 유전자에 대응하는 약제 (예를 들어, 항생 물질 등) 를 첨가한 배지) 중에서 배양되고, 세포 내에서 GS 유전자 (해당하는 경우에는, 추가로 약제 내성 유전자) (이른바 선택 마커) 가 발현하는 세포만 선택된다. 이것을 선택 배양이라고 하고, 이 때 사용되는 배지를 선택 배지라고 한다.

선택 배양에 있어서는, 발현하는 선택 마커의 양이 첨가되는 GS 저해제 또는 약제의 양 등에 비해 너무 많은 경우에는, 충분한 선택압이 가해지지 않고, 재조합체 단백질의 발현량이 상대적으로 많은 발현 벡터 도입 세포를 얻을 수 없는 한편, 발현하는 선택 마커의 양이 극단적으로 너무 적은 경우에는, 세포가 사멸하거나 충분히 증식할 수 없어, 역시 발현량이 상대적으로 많은 발현 벡터 도입 세포를 얻을 수 없다. 그러나, 발현하는 선택 마커의 양을, 일정한 범위의 양으로 조절함으로써, GS 저해제나 약제에 대한 감수성을 높여 충분한 선택압을 얻을 수 있도록 하면, 이하에 기술하는 바와 같이, 재조합체 단백질의 발현량이 상대적으로 많은 발현 벡터 도입 세포를 얻을 수 있다.

즉, 발현하는 선택 마커의 양을, 선택 배양에 있어서 충분한 선택압을 얻을 수 있도록, 일정한 범위의 양으로 조절한 다음, 선택 배지 중에 첨가되는 GS 저해제의 농도 (해당하는 경우에는, 추가로 약제 내성 유전자에 대응하는 약제의 농도) 를 단계적으로 상승시킴으로써, 선택 마커의 발현량이 보다 많은 발현 벡터 도입 세포를 선택할 수 있다. 이것은, 선택 배양의 과정에서, 발현 벡터 도입 세포의 게놈 중에 삽입된 선택 마커의 수가 중복에 의해 증가하고, 선택 마커의 발현량이 상대적으로 증가한 발현 벡터 도입 세포만이 선택적으로 증식하는 것 등에서 기인한다. 이 때, 발현 벡터에 삽입한 재조합체 단백질을 코드하는 유전자의 카피수도 증가하므로, 그 유전자의 발현량도 증가한다. 따라서, 발현 벡터 도입 세포를 이와 같이 선택 배양함으로써, 원하는 재조합체 단백질의 발현량이 상대적으로 많은 발현 벡터 도입 세포를 선택할 수 있다. 본 명세서에 있어서는, 이와 같이 선택된 발현 벡터 도입 세포를 형질 전환 세포라고 한다.

본 발명에 있어서, 선택 마커로서 GS 유전자에 더하여 약제 내성 유전자를 추가로 삽입한 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하는 경우에는, GS 유전자만을 삽입한 경우에 비해, 더욱 발현량이 많은 형질 전환 세포를 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서, 선택 배지 중에 첨가되는 GS 저해제 또는 약제 내성 유전자에 대응하는 약제의 농도를 단계적으로 상승시키는 경우에 있어서, 그 최대 농도는, 예를 들어, GS 저해제가 메티오닌술폭시민인 경우, 바람직하게는 100 ∼ 1000 μM 이며, 보다 바람직하게는 200 ∼ 500 μM 이며, 더욱 바람직하게는 약 300 μM 이다. 혹은, 약제가 퓨로마이신인 경우, 그 최대 농도는 바람직하게는 3 ∼ 30 μM 이며, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μM 이며, 더욱 바람직하게는 약 10 μM 이다.

실시예

이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.

〔pE-neo 벡터 및 pE-hygr 벡터의 구축〕

pEF/myc/nuc 벡터 (인비트로젠사) 를, KpnI 와 NcoI 로 소화하고, EF-1 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo (인비트로젠사) 를, BglII 및 EcoRI 로 소화하여, CMV 의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다 (도 1a 및 도 1b).

pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI 로 소화하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1 kbp 의 영역을 절제했다 (도 2a). pcDNA3.1/Hygro(+) (인비트로젠사) 를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5'(5'-gaggccgcctcggcctctga-3'； 배열 번호 7) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(5'-aaccatcgtgatgggtgctattcctttgc-3'； 배열 번호 8) 을 사용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다 (도 2b). 증폭한 하이그로마이신 유전자를 SfiI 및 BstXI 로 소화하고, 상기의 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축했다 (도 2c).

