JP2021070700A - 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物 - Google Patents
血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021070700A JP2021070700A JP2020180998A JP2020180998A JP2021070700A JP 2021070700 A JP2021070700 A JP 2021070700A JP 2020180998 A JP2020180998 A JP 2020180998A JP 2020180998 A JP2020180998 A JP 2020180998A JP 2021070700 A JP2021070700 A JP 2021070700A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- concentration
- amino acid
- hsa
- fusion protein
- aqueous pharmaceutical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 107
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title abstract description 27
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title abstract description 26
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title abstract description 22
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 title abstract description 9
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 title abstract description 9
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 97
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 24
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 108
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 36
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 36
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 17
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 16
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 16
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 15
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 11
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 10
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 10
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 10
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 5
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 5
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 5
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 4
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 93
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 46
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 63
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 50
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 32
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 32
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 31
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 16
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 12
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 12
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 10
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 10
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 10
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 10
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 10
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 10
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 9
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 9
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 7
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010054737 albumin Redhill Proteins 0.000 description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 4
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 239000012572 advanced medium Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- BNMJSBUIDQYHIN-UHFFFAOYSA-N butyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCCOP(O)(O)=O BNMJSBUIDQYHIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 3
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical class [H]ON([H])[*] 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710190 Cardiovirus Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N L-methionine S-oxide Chemical compound CS(=O)CC[C@H](N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029748 Noonan syndrome Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241001180873 Saposhnikovia divaricata Species 0.000 description 1
- 206010041092 Small for dates baby Diseases 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000009751 slip forming Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 230000007279 water homeostasis Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/05—Phenols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Abstract
【課題】血清アルブミンと成長ホルモンが連結した蛋白質を含有する水性医薬組成物を提供すること。【解決手段】ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって,該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,スクロースの濃度が10〜150mg/mLであり,非イオン性界面活性剤の濃度が0.15〜10mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12mg/mLであり,緩衝剤の濃度が1〜30mMであり,pHが5.0〜8.0である,水性医薬組成物。【選択図】図1
Description
本発明は,例えば,血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を有効成分として含有する医薬の,溶液状態で貯蔵安定な水性医薬組成物に関し,より詳しくは,安定化剤として,スクロースと非イオン性界面活性剤を更に含有する水性医薬組成物に関する。
ヒト成長ホルモン(hGH)は,視床下部の制御下で下垂体前葉から分泌される蛋白質である。hGHは,軟骨形成促進,蛋白質同化促進等の成長促進活性を示すほか,体組成及び脂質代謝改善作用を示す。hGHの分泌が少ない小児は,健常児と比較して低身長を呈する成長ホルモン分泌不全性低身長症を発症する。
hGH遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約22KDのhGHを有効成分として含有する製剤(hGH製剤)が,成長ホルモン分泌不全性低身長症,ターナー症候群における低身長,SGA(Small-for-Gestational Age)性低身長症,ヌーナン症候群における低身長症,慢性腎不全による低身長症,プラダーウィリー症候群における低身長症,軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床応用されている。hGH製剤は,これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。hGH製剤は,皮下又は筋肉内に投与されて血中を循環し,その成長促進活性により患者の成長を促す効果を奏する。また,hGH製剤は,成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床応用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では,脂質代謝異常等種々の異常が認められるが,hGH製剤の投与により,患者の脂質代謝が正常化する等,患者のQOLが改善される。成長ホルモン分泌不全性低身長症,成人成長ホルモン分泌不全症等に対するhGH製剤としては,例えば,グロウジェクト(登録商標)がある。
hGHの血漿中における半減期は20分未満とされており,患者に投与されたhGHは,速やかに血中から消失する。このため,hGHの薬効を患者で実質的に発揮させるには,患者にhGHを週に3回筋肉内に又は毎日皮下に投与する必要がある。このような頻繁な投与は患者の負担となっている。従って,hGHの血漿中における安定性を増加させて半減期を延長させることにより患者へのhGHの投与回数を減らすことができれば,患者の負担を軽減させることができ,好ましい。
ヒト血清アルブミン(HSA)は,その成熟型が585個のアミノ酸からなる蛋白質である。HSAは,血漿蛋白質の中では最も量の多い成分で,血漿中での半減期が14〜20日と長い。HSAは,血漿の浸透圧の調節に寄与するとともに,血中の陽イオン,脂肪酸,ホルモン類,ビリルビンその他の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質と結合してそれらを運搬する機能を有する。一般に,HSAと結合した物質は,臓器に取り込まれ難くなり,血中をより長時間循環できるようになる。
ヒト血清アルブミン(HSA)には,天然のバリアントが複数あることが知られている。ヒト血清アルブミンRedhillはその一つである(非特許文献1,2)。ヒト血清アルブミンRedhillは,585個のアミノ酸からなる上記の通常のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列と比べて,そのN末端側から320番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり,且つそのN末端にアルギニン残基が一つ付加している点で異なり,586個のアミノ酸からなる。上記アラニンのトレオニンへの変化により,アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列が生じ,この配列中のAsn(アスパラギン)残基がN−結合型グリコシド化される。このためアルブミンRedhillは,上記の通常のヒト血清アルブミンと比較して分子量が2.5kDa程大きく観察される。
hGHの血漿中での安定性を,hGHにHSAを結合させることによって増加させる方法が報告されている(特許文献1〜8)。hGHにHSAを結合させた蛋白質は,hGHをコードする遺伝子とHSAをコードする遺伝子とをインフレームに結合させたDNAを組込んだ発現ベクターを導入した形質転換細胞を作製し,この細胞を培養することにより,培地中又は細胞内に組換え蛋白質として作製される。
上記背景の下で,本発明の一目的は,ヒトアルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質を有効成分として含有する医薬の,市場に流通させることが可能な程度に安定な,水性医薬組成物を提供することである。
本発明者らは,上記目的に向けた研究において検討を重ねた結果,585個のアミノ酸からなる通常のヒト血清アルブミンと比較してそのN末端から320番目のアミノ酸残基であるアラニンがトレオニンで置き換わっているものであるアミノ酸配列よりなる変異体(ヒト血清アルブミン変異体)をヒト成長ホルモン(hGH)と結合させて得た化合物(ヒト血清アルブミン変異体−hGH融合蛋白質)が,スクロースと非イオン性界面活性剤とを含有する水性医薬組成物中で安定であることを見出し,本発明を完成した。すなわち,本発明は以下を含むものである。
1.ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって,該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,スクロースの濃度が10〜150mg/mLであり,非イオン性界面活性剤の濃度が0.15〜10mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12mg/mLであり,緩衝剤の濃度が1〜30mMであり,pHが5.0〜8.0である,水性医薬組成物。
2.該融合蛋白質の濃度が,15〜70mg/mLである,上記1に記載の水性医薬組成物。
3.該スクロースの濃度が,50〜100mg/mLである,上記1又は2に記載の水性医薬組成物。
4.該非イオン性界面活性剤の濃度が,1.5〜4.5mg/mLである,上記1乃至3のいずれかに記載の水性医薬組成物。
5.該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート又はポロキサマーである,上記1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
6.該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート20,ポリソルベート80及びポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールからなる群から選択されるものである,上記1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
7.該防腐剤がフェノールである,上記1乃至6のいずれかに記載の水性医薬組成物。
8.該フェノールの濃度が,3〜9mg/mLである,上記7に記載の水性医薬組成物。
9.該緩衝剤がリン酸緩衝剤である,上記1乃至8のいずれかに記載の水性医薬組成物。
10.該リン酸緩衝剤の濃度が,2〜20mMである,上記9に記載の水性医薬組成物。
11.該pHが,6.0〜7.8である,上記1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
12.該pHが,6.5〜7.6である,上記1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
13.該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
14.該融合蛋白質の濃度が15〜70mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
15.該融合蛋白質の濃度が50mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
16.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,85%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
17.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,90%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
18.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,95%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
19.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
1.ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって,該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,スクロースの濃度が10〜150mg/mLであり,非イオン性界面活性剤の濃度が0.15〜10mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12mg/mLであり,緩衝剤の濃度が1〜30mMであり,pHが5.0〜8.0である,水性医薬組成物。
2.該融合蛋白質の濃度が,15〜70mg/mLである,上記1に記載の水性医薬組成物。
3.該スクロースの濃度が,50〜100mg/mLである,上記1又は2に記載の水性医薬組成物。
4.該非イオン性界面活性剤の濃度が,1.5〜4.5mg/mLである,上記1乃至3のいずれかに記載の水性医薬組成物。
5.該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート又はポロキサマーである,上記1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
6.該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート20,ポリソルベート80及びポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールからなる群から選択されるものである,上記1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
