ES2861059T3 - Nuevo mutante de la seroalbúmina humana - Google Patents

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Hideto Morimoto
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Abstract

Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana y una segunda cadena polipeptídica unida a la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de otra proteína (A), en donde el mutante de la seroalbúmina humana que comprende una secuencia de aminoácidos que, en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, carece de no más de 10 restos de aminoácidos y/o no tiene más de 10 restos de aminoácidos reemplazados, con la condición de que el resto de asparagina que se encuentra en la posición 318 y la treonina en la posición 320 del extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3 se conserven y se unan por enlaces peptídicos mediante un único resto de aminoácido (X) excepto la prolina que está situada entre esos dos restos de aminoácidos, y en donde la proteína (A) es la hormona del crecimiento 22K o la hormona del crecimiento 20K.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo mutante de la seroalbúmina humana
Campo técnico
La presente invención se refiere a una proteína unida a un mutante de la seroalbúmina humana (proteína unida a un mutante de la HSA) preparada uniendo el mutante de la seroalbúmina humana a una hormona del crecimiento humana fisiológicamente activa, y un medicamento que la comprende.
Antecedentes de la técnica
La seroalbúmina humana (HSA) es una proteína cuya forma madura consiste en 585 aminoácidos. La HSA es el componente más abundante de las proteínas plasmáticas, tiene una semivida prolongada de 14 a 21 días en el plasma. La HSA contribuye al ajuste de la presión osmótica del plasma y funciona para unirse y transportar, compuestos intrínsecos tales como cationes, ácidos grasos, hormonas, bilirrubina y similares, así como extrínsecos como medicamentos en la sangre. En general, los compuestos unidos a la HSA tienen menos probabilidades de ser absorbidos por los órganos y, por lo tanto, pueden circular durante más tiempo en la sangre.
Se sabe que la seroalbúmina humana (HSA) tiene múltiples variantes naturales. La seroalbúmina humana Redhill es una de ellas (documentos no de patente 1 y 2). En comparación con la secuencia de aminoácidos de la seroalbúmina humana común que consiste en 585 aminoácidos como se mencionó anteriormente, la seroalbúmina humana Redhill difiere en que la alanina como el resto de aminoácido 320 del extremo N se reemplaza con treonina, y en que se añade un resto de arginina al extremo N y, por tanto, consiste en 586 aminoácidos. Esta sustitución de alanina por treonina da lugar a una secuencia Asn-Tyr-Thr dentro de la secuencia de aminoácidos de la albúmina Redhill, y este resto Asn (asparagina) en esa secuencia recibe N-glicosilación. Así, se observa que el peso molecular de la albúmina Redhill es mayor que el de la seroalbúmina humana común anterior en aproximadamente 2,5 kDa.
Se ha descrito un método para aumentar la estabilidad de una proteína, tal como una enzima, en el plasma mediante la fusión de la HSA con la proteína (Documento no de patente 3, Documentos de patente 1 y 2). Una proteína de fusión compuesta por HSA y una enzima o similar se proporciona en un medio o dentro de las células como una proteína recombinante, mediante el cultivo de células transformantes producidas mediante la introducción de un vector de expresión que lleva un ADN en el que un gen que codifica la HSA y un gen que codifica una proteína, p. ej., una enzima, están unidos en marco.
Ejemplos de proteínas cuya estabilidad en el plasma aumenta por la fusión con la seroalbúmina humana (HSA) incluyen una proteína de fusión de HSA con G-CSF (Documentos de patente 1 y 3), una proteína de fusión de HSA con interferón a (Documento de patente 4), una proteína de fusión de HSA con GLP-1 (Documento de patente 5), una proteína de fusión de HSA con insulina (Documento de patente 6), una proteína de fusión de HSA con eritropoyetina (Documento de patente 7), una proteína de fusión de HSA con hormona del crecimiento (Documentos de patente 4, 5 y 8-11) y similares.
La hormona del crecimiento humana (hGH) es una proteína secretada por la hipófisis anterior bajo el control del hipotálamo. La GH humana presenta actividades que promueven el crecimiento, tales como la promoción de la formación de cartílago, la promoción del anabolismo de proteínas y similares, así como la mejora de la composición corporal y el metabolismo de los lípidos. Los niños con baja secreción de hGH presentan enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, que se caracteriza por una estatura baja en comparación con los niños normales.
Las preparaciones farmacéuticas (preparación de hGH) que contienen hGH como el principio activo, que se prepara como una proteína recombinante que utiliza células de E. coli con un gen de hGH introducido y que tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kD, son muy utilizadas clínicamente como fármaco terapéutico para el enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, enanismo en el síndrome de Turner, enanismo en el contexto SGA (pequeño para la edad gestacional), enanismo por insuficiencia renal crónica, enanismo en el síndrome de Prader-Willi y enanismo en la acondroplasia, acompañado de ausencia del cierre epifisario. Después de la administración subcutánea o intramuscular de una preparación de hGH, ésta circula en la sangre y su actividad promotora del crecimiento promueve el crecimiento del paciente. Las preparaciones que contienen hGH también son muy utilizadas clínicamente como fármaco terapéutico para la deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos. Los pacientes con deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos muestran diversas anomalías, tales como metabolismo lipídico anormal, y la administración de la preparación de hGH mejorará la calidad de vida de los pacientes mediante, p. ej., la normalización del metabolismo lipídico de los pacientes. Growject™, p. ej., está disponible como una preparación de hGH para el enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento y la deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos.
Estos intentos de mejorar la estabilidad de la hGH en plasma se realizaron en respuesta a las necesidades clínicas. Se considera que la semivida de la hGH en plasma es inferior a 20 minutos y, por tanto, la hGH administrada a un paciente desaparece rápidamente de la sangre. Para que la hGH muestre su actividad farmacológica en un paciente, por lo tanto, debe administrarse al paciente tres veces por semana por vía intramuscular o subcutánea todos los días. Una administración tan frecuente impone una carga a los pacientes. Así pues, la reducción de la frecuencia de administración, si se logra aumentando la estabilidad de la hGH en el plasma y alargando así su semivida en el plasma, sería deseable para reducir la carga de los pacientes.
DOCUMENTOS DE LA TÉCNICA ANTERIOR
[Documentos de patente]
[Documento de patente 1] Publicación de solicitud de patente n.° JP H07-503368
[Documento de patente 2] Publicación de solicitud de patente n.° JP H03-178998
[Documento de patente 3] Publicación de solicitud de patente n.° JP H07-503844
[Documento de patente 4] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2003- 503838
[Documento de patente 5] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2005- 514060
[Documento de patente 6] Publicación de solicitud de
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patente n.° JP 2010- 500031
[Documento de patente 7] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2011- 015690
[Documento de patente 8] Publicación de solicitud de
Figure imgf000003_0002
patente n.° JP 2000- 502901
[Documento de patente 9] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2008- 518615
[Documento de patente 10] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2013- 501036
[Documento de patente 11] Publicación de solicitud de patente n.° JP 2013- 518038
[Documentos no de patente]
[Documento no de Patente 1] Brand S. et al., Clin Chim Acta. 136, 197-202 (1984)
[Documento no de Patente 2] Brennan SO. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 87, 26-30 (1990)
[Documento no de Patente 3] Poznansky MJ. et al., FEBS Letter. 239, 18-22 (1988)
El documento US-A-2009099071 describe un sistema de administración de fármaco basado en mHSA (A320T) como una proteína vehículo.
Brennan S O et al. (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America, 1990, vol. 87, n.° 1, páginas 26-30) describe la albúmina Redhill, que es una variante de glicoproteína de la seroalbúmina humana cuyo precursor tiene un sitio de escisión de peptidasa señal aberrante.
Kragh-Hansen Au et al. (Biochimica ET Biophysica ACTA, 2001, vol. 1550, n.° 1, páginas 20-26) describe la estructura glicano de la albúmina Redhill que es una variante glicosilada de la seroalbúmina humana.
Osborn B L et al. (European Journal of Pharmacology, 2002, vol. 456, n.° 1-3, páginas 149-158) describen una albutropina que es una fusión de la hormona del crecimiento-albúmina con farmacocinética y farmacodinámica mejoradas en ratas y monos.
Sumario de la invención
Problema técnico
En el contexto anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar una proteína unida a un mutante de la seroalbúmina humana que comprende una hormona del crecimiento y el mutante de la seroalbúmina humana unido a la misma, y un medicamento que la comprende.
Solución del problema
Como resultado de investigaciones repetidas en el estudio para los propósitos mencionados anteriormente, los inventores de la presente invención encontraron que un compuesto (hGH unida a un mutante de la seroalbúmina humana) que se obtiene uniendo la hormona del crecimiento humana (hGH) con un mutante (mutante de la seroalbúmina humana) que consiste en una secuencia de aminoácidos cuyo resto de aminoácido en la posición 320 desde su extremo N está sustituido por treonina en lugar de la arginina que es el que está presente en la seroalbúmina humana normal que consta de 585 aminoácidos, presenta una estabilidad notablemente mayor en la sangre que la hormona del crecimiento humana original cuando se administra a un organismo vivo, y completó la presente invención después de realizar investigaciones adicionales. Así, la presente invención proporciona lo siguiente.
1. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana y una segunda cadena polipeptídica unida a la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de otra proteína (A), en la que
el mutante de la seroalbúmina humana comprende una secuencia de aminoácidos que, en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, carece de no más de 10 restos de aminoácidos y/o no tiene más de 10 restos de aminoácidos reemplazados, con la condición de que el resto de asparagina que se encuentra en la posición 318 y la treonina en la posición 320 desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3 se conserven y se unan por enlaces peptídicos mediante un único resto de aminoácido (X) excepto la prolina que se sitúa entre esos dos restos de aminoácidos, y en la que la proteína (A) es la hormona del crecimiento 22K o la hormona del crecimiento 20K.
2. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 1 anterior, en la que el aminoácido (X) es tirosina.
3. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 2 anterior, en la que el mutante de la seroalbúmina humana consiste en la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3. 4. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, en la que el mutante de la seroalbúmina humana, en comparación con la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-3 anteriores, no tiene más de 10 aminoácidos añadidos fuera de la región correspondiente a las posiciones 318-320 desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, y no es idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2
5. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, en la que el mutante de la seroalbúmina humana no tiene más de 10 restos de aminoácidos añadidos al extremo N o C en comparación con la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-3 anteriores, y no es idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2.
6. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-5 anteriores, en la que
a) el extremo C de la segunda cadena polipeptídica está unido al extremo N de la primera cadena polipeptídica o
b) el extremo N de la segunda cadena polipeptídica está unido al extremo C del primer polipéptido por uno o más enlaces peptídicos.
7. La proteína unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 6 anterior, en la que la unión mediante enlaces peptídicos incluye enlaces peptídicos con un enlazador.
8. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 7 anterior, en la que el enlazador consiste en 1-50, preferentemente en 1-6 restos de aminoácidos.
9. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 7 anterior, en la que el enlazador se selecciona del grupo que consiste en Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, y las secuencias de aminoácidos descritas como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6.
10. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 7 anterior, en la que el enlazador está representado por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser.
11. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con el punto 1 anterior que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
12. Un medicamento que comprende una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-11 anteriores como el principio activo.
Descrita y no reivindicada per se es una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana que es la misma que de acuerdo con uno de los puntos 1-12 anteriores, excepto que la proteína (A) se selecciona del grupo que consiste en enzimas lisosómicas que incluyen a-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, glucocerebrosidasa, pgalactosidasa, proteína activadora de GM2, p-hexosaminidasa A, p-hexosaminidasa B, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, a-manosidasa, p-manosidasa, galactosilceramidasa, saposina C, arilsulfatasa A, a-L-fucosidasa, aspartilglucosaminidasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, esfingomielinasa ácida, a-galactosidasa, p-glucuronidasa, heparán sulfato N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetil-CoA:a-glucosaminida N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, ceramidasa ácida, amilo-1,6-glucosidasa, y CLN1 a 10, ligandos de PD-1, proteína morfogenética ósea (BMP), insulina, prolactina, motilina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona melanocito-estimulante (MSH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona estimulante tiroidea (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona folículo-estimulante (FSH), hormona paratiroidea (PTH), trombopoyetina, factor citoblástico (SCF), leptina, vasopresina, oxitocina, calcitonina, glucagón, gastrina, secretina, pancreozimina, colecistoquinina, angiotensina, angiostatina, endostatina, lactógeno placentario humano (HPL), gonadotropina coriónica humana (HCG), encefalina, endorfina, interferón a, interferón p, interferón y, interleucina 2, timopoyetina, timoestimulina, factor humoral del timo (THF), factor tímico sérico (FTS), timosina, factor tímico X, factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), uroquinasa, activador del plasminógeno tisular (tPA), dinorfina, bombesina, neurotensina, caeruleína, bradiquinina, asparaginasa, calicreína, sustancia P, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, neurotrofina 6, neurregulina 1, activina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteína morfogenética ósea (BMP), factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF), factor de coagulación sanguínea VII, factor de coagulación sanguínea VIII, factor de coagulación sanguínea IX, superóxido dismutasa (SOD), cloruro de lisozima, polimixina B, colistina, gramicidina, bacitracina, polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor liberador de la hormona del crecimiento (GRF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina, somatostatina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), y una sal o mutante de las mismas.
13. Un medicamento que comprende una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-11 anteriores como el principio activo para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, enanismo en el síndrome de Turner, enanismo por insuficiencia renal crónica, enanismo en el síndrome de Prader-Willi, enanismo en la acondroplasia y enanismo en el contexto de pequeño para la edad gestacional (SGA), acompañado de ausencia del cierre epifisario; y deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, consumo provocado por el SIDA y consumo provocado por la anorexia.
14. Un ADN que comprende un gen que codifica la proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con uno de los puntos 1-11 anteriores.
15. Un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con el punto 14 anterior.
16. Una célula de mamífero transformada con el vector de acuerdo con el punto 15 anterior.
17. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana que se puede obtener cultivando la célula de mamífero de acuerdo con el punto 16 anterior en un medio sin suero.