〔pE-IRES-GS-puro 의 구축〕

발현 벡터 pPGKIH (Miyahara M. et. al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) 를 제한 효소 (XhoI 및 BamHI) 로 소화하고, 마우스 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 하이그로마이신 내성 유전자 (Hygr 유전자) 및 마우스 포스포글리세린산 키나아제 (mPGK) 의 폴리아데닐화 영역 (mPGKpA) 을 포함하는 염기 배열 IRES-Hygr-mPGKpA (5'-CTCGAGgaattcactccttcaggtg cgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcGGATCC-3' ; 배열 번호 9. 5' 단의 대문자로 나타낸 배열 CTCGAG 가 「XhoI 사이트」, 그 다음에 대문자로 나타낸 CGC 로부터 시작되는 배열 및 그것에 계속되는 소문자 3 문자 (atg) 로 이루어지는 영역이 「마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 포함하는 염기 배열」, 그 atg 로부터 시작되는 소문자로 나타낸 영역이 「하이그로마이신 내성 유전자를 코드하는 염기 배열」, 그 다음의 소문자로 나타낸 aaa 로부터 시작되는 영역이 「마우스 포스포글리세린산 키나아제 (mPGK) 의 폴리아데닐화 영역을 포함하는 염기 배열」, 및, 3' 단의 대문자로 나타낸 배열 GGATCC 가 「BamHI 사이트」이다.) 의 DNA 단편을 잘라냈다 (또한, Hygr 유전자에 대응하는 아미노산 배열은 배열 번호 10 으로 나타낸 것이다.). 이 DNA 단편을 pBluescript SK(-) (Stratagene 사) 의 XhoI 와 BamHI 간에 삽입하고, 이것을 pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA) 로 했다 (도 3a).

pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA) 를 주형으로 하여 프라이머 IRES5' (5'-caactcgagc ggccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttact-3'； 배열 번호 11) 및 프라이머 IRES3' (5'-caagaagcttccagaggaactg-3'； 배열 번호 12) 을 사용하여 PCR 에 의해 EMCV 의 IRES 의 일부를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (XhoI 및 HindIII) 로 소화하여, pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA) 의 XhoI 와 HindIII 간에 삽입하고, 이것을 pBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) 로 했다 (도 3b).

pBSK (NotI-IRES-Hygro-mPGKpA) 를 제한 효소 (NotI 및 BamHI) 로 소화하여, pE-hygr 벡터의 NotI 와 BamHI 간에 삽입하고, 이것을 플라스미드 pE-IRES-Hygr 로 했다 (도 3c).

발현 벡터 pPGKIH 를 주형으로 하여 프라이머 mPGKP5' (5'-gcgagatcttaccgggtaggggaggcgctt-3'； 배열 번호 13) 및 프라이머 mPGKP3' (5'-gaggaattcgatgatcggtcgaaaggcccg-3'； 배열 번호 14) 을 사용하여 PCR 에 의해 mPGK 의 프로모터 영역 (mPGKp) 포함하는 염기 배열 (5'-GCGagatctTACCGGGTAGGGG AGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCgatcatcGAATTCctc-3'； 배열 번호 15. 5' 말단으로부터 최초로 소문자로 나타낸 배열 agatct 가 「BglII 사이트」, 이것에 계속되는 대문자로 나타낸 TAC 로부터 시작되는 배열이 「마우스 포스포글리세린산 키나아제 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 염기 배열」, 및, 그 다음에 대문자로 나타낸 배열 GAATTC 가 「EcoRI 사이트」이다.) 의 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (BglII 및 EcoRI) 로 소화하여, pCI-neo (Promega 사) 의 BglII 와 EcoRI 간에 삽입하고, 이것을 pPGK-neo 로 했다 (도 3d).

pE-IRES-Hygr 을 제한 효소 (NotI 및 BamHI) 로 소화하여 DNA 단편 (IRES-Hygr) 을 잘라내고, pPGK-neo 의 NotI 와 BamHI 간에 삽입하여, 이것을 pPGK-IRES-Hygr 로 했다 (도 3e).

CHO-K1 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 프라이머 GS5' (5'-aatatggccacaaccatggcgacctcagcaagttcc-3'； 배열 번호 16) 및 프라이머 GS3' (5'-ggaggatccctcgagttagtttttgtattggaagggct-3'； 배열 번호 17) 을 사용하여 PCR 에 의해 GS 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (BalI 및 BamHI) 로 소화하여, pPGK-IRES-Hygr 의 BalI 와 BamHI 간에 삽입하고, 이것을 pPGK-IRES-GS-ΔpolyA 로 했다 (도 3f).

pCAGIPuro (Miyahara M. et. al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) 를 주형으로 하여 프라이머 puro5' (5'-gcttaagatgaccgagtacaagcccacg-3'； 배열 번호 18) 및 프라이머 puro3' (5'-cccatcgtgatggtcaggcaccgggcttgc-3'； 배열 번호 19) 을 사용하여 PCR 에 의해 퓨로마이신 내성 유전자 (puro 유전자) 를 포함하는 염기 배열 (5'-GcttaagATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTA CGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAccatcacgatggG-3'； 배열 번호 20. 5' 단으로부터 최초로 소문자로 나타낸 배열 cttaag 가 「AflII 사이트」, 이것에 계속되는 대문자로 나타낸 ATG 로부터 시작되는 배열이 「퓨로마이신 내성 유전자 (puro 유전자) 를 코드하는 염기 배열」, 및, 그 다음의 소문자로 나타낸 배열이 「BstXI 사이트」이다.) 의 DNA 단편을 증폭시켰다 (또한, puro 유전자에 대응하는 아미노산 배열은 배열 번호 21 로 나타낸 것이다.). 이 DNA 단편을 제한 효소 (AflII 및 BstXI) 로 소화하여, 발현 벡터 pE-neo 의 AflII 와 BstXI 간에 삽입하고, 이것을 pE-puro 로 했다 (도 3g).

pE-puro 를 주형으로 하여 프라이머 SV40polyA5' (5'-caacaagcggccgccctc gagttccctttagtgagggttaatgc-3'； 배열 번호 22) 및 프라이머 SV40polyA3' (5'-cccctgaacctgaaacataaaatg-3'； 배열 번호 23) 을 사용하여 PCR 에 의해 SV40 후기 폴리아데닐화 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (NotI 및 HpaI) 로 소화하고, 발현 벡터 pE-puro 의 NotI 와 HpaI 간에 삽입하고, 이것을 pE-puro (XhoI) 로 했다 (도 3h).

pPGK-IRES-GS-ΔpolyA 를 제한 효소 (NotI 및 XhoI) 로 소화하여, IRES-GS 영역을 포함하는 DNA 단편을 잘라내고, 이것을 발현 벡터 pE-puro (XhoI) 의 NotI 와 XhoI 간에 삽입하여, 이것을 pE-IRES-GS-puro 로 했다 (도 3i).