7.該防腐剤がフェノールである,上記1乃至6のいずれかに記載の水性医薬組成物。
8.該フェノールの濃度が,3〜9mg/mLである,上記7に記載の水性医薬組成物。
9.該緩衝剤がリン酸緩衝剤である,上記1乃至8のいずれかに記載の水性医薬組成物。
10.該リン酸緩衝剤の濃度が,2〜20mMである,上記9に記載の水性医薬組成物。
11.該pHが,6.0〜7.8である,上記1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
12.該pHが,6.5〜7.6である,上記1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
13.該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
14.該融合蛋白質の濃度が15〜70mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
15.該融合蛋白質の濃度が50mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,上記1に記載の水性医薬組成物。
16.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,85%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
17.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,90%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
18.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,95%以上の同一性を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
19.該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するものである,上記1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
本発明によれば,例えば,市場に流通させることが可能な程度に,ヒトアルブミンとヒト成長ホルモンが結合した蛋白質を有効成分として含有する医薬を,安定な水性医薬組成物とすることができる。
本明細書において,単に「ヒト血清アルブミン」又は「HSA」というときは,配列番号1で示される585個のアミノ酸残基からなる通常の野生型のヒト血清アルブミンに加え,血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り,配列番号1で示されるアミノ酸配列に対し,1個又は複数個のアミノ酸残基が,置換,欠失,及び/又は付加(本明細書において,アミノ酸残基の「付加」は,配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。)されたものに相当するHSAの変異体も特に区別することなく包含する。アミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合,置換するアミノ酸残基の個数は,好ましくは1〜10個であり,より好ましくは1〜5個であり,更に好ましくは1〜3個である。アミノ酸残基を欠失させる場合,欠失させるアミノ酸残基の個数は,好ましくは1〜10個であり,より好ましくは1〜5個であり,更に好ましくは1〜3個である。例えば,配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端のアミノ酸残基が欠失した,584個のアミノ酸残基からなる変異体も,ヒト血清アルブミンに含まれる。また,これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせてもよい。更に,通常の野生型のHSA又はその変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のN末端側若しくはC末端側に,1個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。このとき付加されるアミノ酸残基の個数は,好ましくは1〜10個であり,より好ましくは1〜5個であり,更に好ましくは1〜3個である。
これらアミノ酸の置換,欠失,及び付加の3種類の変異のうち,少なくとも2種類の変異を組み合わせて導入したHSAの変異体としては,配列番号1で示されるアミノ酸配列に対し,0〜10個のアミノ酸残基の欠失と,0〜10個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と,更に0〜10個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。より好ましくは,配列番号1で示されるアミノ酸配列に対するそれら欠失,置換,及び/又は付加されるアミノ酸残基の個数は,好ましくはそれぞれ5個以下,更に好ましくは3個以下である。
本発明において,「ヒト血清アルブミンRedhill」(HSA-Redhill)の語は,ヒト血清アルブミンのバリアントであって,配列番号2で示される586個のアミノ酸残基からなるものを意味する。ヒト血清アルブミンRedhillは,配列番号1で示される585個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して,N末端から320番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり且つN末端にアルギニン残基が一つ付加したものに相当する。このアラニンのトレオニンへの置換により,アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ,この配列部分中のAsn(アスパラギン)残基がN−結合型グリコシド化されている。このためアルブミンRedhillは,通常の野生型アルブミン(配列番号1)と比較して分子量が2.5kDa程大きく観察される。
本発明において,「ヒト血清アルブミン変異体」(HSA変異体)の語は,通常の野生型HSA(配列番号1)に対する上述の変異体であって,但し配列番号2で示されるバリアント(HSA-Redhill)以外のものをいう。本発明において好ましいHSA変異体は,野生型のHSAのアミノ酸配列のN末端から320番目のアラニンがトレオニンへ置換したものである配列番号3で示されるものに加え,血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り,配列番号3で示されるアミノ酸配列に対し,1個又は複数個のアミノ酸残基が,他のアミノ酸残基へ置換され,欠失し,或いは付加されたアミノ酸配列であって,但し配列番号3で示されるアミノ酸配列のN末端から318番目のアスパラギン残基及び320番目のトレオニン残基が,これら2残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基(X)を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を有するものを含む。当該アミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合,置換するアミノ酸残基の個数は,好ましくは1〜10個であり,より好ましくは1〜5個であり,更に好ましくは1〜3個である。アミノ酸残基を欠失させる場合,欠失させるアミノ酸残基の個数は,好ましくは1〜10個であり,より好ましくは1〜5個であり,更に好ましくは1〜3個である。例えば,配列番号3で示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端のアミノ酸残基が欠失した,584個のアミノ酸残基からなる変異体でもよい。また,これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせたものであってもよい。更に,それら変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のN末端側若しくはC末端側に,1個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。即ち,配列番号3で示されるアミノ酸配列に対し,アミノ酸の置換及び欠失,及び付加の3種類の変異のうち,少なくとも2種類の変異を組み合わせて導入したものであって,0〜10個のアミノ酸残基の欠失と,0〜10個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と,更に0〜10個のアミノ酸残基の付加とを行ったものであることができる。但し,配列番号3に示されるアミノ酸配列のN末端から318〜320番目のアミノ酸残基はアスパラギン−X−トレオニン(「X」はプロリン以外のアミノ酸残基)でなければならず,好ましくは,アスパラギン−チロシン−トレオニンである。なお,ヒト血清アルブミン変異体は,ヒト血清アルブミンとしての機能を保持する限り,ヒト血清アルブミンに包含される。ここでヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列は,配列番号1で示される通常の野生型HSAのアミノ酸配列と,好ましくは85%以上の同一性を,より好ましくは90%以上の同一性を,更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
本発明において,種々のHSA変異体における通常の野生型HSAと比較したときの各変異の位置及びその形式(欠失,置換,付加)は,両HSAのアミノ酸配列のアラインメントにより,容易に確認することができる。なお,本発明において,野生型HSAのアミノ酸配列と変異を加えたHSAのアミノ酸配列との同一性は,周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば,そのようなアルゴリズムとして,BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)),Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)),Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
上記のHSAのアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換は,例えば,アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は,HSAの機能に大きな変化をもたらさない(即ち,保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては,例えば以下のものがある:
(1)酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸,
(2)塩基性アミノ酸であるヒスチジン,リシン,及びアルギニン
(3)芳香族アミン酸であるフェニルアラニン,チロシン,トリプトファン,
(4)水酸基を有するアミノ酸(ヒドロキシアミノ酸)であるセリンとトレオニン,
(5)疎水性アミノ酸であるメチオニン,アラニン,バリン,ロイシン,及びイソロイシン,
(6)中性の親水性アミノ酸であるシステイン,セリン,トレオニン,アスパラギン,及びグルタミン,
(7)ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン,
(8)アミド型アミノ酸(極性アミノ酸)であるアスパラギンとグルタミン,
(9)脂肪族アミノ酸である,アラニン,ロイシン,イソロイシン,及びバリン,
(10)側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン,グリシン,セリン,及びトレオニン,
(11)側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
(1)酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸,
(2)塩基性アミノ酸であるヒスチジン,リシン,及びアルギニン
(3)芳香族アミン酸であるフェニルアラニン,チロシン,トリプトファン,
(4)水酸基を有するアミノ酸(ヒドロキシアミノ酸)であるセリンとトレオニン,
(5)疎水性アミノ酸であるメチオニン,アラニン,バリン,ロイシン,及びイソロイシン,
(6)中性の親水性アミノ酸であるシステイン,セリン,トレオニン,アスパラギン,及びグルタミン,
(7)ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン,
(8)アミド型アミノ酸(極性アミノ酸)であるアスパラギンとグルタミン,
(9)脂肪族アミノ酸である,アラニン,ロイシン,イソロイシン,及びバリン,
(10)側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン,グリシン,セリン,及びトレオニン,
(11)側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
後述の実施例においてヒト成長ホルモンとヒト血清アルブミン変異体とを結合させた蛋白質におけるヒト血清アルブミン変異体(HSA変異体の典型的一例)は,585個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1)に対し,N末端から320番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンである点においてのみ異なる(配列番号3)。この相違により,当該HSA変異体(「HSA(A320T)」という。)ではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ,この配列部分においてAsn(アスパラギン)残基がN−結合型グリコシド化されることができる。
本明細書において,「ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質」又は「ヒト血清アルブミン−hGH融合蛋白質(HSA−hGH融合蛋白質)」とは,HSAと成長ホルモンとを結合させた蛋白質のことをいう。ここで,これらの蛋白質を「結合させる」とは,例えば,これらをペプチド結合により連結させることを含むが,これに限られない。また,これらの蛋白質を「結合させる」とは,一方のN末端と他方のC末端との間を直接にペプチド結合で連結させることのみならず,両蛋白質をリンカーを介して間接的に結合させることをも含む。特に,ヒト血清アルブミンがヒト血清アルブミン変異体であるときは,「ヒト血清アルブミン変異体とヒト成長ホルモンの融合蛋白質」又は「ヒト血清アルブミン変異体−hGH融合蛋白質(HSA変異体−hGH融合蛋白質)」という。つまり,ヒト血清アルブミン変異体−hGH融合蛋白質は,ヒト血清アルブミン−hGH融合蛋白質に包含される。「ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質」は,HSA連結hGHということもできる。
ここに「リンカー」は,上記2つのポリペプチドの間にあって両者を共有結合で結合する構造部分であり,HSA(HSA変異体を含む)とその結合相手である成長ホルモンの何れの末端にも由来しないものである。リンカーは,両ポリペプチドとペプチド結合した,単一のアミノ酸残基であるか又は2個以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖部分(ペプチドリンカー)であることができ,これら1個以上のアミノ酸残基からなるリンカーを,本明細書において包括的に「ペプチドリンカー」という。また,本明細書において,HSAと成長ホルモンが「ペプチド結合を介して」結合しているというときは,両者が直接ペプチド結合により結合している場合と両者がペプチドリンカーとの結合により結合している場合とを包含する。なお,本明細書において,HSAと成長ホルモンとが直接に又はペプチドリンカーを介して結合している場合,当該化合物である「ヒト血清アルブミン−hGH融合蛋白質(HSA−hGH融合蛋白質)」は,「ヒト血清アルブミン融合hGH(HSA融合hGH)」ということもできる。ヒト血清アルブミン変異体−hGH融合蛋白質(HSA変異体−hGH融合蛋白質)についても同様である。
本発明において,HSAと成長ホルモンがペプチドリンカーを介して結合しているとき,そのリンカーは,好ましくは1〜50個,より好ましくは1〜17個,更に好ましくは1〜10個,尚も好ましくは1〜6個のアミノ酸残基で構成されており,例えば,2〜17個,2〜10個,10〜40個,20〜34個,23〜31個又は25〜29個のアミノ酸で構成されるものであり,更に例えば,1個のアミノ酸残基のみで,又は2個,3個,5個,6個又は20個のアミノ酸残基から構成されるものである。ペプチドリンカーで結合されたHSA部分がHSAとしての機能を保持し且つ成長ホルモンの部分も生理的条件下で成長ホルモンの生理活性を発揮できる限り,ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基又はアミノ酸配列に限定はないが,好ましくは,グリシンとセリンから構成されるものである。ペプチドリンカーの好適な例として,一つのグリシン,一つのセリン,Gly-Ser,Gly-Gly-Ser,Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号4),Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号5),及びSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(配列番号6)からなるもの,並びにこれらアミノ酸配列を含んでなるものが挙げられる。これらのアミノ酸配列の何れか一種が2〜10回,あるいは2〜5回連続してなる配列を有するものも,ペプチドリンカーとして好適に使用でき,また,これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさって1〜10回,あるいは2〜5回連続してなる配列を有するものも,ペプチドリンカーとして好適に使用できる。これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさったペプチドリンカーの好適なものとして,アミノ酸配列Gly−Serに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号5)が3個連続してなる計20個のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
2つの異なるポリペプチドを結合する方法としては,例えば,一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に,インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたDNAを組み込んだ発現ベクターを作製し,この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより,組換え融合蛋白質として発現させる方法が一般的であり,本発明において利用できる。
組換え体として形質転換細胞に発現させることによりHSA−hGH融合蛋白質を産生させる場合,成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが,HSAのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのN末端又はC末端の何れかに結合された形の融合蛋白質が得られる。遺伝子組換え技術を用いて製造されたHSA−hGH融合蛋白質は,特に,組換えHSA−hGH融合蛋白質という。
HSAのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのN末端側に成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを結合させる場合,成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子の下流に,HSAのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたDNAを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して2つのポリペプチドを間接的に結合させる場合は,2つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に,当該リンカーをコードするDNA配列がインフレームで挿入される。
HSAのアミノ酸配列を含むポリペプチドのC末端側に成長ホルモンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合,成長ホルモンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に,HSAのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたDNAを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して2つのポリペプチドを間接的に結合させる場合は,2つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に,当該リンカーをコードするDNA配列がインフレームで挿入される。
