KR20180042432A - 신규 인간 혈청 알부민 변이체 - Google Patents

신규 인간 혈청 알부민 변이체 Download PDF

Info

Publication number
KR20180042432A
KR20180042432A KR1020187009487A KR20187009487A KR20180042432A KR 20180042432 A KR20180042432 A KR 20180042432A KR 1020187009487 A KR1020187009487 A KR 1020187009487A KR 20187009487 A KR20187009487 A KR 20187009487A KR 20180042432 A KR20180042432 A KR 20180042432A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
glu
ala
lys
val
Prior art date
Application number
KR1020187009487A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102360744B1 (ko
Inventor
겐이치 다카하시
아야 요시오카
히데토 모리모토
마사후미 기노시타
Original Assignee
제이씨알 파마 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제이씨알 파마 가부시키가이샤 filed Critical 제이씨알 파마 가부시키가이샤
Publication of KR20180042432A publication Critical patent/KR20180042432A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102360744B1 publication Critical patent/KR102360744B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

생리 활성 단백질과 연결시켜 그 단백질의 혈중 안정성을 높일 수 있는 인간 혈청 알부민 변이체 및 이것을 연결시킨 단백질이 개시되어 있다. 당해 연결시킨 단백질은, 그 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 10 개 이하의 아미노산 잔기가 결실하고 및/또는 10 개 이하의 아미노산 잔기가 치환되어 이루어지는 아미노산 서열로서, 단 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째의 아스파라긴 잔기 및 320 번째의 트레오닌 잔기가 이들 2 잔기의 사이에 프롤린 이외의 단일의 아미노산 잔기 (X) 를 개재하여 펩티드 결합에 의해 연결된 상태로 보존되어 있는 것인 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는, 인간 혈청 알부민 변이체, 및 이것을 연결시킨 생리 활성 단백질이다.