〔pE-mIRES-GS-puro 의 구축〕

발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 를 주형으로 하여 프라이머 mIRES-GS5' (5'-acacgatgataagcttgccacaacc-3'； 배열 번호 24) 및 프라이머 mIRES-GS3' (5'-ctccacgatatccctgccata-3'； 배열 번호 25) 을 사용하여 PCR 에 의해 EMCV 의 IRES 로부터 GS 에 걸친 영역을 증폭시키고, EMCV 의 IRES 의 5' 측으로부터 2 번째에 위치하는 개시 코돈 (ATG) 에 변이를 추가하여 파괴한 DNA 단편을 증폭시켰다. 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 를 주형으로 하여, 이 DNA 단편과 상기의 프라이머 IRES5' 를 사용하여 PCR 에 의해 IRES 로부터 GS 에 걸친 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (NotI 및 PstI) 로 소화하여, 잘라낸 DNA 단편을, 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 의 NotI 와 PstI 간에 삽입하고, 이것을 pE-mIRES-GS-puro 로 했다 (도 4).

〔pE-mIRES-GS 의 구축〕

발현 벡터 pE-neo 를 주형으로 하여 프라이머 SV40polyA5'-2 (5'-actaactcgagttccctttagtg-3'； 배열 번호 26) 및 프라이머 SV40polyA3'-2 (5'-aacggatccttatcggattttaccac-3'； 배열 번호 27) 를 사용하여 PCR 에 의해 SV40 polyA 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (XhoI 및 BamHI) 로 소화하여, pE-mIRES-GS-puro 의 XhoI 와 BamHI 간에 삽입하고, 이것을 pE-mIRES-GS 로 했다 (도 5).

〔인간 글루코세레브로시다아제 (hGBA) 발현 벡터의 구축〕

인간 간장 Quick Clone cDNA (Clontech 사) 를 주형으로 하여 프라이머 hGBA5' (5'-gcaatacgcgtccgccaccatggagttttcaagtccttccagagagg-3'； 배열 번호 28) 및 프라이머 hGBA3' (5'-ggacgcggccgcgagctctcactggcgacgccacaggtagg-3'； 배열 번호 29) 을 사용하여 PCR 에 의해 인간 글루코세레브로시다아제 유전자 (hGBA 유전자) 를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화하여, pE-IRES-GS-puro, pE-mIRES-GS 및 pE-mIRES-GS-puro 의 MluI 와 NotI 간에 삽입하고, 각각 GBA 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro (GBA), pE-mIRES-GS (GBA), 및 pE-mIRES-GS-puro (GBA) 로 했다.

〔인간 에리스로포에틴 (hEPO) 발현 벡터의 구축〕

pCI-neo (EPO) 를 주형으로 하여 프라이머 hEPO5' (5'-aagacgcgtcgccaccatgg gggtgcacgaatgtcctgc-3'； 배열 번호 30) 및 프라이머 hEPO3' (5'-aagagcggccgctca tctgtcccctgtcctgcagg-3'； 배열 번호 31) 을 사용하여 PCR 에 의해 hEPO 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화하여, pE-IRES-GS-puro 및 pE-mIRES-GS-puro 의 MluI 와 NotI 간에 삽입하고, 각각 hEPO 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro (EPO) 및 pE-mIRES-GS-puro (EPO) 로 했다.

〔hGBA 발현 세포 및 hEPO 발현 세포의 제조〕

차이니즈 햄스터의 난소에서 유래하는 세포의 CHO-K1 세포에, 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen 사) 을 사용하여, pE-IRES-GS-puro (GBA), pE-mIRES-GS (GBA), pE-mIRES-GS-puro (GBA), pE-IRES-GS-puro (EPO) 및 pE-mIRES-GS-puro (EPO) 를 각각 도입했다. 이들 세포를 선택 배지를 사용하여 선택 배양하고, hGBA 발현 형질 전환 세포 및 hEPO 발현 형질 전환 세포를 얻었다.

이 때, pE-IRES-GS-puro (GBA), pE-mIRES-GS-puro (GBA), pE-IRES-GS-puro (EPO) 및 pE-mIRES-GS-puro (EPO) 를 도입한 세포의 선택 배양에는, 메티오닌술폭시민 (SIGMA 사) 및 퓨로마이신 (SIGMA 사) 을 포함하는 CD Opti CHO 배지 (Invitrogen 사) 를 선택 배지로서 사용하고, pE-mIRES-GS (GBA) 를 도입한 세포의 선택 배양에는, 메티오닌술폭시민 (SIGMA 사) 을 포함하는 CD Opti CHO 배지 (Invitrogen 사) 를 선택 배지로서 사용했다. 선택 배양시, 메티오닌술폭시민 및 퓨로마이신의 농도를 단계적으로 상승시켜, 최종적으로 메티오닌술폭시민의 농도를 300 μM, 퓨로마이신의 농도를 10 ㎍/㎖ 로 하여, 약제 내성을 나타내는 세포를 선택적으로 증식시켰다. 이 선택 배양에 의해, 3 종류의 hGBA 발현 형질 전환 세포와 2 종류의 hEPO 발현 형질 전환 세포를 얻었다.