HSA−hGH融合蛋白質を宿主細胞に産生させるには,それらの何れかをコードするDNAを組み込んだ発現ベクターが宿主細胞に導入される。このために用いることのできる宿主細胞は,そのような発現ベクターを導入することによりHSA−hGH融合蛋白質を発現させることができるものである限り特に制限はなく,哺乳動物細胞,酵母,植物細胞,昆虫細胞等の真核生物細胞,大腸菌,枯草菌等の原核細胞の何れであってもよいが,哺乳動物細胞が特に好適である。但し,糖鎖修飾された蛋白質として発現させる場合の宿主細胞は,哺乳動物細胞,酵母,植物細胞,昆虫細胞等の真核生物細胞から選択される。通常野生型のHSAの320番目のアミノ酸残基がトレオニンとなることにより生じるAsn−Tyr−Thrで表される配列部分のAsn残基,又はAsn−X−Thr(「X」はプロリン以外のアミノ酸残基)で表される配列中のAsn残基は,HSA−hGH融合蛋白質の発現を真核生物細胞で行わせることによりN−結合型グリコシド化される。
哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合,該哺乳動物細胞の種類について特に限定はないが,ヒト,マウス,チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく,特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のCHO細胞,又はマウス骨髄腫に由来するNS/0細胞が好ましい。またこのときHSA−hGH融合蛋白質をコードするDNA断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは,哺乳動物細胞内に導入したとき該遺伝子の発現をもたらすものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は,哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるDNA配列(遺伝子発現制御部位)の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては,例えば,サイトメガロウイルス由来のプロモーター,SV40初期プロモーター,ヒト伸長因子−1α(EF−1α)プロモーター,ヒトユビキチンCプロモーターが挙げられる。
このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は,発現ベクターに組み込まれている蛋白質を発現するようになるが,その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って,HSA−hGH融合蛋白質を効率よく生産するためには,発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から,これらの発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために,発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。
選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン,ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素(薬剤耐性マーカー)である。哺乳動物細胞は通常一定濃度以上のこれらの薬剤の存在下で死滅する。しかし,薬剤耐性マーカー遺伝子の組み込まれた発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は,発現された薬剤耐性マーカーにより上記薬剤を無毒化又は弱毒化することができるため,上記薬剤存在下でも生存可能となる。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーが組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し,その薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含有する選択培地中で,例えば,その薬剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると,より高濃度の薬剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では,薬剤耐性マーカーとともに,一般に,発現ベクターに組み込まれた目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し,結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
また,選択マーカーとして,グルタミン合成酵素(GS)を用いることもできる。グルタミン合成酵素は,グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞を,グルタミン合成酵素の阻害剤,例えばL-メチオニンスルホキシミン(MSX)を含有し,且つグルタミンを含有しない選択培地中で培養すると,細胞は通常死滅する。しかし,選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると,該細胞では,グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので,より高濃度のMSX存在下でも増殖可能となる。このとき,MSXの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると,より高濃度のMSX存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では,グルタミン合成酵素とともに,一般に,発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し,結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
また,選択マーカーとして,ジヒドロ葉酸レデクターゼ(DHFR)を用いることもできる。DHFRを選択マーカーとして用いる場合,発現ベクターを導入した哺乳動物細胞は,メトトレキセート,アミノプテリン等のDHFR阻害剤を含有する選択培地中で培養される。DHFR阻害剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると,より高濃度のDHFR阻害剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このとき用いられる選択培地は,ヒポキサンチン及びチミジンを含有しないことが好ましい。このようにして選択された細胞では,DHFRとともに,一般に,発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し,結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
目的の蛋白質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位(IRES:internal ribosome entry site)を介して,選択マーカーとしてグルタミン合成酵素(GS)を配置した発現ベクターが知られている(国際特許公報WO2012/063799,WO2013/161958)。これら文献に記載された発現ベクターは,HSA−hGH融合蛋白質の製造に特に好適に使用することができる。
例えば,目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって,第1の遺伝子発現制御部位,並びに,その下流に該蛋白質をコードする遺伝子,更に下流に内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ,上記第1の遺伝子発現制御部位の又はこれとは別の第2の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる発現ベクターは,HSA−hGH融合蛋白質の製造に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて,第1の遺伝子発現制御部位又は第2の遺伝子発現制御部位としては,サイトメガロウイルス由来のプロモーター,SV40初期プロモーター,ヒト伸長因子−1αプロモーター(hEF−1αプロモーター),ヒトユビキチンCプロモーターが好適に用いられるが,hEF−1αプロモーターが特に好適である。
また,内部リボソーム結合部位としては,ピコルナウイルス科のウイルス,口蹄疫ウイルス,A型肝炎ウイルス,C型肝炎ウイルス,コロナウイルス,ウシ腸内ウイルス,サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス,コクサッキーB型ウイルスからなる群より選択されるウイルスのゲノム,又はヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子,ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子,ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択される遺伝子の5’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが,マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合,野生型のもの以外に,野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また,この発現ベクターにおいて,好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は,好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり,より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。
また,例えば,目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1αプロモーター,その下流に該蛋白質をコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって,該内部リボソーム結合部位が,野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは,HSA−hGH融合蛋白質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして,WO2013/161958に記載された発現ベクターが挙げられる。
また,例えば,目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって,ヒト伸長因子−1αプロモーター,その下流に該蛋白質をコードする遺伝子,更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位,及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み,且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって,該内部リボソーム結合部位が,野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは,HSA−hGH融合蛋白質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして,WO2012/063799に記載されたpE-mIRES-GS-puro及びWO2013/161958に記載されたpE-mIRES-GS-mNeoが挙げられる。
野生型のマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の3’末端には,3つの開始コドン(ATG)が存在しており,その3つの開始コドンを含む配列部分は配列番号7(5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3':開始コドンのATGを大文字で示す)で示される。この配列部分中の開始コドンのうちの一部が破壊されたものとして,例えば,配列番号8(5'-atgataagcttgccacaaccatg-3')で示されるものがあり,上記のpE-mIRES-GS-puro及びpE-mIRES-GS-mNeoは,配列番号8で示される配列を含むIRESを有する発現ベクターである。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質をコードするDNA断片を組み込んだ発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は,これらの発現レベルの高い細胞を選択するために,選択培地中で選択培養される。
選択培養において,DHFRを選択マーカーとして使用する場合,選択培地に含まれるDHFR阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は,DHFR阻害剤がメトトレキセートの場合,好ましくは0.25〜5 μMであり,より好ましくは0.5〜1.5 μMであり,更に好ましくは約1.0 μMである。
GSを選択マーカーとして使用する場合,選択培地に含まれるGS阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は,GS阻害剤がMSXの場合,好ましくは10〜1000 μM等であり,例えば,20〜500 μM,20〜80 μM,20〜30 μMである。またこのとき,一般的にグルタミンを含有しない培地が選択培地として用いられる。
ピューロマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合,選択培地に含まれるピューロマイシンの最大濃度は,好ましくは3〜30 μg/mLであり,より好ましくは5〜20 μg/mLであり,更に好ましくは約10 μg/mLである。
ネオマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合,選択培地に含まれるG418の最大濃度は,好ましくは0.1〜2 mg/mLであり,より好ましくは0.5〜1.5 mg/mLであり,更に好ましくは約1 mg/mLである。
また,哺乳動物細胞の培養のための培地としては,選択培養で用いる培地,後述する組換え蛋白質を生産するために用いる培地(組換え蛋白質生産用培地)ともに,哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば,特に限定なく用いることができるが,好ましくは無血清培地が用いられる。HSAは血清中に含まれる成分を吸着する性質を有するため,血清を含有する培地を用いてHSAを生産した場合には,血清中の不純物を吸着したHSAが得られることから,その後の工程でこの不純物を除去する必要が生じる。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質は,特に,これらを発現している細胞を無血清培地で培養して得られるものである。無血清培地を用いることにより,HSA−hGH融合蛋白質への不純物の吸着量を低減することができるので,その後の精製工程を簡便化することができる。
選択培養により選択されたHSA−hGH融合蛋白質の発現レベルの高い細胞がHSA−hGH融合蛋白質の生産に用いられる(HSA−hGH融合蛋白質産生細胞)。HSA−hGH融合蛋白質の生産は,HSA−hGH融合蛋白質産生細胞をHSA−hGH融合蛋白質生産用培地中で培養することにより行われる。この培養を生産培養という。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地としては,例えば,アミノ酸を3〜700 mg/L,ビタミン類を0.001〜50 mg/L,単糖類を0.3〜10 g/L,無機塩を0.1〜10000 mg/L,微量元素を0.001〜0.1 mg/L,ヌクレオシドを0.1〜50 mg/L,脂肪酸を0.001〜10 mg/L,ビオチンを0.01〜1 mg/L,ヒドロコルチゾンを0.1〜20 μg/L,インシュリンを0.1〜20 mg/L,ビタミンB12を0.1〜10 mg/L,プトレッシンを0.01〜1 mg/L,ピルビン酸ナトリウムを10〜500 mg/L,及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により,チミジン,ヒポキサンチン,慣用のpH指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
HSA−hGH融合蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地として,DMEM/F12培地(DMEMとF12の混合培地)を基本培地として用いてもよく,これら各培地は当業者に周知である。更にまた,無血清培地として,炭酸水素ナトリウム,L−グルタミン,D−グルコース,インスリン,ナトリウムセレナイト,ジアミノブタン,ヒドロコルチゾン,硫酸鉄(II),アスパラギン,アスパラギン酸,セリン及びポリビニルアルコールを含むものである,DMEM(HG)HAM改良型(R5)培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地,例えば,CD OptiCHOTM培地,CHO−S−SFM II培地又はCD CHO培地(Thermo Fisher Scientific社),IS cho−VTM 培地(Irvine Scientific社),EX−CELLTM302培地,EX−CELLTM Advanced培地又はEX−CELLTM325−PF培地(SAFC Biosciences社)等を基本培地として使用することもできる。
HSA−hGH融合蛋白質生産用培地には,適宜,ダイズ,小麦,イネ等の植物由来の加水分解物を1〜50g/L(例えば1〜5g/L)を添加することもできる。最も一般的に用いられるものは,ダイズ由来の蛋白質加水分解物である。但し,HSA−hGH融合蛋白質は,HSA−hGH融合蛋白質生産用培地に,イネ等の植物由来の加水分解物,例えばダイズ由来の蛋白質加水分解物を添加することなく製造することができる。
生産培養終了後の培養液は,HSA−hGH融合蛋白質の精製のためのクロマトグラフィー工程に供される。但し,クロマトグラフィー工程に供されるものは,培養液から細胞等が除去された培養上清である。培養液から培養上清を得る方法としては,膜フィルターによるろ過,遠心分離等がある。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質の精製のためのクロマトグラフィー工程の各々は,必要に応じ,蛋白質の非特異的吸着を防止するため,非イオン性界面活性剤の存在下で行われてよい。どの非イオン性界面活性剤を用いるかについて特段の限定はないが,ポリソルベート系界面活性剤が好ましく用いられ,より好ましくはポリソルベート80又はポリソルベート20である。そのような非イオン性界面活性剤の濃度は,好ましくは0.005% (w/v)〜0.1% (w/v)であり,より好ましくは0.005% (w/v)〜0.05% (w/v)であり,例えば0.01% (w/v),0.05% (w/v)等である。
HSA−hGH融合蛋白質の精製工程は,室温又は低温で行うことができるが,好ましくは低温で,特に1〜10℃で行うことができる。
本発明の一実施形態において,HSA−hGH融合蛋白質の精製工程は,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを含むものである。但し,これらのクロマトグラフィー工程に1又は複数のクロマトグラフィー工程を加えることもできる。かかる追加のクロマトグラフィー工程としては,例えば,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程,疎水性カラムクロマトグラフィー工程,色素親和性カラムクロマトグラフィー工程,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程が挙げられる。
本発明の一実施形態において,HSA−hGH融合蛋白質の精製工程は,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを,この順で含むものである。但し,これらのクロマトグラフィー工程に1又は複数のクロマトグラフィー工程を加えることもできる。かかる追加のクロマトグラフィー工程としては,例えば,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程,疎水性カラムクロマトグラフィー工程,色素リガンドカラムクロマトグラフィー工程及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程が挙げられる。追加のクロマトグラフィーは,どの隣接するステップ間に加えても良く,又は,最初のクロマトグラフィー工程,最後のクロマトグラフィー工程として加えても良い。