Description

신규 인간 혈청 알부민 변이체
본 발명은, 생리 활성을 갖는 단백질과 연결시킴으로써, 당해 단백질의 혈중 안정성을 높일 수 있는 신규 인간 혈청 알부민 변이체, 및 당해 인간 혈청 알부민 변이체와 생리 활성을 갖는 단백질을 연결시킨 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (HSA 변이체 연결 단백질), 예를 들어 인간 혈청 알부민 변이체 연결 인간 성장 호르몬에 관한 것이다.
인간 혈청 알부민 (HSA) 은, 그 성숙형이 585 개의 아미노산으로 이루어지는 단백질이다. HSA 는, 혈장 단백질 중에서는 가장 양이 많은 성분으로, 혈장 중에서의 반감기가 14 ∼ 20 일로 길다. HSA 는, 혈장의 삼투압의 조절에 기여함과 함께, 혈중의 양이온, 지방산, 호르몬류, 빌리루빈 그 밖의 내인성 물질 및 약제 등의 외인성 물질과 결합하여 그것들을 운반하는 기능을 갖는다. 일반적으로, HSA 와 결합한 물질은, 장기에 취입되기 어려워져, 혈중을 보다 장시간 순환할 수 있게 된다.
인간 혈청 알부민 (HSA) 에는, 천연 배리언트가 복수 있는 것이 알려져 있다. 인간 혈청 알부민 Redhill 은 그 하나이다 (비특허문헌 1, 2). 인간 혈청 알부민 Redhill 은, 585 개의 아미노산으로 이루어지는 상기의 통상적인 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열과 비교하여, 그 N 말단측으로부터 320 번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌이고, 또한 그 N 말단에 아르기닌 잔기가 하나 부가되어 있는 점에서 상이하고, 586 개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 알라닌의 트레오닌으로의 변화에 의해, 알부민 Redhill 에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr 로 표시되는 서열이 생기고, 이 서열 중의 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화 된다. 이 때문에 알부민 Redhill 은, 상기의 통상적인 인간 혈청 알부민과 비교하여 분자량이 2.5 kDa 정도 크게 관찰된다.
효소 등의 단백질의 혈장 중에서의 안정성을, 당해 단백질에 HSA 를 융합시킴으로써 증가시키는 방법이 보고되어 있다 (비특허문헌 3, 특허문헌 1, 2). HSA 와 효소 등의 융합 단백질은, HSA 를 코드하는 유전자와 효소 등의 단백질을 코드하는 유전자를 인프레임에 결합시킨 DNA 를 삽입한 발현 벡터를 도입한 형질 전환 세포를 제조하고, 이 세포를 배양함으로써, 배지 중 또는 세포 내에 재조합 단백질로서 제조된다.
인간 혈청 알부민 (HSA) 과 융합시켜 혈장 중에서의 안정성을 증가시킨 단백질의 예로는, HSA 와 G-CSF 의 융합 단백질 (특허문헌 1, 3), HSA 와 인터페론 α 의 융합 단백질 (특허문헌 4), HSA 와 GLP-1 의 융합 단백질 (특허문헌 5), HSA 와 인슐린의 융합 단백질 (특허문헌 6), HSA 와 에리트로포이에틴의 융합 단백질 (특허문헌 7), HSA 와 성장 호르몬의 융합 단백질 (특허문헌 4, 5 및 8 ∼ 11) 등이 있다.
인간 성장 호르몬 (hGH) 은, 시상 하부의 제어하에서 하수체 전엽으로부터 분비되는 단백질이다. hGH 는, 연골 형성 촉진, 단백질 동화 촉진 등의 성장 촉진 활성을 나타내는 것 외에, 체 조성 (體組成) 및 지질 대사 개선 작용을 나타낸다. hGH 의 분비가 적은 소아는, 정상아와 비교하여 저신장을 나타내는 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증을 발증한다.
hGH 유전자를 도입한 대장균을 사용하여 재조합 단백질로서 제조된 분자량 약 22 KD 의 hGH 를 유효 성분으로서 함유하는 제제 (hGH 제제) 가, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에 있어서의 저신장, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 SGA (Small-for-Gestational Age) 성 저신장증, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증, 연골 이영양증 (異營養症) 에 있어서의 저신장증의 치료제로서 널리 임상 응용되고 있다. hGH 제제는, 피하 또는 근육 내에 투여되어 혈중을 순환하고, 그 성장 촉진 활성에 의해 환자의 성장을 재촉하는 효과를 발휘한다. 또, hGH 제제는, 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 치료제로서도 널리 임상 응용되고 있다. 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에서는, 지질 대사 이상 등 각종 이상이 확인되지만, hGH 제제의 투여에 의해, 환자의 지질 대사가 정상화되는 등, 환자의 QOL 이 개선된다. 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 분비 부전증 등에 대한 hGH 제제로는, 예를 들어, 그로우젝트 (등록상표) 가 있다.
혈장 중에 있어서의 hGH 의 안정성을 증가시키는 시도는, 임상상의 요청에 의한 것이다. hGH 의 혈장 중에 있어서의 반감기는 20 분 미만으로 되어 있고, 환자에게 투여된 hGH 는, 신속하게 혈중으로부터 소실된다. 이 때문에, hGH 의 약효를 환자에게서 실질적으로 발휘시키려면, 환자에게 hGH 를 주 3 회 근육 내에 또는 매일 피하에 투여할 필요가 있다. 이와 같은 빈번한 투여는 환자의 부담이 되고 있다. 따라서, hGH 의 혈장 중에 있어서의 안정성을 증가시켜 반감기를 연장시킴으로써 환자에 대한 hGH 의 투여 횟수를 줄일 수 있으면, 환자의 부담을 경감시킬 수 있어 바람직하다.
일본 공표특허공보 평7-503368호 일본 공개특허공보 평3-178998호 일본 공표특허공보 평7-503844호 일본 공표특허공보 2003-530838호 일본 공표특허공보 2005-514060호 일본 공표특허공보 2010-500031호 일본 공개특허공보 2011-015690호 일본 공표특허공보 2000-502901호 일본 공표특허공보 2008-518615호 일본 공표특허공보 2013-501036호 일본 공표특허공보 2013-518038호
Brand S. et al., Clin Chim Acta. 136, 197-202 (1984) Brennan SO. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 87, 26-30 (1990) Poznansky MJ. et al., FEBS Letter. 239, 18-22 (1988)
상기 배경하에서, 본 발명의 하나의 목적은, 원하는 생리 활성 단백질 (본 명세서에 있어서 단백질 (A) 라고도 한다.) 과 결합시킴으로써 그 생리 활성 단백질의 혈중 안정성을 높일 수 있는, 신규 인간 혈청 알부민 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가적인 하나의 목적은, 원하는 단백질 (예를 들어, 성장 호르몬) 과, 이것에 연결된 당해 인간 혈청 알부민 변이체를 포함하여 이루어지는, 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 더 추가적인 하나의 목적은, 원하는 단백질을 당해 인간 혈청 알부민 변이체와 연결시킴으로써, 당해 단백질의 혈중 안정성을 높이는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 향한 연구에 있어서 검토를 거듭한 결과, 585 개의 아미노산으로 이루어지는 통상적인 인간 혈청 알부민과 비교하여 그 N 말단으로부터 320 번째의 아미노산 잔기인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되어 있는 것인 아미노산 서열로 이루어지는 변이체 (인간 혈청 알부민 변이체) 를 인간 성장 호르몬 (hGH) 과 연결시켜 얻은 화합물 (인간 혈청 알부민 변이체 연결 hGH) 이, 이것을 생체에 투여했을 때에, 원래의 인간 성장 호르몬에 비해 현저하게 높은 혈중 안정성을 나타내는 것을 알아내어, 더욱 검토를 계속하여 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
1. 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 결실하고 및/또는 10 개 이하의 아미노산 잔기가 치환되어 이루어지는 아미노산 서열로서, 단 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째의 아스파라긴 잔기 및 320 번째의 트레오닌 잔기가 이들 2 잔기의 사이에 프롤린 이외의 단일의 아미노산 잔기 (X) 를 개재하여 펩티드 결합에 의해 연결된 상태로 보존되어 있는 것인 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는, 인간 혈청 알부민 변이체.
2. 그 아미노산 잔기 (X) 가 티로신인, 상기 1 의 인간 혈청 알부민 변이체.
3. 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 청구항 2 의 인간 혈청 알부민 변이체.
4. 상기 1 ∼ 3 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열에 대하여, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째 ∼ 320 번째에 대응하는 위치의 서열 부분 이외에 있어서, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 부가되어 이루어지고, 또한 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열과는 동일하지 않은 것인, 인간 혈청 알부민 변이체.
5. 상기 1 ∼ 3 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열에 대하여, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 N 말단 또는 C 말단에 부가되어 이루어지고, 또한 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열과는 동일하지 않은 것인, 인간 혈청 알부민 변이체.
6. 상기 1 ∼ 5 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 제 1 폴리펩티드 사슬과, 이것에 연결된 다른 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하여 이루어지는 것인, 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
7. (a) 그 제 1 폴리펩티드 사슬의 N 말단에 그 제 2 폴리펩티드 사슬의 C 말단이, 또는
(b) 그 제 1 폴리펩티드 사슬의 C 말단에 그 제 2 폴리펩티드 사슬의 N 말단이,
펩티드 결합을 개재하여 연결되어 있는 것인, 상기 6 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
8. 그 펩티드 결합을 개재한 연결이, 링커와의 펩티드 결합을 포함하는 것인, 상기 7 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
9. 그 링커가, 1 ∼ 50 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 상기 8 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
10. 그 링커가, 1 ∼ 6 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 상기 8 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
11. 그 링커가, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 상기 8 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
12. 그 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser 로 나타내는 것인, 상기 8 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
13. 그 단백질 (A) 가, 생체에 투여했을 때에 생리 활성을 나타내는 것인, 상기 6 ∼ 12 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
14. 그 단백질 (A) 가, α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 아릴술파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 황산 N-술파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸CoAα-글루코사미니드N-아세틸트랜스페라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산술파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, CLN1 ∼ 10 을 포함하는 리소좀 효소, PD-1 리간드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 인슐린, 프로락틴, 모틸린, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH), 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH), 갑상선 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 부갑상선 호르몬 (PTH) 트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 (SCF), 렙틴, 바소프레신, 옥시토신, 칼시토닌, 글루카곤, 가스트린, 세크레틴, 판크레오지민, 콜레시스토키닌, 안지오텐신, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인간 태반 락토겐 (HPL), 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG), 엔케팔린, 엔돌핀, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 2, 티모포이에틴, 티모스티물린, 흉선 액성 인자 (THF), 혈중 흉선 인자 (FTS), 티모신, 티믹 팩터 X, 종양 괴사 인자 (TNF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (tPA), 다이놀핀, 봄베신, 뉴로텐신, 세룰레인, 브래디키닌, 아스파라기나아제, 칼리크레인, 서브스탠스 P, 신경 성장 인자 (NGF), 모양체 신경 영양 인자 (CNTF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 글리아 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 선유아세포 성장 인자 (bFGF), 선유아세포 성장 인자 2 (FGF2), 혈관내 피증식 인자 (VEGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 거핵구 증식 분화 인자 (MGDF), 혈액 응고 인자 VII, 혈액 응고 인자 VIII, 혈액 응고 인자 IX, 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD), 염산 리소자임, 폴리믹신 B, 콜리스틴, 그라미시딘, 바시트라신, 위산 분비 억제 폴리펩티드 (GIP), 혈관 작동성 장 폴리펩티드 (VIP), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 성장 호르몬 분비 인자 (GRF), 상피 세포 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴, 소마토스타틴, 인슐린형 성장 인자 1 (IGF-1), 20K 성장 호르몬, 22K 성장 호르몬, 및 이들의 염 혹은 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 상기 6 ∼ 13 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
15. 그 단백질 (A) 가, 22K 성장 호르몬인, 상기 6 ∼ 12 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
16. 그 단백질 (A) 가, 20K 성장 호르몬인, 상기 6 ∼ 12 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
17. 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 상기 15 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
18. 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 상기 16 의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
19. 상기 6 ∼ 18 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A) 를 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는, 의약.
20. 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에 있어서의 저신장, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증, 연골 이영양증에 있어서의 저신장증, 및 SGA 성 저신장증으로서, 어느 것도 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 것, 그리고 성인 성장 호르몬 분비 부전증, AIDS 에 의한 소모, 및 거식증에 의한 소모로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 치료제인, 상기 19 의 의약.
21. 상기 1 ∼ 5 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 DNA.
22. 상기 6 ∼ 18 중 어느 하나의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A) 를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 DNA.
23. 상기 21 또는 22 의 DNA 를 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
24. 상기 23 의 벡터로 형질 전환된 포유류 세포.
25. 상기 24 의 포유류 세포를, 무혈청 배지에서 배양함으로써 얻어지는, 인간 혈청 알부민 변이체 또는 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
본 발명에 의하면, 의약품으로서 동물 (사람을 포함한다) 에 투여되어야 할 생리 활성이 있는 원하는 생리 활성 단백질의 혈중 안정성을 높일 수 있다. 그 때문에, 그들의 생리 활성 단백질의 약효를 높일 수 있고, 그 약효의 지속 시간의 연장도 가져올 수 있다. 또 그에 따라, 그들의 생리 활성 단백질의 투여량이나 투여 빈도를 줄이는 것도 가능해져, 환자의 QOL 의 향상을 가능하게 함과 함께, 종래의 빈번한 투여에서 기인하는 감염이나 의료 사고의 방지에도 기여할 수 있다.
도 1 은, pE-neo 벡터의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 2 는, pE-hygr 벡터의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3a 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3b 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3c 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3d 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3e 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3f 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3g 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3h 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 3i 는, pE-IRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 4 는, pE-mIRES-GS-puro 의 구축 방법을 나타내는 흐름도.
도 5 는, BaF3/hGHR 세포를 사용한 HSA-hGH 융합 단백질의 세포 증식 활성의 측정 결과를 나타내는 도면. 세로축은 490 ㎚ 의 흡광도, 가로축은 각 검체의 농도 (nM) 를 나타낸다. 세로로 그은 선은 표준 편차를 나타낸다.
도 6 은, 필리핀 원숭이를 사용한 HSA-hGH 융합 단백질의 약물 동태 해석의 결과를 나타내는 그래프. 세로축은 필리핀 원숭이 혈장 중의 HSA-hGH 융합 단백질의 농도 (ng/㎖), 가로축은 HSA-hGH 융합 단백질을 투여 후의 경과 시간 (시간) 을 나타낸다. 그래프 내의 세로로 그은 선은 표준 편차를 나타낸다.
도 7 은, 필리핀 원숭이를 사용한 HSA-hGH 융합 단백질의 약효 해석의 결과를 나타내는 그래프. 세로축은 HSA-hGH 융합 단백질을 투여 전의 농도를 100 ％ 로 했을 때의, 필리핀 원숭이 혈장 중의 IGF-1 의 농도 (％), 가로축은 HSA-hGH 융합 단백질을 투여 후의 경과 시간 (일) 을 나타낸다. 그래프 내의 세로로 그은 선은 표준 편차를 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 단순히 「인간 혈청 알부민」 또는 「HSA」 라고 할 때에는, 서열 번호 1 로 나타내는 585 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 통상적인 야생형의 인간 혈청 알부민에 더하여, 혈중의 내인성 물질 및 약제 등의 외인성 물질을 결합하여 운반하는 기능 등의 통상적인 야생형 인간 혈청 알부민으로서의 기능을 갖는 것인 한, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 1 개 또는 복수 개의 아미노산 잔기가, 치환, 결실, 및/또는 부가 (본 명세서에 있어서, 아미노산 잔기의 「부가」 는, 서열의 말단 또는 내부에 잔기를 추가하는 것을 의미한다.) 된 것에 상당하는 HSA 의 변이체도 특별히 구별하는 일 없이 포함한다. 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다. 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다. 예를 들어, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기가 결실한, 584 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 변이체도, 인간 혈청 알부민에 포함된다. 또, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합해도 된다. 또한, 통상적인 야생형의 HSA 또는 그 변이체의 아미노산 서열 중에 또는 당해 아미노산 서열의 N 말단측 혹은 C 말단측에, 1 개 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 부가 (「부가」 는 서열의 말단 또는 내부에 잔기를 추가하는 것을 의미한다.) 된 것이어도 된다. 이 때 부가되는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다.
이들 아미노산의 치환 및 결실, 및 부가의 3 종류의 변이 중, 적어도 2 종류의 변이를 조합하여 도입한 HSA 의 변이체로는, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 결실과, 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환과, 또한 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 부가를 실시하여 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 대한 그들 결실, 치환, 및/또는 부가되는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 각각 5 개 이하, 더욱 바람직하게는 3 개 이하이다.
본 발명에 있어서, 「인간 혈청 알부민 Redhill」 (HSA-Redhill) 의 단어는, 인간 혈청 알부민의 배리언트로서, 서열 번호 2 로 나타내는 586 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것을 의미한다. 인간 혈청 알부민 Redhill 은, 서열 번호 1 로 나타내는 585 개의 아미노산으로 이루어지는 야생형의 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열에 대하여, N 말단으로부터 320 번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌이고 또한 N 말단에 아르기닌 잔기가 하나 부가된 것에 상당한다. 이 알라닌의 트레오닌으로의 치환에 의해, 알부민 Redhill 에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr 로 표시되는 서열 부분이 생기고, 이 서열 부분 중의 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화 되어 있다. 이 때문에 알부민 Redhill 은, 통상적인 야생형 알부민 (서열 번호 1) 과 비교하여 분자량이 2.5 kDa 정도 크게 관찰된다.
본 발명에 있어서, 「인간 혈청 알부민 변이체」 (HSA 변이체) 의 단어는, 통상적인 야생형 HSA (서열 번호 1) 에 대한 상기 서술한 변이체로서, 단 서열 번호 2 로 나타내는 배리언트 (HSA-Redhill) 이외의 것을 말한다. 본 발명에 있어서 바람직한 HSA 변이체는, 서열 번호 3 으로 나타내는 것에 더하여, 혈중의 내인성 물질 및 약제 등의 외인성 물질을 결합하여 운반하는 기능 등의 통상적인 야생형 인간 혈청 알부민으로서의 기능을 갖는 것인 한, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 1 개 또는 복수 개의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 결실하고, 혹은 부가된 아미노산 서열로서, 단 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째의 아스파라긴 잔기 및 320 번째의 트레오닌 잔기가, 이들 2 잔기의 사이에 프롤린 이외의 단일의 아미노산 잔기 (X) 를 개재하여 펩티드 결합에 의해 연결된 상태로 보존되어 있는 것인 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 당해 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다. 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다. 예를 들어, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기가 결실한, 584 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 변이체여도 된다. 또, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합한 것이어도 된다. 또한, 그들 변이체의 아미노산 서열 중에 또는 당해 아미노산 서열의 N 말단측 혹은 C 말단측에, 1 개 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 부가된 것이어도 된다. 즉, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 아미노산의 치환 및 결실, 및 부가의 3 종류의 변이 중, 적어도 2 종류의 변이를 조합하여 도입한 것으로서, 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 결실과, 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환과, 또한 0 ∼ 10 개의 아미노산 잔기의 부가를 실시한 것일 수 있다. 단, 서열 번호 3 에 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 ∼ 320 번째의 아미노산 잔기는 아스파라긴-X-트레오닌 (「X」 는 프롤린 이외의 아미노산 잔기) 이 아니면 안되고, 바람직하게는 아스파라긴-티로신-트레오닌이다.
본 발명의 각종 HSA 변이체에 있어서의 통상적인 야생형 HSA 와 비교했을 때의 각 변이의 위치 및 그 형식 (결실, 치환, 부가) 은, 양 (兩) HSA 의 아미노산 서열의 얼라이먼트에 의해, 용이하게 확인할 수 있다.
후술하는 실시예에 있어서 제조된 인간 혈청 알부민 변이체 (본 발명의 HSA 변이체의 전형적 일례) 는, 585 개의 아미노산으로 이루어지는 야생형의 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 에 대하여, N 말단으로부터 320 번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌인 점에 있어서만 상이하다 (서열 번호 3). 이 상위 (相違) 에 의해, 당해 HSA 변이체 (「HSA(A320T)」 라고 한다.) 에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr 로 표시되는 서열 부분이 생기고, 이 서열 부분에 있어서 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화 될 수 있다.
본 발명의 HSA 변이체는, 본 발명의 HSA 변이체를 코드하는 DNA 를 삽입한 발현 벡터를 제조하고, 이 발현 벡터를 사용하여 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 단백질로서 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 변이체에 연결되는 상대가 되는 생리 활성을 갖는 단백질 (본 명세서에 있어서, 「단백질 (A)」 라고도 한다.) 은, 혈청 알부민 (변이체인지 여부를 불문한다) 이외의 단백질로서 생리 활성을 갖는 것을 말한다. 또, 여기에 「생리 활성」 이란, 생체에 대하여 작용하여 어떤 특정한 생리적 변화를 가져오는 능력을 말하며, 예를 들어, 각종 효소 (예를 들어, 리소좀 효소군), 펩티드 호르몬 (단백질 호르몬), 신경 전달 물질, 성장 인자, 시그널 전달 인자 등, 각종 생리적 조절 (촉진, 억제) 에 관여하는 단백질을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 「인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A)」 또는 「HSA 변이체 연결 단백질 (A)」 의 단어는, 본 발명의 HSA 변이체가 연결되어 있는 단백질 (A) 를 말하며, 이것은 양자의 각 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드끼리를 연결시킴으로써 얻어지는 화합물이다. 여기서, 그들 폴리펩티드를 「연결시킨다」 란, 일방의 N 말단과 타방의 C 말단의 사이의 직접 펩티드 결합에 의한 경우 뿐만 아니라, 양 폴리펩티드를 링커를 개재하여 간접적으로 결합시키는 경우도 포함한다.
여기에 「링커」 는, 상기 2 개의 폴리펩티드의 사이에 있어 양자를 공유 결합으로 연결하는 구조 부분이며, 본 발명의 HSA 변이체와 그 연결 상대인 단백질 (A) 의 어느 쪽의 말단에도 유래하지 않는 것이다. 링커는, 양 폴리펩티드와 펩티드 결합한, 단일의 아미노산 잔기이거나 또는 2 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 사슬 부분 (펩티드 링커) 일 수 있으며, 이들 1 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 링커를, 본 명세서에 있어서 포괄적으로 「펩티드 링커」 라고 한다. 본 발명에 있어서 링커는, 펩티드 링커 이외의 2 가의 기로서 HSA 변이체와 단백질 (A) 의 사이를 공유 결합에 의해 연결하는 구조 부분일 수도 있으며, 그것들을 본 명세서에 있어서 「비펩티드 링커」 라고 한다. 또, 본 명세서에 있어서, HSA 변이체와 단백질 (A) 가 「펩티드 결합을 개재하여」 연결되어 있다라고 할 때에는, 양자가 직접 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 경우와 양자가 펩티드 링커와의 결합에 의해 연결되어 있는 경우를 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서, HSA 변이체와 단백질 (A) 가 직접 또는 펩티드 링커를 개재하여 결합되어 있는 경우, 당해 화합물인 「HSA 변이체 연결 단백질 (A)」 는, 「HSA 변이체 융합 단백질 (A)」 라고도 한다.
본 발명의 HSA 변이체와 단백질 (A) 가 펩티드 링커를 개재하여 연결되어 있을 때, 그 링커는, 바람직하게는 1 ∼ 50 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 17 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱더 바람직하게는 1 ∼ 6 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 예를 들어, 2 ∼ 17 개, 2 ∼ 10 개, 10 ∼ 40 개, 20 ∼ 34 개, 23 ∼ 31 개 또는 25 ∼ 29 개의 아미노산으로 구성되는 것이며, 또한 예를 들어, 1 개의 아미노산 잔기만으로, 또는 2 개, 3 개, 5 개, 6 개 또는 20 개의 아미노산 잔기로 구성되는 것이다. 펩티드 링커로 연결된 HSA 변이체 부분이 HSA 로서의 기능을 유지하고 또한 단백질 (A) 의 부분도 생리적 조건하에서 단백질 (A) 의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 펩티드 링커를 구성하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는 글리신과 세린으로 구성되는 것이다. 펩티드 링커의 적합한 예로서, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 4), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 5), Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 6) 로 이루어지는 것, 및 이들 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 들 수 있다. 이들 아미노산 서열 중 어느 1 종이 2 ∼ 10 회, 혹은 2 ∼ 5 회 연속해서 이루어지는 서열을 갖는 것도, 펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있으며, 또, 이들 아미노산 서열 중 어느 2 종 이상이 조합되어 1 ∼ 10 회, 혹은 2 ∼ 5 회 연속해서 이루어지는 서열을 갖는 것도, 펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다. 이들 아미노산 서열 중 어느 2 종 이상이 조합된 펩티드 링커의 적합한 것으로서, 아미노산 서열 Gly-Ser 에 이어서 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 5) 이 3 개 연속해서 이루어지는 합계 20 개의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
2 개의 상이한 폴리펩티드를 연결하는 방법으로는, 예를 들어, 일방의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 하류에, 인프레임으로 타방의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 결합시킨 DNA 를 삽입한 발현 벡터를 제조하고, 이 발현 벡터를 사용하여 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 융합 단백질로서 발현시키는 방법이 일반적이고, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다.
재조합체로서 형질 전환 세포에 발현시킴으로써 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 를 산생시키는 경우, 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리티드가, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단 중 어느 것에 연결된 형태의 융합 단백질이 얻어진다.
HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드의 N 말단측에 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 연결시키는 경우, 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 하류에, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 인프레임으로 연결시킨 DNA 를 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 펩티드 링커를 개재하여 2 개의 폴리펩티드를 간접적으로 연결시키는 경우에는, 2 개의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 사이에, 당해 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임으로 삽입된다.
HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 C 말단측에 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결시키는 경우, 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 상류에, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 인프레임으로 연결시킨 DNA 를 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 펩티드 링커를 개재하여 2 개의 폴리펩티드를 간접적으로 연결시키는 경우에는, 2 개의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 사이에, 당해 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임으로 삽입된다.
HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 를 숙주 세포에 산생시키려면, 그들 중 어느 것을 코드하는 DNA 를 삽입한 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된다. 이를 위해서 사용할 수 있는 숙주 세포는, 그러한 발현 벡터를 도입함으로써 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 를 발현시킬 수 있는 것인 한 특별히 제한은 없고, 포유 동물 세포, 효모, 식물 세포, 곤충 세포 등의 진핵 생물 세포, 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 중 어느 것이어도 되지만, 포유 동물 세포가 특히 적합하다. 단, 당사슬 수식된 단백질 (A) 로서 발현시키는 경우의 숙주 세포는, 포유 동물 세포, 효모, 식물 세포, 곤충 세포 등의 진핵 생물 세포에서 선택된다. 통상적으로 야생형의 HSA 의 320 번째의 아미노산 잔기가 트레오닌이 됨으로써 생기는 Asn-Tyr-Thr 로 표시되는 서열 부분의 Asn 잔기, 또는 Asn-X-Thr (「X」 는 프롤린 이외의 아미노산 잔기) 로 표시되는 서열 중의 Asn 잔기는, HSA 변이체 융합 단백질 (A) 의 발현을 진핵 생물 세포에서 실시시킴으로써 N-결합형 글리코시드화 된다.