Efectos de la invención
La presente invención permite una mayor estabilidad en sangre de una proteína fisiológicamente activa deseable como medicamento para administrar a un animal (incluido el ser humano). Así, también puede potenciar los efectos farmacológicos de la proteína fisiológicamente activa y prolongar la duración del efecto farmacológico de la proteína. Asimismo, permite disminuir la dosis o frecuencia de dosificación de la proteína fisiológicamente activa, mejorar la calidad de vida de los pacientes y también contribuir a la prevención de infecciones y accidentes médicos derivados de la dosificación frecuente convencional.
Breve descripción de los dibujos
[Fig. 1] Un diagrama de flujo del método para la construcción del vector pE-neo.
[Fig. 2] Un diagrama de flujo del método para la construcción del vector pE-hygr.
[Fig. 3-1] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-2] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-3] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-4] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-5] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-6] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-7] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-8] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 3-9] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-IRES-GS-puro.
[Fig. 4] Un diagrama de flujo del método para la construcción de pE-mIRES-GS-puro.
[Fig. 5] Una figura que muestra el resultado de la medición de la actividad de la proteína de fusión HSA-hGH sobre la actividad de crecimiento celular usando células BaF3/hGHR. El eje vertical indica la absorbancia a 490 nm y el eje horizontal la concentración (nM) de cada muestra de prueba. Las barras verticales muestran la desviación estándar.
[Fig. 6] Un gráfico que muestra el resultado del análisis farmacodinámico de la proteína de fusión HSA-hGH utilizando monos cinomolgos. El eje vertical indica la concentración (ng/ml) de la proteína de fusión HSA-hGH en el plasma de monos cinomolgos y el eje horizontal el tiempo transcurrido (h) desde la administración de la proteína de fusión HSA-hGH. Las barras verticales del gráfico muestran la desviación estándar.
[Fig. 7] Un gráfico que muestra el resultado del análisis del efecto farmacológico de la proteína de fusión HSA-hGH utilizando monos cinomolgos. El eje vertical indica la concentración (%) de IGF-1 en el plasma de monos cinomolgos después de la administración de la proteína de fusión HSA-hGH en comparación con su concentración antes de la administración, y el eje horizontal indica el tiempo transcurrido (días) después de la administración de la proteína de fusión de HSA-hGH. Las barras verticales del gráfico muestran la desviación estándar.
Descripción de las realizaciones
En la presente invención, la expresión "seroalbúmina humana" o a la que se hace referencia simplemente como "HSA", no solo significa la seroalbúmina humana de tipo silvestre común que consiste en 585 restos de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:1 sino que también incluye sin diferenciación, los mutantes de la HSA que corresponden a los producidos por sustitución, deleción y/o adición de uno o más restos de aminoácidos en, de, o a, la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:1 (en la memoria descriptiva, el término "adición" significa que se añaden uno o más restos a un extremo de o dentro de la secuencia), siempre que todavía tengan las funciones habituales de la seroalbúmina humana de tipo silvestre común como la unión a y el transporte de compuestos intrínsecos, así como de compuestos extrínsecos, p. ej., fármacos, en la sangre. Cuando se sustituyen algunos restos de aminoácidos por diferentes restos de aminoácidos, el número de restos de aminoácidos a sustituir es preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y todavía más preferentemente de 1- 3. Cuando se eliminan algunos restos de aminoácidos, el número de restos de aminoácidos a eliminar es preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y todavía más preferentemente de 1- 3. Un mutante, por ejemplo, que consiste en 584 restos de aminoácidos producidos por deleción de un resto de aminoácido del extremo N o C de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID n O:1 también se incluye en el significado de seroalbúmina humana. Además, también se puede realizar una combinación de dicha sustitución y deleción de aminoácidos. Asimismo, se pueden añadir uno o más restos de aminoácidos a la HSA de tipo silvestre común o su mutante, dentro de esas secuencias de aminoácidos o en su extremo N o C (el término "adición" significa que se añaden uno o más restos al extremo de o dentro de una secuencia). El número de restos de aminoácidos añadidos en el presente documento es preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y todavía más preferentemente de 1-3.
Como mutante de la HSA que contiene una combinación de al menos dos de los tres tipos diferentes de mutación anteriores, es decir, sustitución, deleción y adición, se prefiere uno producido por deleción de 0-10 restos de aminoácidos, sustitución de 0-10 amino restos de aminoácidos con otros, y adición adicional de 0-10 restos de aminoácidos. Más preferentemente, el número de restos de aminoácidos eliminados, sustituidos y/o añadidos, de, en, a, la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:1 es preferentemente no más de 5, y más preferentemente no más de 3, respectivamente.
En la presente invención, la expresión "seroalbúmina humana Redhill" (HSA-Redhill) significa una variante de la seroalbúmina humana que consiste en 586 restos de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2. En comparación con la seroalbúmina humana de tipo silvestre que consiste en 585 restos de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:1, la seroalbúmina humana Redhill tiene una secuencia en la que el aminoácido en la posición 320 desde el extremo N no es alanina sino treonina, y se añade un resto de arginina al extremo N. Como resultado de la sustitución de alanina por treonina, la albúmina Redhill contiene una secuencia de aminoácidos parcial, Asn-Tyr-Thr, dentro de su secuencia de aminoácidos completa, y el resto Asn (asparagina) en esta secuencia parcial recibe glicosilación unida al N. Así, se observa que la albúmina Redhill tiene un peso molecular de 2,5 kD más en comparación con la albúmina de tipo silvestre común (SEQ ID NO:1).
En la presente invención, la expresión "mutante de la seroalbúmina humana" (mutante de la HSA) significa uno de los mutantes mencionados anteriormente en comparación con la HSA de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) excepto la variante (HSA Redhill) descrita como SEQ ID NO:2. Los mutantes de HSA preferidos en la presente invención incluyen uno descrito como SEQ ID NO:3 así como aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos producida por sustitución, deleción o adición de uno o más restos de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, y en la cual el resto de asparagina en la posición 318 y el resto de treonina en la posición 320 desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3 se conservan, estando unidos por enlaces peptídicos a través de un único resto de aminoácido (X) excepto prolina entre esos dos, siempre que todavía tengan la función de la seroalbúmina humana de tipo silvestre común, es decir, que unan y transporten compuestos intrínsecos, así como compuestos extrínsecos, p. ej., fármacos, en la sangre. Cuando se sustituyen algunos restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos por otros, el número de restos de aminoácidos a sustituir es preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y todavía más preferentemente de 1- 3. Cuando se eliminan algunos restos de aminoácidos, el número de restos de aminoácidos a eliminar es preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y todavía más preferentemente de 1- 3. Por ejemplo, un mutante puede consistir en 584 restos de aminoácidos en los que se elimina el resto de aminoácido en el extremo N o C de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3. También se puede realizar una combinación de dicha sustitución y deleción de restos de aminoácidos. Además, se pueden añadir uno o más restos de aminoácidos a estos mutantes dentro, o en el extremo N o C de, sus secuencias de aminoácidos. Así, en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, los mutantes pueden ser los producidos por una combinación de al menos dos de los tres tipos de mutación, es decir, sustitución, deleción y adición, donde se ha realizado la deleción de 0-10 restos de aminoácidos, sustitución de 0-10 restos de aminoácidos por otros, y adición de 0-10 restos de aminoácidos. No obstante, los aminoácidos en las posiciones 318-320 desde el extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3 deben ser asparagina-X-treonina ("X" es un resto de aminoácido excepto prolina), y es preferentemente asparagina-tirosinatreonina.
Las posiciones y tipos (deleción, sustitución, adición) de mutación en varios mutantes de la HSA de la presente invención en comparación con la HSA de tipo silvestre común pueden identificarse fácilmente por alineación de las secuencias de aminoácidos de ambas HSA.
El mutante de la seroalbúmina humana preparado en el ejemplo de la presente invención descrito a continuación (un ejemplo típico de mutante de la HSA de la presente invención) difiere de la secuencia de aminoácidos de la seroalbúmina humana de tipo silvestre común que consiste en 585 aminoácidos (SEQ ID NO:1) solo en que el resto de aminoácido en la posición 320 desde su extremo N no es alanina sino treonina (SEQ ID NO:3). Esta diferencia da lugar a una secuencia parcial, Asn-Tyr-Thr, dentro de la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA [HSA(A320T)], y la Asn (resto de asparagina) en la secuencia parcial puede sufrir glicosilación unida al N.
El mutante de la HSA de la presente invención se puede producir como una proteína recombinante, preparando un vector de expresión en el que se incorpora un ADN que codifica el mutante de la HSA de la presente invención y cultivando células hospedadoras transformadas con el vector de expresión.
En la presente invención, una proteína equivalente fisiológicamente activa (denominada también "proteína (A))" en la memoria descriptiva) que se unirá al mutante de la seroalbúmina humana es la hormona del crecimiento 22K o la hormona del crecimiento 20K. En este sentido, se describe y no se reivindica per se el escenario en el que la proteína (A) es cualquier otra proteína, excepto la seroalbúmina (sea mutante o no) que tenga actividad fisiológica. La expresión "actividad fisiológica" es la capacidad de actuar sobre un cuerpo vivo para provocar algún cambio fisiológico específico. Los ejemplos incluyen aquellas proteínas implicadas en diferentes regulaciones fisiológicas (estimulación, supresión), tales como varias enzimas (por ejemplo, enzimas lisosómicas), hormonas peptídicas (hormonas proteicas), neurotransmisores, factores de crecimiento, factores de la transducción de señales, etc.
En la presente invención, la expresión "proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana" o "proteína (A) unida a un mutante de la HSÁ' significa la proteína (A) a la que está unido el mutante de la HSA de la presente invención, un compuesto obtenido uniendo los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de uno de los dos, respectivamente. El término "unir esos polipéptidos" no solo significa que el extremo N de uno está directamente unido al extremo C del otro mediante un enlace peptídico, sino que también incluye el enlace de ellos indirectamente mediante un enlazador.
En el presente documento, el término "enlazador" es una porción estructural que se coloca entre los dos polipéptidos anteriores y los une mediante enlaces covalentes, y no se deriva de los extremos ni del mutante de la HSA de la presente invención ni de su proteína homóloga (A). Un enlazador puede ser un único resto de aminoácido o una porción de cadena peptídica que consiste en dos o más restos de aminoácidos que forman enlaces peptídicos con ambos polipéptidos (enlazador peptídico). En la presente memoria descriptiva, cualquiera de dichos enlazadores que consiste en uno o más aminoácidos se denomina de forma inclusiva "enlazador peptídico". En la presente invención, un enlazador también puede ser una porción estructural que es un grupo divalente que no pertenece a un enlazador peptídico pero que une el mutante de la HSA y la proteína (A) entre ellos por enlaces covalentes. En la memoria descriptiva se hace referencia a ellos como un "enlazador no peptídico". Además, en la presente memoria descriptiva, la expresión que indica que un mutante de la HSA y la proteína (A) están unidos "mediante enlaces peptídicos" incluye un caso en el que ambos están unidos directamente por un enlace peptídico y un caso en el que ambos están unidos mediante un enlazador peptídico. Asimismo, en el caso de que el mutante de la HSA y la proteína (A) se unan directamente o mediante un enlazador peptídico, el compuesto "proteína (A) unida al mutante de la HSA" también se denomina "proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA".
Cuando el mutante de la HSA de la presente invención y la proteína (A) se unen mediante un enlazador peptídico, el enlazador consiste preferentemente en 1-50, más preferentemente 1-17, incluso preferentemente 1-10, aún más preferentemente 1-6 restos de aminoácidos, y, por ejemplo, 2-17, 2-10, 10-40, 20-34, 23-31, o 25-29 aminoácidos, y además, un único resto de aminoácido, o 2, 3, 5, 6 o 20 restos de aminoácidos. Siempre que la porción mutante de la HSA unida por el enlazador peptídico conserve la función de la HSA y la porción de proteína (A) pueda exhibir su actividad fisiológica de la proteína (A) en un entorno fisiológico, no hay limitación en cuanto a un aminoácido o secuencia de aminoácidos que forman el enlazador peptídico, aunque está preferentemente compuesto por glicina y serina. Ejemplos preferibles de un enlazador peptídico incluyen aquellos que consisten en Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:4), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:5), Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:6), y enlazadores que comprenden algunas secuencias de aminoácidos. Una secuencia que comprende 2-10 o 2-5 copias unidas consecutivamente de cualquiera de esas secuencias de aminoácidos puede emplearse como enlazador peptídico, y una secuencia que comprende 1-10 o 2-5 copias unidas consecutivamente de cualquier combinación de dos o más de estas secuencias de aminoácidos también se pueden emplear como enlazador peptídico. Ejemplos de enlazadores peptídicos preferidos que comprenden una combinación de dos o más de esos aminoácidos incluyen una secuencia de aminoácidos que comprende 20 aminoácidos en total que consiste en una secuencia de aminoácidos Gly-Ser seguida de tres copias unidas consecutivamente de una secuencia de aminoácidos Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 5).
Como método para unir dos polipéptidos diferentes, se conoce un método común, por ejemplo, en el que se prepara un vector de expresión que tiene un ADN incorporado producido al enlazar, en dirección 3' del gen que codifica uno de los polipéptidos, codificando el gen el otro polipéptido en marco, y las células hospedadoras transformadas con este vector de expresión se cultivan para permitirles expresar la proteína de fusión recombinante. Tal método puede usarse para la presente invención.
En el caso de que la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA se produce como una proteína recombinante por células transformantes, se obtiene una proteína de fusión en la que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína (A) se une al extremo N o C de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un mutante de la HSA.
En el caso de que un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la proteína (A) se une al extremo N de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un mutante de la HSA, se emplea un vector de expresión que tiene un ADN incorporado en el que el gen que codifica la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA está unido en marco en dirección 3' del gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína (A). Cuando los dos polipéptidos se unen indirectamente mediante un enlazador peptídico, el ADN que codifica el enlazador se inserta en marco entre los genes que codifican las dos proteínas respectivas.