本発明の一実施形態における,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを,この順で含む精製工程について以下に詳述する。
第一のカラムクロマトグラフィー工程は,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーを用いるものである。ここで,抗体は,HSA又はhGHの何れに親和性を有するものであってもよいが,好ましくはhGHに親和性を有するものである。例えば,ヒト成長ホルモンに対する抗体を結合させた担体を含むものである,Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific社)は,好適に使用することができる。
hGHに親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーカラムを用いる場合,HSA−hGH融合蛋白質は,予め緩衝液で平衡化させたカラムに付される。ここで,緩衝液の種類に特に限定は無いが,Tris-HCl緩衝液が好ましく,その濃度は,好ましくは5〜50 mMであり,より好ましくは10〜30 mMである。また,そのpHは,好ましくは6.7〜7.3,より好ましくは6.9〜7.1,更に好ましくは約7.0に調整される。カラムからのHSA−hGH融合蛋白質の溶出は,好ましくはグリシン-塩酸を用いて行われる。グリシン-塩酸の濃度は,好ましくは20〜100 mMであり,より好ましくは40〜60mMであり,更に好ましくは約50 mMである。また,そのpHは好ましくは2.0〜4.0,より好ましくは2.8〜3.2,そして更に好ましくは約3.0に調整される。溶出液のpHは,直ちに中性付近,例えばpH 6.4〜7.0に調整される。
第二のカラムクロマトグラフィー工程は,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いるものである。リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いるカラムクロマトグラフィーとして好適なものとして,ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーとフルオロアパタイトカラムクロマトグラフィーが挙げられるが,ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーが特に好ましい。これらは,カルシウムイオンによる金属アフィニティと,リン酸基による陽イオン交換の双方による相互作用を利用して,夾雑物を除去するためのものである。
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを用いる場合について,以下に詳述する。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに用いる担体については特段の限定は無く,セラミック性であっても,結晶性であってもよいが,特に好ましい担体の1つとして,CHT Type II, 40μm(バイオ・ラッド ラボラトリーズ社)が挙げられる。
第一のカラムクロマトグラフィー工程で得られた溶出液は,ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに付される前に,pHと導電率が調整される。このとき,pHは,好ましくは6.5〜7.5,より好ましくは6.8〜7.2,更に好ましくは6.9〜7.1に調整される。また,導電率は,好ましくは0.4〜0.8 S/m,より好ましくは0.5〜0.7 S/mに調整される。
pHと導電率を調整した溶出液は,予め緩衝液で平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに付される。ここで,緩衝液の種類に特に限定は無いが,MES緩衝液が好ましく,その濃度は,好ましくは5〜50 mMであり,より好ましくは10〜30 mMであり,例えば20 mMである。また,そのpHは,好ましくは6.7〜7.3,より好ましくは6.9〜7.1,更に好ましくは約7.0に調整される。また,緩衝液はリン酸イオンを含み,その濃度は好ましくは0〜3 mMであり,より好ましくは0〜2 mMであり,例えば1 mMである。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからのHSA−hGH融合蛋白質の溶出は,リン酸イオンの濃度を高めた緩衝液を用いて行われる。このときのリン酸イオンの濃度は,好ましくは20〜50 mMであり,より好ましくは25〜40 mMであり,更に好ましくは25〜35 mMであり,例えば30 mMである。
第三のカラムクロマトグラフィー工程は,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるものであり,夾雑蛋白質を除去するためのものである。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいてどの陽イオン交換樹脂を用いるかについて特に限定はないが,弱陽イオン交換樹脂が好ましく,より好ましくは,疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を有する弱陽イオン交換樹脂である。例えば,Capto MMC (GE Healthcare)等のような,フェニル基,アミド結合,及びカルボキシル基を有し且つ疎水性相互作用及び水素結合形成に基づく選択性を有する弱陽イオン交換樹脂は好適に用いることができる。
第二のカラムクロマトグラフィー工程で得られた溶出液は,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付される前に,pHと導電率が調整される。このとき,pHは,好ましくは5.3〜6.2,より好ましくは5.4〜6.1,更に好ましくは5.6〜5.8に調整される。また,導電率は,好ましくは0.5〜0.9 S/m,より好ましくは0.6〜0.8 S/mに調整される。
pHと導電率を調整した溶出液は,予め緩衝液で平衡化された陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付される。ここで,緩衝液の種類に特に限定は無いが,MES緩衝液が好ましく,その濃度は,好ましくは30〜70 mMであり,より好ましくは40〜60 mMであり,例えば50 mMである。また,そのpHは,好ましくは5.4〜6.0,より好ましくは5.6〜5.8,例えば5.7に調整される。また,緩衝液は塩を含み,塩が中性塩であるときの緩衝液中での濃度は好ましくは30〜150 mMであり,より好ましくは50〜120 mMであり,更に好ましくは80〜120 mMであり,例えば100 mMである。このときの中性塩は,好ましくは塩化ナトリウム,塩化カリウムであるが,特に好ましくは塩化ナトリウムである。
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーからのHSA−hGH融合蛋白質の溶出は,中性塩の濃度を高めた緩衝液を用いて行われる。このときの中性塩の濃度は,好ましくは400〜600 mMであり,より好ましくは500〜600 mMであり,更に好ましくは530〜570 mMであり,例えば550 mMである。
第四のカラムクロマトグラフィー工程は,サイズ排除クロマトグラフィーを用いるものである。サイズ排除クロマトグラフィーは,分子サイズに基づいて,特にエンドトキシン等の低分子の夾雑物,HSA−hGH融合蛋白質の多量体や分解物を除去するためのものである。
サイズ排除クロマトグラフィー工程において,カラムは予め平衡化される。ここで,緩衝液の種類に特に限定は無いが,リン酸緩衝液が好ましく,その濃度は,好ましくは5〜20 mMであり,より好ましくは8〜12 mMであり,例えば10 mMである。そのpHは,好ましくは6.6〜7.4,より好ましくは7.0〜7.4,例えば7.2に調整される。また,緩衝液は医薬品添加物として使用し得る二糖を含有するものであってもよい。かかる二糖は,好ましくはショ糖であり,その濃度は,好ましくは60〜90 mg/mLであり,より好ましくは70〜80 mg/mLであり,例えば75 mg/mLである。この第一から第四のカラムクロマトグラフィー工程により,実質的に純粋なHSA−hGH融合蛋白質が得られる。
HSA−hGH融合蛋白質の精製工程において,ウイルス不活化工程を所望により追加することもできる。ウイルス不活化工程は,任意の2つのクロマトグラフィー工程の間で実施してもよく,また,最初のクロマトグラフィー工程の前に,又は最後のクロマトグラフィー工程の後に実施しても良い。また,ウイルス不活化工程はHSA−hGH融合蛋白質の精製工程において,1回実施してもよく,2回実施してもよく,又は3回以上実施してもよい。
クロマトグラフィー工程が,HSA−hGH融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程(第一のカラムクロマトグラフィー工程)と,リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程(第二のカラムクロマトグラフィー工程)と,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程(第三のカラムクロマトグラフィー工程)と,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程(第四のカラムクロマトグラフィー工程)とを,この順で含むものである場合,ウイルス不活化工程は,好ましくは,第一のカラムクロマトグラフィー工程と第二のカラムクロマトグラフィー工程の間において,又は/及び第四のカラムクロマトグラフィー工程の後で実施される。如何なるウイルス不活化工程を適用するかについて特に限定はないが,溶媒−界面活性剤法又はフィルターろ過法が好適に適用できる。溶媒−界面活性剤法は,ウイルスを不活化すべき溶液に,有機溶媒と界面活性剤を添加することにより,ウイルスを不活化させる方法である。溶媒−界面活性剤法が適用される場合,HSA−hGH融合蛋白質を含有する溶液に有機溶媒と非イオン性界面活性剤を添加して混合し,この混合液が,例えば3時間を超えてインキュベートされる。溶媒−界面活性剤法において用いられる溶液は,HSA−hGH融合蛋白質が少なくとも2時間安定に保持されるものである限り特に限定はないが,中性付近にpHが調整されたグリシン緩衝液,リン酸緩衝液,MES緩衝液,Tris-HCl緩衝液,又はこれらの混合物に,有機溶媒と非界面活性剤が混合されたものが好適に使用できる。また,どの非イオン性界面活性剤を用いるかについても特に限定はないが,例えば,ポリソルベート20,ポリソルベート80,及びtriton X-100を,単独で又はこれらを任意に組み合わせて用いることができる。ポリソルベート80は特に好適な非イオン性界面活性剤の一つであり,単独で又は他の非イオン性界面活性剤と組み合わせて用いることができる。また,どの有機溶媒を用いるかについても特に限定はないが,例えば,トリ(n−ブチルホスフェート)を用いることができる。ポリソルベート80とトリ(n−ブチルホスフェート)とを組み合わせ用いる場合,混合液中のポリソルベート80の濃度は0.3〜2%,例えば1%であり,トリ(n−ブチルホスフェート)の濃度は0.1〜0.5%,例えば0.3%であり,混合液は2〜5時間,例えば3時間インキュベートされる。
フィルターろ過法は,ウイルスを除去すべき溶液を,ウイルスを除去する性能を有するろ過膜(ウイルス除去膜)でろ過して,ウイルスを除去する方法である。フィルターろ過法で用いられるろ過膜は,好ましくは平均孔径が17〜21 nmのものであり,その材質は例えば再生セルロースである。フィルターろ過法が適用される場合,HSA−hGH融合蛋白質を含有する溶液をウイルス除去膜に通過させる。例えば,第一のカラムクロマトグラフィー工程と第二のカラムクロマトグラフィー工程の間において溶媒−界面活性剤法によりウイルス不活化を行い,第四のカラムクロマトグラフィー工程の後に,フィルターろ過法によりウイルス不活化を行うことにより,より確実にウイルス除去を行うことができる。
なお,ウイルス除去膜による方法は,ウイルス除去工程ということもできるが,本発明においては,ウイルス不活化工程の一手法ということもできる。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質は,HSAが結合していない元の成長ホルモンに比べ,血中での安定性が高まり半減期が長くなる。投与経路や投与量により変動はするが,皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期(t1/2β)が例えば5時間以上と,血中で極めて安定になる。例えば,HSA変異体−ヒト成長ホルモン融合蛋白質の血中半減期(t1/2β)は,0.5〜10mg/kgの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したとき,血中半減期(t1/2β)は,5〜40時間である。
本発明において,HSA変異体−成長ホルモン融合蛋白質を有効成分として含有してなる医薬は,注射剤として静脈内,筋肉内,腹腔内又は皮下に投与することができる。
ヒト成長ホルモンには,主に分子量が22 kDaであるもの(22kDaヒト成長ホルモン,本明細書において22Kヒト成長ホルモン)と20 kDaであるもの(20kDaヒト成長ホルモン,本明細書において20Kヒト成長ホルモン)の分子量の異なる2種類がある。22K成長ホルモンは,配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する,191個のアミノ酸から構成される蛋白質である。通常,「ヒト成長ホルモン(又はhGH)」というときは,この22K成長ホルモンのことを意味するが,本明細書において,単に「ヒト成長ホルモン(又はhGH)」というときは,22Kヒト成長ホルモンと20Kヒト成長ホルモンの双方を包含する。
本明細書において,単に「22Kヒト成長ホルモン(又は22KhGH)」というときは,配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する野生型の22KhGHに加え,これに対し1個又は複数個のアミノ酸が,置換,欠失及び/又は付加されたものである22KhGH変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換,欠失及び/又は付加されてよいアミノ酸の個数は,各変異タイプにつき,好ましくは1〜8個であり,より好ましくは1〜4個であり,更に好ましくは1〜2個である。ここで22KhGH変異体のアミノ酸配列は,配列番号9で示される野生型の22KhGHのアミノ酸配列と,好ましくは85%以上の同一性を,より好ましくは90%以上の同一性を,更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
野生型の20Kヒト成長ホルモンは,野生型の22K成長ホルモン(配列番号9)を構成する191個のアミノ酸のうちN末端から数えて32番目〜46番目の15個のアミノ酸が欠失したものに相当し,176個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列(配列番号10)よりなる,成長促進活性を有する蛋白質である。但し,本明細書において,単に「20Kヒト成長ホルモン(又は20KhGH)」というときは,配列番号10で示される野生型の20KhGHに加え,当該配列に対し,1個又は複数個のアミノ酸が,置換,欠失及び/又は付加されたものに相当する20KhGHの変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換,欠失及び/又は付加されてよいアミノ酸の個数は,各変異タイプにつき,好ましくは1〜8個であり,より好ましくは1〜4個であり,更に好ましくは1〜2個である。ここで20KhGH変異体のアミノ酸配列は,配列番号10で示される野生型の20KhGHのアミノ酸配列と,好ましくは85%以上の同一性を,より好ましくは90%以上の同一性を,更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
本発明において,種々のhGH変異体における通常の野生型hGHと比較したときの各変異の位置及びその形式(欠失,置換,付加)は,両hGHのアミノ酸配列のアラインメントにより,容易に確認することができる。なお,本発明において,野生型hGHのアミノ酸配列と変異を加えたhGHのアミノ酸配列との同一性は,周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば,そのようなアルゴリズムとして,BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)),Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)),Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
上記のhGHのアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換は,例えば,アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は,hGHの機能に大きな変化をもたらさない(即ち,保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては,例えば以下のものがある:
(1)酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸,
(2)塩基性アミノ酸であるヒスチジン,リシン,及びアルギニン
(3)芳香族アミン酸であるフェニルアラニン,チロシン,トリプトファン,
(4)水酸基を有するアミノ酸(ヒドロキシアミノ酸)であるセリンとトレオニン,
(5)疎水性アミノ酸であるメチオニン,アラニン,バリン,ロイシン,及びイソロイシン,
(6)中性の親水性アミノ酸であるシステイン,セリン,トレオニン,アスパラギン,及びグルタミン,
(7)ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン,
(8)アミド型アミノ酸(極性アミノ酸)であるアスパラギンとグルタミン,
(9)脂肪族アミノ酸である,アラニン,ロイシン,イソロイシン,及びバリン,
(10)側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン,グリシン,セリン,及びトレオニン,
(11)側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
(1)酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸,
(2)塩基性アミノ酸であるヒスチジン,リシン,及びアルギニン
(3)芳香族アミン酸であるフェニルアラニン,チロシン,トリプトファン,
(4)水酸基を有するアミノ酸(ヒドロキシアミノ酸)であるセリンとトレオニン,
(5)疎水性アミノ酸であるメチオニン,アラニン,バリン,ロイシン,及びイソロイシン,
(6)中性の親水性アミノ酸であるシステイン,セリン,トレオニン,アスパラギン,及びグルタミン,
(7)ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン,
(8)アミド型アミノ酸(極性アミノ酸)であるアスパラギンとグルタミン,
(9)脂肪族アミノ酸である,アラニン,ロイシン,イソロイシン,及びバリン,
(10)側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン,グリシン,セリン,及びトレオニン,
(11)側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
hGH遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約22KDのhGHを有効成分として含有する製剤(hGH製剤)が,成長ホルモン分泌不全性低身長症,ターナー症候群における低身長,SGA性低身長症,ヌーナン症候群における低身長症,慢性腎不全による低身長症,プラダーウィリー症候群における低身長症,及び軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床使用されている。hGH製剤は,これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。hGH製剤は,皮下又は筋肉内に投与されることで成分のhGHが血中を循環し,その成長促進活性により患者の成長を促進する効果を発揮する。また,hGH製剤は,成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床使用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では,脂質代謝異常が認められるが,hGH製剤の投与により,患者の脂質代謝等が正常化し,患者のQOLが改善される。AIDSによる消耗の治療剤としても成長ホルモンは臨床応用されている。成長ホルモン分泌不全性低身長症,成人成長ホルモン分泌不全症等のhGH製剤としては,例えば,グロウジェクト(登録商標)がある。