포유 동물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우, 그 포유 동물 세포의 종류에 대해 특별히 한정은 없지만, 사람, 마우스, 차이니즈 햄스터 유래의 세포가 바람직하고, 특히 차이니즈 햄스터 난소 세포 유래의 CHO 세포, 또는 마우스 골수종에서 유래하는 NS/0 세포가 바람직하다. 또 이 때 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 를 코드하는 DNA 단편을 삽입하여 발현시키기 위해서 사용하는 발현 벡터는, 포유 동물 세포 내에 도입했을 때 그 유전자의 발현을 가져오는 것이면 특별히 한정없이 사용할 수 있다. 발현 벡터에 삽입된 그 유전자는, 포유 동물 세포 내에서 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 서열 (유전자 발현 제어 부위) 의 하류에 배치된다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 유전자 발현 제어 부위로는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α (EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터 등을 들 수 있다.
이와 같은 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 발현 벡터에 삽입되어 있는 단백질을 발현하게 되지만, 그 발현량은 개개의 세포에 따라 상이하고 똑같지는 않다. 따라서, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 를 효율적으로 생산하기 위해서는, 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포로부터, 이들의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하는 스텝이 필요해진다. 이 선택 스텝을 실시하기 위해서, 발현 벡터에는 선택 마커로서 작용하는 유전자가 삽입되어 있다.
선택 마커로서 가장 일반적인 것은 퓨로마이신, 네오마이신 등의 약제를 분해하는 효소 (약제 내성 마커) 이다. 포유 동물 세포는 통상적으로 일정 농도 이상의 이들 약제의 존재하에서 사멸한다. 그러나, 약제 내성 마커 유전자가 삽입된 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 발현된 약제 내성 마커에 의해 상기 약제를 분해하고, 이것을 무독화 또는 약독화할 수 있기 때문에, 상기 약제 존재하에서도 생존 가능해진다. 선택 마커로서 약제 내성 마커가 삽입된 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하고, 그 약제 내성 마커에 대응하는 약제를 함유하는 선택 배지 중에서, 그 약제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 약제 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 약제 내성 마커와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입된 목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 당해 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또, 선택 마커로서, 글루타민 합성 효소 (GS) 를 사용할 수도 있다. 글루타민 합성 효소는, 글루타민산과 암모니아로부터 글루타민을 합성하는 효소이다. 포유 동물 세포를, 글루타민 합성 효소의 저해제, 예를 들어 메티오닌술폭시민 (MSX) 을 함유하고, 또한 글루타민을 함유하지 않는 선택 배지 중에서 배양하면, 세포는 통상적으로 사멸한다. 그러나, 선택 마커로서 글루타민 합성 효소가 삽입된 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하면, 그 세포에서는, 글루타민 합성 효소의 발현 레벨이 상승하게 되므로, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능해진다. 이 때, MSX의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 MSX 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 글루타민 합성 효소와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입한 목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 당해 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또, 선택 마커로서, 디하이드로 엽산 리덕타아제 (DHFR) 를 사용할 수도 있다. DHFR 을 선택 마커로서 사용하는 경우, 발현 벡터를 도입한 포유 동물 세포는, 메토트렉세이트, 아미노프테린 등의 DHFR 저해제를 함유하는 선택 배지 중에서 배양된다. DHFR 저해제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 DHFR 저해제 존재하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, DHFR 과 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입한 목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 당해 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자의 하류측에 내부 리보솜 결합 부위 (IRES：internal ribosome entry site) 를 개재하여, 선택 마커로서 글루타민 합성 효소 (GS) 를 배치한 발현 벡터가 알려져 있다 (국제 특허공보 WO2012/063799, WO2013/161958). 이들 문헌에 기재된 발현 벡터는, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 의 제조에 특히 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 목적으로 하는 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 제 1 유전자 발현 제어 부위, 그리고, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한, 상기 제 1 유전자 발현 제어 부위의 또는 이것과는 다른 제 2 유전자 발현 제어 부위의 하류에 디하이드로 엽산 레닥타아제 유전자 또는 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어지는 발현 벡터는, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이 발현 벡터에 있어서, 제 1 유전자 발현 제어 부위 또는 제 2 유전자 발현 제어 부위로는, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α 프로모터 (hEF-1α 프로모터), 인간 유비퀴틴 C 프로모터가 적합하게 사용되지만, hEF-1α 프로모터가 특히 적합하다.
또, 내부 리보솜 결합 부위로는, 피코르나바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 코로나바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B 형 바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 바이러스의 게놈, 또는 인간 면역 글로불린 중쇄 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비트랙스 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자의 5' 비번역 영역에서 유래하는 것이 적합하게 사용되지만, 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위가 특히 적합하다. 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 사용하는 경우, 야생형의 것 이외에, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중 일부가 파괴된 것도 적합하게 사용할 수 있다. 또, 이 발현 벡터에 있어서, 적합하게 사용되는 약제 내성 유전자는, 바람직하게는 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자이고, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자이다.
또, 예를 들어, 목적으로 하는 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 인간 신장 인자-1α 프로모터, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한 다른 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 디하이드로 엽산 레닥타아제 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터로서, 그 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터로서, WO2013/161958 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
또, 예를 들어, 목적으로 하는 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 인간 신장 인자-1α 프로모터, 그 하류에 그 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한 다른 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터로서, 그 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터로서, WO2012/063799 에 기재된 pE-mIRES-GS-puro 및 WO2013/161958 에 기재된 pE-mIRES-GS-mNeo 를 들 수 있다.
야생형의 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위의 3' 말단에는, 3 개의 개시 코돈 (ATG) 이 존재하고 있고, 그 3 개의 개시 코돈을 포함하는 서열 부분은 서열 번호 7 (5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3'：개시 코돈의 ATG 를 대문자로 나타낸다) 로 나타낸다. 이 서열 부분 중의 개시 코돈 중 일부가 파괴된 것으로서, 예를 들어, 서열 번호 8 (5'-atgataagcttgccacaaccatg-3') 로 나타내는 것이 있으며, 상기의 pE-mIRES-GS-puro 및 pE-mIRES-GS-mNeo 는, 서열 번호 8 로 나타내는 서열을 포함하는 IRES 를 갖는 발현 벡터이다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 연결 단백질 (A) 를 코드하는 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 이들의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하기 위해서, 선택 배지 중에서 선택 배양된다.
선택 배양에 있어서, DHFR 을 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 DHFR 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, DHFR 저해제가 메토트렉세이트인 경우, 바람직하게는 0.25 ∼ 5 μM 이고, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 1.5 μM 이고, 더욱 바람직하게는 약 1.0 μM 이다.
GS 를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 GS 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, GS 저해제가 MSX 인 경우, 바람직하게는 100 ∼ 1000 μM 이고, 보다 바람직하게는 200 ∼ 500 μM 이고, 더욱 바람직하게는 약 300 μM 이다. 또 이 때, 일반적으로 글루타민을 함유하지 않는 배지가 선택 배지로서 사용된다.
퓨로마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 퓨로마이신의 최대 농도는, 바람직하게는 3 ∼ 30 ㎍/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 ㎍/㎖ 이고, 더욱 바람직하게는 약 10 ㎍/㎖ 이다.
네오마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 G418 의 최대 농도는, 바람직하게는 0.1 ㎎ ∼ 2 ㎎/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 1.5 ㎎/㎖ 이고, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎎/㎖ 이다.
또, 포유 동물 세포의 배양을 위한 배지로는, 선택 배양에서 사용하는 배지, 후술하는 재조합 단백질을 생산하기 위해서 사용하는 배지 (재조합 단백질 생산용 배지) 함께, 포유 동물 세포를 배양하여 증식시킬 수 있는 것이면, 특별히 한정없이 사용할 수 있지만, 바람직하게는 무혈청 배지가 사용된다. HSA 는 혈청 중에 포함되는 성분을 흡착하는 성질을 갖기 때문에, 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 HSA 를 생산한 경우에는, 혈청 중의 불순물을 흡착한 HSA 가 얻어지기 때문에, 그 후의 공정에서 이 불순물을 제거할 필요가 발생한다.
본 발명의 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합 단백질 (A) 는, 특히, 이들을 발현하고 있는 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻어지는 것이다. 무혈청 배지를 사용함으로써, HSA 에 대한 불순물의 흡착량을 저감할 수 있기 때문에, 그 후의 정제 공정을 간편화할 수 있다.
선택 배양에 의해 선택된 재조합 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 재조합 단백질의 생산에 사용된다 (재조합 단백질 산생 세포). 재조합 단백질의 생산은, 재조합 단백질 산생 세포를 재조합 단백질 생산용 배지 중에서 배양함으로써 실시된다. 이 배양을 생산 배양이라고 한다.
본 발명에 있어서, 재조합 단백질 생산용 배지로서 사용되는 무혈청 배지로는, 예를 들어, 아미노산을 3 ∼ 700 ㎎/ℓ, 비타민류를 0.001 ∼ 50 ㎎/ℓ, 단당류를 0.3 ∼ 10 g/ℓ, 무기 염을 0.1 ∼ 10000 ㎎/ℓ, 미량 원소를 0.001 ∼ 0.1 ㎎/ℓ, 뉴클레오티드를 0.1 ∼ 50 ㎎/ℓ, 지방산을 0.001 ∼ 10 ㎎/ℓ, 비오틴을 0.01 ∼ 1 ㎎/ℓ, 하이드로코르티손을 0.1 ∼ 20 ㎍/ℓ, 인슐린을 0.1 ∼ 20 ㎎/ℓ, 비타민 B12 를 0.1 ∼ 10 ㎎/ℓ, 푸트레신을 0.01 ∼ 1 ㎎/ℓ, 피루브산나트륨을 10 ∼ 500 ㎎/ℓ, 및 수용성 철 화합물을 함유하는 배지가 적합하게 사용된다. 원하는 바에 따라, 티미딘, 히포크산틴, 관용의 pH 지시약 및 항생 물질 등을 배지에 첨가해도 된다.
재조합 단백질 생산용 배지로서 사용되는 무혈청 배지로서, DMEM/F12 배지 (DMEM 과 F12 의 혼합 배지) 를 기본 배지로서 사용해도 되고, 이들 각 배지는 당업자에게 주지이다. 나아가 또, 무혈청 배지로서, 탄산수소나트륨, L-글루타민, D-글루코오스, 인슐린, 나트륨셀레나이트, 디아미노부탄, 하이드로코르티손, 황산철 (II), 아스파라긴, 아스파르트산, 세린 및 폴리비닐알코올을 포함하는 것인, DMEM(HG)HAM 개량형 (R5) 배지를 사용해도 된다. 나아가서는 시판되는 무혈청 배지, 예를 들어, CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지 (Thermo Fisher Scientific 사, 구 (舊) 라이프 테크놀로지즈사), IS cho-VTM 배지 (Irvine Scientific 사), EX-CELLTM 302 배지 또는 EX-CELLTM 325-PF 배지 (SAFC Biosciences 사) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있다.
HSA 변이체 연결 단백질 (A) 를 얻기 위해서는, 양 단백질을 따로 따로 제조하고, 각각의 폴리펩티드를 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커로 연결한다는 방법도 채용해도 된다. 비펩티드 링커의 예로는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 혹은 이들의 유도체, 또는 이들을 조합한 것을 사용할 수 있다. 한편, 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1 ∼ 50 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 사슬 혹은 그 유도체로서, 그 N 말단과 C 말단이, 각각 본 발명의 HSA 변이체 또는 원하는 단백질 중 어느 것과 펩티드 결합을 형성함으로써, 본 발명의 HSA 변이체와 원하는 단백질을 연결하는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG 를 사용하여 본 발명의 HSA 변이체와 단백질 (A) 를 연결시킨 것은, 이것을 특기하는 경우, HSA 변이체 PEG 연결 단백질 (A) 라고 한다. HSA 변이체 PEG 연결 단백질 (A) 는, HSA 변이체와 PEG 를 결합시키고 (PEG 화 HSA 변이체), 이것에 단백질 (A) 를 결합시킴으로써, 또는, 먼저 단백질 (A) 와 PEG 를 결합시키고 (PEG 화 생리 활성 단백질 (A)), 이것에 HSA 변이체를 결합시킴으로써, 제조할 수 있다. PEG 를 HSA 변이체 또는 단백질 (A) 와 결합시키려면, 카보네이트, 카르보닐이미다졸, 카르복실산의 활성 에스테르, 아즐락톤, 고리형 이미드티온, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미데이트, 또는 알데히드 등의 관능기로 수식된 PEG 가 사용된다. 이들 PEG 에 도입된 관능기가, 주로 본 발명의 HSA 변이체 및 단백질 (A) 의 아미노기와 반응함으로써, 본 발명의 HSA 변이체 및 단백질 (A) 가 공유 결합한다. 이 때 사용되는 PEG 의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량 (MW) 은, 바람직하게는 MW = 500 ∼ 60000 이고, 보다 바람직하게는 MW = 500 ∼ 20000 이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG 는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, PEG 화 HSA 변이체는, 본 발명의 HSA 변이체와 알데히드기를 관능기로서 갖는 폴리에틸렌글리콜 (ALD-PEG-ALD) 을, HSA/(ALD-PEG-ALD) 의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시킴으로써 얻어진다. 이어서, 상기 PEG 화 HSA 변이체를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 단백질 (A) 와 반응시킴으로써, HSA 변이체 PEG 연결 단백질이 얻어진다. 반대로, 먼저 단백질 (A) 와 ALD-PEG-ALD 를 결합시켜 PEG 화 단백질 (A) 를 제조하고, 이것과 본 발명의 HSA 변이체를 결합시킴으로써도, 본 발명의 HSA 변이체 PEG 연결 단백질 (A) 를 얻을 수 있다.
본 발명의 HSA 변이체와 연결시키는 단백질 (A) 는, 바람직하게는 생체에 투여했을 때에 생리 활성을 나타내는 단백질이며, 원하는 바에 따라 선택된다. 이와 같은 단백질로는, α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 아릴술파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 황산 N-술파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸CoAα-글루코사미니드N-아세틸트랜스페라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산술파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, CLN1 ∼ 10 을 포함하는 리소좀 효소, PD-1 리간드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 인슐린, 프로락틴, 모틸린, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH), 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH), 갑상선 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 부갑상선 호르몬 (PTH) 트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 (SCF), 렙틴, 바소프레신, 옥시토신, 칼시토닌, 글루카곤, 가스트린, 세크레틴, 판크레오지민, 콜레시스토키닌, 안지오텐신, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인간 태반 락토겐 (HPL), 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG), 엔케팔린, 엔돌핀, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 2, 티모포이에틴, 티모스티물린, 흉선 액성 인자 (THF), 혈중 흉선 인자 (FTS), 티모신, 티믹 팩터 X, 종양 괴사 인자 (TNF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (tPA), 데이노르핀, 봄베신, 뉴로텐신, 세룰레인, 브래디키닌, 아스파라기나아제, 칼리크레인, 서브스탠스 P, 신경 성장 인자 (NGF), 모양체 신경 영양 인자 (CNTF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 글리아 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 선유아세포 성장 인자 (bFGF), 선유아세포 성장 인자 2 (FGF2), 혈관내 피증식 인자 (VEGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 거핵구 증식 분화 인자 (MGDF), 혈액 응고 인자 VII, 혈액 응고 인자 VIII, 혈액 응고 인자 IX, 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD), 조직 플라스미노겐 액티베이터 (TPA), 염산 리소자임, 폴리믹신 B, 콜리스틴, 그라미시딘, 바시트라신, 위산 분비 억제 폴리펩티드 (GIP), 혈관 작동성 장 폴리펩티드 (VIP), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 성장 호르몬 분비 인자 (GRF), 상피 세포 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴, 소마토스타틴, 인슐린형 성장 인자 1 (IGF-1), 20K 성장 호르몬, 22K 성장 호르몬, 및 이들의 염, 혹은 변이체를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, HSA 변이체와 연결시켜야 할 단백질 (A) 는, 그것이 유래하는 생물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 포유 동물 유래의 단백질이고, 보다 바람직하게는, 인간, 아프리카 푸른 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터 등 설치류, 토끼, 개 유래의 단백질이며, 특히 바람직하게는 인간 유래의 단백질이다.
본 발명에 있어서, 단백질 (A) 는, 야생형의 것에 한정되지 않는다. 즉, 야생형의 아미노산 서열에 대하여, 1 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 및/또는 부가된 변이체로서, 원래의 단백질 (A) 의 생리 활성을 유지하는 것 외에, 야생형의 단백질 (A) 와 길항하여 기능하는 (이것은, 내인성의 단백질 (A) 의 작용에 영향을 미치는) 것이어도 된다. 치환, 결실, 및/또는 부가되어 있어도 되는 아미노산의 개수는, 각 변이 타입에 대해, 바람직하게는 1 ∼ 10 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 개이다. 이들 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가는 조합하여 일어날 수 있다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 단백질 (A) 는, HSA 변이체가 연결되어 있지 않은 원래의 단백질 (A) 에 비해, 혈중에서의 안정성이 높아져 반감기가 길어진다. 투여 경로나 투여량에 따라 변동은 하지만, 피하 주사로 필리핀 원숭이에 투여했을 때의 혈중 반감기 (t1/2β) 가 대체로 5 시간 이상으로, 혈중에서 매우 안정적이 된다. 예를 들어, 본 발명의 HSA 변이체 연결 인간 성장 호르몬의 혈중 반감기 (t1/2β) 는, 0.5 ∼ 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 웅성 필리핀 원숭이에 단회 피하 투여했을 때, 혈중 반감기 (t1/2β) 는, 5 ∼ 40 시간이다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 단백질 (A) 는, 생체에 투여했을 때에 단백질 (A) 의 부분이 나타내는 활성에 의해, 의약으로서 사용할 수 있다. 여기에, 「생체」 란, 사람을 포함하는 포유류, 특히 바람직하게는 사람의 생체이다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 단백질 (A) 는 혈중에서의 안정성이 높아져 있기 때문에, 종래에는 혈중에서 불안정하여 투여 후 곧바로 분해되어 충분한 약효를 나타낼 수 없었던 단백질 (A) 라도, 이것에 본 발명의 HSA 변이체를 연결시킴으로써, 혈중에서 안정화시키고 그 생리 활성을 발휘시키는 것이 가능해져, 의약으로서의 개발의 길이 열린다.
또, 종래 의약으로서 사용 가능하였던 단백질 (A) 라도, 이것에 본 발명의 HSA 변이체를 연결시킴으로써, 혈중에서의 안정성을 더욱 향상시켜 장기에 걸쳐 활성을 유지한 상태에서 혈중에 머무르게 할 수 있기 때문에, 단백질 (A) 의 투여 빈도 또는 투여량을 줄이는 것이 가능해진다. 예를 들어, 매일 투여가 필요한 의약의 투여 빈도를, 본 발명의 HSA 변이체와 연결시킴으로써, 예를 들어 3 ∼ 30 일마다의 투여로 할 수 있다. 또, 당해 의약의 투여량을, 몰비로 예를 들어 1/3 ∼ 1/100 으로까지 줄일 수 있다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 단백질 (A) 를 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 의약은, 주사제로서 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하에 투여할 수 있다. 의약의 투여 경로는, 그 제형, 적용증 등에 따라 적절히 선택된다. 그들 주사제는, 동결 건조 제제 또는 수성 액제로서 공급할 수 있다. 수성 액제로 하는 경우, 바이알에 충전한 형태로 해도 되고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형 제제로서 공급할 수도 있다. 동결 건조 제제의 경우, 사용 전에 수성 매질에 용해하고 복원하여 사용한다.
본 발명의 HSA 변이체와 연결시켜야 할 단백질 (A) 의 하나로서 인간 성장 호르몬을 들 수 있다. 인간 성장 호르몬에는, 주로 22K 인간 성장 호르몬과 20K 인간 성장 호르몬의 분자량이 상이한 2 종류가 있다. 22K 성장 호르몬은, 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 191 개의 아미노산으로 구성되는 단백질이다. 통상적으로, 「인간 성장 호르몬 (또는 hGH)」 이라고 할 때에는, 이 22K 성장 호르몬을 의미하지만, 본 명세서에 있어서, 단순히 「인간 성장 호르몬 (또는 hGH)」 이라고 할 때에는, 22K 인간 성장 호르몬과 20K 인간 성장 호르몬의 쌍방을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 단순히 「22K 인간 성장 호르몬 (또는 22KhGH)」 이라고 할 때에는, 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 야생형의 22KhGH 에 더하여, 이에 대하여 1 개 또는 복수 개의 아미노산이, 치환, 결실 및/또는 부가된 것인 22KhGH 변이체로서 성장 촉진 활성을 갖는 것도 포함된다. 치환, 결실 및/또는 부가되어도 되는 아미노산의 개수는, 각 변이 타입에 대해, 바람직하게는 1 ∼ 8 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 4 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 2 개이다.
야생형의 20K 인간 성장 호르몬은, 야생형의 22K 성장 호르몬 (서열 번호 9) 을 구성하는 191 개의 아미노산 중 N 말단으로부터 세어 32 번째 ∼ 46 번째의 15 개의 아미노산이 결실한 것에 상당하고, 176 개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열 (서열 번호 10) 로 이루어지는, 성장 촉진 활성을 갖는 단백질이다. 단, 본 명세서에 있어서, 단순히 「20K 인간 성장 호르몬 (또는 20KhGH)」 이라고 할 때에는, 서열 번호 10 으로 나타내는 야생형의 20KhGH 에 더하여, 당해 서열에 대하여, 1 개 또는 복수 개의 아미노산이, 치환, 결실 및/또는 부가된 것에 상당하는 20KhGH 의 변이체로서 성장 촉진 활성을 갖는 것도 포함된다. 치환, 결실 및/또는 부가되어도 되는 아미노산의 개수는, 각 변이 타입에 대해, 바람직하게는 1 ∼ 8 개이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 4 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 2 개이다.
hGH 유전자를 도입한 대장균을 사용하여 재조합 단백질로서 제조된 분자량 약 22KD 의 hGH 를 유효 성분으로서 함유하는 제제 (hGH 제제) 가, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에 있어서의 저신장, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 SGA 성 저신장증, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증, 및 연골 이영양증에 있어서의 저신장증의 치료제로서 널리 임상 사용되고 있다. hGH 제제는, 피하 또는 근육내에 투여됨으로써 성분의 hGH 가 혈중을 순환하고, 그 성장 촉진 활성에 의해 환자의 성장을 촉진하는 효과를 발휘한다. 또, hGH 제제는, 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 치료제로서도 널리 임상 사용되고 있다. 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에서는, 지질 대사 이상이 확인되지만, hGH 제제의 투여에 의해, 환자의 지질 대사 등이 정상화되고, 환자의 QOL 이 개선된다. AIDS 에 의한 소모 치료제로서도 성장 호르몬은 임상 응용되고 있다. 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 분비 부전증 등의 hGH 제제로는, 예를 들어, 그로우젝트 (등록상표) 가 있다.
본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 변이체 (mHSA) 의 연결 상대인 단백질 (A) 로서 인간 성장 호르몬을 채용한 것을, 「인간 혈청 알부민 변이체 연결 인간 성장 호르몬」 또는 「mHSA 연결 hGH」 등이라고 하고, 펩티드 결합을 개재하여 연결시켜 있는 경우에는, 특히, 인간 혈청 알부민 변이체 융합 인간 성장 호르몬」, 「mHSA 융합 hGH」 등이라고도 한다.
본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결시키는 구체적 방법으로는, 예를 들어, 일방의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 하류에, 인프레임으로 타방의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터를 제조하고, 이 발현 벡터를 사용하여 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 단백질로서 발현시키는 방법이 일반적이고, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다.
재조합 단백질로서 형질 전환 세포에 발현시키는 방법에 의해 mHSA 연결 hGH 를 제조할 때, hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 N 말단측 또는 C 말단측 중 어느 것에, 직접, 또는 링커를 개재하여 간접적으로 연결된다.
본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 N 말단측에 hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결하는 경우, hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 하류에, 본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 인프레임으로 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 2 개의 폴리펩티드를 펩티드 링커를 개재하여 간접적으로 연결하는 경우에는, 2 개의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 사이에, 당해 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임으로 배치된다.
본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 C 말단측에 hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결하는 경우, hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 상류에, 본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 인프레임으로 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 2 개의 폴리펩티드를 펩티드 링커를 개재하여 간접적으로 연결하는 경우에는, 2 개의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 사이에, 당해 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임으로 배치된다.
그 외, 본 발명의 HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 hGH 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결하는 방법으로는, 예를 들어 재조합 단백질로서 2 개의 폴리펩티드를 따로 따로 제조하고, 이어서, 그것들 2 개를, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재하여 연결시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 사용할 수 있다. 한편, 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1 ∼ 50 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 사슬 혹은 그 유도체로서, 그 N 말단과 C 말단이, 각각 본 발명의 HSA 변이체 또는 원하는 단백질 중 어느 것과 펩티드 결합을 형성함으로써, 본 발명의 HSA 변이체와 원하는 단백질을 연결하는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG 를 사용하여 HSA 변이체와 단백질 (A) 를 연결시킨 것은, 링커를 명시하는 경우, HSA 변이체 PEG 연결 단백질 (A) 라고 한다. 즉, 단백질 (A) 로서 hGH 를 선택한 경우에는, HSA 변이체 PEG 연결 hGH 라고 한다. HSA 변이체 PEG 연결 hGH 는, HSA 변이체와 PEG 를 먼저 결합시키고 (PEG 화 HSA 변이체), 이것에 hGH 를 결합시킴으로써, 또는, 먼저 hGH 와 PEG 를 결합시키고 (PEG 화 hGH), 이것에 HSA 변이체를 결합시킴으로써, 제조할 수 있다. PEG 를 본 발명의 HSA 변이체 또는 hGH 와 결합시키려면, 카보네이트, 카르보닐이미다졸, 카르복실산의 활성 에스테르, 아즐락톤, 고리형 이미드티온, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미데이트, 또는 알데히드 등의 관능기로 수식된 PEG 가 사용된다. 이들 PEG 에 도입된 관능기가, 주로 본 발명의 HSA 변이체 및 hGH 분자의 아미노기와 반응함으로써, 본 발명의 HSA 변이체 및 hGH 가 공유 결합한다. 이 때 사용되는 PEG 의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량 (MW) 은, 바람직하게는 MW = 500 ∼ 60000 이고, 보다 바람직하게는 MW = 500 ∼ 20000 이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG 는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, PEG 화 HSA 변이체는, 본 발명의 HSA 변이체와 알데히드기를 관능기로서 갖는 폴리에틸렌글리콜 (ALD-PEG-ALD) 을, HSA/(ALD-PEG-ALD) 의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시킴으로써 얻어진다. 이어서, 상기 PEG 화 HSA 변이체를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, hGH 와 반응시킴으로써, HSA 변이체 PEG 연결 hGH 가 얻어진다. 반대로, 먼저 hGH 와 ALD-PEG-ALD 를 결합시켜 PEG 화 hGH 를 제조하고, 이것과 HSA 변이체를 결합시킴으로써도, 본 발명의 HSA 변이체 PEG 연결 hGH 를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, mHSA 연결 (융합) hGH 의 적합한 일례로서, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 HSA(A320T) 의 N 말단에, 링커를 개재하지 않고, 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 22K 인간 성장 호르몬의 C 말단을 펩티드 결합에 의해 연결시킨 것인, 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 mHSA 연결 hGH 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 이 순서로 HSA(A320T) 와 22KhGH 를 연결한 것을, 「22K 인간 성장 호르몬-mHSA」 또는 「22KhGH-mHSA」 라고 한다. 마찬가지로, HSA(A320T) 의 C 말단에, 링커를 개재하지 않고, 22K 인간 성장 호르몬의 N 말단이 펩티드 결합에 의해 결합한 것을 「mHSA-22K 인간 성장 호르몬」 또는 「mHSA-22KhGH」 라고 한다.
또, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 인간 혈청 알부민 (A320T) 의 N 말단에, 링커를 개재하지 않고, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 20K 인간 성장 호르몬의 C 말단을 펩티드 결합에 의해 연결시킨 것인, 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 mHSA 연결 hGH 를, 「20K 인간 성장 호르몬-mHSA」 또는 「20KhGH-mHSA」 라고 한다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민 (A320T) 의 C 말단에, 링커를 개재하지 않고, 20K 인간 성장 호르몬의 N 말단이 펩티드 결합에 의해 연결된 것을 「mHSA-20K 인간 성장 호르몬」 또는 「mHSA-22KhGH」 라고 한다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 인간 성장 호르몬은, 피하 주사로 필리핀 원숭이에 투여했을 때의 혈중 반감기 (t1/2β) 가 대체로 10 시간 이상으로 혈중에서 매우 안정되는 것을 특징으로 한다. 투여량에 의해 변동은 하지만, 예를 들어, 4 ㎎/㎏ 의 용량으로 웅성 필리핀 원숭이에 단회 피하 투여했을 때의, mHSA-22KhGH 및 22KhGH-mHSA 의 혈중 반감기 (t1/2β) 는, 20 ∼ 35 시간이다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 인간 성장 호르몬은, 의약으로서 사용할 수 있다. 인간 성장 호르몬과 HSA 변이체의 생체 내에 있어서의 기능을 협동시킴으로써, 의약으로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 인간 성장 호르몬은, 혈중에서 매우 안정적이다. 따라서, 본 발명에 의하면 인간 성장 호르몬을 혈중에서 안정화시켜 장시간에 걸쳐 활성을 유지한 상태로 혈중에 머무르게 할 수 있어, 의약으로서 사용하는 경우의 인간 성장 호르몬의 투여 빈도 또는 투여량을 줄이는 것이 가능해진다. 예를 들어, 매일 투여가 필요한 의약의 투여 빈도를, 본 발명의 HSA 변이체와 연결함으로써, 예를 들어 3 ∼ 30 일마다의 투여로 하는 것도 가능해진다. 또, 당해 의약의 투여량을, 몰비로 1/3 ∼ 1/100 으로까지 줄이는 것도 가능해진다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 인간 성장 호르몬은, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에 있어서의 저신장, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증, 연골 이영양증에 있어서의 저신장증, SGA 성 저신장증으로서, 어느 것도 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 것, 성인 성장 호르몬 분비 부전증, AIDS 에 의한 소모, 및 거식증에 의한 소모를 대상 질환으로 하는 의약으로서 사용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않고, 성장 호르몬이 갖는 연골 형성 촉진, 단백질 동화 촉진 등의 성장 촉진 활성, 체 조성 및 지질 대사 개선 작용 등의 생리 활성을, 장기에 걸쳐 작용시킴으로써 증상이 개선될 수 있는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다.
mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.01 ∼ 0.7 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 터너 증후군에 있어서의 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.015 ∼ 1.4 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 만성 신부전에 의한 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.01 ∼ 1.4 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.012 ∼ 0.98 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 연골 이영양증에 있어서의 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.015 ∼ 1.4 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 SGA 성 저신장증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.012 ∼ 1.9 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.001 ∼ 0.34 ㎎/Kg 체중이다. mHSA-22KhGH 를, AIDS 에 의해 소모된 환자에게 투여하는 경우, 1 회당 바람직한 투여량은 0.005 ∼ 0.4 ㎎/Kg 체중이다. 단, 투여량은 환자의 검사 소견 등에 따라, 적절히 변경되어야 할 것이다. 또, 이들 질환에 있어서의, 바람직한 mHSA-22KhGH 의 투여 간격은, 7 ∼ 30 일마다 1 회이며, 환자의 검사 소견 등에 의해, 7 ∼ 14 일마다, 10 ∼ 20 일마다, 또는 14 ∼ 21일마다 1 회로 적절히 변경되어야 할 것이다. 또, 투여 방법은, 바람직하게는 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥 주사이고, 보다 바람직하게는 피하 주사 또는 근육내 주사이다.
본 발명의 HSA 변이체 연결 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 의약은, 주사제로서 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 또는 뇌실내에 투여할 수 있다. 그들 주사제는, 동결 건조 제제 또는 수성 액제로서 공급할 수 있다. 수성 액제로 하는 경우, 바이알에 충전한 형태로 해도 되고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형 제제로서 공급할 수도 있다. 동결 건조 제제의 경우, 사용 전에 수성 매질에 용해하고 복원하여 사용한다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.
[실시예 1] pE-mIRES-GS-puro 의 구축
pEF/myc/nuc 벡터 (인비트로젠사) 를, 제한 효소 (KpnI 및 NcoI) 로 소화하고, EF-1α 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 DNA 단편을 잘라내고, 이 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리하였다. 별도로, pCI-neo (인비트로젠사) 를, 제한 효소 (BglII 및 EcoRI) 로 소화하고, CMV 의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리하였다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 영역 (평활 말단화 처리 후의 것) 을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축하였다 (도 1).
pE-neo 벡터를, 제한 효소 (SfiI 및 BstXI) 로 소화하고, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1 kbp 의 영역을 절제하였다 (도 2). pcDNA 3.1/Hygro(+) (인비트로젠사) 를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5' (서열 번호 13) 및 프라이머 Hyg-BstX3' (서열 번호 14) 를 사용하여, PCR 에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭하였다 (도 2). 증폭한 하이그로마이신 유전자를, 제한 효소 (SfiI 및 BstXI) 로 소화하고, 상기의 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축하였다 (도 2).
발현 벡터 pPGKIH (Miyahara M. et. al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) 를 제한 효소 (XhoI 및 BamHI) 로 소화하고, 마우스 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 하이그로마이신 내성 유전자 (Hygr 유전자) 및 마우스 포스포글리세린산 키나아제 (mPGK) 의 폴리아데닐화 영역 (mPGKpA) 을 포함하는 염기 서열 IRES-Hygr-mPGKpA (서열 번호 15：5' 말단으로부터, 염기 1 ∼ 6 으로 이루어지는 영역이 「XhoI 부위」, 염기 120 ∼ 715 및 이것에 이어지는 염기 716 ∼ 718 (atg) 로 이루어지는 영역이 「마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 포함하는 염기 서열」, 그 염기 716 ∼ 718 (atg) 을 포함하는 염기 716 ∼ 1741 로 이루어지는 영역이 「하이그로마이신 내성 유전자를 코드하는 염기 서열」, 염기 1747 ∼ 2210 으로 이루어지는 영역이 「마우스 포스포글리세린산 키나아제 (mPGK) 의 폴리아데닐화 영역을 포함하는 염기 서열」, 및 3' 말단의 6 개의 염기 (염기 2211 ∼ 2216) 로 이루어지는 영역이 「BamHI 부위」 이다.) 로 이루어지는 DNA 단편을 잘라내었다 (또한, Hygr 유전자에 대응하는 아미노산 서열은, 서열 번호 16 으로 나타낸 것이다.). 이 DNA 단편을 pBluescript SK(-) (Stratagene 사) 의 XhoI 부위와 BamHI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA) 로 하였다 (도 3a).
pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA) 를 주형으로 하고, 프라이머 IRES5' (서열 번호 17) 및 프라이머 IRES3' (서열 번호 18) 를 사용하여, PCR 에 의해 EMCV 의 IRES 의 일부를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (XhoI 및 HindIII) 로 소화하고, pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA) 의 XhoI 부위와 HindIII 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) 로 하였다 (도 3b). pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) 를 제한 효소 (NotI 및 BamHI) 로 소화하고, pE-hygr 벡터의 NotI 부위와 BamHI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 플라스미드 pE-IRES-Hygr 로 하였다 (도 3c).
발현 벡터 pPGKIH 를 주형으로 하고, 프라이머 mPGKP5' (서열 번호 19) 및 프라이머 mPGKP3' (서열 번호 20) 를 사용하여, PCR 에 의해 mPGK 의 프로모터 영역 (mPGKp) 을 포함하는 염기 서열 (서열 번호 21：5' 말단으로부터, 염기 4 ∼ 9 가 「BglII 부위」, 이것에 이어지는 염기 10 ∼ 516 으로 이루어지는 영역이 「마우스 포스포글리세린산 키나아제 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 염기 서열」, 이것에 이어지는 염기 524 ∼ 529 로 이루어지는 영역이 「EcoRI 부위」 이다.) 로 이루어지는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (BglII 및 EcoRI) 로 소화하고, pCI-neo (프로메가사) 의 BglII 부위와 EcoRI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pPGK-neo 로 하였다 (도 3d). pE-IRES-Hygr 을 제한 효소 (NotI 및 BamHI) 로 소화하여 DNA 단편 (IRES-Hygr) 을 잘라내고, pPGK-neo 의 NotI 부위와 BamHI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pPGK-IRES-Hygr 로 하였다 (도 3e).
CHO-K1 세포로부터 cDNA 를 조제하고, 이 cDNA 를 주형으로 하고, 프라이머 GS5' (서열 번호 22) 및 프라이머 GS3' (서열 번호 23) 를 사용하여, PCR 에 의해 GS 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (BalI 및 BamHI) 로 소화하고, pPGK-IRES-Hygr 의 BalI 부위와 BamHI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pPGK-IRES-GS-ΔpolyA 로 하였다 (도 3f).
pCAGIPuro (Miyahara m. et. al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) 를 주형으로 하고, 프라이머 puro5' (서열 번호 24) 및 프라이머 puro3' (서열 번호 25) 를 사용하여, PCR 에 의해 퓨로마이신 내성 유전자 (puro 유전자) 를 포함하는 염기 서열 (서열 번호 26：5' 말단으로부터, 염기 2 ∼ 7 로 이루어지는 영역이 「AflII 부위」, 이것에 이어지는 염기 8 ∼ 607 로 이루어지는 영역이 「퓨로마이신 내성 유전자 (puro 유전자) 를 코드하는 염기 서열」, 및, 그 다음의 염기 608 ∼ 619 로 이루어지는 영역이 「BstXI 부위」 이다.) 로 이루어지는 DNA 단편을 증폭하였다 (또한, puro 유전자에 대응하는 아미노산 서열은, 서열 번호 27 로 나타낸 것이다.). 이 DNA 단편을 제한 효소 (AflII 및 BstXI) 로 소화하고, 발현 벡터 pE-neo 의 AflII 부위와 BstXI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pE-puro 로 하였다 (도 3g).
pE-puro 를 주형으로 하고, 프라이머 SV40polyA5' (서열 번호 28) 및 프라이머 SV40polyA3' (서열 번호 29) 를 사용하여, PCR 에 의해 SV40 후기 폴리아데닐화 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (NotI 및 HpaI) 로 소화하고, 발현 벡터 pE-puro 의 NotI 부위와 HpaI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pE-puro(XhoI) 로 하였다 (도 3h). pPGK-IRES-GS-ΔpolyA 를 제한 효소 (NotI 및 XhoI) 로 소화하고, IRES-GS 영역을 포함하는 DNA 단편을 잘라내고, 이 DNA 단편을 발현 벡터 pE-puro(XhoI) 의 NotI 부위와 XhoI 부위의 사이에 삽입하고, 이것을 pE-IRES-GS-puro 로 하였다 (도 3i).
발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 를 주형으로 하고, 프라이머 mIRES-GS5' (서열 번호 30) 및 프라이머 mIRES-GS3' (서열 번호 31) 를 사용하여, PCR 에 의해, EMCV 의 IRES 로부터 GS 에 걸친 영역을 증폭하고, EMCV 의 IRES 의 5' 측으로부터 2 번째에 위치하는 개시 코돈 (atg) 에 변이를 가하여 파괴한 DNA 단편을 증폭하였다. 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 를 주형으로 하여, 이 DNA 단편과 상기의 프라이머 IRES5' 를 사용하여, PCR 에 의해 IRES 로부터 GS 에 걸친 상기 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (NotI 및 PstI) 로 소화하고, 잘라진 DNA 단편을, 발현 벡터 pE-IRES-GS-puro 의 NotI 부위와 PstI 부위의 사이에 삽입하고, 포유 동물 세포용의 발현 벡터 pE-mIRES-GS-puro 로 하였다 (도 4).
[실시예 2] HSA-22KhGH 발현용 벡터의 구축
야생형 HSA (서열 번호 1) 의 C 말단과 22KhGH 의 N 말단을 융합시킨 것인 융합 단백질 HSA-22KhGH 의 아미노산 서열을, 서열 번호 32 에 나타낸다. 이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 585 번째의 아미노산 잔기가 야생형의 성숙 HSA 의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 에 상당하고, 586 ∼ 776 번째의 아미노산 잔기가 22KhGH 의 아미노산 서열에 상당한다. HSA-22KhGH 를 코드하는 유전자 (HSA-22KhGH 유전자) 를 포함하는 서열 번호 33 으로 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA 를 화학적으로 합성하였다. 이 서열에 있어서, 염기 11 ∼ 82 가 HSA 의 리더 펩티드를, 염기 83 ∼ 1837 이 성숙형 HSA 를, 그리고 염기 1838 ∼ 2410 이 성숙형 hGH 를, 각각 코드한다. 이 DNA 를 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화하고, 실시예 1 에서 제조한 pE-mIRES-GS-puro 의 MluI 부위와 NotI 부위의 사이에 삽입함으로써, HSA-22KhGH 발현용 벡터 pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH) 를 구축하였다.
[실시예 3] mHSA-22KhGH 발현용 벡터의 구축
HSA(A320T) (서열 번호 3) 의 C 말단과 22KhGH 의 N 말단을 융합시킨 것인, 서열 번호 34 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을, mHSA-22KhGH 로 하였다. 서열 번호 34 로 나타내는 아미노산 서열 중, 1 ∼ 585 번째의 아미노산 잔기가 mHSA 의 아미노산 서열에 상당하고, 586 ∼ 776 번째의 아미노산 잔기가 22KhGH 의 아미노산 서열에 상당한다. 실시예 2 에서 제조한 pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH) 를 주형으로 하여, 프라이머 YA082 (서열 번호 35) 및 프라이머 YA083 (서열 번호 36) 을 사용하여, PCR 에 의해 mHSA-22KhGH 를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 셀프 어닐시켜, mHSA-22KhGH 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH) 를 구축하였다.
[실시예 4] 22KhGH-HSA 발현용 벡터의 구축
22KhGH 의 C 말단과 야생형 HSA (서열 번호 1) 의 N 말단을 융합시킨 것인, 서열 번호 37 로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을, 22KhGH-HSA 로 하였다. 서열 번호 37 로 나타낸 아미노산 서열 중, 1 ∼ 191 번째의 아미노산 잔기가 22KhGH 의 아미노산 서열에 상당하고, 192 ∼ 776 번째의 아미노산 잔기가 HSA 의 아미노산 서열에 상당한다. 22KhGH-HSA 를 코드하는 유전자 (22KhGH-HSA 유전자) 를 포함하는 서열 번호 38 로 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA 를 화학적으로 합성하였다. 이 서열에 있어서, 염기 11 ∼ 88 이 hGH 의 리더 펩티드를, 염기 89 ∼ 661 이 성숙형 hGH 를, 염기 662 ∼ 2416 이 성숙형 HSA 를, 각각 코드한다. 이 DNA 를 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화하고, 실시예 1 에서 제조한 pE-mIRES-GS-puro 의 MluI 부위와 NotI 부위의 사이에 삽입함으로써, HSA-22KhGH 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA) 를 구축하였다.
[실시예 5] 22KhGH-mHSA 발현용 벡터의 구축
22KhGH 의 C 말단과 HSA(A320T) (서열 번호 3) 의 N 말단을 융합시킨 것인, 서열 번호 39 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을, 22KhGH-mHSA 로 하였다. 실시예 4 에서 제조한 pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA) 를 주형으로 하여, 프라이머 YA082 (서열 번호 35) 및 프라이머 YA083 (서열 번호 36) 을 사용하여, PCR 에 의해 22KhGH-mHSA 를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 셀프 어닐시켜, 22KhGH-mHSA 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA) 를 구축하였다.
[실시예 6] 융합 단백질 발현 세포의 제조
HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, 및 22KhGH-mHSA 의 각 융합 단백질을 발현시키기 위한 세포를 다음과 같이 하여 제조하였다. 차이니즈 햄스터의 난소에서 유래하는 세포인 CHO-K1 세포에, Gene Pulser Xcell 일렉트로포레이션 시스템 (Bio Rad 사) 을 사용하여, 실시예 2 ∼ 5 에서 제조한, HSA-22KhGH 발현용 벡터 pE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH), mHSA-22KhGH 발현용 벡터 pE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH), 22KhGH-HSA 발현용 벡터 pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA), 및 22KhGH-mHSA 발현용 벡터 pE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA) 를 각각 도입하였다. 각각의 발현 벡터를 도입한 세포를, 메티오닌술폭시민 (SIGMA 사) 및 퓨로마이신 (SIGMA 사) 을 포함하는 CD OptiCHOTM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 선택 배양하고, HSA-22KhGH 발현 세포, mHSA-22KhGH 발현 세포, 22KhGH-HSA 발현 세포, 및 22KhGH-mHSA 발현 세포를 각각 확립하였다. 선택 배양시에는, 메티오닌술폭시민 및 퓨로마이신의 농도를 단계적으로 상승시켜, 최종적으로 메티오닌술폭시민의 농도를 300 μM, 퓨로마이신의 농도를 10 ㎍/㎖ 로 하여, 보다 높은 약제 내성을 나타내는 세포를 선택적으로 증식시켰다.
이렇게 하여 얻어진 HSA-22KhGH 발현용 세포, mHSA-22KhGH 발현용 세포, 22KhGH-HSA, 및 22KhGH-mHSA 발현용 세포를, HSA-hGH 융합 단백질 발현 세포라고 총칭하고, 그들 세포를 배양함으로써 얻어지는 HSA 와 hGH 의 융합 단백질을, HSA-hGH 융합 단백질이라고 총칭한다.
[실시예 7] 융합 단백질 발현 세포의 배양
HSA-22KhGH 발현 세포, mHSA-22KhGH 발현 세포, 22KhGH-HSA 발현 세포, 및 22KhGH-mHSA 발현 세포의 배양을, 다음과 같이 하여 실시하였다. CD OptiCHOTM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에, 메티오닌술폭시민과 퓨로마이신을, 각각 300 μM 및 10 ㎍/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하여, 세포 배양용 배지를 조제하였다. 실시예 6 에서 제조한 각 발현 세포를, 각각 2 × 105 개/㎖ 의 세포 밀도가 되도록 5 ㎖ 의 세포 배양용 배지에 첨가하고, 5 ％ CO2 존재하 37 ℃ 에서 배양하였다. 5 일마다, 2 × 105 개/㎖ 의 세포 밀도가 되도록, 세포를 새로운 배양용 배지로 옮겨, 계대 배양을 실시하였다.
[실시예 8] HSA-hGH 융합 단백질의 정제
HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA, 및 22KhGH-mHSA 의 정제를 다음과 같이 하여 실시하였다. 실시예 7 에서 계대 배양한 각 발현 세포를, 각각 세포 배양용 배지에 전체량이 240 ㎖ 가 되도록 2 × 105 개/㎖ 의 밀도로 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 30 ㎖ 씩, 직경 15 ㎝ 의 샬레 8 매에 첨가하여, 5 일간, 5 ％ CO2 존재하, 37 ℃ 에서 배양하였다. 배양 종료 후에 배지를 회수하고, 막필터 (공경 (孔徑) 0.22 μM, Millipore 사) 로 여과하여, 배양 상청으로 하였다. 이어서, 각 배양 상청에, 1M HEPES (pH 8.0) 를 첨가하여, pH 를 7.0 ∼ 7.2 로 조정하였다.
폴리프로필렌제 칼럼 (폴리프렙TM 칼럼, 바이오라드사) 에, 5 ㎖ 의 항인간 성장 호르몬 항체를 결합시킨 수지 (Capture SelectTM 항 hGH 레진, Thermo Fisher Scientific 사) 를 충전하고, 칼럼 체적의 5 배용의 500 mM NaCl 을 함유하는 10 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 으로 수지를 평형화시켰다. 이어서, pH 를 조정한 상기의 배양 상청을, 칼럼에 약 2.5 ㎖/분의 유속으로 부하하고, HSA-hGH 융합 단백질을 각각 수지에 흡착시켰다. 계속해서, 동 (同) 유속으로, 칼럼 체적의 5 배용의 500 mM NaCl 을 함유하는 10 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 으로 칼럼을 세정하였다. 이어서, 칼럼 체적의 5 배용의 100 mM NaCl 을 함유하는 0.1M 글리신 완충액 (pH 3.0) 으로 HSA-hGH 융합 단백질을 각각 수지로부터 용출시켰다. HSA-hGH 융합 단백질을 포함하는 용출 획분을 회수하고, 즉시 7 ％ (v/v) 의 1M HEPES 완충액 (pH 8.0) 을 첨가하였다. 용출 획분에 포함되는 HSA-hGH 융합 단백질의 농도를, PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여, BSA 를 표준 물질로서 측정하였다.
[실시예 9] BaF3/hGHR 세포의 제조
사람 GH 수용체 (hGHR) 유전자를 마우스 BaF3 세포에 도입함으로써 GH 의존성 증식능을 획득시킨 BaF3/hGHR 세포를, 이하와 같이 하여 제조하였다. 서열 번호 40 에 나타낸 염기 서열을 갖는 hGHR ECD 인공 합성 유전자 (hGHR 의 세포외 영역 (Extra Cellular Domain) 을 코드하는 hGHR 유전자의 5' 측 단편) 를 주형으로 하여, 프라이머 YA034 (서열 번호 41) 및 프라이머 YA035 (서열 번호 42) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스 전기 영동에 제공하고, QIAEX II (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제하였다. 이 DNA 단편을 메가 프라이머로 하였다. 사람 폐 유래 cDNA 를 주형으로 하여, 프라이머 K708 (서열 번호 43) 및 프라이머 K709 (서열 번호 44) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, hGHR 유전자의 전체 길이를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스 전기 영동에 제공하고, QIAEX II 를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제한 hGHR 유전자의 전체 길이를 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하여, 상기 메가 프라이머 및 프라이머 K709 (서열 번호 44) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, 5' 측에 hGHR ECD 인공 합성 유전자 서열을 갖는 hGHR 의 전체 길이를 코드하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 45 에 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화하고, 레트로바이러스 벡터인 pMX-II (Ono Y., Oncogene. 19. 3050-8 (2000)) 의 MluI 와 NotI 의 사이에 삽입하고, 이것을 hGHR 발현용 레트로바이러스 벡터 (hGHR/pMX-II) 로 하였다.
10 ㎖ 의 10 ％ FBS 를 포함하는 DMEM 배지에 6 × 106 개의 293 세포 (다이닛폰 제약사) 를 현탁시키고, 이것을 세포 배양용 10 ㎝ 디쉬에 첨가하고, 5 ％ CO2 존재하, 37 ℃ 에서 24 시간 배양하였다. 또한, 여기서 사용한 293 세포는, 아데노바이러스의 E1 유전자에 의해 형질 전환된 인간 태아 신세포 (腎細胞) 이다.
500 ㎕ 의 Opti-MEMITM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에, 15 ㎕ 의 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche 사) 를 첨가하여 혼합하고, 이것에 추가로 5 ㎍ 의 레트로바이러스 패키징 벡터인 pCL-Eco (IMGENEX 사) 와, 5 ㎍ 의 hGHR/pMX-II 를 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액을, 실온에서 15 분간 정치 (靜置) 한 후, 상기의 293 세포를 24 시간 배양시킨 10 ㎝ 디쉬에 첨가하였다. 이어서, 세포를 5 ％ CO2 존재하, 37 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 배지를 3000 rpm 으로 5 분간 원심하여 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 hGHR 발현 레트로바이러스액으로 하였다.
WEHI-3 세포 (이화학 연구소) 를 10 ％ FBS 함유 RPMI 1640 배지에서 배양한 후, 배지를 3000 rpm 으로 5 분간 원심하여 상청을 회수하였다. 2 ㎖ 의 hGHR 발현 레트로바이러스액에, 500 ㎕ 의 WEHI-3 세포의 배양 상청과 2.5 ㎖ 의 10 ％ FBS 함유 RPMI 1640 배지를 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액을, 2 × 106 개의 IL-3 의존성 세포주인 BaF3 세포 (이화학 연구소) 에 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 75 ㎠ 배양 플라스크로 옮기고, 세포를 5 ％ CO2 존재하, 37 ℃ 에서 8 시간 배양하고, 추가로, 500 ㎕ 의 WEHI-3 세포의 배양 상청과 2.5 ㎖ 의 10 ％ FBS 함유 RPMI 1640 배지를 첨가하여 16 시간 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 원심하여 회수하고, PBS 로 3 회 세정하였다. 회수한 세포에 100 ng/㎖ 의 22KhGH 를 포함하는 10 ％ FBS 함유 RPMI 1640 배지를 5 ㎖ 첨가하여 세포를 현탁시키고, 이어서, 이 세포 현탁액을 배양 플라스크로 옮기고, 5 ％ CO2 존재하, 37 ℃ 에서 배양하여, hGHR 유전자가 발현함으로써 hGH 의존적 증식능을 획득한 BaF3 세포를 얻었다. 이 세포를 BaF3/hGHR 세포로 하였다.
[실시예 10] BaF3/hGHR 세포를 사용한 세포 증식 활성의 측정
HSA-hGH 융합 단백질의 세포 증식 활성을, 실시예 9 에 기재된 방법으로 제조한 BaF3/hGHR 세포를 사용하여 평가하였다.
대수 증식기에 있는 BaF3/hGHR 세포를 PBS 로 3 회 세정한 후, 1 ％ 말 혈청을 포함하는 15 ㎖ 의 RPMI 1640 배지에서 1 × 106 개/㎖ 가 되도록 희석하고, 5 ％ CO2 존재하 37 ℃ 에서 16 시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 3 × 105 개/㎖ 가 되도록 동 배지에서 희석하고, 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 파종하였다. 0.1 ％ BSA 를 포함하는 PBS 를 사용하여, 실시예 8 에서 정제한 HSA-hGH 융합 단백질 (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA 및 22KhGH-mHSA) 을 희석하고, 각각 7 단계 농도 (90.3 nM, 18.1 nM, 3.6 nM, 0.72 nM, 0.14 nM, 0.029 nM, 및 0.0058 nM) 의 희석액을 조정하였다.
이렇게 하여 조제한 검체 희석액을, BaF3/hGHR 세포를 파종한 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 20 ㎕ 씩 첨가하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 혼합한 후, 세포를 5 ％ CO2 존재하 37 ℃ 에서 22 시간 배양하였다. 배양 후, 생 세포수를 측정하는 비색 정량 분석용 시약인 CellTiter 96TM Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 시액 (프로메가사) 을 24 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하여 혼화하고, 추가로 3 시간 배양하였다. 이어서, 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 490 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 세로축에 490 ㎚ 에 있어서의 흡광도, 가로축에 각 검체의 몰 농도 (nM) 를 취하고, 측정값을 플롯하였다. 490 ㎚ 에 있어서의 흡광도는, 생 세포수의 상대값을 나타내기 때문에, 측정값을 플롯하여 얻어진 곡선은, 검체의 농도와 세포의 증식량의 상관을 나타내는 것이며, 이 곡선에서 구해지는 세포의 증식량의 최대값에 대하여, 세포의 증식량이 50 ％ 일 때의 검체의 농도를 EC50 으로서 구하였다. 또한, 어느 쪽의 검체에 대해서도 측정은 3 회 실시하였다.
[실시예 11] 필리핀 원숭이를 사용한 약물 동태 및 약효 해석
실시예 8 에서 정제한 HSA-hGH 융합 단백질 (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA 및 22KhGH-mHSA) 을, 각각, 4.0 ㎎/㎏ 의 용량으로 웅성 필리핀 원숭이에 단회 피하 투여하였다. 또한, HSA-22KhGH 의 투여는 3 마리의 필리핀 원숭이를 사용하여 실시하고, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA 및 22KhGH-mHSA 의 투여에 대해서는, 각각 1 마리의 필리핀 원숭이를 사용하여 실시하였다.
약물 동태 해석용으로, 투여 15 분 후, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 120, 168, 및 216 시간 후에 동물의 말초혈을 채취하였다. 혈액을 EDTA2 칼륨이 들어간 채혈관에 채취하고, 빙랭한 후, 원심 분리 (1700 × g, 5 분간, 4 ℃) 하여 혈장을 분리하였다. 조제한 혈장 중에 포함되는 HSA-hGH 융합 단백질의 농도를 실시예 12 에서 상세하게 서술하는 방법에 의해 측정하고, 세로축에 HSA-hGH 융합 단백질의 농도를, 가로축에 투여 후의 시간을 플롯함으로써 Cmax, AUC0-216h, AUC0-inf 및 t1/2β 를 구하여 약물 동태 해석을 실시하였다.
또, IGF-1 분비 촉진을 지표로 하고, HSA-hGH 융합 단백질의 약효를 다음과 같이 하여 해석하였다. HSA-hGH 융합 단백질 투여 전, 투여 6, 12 시간 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9 일 후에 말초혈을 채혈하고, 상기의 수법에 의해 말초혈로부터 혈장을 조제하였다. 혈장 중에 포함되는 IGF-1 의 농도를 실시예 13 에서 상세하게 서술하는 방법에 의해 측정하고, 세로축에 IGF-1 의 농도를, 가로축에 투여 후의 시간을 플롯함으로써 약효 해석을 실시하였다. 또, 컨트롤로서 추가로 1 마리의 필리핀 원숭이를 준비하여, 이것에 0.3 ㎎/㎏ 의 용량으로 22KhGH (그로우젝트 (등록상표)) 를 7 일간 연속해서 피하 투여하고, 혈장 중의 IGF-1 의 농도를 동일하게 측정하였다.
[실시예 12] 혈장 중의 HSA-hGH 융합 단백질의 정량
마우스 항 HSA 모노클로날 항체 및 마우스 항 hGH 항체를, 당업자에게 주지의 수법에 의해, HSA 또는 hGH 로 면역한 마우스의 비장 세포를 각각 미엘로마 세포와 융합시켜 얻은 하이브리도마 세포를 배양하여 얻었다. 마우스 항 hGH 모노클로날 항체를, 0.1M NaHCO3 용액 (pH 9) 으로 투석한 후, 용액 중의 항체 농도를 NanoDropTM (Thermo Scientific 사) 을 사용하여 측정하였다. 이어서, 5 ㎎/㎖ 의 농도로 DMSO 에 용해한 EZ-LinkTM NHS-LC-비오틴 (Biotin) (Thermo Fisher Scientific 사) 을, 1 ㎎ 의 항체당 60 ㎍ 의 NHS-LC-Biotin 의 비율로 항체 용액에 첨가하고, 실온에서 2 시간 반응시킨 후, 반응 용액을 PBS 로 투석하고 비오틴화 마우스 항 hGH 모노클로날 항체를 얻었다. 하기의 정량법에 있어서, 마우스 항 HSA 모노클로날 항체를 1 차 항체, 비오틴화 마우스 항 hGH 모노클로날 항체를 2 차 항체로서 사용하였다.
혈장 중의 HSA-hGH 융합 단백질의 농도는, Sector Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics 사) 을 사용하여, 전기 화학 발광 (ECL) 이뮤노어세이법에 의해 측정하였다. ECL 이뮤노어세이법은, 루테늄 착물인 SULFO-TAG 로 라벨한 2 차 항체에 플레이트 상에서 전기 화학적 자극을 주고, SULFO-TAG 의 전해 산화·환원에 의한 파장 620 ㎚ 의 발광을 CCD 카메라로 검출함으로써, 검체를 정량하는 방법이다.
측정은, Sector Imager 6000 의 사용 설명서에 따라서, 대체로 하기와 같이 실시하였다. 마우스 항 HSA 모노클로날 항체를 High Bind Plate (Meso Scale Diagnostics 사) 에 첨가하고, 1 시간 정치하여 항 HSA 항체 (1 차 항체) 를 플레이트에 고정하였다. 이어서, PBS 의 슈퍼 블록 블로킹 버퍼 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 플레이트에 첨가하여 1 시간 진탕하고, 플레이트를 블로킹하였다. 플레이트를 PBST (0.05 ％ 트윈20 을 함유하는 PBS) 로 세정한 후, 검체를 첨가하여 1 시간 진탕하였다. 플레이트를 PBST 로 세정한 후, 비오틴화 마우스 항 hGH 모노클로날 항체 (2 차 항체) 를 첨가하여 1 시간 진탕하였다. 플레이트를 PBST 로 세정한 후, SULFO-Tag-스트렙타아비딘 (Streptavidin) (Meso Scale Diagnostics 사) 을 첨가하여 1 시간 진탕하였다. 플레이트를 PBST 로 세정한 후, 리드 버퍼 T (Read buffer T) (Meso Scale Diagnostics 사) 를 첨가하고, Sector Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics 사) 으로 파장 620 ㎚ 의 발광을 측정하였다. 동일하게 하여 동일 플레이트 상에서 이미 알려진 농도의 HSA-hGH 를 정량하여 표준 곡선을 구하고, 이것에 검체의 측정값을 내삽 (內揷) 하고, 혈장 중의 HSA-hGH 융합 단백질의 농도를 구하였다.
[실시예 13] 혈장 중의 IGF-1 의 정량