〔hGBA 발현 세포의 배양과 세포 밀도의 측정〕

선택 배양하여 얻은 형질 전환 세포를, 2×10⁵개/㎖ 의 세포 밀도로, 300 μM 의 메티오닌술폭시민과 10 ㎍/㎖ 의 퓨로마이신을 함유하는 5 ㎖ 의 CD Opti CHO 배지에서, 5 ％ CO₂ 존재하에서 12 일간 배양했다. 배양 온도는 배양 개시부터 3 일째까지는 37 ℃ 로, 그 후는 30 ℃ 로 설정했다. 배양, 4, 7, 10 및 12 일째에 배양 상청을 샘플링하여, 세포 밀도를 측정했다. 단, pE-mIRES-GS (GBA) 를 도입하여 얻은 hGBA 발현 형질 전환 세포의 배양은 300 μM 의 메티오닌술폭시민을 함유하는 5 ㎖ 의 CD Opti CHO 배지를 사용하여 실시했다.

〔hEPO 발현 세포의 배양과 세포 밀도의 측정〕

선택 배양하여 얻은 형질 전환 세포를, 2×10⁵개/㎖ 의 세포 밀도로, 300 μM 의 메티오닌술폭시민과 10 ㎍/㎖ 의 퓨로마이신을 함유하는 5 ㎖ 의 CD Opti CHO 배지에서, 5 ％ CO₂ 존재하에서 7 일간 배양했다. 배양 온도는 배양 개시부터 3 일째까지는 37 ℃ 로, 그 후는 30 ℃ 로 설정했다. 배양 7 일째에 배양 상청을 샘플링하여, 세포 밀도를 측정했다.

〔hGBA 의 활성 측정〕

GBA 활성 측정은 Pasmanik-Chor M. et al., Biochem J 317, 81-88 (1996) 에 기재된 방법을 참고로 하여 실시했다. 인산4-메틸움벨리페릴 (4-MUF, Sigma Chemical Co. 제조) 을 희석용 완충액 (0.125 ％ 나트륨-타우로콜레이트, 0.15 ％ Triton X-100, 0.1 ％ 소 혈청 알부민을 함유하는 100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 5.96)) 에 용해한 후, 단계 희석하여, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 mM 농도의 표준 용액을 제조했다. 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드 (Sigma Chemical Co. 제조) 를, 4 mM 의 농도가 되도록 희석용 완충액에 용해하고, 이것을 기질 용액으로 했다. 검체는 필요에 따라, 측정 전에 희석용 완충액을 사용하여 희석했다. 플루오로 플레이트 F96 에, 4-MUF 표준 용액 또는 검체를 10 ㎕ 씩 첨가한 후, 기질 용액을 70 ㎕ 첨가하여 혼합했다. 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 반응 정지액으로서 50 mM 글리신-NaOH 완충액 (pH 10.6) 을 200 ㎕ 씩 각 웰에 첨가한 후, 플루오로 플레이트 리더를 사용하여, 여기 파장 355 nm, 검출 파장 460 nm 의 조건에서 형광 강도를 측정했다. 4-MUF 표준 용액의 형광 강도로부터 검량선을 그리고, 각 검체의 형광 강도를 검량선에 내삽하여, 활성 (nmol/h/㎖) 을 산출했다.

〔ELISA 법에 의한 hEPO 의 정량〕

재조합체 hEPO 를 사용하여 면역한 토끼의 혈액으로부터, 통상적인 방법에 의해 토끼 항 hEPO 항체 용액을 얻었다. 또한, 재조합체 hEPO 는 국제 공개 공보 (WO2008/068879) 에 기재된 방법을 참고로 하여 제조했다. 토끼 항 hEPO 항체 용액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켜 항체를 플레이트에 고정시켰다. 액을 버린 후, 0.075 ％ Tween20 을 포함하는 1 ％ BSA/TBS－T 액 (Tris ： 0.005 M, NaCl ： 0.138 M, KCl ： 0.0027 M, pH 8.0) 을 플레이트에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켜 플레이트를 블로킹했다. 액을 버리고, 플레이트를 0.075 ％ Tween20 을 포함하는 TBS－T 액으로 3 회 세정한 후, 적당한 농도로 희석한 검체를 플레이트에 100 ㎕ 씩 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 이 때, 로우리 (Lowry) 법에 의해 정량한 자가 제조의 hEPO 를 희석하여 1 ∼ 16 ng/㎖ 의 농도로 한 것을 표준 용액으로 하여, 검체와 마찬가지로 플레이트에 첨가하여 가만히 정지시켰다. 액을 버리고, 플레이트를 상기와 마찬가지로 하여 세정 후, HRP 표식한 마우스 항 hEPO 모노클로날 항체 (R＆D 사 제조) 를 2 차 항체로서 플레이트에 100 ㎕ 씩 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 플레이트를 상기와 마찬가지로 하여 세정 후, HRP 기질 (프로메가사) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 15 분간 가만히 정지시킨 후, 염산을 첨가하여 반응을 정지했다. 마이크로 웰 플레이트 리더로 450 nm 에 있어서의 흡광도를 측정하여, 표준 용액의 흡광도와의 비교로부터 검체 중의 hEPO 농도를 구했다.