HSA変異体とhGHとの融合蛋白質を作製する場合,HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとhGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合させる具体的方法としては,例えば,一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に,インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたDNA断片を組み込んだ発現ベクターを作製し,この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより,組換え蛋白質として発現させる方法が一般的であり,本発明において利用できる。
組換え蛋白質として形質転換細胞に発現させる方法によりHSA変異体とhGHとの融合蛋白質を作製するとき,hGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドは,HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのN末端側又はC末端側の何れかに,直接,又はリンカーを介して間接的に結合される。
HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのN末端側にhGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合,hGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の下流に,HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたDNA断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。2つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に結合させる場合は,2つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に,当該リンカーをコードするDNA配列がインフレームで配置される。
HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのC末端側にhGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合,hGHのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に,HSA変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたDNA断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。2つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に結合させる場合は,2つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に,当該リンカーをコードするDNA配列がインフレームで配置される。
本発明において,HSA変異体とhGHの融合蛋白質(HSA−hGH融合蛋白質の一種)の好適な一例として,配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するHSA(A320T)のN末端に,リンカーを介さずに,配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する22Kヒト成長ホルモンのC末端をペプチド結合により結合させたものである,配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するHSA−hGH融合蛋白質が挙げられる。本発明において,この順序でHSA(A320T)と22KhGHとを結合させたものを,「22Kヒト成長ホルモン−mHSA」又は「22KhGH−mHSA」という。同様に,HSA(A320T)のC末端に,リンカーを介さずに,22Kヒト成長ホルモンのN末端がペプチド結合により結合したものを「mHSA−22Kヒト成長ホルモン」又は「mHSA−22KhGH」という。
また,配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン(A320T)のN末端に,リンカーを介さずに,配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する20Kヒト成長ホルモンのC末端をペプチド結合により結合させたものである,配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するHSA−hGH融合蛋白質を,「20Kヒト成長ホルモン−mHSA」又は「20KhGH−mHSA」という。同様に,ヒト血清アルブミン(A320T)のC末端に,リンカーを介さずに,20Kヒト成長ホルモンのN末端がペプチド結合により結合したものを「mHSA−20Kヒト成長ホルモン」又は「mHSA−20KhGH」という。
本発明において,HSA−hGH融合蛋白質は,皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期(t1/2β)が概ね5時間以上と血中で極めて安定になることを特徴とする。投与量により変動はするが,例えば,4mg/kgの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したときの,mHSA−22KhGH及び22KhGH−mHSAの血中半減期(t1/2β)は,20〜35時間である。
本発明におけるHSA−hGH融合蛋白質は,医薬として使用することができる。HSA−hGH融合蛋白質は,ヒト成長ホルモンとHSAの機能を生体内において協働させることができる。
本発明におけるHSA−hGH融合蛋白質は,血中で極めて安定である。従って,本発明によればヒト成長ホルモンを血中で安定化させて長時間に渡って活性を保持した状態で血中に留まらせることができる。従って,当該融合蛋白質は,医薬として用いた場合,ヒト成長ホルモンと比較して投与頻度又は/及び投与量を減じることが可能となる。例えば,ヒト成長ホルモンは毎日投与が必要であるが,当該融合蛋白質であれば,投与頻度を例えば3〜30日毎とすることも可能となる。また,治療期間中の医薬の総投与量を,例えばモル比で1/3以下(例えば1/3〜1/10)にまで減じることも可能となる。
本発明におけるHSA−hGH融合蛋白質は,成長ホルモン分泌不全性低身長症,ターナー症候群における低身長,慢性腎不全による低身長症,プラダーウィリー症候群における低身長症,軟骨異栄養症における低身長症,SGA性低身長症,又はヌーナン症候群における低身長症を対象疾患とする医薬として使用することができる。hGH製剤は,これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。その他,本発明におけるHSA−hGH融合蛋白質は,成人成長ホルモン分泌不全症,AIDSによる消耗,及び拒食症による消耗を対象疾患とする医薬として使用することができるが,これに限らず,成長ホルモンの有する軟骨形成促進,蛋白質同化促進等の成長促進活性,体組成及び脂質代謝改善作用等の生理活性を,長期に渡って作用させることにより症状が改善され得る疾患の治療剤として使用することができる。
22KhGH−mHSAを治療目的でヒトに投与するときの用法用量に,hGHの薬効が示される限り特に限定はない。22KhGH−mHSAの用法用量を以下に例示するが,用法用量はこれらに限定されるものではない。
22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わない成長ホルモン分泌不全性低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.01〜0.7 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わないターナー症候群における低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.015〜1.4 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わない慢性腎不全による低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.01〜1.4 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わないプラダーウィリー症候群における低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.012〜0.98 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わない軟骨異栄養症における低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.015〜1.4 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わないSGA性低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.012〜1.9 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,成人成長ホルモン分泌不全症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.001〜0.34 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,骨端線閉鎖を伴わないヌーナン症候群における低身長症の患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.013〜1.8 mg/Kg体重である。22KhGH−mHSAを,AIDSにより消耗した患者に投与する場合,1回当たりの好ましい投与量は0.005〜0.4 mg/Kg体重である。但し,投与量は患者の検査所見等によって,適宜変更されるべきものである。また,これら疾患における,好ましい22KhGH−mHSAの投与間隔は,7〜30日毎に1回であり,患者の検査所見等によって,7〜14日毎,10〜20日毎,又は14〜21日毎に1回と適宜変更されるべきものである。また,投与方法は,好ましくは皮下注射,筋肉内注射又は静脈注射であり,より好ましくは皮下注射又は筋肉内注射である。
本発明における水性医薬組成物は,有効成分として血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質,防腐剤,主に安定化剤としてスクロースと非イオン性界面活性剤,及びpH調整剤として緩衝剤を含有してなるものである。
水性医薬組成物に含まれる血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質(特に22KhGH−mHSA)の濃度は,好ましくは10〜100 mg/mLであり,より好ましくは15〜70 mg/mLであり,更に好ましくは30〜65 mg/mLであり,更により好ましくは40〜60 mg/mLであり,例えば,50 mg/mLである。
水性医薬組成物に含有される防腐剤としては,薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが,フェノールが好ましい。防腐剤としてフェノールが使用される場合,水性医薬組成物に含有されるフェノールの濃度は,好ましくは0.5〜12 mg/mLであり,より好ましくは3〜9 mg/mLであり,更に好ましくは4〜8 mg/mLであり,更により好ましくは5〜7 mg/mLであり,例えば,6 mg/mLである。
水性医薬組成物に含有されるスクロースの濃度は,好ましくは10〜150 mg/mLであり,より好ましくは50〜100 mg/mLであり,更に好ましくは60〜90 mg/mLであり,更により好ましくは70〜80 mg/mLであり,例えば,75 mg/mLである。
水性医薬組成物に含有される非イオン性界面活性剤としては,ポリソルベートやポロキサマー等を単独で又はこれらを組合わせて使用することができる。ポリソルベートとしてはポリソルベート20,ポリソルベート80が,ポロキサマーとしてはポロキサマー188(ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール)が特に好適である。また,水性医薬組成物に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は,0.15〜10 mg/mLであることが好ましく,1.0〜4.5 mg/mLであることがより好ましく,1.5〜4.5 mg/mLであることが更に好ましく,2〜4 mg/mLであることが更により好ましく,2.5〜3.5 mg/mLであることが更により好ましく,例えば,3 mg/mLである。
水性医薬組成物に含有される緩衝剤は,薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが,リン酸緩衝剤が好ましい。緩衝剤としてリン酸緩衝剤が使用される場合,水性医薬組成物に含有されるリン酸緩衝剤の濃度は,好ましくは1〜30 mMであり,より好ましくは2〜20 mMであり,更に好ましくは5〜15 mMであり,例えば,約10 mMである。また,緩衝剤によって調整される水性医薬組成物のpHは,好ましくは5.0〜8.0であり,より好ましくは6.0〜7.8であり,更に好ましくは6.5〜7.6であり,更により好ましくは7.0〜7.4であり,例えば7.2である。また,水性医薬組成物の生理食塩水に対する浸透圧比は,例えば1.0〜1.3に調整される。
本発明の水性医薬組成物の好適な組成として,血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質(特に22KhGH−mHSA)の濃度が10〜100 mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12 mg/mLであり,スクロースの濃度が10〜150 mg/mLであり,非イオン性界面活性剤の濃度が0.15〜10 mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12 mg/mLであり,緩衝剤の濃度が1〜30 mMであり,pHが5.0〜8.0であるもの,が挙げられる。
更なる本発明の水性医薬組成物の好適な組成として,血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質(特に22KhGH−mHSA)の濃度が10〜100 mg/mLであり,スクロースの濃度が7 5mg/mLであり,ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3 mg/mLであり,フェノールの濃度が6 mg/mLであり,リン酸緩衝剤の濃度が10 mMであり, pHが7.0〜7.4であるもの,が挙げられる。各成分の濃度は,上記の好ましい濃度の何れかにそれぞれ変更することが可能である。
更なる本発明の水性医薬組成物の好適な組成として,血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質(特に22KhGH−mHSA)の濃度が15〜70 mg/mLであり,スクロースの濃度が75 mg/mLであり,ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3 mg/mLであり,フェノールの濃度が6 mg/mLであり,リン酸緩衝剤の濃度が10 mMであり,pHが7.0〜7.4であるもの,が挙げられる。各成分の濃度は,上記の好ましい濃度の何れかにそれぞれ変更することが可能である。
本発明のHSA−hGH融合蛋白質(特に22KhGH−mHSA)を有効成分として含有してなる医薬は,注射剤として静脈内,筋肉内,腹腔内,皮下又は脳室内に投与することができる。それらの注射剤は,凍結乾燥製剤又は水性液剤(水性医薬組成物)として供給することができる。水性液剤とする場合,バイアルに充填した形態としてもよく,注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合,使用前に水性媒質に溶解し復元して使用する。
以下,実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが,本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例1〕22KhGH−HSA発現用ベクターの構築
22KhGHのC末端と野生型HSA(配列番号1)のN末端とを結合させたものである,配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を,22KhGH−HSAとした。配列番号15で示されるアミノ酸配列中,1〜191番目のアミノ酸残基が22KhGHのアミノ酸配列に相当し,192〜776番目のアミノ酸残基がHSAのアミノ酸配列に相当する。22KhGH−HSAをコードする遺伝子(22KhGH-HSA遺伝子)を含む配列番号16で示される塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において,塩基11〜88がhGHのリーダーペプチドを,塩基89〜661が成熟型hGHを,塩基662〜2416が成熟型HSAを,それぞれコードする。このDNAを制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,pE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより,22KhGH−HSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を構築した。なお,pE-mIRES-GS-puroは,国際特許公報WO2012/063799等に作製方法が記載されており周知のものである。
22KhGHのC末端と野生型HSA(配列番号1)のN末端とを結合させたものである,配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を,22KhGH−HSAとした。配列番号15で示されるアミノ酸配列中,1〜191番目のアミノ酸残基が22KhGHのアミノ酸配列に相当し,192〜776番目のアミノ酸残基がHSAのアミノ酸配列に相当する。22KhGH−HSAをコードする遺伝子(22KhGH-HSA遺伝子)を含む配列番号16で示される塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において,塩基11〜88がhGHのリーダーペプチドを,塩基89〜661が成熟型hGHを,塩基662〜2416が成熟型HSAを,それぞれコードする。このDNAを制限酵素(MluI及びNotI)で消化し,pE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより,22KhGH−HSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を構築した。なお,pE-mIRES-GS-puroは,国際特許公報WO2012/063799等に作製方法が記載されており周知のものである。
〔実施例2〕22KhGH−mHSA発現用ベクターの構築
22KhGH(配列番号9)のC末端とHSA(A320T)(配列番号3)のN末端とを結合させたものである,配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を,22KhGH−mHSAとした。実施例1で作製したpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を鋳型として,プライマーYA082(配列番号13)及びプライマーYA083(配列番号14)を用いて,PCRにより22KhGH−mHSAをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて,22KhGH−mHSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を構築した。