En el caso de que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína (A) se une al extremo C de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un mutante de la HSA, se emplea un vector de expresión que tiene un ADN incorporado en el que el gen que codifica la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA está unido en marco en dirección 5' del gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína (A). Cuando los dos polipéptidos se unen indirectamente mediante un enlazador peptídico, el ADN que codifica el enlazador se inserta en marco entre los genes que codifican las dos proteínas respectivas.
Para permitir que las células hospedadoras produzcan el mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA, se introduce en las células hospedadoras un vector de expresión que tiene incorporado un ADN que codifica cualquiera de ellos. Siempre que puedan producir el mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención mediante la introducción de dicho vector de expresión, no existe una limitación notable en cuanto a las células hospedadoras que pueden emplearse para este propósito y, por lo tanto, pueden ser células eucariotas tales como células de mamífero, levadura, células vegetales, y células de insectos o células procariotas, tales como E. coli, Bacillus subtilis, entre las que se prefieren particularmente las células de mamífero. Para que la proteína (A) se exprese en forma glicosilada, las células hospedadoras se seleccionan de los grupos que consisten en células eucariotas tales como células de mamífero, levadura, células vegetales y células de insectos. El resto Asn en la secuencia parcial Asn-Tyr-Thr que surge por la sustitución del resto de aminoácido en la posición 320 de la HSA de tipo silvestre común con treonina, o el resto Asn en una secuencia parcial Asn-X-Thr ("X" es una secuencia de aminoácidos distinta de prolina), se somete a glicosilación unida al N mediante el empleo de células eucariotas para la expresión de la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA.
Aunque no existe una limitación especial en cuanto a las especies de células de mamífero que se emplean como células hospedadoras, se prefieren las células derivadas de seres humanos, ratón y hámster chino, entre las que las células CHO, que se derivan de células de ovario de hámster chino, o células NS/O, que se derivan del mieloma de ratón son particularmente preferidas. Siempre que conduzca a la expresión del gen en células de mamífero en las que se introduce, no existe limitación notable en cuanto al vector de expresión empleado en el que un fragmento de a Dn que codifica el mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de HSA de la presente invención, se incorpora para su expresión. El gen introducido en un vector de expresión se coloca en dirección 3' de una secuencia de ADN que regula la frecuencia de transcripción del gen en células de mamífero (sitio regulador de la expresión génica). Los ejemplos de un sitio regulador de la expresión génica que puede emplearse en la presente invención incluyen un promotor derivado de citomegalovirus, promotor temprano de SV40, promotor del factor de elongación humano-1a (EF-1a) y un promotor de ubiquitina C humana.
Aunque las células de mamífero que tienen tal vector de expresión introducido llegan a producir la proteína incorporada en el vector de expresión, la cantidad de su expresión variará de una célula a otra y no será uniforme. Para la producción eficiente del mutante de la HSA, o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención, por lo tanto, se requiere una etapa en la que las células que presentan un alto nivel de expresión se seleccionan de las células de mamífero que tienen el vector de expresión introducido. Para llevar a cabo tal etapa de selección, se introduce un gen que actúa como un marcador de selección en el vector de expresión.
El más común de estos marcadores de selección son las enzimas que descomponen fármacos, tales como la puromicina y la neomicina (marcador de resistencia a fármacos). En general, las células de mamíferos serán destruidas por uno de esos fármacos que está presente más allá de ciertas concentraciones. Dado que las células que tienen un vector de expresión introducido en el que se incorpora un gen de resistencia a fármacos pueden descomponer el fármaco con el gen de resistencia a fármacos expresado para desintoxicarlo o atenuar su toxicidad, pueden sobrevivir incluso en presencia de dichos fármacos. Introduciendo en células de mamíferos un vector de expresión que tiene incorporado un gen de resistencia a fármacos como un marcador de selección, y a continuación cultivando las células en un medio con una concentración gradualmente creciente del fármaco correspondiente al marcador de resistencia al fármaco, se pueden obtener células que sean capaces de crecer incluso en presencia de concentraciones más altas del fármaco. En células seleccionadas de esta manera, generalmente, los niveles de expresión del gen que codifica esa proteína de interés incorporado en el vector de expresión también se elevan junto con los del marcador de resistencia al fármaco y, como resultado, se seleccionan las células que expresan la proteína en niveles altos.
Además, la glutamina sintetasa (GS) también se puede utilizar como marcador de selección. La glutamina sintetasa es una enzima que sintetiza glutamina a partir de ácido glutámico y amoníaco. Generalmente, si se cultivan células de mamífero en un medio que contiene un inhibidor de la glutamina sintetasa, p. ej., metionina sulfoximina (MSX), pero no glutamina, las células serán aniquiladas. Sin embargo, si las células de mamífero tienen un vector de expresión introducido en el que se incorpora glutamina sintetasa como marcador de selección, las células pueden crecer incluso en presencia de concentraciones más altas de MSX debido a sus niveles aumentados de expresión de glutamina sintetasa. En este caso, si el cultivo se continúa con una concentración de MSX que aumenta gradualmente, se obtienen células que pueden crecer incluso en presencia de concentraciones aún más elevadas de MSX. Generalmente, en las células seleccionadas de esta manera, los niveles de expresión del gen que codifica esa proteína de interés incorporado en el vector de expresión también se elevan junto con los del marcador de resistencia al fármaco y, como resultado, se seleccionan las células que expresan la proteína en niveles altos.
La dihidrofolato reductasa (DHFR) también se puede utilizar como marcador de selección. En el caso en el que se usa DHFR como un marcador de selección, las células de mamífero que tienen el vector de expresión introducido se cultivan en un medio de selección que contiene un inhibidor de DHFR tal como metotrexato o aminopterina. El cultivo continuado con una concentración gradualmente creciente de un inhibidor de DHFR da lugar a células que pueden crecer incluso en presencia de concentraciones más altas del inhibidor de DHFR. Generalmente, en células seleccionadas de esta manera, los niveles de expresión del gen que codifica esa proteína de interés incorporada en el vector de expresión también se elevan junto con los de DHFR, y como resultado se seleccionan aquellas células que expresan la proteína en niveles altos.
Se conocen vectores de expresión en los que la glutamina sintetasa (GS) se coloca como un marcador de selección en dirección 3' del gen que codifica una proteína de interés a través de un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) (documento WO 2012/063799, documento WO 2013/161958). Los vectores de expresión descritos en estos documentos se pueden usar de manera particularmente preferida en la producción del mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención.
Por ejemplo, un vector de expresión para la expresión de una proteína de interés que comprende un primer sitio regulador de la expresión génica, un gen que codifica la proteína en dirección 3' del mismo, un sitio interno de entrada del ribosoma más en dirección 3' del mismo y un gen que codifica la glutamina sintetasa aún más en dirección 3' del mismo, y que además comprende el gen de la dihidrofolato reductasa o un gen de resistencia a fármacos, ya sea en dirección 3' del primer sitio regulador del gen o en dirección 3' de un segundo sitio regulador de la expresión génica diferente, puede usarse preferentemente para producir el mutante de la HSA o una proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención. En este vector, un promotor derivado de citomegalovirus, un promotor temprano de SV40 y un promotor del factor de elongación humano-1a (promotor de hEF-1a) y el promotor de la ubiquitina C humana se usan preferentemente como el primer sitio regulador de la expresión génica o el segundo sitio regulador de la expresión génica, entre los que se prefiere particularmente el promotor de hEF-1a.
Además, como un sitio interno de entrada del ribosoma, preferentemente se usa uno de los derivados de la región no traducida 5' del genoma de un virus seleccionado del grupo que consiste en un virus de Picomaviridae, Picornaviridae Aphthovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C, coronavirus, enterovirus bovino, virus de la encefalomielitis murina de Theiler, virus Coxsackie B, o de un gen seleccionado del grupo que consiste en el gen de la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, el gen antennapedia de Drosophila, y el gen Ultrabithorax de Drosophila, entre los cuales es particularmente preferible el sitio interno de entrada del ribosoma derivado de la región 5' no traducida del virus de la encefalomiocarditis de ratón. En el caso en el que se utilice la región no traducida 5' del genoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón, se puede emplear preferentemente no solo su tipo silvestre sino también aquellos en los que se pueden destruir algunos de los varios codones de inicio incluidos en los sitios internos de entrada del ribosoma de tipo silvestre. El gen de resistencia a fármacos empleado en el vector de expresión de la presente invención es preferentemente un gen de resistencia a puromicina o neomicina, y más preferentemente un gen de resistencia a puromicina.
Asimismo, por ejemplo, un vector de expresión para la expresión de una proteína de interés que comprende el promotor del factor de elongación humano 1a, un gen que codifica la proteína en dirección 3' del mismo y un sitio interno de entrada del ribosoma derivado de la región no traducida 5' del genoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón más en dirección 3' del mismo, y que comprende además otro sitio regulador de la expresión génica y el gen de la dihidrofolato reductasa en dirección 3' del mismo, en el que el sitio interno de entrada del ribosoma es uno en el que se destruyen algunos de los varios codones de inicio incluidos en los sitios internos de entrada del ribosoma de tipo silvestre, puede emplearse preferentemente para producir el mutante de la HSA, o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención. Un ejemplo de un vector de este tipo es el descrito en el documento WO 2013/161958.
Aún más, por ejemplo, un vector de expresión para la expresión de una proteína de interés que comprende el promotor del factor de elongación humano 1a, un gen que codifica la proteína en dirección 3' del mismo, un sitio interno de entrada del ribosoma derivado de la región no traducida 5' del genoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón en dirección 3' más abajo del mismo, y un gen que codifica la glutamina sintetasa aún más en dirección 3' del mismo, y que además comprende otro sitio regulador de la expresión génica y un gen de resistencia a fármacos en dirección 3' del mismo, en el que el sitio interno de entrada del ribosoma es uno en el que se destruyen algunos de los varios codones de inicio incluidos en los sitios internos de entrada del ribosoma de tipo silvestre, puede emplearse preferentemente para producir el mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la invención. Ejemplos de un vector de este tipo son pE-mIRES-GS-puro descrito en el documento WO 2012/063799 y pE-mIRES-GS-mNeo descrito en el documento w O 2013/161958.
Hay tres codones de inicio (ATG) en el extremo 3' del sitio interno de entrada del ribosoma derivado de la región no traducida 5' del genoma de tipo silvestre del virus de la encefalomiocarditis de ratón. Las secuencias parciales que contienen esos tres codones de inicio se muestran como SEQ ID NO:7 (5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3': el codón de inicio ATG se muestra en letras mayúsculas). Un ejemplo en el que se destruye uno de los codones de inicio en esta secuencia es uno que se describe como SEQ ID NO:8 (5'- atgataagcttgccacaaccatg-3'), y pE-mIRES-GS-puro y pE-mIRES-GS-mNeo anteriormente mencionados son vectores de expresión que tienen IRES que comprenden la secuencia descrita como SEQ ID NO:8.
En la presente invención, las células de mamífero que tienen introducido un vector de expresión en el que un fragmento de a Dn que codifica el mutante de la HSA o la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA de la presente invención, se someten a cultivo selectivo en un medio de selección para seleccionar células que muestran altos niveles de expresión.
En el caso de que se utilice DHFR como un marcador de selección en cultivo selectivo, la concentración de un inhibidor de DHFR en el medio de selección aumenta gradualmente. La concentración máxima del mismo, donde el inhibidor de DHFR es metotrexato, es preferentemente 0,25-5 pm, más preferentemente 0,5-1,5 pM y aún más preferentemente aproximadamente 1,0 pM.
En el caso en el que se usa GS como el marcador de selección, la concentración de un inhibidor de GS en el medio de selección aumenta gradualmente. La concentración máxima del mismo, donde el inhibidor de GS es MSX, es preferentemente 100-1000 pm, más preferentemente 200-500 pM y aún más preferentemente aproximadamente 300 pM. Como un medio de selección, generalmente se emplea aquí un medio que no contiene glutamina.
En el caso de que se emplee una enzima que descompone puromicina como marcador de selección, la concentración máxima de puromicina en el medio de selección es preferentemente 3-30 pg/ml, más preferentemente 5-20 pg/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 10 pg/ml.
En el caso de que se emplee una enzima que descompone la neomicina como un marcador de selección, la concentración máxima de G418 en el medio de selección es preferentemente 0,1-2 mg/ml, más preferentemente 0,5­ 1,5 mg/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 1 mg/ml.
Como un medio para cultivar células de mamíferos, ya sea para cultivo de selección o para la producción de la proteína recombinante mencionada a continuación (medio de producción de proteína recombinante), se puede usar cualquier medio sin limitación especial siempre que permita el cultivo de células de mamífero para dejarlas crecer en él, y entre ellos se emplea preferentemente un medio sin suero. Debido a que la HSA tiene la propiedad de adsorber los componentes contenidos en la sangre, si la HSA se produce utilizando un medio que contiene suero, la HSA así obtenida contendría impurezas derivadas de la sangre adsorbidas, que tendrían que eliminarse en las siguientes etapas.
El mutante de la HSA, o la proteína (A) fusionada con un mutante de la HSA de la presente invención, se obtiene, en particular, cultivando células que expresan estos, en un medio sin suero. Dado que el empleo de un medio sin suero permite la reducción de la cantidad de impurezas adsorbidas por la HSA, permite la simplificación de las etapas de purificación posteriores.
Las células seleccionadas por cultivo de selección que muestran altos niveles de expresión de la proteína recombinante (células productoras de proteína recombinante) se emplean en la producción de la proteína recombinante. La producción de la proteína recombinante se realiza cultivando las células productoras de proteína recombinante en un medio para la producción de proteína recombinante. Este cultivo se llama cultivo de producción.