혈장 중에 포함되는 IGF-1 의 정량은, 인간 IGF-I Quantikine ELISA kit (R & D systems) 를 사용하여, ELISA 법에 의해 실시하였다.
[실시예 14] 결과와 고찰
(1) BaF3/hGHR 세포를 사용한 세포 증식 활성의 측정
도 5 는, 세로축에 490 ㎚ 에 있어서의 흡광도, 가로축에 각 검체의 몰 농도 (nM) 를 취하고 측정값을 플롯한, BaF3/hGHR 세포를 사용한 세포 증식 활성의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 이 도면으로부터, 각 검체의 EC50 을 구한 결과를 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00001
표 1 에 보이는 바와 같이, 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 HSA-22KhGH 와 mHSA-22KhGH 의 EC50 은, 각각 1.38 × 10-1 nM 과 1.53 × 10-1 nM 이며, 양자는 거의 동등한 세포 증식 활성을 갖는다. 또, 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 22KhGH-HSA 와 22KhGH-mHSA 에 대해 보면, 그들의 EC50 은 각각 8.78 × 10-1 nM 과 1.20 ㎚ 이며, 이들도 서로 거의 동등한 세포 증식 활성을 갖는 것이 나타났다.
한편, HSA-22KhGH 와 22KhGH-HSA 의 EC50 을 비교하면, 22KhGH-HSA 의 EC50 은 HSA-22KhGH 의 EC50 의 약 6.4 배를 나타내고, 또, mHSA-22KhGH 와 22KhGH-mHSA 의 EC50 을 비교하면, 22KhGH-mHSA 의 EC50 은 mHSA-22KhGH 의 EC50 의 약 7. 8 배를 나타내었다.
이들 결과는, 22KhGH 와 인간 혈청 알부민을 연결시켜 융합 단백질로 하는 경우, 적어도 in vitro 에서는, 22KhGH 를 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 연결시키는 것보다도 C 말단측에 연결시키는 쪽이, 22KhGH 가 갖는 세포 증식 활성이 보다 높은 융합 단백질이 얻어지는 것을 나타내는 것이다. 따라서, 상기 결과는 또한, 22KhGH 와 인간 혈청 알부민을 연결시켜 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증 등의 치료제로 하는 경우, 22KhGH 를 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 결합시키는 쪽이 바람직한 것을 시사하는 것이다.
(2) 필리핀 원숭이를 사용한 약물 동태 해석
도 6 은, 세로축에 필리핀 원숭이 혈청 중의 HSA-hGH 융합 단백질 (HSA-22KhGH, mHSA-22KhGH, 22KhGH-HSA 및 22KhGH-mHSA) 의 농도, 가로축에 HSA-hGH 융합 단백질을 투여 후의 경과 시간을 플롯한, HSA-hGH 융합 단백질의 약물 동태 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 이 도면로부터, 각 검체의 Cmax, AUC0-216h, AUC0-inf 및 t1/2β 를 구한 결과를 표 2 에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2 에 보이는 바와 같이, AUC 는, 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 HSA-22KhGH 와 mHSA-22KhGH 의 AUC0-inf 에 대해서는, 각각 752 ± 55 ㎍·시/㎖, 737 ㎍·시/㎖ 의 값을 나타내고 있다. 이에 반해, 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 22KhGH-HSA 와 22KhGH-mHSA 의 AUC0-inf 는, 각각 2220 ㎍·시/㎖ 와 3260 ㎍·시/㎖ 이며, 이것은, 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것은, 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것과 비교하여, 혈중에서 훨씬 안정적인 것을 분명히 하고 있다. 또, 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 HSA-22KhGH 와 mHSA-22KhGH 끼리는 동등한 AUC0-inf 값을 나타냈지만, 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 22KhGH-HSA 와 22KhGH-mHSA 의 비교에서는, 22KhGH-mHSA 의 AUC0-inf 가, 22KhGH-HSA 에 비해 약 1.47 배의 높은 값을 나타내고, 22KhGH-mHSA 가 혈중에서 특별히 안정적인 것을 나타내고 있다.
이들 결과는, 예상 밖에도, 인간 혈청 알부민의 C 말단에 인간 성장 호르몬의 N 말단을 연결시킨 경우와, 반대로 인간 성장 호르몬의 C 말단에 인간 혈청 알부민의 N 말단을 연결시킨 경우에서, 그들의 융합 단백질의 혈중 안정성이 현격하게 상위하고, 후자의 경우에 있어서 훨씬 높은 안정성을 달성할 수 있는 것을 나타내고 있다. 게다가 이들 결과는, 인간 성장 호르몬의 C 말단측에 HSA(A320T) 의 N 말단측을 연결했을 경우에 인간 성장 호르몬의 혈중 안정성이 특히 현저하게 높아지는 것, 즉 HSA(A320T) 가, 그 N 말단측에 연결시킨 단백질의 혈중 안정성을 현저하게 높이는 능력을 갖는 것도 나타내고 있다. 즉, 종합하면, 이들 결과는, 의약품으로서 인간 그 밖의 동물에 투여되어야 할 성장 호르몬 등의 각종 단백질을 투여 후의 혈중에 있어서 안정화하는 수단으로서, 그들 단백질과 HSA(A320T) 를 연결시키는 것이 유효하고, 특히 그들 단백질의 C 말단을 HSA(A320T) 의 N 말단과, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 연결시키는 것이 유효한 것을 나타내는 것이다.
(3) 필리핀 원숭이를 사용한 약효 해석
도 7 은, HSA 융합 22KhGH 의 약물 동태 해석의 결과를 나타내는 도면이며, 세로축은 혈장 중의 IGF-1 의 농도를, 가로축은 HSA-22KhGH 융합 단백질을 투여 후의 경과 시간을 나타낸다. IGF-1 은 성장 호르몬에 의해 분비가 유도되는 뼈 성장 촉진 작용 등의 활성을 갖는 폴리펩티드이고, hGH 의 생리 활성의 일부는 IGF-1 을 개재하여 발휘되는 것이 알려져 있다.
도 7 에 보이는 바와 같이, 인간 혈청 알부민의 C 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 HSA-22KhGH 또는 mHSA-22KhGH 를 투여한 동물에 있어서, 혈장 중 IGF-1 농도는, HSA-22KhGH 투여 동물에서는 투여 후 3 일째에 투여 전의 약 1.5 배로 최대값을 나타내고, HSA-m22KhGH 투여 동물에서는 투여 후 2 일째에 투여 전의 약 2 배로 최대값을 나타내고 있다. 그러나, 어느 쪽에 있어서도 그 후에는 혈장 중 IGF-1 농도는 저하되고, 투여 후 5 일째 이후에는, 대조인 22KhGH 와 거의 동등한 값으로 되어 있다. 또한, 도 7 에서 22KhGH 의 투여 후에 혈장 중 IGF-1 농도의 현저한 상승이 확인되지 않는 것은, 22KhGH 의 혈중 반감기가 약 20 분으로 짧고, 혈액을 채취한 시점에 있어서 IGF-1 농도가 거의 투여 전의 값으로까지 되돌아갔기 때문인 것으로 생각된다. 또, 22KhGH 투여 동물의 혈장 중 IGF-1 의 농도는, 2 일째부터 상승하고, 그 후 측정 마지막 날인 9 일째까지의 동안, 투여 전의 값보다 높은 값을 나타내고 있지만, 이것은, 22KhGH 만 7 일간 연속 투여를 실시한 것에 의해, 22KhGH 의 효과가 축적되어 나타났기 때문인 것으로 생각된다.
한편, 인간 혈청 알부민의 N 말단측에 22KhGH 를 연결시킨 것인 HSA-22KhGH 또는 mHSA-22KhGH 를 투여한 동물의 혈장 중 IGF-1 의 농도는, 22KhGH-HSA 투여 동물에서는 투여 후 7 일째에 투여 전의 약 2.0 배로 최대값을 나타내고, 22KhGH-mHSA 투여 동물에서도 투여 후 7 일째에 투여 전의 약 2.0 배로 최대값을 나타내고 있다. 또, 어느 쪽도, 대조인 22KhGH 와 비교하여, 투여 후 9 일째에 있어서도 혈장 중의 IGF-1 의 농도는 높은 값으로 유지되고 있다. 또한, HSA-22KhGH 와 mHSA-22KhGH 를 비교하면, 투여 후 3 일째까지는 HSA-22KhGH 의 IGF-1 농도가 보다 높은 경향이 있기는 했지만, 투여 후 5 일째 이후에는 mHSA-22KhGH 의 IGF-1 농도 쪽이 일관되게 높고, mHSA-22KhGH 가 HSA-22KhGH 와 비교하여, 보다 장기에 걸쳐 혈중의 IGF-1 농도를 높은 값으로 지속할 수 있는 것이 나타나 있다.
이들 결과는, 성장 호르몬을 HSA(A320T) 의 N 말단측에 연결시킴으로써, 성장 호르몬의 약효를 현저하게 장기화 할 수 있는 것을 나타내는 것이며, 따라서, 기존의 성장 호르몬 제제 (그로우젝트 (등록상표) 등) 보다 약효가 장시간에 걸쳐서 계속되는 지속형 성장 호르몬으로서, 성장 호르몬의 C 말단측을 HSA(A320T) 의 N 말단측에 연결시킨 것인 22KhGH-mHSA 를 적합하게 사용할 수 있는 것을 나타낸다. 나아가서는, 이들 결과는, 의약품 등으로서 동물에 투여되어야 할 생리 활성 단백질을 HSA(A320T) 의 N 말단측에 연결시킴으로써, 그들의 생리 활성 단백질의 활성을 혈장 중에 있어서 현저하게 지속할 수 있는 것을 나타냄과 함께, 약효가 장시간에 걸쳐서 계속되는 지속형의 의약품을 제조하는 수단으로서, 생리 활성 단백질을 HSA(A320T) 와 연결시키는 것이 유효하고, 특히 생리 활성 단백질의 C 말단을 HSA(A320T) 의 N 말단과 펩티드 결합시키는 것이 유효한 것을 나타내는 것이다.
22KhGH-mHSA 투여 동물에서는, 투여 후 9 일째에 있어서도 혈장 중 IGF-1 농도가 매우 높은 값으로 유지되고 있기 때문에, 22KhGH-mHSA 를 성장 호르몬 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 부전증 등의 환자에게 투여하는 경우, 투여 간격을 7 일 ∼ 14 일로 해도, 그 약효가 충분히 발휘될 것이라고 합리적으로 예측된다. 표 3 에 22KhGH-mHSA 를 성장 호르몬 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 부전증 등의 환자에게 투여할 때의 용법·용량을 예시한다. 표 3 에 나타낸 투여량, 투여 간격은, 임상 증상 및 IGF-1 농도 등의 검사 소견에 따라 적절히 증감되어야 할 것이다. 또, 바람직하게는 22KhGH-mHSA 는, 근육내 주사 또는 피하 주사의 형태로 환자에게 투여된다.
Figure pct00003
[제제 실시예 1] 수성 주사제
인산수소2나트륨 7수화물 ··· · 1.33 ㎎
인산이수소나트륨 ········ 1.57 ㎎
폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜 ··· 3 ㎎
벤질알코올 ········ 13.5 ㎎
D-만니톨 ········· 52.5 ㎎
22KhGH-mHSA ······ ·· 1 ㎎
상기 성분 비율로 각 성분을 주사용수에 용해시키고, pH 를 6.0 ∼ 6.4 로 조정하고, 액량을 1.5 ㎖ 로 하여 수성 주사제로 한다.
[제제 실시예 2] 수성 주사제
L-히스티딘 ········ 1 ㎎
페놀 ···········4.5 ㎎
폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜 ·· 4.5 ㎎
D-만니톨 ········ ·60 ㎎
22KhGH-mHSA ········ 1 ㎎
상기 성분 비율로 각 성분을 주사용수에 용해시켜, pH 를 6.0 ∼ 6.4 로 조정하고, 액량을 1.5 ㎖ 로 하여 수성 주사제로 한다.
[제제 실시예 3] 동결 건조제
인산수소2나트륨 7수화물 ··· 2.475 ㎎
인산2수소나트륨 ······· 0.394 ㎎
염화나트륨 ······· ·· 1.125 ㎎
아미노아세트산 ······· 11.25 ㎎
D-만니톨 ········ ·· 22.5 ㎎
22KhGH-mHSA ······ ·· 1 ㎎
상기 성분으로 이루어지는 동결 건조제를, 사용시에 9.7 ㎎ 의 벤질알코올을 함유하는 1 ㎖ 의 주사용수에 용해한다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, 의약품으로서 동물에 투여되어야 할 원하는 단백질의 혈중 안정성을 높일 수 있으므로, 의약품으로서 투여했을 때의 당해 원하는 단백질의 투여량을 줄일 수 있는, 새로운 의약품을 제공할 수 있다.
1：LacZ 프로모터
2：mPGK 프로모터
3：서열 번호 7 에 나타내는 염기 서열을 포함하는 야생형 마우스 뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합 부위의 부분 서열
3a：서열 번호 8 에 나타내는 염기 서열을 포함하는 변이형 마우스 뇌심근염 바이러스의 내부 리보솜 결합 부위의 부분 서열
4：mPGK 의 폴리아데닐화 영역 (mPGKpA)
5：EF-1 p 및 제 1 인트론을 포함하는 염기 서열
6：SV40 후기 폴리아데닐화 영역
7：SV40 초기 프로모터를 포함하는 영역
8：합성 폴리아데닐화 영역
9：사이토메갈로바이러스 프로모터를 포함하는 영역
10 글루타민 합성 효소 유전자
서열표 프리 텍스트
서열 번호 3：인간 혈청 알부민 변이체 (A320T)
서열 번호 4：링커 예
서열 번호 5：링커 예
서열 번호 6：링커 예
서열 번호 8：변이형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위의 부분 서열, 합성
서열 번호 11：22KhGH-mHSA, 성숙형
서열 번호 12：20KhGH-mHSA, 성숙형
서열 번호 13：프라이머 Hyg-Sfi5', 합성
서열 번호 14：프라이머 Hyg-BstX3', 합성
서열 번호 15：IRES-Hygr-mPGKpA, 합성
서열 번호 16：하이그로마이신 내성 유전자에 대응하는 아미노산 서열
서열 번호 17：프라이머 IRES5', 합성
서열 번호 18：프라이머 IRES3', 합성
서열 번호 19：프라이머 mPGKP5', 합성
서열 번호 20：프라이머 mPGKP3', 합성
서열 번호 21：mPGKp, 합성
서열 번호 22：프라이머 GS5', 합성
서열 번호 23：프라이머 GS3', 합성
서열 번호 24：프라이머 puro5', 합성
서열 번호 25：프라이머 puro3', 합성
서열 번호 26：퓨로마이신 내성 유전자를 포함하는 서열
서열 번호 27：퓨로마이신 내성 유전자에 대응하는 아미노산 서열
서열 번호 28：프라이머 SV40polyA5', 합성
서열 번호 29：프라이머 SV40polyA3', 합성
서열 번호 30：프라이머 mIRES-GS5', 합성
서열 번호 31：프라이머 mIRES-GS3', 합성
서열 번호 32：HSA-22KhGH, 성숙형
서열 번호 33：HSA-22KhGH 유전자를 포함하는 서열, 합성
서열 번호 34：mHSA-22KhGH, 성숙형
서열 번호 35：프라이머 YA082, 합성 서열
서열 번호 36：프라이머 YA083, 합성 서열
서열 번호 37：22KhGH-HSA, 성숙형
서열 번호 38：22KhGH-HSA 유전자를 포함하는 서열, 합성
서열 번호 39：22KhGH-mHSA
서열 번호 40：hGHR ECD 를 코드하는 인공 합성 유전자의 서열
서열 번호 41：프라이머 YA034, 합성
서열 번호 42：프라이머 YA035, 합성
서열 번호 43：프라이머 K708, 합성
서열 번호 44：프라이머 K709, 합성
서열 번호 45：hGHR 을 코드하는 인공 합성 유전자의 염기 서열, 합성
SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Novel Human Serum Albumin Mutants <130> GP187-PCT <150> JP2015-177093 <151> 2015-09-08 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 2 <211> 586 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu 20 25 30 Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr 35 40 45 Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp 50 55 60 Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr 65 70 75 80 Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu 85 90 95 Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn 100 105 110 Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe 115 120 125 His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala 130 135 140 Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala 165 170 175 Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala 180 185 190 Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly 195 200 205 Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe 210 215 220 Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr 225 230 235 240 Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp 245 250 255 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile 260 265 270 Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro 290 295 300 Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr 305 310 315 320 Thr Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 325 330 335 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 340 345 350 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 355 360 365 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu 370 375 380 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 405 410 415 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 420 425 430 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 435 440 445 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 450 455 460 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 465 470 475 480 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 485 490 495 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 500 505 510 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 515 520 525 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 530 535 540 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 545 550 555 560 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 565 570 575 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 3 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human serum albumin mutant (A320T) <400> 3 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of linker <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of linker <400> 6 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Murine encephalomyocardinitis virus <400> 7 atgataatat ggccacaacc atg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of IRES from mutant type murine encephalomyocardinitis virus <400> 8 atgataagct tgccacaacc atg 23 <210> 9 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 10 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175 <210> 11 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22KhGH-mHSA <400> 11 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp 180 185 190 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu 195 200 205 Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln 210 215 220 Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe 225 230 235 240 Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser 245 250 255 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg 260 265 270 Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu 275 280 285 Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 290 295 300 Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 305 310 315 320 Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 325 330 335 His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 340 345 350 Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys 355 360 365 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 370 375 380 Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg 385 390 395 400 Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys 405 410 415 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val 420 425 430 His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg 435 440 445 Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser 450 455 460 Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 465 470 475 480 Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 485 490 495 Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr Glu 500 505 510 Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 515 520 525 His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 530 535 540 Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys 545 550 555 560 Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln 565 570 575 Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr 580 585 590 Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln 595 600 605 Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val 610 615 620 Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 625 630 635 640 Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu 645 650 655 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 660 665 670 Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr 675 680 685 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 690 695 700 Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu 705 710 715 720 Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys 725 730 735 Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 740 745 750 Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala 755 760 765 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 770 775 <210> 12 <211> 761 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20KhGH-mHSA <400> 12 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 180 185 190 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 195 200 205 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 210 215 220 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 225 230 235 240 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 245 250 255 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 260 265 270 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 275 280 285 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 290 295 300 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 305 310 315 320 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 325 330 335 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 340 345 350 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 355 360 365 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 370 375 380 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 385 390 395 400 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 405 410 415 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 420 425 430 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 435 440 445 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 450 455 460 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 465 470 475 480 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr 485 490 495 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 500 505 510 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 515 520 525 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 530 535 540 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 545 550 555 560 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 565 570 575 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 580 585 590 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 595 600 605 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 610 615 620 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 625 630 635 640 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 645 650 655 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 660 665 670 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 675 680 685 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 690 695 700 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 705 710 715 720 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 725 730 735 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 740 745 750 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 755 760 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic <400> 13 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX3', synthetic <400> 14 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 15 <211> 2216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-Hygr-mPGKpA, synthetic <400> 15 ctcgaggaat tcactccttc aggtgcaggc ttgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg 60 ccaactggct cacaaatacc actgagatcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcc 120 gccccccccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 180 ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 240 agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 300 gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 360 tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 420 aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 480 cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 540 ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 600 cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 660 aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caaccatgaa 720 aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt 780 ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg 840 agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta 900 tgttcatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga 960 attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga 1020 cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc gcggaggcca tggatgcgat 1080 cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg 1140 tcaatacact acgtggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg 1200 gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat 1260 gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa 1320 caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt 1380 cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat 1440 ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccgcggct 1500 ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa 1560 tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg 1620 gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt 1680 agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaata 1740 gtcgagaaat tgatgatcta ttaagcaata aagacgtcca ctaaaatgga agtttttcct 1800 gtcatacttt gttaagaagg gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga 1860 gctacggggg tgggggtggg gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt 1920 tactattgct ttatgataat gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca 1980 aattaagggc cagctcattc ctccactcac gatctataga tccactagct tggcgtaatc 2040 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 2100 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 2160 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatcc 2216 <210> 16 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence corresponding to hygromycin resistance gen <400> 16 Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile 1 5 10 15 Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu 20 25 30 Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu 35 40 45 Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val His 50 55 60 Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln 85 90 95 Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu 100 105 110 Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser 115 120 125 Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr 130 135 140 Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr 145 150 155 160 His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln 165 170 175 Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg 180 185 190 His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn 195 200 205 Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp 210 215 220 Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala 225 230 235 240 Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu 245 250 255 Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp 260 265 270 Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp 275 280 285 Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val 290 295 300 Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly 305 310 315 320 Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg 325 330 335 Pro Arg Ala Lys Glu 340 