22KhGH(配列番号9)のC末端とHSA(A320T)(配列番号3)のN末端とを結合させたものである,配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を,22KhGH−mHSAとした。実施例1で作製したpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を鋳型として,プライマーYA082(配列番号13)及びプライマーYA083(配列番号14)を用いて,PCRにより22KhGH−mHSAをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて,22KhGH−mHSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を構築した。
〔実施例3〕22KhGH−mHSA発現細胞株の作製
22KhGH−mHSAを発現させるための細胞を次のようにして作製した。チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるCHO-K1細胞に,Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム(Bio Rad社)を用いて,実施例2で作製した,22KhGH−mHSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を導入した。発現ベクターを導入した細胞を,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン,10 mg/L インスリン,L-メチオニンスルホキシミン(SIGMA社)及びピューロマイシン(SIGMA社)を含むCD OptiCHOTM培地(Thermo Fisher Scientific社)を用いて選択培養した。選択培養の際には,L-メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて,最終的にL-メチオニンスルホキシミンの濃度を300 μM,ピューロマイシンの濃度を10 μg/mLとして,より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで,限界希釈法により,1ウェルあたり1個以下の細胞が播種されるように,96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し,単一細胞由来のコロニーが形成されるまで約10日間培養して,細胞をクローン化した。クローン化した細胞を更に培養して増殖させた後,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン,300 μM L-メチオニンスルホキシミン,及び10% (v/v) DMSOを含有するCD OptiCHOTM培地に懸濁させてからクライオチューブに分注し,液体窒素中で保存した。この細胞を22KhGH−mHSA発現細胞株とした。
22KhGH−mHSAを発現させるための細胞を次のようにして作製した。チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるCHO-K1細胞に,Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム(Bio Rad社)を用いて,実施例2で作製した,22KhGH−mHSA発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を導入した。発現ベクターを導入した細胞を,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン,10 mg/L インスリン,L-メチオニンスルホキシミン(SIGMA社)及びピューロマイシン(SIGMA社)を含むCD OptiCHOTM培地(Thermo Fisher Scientific社)を用いて選択培養した。選択培養の際には,L-メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて,最終的にL-メチオニンスルホキシミンの濃度を300 μM,ピューロマイシンの濃度を10 μg/mLとして,より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで,限界希釈法により,1ウェルあたり1個以下の細胞が播種されるように,96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し,単一細胞由来のコロニーが形成されるまで約10日間培養して,細胞をクローン化した。クローン化した細胞を更に培養して増殖させた後,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン,300 μM L-メチオニンスルホキシミン,及び10% (v/v) DMSOを含有するCD OptiCHOTM培地に懸濁させてからクライオチューブに分注し,液体窒素中で保存した。この細胞を22KhGH−mHSA発現細胞株とした。
〔実施例4〕22KhGH−mHSA発現細胞の前培養
実施例3で作製した22KhGH−mHSA発現細胞株を,37℃水浴中で融解し,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン及び300 μM L-メチオニンスルホキシミンを含む無血清培地のEX-CELL Advanced培地(前培養用培地,SIGMA社)に懸濁させて遠心して細胞を沈殿させ,上清を除去した。沈殿させた細胞を,2×105 個/mL以上の密度で前培養用培地に懸濁し,37℃,5% CO2存在下で2〜4日間培養した。細胞数が少なくとも1.0×1011 個に増殖するまで培養規模を拡大させながら,この培養を繰り返した。
実施例3で作製した22KhGH−mHSA発現細胞株を,37℃水浴中で融解し,16 μM チミジン,100 μM ヒポキサンチン及び300 μM L-メチオニンスルホキシミンを含む無血清培地のEX-CELL Advanced培地(前培養用培地,SIGMA社)に懸濁させて遠心して細胞を沈殿させ,上清を除去した。沈殿させた細胞を,2×105 個/mL以上の密度で前培養用培地に懸濁し,37℃,5% CO2存在下で2〜4日間培養した。細胞数が少なくとも1.0×1011 個に増殖するまで培養規模を拡大させながら,この培養を繰り返した。
〔実施例5〕22KhGH−mHSA発現細胞の生産培養
前培養で増殖させた細胞を,細胞濃度が4×105 個/mLの密度で,200 Lの容量の16 μMのチミジン及び100 μMのヒポキサンチンを含む無血清培地であるEX-CELL Advanced培地(生産培養用培地,SIGMA社)に懸濁させた。この懸濁液を,Xcellerex200L培養システム(XDR200)のシングルユース培養槽内で,インペラで100 rpmの速度で撹拌しながら,37℃,溶存酸素量40%,pHを6.9に維持して10日間培養した。
前培養で増殖させた細胞を,細胞濃度が4×105 個/mLの密度で,200 Lの容量の16 μMのチミジン及び100 μMのヒポキサンチンを含む無血清培地であるEX-CELL Advanced培地(生産培養用培地,SIGMA社)に懸濁させた。この懸濁液を,Xcellerex200L培養システム(XDR200)のシングルユース培養槽内で,インペラで100 rpmの速度で撹拌しながら,37℃,溶存酸素量40%,pHを6.9に維持して10日間培養した。
〔実施例6〕22KhGH−mHSAの精製
(精製工程1:ハーベスト工程/濃縮1工程)
生産培養終了後,培養液を,Millistak+(登録商標)HCポッドフィルターグレードD0HC(1.1 m2×2,Merck社)を用いてろ過し,次いでMillistak+HCポッドフィルターグレードX0HC(1.1 m2×1,Merck社)を用いてろ過して細胞を除去し,更に,Opticap SHC XL3(孔径:0.5/0.2 μm,Merck社)でろ過して培養上清を得た。得られた培養上清を,予め純水で洗浄した後,PBSで平衡化した分画分子量30 kDaの限外ろ過膜装置(Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン装着 1.14 m2,Merck社)を用いて濃縮した。限外ろ過膜装置から濃縮後の溶液を回収した。更に装置内を,PBSを通して洗浄し,この洗浄液を先に回収した濃縮後の溶液に合わせて重量を約15 kgに調整したものを濃縮培養液とした。次いで,濃縮培養液を,孔径の最大部が0.5 μmであり最小部が0.2 μmである親水性フィルター(Opticap SHC XL600,Merck社)を用いてろ過した。ろ過後,濃縮培養液のpH及び導電率がそれぞれ7.0±0.3,1.2±0.4 S/mであることを確認した。
(精製工程1:ハーベスト工程/濃縮1工程)
生産培養終了後,培養液を,Millistak+(登録商標)HCポッドフィルターグレードD0HC(1.1 m2×2,Merck社)を用いてろ過し,次いでMillistak+HCポッドフィルターグレードX0HC(1.1 m2×1,Merck社)を用いてろ過して細胞を除去し,更に,Opticap SHC XL3(孔径:0.5/0.2 μm,Merck社)でろ過して培養上清を得た。得られた培養上清を,予め純水で洗浄した後,PBSで平衡化した分画分子量30 kDaの限外ろ過膜装置(Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン装着 1.14 m2,Merck社)を用いて濃縮した。限外ろ過膜装置から濃縮後の溶液を回収した。更に装置内を,PBSを通して洗浄し,この洗浄液を先に回収した濃縮後の溶液に合わせて重量を約15 kgに調整したものを濃縮培養液とした。次いで,濃縮培養液を,孔径の最大部が0.5 μmであり最小部が0.2 μmである親水性フィルター(Opticap SHC XL600,Merck社)を用いてろ過した。ろ過後,濃縮培養液のpH及び導電率がそれぞれ7.0±0.3,1.2±0.4 S/mであることを確認した。
(精製工程2:第一のクロマトグラフィー工程(アフィニティーカラムクロマトグラフィー工程))
Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific社)を充填したQSカラム(カラム体積:4.2〜5.2 L,ベッド高:15.0±1.5 cm,Merck社)を,カラム体積の1倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液(pH 3.0),更にカラム体積の1倍容の0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した後,カラム体積の4倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)で平衡化した。次いで,精製工程1で得られた濃縮培養液の1/4量をカラムに負荷して,22KhGH−mHSAをカラムに吸着させた。次いで,カラム体積の5倍容の200 mM アルギニン及び0.05%(w/v) ポリソルベート80を含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0),更にカラム体積の5倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)でカラムを洗浄した。次いで,カラム体積の5倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液(pH 3.0)をカラムに供給して,22KhGH−mHSAを溶出させた。溶出液は,溶出液量の1/5容量の250 mM MES緩衝液(pH7.0)を予め入れた容器に回収してpHが6.7±0.3となるよう直ちに中和した。精製工程2は4〜8℃の冷温下で実施し,また,精製工程2の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのアフィニティーカラム担体あたりに負荷される22KhGH−mHSAの上限は7 gとした。
Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo Fisher Scientific社)を充填したQSカラム(カラム体積:4.2〜5.2 L,ベッド高:15.0±1.5 cm,Merck社)を,カラム体積の1倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液(pH 3.0),更にカラム体積の1倍容の0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した後,カラム体積の4倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)で平衡化した。次いで,精製工程1で得られた濃縮培養液の1/4量をカラムに負荷して,22KhGH−mHSAをカラムに吸着させた。次いで,カラム体積の5倍容の200 mM アルギニン及び0.05%(w/v) ポリソルベート80を含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0),更にカラム体積の5倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)でカラムを洗浄した。次いで,カラム体積の5倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液(pH 3.0)をカラムに供給して,22KhGH−mHSAを溶出させた。溶出液は,溶出液量の1/5容量の250 mM MES緩衝液(pH7.0)を予め入れた容器に回収してpHが6.7±0.3となるよう直ちに中和した。精製工程2は4〜8℃の冷温下で実施し,また,精製工程2の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのアフィニティーカラム担体あたりに負荷される22KhGH−mHSAの上限は7 gとした。
(精製工程3:ウイルス不活化工程)
精製工程2で得られた溶出液を25℃に加温し,この溶出液に,その液量の1/19容量の20.0%(w/v) ポリソルベート80を含有する6.0%(v/v) トリ(nーブチル)ホスフェート水溶液を加え,25℃で3時間撹拌した。
精製工程2で得られた溶出液を25℃に加温し,この溶出液に,その液量の1/19容量の20.0%(w/v) ポリソルベート80を含有する6.0%(v/v) トリ(nーブチル)ホスフェート水溶液を加え,25℃で3時間撹拌した。
(精製工程4:第二のクロマトグラフィー工程(ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー工程))
精製工程3でウイルス不活化処理を行った画分を8℃に冷却し,1 M Tris-HCl緩衝液(pH8.8)と,4 M NaClを含有する20 mM MES緩衝液(pH7.0)とを適量加えてpH及び導電率をそれぞれ7.0±0.1及び0.6±0.1 S/mに調整し,孔径0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。次いで,以下のクロマトグラフィーを冷蔵(線流速:200 cm/時)で実施した。
精製工程3でウイルス不活化処理を行った画分を8℃に冷却し,1 M Tris-HCl緩衝液(pH8.8)と,4 M NaClを含有する20 mM MES緩衝液(pH7.0)とを適量加えてpH及び導電率をそれぞれ7.0±0.1及び0.6±0.1 S/mに調整し,孔径0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。次いで,以下のクロマトグラフィーを冷蔵(線流速:200 cm/時)で実施した。
ハイドロキシアパタイト担体であるCHT Type II, 40 μm(バイオ・ラッド ラボラトリーズ社)を充填したQSカラム(カラム体積:8.8〜10.8 L,ベッド高:20.0±2.0 cm,Merck社)を,200 mM リン酸緩衝液(pH7.0),次いで,1 M NaOH水溶液,更に200 mM リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後,4倍容の50 mM NaCl及び1 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液(pH7.0)で平衡化した。次いで,上記のろ液をカラムに負荷し22KhGH−mHSAをカラムに吸着させた。次いで,3倍容の50 mM NaCl及び1 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄した。次いで,50 mM NaCl及び30 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液(pH7.0)をカラムに供給して22KhGH−mHSAを溶出させた。精製工程4は4〜8℃の冷温下で実施し,また,精製工程4の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのハイドロキシアパタイト担体あたりに負荷される22KhGH−mHSAの上限は13 gとした。
(精製工程5:第三のクロマトグラフィー工程(マルチモーダル弱陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程))
精製工程4で得られた溶出液に,これと同体積の50 mM NaClを含有する20mM MES緩衝液(pH5.7)を添加した後,希塩酸を添加して,pH及び導電率をそれぞれ5.7±0.1,0.7±0.1 S/mに調整した。その後,孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。
精製工程4で得られた溶出液に,これと同体積の50 mM NaClを含有する20mM MES緩衝液(pH5.7)を添加した後,希塩酸を添加して,pH及び導電率をそれぞれ5.7±0.1,0.7±0.1 S/mに調整した。その後,孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。
プレパックカラムRTP Capto MMC 10 L(カラム体積:8.8〜10.8 L,ベッド高:20.0±2.0 cm,Merck社)を,1 M NaOH水溶液,次いで1M NaClを含有する50 mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて洗浄した後,4倍容の100 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液(pH5.7)で平衡化した。次いで上記のろ液をカラムに負荷し22KhGH−mHSAをカラムに吸着させた。次いで,5倍容の100 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液(pH5.7)でカラムを洗浄した。次いで,550 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液(pH5.7)をカラムに供給して22KhGH−mHSAを溶出させた。精製工程5は4〜8℃の冷温下で実施し,また,精製工程5の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのマルチモーダル弱陽イオン交換担体あたりに負荷される22KhGH−mHSAの上限は11.5 gとした。
(精製工程6:濃縮2工程)
分画分子量30 kDaの限外ろ過膜(Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン1.14 m2,Merck社)に純水を通液して十分に洗浄した後,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)で平衡化した。精製工程5で得られた溶出液を,この限外ろ過膜を用いて濃縮した。濃縮後の溶液に75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)を添加して,吸光度(280 nm)を23±3に調整した。この濃縮工程は室温で実施した。
分画分子量30 kDaの限外ろ過膜(Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン1.14 m2,Merck社)に純水を通液して十分に洗浄した後,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)で平衡化した。精製工程5で得られた溶出液を,この限外ろ過膜を用いて濃縮した。濃縮後の溶液に75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)を添加して,吸光度(280 nm)を23±3に調整した。この濃縮工程は室温で実施した。
(精製工程7:第四のクロマトグラフィー工程(サイズ排除カラムクロマトグラフィー工程))
精製工程6で得られた濃縮液を孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。サイズ排除クロマトグラフィー用の樹脂であるFractogelTM BioSEC樹脂(Merck社)を充填したQSカラム(カラム体積:25.4〜31.1 L,ベッド高:40.0±4.0 cm, Merck社)を0.5M NaOH水溶液で洗浄した後,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)で平衡化した。次いで,上記のろ液をカラムに負荷し,引き続き,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)を供給した。このとき,サイズ排除カラムからの溶出液の流路に,溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して,280 nmの吸光度をモニターし,280 nmで吸収ピークを示した画分を,22KhGH−mHSAを含む画分として回収し,これを22KhGH−mHSA精製品とした。精製工程7は室温下で実施し,また,精製工程7の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は30 cm/時以下とした。またマルチモーダル弱陽イオン交換担体に負荷される22KhGH−mHSAを含有するろ液の液量は,担体の体積の8%以下とした。
精製工程6で得られた濃縮液を孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。サイズ排除クロマトグラフィー用の樹脂であるFractogelTM BioSEC樹脂(Merck社)を充填したQSカラム(カラム体積:25.4〜31.1 L,ベッド高:40.0±4.0 cm, Merck社)を0.5M NaOH水溶液で洗浄した後,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)で平衡化した。次いで,上記のろ液をカラムに負荷し,引き続き,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)を供給した。このとき,サイズ排除カラムからの溶出液の流路に,溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して,280 nmの吸光度をモニターし,280 nmで吸収ピークを示した画分を,22KhGH−mHSAを含む画分として回収し,これを22KhGH−mHSA精製品とした。精製工程7は室温下で実施し,また,精製工程7の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は30 cm/時以下とした。またマルチモーダル弱陽イオン交換担体に負荷される22KhGH−mHSAを含有するろ液の液量は,担体の体積の8%以下とした。
(精製工程8:濃縮3工程)
中空糸膜(ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge,分画分子量 30 kDa,GEヘルスケア社)を,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)で平衡化した。この中空糸膜を用いて,精製工程7で得られた22KhGH−mHSA精製品を濃縮し,22KhGH−mHSAの濃度を85 mg/mLに調整した。得られた濃縮液に,その液量の1/29の容量の90 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)を添加して混合し,孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。この濃縮工程は室温で実施した。
中空糸膜(ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge,分画分子量 30 kDa,GEヘルスケア社)を,75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)で平衡化した。この中空糸膜を用いて,精製工程7で得られた22KhGH−mHSA精製品を濃縮し,22KhGH−mHSAの濃度を85 mg/mLに調整した。得られた濃縮液に,その液量の1/29の容量の90 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)を添加して混合し,孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)を用いてろ過した。この濃縮工程は室温で実施した。
(精製工程9:ウイルス除去工程)
3 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースとを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)を作製した。この緩衝液を用いて,ウイルス除去膜(プラノバ20N,膜面積:0.12 m2,材質:再生セルロース,旭化成メディカル社)を平衡化させた。このウイルス除去膜に,圧力98 kPa以下で,精製工程8で得られたろ液を通じてろ過した。このウイルス除去工程は室温で実施した。
3 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースとを含有する10 mM リン酸緩衝液(pH7.2)を作製した。この緩衝液を用いて,ウイルス除去膜(プラノバ20N,膜面積:0.12 m2,材質:再生セルロース,旭化成メディカル社)を平衡化させた。このウイルス除去膜に,圧力98 kPa以下で,精製工程8で得られたろ液を通じてろ過した。このウイルス除去工程は室温で実施した。
(精製工程10:原薬化工程)
室温で,精製工程9で得られたろ液を孔径0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)でろ過し,22KhGH−mHSA原薬とした。
室温で,精製工程9で得られたろ液を孔径0.2 μmの親水性フィルター(Merck社)でろ過し,22KhGH−mHSA原薬とした。
〔実施例7〕22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の安定性の検討1
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,15 mg/mL 22KhGH−mHSA及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し,pHが異なる,表1に示される組成を有する6種類の水性医薬組成物(処方1−1〜1−6)を調製した。
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,15 mg/mL 22KhGH−mHSA及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し,pHが異なる,表1に示される組成を有する6種類の水性医薬組成物(処方1−1〜1−6)を調製した。
上記6種類の水性医薬組成物をそれぞれ1.5 mLずつガラス製バイアルに充填し,暗所で,5℃で1週間,又は40℃で1週間静置保存した。静置後,各溶液中に含まれる22KhGH−mHSAの単量体,その重合体,及びその分解物である低分子体の比率を,実施例13に示すSE-HPLC分析により測定した。その結果を表2に示す。ここで,暗所で5℃で1週間,及び40℃で1週間静置後の溶液に含まれる重合体及び低分子体の比率が,何れも概ね2%以下であることを,安定な水性医薬組成物の条件と予め定めた。表2の結果は,この測定条件の下では,22KhGH−mHSAの安定な水性医薬組成物を得るためには,pHを6.0以上とすることが好ましく,特にpHを6.5〜7.5とすることが好ましいことを示す。
〔実施例8〕22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の安定性の検討2
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,15 mg/mL 22KhGH−mHSA及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し,ショ糖及び塩化ナトリウムの濃度の異なる,表3に示される組成を有する3種類の水性医薬組成物(処方2−1〜2−3)を調製した。何れの溶液もpHは7.0に,浸透圧比は約1.0に調整した。蛋白質物性解析装置(Optim1000,AVACTA社)を用い,キュベット(UNi,UNCHAINED LABS社)に測定試料を9 μL入れ,20.0℃から96.0℃まで1℃ずつキュベットを加温して,各温度に対し波長473 nmにおける静的光散乱強度を測定した。
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,15 mg/mL 22KhGH−mHSA及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し,ショ糖及び塩化ナトリウムの濃度の異なる,表3に示される組成を有する3種類の水性医薬組成物(処方2−1〜2−3)を調製した。何れの溶液もpHは7.0に,浸透圧比は約1.0に調整した。蛋白質物性解析装置(Optim1000,AVACTA社)を用い,キュベット(UNi,UNCHAINED LABS社)に測定試料を9 μL入れ,20.0℃から96.0℃まで1℃ずつキュベットを加温して,各温度に対し波長473 nmにおける静的光散乱強度を測定した。
静的光散乱強度の測定結果のグラフを図1に示す。図1において縦軸が静的光散乱強度を示し,この静的光散乱強度と溶液中に含まれる蛋白質が凝集することにより生じる微粒子の濃度との間には正の相関関係にある。凝集が生じ始める温度は処方2−1〜2−3でほぼ同じであるが,温度を上昇させることにより生じる微粒子の量は,塩化ナトリウムの濃度が高いほど多い傾向にある。従って,溶液中に含まれる22KhGH−mHSAの凝集を抑制するためには,水性医薬組成物に添加する賦形剤として塩化ナトリウムよりもショ糖が好ましいといえる。
〔実施例9〕22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の安定性の検討3
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,35 mg/mL 22KhGH−mHSA,20 mM リン酸緩衝剤,及び70 mg/mL ショ糖を含有し,非イオン性界面活性剤(ポロキサマー188)の濃度の異なる,表4に示される組成を有する6種類の水性医薬組成物(処方3−1〜3−6)を調製した。何れの溶液もpHは7.2に,浸透圧比は約1.0に調整した。
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,35 mg/mL 22KhGH−mHSA,20 mM リン酸緩衝剤,及び70 mg/mL ショ糖を含有し,非イオン性界面活性剤(ポロキサマー188)の濃度の異なる,表4に示される組成を有する6種類の水性医薬組成物(処方3−1〜3−6)を調製した。何れの溶液もpHは7.2に,浸透圧比は約1.0に調整した。
上記6種類の水性医薬組成物をそれぞれ1 mLずつガラス製バイアルに充填し,室温環境下で240 往復/分で24時間振とうした。振とう前及び振とう後における各溶液中に含まれる22KhGH−mHSA全体に占める重合体の比率を,実施例13に示すSE-HPLC分析により測定し,振とう後の重合体含量(%)から振とう前の重合体含量(%)を引いた値を重合体増加量(%)として求めた。その結果を表5に示す。この条件下では,ポロキサマー188の濃度を1.0 mg/mL以上にすることにより重合体の生成を抑制することができ,その濃度を1.5 mg/mL以上にすることにより重合体の生成をほとんど抑制することができる。なお,ポロキサマー188を含まない処方3−1では,重合体が多量に生成したため測定値が得られなかった。
次いで,22KhGH−mHSAの濃度を130 mg/mLとして,20 mM リン酸緩衝剤及び70 mg/mL ショ糖を含有し,非イオン性界面活性剤(ポロキサマー188)の濃度の異なる,表6に示される組成を有する5種類の水性医薬組成物(処方4−1〜4−5)を調製した。何れの溶液もpHは7.2に,浸透圧比は約1.0に調整した。
上記5種類の水性医薬組成物をそれぞれ0.8 mLずつガラス製バイアルに充填し,室温環境下で240 往復/分で24時間振とうした。振とう後,各溶液中に含まれる22KhGH−mHSA全体に占める重合体及び低分子体の比率を,実施例13に示すSE-HPLC分析により測定した。その結果を表7に示す。処方4−1〜4−5の何れにおいても,重合体含量(%)及び低分子体含量(%)の値は,振とう前の値とほとんど変化はなく(振とう前のデータは示さない),重合体含量(%)及び低分子体含量(%)の値は,全ての処方で同等である。
〔実施例10〕22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の安定性の検討4
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,35 mg/mL 22KhGH−mHSA,20 mM リン酸緩衝剤, 70 mg/mL ショ糖,1.0 mg/mL 非イオン性界面活性剤(ポロキサマー188)及び防腐剤として3.3 mg/mL フェノールを含有する,表8に示される組成を有する,pHが異なる3種類の水性医薬組成物(処方5−1〜5−3)を調製した。
実施例6で得た22KhGH−mHSA原薬を用いて,35 mg/mL 22KhGH−mHSA,20 mM リン酸緩衝剤, 70 mg/mL ショ糖,1.0 mg/mL 非イオン性界面活性剤(ポロキサマー188)及び防腐剤として3.3 mg/mL フェノールを含有する,表8に示される組成を有する,pHが異なる3種類の水性医薬組成物(処方5−1〜5−3)を調製した。
上記3種類の水性医薬組成物をそれぞれ1 mLずつガラス製バイアルに充填し,暗所で5℃又は25℃で2ヶ月静置保存した。5℃で静置したものについては,2週間後,1ヶ月後及び2ヶ月後に,25℃で静置したものについては1ヶ月後及び2ヶ月後に,実施例13に記載のSE-HPLC分析,及び実施例15に記載の微粒子数分析を行った。その結果を表9に示す。
SE-HPLC測定による重合体含量についてみると,pH 7.2に調整した処方5−3では5℃で1ヶ月間静置した場合,25℃で2ヶ月間静止した場合の何れにおいてもほとんど変化はない。一方,pH 6.2に調整した処方5−1では,5℃で1ヶ月間静置した場合,25℃で2ヶ月間静置した場合の何れにおいても重合体の含量の継時的な増加が観察される。また,pH 6.7に調整した処方5−2では,5℃で1ヶ月間静置した場合には重合体の含量に変化はないが,25℃で2ヶ月間静止した場合には重合体の継時的な増加が観察される。SE-HPLC測定による低分子体含量についてみると,5℃で1ヶ月間静置した場合には,処方5−1〜5−3の何れにおいてもほとんど変化はない。一方,25℃で2ヶ月間静置した場合には,何れの処方においても低分子体含量の増加が観察されるが,その程度は軽微である。微粒子数分析についてみると,pH 7.2に調整した処方5−3では,10 μm以上及び25 μm以上の微粒子数が,処方5−1及び5−2と比較して大幅に減少している。
〔実施例11〕水性医薬組成物の製剤設計
上記実施例7〜10で示した結果より,22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の製剤処方の好適なものの一例として,50 mg/mL 22KhGH−mHSA,10 mM リン酸緩衝剤,75 mg/mL ショ糖,3 mg/mLポロキサマー188及び6 mg/mL フェノールを含有し,pHを7.2,浸透圧比を約1.0に調整した,表10に示される組成を有するもの(処方6)が設計し得る。この水性医薬組成物は,0.5〜10 mLの液量で,ガラス製又はプラスチック製のバイアル,アンプル,又は注射器に充填・封入することができる。注射器に予め充填したものはプレフィルド型の製剤として供給することもできる。保存温度は2〜10℃,例えば4℃が好ましく,温度記録の可能な冷蔵庫中での保存が想定される。
上記実施例7〜10で示した結果より,22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の製剤処方の好適なものの一例として,50 mg/mL 22KhGH−mHSA,10 mM リン酸緩衝剤,75 mg/mL ショ糖,3 mg/mLポロキサマー188及び6 mg/mL フェノールを含有し,pHを7.2,浸透圧比を約1.0に調整した,表10に示される組成を有するもの(処方6)が設計し得る。この水性医薬組成物は,0.5〜10 mLの液量で,ガラス製又はプラスチック製のバイアル,アンプル,又は注射器に充填・封入することができる。注射器に予め充填したものはプレフィルド型の製剤として供給することもできる。保存温度は2〜10℃,例えば4℃が好ましく,温度記録の可能な冷蔵庫中での保存が想定される。
〔実施例12〕22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物の安定性の検討5
表10に示される組成を有する,処方6の水性医薬組成物を調製し,ほう珪酸ガラス製カートリッジに1.7 mLを充填し,暗所,5℃で12ヶ月静置保存した。3ヶ月後,6ヶ月後,及び12ヶ月後に,実施例14に記載の性状試験,実施例16に記載の不溶性異物検査及びpH測定,実施例13に記載のSE-HPLC分析,実施例15に記載の微粒子数分析,及び実施例17に記載の22KhGH−mHSA定量を行った。その結果を表11に示す。何れの検査値にも大きな変化はなく,処方6は22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物として少なくとも12ヶ月間は安定であることがわかる。なお,表11中,定量法(対理論値(%))は,処方6を調製時の22KhGH−mHSAの量を100%としたときの,実際の定量値(%)を示す。
表10に示される組成を有する,処方6の水性医薬組成物を調製し,ほう珪酸ガラス製カートリッジに1.7 mLを充填し,暗所,5℃で12ヶ月静置保存した。3ヶ月後,6ヶ月後,及び12ヶ月後に,実施例14に記載の性状試験,実施例16に記載の不溶性異物検査及びpH測定,実施例13に記載のSE-HPLC分析,実施例15に記載の微粒子数分析,及び実施例17に記載の22KhGH−mHSA定量を行った。その結果を表11に示す。何れの検査値にも大きな変化はなく,処方6は22KhGH−mHSAを含有する水性医薬組成物として少なくとも12ヶ月間は安定であることがわかる。なお,表11中,定量法(対理論値(%))は,処方6を調製時の22KhGH−mHSAの量を100%としたときの,実際の定量値(%)を示す。
〔実施例13〕SE-HPLC分析(SE-HPLCを用いた22KhGH−mHSAの重合体,単量体及び低分子体含量の測定)
リン酸二水素ナトリウム二水和物及び塩化ナトリウムを水に溶解し,リン酸を0.1 M,塩化ナトリウムを0.2 M含有するリン酸塩緩衝液を調製した。また,試験対象であるそれぞれの水性医薬組成物と同組成であり,かつ22KhGH−mHSA及びフェノールを含まない溶液を調製し,これを試料希釈液とした。
リン酸二水素ナトリウム二水和物及び塩化ナトリウムを水に溶解し,リン酸を0.1 M,塩化ナトリウムを0.2 M含有するリン酸塩緩衝液を調製した。また,試験対象であるそれぞれの水性医薬組成物と同組成であり,かつ22KhGH−mHSA及びフェノールを含まない溶液を調製し,これを試料希釈液とした。
試験の対象である水性医薬組成物を,試料希釈液を用いて蛋白質濃度が2.0 mg/mLになるよう調整し,試料溶液とした。
HPLC装置(LC-20A,島津製作所社)及びカラム(TSKgel G3000SWXL,東ソー社)を用い,下記の表12に示す条件で測定を行った。但し,流量については必ずしも表12に示した条件に限らず,主ピークの保持時間が12分付近となるよう適宜調整した。代表的なクロマトグラムを図2に示す。試料溶液の測定により得られたクロマトグラム上,保持時間12分付近に検出される主ピークを単量体,主ピークより前に検出されるピークを重合体,主ピークより後に検出されるピークを低分子体とし,各ピークの面積から主ピーク含量(%),重合体含量(%),低分子体含量(%)を算出した。なお,23.5分付近に検出されるピークはフェノール由来であるため,解析から除外した。また,試料希釈液の測定により得られたクロマトグラム上に検出されたピークと同じピークについても,試料溶液の解析から除外した。
〔実施例14〕性状試験
色の比較液として,下記を用いた。
(1)Color Reference Solutions Bセット(褐色,シグマアルドリッチ社)
(2)Color Reference Solutions BYセット(帯褐黄色,シグマアルドリッチ社)
(3)Color Reference Solutions Yセット(黄色,シグマアルドリッチ社)
色の比較液として,下記を用いた。
(1)Color Reference Solutions Bセット(褐色,シグマアルドリッチ社)
(2)Color Reference Solutions BYセット(帯褐黄色,シグマアルドリッチ社)
(3)Color Reference Solutions Yセット(黄色,シグマアルドリッチ社)
試験の対象である水性医薬組成物の入った容器(バイアル等)を,黒色及び白色の背景を用いて容器側面から観察し,色調及び澄明性を確認した。色調の判断にあたっては,色の比較液を使用しても良いこととした。
〔実施例15〕微粒子数の測定