En la presente invención, como un medio sin suero empleado para la producción de proteína recombinante, se usa preferentemente un medio que contenga, p. ej., 3-700 mg/l de aminoácidos, 0,001-50 mg/l de vitaminas, 0,3-10 g/l de monosacáridos, 0,1-10000 mg/l de sales inorgánicas, 0,001-0,1 mg/l de oligoelementos, 0,1-50 mg/l de nucleósidos, 0,001-10 mg/l de ácidos grasos, 0,01-1 mg/l de biotina, 0,1-20 pg/l de hidrocortisona, 0,1-20 mg/l de insulina, 0,1-10 mg/l de vitamina B12, 0,01-1 mg/l de putrescina, 10-500 mg/l de piruvato sódico, y compuestos de hierro solubles en agua. También se pueden añadir al medio timidina, hipoxantina, un indicador de pH convencional y antibióticos.
Como un medio sin suero para la producción de proteína recombinante, puede usarse como un medio base, medio DMEM/F12 (medio de mezcla de DMEM y F12), bien conocido por un experto en la materia. Asimismo, como un medio sin suero, también se puede usar medio DMEM(HG)HAM modificado (R5), que contiene bicarbonato sódico, L-glutamina, D-glucosa, insulina, selenito de sodio, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro(II), asparagina, ácido aspártico, serina y alcohol polivinílico. Además, los medios sin suero comercializados, tales como el medio CD OptiCHO™, el medio CHO-S-SFM II, o el medio CD CHO (Thermo Fisher Scientific, antes Life Technologies), el medio IS cho-V™ (Irvine Scientific), el medio EX-CELL™ 302, o el medio EX-CELL™ 325-PF (SAFC Biosciences), pueden utilizarse, asimismo, como un medio de base.
Para obtener la proteína (A) fusionada con el mutante de la HSA, también se puede emplear un método en el que ambos restos de proteína se preparan por separado, y sus polipéptidos luego se unen mediante un enlazador no peptídico o un enlazador peptídico. Ejemplos de enlazadores no peptídicos que pueden usarse incluyen polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poliéteres, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, poli(vinil éteres), polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, y ácido hialurónico, o derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos. Un enlazador peptídico es una cadena peptídica o su derivado compuesto de 1-50 aminoácidos unidos con péptidos, cuyos extremos N y C están unidos respectivamente con péptidos al mutante de la HSA de la presente invención o a una proteína de interés para unir el mutante de la HSA de la presente invención y la proteína de interés.
La proteína (A) unida con el mutante de la HSA de la presente invención que usa PEG como un enlazador no peptídico es, cuando se identifica específicamente, se denomina proteína (A) unida por PEG con el mutante de la h Sa . La proteína (A) unida por PEG con el mutante de la HSA se puede producir uniendo el mutante de la HSA y PEG (mutante de la HSA PEGilado), y a continuación uniendo la proteína (A) al mismo o uniendo en primer lugar la proteína (A) y PEG (proteína (A) fisiológicamente activa PEGilada), y a continuación uniendo el mutante de la HSA a la misma. Para unir el PEG al mutante de la HSA o a la proteína (A), se utiliza un PEG que está modificado con grupos funcionales tales como carbonato, carbonildiimidazol, un éster activo del ácido carbónico, azlactona, imida tiona cíclica, isocianato, isotiocianato, imidato, o aldehído. El mutante de la HSA de la presente invención y la proteína (A) se unen covalentemente principalmente a través de la reacción de uno de estos grupos funcionales introducidos en el PEG con el grupo amino en el mutante de la HSA de la presente invención y la proteína (A). Aunque no existe una limitación especial en cuanto al peso molecular del PEG empleado aquí, su peso molecular medio (PM) es el siguiente: preferentemente PM = 500-60000, y más preferentemente 500-20000. Por ejemplo, el PEG que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 300, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 2000, aproximadamente 4000, aproximadamente 10000 nm o aproximadamente 20000, y similares, se puede usar preferentemente como un enlazador no peptídico.
Por ejemplo, se puede obtener un mutante de la HSA PEGilado mezclando el mutante de la HSA de la presente invención con polietilenglicol que tiene grupos aldehído como grupos funcionales (ALD-PEG-ALD) en una relación molar HSA/(ALD-PEG-ALD) de 11, 12,5, 15, 110, 120 o similares, y agregando un agente reductor como NaCNBH3 a la mezcla y dejándolos reaccionar. A continuación, haciendo reaccionar el mutante de la HSA PEGilado con la proteína (A) en presencia de un agente reductor como NaCNBH3, se obtiene una proteína unida por PEG a un mutante de la HSA. En cambio, la proteína (A) unida por PEG al de la HSA de la presente invención también se puede obtener uniendo en primer lugar la proteína (A) con ALD-PEG-ALD para preparar la proteína PEGilada (A) y a continuación unir la misma al mutante de la HSA de la presente invención.
La proteína (A) que se va a unir al mutante de la HSA de la presente invención es la hormona del crecimiento 20K o la hormona del crecimiento 22K. Descrito y no reivindicado per se es dicho mutante de la HSA unido con otras proteínas que presentan algunas actividades fisiológicas cuando se administran a un organismo vivo, en donde los ejemplos de dichas proteínas incluyen, pero sin limitación, a-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, glucocerebrosidasa, pgalactosidasa, proteína activadora de GM2, p-hexosaminidasa A, p-hexosaminidasa B, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, a-manosidasa, p-manosidasa, galactosilceramidasa, saposina C, arilsulfatasa A, a-L-fucosidasa, aspartilglucosaminidasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, esfingomielinasa ácida, a-galactosidasa, p-glucuronidasa, heparán sulfato N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetil-CoA:-a-glucosaminida N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, ceramidasa ácida, amilo-1,6-glucosidasa, enzimas lisosómicas incluyendo CLN1-10, ligandos de PD-1, proteína morfogenética ósea (BMP), insulina, prolactina, motilina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona melanocito-estimulante (MSH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona estimulante tiroidea (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona folículo-estimulante (FSH), hormona paratiroidea (PTH), trombopoyetina, factor citoblástico (SCF), leptina, vasopresina, oxitocina, calcitonina, glucagón, gastrina, secretina, pancreozimina, colecistoquinina, angiotensina, angiostatina, endostatina, lactógeno placentario humano (HPL), gonadotropina coriónica humana (HCG), encefalina, endorfina, interferón a, interferón p, interferón y, interleucina 2, timopoyetina, timoestimulina, factor humoral del timo (THF), factor tímico sérico (FTS), timosina, factor tímico X, factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), uroquinasa, activador del plasminógeno tisular (tPA), dinorfina, bombesina, neurotensina, caeruleína, bradiquinina, asparaginasa, calicreína, sustancia P, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, neurotrofina 6, neurregulina 1, activina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteína morfogenética ósea (BMP), factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF), factor de coagulación sanguínea VII, factor de coagulación sanguínea VIII, factor de coagulación sanguínea IX, superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), cloruro de lisozima, polimixina B, colistina, gramicidina, bacitracina, polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor liberador de la hormona del crecimiento (GRF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina, somatostatina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), y una sal o mutante de las mismas.
En la presente invención, aunque no existe una limitación especial en cuanto a las especies biológicas de las que procede la proteína (A) que se va a unir al mutante de la HSA, se prefieren las que proceden de mamíferos, más preferentemente proteínas procedentes de primates incluidos seres humanos, mono verde africano, roedores incluido el ratón, rata, hámster chino, conejo, perro y más preferentemente proteínas procedentes de seres humanos.
En la presente invención, no es necesario que la proteína (A) sea una proteína de tipo silvestre. En concreto, esta puede ser un mutante, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o añadidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, pero conservando las actividades fisiológicas de la proteína original (A), o incluso actuando como un antagonista de la proteína de tipo silvestre (A) (ejerciendo así una influencia sobre la actividad de la proteína intrínseca (A)). El número de restos de aminoácidos sustituidos, eliminados y/o añadidos puede ser preferentemente de 1-10, más preferentemente de 1-5 y aún más preferentemente de 1-3, para cada tipo de mutación. Dicha sustitución, deleción, y/o adición puede tener lugar en combinación.
La proteína (A) unida a un mutante de la HSA de la presente invención tiene una mayor estabilidad y, por lo tanto, una semivida más larga en la sangre que la proteína (A) original sin mutante de la HSA unido. Aunque la semivida variaría dependiendo de la vía de administración y la dosis empleada, se vuelve muy estable en la sangre, como lo demuestra su semivida en la sangre (t-iop) que es más de aproximadamente 5 horas después de la administración subcutánea a monos cinomolgos. Por ejemplo, la semivida en la sangre (t-iop) de la hormona del crecimiento humana unida a un mutante de la HSA de la presente invención es 5-40 horas después de su única administración subcutánea a monos cinomolgos macho a una dosis de 0,5-10 mg/kg.
La proteína (A) unida a un mutante de la HSA de la presente invención puede usarse como un medicamento utilizando la actividad presentada por el resto de proteína (A) cuando se administra a un organismo vivo. La expresión "cuerpo vivo" significa un cuerpo vivo de mamíferos, incluido un ser humano, y lo más preferentemente un ser humano.
La proteína (A) unida a un mutante de la HSA de la presente invención tiene una mayor estabilidad en la sangre. Por lo tanto, incluso una proteína que es tan inestable en la sangre y que se descompone rápidamente después de la administración que hasta ahora no podría presentar un efecto suficiente, ahora puede estabilizarse en la sangre y permitir que presente su actividad fisiológica, uniéndola al mutante de la HSA, lo que da lugar a la posibilidad de su desarrollo como medicamento.
Incluso una proteína que podría haberse utilizado hasta ahora como medicamento puede mejorar su estabilidad en la sangre uniéndola al mutante de la HSA y, por lo tanto, puede permanecer en la sangre durante un período de tiempo más prolongado, manteniendo su actividad fisiológica. Esto permite reducir la frecuencia de dosificación o la dosis de la propia proteína. Por ejemplo, la frecuencia de dosificación de un medicamento que requiere la administración diaria podría reducirse a, p. ej., una vez cada 3-30 días uniéndola al mutante de la HSA de la presente invención. Asimismo, la dosis del medicamento podría reducirse, por ejemplo, a 1/3-1/100.
Un medicamento que comprende la proteína (A) unida a un mutante de la HSA como principio activo puede administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea en la forma de inyección. La vía de administración del medicamento se puede elegir según se desee, de acuerdo con su forma de preparación, los trastornos a tratar y similares. Las preparaciones para esas vías de inyección se pueden suministrar como preparaciones liofilizadas o líquidas acuosas. Dichas preparaciones líquidas acuosas se pueden suministrar en forma de viales que las contengan, o en un tipo precargado, donde ya se encuentran incluidas en las jeringas. Las preparaciones liofilizadas se reconstituyen disolviéndolas en un medio acuoso antes de su uso y a continuación se administran.
La hormona del crecimiento humana es la proteína (A) que se va a unir a un mutante de la HSA de la presente invención. La hormona del crecimiento humana incluye dos tipos principales que se diferencian entre sí por su peso molecular, es decir, la hormona del crecimiento humana 22K y la hormona del crecimiento 20K. La hormona del crecimiento 22K es una proteína que consiste en 191 aminoácidos y que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:9. Aunque la expresión "hormona del crecimiento humana (o hGH)" generalmente se refiere a esta hormona del crecimiento 22K, esta expresión "hormona del crecimiento humana (o hGH)" a la que se hace referencia simplemente en la presente memoria descriptiva incluye tanto la hormona del crecimiento humana 22K como la hormona del crecimiento humana 20K.
La expresión "hormona del crecimiento humana 22K (o "22K hGH)" a la que se hace referencia simplemente en la presente memoria incluye, además de la 22K hGH de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:9, aquellos mutantes de la 22K hGH que tienen uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o añadidos en comparación con el tipo silvestre y que todavía tienen actividad promotora del crecimiento. El número de restos de aminoácidos que se pueden sustituir, eliminar y/o añadir es preferentemente de 1-8, más preferentemente de 1-4 y aún más preferentemente de 1-2, para cada tipo de mutación.
La hormona del crecimiento 20K de tipo silvestre es equivalente a la deleción resultante de 15 aminoácidos en las posiciones 32-46 del extremo N de los 191 aminoácidos que forman la hormona del crecimiento 22K de tipo silvestre (SEQ ID NO:9), concretamente, una proteína con actividad promotora del crecimiento que consiste en una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:10) que se compone de 176 aminoácidos. Cabe señalar que en la presente memoria descriptiva, la expresión "hormona del crecimiento humana 20K (o "20K hGH)" a la que se hace referencia simplemente en la presente memoria descriptiva incluye, además de la 20K hGH de tipo silvestre descrita como SEQ ID NO:10, aquellos mutantes de la 20K hGH que corresponden a los que tienen uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o añadidos en comparación con esa secuencia y que todavía tienen actividad promotora del crecimiento. El número de restos de aminoácidos que se pueden sustituir, eliminar y/o añadir es preferentemente de 1-8, más preferentemente de 1-4 y aún más preferentemente de 1-2, para cada tipo de mutación.
Las preparaciones farmacéuticas (preparaciones de hGH) que contienen hGH que tienen un peso molecular de aproximadamente 22KD como el principio activo, que se producen como una proteína recombinante usando células de E. coli que tienen el gen de la hGH introducido, son muy utilizadas clínicamente como preparaciones terapéuticas para el enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, enanismo en el síndrome de Turner, enanismo en el contexto del SGA acompañado de ausencia del cierre epifisario, enanismo por insuficiencia renal crónica, enanismo en el síndrome de Prader-Willi y enanismo en la acondroplasia. Esas preparaciones de la hGH se administran por vía subcutánea o intramuscular, y su componente, hGH, que circula en la sangre, presenta su efecto de promoción del crecimiento del paciente mediante su actividad promotora del crecimiento. Al mismo tiempo, las preparaciones de hGH también se utilizan ampliamente en la clínica como preparaciones terapéuticas para la deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos. Si bien se observa un metabolismo lipídico anormal en pacientes con deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, la administración de la hGH normaliza el metabolismo lipídico del paciente y mejora su calidad de vida. La GH humana también se aplica clínicamente como fármaco terapéutico para el consumo provocado por el SIDA. Growject (marca comercial) es un ejemplo de preparación de hGH para el tratamiento del enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, la deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos y similares.
En la presente invención, el producto en el que se emplea la hormona del crecimiento humana como proteína (A) unida al mutante de la seroalbúmina humana (mHSA) se denomina "hormona del crecimiento humana unida a un mutante de la seroalbúmina humana", "hGH unida a mHSA", o similar, y donde la unión se realiza mediante un enlace peptídico, específicamente también se denomina como "hormona del crecimiento humana fusionada con un mutante de la seroalbúmina humana", "hGH fusionada con mHSA", o similar.
Más específicamente, para unir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH, se puede emplear un método general en la presente invención, en el que, por ejemplo, un vector de expresión preparado que tiene un fragmento de ADN incorporado en el que el gen que codifica uno de los polipéptidos se une en dirección 3' del mismo en marco al gen que codifica el otro polipéptido, y se cultivan las células hospedadoras transformadas con este vector de expresión para permitir que la proteína recombinante se exprese por sí misma.
Al preparar una hGH unida a mHSA usando un método para permitir que las células transformadas la expresen como una proteína recombinante, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH se une al extremo N o C del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención, ya sea directa o indirectamente a través de un enlazador.
En el caso de que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH se una al extremo N de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención, se emplea un vector de expresión que tiene un fragmento de ADN incorporado en el que el gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención se une en marco a, y en dirección 3', al gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH. En el caso en el que los dos polipéptidos se unan indirectamente mediante un enlazador peptídico, se coloca una secuencia de ADN que codifica el enlazador en marco entre los genes que codifican los dos polipéptidos.
En el caso de que un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH se una al extremo C de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención, se emplea un vector de expresión que tiene un fragmento de ADN incorporado en el que el gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención se une en marco, y en dirección 5', al gen que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH. En el caso en el que los dos polipéptidos se unan indirectamente mediante un enlazador peptídico, se coloca una secuencia de ADN que codifica el enlazador en marco entre los genes que codifican los dos polipéptidos.
Asimismo, para unir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la HSA de la presente invención con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la hGH, existe un método, por ejemplo, en el cual los dos polipéptidos se preparan por separado y a continuación se unen mediante un enlazador no peptídico o un péptido enlazador. Como un enlazador no peptídico, pueden usarse los siguientes: polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, poli(vinil éteres), polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, y ácido hialurónico, o derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos. Por otro lado, un enlazador peptídico es una cadena peptídica que consiste en un péptido de 1-50 aminoácidos unidos o su derivado, cuyos extremos N y C respectivamente forman enlaces peptídicos con el mutante de la HSA o una proteína de interés para unir el mutante de la HSA y la proteína de interés.
Cuando el enlazador está específicamente identificado, la proteína (A) unida con el mutante de la HSA usando PEG como un enlazador no peptídico, se denomina proteína (A) unida por PEG a un mutante de la HSA. Así, en la presente invención se denomina hGH unida por PEG a un mutante de la HSA. La hGH unida por PEG a un mutante de la HSA se puede producir uniendo en primer lugar el mutante de la HSA y el PEG (mutante de HSA PEGilado) y a continuación uniendo este con la hGH, o uniendo primero la hGH y PEG (hGH PEGilada) y uniendo a continuación esta con el mutante de la HSA. Para unir el PEG al mutante de la HSA de la presente invención, se emplea el PEG modificado con grupos funcionales tales como carbonato, carbonildiimidazol, carbonato activo, azlactona, imidetiona cíclica, isocianato, isotiocianato, imidato, o aldehído. Estos grupos funcionales unidos a PEG reaccionan principalmente con un grupo amino en las moléculas del mutante de la HSA y la hGH, formando enlaces covalentes con el mutante de la HSA y la hGH. Aunque no existe una limitación notable en cuanto al peso molecular del PEG empleado, su peso molecular medio (PM) es el siguiente: preferentemente PM=500-60000, más preferentemente PM=500-20000. Por ejemplo, el PEG cuyo peso molecular medio es de aproximadamente 300, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 2000, aproximadamente 4000, aproximadamente 10000, aproximadamente 20000, o similares se puede usar preferentemente como un enlazador no peptídico.
El mutante de HSA PEGilado, por ejemplo, se puede obtener mezclando el mutante de la HSA de la presente invención con un polietilenglicol que tiene grupos aldehído como grupos funcionales (ALD-PEG-ALD) en una relación molar HSA/(a Ld-PEG-ALD) de 11, 12,5, 15, 110, 120, y similares, y agregando un agente reductor tal como NaCNBH3 o similares a la mezcla, y dejándolos reaccionar. El mutante de la HSA PEGilado anterior se deja a continuación reaccionar con hGH en presencia de un agente reductor tal como NaCNBH3 o similar para obtener una hGH unida por PEG a un mutante de la HSA. En cambio, la hGH unida por PEG a un mutante de la HSA de la presente invención también se puede obtener uniendo en primer lugar la hGH y ALD-PEG-ALD para formar hGH PEGilada, y unir esta al mutante de la HSA.
En la presente invención, un ejemplo preferible de hGH unida a mHSA (fusionada) es la hGH unida a un mutante mHSA que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:11, en la cual el extremo C de la hormona del crecimiento humana 22K que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:9 está unida al extremo N de la HSA(A320T) que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, formando un enlace peptídico sin un enlazador. En la presente invención, aquella que consiste en HSA(A320T) y 22K hGH unida en este orden se denomina "hormona del crecimiento humana 22K-mHSA" o "22KhGH-mHSA". Análogamente, aquella en la cual el extremo N de la hormona del crecimiento humana 22K está unida al extremo C de HSA(A320T) formando un péptido unido sin un enlazador, se denomina "mHSA-hormona del crecimiento humana 22K" o "mHSA-22KhGH".
Además, la hGH unida al mutante mHSA que tiene la secuencia descrita como SEQ ID NO:12, en la cual el extremo C de la hormona del crecimiento humana 22k descrita como SEQ ID NO:10 está unida al extremo N de la seroalbúmina humana (A320T) que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, formando un enlace peptídico sin un enlazador, se denomina "hormona del crecimiento humana 20K-mHSA" o "20KhGH-mHSA". Análogamente, aquella en la cual el extremo N de la hormona del crecimiento humana 20K está unida al extremo C de la seroalbúmina humana (A320T) formando un enlace peptídico sin un enlazador, se denomina "mHSA-hormona del crecimiento humana 20K" o "mHSA-20KhGH".
La hormona del crecimiento humana unida a un mutante de la HSA de la presente invención se caracteriza porque se estabiliza notablemente en la sangre, presentando una semivida generalmente no menor de 10 horas en la sangre (t-i/2p) después de la inyección subcutánea a monos cinomolgos. Aunque variaría dependiendo de las dosis, la semivida (t-i/2p) de mHSA-22KhGH y 22KhGH-mHSA en la sangre después de una única administración subcutánea a monos cinomolgos machos a una dosis de 4 mg/kg es de 20 a 35 horas.
La hormona del crecimiento humana unida al mutante de la HSA se puede utilizar como un medicamento. También es posible usarlo como un medicamento al permitir la cooperación de las funciones de la hormona del crecimiento humana y el mutante de la HSA en el cuerpo vivo.
La hormona del crecimiento humana unida a un mutante de la HSA de la presente invención es muy estable en la sangre. Así, la presente invención estabiliza la hormona del crecimiento humana en la sangre y permite que permanezca durante un tiempo prolongado, manteniendo su actividad, lo que conduce a una reducción de la frecuencia de administración o dosis de la hormona del crecimiento humana utilizada como medicamento. Por ejemplo, la frecuencia de administración de un medicamento que debe administrarse diariamente podría reducirse a una vez cada 3-30 días uniéndolo al mutante de la HSA de la presente invención. Asimismo, la dosis de tal medicamento podría reducirse a 1/3-1/100 en relación molar.
La hormona del crecimiento humana unida a un mutante de la HSA de la presente invención se puede usar como un medicamento para el tratamiento de trastornos tales como enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, enanismo en el síndrome de Turner, enanismo por insuficiencia renal crónica, enanismo en el síndrome de Prader-Willi, enanismo en la acondroplasia, enanismo en el contexto SGA, todos ellos acompañados de ausencia del cierre epifisario; y deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, consumo provocado por el SIDA y consumo provocado por la anorexia, y además, también se puede utilizar como fármaco terapéutico para el tratamiento de trastornos con síntomas que podrían mejorarse mediante la aplicación a largo plazo de actividades fisiológicas de hormona del crecimiento, tal como la actividad promotora del crecimiento incluyendo la aceleración de la condrogénesis, la aceleración del anabolismo proteico y similares, así como la mejora de la composición corporal y el metabolismo de los lípidos.
En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,01-0,7 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con enanismo en el síndrome de Turner acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,15-1,4 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con enanismo por insuficiencia renal crónica acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,01-1,4 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con síndrome de Prader-Willi, acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,012-0,98 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con enanismo en la acondroplasia, acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,015-1,4 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con enanismo en el contexto SGA, acompañado de ausencia del cierre epifisario, una dosis preferible es de 0,012-1,9 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con deficiencia de la hormona del crecimiento, una dosis preferible es de 0,001­ 0,34 mg/kg de peso corporal de una vez. En el caso en el que se administre mHSA-22KhGH a un paciente con consumo causado por el SIDA, una dosis preferible es de 0,005-0,4 mg/kg de peso corporal de una vez. Estas dosis, sin embargo, deben modificarse adecuadamente de acuerdo con el resultado del examen del paciente. Asimismo, un intervalo preferible de dosificación de mHSA-22KhGH para estos trastornos es una vez cada 7-30 días, y debe modificarse a una vez cada 7-14 días, una vez cada 10-20 días, una vez cada 14-21 días de acuerdo con el resultado del examen del paciente. La vía de administración es preferentemente inyección subcutánea, inyección intramuscular o inyección intravenosa, y más preferentemente inyección subcutánea o inyección intramuscular.
Un medicamento que contiene una proteína unida a un mutante de la HSA como el principio activo puede administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o intracerebroventricular, en la forma de preparación inyectable. Tal preparación inyectable puede suministrarse en forma de preparación liofilizada o preparación líquida acuosa. En el caso de que se trate de una preparación líquida acuosa, esta puede suministrarse en forma de un vial lleno con ella o en la preparación de tipo precargado donde ya está incluida en una jeringa. En el caso de una preparación liofilizada, se reconstituye disolviéndola con un medio acuoso antes de su uso.
Ejemplos
Aunque la presente invención se describe con mayor detalle con referencia a los ejemplos, no se pretende que la presente invención esté limitada a estos ejemplos.
[Ejemplo 1] Construcción de pE-mIRES-GS-puro
Un vector, pEF/myc/nuc (Invitrogen), se digirió con enzimas de restricción (KpnI y NcoI) para cortar un fragmento de ADN que contenía el promotor del EF-1a y su primer intrón, y este fragmento de a Dn se degradó con la ADN polimerasa T4 para generar extremos romos. Por separado, el pCl-neo (Invitrogen) se digirió con enzimas de restricción (BglII y EcoRI) para cortar y eliminar una región que incluía el potenciador/promotor de CMV y su intrón, y a continuación se generaron extremos romos con la ADN polimerasa T4. En este producto se insertó la región anterior (extremos romos) que incluía el promotor del EF-1a y su primer intrón para preparar el vector pE-neo (Fig. 1).
El vector, pE-neo, se digirió con enzimas de restricción (SfiI y BstXI) para cortar y eliminar una región de aproximadamente 1 kpb que contenía el gen de resistencia a neomicina (Fig. 2). Utilizando pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen), como molde, y el cebador Hyg-Sfi5' (SEQ ID NO:13) y el cebador Hyg-BstX3' (SEQ iD NO:14), se llevó a cabo la PCR para multiplicar el gen de la higromicina (Fig. 2). La higromicina así multiplicada se digirió con enzimas de restricción (SfiI y BstXl) y se insertó en el vector pE-neo para construir el vector pE-hygr (Fig. 2).
Un vector de expresión, pPGKIH (Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) se digirió con enzimas de restricción (Xhol y BamHl) para cortar un fragmento de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) derivado del virus de la encefalomiocarditis de ratón (EMCV), un gen de resistencia a la higromicina (gen Hygr), y la región de poliadenilación (mPGKpA) de la fosfoglicerato quinasa de ratón (mPGK), es decir, IRES-Hygr-mPGKpA (SEQ ID NO:15: la región que consiste en los nucleótidos 1­ 6 de su extremo 5' es un "sitio Xhol", la región que consiste en los nucleótidos 120-715 y 716-718 (atg) que sigue es la "secuencia de nucleótidos que comprende el sitio interno de entrada del ribosoma derivado de la región 5' no traducida del genoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón, la región que consiste en los nucleótidos 716-1741 que incluye 716-718 (atg) es la "secuencia de nucleótidos que codifica el gen de resistencia a la higromicina", la región que consiste en los nucleótidos 1747-2210 es la "secuencia de nucleótidos que comprende la región de poliadenilación de la fosfoglicerato quinasa de ratón (mPGK)", y la región que consiste en los 6 nucleótidos (nucleótidos 2211-2216) en el extremo 3' hay un "sitio BamHl") (además, la secuencia de aminoácidos correspondiente al gen Hygr se muestra en la SEQ ID NO:16). Este fragmento de ADN se insertó entre los sitios Xhol y BamHl de pBluescript SK(-) (Stratagene), y el producto resultante se denominó pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA) (Fig. 3-1).
Usando pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA), como molde, y el cebador IRES5' (SEQ ID NO:17) y el cebador IRES3' (SEQ ID NO:18), se llevó a cabo una PCR para multiplicar un fragmento de ADN que comprendía parte del IRES de EMCV. Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (Xhol y Hindlll) y se introdujo entre los sitios Xhol y Hindlll de pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA), y el producto resultante se denominó pBSK(Notl-IRES-Hygr-mPGKpA) (Fig. 3-2). Después de la digestión con enzimas de restricción (Notl y BamHl), se insertó pBSK(Notl-IRES-Hygr-mPGKpA) entre los sitios Notl y BamHI del vector pE-hygr, y el producto resultante se denominó plásmido pE-IRES-Hygr (Fig. 3­ 3).
Usando el vector de expresión pPGKIH, como molde, y el cebador mPGKP5' (SEQ ID NO:19) y el cebador (mPGKP3' (SEQ ID NO:20), se llevó a cabo la PCR para multiplicar un fragmento de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que comprende la región promotora de mPGK (SEQ ID NO:21: los nucleótidos 4-9 del extremo 5' es un "sitio BglII", la región que consiste en los nucleótidos 10-516 que sigue es la "secuencia de nucleótidos que comprende la región promotora del gen de la fosfoglicerato quinasa de ratón (mPGK)", y la región que consiste en los nucleótidos 524-529 que sigue es un "sitio EcoRI"). Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (BglII y EcoRI) y se insertó entre los sitios BglII y EcoRI de pCI-neo (Promega), y el producto resultante se denominó pPGK-neo (Fig. 3-4). Después de la digestión de pE-IRES-Hygr con enzimas de restricción (NotI y BamHI) para cortar un fragmento de ADN (IRES-Hygr), el cual se insertó a continuación entre los sitios NotI y BamH de pPGK-neo, el producto resultante se denominó pPGK- IRES-Hygr (Fig. 3-5).
A partir de células CHO-K1, se preparó ADNc, y usando este ADNc, como molde, y el cebador GS5' (SEQ ID NO:22) y el cebador GS3' (SEQ ID NO:23), se llevó a cabo la PCR para multiplicar un fragmento de ADN que comprende el gen de la GS. Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (Ball y BamHI) y se insertó entre los sitios Ball y BamHI de pPGK-IRES-Hygr, y el producto resultante se denominó pPGK-RES-GS-ApolyA (Fig. 3-6).
Usando pCAGIPuro (Miyahara m. et.al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)), como molde, y el cebador puro5' (SEQ ID NO:24) y el cebador puro3' (SEQ ID NO:25), un fragmento de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que comprende un gen de resistencia a puromicina (gen puro) se multiplicó por PCR (SEQ ID NO:26: la región que consiste en los nucleótidos 2-7 de su extremo 5' es un "sitio AflII", la región que consiste en los nucleótidos 8-607 que sigue es la "secuencia de nucleótidos que codifica el gen de resistencia a la puromicina (gen puro)", y la región que consiste en los nucleótidos 608-619 que sigue es un "sitio BstXI") (además, la secuencia de aminoácidos correspondiente al gen puro se muestra en la SEQ ID NO:27). Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (AflII y BstXI) y a continuación se insertó entre los sitios AflII y BstXI, y el producto resultante se denominó pE-puro (Fig. 3-7).
Usando pE-puro, como molde, y el cebador SV40polyA5' (SEQ ID NO:28 y el cebador SV40polyA3' (SEQ ID NO:29), se multiplicó por PCR un fragmento de ADN que incluye la región de poliadenilación tardía de SV40. Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (NotI y HpaI) y a continuación se insertó entre los sitios NotI y HpaI del vector de expresión pE-puro, y el producto resultante se denominó pE-puro (XhoI) (Fig. 3-8). Al digerir pPGK-IRES-GS-ApolyA con enzimas de restricción (NotI y XhoI), se cortó un fragmento de ADN que incluía la región IRES-GS, el cual a continuación se insertó entre los sitios NotI y XhoI del vector de expresión pE-puro (XhoI), y el producto resultante se denominó pE-IRES-GS-puro (Fig. 3-9).
Usando el vector de expresión pE-IRES-GS-puro, como molde, y el cebador mIRES-GS5 '(SEQ ID NO:30) y el cebador mIRES-GS3' (SEQ ID NO:31), la región desde IRES del EMCV hasta GS se multiplicó por PCR en la que el segundo codón de inicio (atg) del extremo 5' del IRES del EMCV se destruyó mediante la introducción de una mutación. Usando el vector de expresión pE-IRES-GS-puro, como molde, y el fragmento de ADN anterior y el cebador IRES5' mencionado anteriormente, se multiplicó por PCR un fragmento de ADN que incluye la región anterior desde IRES hasta GS. Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (NotI y PstI), y un fragmento de ADN así cortado se insertó entre los sitios NotI y PstI del vector de expresión pE-IRES-GS-puro, y el producto resultante se denominó pE-mIRES- GS-puro, un vector de expresión para células de mamífero (Fig. 4).
[Ejemplo 2] Construcción de un vector para la expresión de HSA-22KhG
La SEQ ID NO:32 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HSA-22KhGH, que es el producto resultante de la fusión del extremo C de la HSA de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) con el extremo N de 22KhGH. En esta secuencia de aminoácidos, los restos de aminoácidos 1-585 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la HSA madura de tipo silvestre (SEQ ID NO:1), y los restos de aminoácidos 586-776 corresponden a la secuencia de aminoácidos de 22KhGH. El ADN que tiene la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 33, que incluye el gen que codifica HSA-22KhGH (gen HSA-22KhGH) se sintetizó químicamente. En esta secuencia, los nucleótidos 11­ 82, los nucleótidos 83-1837 y los nucleótidos 1838-2410 codifican el péptido líder de la HSA, la HSA madura y la hGH madura, respectivamente. Este ADN se digirió con enzimas de restricción (MluI y NotI), y se insertó entre los sitios MluI y NotI de pE-mIRES-GS-puro preparado en el Ejemplo 1 para construir el vector pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH) para la expresión de HSA-22KhGH.
[Ejemplo 3] Construcción de un vector para la expresión de mHSA-22KhGH
La proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:34, que era el producto obtenido fusionando el extremo C de la HSA(A320T) (SEQ ID NO:3) con el extremo N de 22KhGH, se denominó mHSA-22KhGH. En la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 34, los restos de aminoácidos 1-585 corresponden a la secuencia de aminoácidos de mHSA, y los restos de aminoácidos 586-776 corresponden a la secuencia de aminoácidos de 22KhGH. Usando pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH) preparado en el Ejemplo 2, como molde, y el cebador YA082 (SEQ ID NO:35) y el cebador YA083 (SEQ ID NO:36), se multiplicó por PCR un fragmento de ADN que comprende el gen que codifica mHSA-22KhGH. Mediante la autohibridación de este fragmento de ADN, se construyó pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH) como el vector para la expresión de mHSA-22KhGH.
[Ejemplo 4] Construcción de un vector para la expresión de 22KhGH-HSA
La proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:37, que era el producto obtenido al fusionar el extremo C de 22KhGH con el extremo N de la HSA de tipo silvestre (SEQ ID NO:1), se denominó 22KhGH-HSA. En la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 37, los restos de aminoácidos 1-191 corresponden a la secuencia de aminoácidos de 22KhGH, y los restos de aminoácidos 192-776 corresponden a la secuencia de aminoácidos de HSA. Se sintetizó químicamente un ADN que tenía la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:38 que contiene el gen que codifica 22KhGH-HSA (gen 22KhGH-HSA). En esta secuencia, los nucleótidos 11-88 codifican el péptido líder de hGH, los nucleótidos 89-661 la hGH madura, los nucleótidos 662-2416 la HSA madura, respectivamente. Este ADN se digirió con enzimas de restricción (MluI y NotI) y se insertó entre los sitios MluI y NotI de pE-mIRES-GS-puro preparado en el Ejemplo 1 para construir pE-mIRES-GS-puro(22KhGH- HSA) como el vector para la expresión de 22KhGH- HSA.
[Ejemplo 5] Construcción de un vector para la expresión de 22KhGH-mHSA
La proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:39, que era el producto obtenido al fusionar el extremo C de 22KhGH con el extremo N de HSA(A320T) (SEQ ID NO:3), se denominó 22KhGH-mHSA. Usando el pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA) preparado en el Ejemplo 4, como molde, y el cebador YA082 (SEQ ID NO:35) y el cebador YA083 (SEQ ID NO:36), se multiplicó por p Cr un fragmento de A d N que comprende el gen que codifica 22KhGH-mHSA. Mediante la autohibridación de este fragmento de ADN, pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA), se construyó el vector para la expresión de 22KhGH-mHSA.
[Ejemplo 6] Preparación de células que expresan proteínas de fusión
Las células para la expresión de cada proteína de fusión, HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, y 22KhGH-mHSA se prepararon de la siguiente manera. En células CHO-K1, las células derivadas de las células de ovario de hámster chino, se introdujeron por separado los vectores de expresión preparados en los Ejemplos 2-5, es decir, pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH), que era el vector de expresión para HSA-22KhGH, pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH), que era el vector de expresión para mHSA-22KhGH, pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA), que era el vector de expresión para 22KhGH-HSA, y pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA), que era el vector de expresión para 22KhGH-mHSA, usando el sistema de electroporación Gene Pulser Xcell (Bio Rad). Las células que tenían uno de los vectores de expresión introducidos se sometieron a cultivo de selección en un medio CD OptiCHO™ (Thermo Fisher Scientific) utilizando metionina sulfoximina (SIGMA) y puromicina (SIGMA) para establecer células para la expresión de HSA-22KhGH, células para la expresión de mHSA-22KhGH, células para la expresión de 22KhGH-HSA, y células para la expresión de 22KhGH-mHSA, respectivamente. En el cultivo de selección, la concentración de metionina sulfoximina y puromicina se incrementó gradualmente, hasta la concentración final de 300 pM para metionina sulfoximina y 10 pg/ml para puromicina, para promover selectivamente las células que tienen una mayor resistencia a los fármacos.
Las células para la expresión de HSA-22KhGH, las células para la expresión de mHSA-22KhGH, las células para la expresión de 22KhGH-HSA, y las células para la expresión de 22KhGH-mHSA se denominan generalmente células que expresan la proteína de fusión HSA-hGH, y las proteínas de fusión entre HSA y hGH obtenidas cultivando esas células se denominan generalmente proteínas de fusión HSA-hGH.
[Ejemplo 7] Cultivo de células que expresan proteínas de fusión
las células que expresan HSA-22KhGH, las células que expresan mHSA-22KhGH, las células que expresan 22KhGH-HSA, y las células que expresan 22KhGH-mHSA se cultivaron de la siguiente manera. Al medio CD OptiCHO™ (Thermo Fisher Scientific) se añadieron metionina sulfoximina y puromicina a la concentración final de 300 pM y 10 pg/ml, respectivamente, para preparar un medio de cultivo celular. Las respectivas células para la expresión preparadas en el Ejemplo 6 se agregaron a 5 ml de cada medio de cultivo celular a una densidad de 2 x 105 células/ml, y se cultivaron a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. Las células se transfirieron a un medio de cultivo nuevo a la densidad de 2 x 105 células/ml una vez cada 5 días, y se subcultivaron.
[Ejemplo 8] Purificación de las proteínas de fusión HSA-hGH
La purificación de HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, y 22KhGH-mHSA se llevó a cabo de la siguiente manera. Las respectivas células para la expresión subcultivadas en el Ejemplo 7 se suspendieron en su medio de cultivo celular a una densidad de 2 x 105 células/ml hasta completar el volumen total de 240 ml. Se añadió la suspensión de células, 30 ml de cada, a ocho placas de Petri de 15 cm y se cultivaron durante 5 días a 37 °C. Tras el cultivo, cada medio se recogió a través de un filtro de membrana (tamaño de poro 0,22, Millipore) para obtener el sobrenadante del cultivo. A cada uno de los sobrenadantes, se añadió HEPES 1 M (pH 8,0) para ajustar el pH a 7,07,2.
Se llenó una columna de polipropileno (Poly-Prep™ Bio-Rad) con una resina a la que se habían unido 5 ml de anticuerpo anti-hormona del crecimiento humana (resina Capture Select™ anti hGH, Thermo Fisher Scientific), y la resina se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón HEPES 10 mM que contiene NaCl 500 mM (pH 7,5). El sobrenadante del cultivo anterior, tras el ajuste del pH, se cargó en la columna a un caudal de aproximadamente 2,5 ml/min para permitir que la proteína de fusión HSA-hGH fuera adsorbida por la resina. A continuación, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón HEPES 10 mM que contenía NaCl 500 mM (pH 7,5) suplementado con el mismo caudal. La proteína de fusión HSA-hGH se eluyó de la resina con 5 volúmenes de columna de tampón de glicina 0,1 M (pH 3,0) que contenía NaCl 100 mM. Se recogieron las fracciones que contenían proteína de fusión HSA-hGH y se añadió inmediatamente 7 % (v/v) de tampón HEPES 1 M (pH 8,0). La concentración de la proteína de fusión HSA-hGH en el eluato se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific) utilizando BSA como compuesto patrón.
[Ejemplo 9] Preparación de células BaF3/hGHR
Se produjeron células BaF3/hGHR que habían adquirido capacidad de crecimiento dependiente de GH mediante la introducción del gen del receptor de la GH humana (hGHR) en células BaF3 de ratón de la siguiente manera. La PCR se llevó a cabo utilizando un gen del ECD de hGHR sintetizado artificialmente que tiene la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:40 (un fragmento del lado 5' del gen hGHR que codifica el dominio extracelular de hGHR), como molde, y el cebador YA034 (SEQ ID NO:41) y el cebador YA035 (SEQ ID NO:42). El producto de PCR se sometió a electroforesis en agarosa y se purificó usando QIAEX II (QIAGEN). Este fragmento de ADN se utilizó como megacebador. Usando ADNc derivado de pulmón humano como molde, el cebador K708 (SEQ ID NO:43), y el cebador K709 (SEQ ID NO:44), se llevó a cabo la PCR para multiplicar un fragmento de ADN que incluía el gen hGHR de longitud completa. El producto de PCR así obtenido se sometió a electroforesis en agarosa y se purificó usando QIAEX II. Usando el fragmento de ADN purificado que incluye el gen hGHR de longitud completa como molde, el megacebador anterior y el cebador K709 (SEQ ID NO:44), se llevó a cabo una PCR para amplificar el fragmento de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:45, que incluía un gen que codifica la hGHR de longitud completa que tenía una secuencia de nucleótidos sintetizada artificialmente del ECD de hGHR en el lado del extremo 5'. Este fragmento de ADN se digirió con enzimas de restricción (MluI y NotI) y a continuación se insertó entre los sitios MluI y NotI del vector retrovirus pMX-II (Ono Y., Oncogene. 19. 3050-8 (2000)) para proporcionar un vector retrovírico para la expresión de hGHR (hGHR/pMX-II).
En 10 ml de medio DMEM que contiene FBS al 10%, se suspendieron 6x106 de "células 293" (Dainippon Pharmaceutical). Esta suspensión se añadió a placas de Petri de 10 cm y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. Las "células 293" empleadas aquí eran células renales embrionarias humanas transformadas con el gen E1 de adenovirus.
A 500 |jl de medio Opti-MEMI™ (Thermo Fisher Scientific) se añadieron 15 j l de un reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE 9 (Roche) y se mezclaron, y a esta mezcla, se añadieron 5 jg del vector de empaquetamiento de retrovirus pCL-Eco (IMGENEX) y se añadieron adicionalmente 5 jg de hGHR/pMX-II y se mezclaron. Esta solución de mezcla se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente y a continuación se añadió a las placas de 10 cm mencionadas anteriormente en las que se habían cultivado las "células 293" durante 24 horas. A continuación las células se cultivaron durante 24 horas a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %, y el medio se centrifugó a continuación a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger el sobrenadante. El sobrenadante así recogido se utilizó como solución de retrovirus que expresa hGHR.
Se cultivaron células WEHI-3 (Riken) en medio RPM1640 que contenía FBS al 10% y el medio se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger el sobrenadante. A 2 ml de la solución de retrovirus que expresa hGHR se le añadieron 500 j l del sobrenadante del cultivo de células WEHI-3 y 2,5 ml de medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% y se mezclaron. Esta solución de mezcla se añadió a 2 x 106 células BaF3 (Riken) de una línea celular dependiente de IL-3 y las células se suspendieron. Esta suspensión celular se transfirió a un matraz de cultivo de 75 cm2 y se cultivó en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C durante 8 horas, y tras la adición de 500 j l del sobrenadante del cultivo de células WEHI-3 y 2,5 ml de medio RPMI1640 que contiene FBS al 10 %, se cultivó durante otras 16 horas. Después de este cultivo, las células se recogieron por centrifugación, y se lavaron tres veces con PBS. A las células recolectadas se les añadió 5 ml de medio RPM1640 que contenía 22KhGHR a 100 ng/ml para suspender las células, y las células suspendidas se transfirieron a un matraz de cultivo y se cultivaron en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C para obtener células BaF3 que habían adquirido la capacidad de crecimiento dependiente de GH como resultado de la expresión del gen hGHR. Las células se denominaron células BaF3/hGHR.
[Ejemplo 10] Determinación de la actividad de crecimiento celular utilizando células BaF3/hGHR
La actividad de crecimiento celular de la proteína de fusión HSA-hGH se evaluó usando las células BaF3/hGHR preparadas mediante el método descrito en el Ejemplo 9.
Las células BaF3/hGHR en la fase de crecimiento logarítmico se lavaron tres veces con PBS y se diluyeron a 1 x 106 células/ml con 15 ml de medio RPMI1640 que contiene suero de caballo al 1 %, y se cultivaron en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C durante 16 horas. Después de este cultivo, las células se diluyeron a 3x105 células/ml con el mismo medio, y se sembraron 100 pl de este en cada pocillo de un placa de cultivo de 96 pocillos. Las proteínas de fusión (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, y 22KhGH-mHSA) purificadas en el Ejemplo 8 se diluyeron cada una de ellas hasta cada una de 7 diferentes concentraciones (90,3 nM, 18,1 nM, 3,6 nM, 0,72 nM, 0,14 nM, 0,029 nM, y 0,0058 nM) con PBS que contiene BSA al 0,1 % para preparar soluciones diluidas.
Se añadieron 20 pl de cada una de las soluciones diluidas preparadas anteriormente a los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos que se habían sembrado con células BaF3/hGHR, se mezclaron en un agitador de placas y se cultivaron en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C durante 22 horas. Después de este cultivo, la solución de prueba del ensayo de proliferación celular CellTiter 96™ Aqueous One Solution, que era un reactivo del análisis colorimétrico para el recuento del número de células vivas, se añadió al pocillo, 24 pl de cada, y se mezcló y se continuó con el cultivo durante otras 3 horas. La absorbancia se determinó a continuación para cada pocillo a 490 nm usando un lector de placas. Los valores medidos se representaron gráficamente, con la absorbancia a 490 nm en el eje vertical y la concentración molar (nM) en el eje horizontal. Como la absorbancia a 490 nm indicaba un valor relativo correspondiente al número de células vivas, la curva producida al representar los valores medidos representaba la correlación entre la concentración de la muestra de prueba y el nivel de crecimiento de las células. La concentración de la muestra de prueba a la que el nivel de crecimiento celular fue el 50 % del crecimiento celular máximo en la curva se determinó como CE50. La medición se llevó a cabo tres veces para cada muestra de prueba.
[Ejemplo 11] Análisis farmacodinámico y farmacológico utilizando monos cinomolgos
Cada una de las proteínas de fusión HSA-hGH purificadas en el Ejemplo 8 (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA y 22KhGH-mHSA) se administró por vía subcutánea una vez, en una dosis de 4,0 mg/kg, a monos cinomolgos. HSA-22KhGH se administró a 3 monos cinomolgos, y mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, o 22KhGH-mHSA se administró a un mono cinomolgo.
Se tomaron muestras de sangre periférica de los animales para el análisis farmacodinámico 15 minutos y 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 120, 168 y 216 horas después de la administración. La sangre se extrajo en tubos de recogida de sangre que contenían EDTA potásico, se enfrió con hielo y se centrifugó (17000xg, 5 minutos, 4 °C) para separar el plasma. La concentración de la proteína de fusión HSA-hGH contenida en el plasma así preparada se midió mediante un método detallado en el Ejemplo 12 a continuación, y se representó la concentración de HSA-hGH en el eje vertical y el tiempo transcurrido después de la administración en el eje horizontal, Cmáx, AUC0-216 h, AUCü-inf, y t-iop se determinaron para realizar el análisis farmacodinámico.
Además, el efecto farmacológico de la proteína de fusión HSA-hGH se analizó como sigue usando la promoción de la secreción de IGF-1 como referencia. Se extrajo sangre periférica antes de la administración, así como a las 6 y 12 horas y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 días después de la administración, y se preparó plasma a partir de la sangre periférica en la manera descrita anteriormente. La concentración de IGF-1 en el plasma se determinó mediante el método descrito en el Ejemplo 13, y el análisis farmacológico se realizó representando la concentración de IGF-1 en el eje vertical y el tiempo transcurrido después de la administración en el eje horizontal. Asimismo, como control, se proporcionó un mono cinomolgo adicional y se le administró 22KhGH (Growject™) por vía subcutánea a una dosis de 0,3 mg/kg durante 7 días consecutivos y se midió simultáneamente la concentración de IGF-1 en plasma.
[Ejemplo 10] Determinación de la proteína de fusión HSA-hGH en plasma
El anticuerpo monoclonal anti-HSA de ratón y el anticuerpo anti-hGH de ratón se obtuvieron cultivando células de hibridoma producidas fusionando células de bazo de ratón inmunizado por HSA o hGH con células de mieloma mediante un método convencional bien conocido por los expertos en la materia. El anticuerpo monoclonal anti-hGH de ratón se dializó contra una solución 0,1 M de NaHCO3 (pH9), y se midió la concentración del anticuerpo en la solución usando NanoDrop™ (Thermo Scientific). A continuación se añadió a la solución de anticuerpo EZ-Link™ NHS-LC-Biotina (Thermo Fisher Scientific) disuelto a 5 mg/ml en DMSO a una relación de 60 pg de NHS-LC-Biotina por 1 mg de anticuerpo, y dejando después que la reacción tuviese lugar durante 2 horas a temperatura ambiente, la solución de reacción se dializó contra PBS para obtener anticuerpo monoclonal anti-hGH de ratón biotinilado. El anticuerpo monoclonal anti-HSA de ratón se utilizó como el anticuerpo primario y el anticuerpo monoclonal anti-hGH de ratón biotinilado como el anticuerpo secundario, respectivamente, en el método de determinación que se describe a continuación.
La concentración de la proteína de fusión HSA-hGH en plasma se determinó mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL). El inmunoensayo ECL es un método en el que se determina una muestra aplicando estimulación electroquímica a un anticuerpo secundario marcado con un complejo de rutenio, SULFO-TAG, en una placa mientras se detecta la luminiscencia con una cámara CCD a la longitud de onda de 620 nm causada por oxidación- reducción de SULFO-TAG.
La medición se llevó a cabo en gran parte de la siguiente manera de acuerdo con el manual del producto de Sector Imager 6000. El anticuerpo monoclonal anti-HSA de ratón se añadió a la placa de alta unión (Meso Scale Diagnostics) y se dejó en reposo durante una hora para inmovilizar el anticuerpo anti-HSA (anticuerpo primario) a la placa. A continuación, se añadió tampón de bloqueo Superblock en PBS (Thermo Fisher Scientific) a la placa y se agitó durante una hora para bloquear la placa. La placa se lavó con PBST (PBS que contenía Tween20 al 0,05 %) y, tras la adición de una muestra, se agitó durante una hora.
La placa se lavó con PBST y, después de la adición del anticuerpo monoclonal anti-hGH de ratón biotinilado (anticuerpo secundario), se agitó durante una hora. La placa se lavó con PBST y, después de la adición de SULFO-Tag-Streptavidina (Meso Scale Diagnostics), se agitó durante una hora. Después de lavar la placa con PBST, se añadió tampón de lectura T (Meso Scale Diagnostics) y se midió la luminiscencia a 620 nm usando Sector Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics). Las concentraciones conocidas de HSA-hGH se determinaron de la misma manera en la misma placa para obtener una curva patrón, y la concentración de HSA-hGH en el plasma se determinó interpolando los valores medidos para la muestra.
[Ejemplo 13] Determinación de IGF-1 en plasma
La determinación de IGF-1 en el plasma se llevó a cabo mediante ELISA usando el kit de ELISA Quantikine del IGF-I humano (R&D systems).
[Ejemplo 14] Resultados y discusión
(1) Determinación de la actividad de crecimiento celular utilizando células BaF3/hGHR
La Fig. 5 ilustra el resultado de la determinación de la actividad de crecimiento celular utilizando células BaF3/hGHR, una figura producida representando la absorbancia a 490 nm en el eje vertical y la concentración molar (nM) para cada muestra en el eje horizontal. Los valores de CE50 para cada muestra determinada a partir de esta figura se muestran en la Tabla 1.
[Tabla 1]
Tabla 1. Valores de CE50 para cada muestra (valores de la actividad de crecimiento celular usando células
BaF3/hGHR
Figure imgf000020_0002
Como se ve en la Tabla 1, los valores de CE50 de HSA-22KhGH y mHSA-22KhGH, es decir, 22KhGH unida al extremo C de la seroalbúmina humana, fueron 1,38x0-1 nM y 1,53x10-1 nM, respectivamente, lo que indica que ambas tenían actividades de crecimiento celular aproximadamente equivalentes. Además, en cuanto a 22KhGH-HSA y 22KhGH-mHSA, es decir, 22KhGH unida al extremo N de la seroalbúmina humana, sus valores de CE50 fueron 8,78x10'1 nM y 1,20 nM, lo que indica que estas dos tenían también actividades de crecimiento celular en gran medida equivalentes entre sí.
Por otro lado, la comparación de los valores de CE50 entre HSA-22KhGH y 22KhGH-HSA mostraron que los valores de CE50 de 22KhGH-HSA eran aproximadamente 6,4 veces los valores de CE50 de HSA-22KhGH, y la comparación de los valores de CE50 entre mHSA-22KhGH y 22KhGH-mHSA mostró que los valores de CE50 de 22KhGH-mHSA eran aproximadamente 7,8 veces los valores CE50 de mHSA-22KhGH.
Los resultados indican que cuando se prepara una proteína de fusión mediante la unión de 22KhGH con seroalbúmina humana, la unión de 22KhGH al extremo C de la seroalbúmina humana proporcionará una proteína de fusión que presenta una mayor actividad de crecimiento celular de 22KhGH que su unión al extremo N de la seroalbúmina humana, al menos in vitro. Así, los resultados anteriores sugieren que cuando se produce un agente terapéutico para el tratamiento del enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento uniendo 22KhGH con seroalbúmina humana, se prefiere unir 22KhGH al extremo C de la seroalbúmina humana.
(2) Análisis farmacodinámico usando monos cinomolgos
La figura 6 ilustra el resultado del análisis farmacodinámico de las proteínas de fusión HSA-hGH producidas mediante la representación gráfica de la concentración de las proteínas de fusión HSA-hGH (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA y 22KhGH-mHSA) en la sangre de monos cinomolgos en el eje vertical, y el tiempo transcurrido después de la administración de las proteínas de fusión HSA-hGH en el eje horizontal. Cmáx, AUC0-216 h, AUCü-inf y t-iop obtenidos a partir de esta figura se muestran en la Tabla 2.