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES5', synthetic <400> 17 caactcgagc ggccgccccc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt act 53 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES3', synthetic <400> 18 caagaagctt ccagaggaac tg 22 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mPGKP5', synthetic <400> 19 gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mPGKP3', synthetic <400> 20 gaggaattcg atgatcggtc gaaaggcccg 30 <210> 21 <211> 532 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGKp, synthetic <400> 21 gcgagatctt accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta 60 gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca 120 tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact 180 cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa 240 atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag 300 cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag 360 aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc 420 gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg 480 ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgaccgatc atcgaattcc tc 532 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS5', synthetic <400> 22 aatatggcca caaccatggc gacctcagca agttcc 36 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GS3', synthetic <400> 23 ggaggatccc tcgagttagt ttttgtattg gaagggct 38 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer puro5', synthetic <400> 24 gcttaagatg accgagtaca agcccacg 28 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer puro3', synthetic <400> 25 cccatcgtga tggtcaggca ccgggcttgc 30 <210> 26 <211> 620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing puromycin resistance gene, synthetic <400> 26 gcttaagatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag 60 ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga 120 tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg 180 gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac 240 gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt 300 gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc 360 caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg 420 tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc 480 cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt 540 caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg 600 tgcctgacca tcacgatggg 620 <210> 27 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence corresponding to puromycin resistance gene <400> 27 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 20 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala 195 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA5', synthetic <400> 28 caacaagcgg ccgccctcga gttcccttta gtgagggtta atgc 44 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SV40polyA3', synthetic <400> 29 cccctgaacc tgaaacataa aatg 24 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mIRES-GS5', synthetic <400> 30 acacgatgat aagcttgcca caacc 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mIRES-GS3', synthetic <400> 31 ctccacgata tccctgccat a 21 <210> 32 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA-22KhGH, mature <400> 32 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser 580 585 590 Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu 595 600 605 Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu 610 615 620 Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser 625 630 635 640 Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser 645 650 655 Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu 660 665 670 Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr 675 680 685 Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu 690 695 700 Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 705 710 715 720 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His 725 730 735 Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg 740 745 750 Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg 755 760 765 Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 770 775 <210> 33 <211> 2421 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing HSA-22KhGH gene, synthetic <400> 33 acgcgtcacc atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta 60 ttccaggggt gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga 120 tttgggagaa gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca 180 gtgtccattt gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg 240 tgttgctgat gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa 300 attatgcaca gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa 360 acaagaacct gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc 420 ccgattggtg agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac 480 atttttgaaa aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga 540 actccttttc tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga 600 taaagctgcc tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc 660 tgccaaacag agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc 720 atgggcagta gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa 780 gttagtgaca gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg 840 tgctgatgac agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag 900 taaactgaag gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt 960 ggaaaatgat gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa 1020 ggatgtttgc aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga 1080 atatgcaaga aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata 1140 tgaaaccact ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt 1200 gttcgatgaa tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga 1260 gctttttgag cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa 1320 gaaagtaccc caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt 1380 gggcagcaaa tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct 1440 atccgtggtc ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt 1500 caccaaatgc tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt 1560 cgatgaaaca tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat 1620 atgcacactt tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt 1680 gaaacacaag cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc 1740 ttttgtagag aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa 1800 aaaacttgtt gctgcaagtc aagctgcctt aggcttattc ccaaccattc ccttatccag 1860 gctttttgac aacgctatgc tccgcgccca tcgtctgcac cagctggcct ttgacaccta 1920 ccaggagttt gaagaagcct atatcccaaa ggaacagaag tattcattcc tgcagaaccc 1980 ccagacctcc ctctgtttct cagagtctat tccgacaccc tccaacaggg aggaaacaca 2040 acagaaatcc aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg ctcatccagt cgtggctgga 2100 gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg gtgtacggcg cctctgacag 2160 caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc caaacgctga tggggaggct 2220 ggaagatggc agcccccgga ctgggcagat cttcaagcag acctacagca agttcgacac 2280 aaactcacac aacgatgacg cactactcaa gaactacggg ctgctctact gcttcaggaa 2340 ggacatggac aaggtcgaga cattcctgcg catcgtgcag tgccgctctg tggagggcag 2400 ctgtggcttc taagcggccg c 2421 <210> 34 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mHSA-22KhGH <400> 34 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser 580 585 590 Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu 595 600 605 Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu 610 615 620 Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser 625 630 635 640 Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser 645 650 655 Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu 660 665 670 Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr 675 680 685 Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu 690 695 700 Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 705 710 715 720 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His 725 730 735 Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg 740 745 750 Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg 755 760 765 Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 770 775 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YA082, synthetic <400> 35 aactatactg aggcaaagga tgtcttc 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YA083, synthetic <400> 36 tgcctcagta tagtttttgc aaacatc 27 <210> 37 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22KhGH-HSA, mature <400> 37 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp 180 185 190 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu 195 200 205 Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln 210 215 220 Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe 225 230 235 240 Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser 245 250 255 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg 260 265 270 Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu 275 280 285 Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 290 295 300 Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 305 310 315 320 Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 325 330 335 His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 340 345 350 Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys 355 360 365 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 370 375 380 Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg 385 390 395 400 Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys 405 410 415 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val 420 425 430 His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg 435 440 445 Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser 450 455 460 Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 465 470 475 480 Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 485 490 495 Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu 500 505 510 Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 515 520 525 His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 530 535 540 Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys 545 550 555 560 Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln 565 570 575 Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr 580 585 590 Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln 595 600 605 Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val 610 615 620 Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 625 630 635 640 Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu 645 650 655 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 660 665 670 Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr 675 680 685 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 690 695 700 Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu 705 710 715 720 Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys 725 730 735 Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 740 745 750 Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala 755 760 765 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 770 775 <210> 38 <211> 2427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing 22KhGH-HSA gene, synthetic <400> 38 acgcgtcacc atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg 60 cctgccctgg cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga 120 caacgctatg ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt 180 tgaagaagcc tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc 240 cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc 300 caacctagag ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca 360 gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta 420 tgacctccta aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg 480 cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca 540 caacgatgac gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga 600 caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt 660 cgatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa 720 agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt 780 aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga 840 aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct 900 tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga 960 atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt 1020 tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata 1080 tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa ctccttttct ttgctaaaag 1140 gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc 1200 aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg 1260 tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag 1320 ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacag atcttaccaa 1380 agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct 1440 tgccaagtat atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga 1500 aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc 1560 tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc 1620 tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa tatgcaagaa ggcatcctga 1680 ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg 1740 ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct 1800 tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga 1860 gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac 1920 tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat gttgtaaaca 1980 tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtggtcc tgaaccagtt 2040 atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc 2100 cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa 2160 agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga 2220 gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagctcgtg aaacacaagc ccaaggcaac 2280 aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctgcaa 2340 ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgttg ctgcaagtca 2400 agctgcctta ggcttataag cggccgc 2427 <210> 39 <211> 776 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22KhGH-mHSA, mature <400> 39 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp 180 185 190 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu 195 200 205 Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln 210 215 220 Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe 225 230 235 240 Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser 245 250 255 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg 260 265 270 Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu 275 280 285 Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 290 295 300 Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 305 310 315 320 Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 325 330 335 His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 340 345 350 Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys 355 360 365 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 370 375 380 Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg 385 390 395 400 Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys 405 410 415 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val 420 425 430 His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg 435 440 445 Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser 450 455 460 Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 465 470 475 480 Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 485 490 495 Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr Glu 500 505 510 Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg 515 520 525 His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 530 535 540 Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys 545 550 555 560 Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln 565 570 575 Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr 580 585 590 Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln 595 600 605 Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val 610 615 620 Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 625 630 635 640 Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu 645 650 655 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 660 665 670 Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr 675 680 685 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 690 695 700 Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu 705 710 715 720 Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys 725 730 735 Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 740 745 750 Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala 755 760 765 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 770 775 <210> 40 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding synthetic hGHR ECD gene <400> 40 atggacctgt ggcagctcct cctgaccctc gctctggctg gctcctccga tgccttctcc 60 ggctccgagg ccaccgctgc tatcctgagc agggctccct ggtccctgca gagcgtcaac 120 cctggcctga agaccaactc ctccaaagag cccaagttca caaagtgcag gtcccccgag 180 agggagacct tctcctgtca ttggaccgac gaggtgcacc acggcaccaa gaacctgggc 240 cccatccagc tcttctacac caggaggaac acccaagagt ggacacagga gtggaaggag 300 tgccccgatt acgtgtccgc cggcgagaac agctgctact tcaactcctc cttcacatcc 360 atctggattc cttattgcat caaactgacc tccaacggcg gcacagtgga tgagaagtgc 420 ttcagcgtcg acgagatcgt gcagcccgat ccccccatcg ctctgaactg gaccctgctg 480 aatgtgtccc tgaccggcat ccacgccgat attcaggtga ggtgggaggc tcccaggaac 540 gctgacatcc agaagggctg gatggtcctg gagtacgagc tgcagtacaa ggaggtcaac 600 gagaccaagt ggaaaatgat ggaccctatc ctgacaacat ccgtccctgt gtacagcctg 660 aaggtggaca aagagtacga ggtgagggtg aggagcaaac agcggaatag cggcaactac 720 ggagaattct ccgaggtgct gtatgtgacc ctgccccaga tgtcccagtt cacctgtgaa 780 gaggactttt ac 792 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YA034, synthetic <400> 41 ccgacgcgtc gccaccatgg acctgtggca gctcctcctg ac 42 <210> 42 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YA035, synthetic <400> 42 cactgttagc ccgaatattc cgaagatgat aattaggagc catgggaagt aaaagtcctc 60 ttcacag 67 <210> 43 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer K708, synthetic <400> 43 ccggtcgacc gccaccatgg atctctggca gctgctgttg acc 43 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer K709, synthetic <400> 44 tttggcggcc gcctaaggca tgattttgtt cagttggtc 39 <210> 45 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding synthetic hGHR gene <400> 45 atggacctgt ggcagctcct cctgaccctc gctctggctg gctcctccga tgccttctcc 60 ggctccgagg ccaccgctgc tatcctgagc agggctccct ggtccctgca gagcgtcaac 120 cctggcctga agaccaactc ctccaaagag cccaagttca caaagtgcag gtcccccgag 180 agggagacct tctcctgtca ttggaccgac gaggtgcacc acggcaccaa gaacctgggc 240 cccatccagc tcttctacac caggaggaac acccaagagt ggacacagga gtggaaggag 300 tgccccgatt acgtgtccgc cggcgagaac agctgctact tcaactcctc cttcacatcc 360 atctggattc cttattgcat caaactgacc tccaacggcg gcacagtgga tgagaagtgc 420 ttcagcgtcg acgagatcgt gcagcccgat ccccccatcg ctctgaactg gaccctgctg 480 aatgtgtccc tgaccggcat ccacgccgat attcaggtga ggtgggaggc tcccaggaac 540 gctgacatcc agaagggctg gatggtcctg gagtacgagc tgcagtacaa ggaggtcaac 600 gagaccaagt ggaaaatgat ggaccctatc ctgacaacat ccgtccctgt gtacagcctg 660 aaggtggaca aagagtacga ggtgagggtg aggagcaaac agcggaatag cggcaactac 720 ggagaattct ccgaggtgct gtatgtgacc ctgccccaga tgtcccagtt cacctgtgaa 780 gaggactttt acttcccatg gctcctaatt atcatcttcg gaatattcgg gctaacagtg 840 atgctatttg tattcttatt ttctaaacag caaaggatta aaatgctgat tctgccccca 900 gttccagttc caaagattaa aggaatcgat ccagatctcc tcaaggaagg aaaattagag 960 gaggtgaaca caatcttagc cattcatgat agctataaac ccgaattcca cagtgatgac 1020 tcttgggttg aatttattga gctagatatt gatgagccag atgaaaagac tgaggaatca 1080 gacacagaca gacttctaag cagtgaccat gagaaatcac atagtaacct aggggtgaag 1140 gatggcgact ctggacgtac cagctgttgt gaacctgaca ttctggagac tgatttcaat 1200 gccaatgaca tacatgaggg tacctcagag gttgctcagc cacagaggtt aaaaggggaa 1260 gcagatctct tatgccttga ccagaagaat caaaataact caccttatca tgatgcttgc 1320 cctgctactc agcagcccag tgttatccaa gcagagaaaa acaaaccaca accacttcct 1380 actgaaggag ctgagtcaac tcaccaagct gcccatattc agctaagcaa tccaagttca 1440 ctgtcaaaca tcgactttta tgcccaggtg agcgacatta caccagcagg tagtgtggtc 1500 ctttccccgg gccaaaagaa taaggcaggg atgtcccaat gtgacatgca cccggaaatg 1560 gtctcactct gccaagaaaa cttccttatg gacaatgcct acttctgtga ggcagatgcc 1620 aaaaagtgca tccctgtggc tcctcacatc aaggttgaat cacacataca gccaagctta 1680 aaccaagagg acatttacat caccacagaa agccttacca ctgctgctgg gaggcctggg 1740 acaggagaac atgttccagg ttctgagatg cctgtcccag actatacctc cattcatata 1800 gtacagtccc cacagggcct catactcaat gcgactgcct tgcccttgcc tgacaaagag 1860 tttctctcat catgtggcta tgtgagcaca gaccaactga acaaaatcat gccttag 1917