測定条件:フローサイト粒子画像解析装置(FlowCam VS-1,FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社)を用い,下記の表13に示す条件で測定を行った。フローセル(FC80FV-5,FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社)を使用し,試験の対象である水性医薬組成物に含まれる微粒子数(個/mL)を実施した。微粒子数は,10 μm以上及び25 μm以上の直径を有するものの個数をそれぞれ測定した。
測定条件:フローサイト粒子画像解析装置(FlowCam VS-1,FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社)を用い,下記の表13に示す条件で測定を行った。フローセル(FC80FV-5,FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社)を使用し,試験の対象である水性医薬組成物に含まれる微粒子数(個/mL)を実施した。微粒子数は,10 μm以上及び25 μm以上の直径を有するものの個数をそれぞれ測定した。
〔実施例16〕不溶性異物検査,pHの測定,及び浸透圧比測定の方法
不溶性異物検査,pHの測定,及び浸透圧比測定については,日本薬局方に定める一般的手法により実施した。なお,不溶性異物検査は,容易く検出される不溶性異物の有無を目視により確認する検査法である。
不溶性異物検査,pHの測定,及び浸透圧比測定については,日本薬局方に定める一般的手法により実施した。なお,不溶性異物検査は,容易く検出される不溶性異物の有無を目視により確認する検査法である。
〔実施例17〕22KhGH−mHSAの定量(Bradford法)
濃度既知の22KhGH−mHSA溶液を水で希釈し,22KhGH−mHSAをそれぞれ1.0,0.8,0.6,0.4,0.2 mg/mL含有する溶液を調製し,それぞれ標準溶液1〜5とした。試験の対象である水性医薬組成物を,蛋白質濃度が0.4〜0.8 mg/mLの範囲に入るように水で希釈し,試料溶液とした。
濃度既知の22KhGH−mHSA溶液を水で希釈し,22KhGH−mHSAをそれぞれ1.0,0.8,0.6,0.4,0.2 mg/mL含有する溶液を調製し,それぞれ標準溶液1〜5とした。試験の対象である水性医薬組成物を,蛋白質濃度が0.4〜0.8 mg/mLの範囲に入るように水で希釈し,試料溶液とした。
クーマシー試液による反応:PierceTM Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit(ThermoFisher SCIENTIFIC社)に含まれるPierce Coomasie Assay Reagentを,15 mL遠心管に5 mLずつ,測定に必要な本数分採取した。次いで,Pierce Coomasie Assay Reagentを採取した15 mL遠心管にそれぞれ水(ブランク用),標準溶液1〜5,及び試料溶液を100 μLずつ添加し,転倒混和した後10分間,室温で静置し反応させた。反応後速やかに,分光光度計(UV-2600,島津製作所社)を用い,測定用セル(キュベット,光路長10 mm,光路幅10 mm,ザルスタット社)に測定試料を2 mL以上入れて波長595 nmで吸光度測定を行った。標準溶液1〜5の吸光度をY軸,理論蛋白質濃度をX軸にとり,回帰直線(検量線)を作成して,試料溶液の吸光度から蛋白質濃度を算出した。
本発明によれば,血清アルブミンと成長ホルモンが連結した蛋白質を有効成分として含有する医薬を,水性医薬組成物の形態で,市場に流通させることができる。
配列番号1:野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列
配列番号2:ヒト血清アルブミンRedhillのアミノ酸配列
配列番号3:ヒト血清アルブミン変異体(A320T)のアミノ酸配列
配列番号4:リンカーのアミノ酸配列の例1
配列番号5:リンカーのアミノ酸配列の例2
配列番号6:リンカーのアミノ酸配列の例3
配列番号7:野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列
配列番号8:変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列,合成
配列番号9:22Kヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号10:20Kヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号11:22KhGH−mHSAのアミノ酸配列
配列番号12:20KhGH−mHSAのアミノ酸配列
配列番号13:プライマーYA082,合成配列
配列番号14:プライマーYA083,合成配列
配列番号15:22KhGH−HSAのアミノ酸配列
配列番号16:22KhGH−HSA遺伝子を含む塩基配列,合成配列
配列番号2:ヒト血清アルブミンRedhillのアミノ酸配列
配列番号3:ヒト血清アルブミン変異体(A320T)のアミノ酸配列
配列番号4:リンカーのアミノ酸配列の例1
配列番号5:リンカーのアミノ酸配列の例2
配列番号6:リンカーのアミノ酸配列の例3
配列番号7:野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列
配列番号8:変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列,合成
配列番号9:22Kヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号10:20Kヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号11:22KhGH−mHSAのアミノ酸配列
配列番号12:20KhGH−mHSAのアミノ酸配列
配列番号13:プライマーYA082,合成配列
配列番号14:プライマーYA083,合成配列
配列番号15:22KhGH−HSAのアミノ酸配列
配列番号16:22KhGH−HSA遺伝子を含む塩基配列,合成配列
Claims (19)
- ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって,該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,スクロースの濃度が10〜150mg/mLであり,非イオン性界面活性剤の濃度が0.15〜10mg/mLであり,防腐剤の濃度が0.5〜12mg/mLであり,緩衝剤の濃度が1〜30mMであり,pHが5.0〜8.0である,水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質の濃度が,15〜70mg/mLである,請求項1に記載の水性医薬組成物。
- 該スクロースの濃度が,50〜100mg/mLである,請求項1又は2に記載の水性医薬組成物。
- 該非イオン性界面活性剤の濃度が,1.5〜4.5mg/mLである,請求項1乃至3のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート又はポロキサマーである,請求項1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該非イオン性界面活性剤が,ポリソルベート20,ポリソルベート80及びポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールからなる群から選択されるものである,請求項1乃至4のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該防腐剤がフェノールである,請求項1乃至6のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該フェノールの濃度が,3〜9mg/mLである,請求項7に記載の水性医薬組成物。
- 該緩衝剤がリン酸緩衝剤である,請求項1乃至8のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該リン酸緩衝剤の濃度が,2〜20mMである,請求項9に記載の水性医薬組成物。
- 該pHが,6.0〜7.8である,請求項1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該pHが,6.5〜7.6である,請求項1乃至10のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質の濃度が10〜100mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,請求項1に記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質の濃度が15〜70mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,請求項1に記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質の濃度が50mg/mLであり,該スクロースの濃度が75mg/mLであり,該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールであって,該ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールの濃度が3mg/mLであり,該防腐剤がフェノールであって,該フェノールの濃度が6mg/mLであり,該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって,該リン酸緩衝剤の濃度が10mMであり,該pHが7.0〜7.4である,請求項1に記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,85%以上の同一性を有するものである,請求項1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,90%以上の同一性を有するものである,請求項1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列と,95%以上の同一性を有するものである,請求項1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
- 該融合蛋白質のアミノ酸配列が,配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するものである,請求項1乃至15のいずれかに記載の水性医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019197978 | 2019-10-30 | ||
JP2019197978 | 2019-10-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021070700A true JP2021070700A (ja) | 2021-05-06 |
Family
ID=75713571
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020180998A Pending JP2021070700A (ja) | 2019-10-30 | 2020-10-29 | 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220378882A1 (ja) |
EP (1) | EP4059512A4 (ja) |
JP (1) | JP2021070700A (ja) |
KR (1) | KR20220095204A (ja) |
CN (1) | CN114728043B (ja) |
TW (1) | TW202131944A (ja) |
WO (1) | WO2021085518A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4047006A4 (en) * | 2019-10-17 | 2023-11-01 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | METHOD FOR PRODUCING SERUM-ALBUMIN FUSION PROTEIN AND GROWTH HORMONE |
CN115845079B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-07-18 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
EP1274720A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-08-18 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSED PROTEINS |
CA2841097A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin and g-csf fusion proteins |
US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
US8841249B2 (en) | 2009-08-06 | 2014-09-23 | Novo Nordisk A/S | Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy |
TWI508737B (zh) | 2010-01-22 | 2015-11-21 | 諾佛 儂迪克股份有限公司 | 具有延長的活體內功效的生長激素 |
KR101337797B1 (ko) * | 2010-07-14 | 2013-12-06 | 한미사이언스 주식회사 | 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제 |
JP5913122B2 (ja) | 2010-11-08 | 2016-04-27 | Jcrファーマ株式会社 | 新規発現ベクター |
WO2013161958A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 新規な発現ベクター |
WO2016011281A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-21 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | FORMULATIONS OF AN ALBUMIN-hGH FUSION PROTEIN |
EP3348635B1 (en) * | 2015-09-08 | 2021-02-17 | JCR Pharmaceuticals CO., LTD. | Novel human serum albumin mutant |
KR20170079409A (ko) * | 2015-12-30 | 2017-07-10 | 한미약품 주식회사 | 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제 |
WO2017154869A1 (ja) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Jcrファーマ株式会社 | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
EP3431508A4 (en) | 2016-03-14 | 2019-08-14 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | SERUM ALBUMIN-20-K-GROWTH HORMONE FUSION PROTEIN |
WO2019049967A1 (ja) * | 2017-09-07 | 2019-03-14 | Jcrファーマ株式会社 | 水性医薬組成物 |
CN109851674B (zh) * | 2018-10-26 | 2022-02-15 | 天津林达生物科技有限公司 | 一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法 |
EP4047006A4 (en) * | 2019-10-17 | 2023-11-01 | JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. | METHOD FOR PRODUCING SERUM-ALBUMIN FUSION PROTEIN AND GROWTH HORMONE |
-
2020
- 2020-10-29 EP EP20881312.1A patent/EP4059512A4/en active Pending
- 2020-10-29 CN CN202080076140.0A patent/CN114728043B/zh active Active
- 2020-10-29 WO PCT/JP2020/040560 patent/WO2021085518A1/ja unknown
- 2020-10-29 JP JP2020180998A patent/JP2021070700A/ja active Pending
- 2020-10-29 US US17/772,908 patent/US20220378882A1/en active Pending
- 2020-10-29 KR KR1020227017996A patent/KR20220095204A/ko unknown
- 2020-10-30 TW TW109137787A patent/TW202131944A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20220095204A (ko) | 2022-07-06 |
WO2021085518A1 (ja) | 2021-05-06 |
EP4059512A1 (en) | 2022-09-21 |
CN114728043B (zh) | 2024-04-16 |
CN114728043A (zh) | 2022-07-08 |
TW202131944A (zh) | 2021-09-01 |
EP4059512A4 (en) | 2023-12-06 |
US20220378882A1 (en) | 2022-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10772963B2 (en) | Etanercept formulations stabilized with xylitol | |
EP2699265B1 (en) | STABLE PHARMACEUTICAL LIQUID FORMULATIONS OF THE FUSION PROTEIN TNFR:Fc | |
US11000588B2 (en) | Etanercept formulations stabilized with sodium chloride | |
WO2021085518A1 (ja) | 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物 | |
WO2021075526A1 (ja) | 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質の製造方法 | |
KR20220063222A (ko) | 고농축 단백질 제형에서 점도 감소제로서의 캄포술폰산 및 양이온성 부형제와 이의 조합 | |
TW201842929A (zh) | 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物 | |
US20240132566A1 (en) | Method for producing fusion protein of serum albumin and growth hormone | |
JP2017165713A (ja) | 血清アルブミン−20k成長ホルモン融合タンパク質 | |
JP2022551622A (ja) | インテグリン抗体の安定な製剤 | |
TW202217006A (zh) | 血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質之製造方法 | |
CN117582517A (zh) | 白介素-2复合物、含白介素-2复合物的药物组合物及用途 | |
JP2024507347A (ja) | Fcドメインを含む操作されたタンパク質コンストラクトの水性組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20220502 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230913 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231025 |