[Tabla 2]
Tabla 2. Farmacodinámica de cada muestra
Figure imgf000020_0001
continuación
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Como se observa en la Tabla 2, en cuanto al AUC, el AUCo-inf de HSA-22KhGH y mHSA-22KhGH, que se produjeron uniendo 22KhGH al extremo C de la seroalbúmina humana, fueron 752±55 |jg h/ml, y 737 |jg h/ml, respectivamente. Por el contrario, el AUCo-inf de 22KhGH-HSA y 22KhGH-mHSA, que se produjeron uniendo 22KhGH al extremo N de la seroalbúmina humana, fueron 2220 jg- h/ml y 3260 jg h/ml, respectivamente. El resultado demuestra que el producto producido uniendo 22KhGH al extremo N de la seroalbúmina humana es mucho más estable en la sangre que el producto producido al unir 22KhGH al extremo C de la seroalbúmina humana. Además, HSA-22KhGH y mHSA-22KhGH, ambas producidas uniendo 22KhHG al extremo C de la seroalbúmina humana presentaron valores del AUCoinf equivalentes, mientras que en la comparación con 22KhGH-HSA y 22KhGH-mHSA, que se produjeron uniendo 22KhGH al extremo N de la seroalbúmina humana, el valor del AUCo-inf para 22KhGH-mHSA resultó ser de hasta 1,47 veces el valor de 22KhGH-HSA, lo que indica que 22KhGH-mHSA es particularmente estable en la sangre.
Los resultados anteriores muestran inesperadamente que la estabilidad de la proteína de fusión resultante en la sangre varía mucho si el extremo N de la hormona del crecimiento humana está unido al extremo C de la seroalbúmina humana o, por el contrario, el extremo N de la seroalbúmina humana se une al extremo C de la hormona del crecimiento humana, y en el último caso se puede lograr una estabilidad mucho mayor. Además, los resultados indican que la estabilidad de la hormona del crecimiento humana en la sangre aumenta especialmente cuando el extremo N de la HSA(A320T) está unido al extremo C de la hormona del crecimiento humana, concretamente que HSA(A320T), tiene la capacidad de aumentar notablemente la estabilidad en la sangre de una proteína que está unida a su extremo N. Así, considerados en su conjunto, los resultados anteriores indican que como medio para estabilizar varias proteínas que se administrarán a humanos y otros mamíferos como medicamento, tal como la hormona del crecimiento o similares, es eficaz unir dichas proteínas con HSA(A320T), y en particular, unir su extremo C al extremo N de HSA(A320T), mediante un enlace peptídico por ejemplo.
(3) Análisis farmacodinámico usando monos cinomolgos
La Fig. 7 ilustra el resultado del análisis farmaodinámico de 22KhGH fusionada con HSA, en el que el eje vertical representa la concentración de IGF-1 y el eje horizontal el tiempo transcurrido después de la administración de la proteína de fusión HSA-22KhGH. IGF-1 es un polipéptido cuya secreción es inducida por la hormona del crecimiento y que tiene actividades tales como la promoción del crecimiento óseo. Se sabe que algunas de las actividades de la hGH se muestran a través de IGF-1.
Como se observa en la Fig. 7, en los animales a los que se administraron HSA-22KhGH o mHSA-22KhGH, es decir, los productos en los cuales 22KhGH estaba unida al extremo C de la seroalbúmina humana, la concentración de IGF-1 en el plasma mostraba el valor máximo, 1,5 veces el valor antes de la administración, al tercer día después de la administración en el caso de animales a los que se les administró HSA-22KhGH, y en el caso de animales a los que se les administró HSA-m22KhGH, el valor máximo, aproximadamente 2 veces el valor antes de la administración, el segundo día después de la administración. Posteriormente, sin embargo, la concentración de IGF-1 en plasma disminuyó y, a partir del quinto día después de la administración, se volvió comparable a la del control 22KhGH, en ambos casos. Además, como se ve en la Fig. 7, la concentración de IFG-1 en plasma no mostró un aumento notable después de la administración de 22KhGH. Esto parece ser debido a la breve semivida de 22KhGH en la sangre, aproximadamente 20 minutos, la concentración de IGF-1 ya había vuelto a su valor registrado antes de la administración cuando se tomaron muestras de sangre. Además, la concentración de IGF-1 en el plasma de los animales a los que se administró 22hGH aumentó el segundo día y mostró valores más altos hasta el noveno día que el valor registrado antes de la administración. Esto parece ser un efecto acumulado de 22KhGH, que solo se administró 7 días consecutivos.
Por otro lado, en cuanto a la concentración de IGF-1 en el plasma de animales a los que se les había administrado HSA-22KhGH o mHSA-22KhGH, es decir, los productos en los cuales 22KhGH estaba unida a la seroalbúmina humana en el extremo N, mostraban el valor máximo, aproximadamente 2,0 veces el valor antes de la administración, al séptimo día después de la administración en el caso de los animales a los que se les administró 22KhGH-HSA, y también en el caso de los animales a los que se les administró 22KhGH-mHSA, el valor máximo, aproximadamente 2,0 veces el valor antes de la administración, el séptimo día después de la administración. Además, en ambos casos, la concentración de IGF-1 en el plasma se mantuvo más alta que la del control 22KhGH, incluso en el noveno día después de la administración. Asimismo, la comparación entre HSA-22KhGH y mHSA-22KhGH muestra que, si bien la concentración de IGF-1 tendía a ser mayor con HSA-22KhGH hasta el tercer día después de la administración, la concentración de IFG-1 fue sistemáticamente mayor con mHSA-22KhGH desde el quinto día después de la administración. Esto indica que mHSA-22KhGH puede mantener la concentración de IGF-1 en la sangre en valores altos durante un período más largo que HSA-22KhGH.
Estos resultados muestran que el efecto farmacológico de la hormona del crecimiento puede ampliarse en gran medida al unirla al extremo N de HSA(A320T), lo que por lo tanto indica que 22KhGH-mHSA, el producto obtenido al unir el extremo C de la hormona del crecimiento al extremo N de HSA(A320T), se puede utilizar preferentemente como una hormona del crecimiento de larga duración cuya actividad farmacológica se mantiene más tiempo que las preparaciones convencionales de la hormona del crecimiento (Gorwjec™, etc.). Asimismo, los resultados anteriores indican que la actividad de una proteína fisiológicamente activa que se va a administrar a un animal como un medicamento o similar, se puede mantener en gran medida en el plasma uniéndola al extremo N de HSA(A320T), y que la unión de una proteína fisiológicamente activa a HSA(A320T) es un medio eficaz para proporcionar un tipo de medicamento de larga duración cuya actividad farmacológica dura un largo período de tiempo y, en particular, que es eficaz para unir el extremo C de una proteína fisiológicamente activa al extremo N de HSA(A320T) a través de un enlace peptídico.
Dado que la concentración de IGF-1 en plasma se mantuvo a niveles muy altos incluso a noveno día después de la administración, como se muestra en los animales a los que se les administró 22KhGH-mHSA, se espera razonablemente que 22KhGH-mHSA presente su actividad a un nivel suficiente si se administra en un intervalo de una vez cada 7-14 días a un paciente con enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, o similares. La Tabla 3 muestra ejemplos de dosificación de 22KhGH-mHSA cuando se administra a pacientes con enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, o similares. La dosis y los intervalos de dosificación que se muestran en la Tabla 3 deben ajustarse según se desee de acuerdo con los síntomas clínicos y los resultados de los exámenes, tal como la concentración de IGF-1. 22KhGH-mHSA se administra a un paciente, preferentemente en forma de inyección intramuscular o inyección subcutánea.
[Tabla 3]
Tabla 3. Indicaciones dosis de 22KhGH-mHSA
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[Ejemplo de preparación 1] Inyección acuosa
Hidrogenofosfato de sodio, heptahidrato 1,33 mg
Dihidrogenofosfato de sodio 1,57 mg
Polioxietilen (160) polioxipropilen (30) glicol 3 mg
Alcohol bencílico 13,5 mg
D-manitol 52,5 mg
22KhGH-mHSA 1 mg
Los componentes anteriores se disuelven en sus proporciones respectivas en agua para inyección, y después del ajuste del pH hasta 6,0-6,4, se completan hasta un volumen de 1,5 ml para proporcionar una inyección acuosa.
[Ejemplo de preparación 2] Inyección acuosa
L-histidina 1 mg
Fenol 4,5 mg
Polioxietilen (160) polioxipropilen (30) glicol 4,5 mg
D-manitol 60 mg
22KhGH-mHSA 1 mg
Los componentes anteriores se disuelven en sus proporciones respectivas en agua para inyección, y después del ajuste del pH hasta 6,0-6,4, se completan hasta un volumen de 1,5 ml para proporcionar una inyección acuosa.
[Ejemplo de preparación 3] Preparación liofilizada
Hidrogenofosfato de sodio, heptahidrato 2,475 mg
Dihidrogenofosfato de sodio 0,394 mg
Cloruro de sodio I , 125 mg
Ácido aminoacético I I , 25 mg
D-manitol 22,5 mg
22KhGH-mHSA 1 mg
Se disuelve una preparación liofilizada de la composición anterior en 1 ml de agua para inyección que contiene 9,7 mg de alcohol bencílico.
Aplicabilidad industrial
Dado que la presente invención aumenta la estabilidad en la sangre de una proteína de interés para administrar a un animal como una medicamento, posibilita la provisión de un nuevo medicamento que permite reducir la dosis de dicha proteína cuando se administra.
[Lista de signos de referencia]
1 Promotor LacZ
2 Promotor mPGK
3 Secuencia parcial del sitio interno de entrada del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón de tipo silvestre que incluye la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:7
3a Secuencia parcial del sitio interno de entrada del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis de ratón que incluye la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:8
4 Región de poliadenilación de mPGK (mPGKpA)
5 Secuencia de nucleótidos que contiene EP-1p y su primer intrón
6 Región de poliadenilación tardía de SV40
7 Región que contiene el promotor temprano de SV40
8 Región de poliadenilación sintética
9 Región que contiene el promotor de citomegalovirus
10 Gen de la glutamina sintetasa
[Texto libre del listado de secuencias]
SEQ ID NO:3: Mutante de la seroalbúmina humana (A320T)
SEQ ID NO:4: Ejemplo de enlazador
SEQ ID NO:5: Ejemplo de enlazador
SEQ ID NO:6: Ejemplo de enlazador
SEQ ID NO:8: Secuencia parcial del IRES del virus de la encefalomiocarditis murina de tipo mutante, sintética SEQ ID NO:11: 22KhGH-mHSA, madura
SEQ ID NO:12: 20KhGH-mHSA, madura
SEQ ID NO:13: Cebador Hyg-Sfi5', sintético
SEQ ID NO:14: Cebador Hyg-BstX3', sintético
SEQ ID NO:15: IRES-Hygr-mPGKpA, sintético
SEQ ID NO:16: Secuencia de aminoácidos que corresponde al gen de resistencia a higromicina
SEQ ID NO:17: Cebador IRES5', sintético
SEQ ID NO:18: Cebador IRES3', sintético
SEQ ID NO:19: Cebador mPGKP5', sintético
SEQ ID NO:20: Cebador mPGKP3', sintético
SEQ ID NO:21: mPGKp, sintético
SEQ ID NO:22: Cebador GS5', sintético
SEQ ID NO:23: Cebador GS3', sintético
SEQ ID NO:24: Cebador puro5', sintético
SEQ ID NO:25: Cebador puro3', sintético
SEQ ID NO:26: Secuencia que contiene el gen de resistencia a puromicina
SEQ ID NO:27: Secuencia de aminoácidos que corresponde al gen de resistencia a puromicina
SEQ ID NO:28: Cebador SV40polyA5', sintético
SEQ ID NO:29: Cebador SV40polyA3', sintético
SEQ ID NO:30: Cebador mIRES-GS5', sintético
SEQ ID NO:31: Cebador mIRES-GS3', sintético
SEQ ID NO:32: HSA-22KhGH, madura
SEQ ID NO:33: Secuencia que contiene el gen HSA-22KhGH, sintético

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana y una segunda cadena polipeptídica unida a la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de otra proteína (A),
en donde
el mutante de la seroalbúmina humana que comprende una secuencia de aminoácidos que, en comparación con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, carece de no más de 10 restos de aminoácidos y/o no tiene más de 10 restos de aminoácidos reemplazados, con la condición de que el resto de asparagina que se encuentra en la posición 318 y la treonina en la posición 320 del extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID n O:3 se conserven y se unan por enlaces peptídicos mediante un único resto de aminoácido (X) excepto la prolina que está situada entre esos dos restos de aminoácidos, y
en donde la proteína (A) es la hormona del crecimiento 22K o la hormona del crecimiento 20K.
2. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el resto de aminoácido (X) es tirosina.
3. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de la seroalbúmina humana consiste en la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3.
4. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, en la que el mutante de la seroalbúmina humana, en comparación con la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, no tiene más de 10 aminoácidos añadidos fuera de la región correspondiente a las posiciones 318-320 del extremo N de la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:3, y no es idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2.
5. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana, en la que el mutante de la seroalbúmina humana no tiene más de 10 restos de aminoácidos añadidos a los extremos N o C en comparación con la secuencia de aminoácidos del mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, y no es idéntica a la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2.
6. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, en la que
(a) el extremo C de la segunda cadena polipeptídica está unido al extremo N de la primera cadena polipeptídica o b) el extremo N de la segunda cadena polipeptídica está unido al extremo C del primer polipéptido
por uno o más enlaces peptídicos.
7. La proteína unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la unión mediante enlaces peptídicos incluye enlaces peptídicos con un enlazador.
8. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el enlazador consiste en 1-50, preferentemente en 1-6 restos de aminoácidos.
9. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el enlazador se selecciona del grupo que consiste en Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, y las secuencias de aminoácidos descritas como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6.
10. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el enlazador está representado por la secuencia de aminoácidos Gly-Ser.
11. La proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
12. Un medicamento que comprende una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-11 como el principio activo.
13. Un medicamento que comprende una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-11 como el principio activo para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento, enanismo en el síndrome de Turner, enanismo por insuficiencia renal crónica, enanismo en el síndrome de Prader-Willi, enanismo en la acondroplasia y enanismo en el contexto de pequeño para la edad gestacional, acompañado de ausencia del cierre epifisario; y deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos, consumo provocado por el SIDA y consumo provocado por la anorexia.
14. Un ADN que comprende un gen que codifica la proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-11.
15. Un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Una célula de mamífero transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 15.
17. Una proteína (A) unida a un mutante de la seroalbúmina humana que se puede obtener cultivando la célula de mamífero de acuerdo con la reivindicación 16 en un medio sin suero.
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