Claims (25)

  1. 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 결실하고 및/또는 10 개 이하의 아미노산 잔기가 치환되어 이루어지는 아미노산 서열로서, 단 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째의 아스파라긴 잔기 및 320 번째의 트레오닌 잔기가 이들 2 잔기의 사이에 프롤린 이외의 단일의 아미노산 잔기 (X) 를 개재하여 펩티드 결합에 의해 연결된 상태로 보존되어 있는 것인 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 인간 혈청 알부민 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    그 아미노산 잔기 (X) 가 티로신인 인간 혈청 알부민 변이체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열에 대하여, 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 번째 ∼ 320 번째에 대응하는 위치의 서열 부분 이외에 있어서, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 부가되어 이루어지고, 또한 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열과는 동일하지 않은 것인 인간 혈청 알부민 변이체.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열에 대하여, 10 개 이하의 아미노산 잔기가 N 말단 또는 C 말단에 부가되어 이루어지고, 또한 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열과는 동일하지 않은 것인 인간 혈청 알부민 변이체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 제 1 폴리펩티드 사슬과, 이것에 연결된 다른 단백질 (A) 의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하여 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  7. 제 6 항에 있어서,
    (a) 그 제 1 폴리펩티드 사슬의 N 말단에 그 제 2 폴리펩티드 사슬의 C 말단이, 또는
    (b) 그 제 1 폴리펩티드 사슬의 C 말단에 그 제 2 폴리펩티드 사슬의 N 말단이,
    펩티드 결합을 개재하여 연결되어 있는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  8. 제 7 항에 있어서,
    그 펩티드 결합을 개재한 연결이 링커와의 펩티드 결합을 포함하는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  9. 제 8 항에 있어서,
    그 링커가 1 ∼ 50 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  10. 제 8 항에 있어서,
    그 링커가 1 ∼ 6 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  11. 제 8 항에 있어서,
    그 링커가 Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  12. 제 8 항에 있어서,
    그 링커가 아미노산 서열 Gly-Ser 로 나타내는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    그 단백질 (A) 가 생체에 투여했을 때에 생리 활성을 나타내는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  14. 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    그 단백질 (A) 가 α-L-이두로니다아제, 이두론산-2-술파타아제, 글루코세레브로시다아제, β-갈락토시다아제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다아제 A, β-헥소사미니다아제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라아제, α-만노시다아제, β-만노시다아제, 갈락토실세라미다아제, 사포신 C, 아릴술파타아제 A, α-L-푸코시다아제, 아스파르틸글루코사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, α-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제, 헤파란 황산 N-술파타아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제, 아세틸CoAα-글루코사미니드N-아세틸트랜스페라아제, N-아세틸글루코사민-6-황산술파타아제, 산성 세라미다아제, 아밀로-1,6-글루코시다아제, CLN1 ∼ 10 을 포함하는 리소좀 효소, PD-1 리간드, 뼈 형성 단백질 (BMP), 인슐린, 프로락틴, 모틸린, 부신피질 자극 호르몬 (ACTH), 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH), 갑상선 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 부갑상선 호르몬 (PTH) 트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 (SCF), 렙틴, 바소프레신, 옥시토신, 칼시토닌, 글루카곤, 가스트린, 세크레틴, 판크레오지민, 콜레시스토키닌, 안지오텐신, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인간 태반 락토겐 (HPL), 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG), 엔케팔린, 엔돌핀, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 2, 티모포이에틴, 티모스티물린, 흉선 액성 인자 (THF), 혈중 흉선 인자 (FTS), 티모신, 티믹 팩터 X, 종양 괴사 인자 (TNF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (tPA), 다이놀핀, 봄베신, 뉴로텐신, 세룰레인, 브래디키닌, 아스파라기나아제, 칼리크레인, 서브스탠스 P, 신경 성장 인자 (NGF), 모양체 신경 영양 인자 (CNTF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 글리아 세포주 유래 신경 영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 선유아세포 성장 인자 (bFGF), 선유아세포 성장 인자 2 (FGF2), 혈관내 피증식 인자 (VEGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 거핵구 증식 분화 인자 (MGDF), 혈액 응고 인자 VII, 혈액 응고 인자 VIII, 혈액 응고 인자 IX, 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD), 염산 리소자임, 폴리믹신 B, 콜리스틴, 그라미시딘, 바시트라신, 위산 분비 억제 폴리펩티드 (GIP), 혈관 작동성 장 폴리펩티드 (VIP), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 성장 호르몬 분비 인자 (GRF), 상피 세포 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴, 소마토스타틴, 인슐린형 성장 인자 1 (IGF-1), 20K 성장 호르몬, 22K 성장 호르몬, 및 이들의 염 혹은 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  15. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    그 단백질 (A) 가 22K 성장 호르몬인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  16. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    그 단백질 (A) 가 20K 성장 호르몬인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  17. 제 15 항에 있어서,
    서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  18. 제 16 항에 있어서,
    서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
  19. 제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A) 를 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는, 의약.
  20. 제 19 항에 있어서,
    성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에 있어서의 저신장, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에 있어서의 저신장증, 연골 이영양증에 있어서의 저신장증, 및 SGA 성 저신장증으로서, 어느 것도 골단선 폐쇄를 수반하지 않는 것, 그리고 성인 성장 호르몬 분비 부전증, AIDS 에 의한 소모, 및 거식증에 의한 소모로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 치료제인 의약.
  21. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 DNA.
  22. 제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A) 를 코드하는 유전자를 포함하여 이루어지는 DNA.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항의 DNA 를 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
  24. 제 23 항의 벡터로 형질 전환된 포유류 세포.
  25. 제 24 항의 포유류 세포를, 무혈청 배지에서 배양함으로써 얻어지는 인간 혈청 알부민 변이체 또는 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 인간 혈청 알부민 변이체 연결 단백질 (A).
KR1020187009487A 2015-09-08 2016-09-08 신규 인간 혈청 알부민 변이체 KR102360744B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015177093 2015-09-08
JPJP-P-2015-177093 2015-09-08
PCT/JP2016/076438 WO2017043569A1 (ja) 2015-09-08 2016-09-08 新規なヒト血清アルブミン変異体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180042432A true KR20180042432A (ko) 2018-04-25
KR102360744B1 KR102360744B1 (ko) 2022-02-08