〔결과〕

상기와 같이, 유전자 발현 제어 부위로서 신장 인자 1 α 프로모터 (EF-1p), 단백질을 코드하는 유전자로서 인간 글루코세레브로시다아제 (hGBA) 유전자, 내부 리보솜 결합 부위로서 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열을 포함하는 변이형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위 (EMCV-mIRES), 및 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자 (GS 유전자) 를 이 순서로 삽입한 발현 벡터인 pE-mIRES-GS (GBA) 를 도입한 CHO 세포를 선택 배지에서 배양하고, 배지 중의 hGBA 의 활성을 측정함과 함께 세포 밀도를 측정했다. 실험은 독립적으로 4 회 (벌크 1 ∼ 4) 실시했다. 세포 밀도는 4 회 모두 배양 7 일째에는 거의 2.5×10⁶개/㎖ 에 도달했다 (도 6a). 한편, 배지 중의 hGBA 활성은, 벌크 2 에서는 배양 10 일째에 30 μmol/h/㎖ 에 도달하고 (도 6b), pE-mIRES-GS (GBA) 를 사용하여 CHO 세포를 형질 전환함으로써, hGBA 를 고레벨로 발현하는 세포가 얻어지는 것을 알 수 있었다. 단, 벌크 1 및 3 에서는, 배지 중의 hGBA 의 활성은 매우 낮고, pE-mIRES-GS (GBA) 를 사용한 경우, 선택 배지에서 배양 후의 세포에, hGBA 의 발현량이 낮은 세포가 상당한 비율로 포함되는 것이 시사되었다.

이어서, 유전자 발현 제어 부위로서 EF-1p, 단백질을 코드하는 유전자로서 hGBA 유전자, 내부 리보솜 결합 부위로서 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열을 포함하는 야생형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위 (EMCV-IRES), 및 GS 유전자를 이 순서로 삽입하고, 또한 약제 내성 유전자로서 퓨로마이신 내성 유전자 (puro 유전자) 를 삽입한 발현 벡터인 pE-IRES-GS-puro (GBA) 를 도입한 CHO 세포를 선택 배지에서 배양하고, 배지 중의 hGBA 의 활성을 측정함과 함께 세포 밀도를 측정했다. 실험은 독립적으로 3 회 (벌크 1 ∼ 3) 실시했다. 세포 밀도는 3 회 모두 배양 7 일째에는 거의 3 ∼ 4×10⁶개/㎖ 에 도달하고, 특히 벌크 3 에서는, 4×10⁶개/㎖ 를 초과하고 있었다 (도 7a 우측). 한편, 배지 중의 hGBA 활성은 3 회 모두 배양 10 일째에 5 ∼ 10 μmol/h/㎖ 에 도달하고 (도 7b 우측), pE-IRES-GS-puro (GBA) 를 사용하여 CHO 세포를 형질 전환함으로써, hGBA 를 고레벨로 발현하는 세포가 얻어지는 것을 알 수 있었다.

이어서, 유전자 발현 제어 부위로서 EF-1p, 단백질을 코드하는 유전자로서 hGBA 유전자, 내부 리보솜 결합 부위로서 EMCV-mIRES, 및 GS 유전자를 이 순서로 삽입하고, 또한, 약제 내성 유전자로서 puro 유전자를 삽입한 발현 벡터인 pE-mIRES-GS-puro (GBA) 를 도입한 CHO 세포를 선택 배지에서 배양하고, 배지 중의 hGBA 의 활성을 측정함과 함께 세포 밀도를 측정했다. 실험은 독립적으로 3 회 (벌크 1 ∼ 3) 실시했다. 세포 밀도는 3 회 모두 배양 7 일째에는 거의 2 ∼ 3×10⁶개/㎖ 에 도달했다 (도 7a 좌측). 한편, 배지 중의 hGBA 활성은 3 회 모두 배양 10 일째에 15 ∼ 25 μmol/h/㎖ 에 도달하고 (도 7b 좌측), 그 발현량은 pE-IRES-GS-puro (GBA) 를 사용하여 형질 전환시킨 CHO 세포의 hGBA 의 발현량과 비교해도 현저하게 높고, pE-mIRES-GS-puro (GBA) 를 사용하여 CHO 세포를 형질 전환함으로써, hGBA 를 매우 고레벨로 발현하는 세포가 얻어지는 것을 알 수 있었다. 특히 벌크 3 에서는, 배양 12 일째에 hGBA 의 활성이 35 μmol/h/㎖ 를 넘어 매우 고레벨의 hGBA 의 발현을 나타냈다.

이어서, 유전자 발현 제어 부위로서 EF-1p, 단백질을 코드하는 유전자로서 인간 에리스로포에틴 유전자 (hEPO 유전자), 내부 리보솜 결합 부위로서 EMCV-IRES, 및 GS 유전자를 이 순서로 삽입하고, 또한 약제 내성 유전자로서 puro 유전자를 삽입한 발현 벡터인 pE-IRES-GS-puro (EPO) 를 도입한 CHO 세포를 선택 배지에서 배양하고, 배지 중의 hEPO 의 농도를 측정함과 함께 세포 밀도를 측정했다.

실험은 독립적으로 2 회 (벌크 1 ∼ 2) 실시했다. 세포 밀도는 2 회 모두 배양 7 일째에는 거의 2 ∼ 3×10⁶개/㎖ 에 도달했다 (도 8a 우측). 한편, 배지 중의 hEPO 농도는 배양 7 일째에 hEPO 의 활성이 8 ∼ 18 ㎍/㎖ 에 도달하고 (도 8b 우측), pE-IRES-GS-puro (EPO) 를 사용하여 CHO 세포를 형질 전환함으로써, hEPO 를 고레벨로 발현하는 세포가 얻어지는 것을 알 수 있었다.

이어서, 유전자 발현 제어 부위로서 EF-1p, 단백질을 코드하는 유전자로서 hEPO 유전자, 내부 리보솜 결합 부위로서 EMCV-mIRES, 및 GS 유전자를 이 순서로 삽입하고, 또한 약제 내성 유전자로서 puro 유전자를 삽입한 발현 벡터인 pE-mIRES-GS-puro (EPO) 를 도입한 포유 동물 세포를 선택 배지에서 배양하고, 배지 중의 hEPO 의 농도를 측정함과 함께 세포 밀도를 측정했다. 실험은 독립적으로 2 회 (벌크 1 ∼ 2) 실시했다. 세포 밀도는 2 회 모두 배양 7 일째에는 거의 2.5 ∼ 3×10⁶개/㎖ 에 도달했다 (도 8a 좌측). 한편, 배지 중의 hGBA 농도는 2 회 모두 배양 7 일째에 hEPO 의 활성이 약 63 ㎍/㎖ 에 도달하고 (도 8b 좌측), 그 발현량은 pE-IRES-GS-puro (EPO) 를 사용하여 형질 전환시킨 CHO 세포의 hGBA 의 발현량과 비교해도 현저하게 높고, pE-mIRES-GS-puro (EPO) 를 사용하여 CHO 세포를 형질 전환함으로써, hEPO 를 매우 고레벨로 발현하는 세포가 얻어지는 것을 알 수 있었다.

이들 결과는 유전자 발현 제어 부위의 하류에, 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 및 배열 번호 1 또는 4 의 염기 배열을 갖는 내부 리보솜 결합 부위, 및 글루타민 합성 효소를 이 순서로 삽입한 발현 벡터, 또는 유전자 발현 제어 부위의 하류에, 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 배열 번호 1 또는 4 의 염기 배열을 갖는 내부 리보솜 결합 부위, 글루타민 합성 효소를 이 순서로 삽입하고 또한 약제 내성 유전자를 삽입한 발현 벡터가 이들 단백질을 코드하는 유전자를 고레벨로 발현시킬 수 있는 발현 벡터인 것을 나타낸다. 특히, 신장 인자 1 α 프로모터의 하류에, 단백질을 코드하는 유전자, 배열 번호 4 의 염기 배열을 갖는 내부 리보솜 결합 부위 및 글루타민 합성 효소를 이 순서로 삽입하고, 또한 약제 내성 유전자로서 퓨로마이신 내성 유전자를 삽입한 발현 벡터가 그 단백질을 코드하는 그 유전자를 고레벨로 발현시킬 수 있는 발현 벡터인 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 포유 동물 세포를 사용하여, 재조합체 단백질을 고레벨로 발현시킬 수 있으므로, 예를 들어, 재조합체 단백질을 함유하는 의료용 의약품의 제조 비용을 대폭 삭감할 수 있다.

1 : LacZ 프로모터
2 : mPGK 프로모터
3 : 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열을 포함하는 야생형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위 (EMCV-IRES)
3a : 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열을 포함하는 변이형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위 (EMCV-mIRES)
4 : mPGK 의 폴리아데닐화 영역 (mPGKpA)
5 : EF-1p 및 제 1 인트론을 포함하는 염기 배열
6 : SV40 후기 폴리아데닐화 영역
7 : SV40 초기 프로모터를 포함하는 영역
8 : 합성 폴리아데닐화 영역
9 : 사이토메갈로 바이러스 프로모터를 포함하는 영역
10 : 글루타민 합성 효소 유전자

SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals. Co. Ltd. <120> Novel Expression Vector <130> GP151-PCT <150> JP2010-250306 <151> 2010-11-08 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Murine encephalomyocarditis virus <400> 1 atgataatat ggccacaacc atg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocariditis virus <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 atgataatnn ngccacaacc nnn 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocarditis virus <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 atgataatnn ngccacaacc atg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocarditis virus <400> 4 atgataagct tgccacaacc atg 23 <210> 5 <211> 596 <212> DNA <213> Murine encephalomyocarditis virus <400> 5 cccccccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 60 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 120 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 180 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 240 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 300 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 360 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 420 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 480 tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa 540 ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa tatggccaca accatg 596 <210> 6 <211> 596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocarditis virus <400> 6 cccccccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 60 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 120 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 180 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 240 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 300 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 360 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 420 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 480 tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa 540 ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca accatg 596 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic sequence <400> 7 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence <400> 8 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 9 <211> 2216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-Hygr-mPGKpA, synthetic sequence <220> <221> CDS <222> (716)..(1741) <400> 9 ctcgaggaat tcactccttc aggtgcaggc ttgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg 60 ccaactggct cacaaatacc actgagatcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcc 120 gccccccccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 180 ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 240 agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 300 gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 360 tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 420 aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 480 cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 540 ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 600 cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 660 aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caacc atg 718 Met 1 aaa aag cct gaa ctc acc gcg acg tct gtc gag aag ttt ctg atc gaa 766 Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile Glu 5 10 15 aag ttc gac agc gtc tcc gac ctg atg cag ctc tcg gag ggc gaa gaa 814 Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu Glu 20 25 30 tct cgt gct ttc agc ttc gat gta gga ggg cgt gga tat gtc ctg cgg 862 Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu Arg 35 40 45 gta aat agc tgc gcc gat ggt ttc tac aaa gat cgt tat gtt cat cgg 910 Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val His Arg 50 55 60 65 cac ttt gca tcg gcc gcg ctc ccg att ccg gaa gtg ctt gac att ggg 958 His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile Gly 70 75 80 gaa ttc agc gag agc ctg acc tat tgc atc tcc cgc cgt gca cag ggt 1006 Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln Gly 85 90 95 gtc acg ttg caa gac ctg cct gaa acc gaa ctg ccc gct gtt ctg cag 1054 Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu Gln 100 105 110 ccg gtc gcg gag gcc atg gat gcg atc gct gcg gcc gat ctt agc cag 1102 Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser Gln 115 120 125 acg agc ggg ttc ggc cca ttc gga ccg caa gga atc ggt caa tac act 1150 Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr Thr 130 135 140 145 acg tgg cgt gat ttc ata tgc gcg att gct gat ccc cat gtg tat cac 1198 Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr His 150 155 160 tgg caa act gtg atg gac gac acc gtc agt gcg tcc gtc gcg cag gct 1246 Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln Ala 165 170 175 ctc gat gag ctg atg ctt tgg gcc gag gac tgc ccc gaa gtc cgg cac 1294 Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg His 180 185 190 ctc gtg cac gcg gat ttc ggc tcc aac aat gtc ctg acg gac aat ggc 1342 Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn Gly 195 200 205 cgc ata aca gcg gtc att gac tgg agc gag gcg atg ttc ggg gat tcc 1390 Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp Ser 210 215 220 225 caa tac gag gtc gcc aac atc ttc ttc tgg agg ccg tgg ttg gct tgt 1438 Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala Cys 230 235 240 atg gag cag cag acg cgc tac ttc gag cgg agg cat ccg gag ctt gca 1486 Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu Ala 245 250 255 gga tcg ccg cgg ctc cgg gcg tat atg ctc cgc att ggt ctt gac caa 1534 Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp Gln 260 265 270 ctc tat cag agc ttg gtt gac ggc aat ttc gat gat gca gct tgg gcg 1582 Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp Ala 275 280 285 cag ggt cga tgc gac gca atc gtc cga tcc gga gcc ggg act gtc ggg 1630 Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val Gly 290 295 300 305 cgt aca caa atc gcc cgc aga agc gcg gcc gtc tgg acc gat ggc tgt 1678 Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly Cys 310 315 320 gta gaa gta ctc gcc gat agt gga aac cga cgc ccc agc act cgt ccg 1726 Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg Pro 325 330 335 agg gca aag gaa tag tcgagaaatt gatgatctat taagcaataa agacgtccac 1781 Arg Ala Lys Glu 340 taaaatggaa gtttttcctg tcatactttg ttaagaaggg tgagaacaga gtacctacat 1841 tttgaatgga aggattggag ctacgggggt gggggtgggg tgggattaga taaatgcctg 1901 ctctttactg aaggctcttt actattgctt tatgataatg tttcatagtt ggatatcata 1961 atttaaacaa gcaaaaccaa attaagggcc agctcattcc tccactcacg atctatagat 2021 ccactagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 2081 caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 2141 tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 2201 cgtgccagcg gatcc 2216 <210> 10 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile 1 5 10 15 Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu 20 25 30 Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu 35 40 45 Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val His 50 55 60 Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln 85 90 95 Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu 100 105 110 Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser 115 120 125 Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr 130 135 140 Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr 145 150 155 160 His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln 165 170 175 Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg 180 185 190 His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn 195 200 205 Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp 210 215 220 Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala 225 230 235 240 Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu 245 250 255 Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp 260 265 270 Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp 275 280 285 Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val 290 295 300 Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly 305 310 315 320 Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg 325 330 335 Pro Arg Ala Lys Glu 340 <210> 11 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES5', synthetic sequence <400> 11 caactcgagc ggccgccccc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt act 53 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES3', synthetic sequence <400> 12 caagaagctt ccagaggaac tg 22 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mPGKP5', synthetic sequence <400> 13 gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mPGKP3', synthetic sequence <400> 14 gaggaattcg atgatcggtc gaaaggcccg 30 <210> 15 <211> 532 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGKp, synthetic sequence <400> 15 gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta 60 gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca 120 tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact 180 cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa 240 atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag 300 cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag 360 aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc 420 gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg 480 ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgaccgatc atcgaattcc tc 532 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS5', synthetic sequence <400> 16 aatatggcca caaccatggc gacctcagca agttcc 36 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS3', synthetic sequence <400> 17 ggaggatccc tcgagttagt ttttgtattg gaagggct 38 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer puro5', synthetic sequence <400> 18 gcttaagatg accgagtaca agcccacg 28 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer puro3', synthetic sequence <400> 19 cccatcgtga tggtcaggca ccgggcttgc 30 <210> 20 <211> 620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Puromycin <220> <221> CDS <222> (8)..(607) <400> 20 gcttaag atg acc gag tac aag ccc acg gtg cgc ctc gcc acc cgc gac 49 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp 1 5 10 gac gtc ccc agg gcc gta cgc acc ctc gcc gcc gcg ttc gcc gac tac 97 Asp Val Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr 15 20 25 30 ccc gcc acg cgc cac acc gtc gat ccg gac cgc cac atc gag cgg gtc 145 Pro Ala Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val 35 40 45 acc gag ctg caa gaa ctc ttc ctc acg cgc gtc ggg ctc gac atc ggc 193 Thr Glu Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly 50 55 60 aag gtg tgg gtc gcg gac gac ggc gcc gcg gtg gcg gtc tgg acc acg 241 Lys Val Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr 65 70 75 ccg gag agc gtc gaa gcg ggg gcg gtg ttc gcc gag atc ggc ccg cgc 289 Pro Glu Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg 80 85 90 atg gcc gag ttg agc ggt tcc cgg ctg gcc gcg cag caa cag atg gaa 337 Met Ala Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu 95 100 105 110 ggc ctc ctg gcg ccg cac cgg ccc aag gag ccc gcg tgg ttc ctg gcc 385 Gly Leu Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala 115 120 125 acc gtc ggc gtc tcg ccc gac cac cag ggc aag ggt ctg ggc agc gcc 433 Thr Val Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala 130 135 140 gtc gtg ctc ccc gga gtg gag gcg gcc gag cgc gcc ggg gtg ccc gcc 481 Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala 145 150 155 ttc ctg gag acc tcc gcg ccc cgc aac ctc ccc ttc tac gag cgg ctc 529 Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu 160 165 170 ggc ttc acc gtc acc gcc gac gtc gag gtg ccc gaa gga ccg cgc acc 577 Gly Phe Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr 175 180 185 190 tgg tgc atg acc cgc aag ccc ggt gcc tga ccatcacgat ggg 620 Trp Cys Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala 195 <210> 21 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 20 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala 195 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA5', synthetic sequence <400> 22 caacaagcgg ccgccctcga gttcccttta gtgagggtta atgc 44 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA3', synthetic sequence <400> 23 cccctgaacc tgaaacataa aatg 24 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mIRES-GS5', synthetic sequence <400> 24 acacgatgat aagcttgcca caacc 25 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mIRES-GS3', synthetic sequence <400> 25 ctccacgata tccctgccat a 21 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA5'-2, synthetic sequence <400> 26 actaactcga gttcccttta gtg 23 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA3'-2, synthetic sequence <400> 27 aacggatcct tatcggattt taccac 26 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hGBA5', synthetic sequence <400> 28 gcaatacgcg tccgccacca tggagttttc aagtccttcc agagagg 47 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hGBA3', synthetic sequence <400> 29 ggacgcggcc gcgagctctc actggcgacg ccacaggtag g 41 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hEPO5', synthetic sequence <400> 30 aagacgcgtc gccaccatgg gggtgcacga atgtcctgc 39 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hEPO3', synthetic sequence <400> 31 aagagcggcc gctcatctgt cccctgtcct gcagg 35 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocariditis virus <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 atgataannn ngccacaacc nnn 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Murine encephalomyocarditis virus <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 atgataannn ngccacaacc atg 23

Claims

단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 유전자 발현 제어 부위, 그리고, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지고,
그 유전자 발현 제어 부위가 신장 인자 1 프로모터이고,
그 내부 리보솜 결합 부위가, 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것으로서 또한, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위의 염기 배열에 1 또는 2 이상의 변이를 추가하는 것에 의해 5' 측으로부터 2 번째 또는 3 번째의 개시 코돈이 파괴된 것이고,
또한, 그 유전자 발현 제어 부위와는 별도로, 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
제 1 항에 있어서, 파괴된 개시 코돈이 그 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 있어서의 5' 측으로부터 2 번째 것인 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,
그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 4 의 염기 배열을 포함하는 것인 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,
그 내부 리보솜 결합 부위가 배열 번호 6 의 염기 배열을 포함하는 것인 발현 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
그 약제 내성 유전자가 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자인 발현 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질을 코드하는 그 유전자가 인간 유래의 유전자인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
인간 유래의 그 유전자가 리소좀 효소, 조직 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 혈액 응고 인자, 에리스로포에틴, 인터페론, 트롬보모듈린, 난포 자극 호르몬, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 및 항체를 코드하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
인간 유래의 그 유전자가 리소좀 효소를 코드하는 유전자인 발현 벡터.
제 8 항에 있어서,
그 리소좀 효소가 α-갈락토시다아제 A, 이즈론산2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, 갈설파아제, α-L-이즈로니다아제, 산성α-글루코시다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
인간 유래의 그 유전자가 에리스로포에틴을 코드하는 유전자인 발현 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질 전환된 포유 동물 세포.
제 11 항에 있어서,
그 포유 동물 세포가 CHO 세포인 세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 발현 벡터를, 포유 동물 세포에 도입하는 스텝과, 그 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포를, 글루타민 합성 효소 저해제의 존재하 또는 글루타민 합성 효소 저해제 및 약제 내성 유전자에 대응하는 약제의 존재하, 선택 배양하는 스텝을 포함하는, 그 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 형질 전환 세포의 제조 방법.
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