Family

ID=58239798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187009487A KR102360744B1 (ko) 2015-09-08 2016-09-08 신규 인간 혈청 알부민 변이체

Country Status (17)

Country Link
US (3) US10654912B2 (ko)
EP (3) EP4374913A3 (ko)
JP (4) JP6886920B2 (ko)
KR (1) KR102360744B1 (ko)
CN (2) CN114591445B (ko)
AU (3) AU2016319540B2 (ko)
CA (2) CA2996672C (ko)
CY (1) CY1123997T1 (ko)
DK (1) DK3348635T3 (ko)
ES (1) ES2861059T3 (ko)
HK (1) HK1247244A1 (ko)
HR (1) HRP20210635T1 (ko)
HU (1) HUE053937T2 (ko)
PL (1) PL3348635T3 (ko)
PT (1) PT3348635T (ko)
SI (1) SI3348635T1 (ko)
WO (1) WO2017043569A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017159540A1 (ja) * 2016-03-14 2017-09-21 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミン－２０ｋ成長ホルモン融合タンパク質
CN112566652A (zh) 2018-06-25 2021-03-26 Jcr制药股份有限公司 含有蛋白的水性液体制剂
CN109734816A (zh) * 2019-03-12 2019-05-10 王大勇 一种基因重组人促皮质素与白蛋白的融合蛋白及表达方法
EP4047006A4 (en) * 2019-10-17 2023-11-01 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. METHOD FOR PRODUCING SERUM-ALBUMIN FUSION PROTEIN AND GROWTH HORMONE
JP2021070700A (ja) * 2019-10-30 2021-05-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物
CN113430227A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 佛山汉腾生物科技有限公司 制备稳定细胞池的方法、蛋白表达方法及试剂盒
CN114133458B (zh) * 2021-12-08 2023-11-14 福州大学 一种在人血清白蛋白内部融合多肽的方法
JP2024056666A (ja) * 2022-10-11 2024-04-23 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミンと生理活性を有する蛋白質との融合蛋白質

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03178998A (ja) 1989-08-03 1991-08-02 Rhone Poulenc Sante 治療的機能を有するアルブミンの誘導体
JPH07503368A (ja) 1992-01-31 1995-04-13 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
JPH07503844A (ja) 1992-01-31 1995-04-27 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド，それらの調製およびそれらを含有する医薬組成
JP2000502901A (ja) 1995-12-30 2000-03-14 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 成長ホルモンおよび血清アルブミンに対する組換え融合タンパク質
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
JP2005514060A (ja) 2001-12-21 2005-05-19 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US20060122374A1 (en) * 2002-02-07 2006-06-08 Peter Mertins Albumin-fused anti-angiogenesis peptides
JP2008518615A (ja) 2004-11-04 2008-06-05 ノーティラス・バイオテック 修飾成長ホルモン
US20090009907A1 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 Headway Technologies, Inc. Laminated film for head applications
JP2010500031A (ja) 2006-08-07 2010-01-07 テヴァ バイオファーマシューティカルズ ユーエスエー，インコーポレーティッド アルブミン−インスリン融合タンパク質
JP2013501036A (ja) 2009-08-06 2013-01-10 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 長期のインビボ有効性を有する成長ホルモン
JP2013518038A (ja) 2010-01-22 2013-05-20 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー ｉｎ−ｖｉｖｏにおける効力が延長された成長ホルモン

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3398427B2 (ja) * 1992-09-09 2003-04-21 三井化学株式会社 成長ホルモンの生産方法
NZ286884A (en) * 1995-06-29 1997-12-19 Mitsui Chemicals Inc Use of 20 kd human growth hormone in hrt, increasing serum igf-1 levels and stimulating lipolysis
WO1997024450A1 (en) * 1996-01-02 1997-07-10 Paik Kye Hyung Method for immunizing and treating human cells in animal organs maintained in vitro
US6123775A (en) 1999-06-30 2000-09-26 Lam Research Corporation Reaction chamber component having improved temperature uniformity
GB0217347D0 (en) * 2002-07-26 2002-09-04 Univ Edinburgh Novel albumins
SI1729795T1 (sl) 2004-02-09 2016-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Albuminski fuzijski proteini
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
CN1313494C (zh) * 2005-08-29 2007-05-02 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种具有促增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用
JP4983148B2 (ja) * 2006-08-18 2012-07-25 ニプロ株式会社 糖鎖含有アルブミン、その製造方法およびその用途
US7943570B2 (en) * 2007-10-16 2011-05-17 Nipro Corporation Sugar chain-containing albumin, production method thereof and use thereof
CN101429240A (zh) * 2007-11-06 2009-05-13 尼普洛株式会社 一种含有糖链的白蛋白、其制备方法及其用途
CA2611540C (en) * 2007-11-09 2017-05-30 Nipro Corporation Sugar chain-containing albumin as a drug carrier to the liver
AU2010239861B2 (en) * 2009-04-22 2013-07-11 Alteogen, Inc In vivo half life increased fusion protein or peptide maintained by sustained in vivo release, and method for increasing in vivo half-life using same
CN102336828B (zh) * 2010-07-26 2013-06-26 中国医学科学院基础医学研究所 一种多发性骨髓瘤特异性蛋白及其专用检测试剂盒
CN103201382A (zh) 2010-11-08 2013-07-10 日本化学研究株式会社 新表达载体
US9657310B2 (en) 2012-04-27 2017-05-23 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Expression vector

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03178998A (ja) 1989-08-03 1991-08-02 Rhone Poulenc Sante 治療的機能を有するアルブミンの誘導体
JPH07503368A (ja) 1992-01-31 1995-04-13 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
JPH07503844A (ja) 1992-01-31 1995-04-27 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド，それらの調製およびそれらを含有する医薬組成
JP2000502901A (ja) 1995-12-30 2000-03-14 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 成長ホルモンおよび血清アルブミンに対する組換え融合タンパク質
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
JP2011015690A (ja) 2001-12-21 2011-01-27 Human Genome Sciences Inc アルブミン融合タンパク質
JP2005514060A (ja) 2001-12-21 2005-05-19 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US20060122374A1 (en) * 2002-02-07 2006-06-08 Peter Mertins Albumin-fused anti-angiogenesis peptides
JP2008518615A (ja) 2004-11-04 2008-06-05 ノーティラス・バイオテック 修飾成長ホルモン
JP2010500031A (ja) 2006-08-07 2010-01-07 テヴァ バイオファーマシューティカルズ ユーエスエー，インコーポレーティッド アルブミン−インスリン融合タンパク質
US20090009907A1 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 Headway Technologies, Inc. Laminated film for head applications
JP2013501036A (ja) 2009-08-06 2013-01-10 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 長期のインビボ有効性を有する成長ホルモン
JP2013518038A (ja) 2010-01-22 2013-05-20 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー ｉｎ−ｖｉｖｏにおける効力が延長された成長ホルモン

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brand S. et al., Clin Chim Acta. 136, 197-202 (1984)
Brennan SO. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 87, 26-30 (1990)
Poznansky MJ. et al., FEBS Letter. 239, 18-22 (1988)

Also Published As

Publication number Publication date
CA2996672A1 (en) 2017-03-16
US20180244754A1 (en) 2018-08-30
EP3845644A1 (en) 2021-07-07
US20210269507A1 (en) 2021-09-02
EP3845644B1 (en) 2024-04-24
EP3348635A4 (en) 2019-06-19
EP3845644C0 (en) 2024-04-24
CY1123997T1 (el) 2022-05-27
AU2016319540A1 (en) 2018-03-22
JP7123216B2 (ja) 2022-08-22
JP2022166098A (ja) 2022-11-01
PT3348635T (pt) 2021-03-15
CN114591445B (zh) 2024-04-23
EP4374913A2 (en) 2024-05-29
SI3348635T1 (sl) 2021-08-31
US11634474B2 (en) 2023-04-25
US10654912B2 (en) 2020-05-19
CA3183289A1 (en) 2017-03-16
CN107949638A (zh) 2018-04-20
DK3348635T3 (da) 2021-03-01
JP2024037850A (ja) 2024-03-19
AU2021212110B2 (en) 2022-07-14
ES2861059T3 (es) 2021-10-05
JPWO2017043569A1 (ja) 2018-06-28
CA2996672C (en) 2023-02-21
WO2017043569A1 (ja) 2017-03-16
HUE053937T2 (hu) 2021-08-30
AU2022204463B2 (en) 2024-05-02
EP3348635B1 (en) 2021-02-17
EP4374913A3 (en) 2024-08-14
AU2016319540B2 (en) 2021-08-26
JP6886920B2 (ja) 2021-06-16
AU2022204463A1 (en) 2022-07-14
HRP20210635T1 (hr) 2021-08-20
CN107949638B (zh) 2022-05-13
EP3348635A1 (en) 2018-07-18
KR102360744B1 (ko) 2022-02-08
HK1247244A1 (zh) 2018-09-21
US11046751B2 (en) 2021-06-29
AU2021212110A1 (en) 2021-08-26
US20200247872A1 (en) 2020-08-06
PL3348635T3 (pl) 2021-09-27
CN114591445A (zh) 2022-06-07
JP7403595B2 (ja) 2023-12-22
JP2021141893A (ja) 2021-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022204463B2 (en) Novel human serum albumin mutant
JP4035400B2 (ja) 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質
JP3946638B2 (ja) 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質
AU2002300359B2 (en) Fusion Protein Having Enhanced in vivo Activity of Erythropoietin
WO2015062350A1 (zh) 一种长效重组促卵泡激素及其应用
US10968267B2 (en) Serum albumin-20K growth hormone fusion protein
KR20220095204A (ko) 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질을 함유하는 수성 의약 조성물
KR20220083784A (ko) 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질의 제조 방법
JP2017502005A (ja) ペグ化タンパク質の組成物を調製するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant