KR20220095204A - 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질을 함유하는 수성 의약 조성물 - Google Patents
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Abstract
혈청 알부민과 성장 호르몬이 연결된 단백질을 함유하는 수성 의약 조성물이 개시되어 있다. 상기 수성 의약 조성물은 사람 혈청 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지고, 상기 융합 단백질의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 10 내지 150mg/mL이며, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.15 내지 10mg/mL이고, 방부제의 농도가 0.5 내지 12mg/mL이며, 완충제의 농도가 1 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 8.0인 것이다.
Description
본 발명은, 예를 들어, 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약의, 용액 상태에서 저장 안정한 수성 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 안정화제로서 수크로오스와 비이온성 계면 활성제를 추가로 함유하는 수성 의약 조성물에 관한 것이다.
사람 성장 호르몬 (hGH)은 시상하부의 제어 하에서 하수체 전엽에서 분비되는 단백질이다. hGH는 연골 형성 촉진, 단백질 동화 촉진 등의 성장 촉진 활성을 나타내는 것 외에, 체조성 및 지질 대사 개선 작용을 나타낸다. hGH의 분비가 적은 소아는, 건강한 아동과 비교하여 저신장을 나타내는 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증을 발증한다.
hGH 유전자를 도입한 대장균을 이용하여 재조합 단백질로서 제조된 분자량 약 22KD의 hGH를 유효 성분으로서 함유하는 제제 (hGH 제제)가, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에서의 저신장, SGA (Small-for-Gestational Age)성 저신장증, 누난 증후군에서의 저신장증, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에서의 저신장증, 연골이영양증에서의 저신장증의 치료제로서 널리 임상 응용되고 있다. hGH 제제는, 이들 질환에서 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 경우에서 특히 효과를 나타낸다. hGH 제제는 피하 또는 근육 내에 투여되어 혈중을 순환하고, 그 성장 촉진 활성에 의해 환자의 성장을 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, hGH 제제는 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 치료제로서도 널리 임상 응용되고 있다. 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에서는, 지질 대사 이상 등 여러 가지의 이상이 보이는데, hGH 제제의 투여에 의해, 환자의 지질 대사가 정상화되는 등, 환자의 QOL이 개선된다. 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 분비 부전증 등에 대한 hGH 제제로서는, 예를 들어, 그로우젝트 (등록상표)가 있다.
hGH의 혈장 중에서의 반감기는 20분 미만으로 알려져 있고, 환자에 투여된 hGH는 신속히 혈중에서 소멸한다. 이 때문에, hGH의 약효를 환자에게서 실질적으로 발휘시키려면, 환자에 hGH를 주에 3회 근육 내에 또는 매일 피하에 투여할 필요가 있다. 이러한 빈번한 투여는 환자의 부담이 되어 있다. 따라서, hGH의 혈장 중에서의 안정성을 증가시켜서 반감기를 연장시킴으로써 환자로의 hGH의 투여 횟수를 줄일 수 있다면, 환자의 부담을 경감시킬 수 있어, 바람직하다.
사람 혈청 알부민 (HSA)은 그 성숙형이 585개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. HSA는 혈장 단백질 중에서는 가장 양이 많은 성분으로, 혈장 중에서의 반감기가 14 내지 20일로 길다. HSA는, 혈장의 삼투압의 조절에 기여하는 동시에, 혈중의 양이온, 지방산, 호르몬류, 빌리루빈 기타 내인성의 물질 및 약제 등의 외인성의 물질과 결합하여 그것들을 운반하는 기능을 갖는다. 일반적으로, HSA와 결합한 물질은 장기에 들어가기 어려워지고, 핏속을 보다 장시간 순환할 수 있게 된다.
사람 혈청 알부민 (HSA)에는, 천연의 변이체 (variant)가 복수 있는 것이 알려져 있다. 사람 혈청 알부민 Redhill은 그 하나이다 (비특허 문헌 1, 2). 사람 혈청 알부민 Redhill은, 585개의 아미노산으로 이루어진 상기의 통상의 사람 혈청 알부민의 아미노산 서열과 비교하여, 그 N 말단측으로부터 320번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌이고, 또한 그 N 말단에 아르기닌 잔기가 1개 부가되어 있는 점에서 다르고, 586개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 알라닌의 트레오닌으로의 변화에 의해, 알부민 Redhill에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr로 표시되는 서열이 생기고, 이 서열 중의 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화된다. 이 때문에 알부민 Redhill은, 상기의 통상의 사람 혈청 알부민과 비교하여 분자량이 2.5kDa 만큼 크게 관찰된다.
hGH의 혈장 중에서의 안정성을, hGH에 HSA를 결합시킴으로써 증가시키는 방법이 보고되어 있다 (특허 문헌 1 내지 8). hGH에 HSA를 결합시킨 단백질은, hGH를 코드하는 유전자와 HSA를 코드하는 유전자를 인프레임에 결합시킨 DNA를 삽입한 발현 벡터를 도입한 형질 전환 세포를 제작하고, 이 세포를 배양함으로써, 배지 중 또는 세포 내에 재조합 단백질로서 제작된다.
상기 배경 하에서, 본 발명의 한 목적은 사람 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약의, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로 안정한, 수성 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 목적을 위한 연구에서 검토를 거듭한 결과, 585개의 아미노산으로 이루어진 통상의 사람 혈청 알부민과 비교하여 그 N 말단으로부터 320번째의 아미노산 잔기인 알라닌이 트레오닌으로 치환되어 있는 것인 아미노산 서열로 이루어진 변이체 (사람 혈청 알부민 변이체)를 사람 성장 호르몬 (hGH)과 결합시켜서 얻은 화합물 (사람 혈청 알부민 변이체-hGH 융합 단백질)이, 수크로오스와 비이온성 계면 활성제를 함유하는 수성 의약 조성물 중에서 안정된 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 이하를 포함하는 것이다.
1. 사람 혈청 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 10 내지 150mg/mL이고, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.15 내지 10mg/mL이고, 방부제의 농도가 0.5 내지 12mg/mL이고, 완충제의 농도가 1 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 8.0인, 수성 의약 조성물.
2. 상기 융합 단백질의 농도가 15 내지 70mg/mL인, 상기 1에 기재된 수성 의약 조성물.
3. 상기 수크로오스 농도가 50 내지 100mg/mL인, 상기 1 또는 2에 기재된 수성 의약 조성물.
4. 상기 비이온성 계면 활성제의 농도가 1.5 내지 4.5mg/mL인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
5. 상기 비이온성 계면 활성제가, 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
6. 상기 비이온성 계면 활성제가, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
7. 상기 방부제가 페놀인, 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
8. 상기 페놀의 농도가 3 내지 9mg/mL인, 상기 7에 기재된 수성 의약 조성물.
9. 상기 완충제가 인산 완충제인, 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
10. 상기 인산 완충제의 농도가 2 내지 20mM인, 상기 9에 기재된 수성 의약 조성물.
11. 상기 pH가 6.0 내지 7.8인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
12. 상기 pH가 6.5 내지 7.6인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
13. 상기 융합 단백질의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 상기 1에 기재된 수성 의약 조성물.
14. 상기 융합 단백질의 농도가 15 내지 70mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 상기 1에 기재된 수성 의약 조성물.
15. 상기 융합 단백질의 농도가 50mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이고, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 상기 1에 기재된 수성 의약 조성물.
16. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 것인, 상기 1 내지 15 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
17. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 것인, 상기 1 내지 15 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
18. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 것인, 상기 1 내지 15 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
19. 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 1 내지 15 중 어느 하나에 기재된 수성 의약 조성물.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로, 사람 알부민과 사람 성장 호르몬이 결합한 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약을, 안정한 수성 의약 조성물로 할 수 있다.
[도 1] 도 1은 실시예의 정적 광산란 강도의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 473nm에서의 정적 광산란 강도 (임의 단위)를, 가로축은 온도를 각각 나타낸다. 도면 중, (a), (b), 및 (c)는, 각각 처방 2-1, 2-2, 및 2-3의 측정 결과이다.
[도 2A] 도 2A는, 실시예 10에서의 처방 5-1의 조제 직후의 SE-HPLC 차트를 나타낸다. 세로축은 215nm에서의 흡광도 (임의 단위), 가로축은 유지 시간 (분)을 각각 나타낸다.
[도 2B] 도 2B는, 도 2A를 세로축 방향으로 확대한 도면이다. 도면 중, 피크 1은 22KhGH-mHSA의 단량체, 피크 2는 그 중합체, 피크 3은 그 저분자체, 피크 4는 페놀에 각각 대응한다.
[도 2A] 도 2A는, 실시예 10에서의 처방 5-1의 조제 직후의 SE-HPLC 차트를 나타낸다. 세로축은 215nm에서의 흡광도 (임의 단위), 가로축은 유지 시간 (분)을 각각 나타낸다.
[도 2B] 도 2B는, 도 2A를 세로축 방향으로 확대한 도면이다. 도면 중, 피크 1은 22KhGH-mHSA의 단량체, 피크 2는 그 중합체, 피크 3은 그 저분자체, 피크 4는 페놀에 각각 대응한다.
본 명세서에서, 단순히 「사람 혈청 알부민」 또는 「HSA」라고 말할 때에는, 서열번호 1로 표시되는 585개의 아미노산 잔기로 이루어진 통상의 야생형의 사람 혈청 알부민에 첨가하고, 혈중의 내인성의 물질 및 약제 등의 외인성의 물질을 결합하여 운반하는 기능 등의 통상의 야생형 사람 혈청 알부민으로서의 기능을 갖는 것인 한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가, 치환, 결실, 및/또는 부가 (본 명세서에서, 아미노산 잔기의 「부가」는, 서열의 말단 또는 내부에 잔기를 추가하는 것을 의미한다.)된 것에 상당하는 HSA의 변이체도 특별히 구별하지 않고 포함한다. 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기가 결실된, 584개의 아미노산 잔기로 이루어진 변이체도, 사람 혈청 알부민에 포함된다. 또한, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합해도 좋다. 또한, 통상의 야생형 HSA 또는 그 변이체의 아미노산 서열 중에 또는 상기 아미노산 서열의 N 말단측 혹은 C 말단 측에, 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 것이라도 좋다. 이때 부가되는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다.
이들 아미노산의 치환, 결실, 및 부가의 3종류의 변이 중, 적어도 2종류의 변이를 조합하여 도입한 HSA의 변이체는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 결실과, 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환과, 추가로 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 부가를 행하여 이루어진 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 대한 이들 결실, 치환 및/또는 부가되는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 각각 5개 이하, 더욱 바람직하게는 3개 이하이다.
본 발명에 있어서, 「사람 혈청 알부민 Redhill」 (HSA-Redhill)이란 말은, 사람 혈청 알부민의 변이체로서, 서열번호 2로 표시되는 586개의 아미노산 잔기로 이루어진 것을 의미한다. 사람 혈청 알부민 Redhill은, 서열번호 1로 표시되는 585개의 아미노산으로 이루어진 야생형의 사람 혈청 알부민의 아미노산 서열에 대하여, N 말단으로부터 320번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌이고 또한 N 말단에 아르기닌 잔기가 1개 부가한 것에 상당한다. 이 알라닌의 트레오닌으로의 치환에 의해, 알부민 Redhill에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr로 표시되는 서열 부분이 생기고, 이 서열 부분 중의 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화되어 있다. 이 때문에 알부민 Redhill은, 통상의 야생형 알부민 (서열번호 1)과 비교하여 분자량이 2.5kDa 만큼 크게 관찰된다.
본 발명에 있어서, 「사람 혈청 알부민 변이체」 (HSA 변이체)의 말은 통상의 야생형 HSA (서열번호 1)에 대한 상술의 변이체로서, 단 서열번호 2로 표시되는 변이체 (HSA-Redhill) 이외의 것을 말한다. 본 발명에서 바람직한 HSA 변이체는, 야생형의 HSA의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 320번째의 알라닌이 트레오닌으로 치환한 것인 서열번호 3으로 표시되는 것에 더하여, 혈중의 내인성의 물질 및 약제 등의 외인성의 물질을 결합하여 운반하는 기능 등의 통상의 야생형 사람 혈청 알부민으로서의 기능을 갖는 것인 한, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 결실되어, 혹은 부가된 아미노산 서열이며, 단 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318번째의 아스파라긴 잔기 및 320번째의 트레오닌 잔기가, 이들 2잔기의 사이에 프롤린 이외의 단일의 아미노산 잔기 (X)를 통하여 펩타이드 결합에 의해 연결된 상태에서 보존되어 있는 것인 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다. 상기 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 아미노산 잔기를 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산 잔기의 개수는, 바람직하게는 1 내지 10개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개이다. 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산 잔기가 결실된, 584개의 아미노산 잔기로 이루어진 변이체라도 좋다. 또한, 이들 아미노산 잔기의 치환과 결실을 조합한 것이라도 좋다. 또한, 이들 변이체의 아미노산 서열 중에 또는 상기 아미노산 서열의 N 말단측 혹은 C 말단측에, 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 것이라도 좋다. 즉, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 아미노산 치환 및 결실, 및 부가의 3종류의 변이 중, 적어도 2종류의 변이를 조합하여 도입한 것으로서, 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 결실과, 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환과, 추가로 0 내지 10개의 아미노산 잔기의 부가를 행한 것일 수 있다. 단, 서열번호 3에 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 318 내지 320번째의 아미노산 잔기는 아스파라긴-X-트레오닌 (「X」는 프롤린 이외의 아미노산 잔기)이어야 하고, 바람직하게는, 아스파라긴-티로신-트레오닌이다. 또한, 사람 혈청 알부민 변이체는, 사람 혈청 알부민으로서의 기능을 유지하는 한, 사람 혈청 알부민에 포함된다. 여기서 사람 혈청 알부민 변이체의 아미노산 서열은, 서열번호 1로 표시되는 통상의 야생형 HSA의 아미노산 서열과, 바람직하게는 85% 이상의 동일성을, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다.
본 발명에 있어서, 다양한 HSA 변이체에서의 통상의 야생형 HSA과 비교했을 때의 각 변이의 위치 및 그 형식 (결실, 치환, 부가)은, 양 HSA의 아미노산 서열의 얼라인먼트에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 야생형 HSA의 아미노산 서열과 변이를 가한 HSA의 아미노산 서열의 동일성은, 주지의 상동성 계산 알고리즘을 이용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그러한 알고리즘으로서, BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘 (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)) 등이 있다.
상기의 HSA의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환은, 예를 들어, 아미노산의 그 측쇄 및 화학적 성질로 관련성이 있는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 이러한 아미노산 패밀리 내에서의 치환은, HSA의 기능에 큰 변화를 가져오지 않는 (즉, 보존적 아미노산 치환인) 것이 예측된다. 이러한 아미노산 패밀리로서는, 예를 들어, 이하의 것이 있다:
(1) 산성 아미노산인 아스파르트산과 글루타민산,
(2) 염기성 아미노산인 히스티딘, 라이신, 및 아르기닌
(3) 방향족 아민산인 페닐알라닌, 티로신, 트립토판,
(4) 수산기를 갖는 아미노산 (하이드록시아미노산)인 세린과 트레오닌,
(5) 소수성 아미노산인 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신,
(6) 중성의 친수성 아미노산인 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민,
(7) 펩타이드쇄의 배향에 영향을 주는 아미노산인 글리신과 프롤린,
(8) 아미드형 아미노산 (극성 아미노산)인 아스파라긴과 글루타민,
(9) 지방족 아미노산인, 알라닌, 류신, 이소류신, 및 발린,
(10) 측쇄가 작은 아미노산인 알라닌, 글리신, 세린, 및 트레오닌,
(11) 측쇄가 특히 작은 아미노산인 알라닌과 글리신.
후술의 실시예에서 사람 성장 호르몬과 사람 혈청 알부민 변이체를 결합시킨 단백질에서의 사람 혈청 알부민 변이체 (HSA 변이체의 전형적 일례)는, 585개의 아미노산으로 이루어진 야생형의 사람 혈청 알부민의 아미노산 서열 (서열번호 1)에 대하여, N 말단으로부터 320번째의 아미노산 잔기가 알라닌이 아니라 트레오닌인 점에서만 다르다 (서열번호 3). 이 상이에 의해, 상기 HSA 변이체 (「HSA (A320T)」라고 한다.)에서는 그 아미노산 서열 중에 Asn-Tyr-Thr로 표시되는 서열 부분이 생기고, 그 서열 부분에서 Asn (아스파라긴) 잔기가 N-결합형 글리코시드화될 수 있다.
본 명세서에서, 「사람 혈청 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질」 또는 「사람 혈청 알부민-hGH 융합 단백질 (HSA-hGH 융합 단백질)」이란, HSA와 성장 호르몬을 결합시킨 단백질을 말한다. 여기서, 이들 단백질을 「결합시킨다」란, 예를 들어, 이것들을 펩타이드 결합에 의해 연결시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이들 단백질을 「결합시킨다」란, 한쪽의 N 말단과 다른 쪽의 C 말단 사이를 직접 펩타이드 결합으로 연결시키는 것뿐만 아니라, 양 단백질을 링커를 통하여 간접적으로 결합시키는 것도 포함한다. 특히, 사람 혈청 알부민이 사람 혈청 알부민 변이체일 때에는, 「사람 혈청 알부민 변이체와 사람 성장 호르몬의 융합 단백질」 또는 「사람 혈청 알부민 변이체-hGH 융합 단백질 (HSA 변이체-hGH 융합 단백질)」이라고 한다. 즉, 사람 혈청 알부민 변이체-hGH 융합 단백질은, 사람 혈청 알부민-hGH 융합 단백질에 포함된다. 「사람 혈청 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질」은, HSA 연결 hGH라고 말할 수도 있다.
여기에 「링커」는, 상기 2개의 폴리펩타이드의 사이에 있고 양자를 공유 결합으로 결합하는 구조 부분이며, HSA (HSA 변이체를 포함한다)와 그 결합 상대인 성장 호르몬의 어느 말단에도 유래하지 않는 것이다. 링커는, 양 폴리펩타이드와 펩타이드 결합한, 단일의 아미노산 잔기이거나 또는 2개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드쇄 부분 (펩타이드 링커)일 수 있고, 이들 1개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 링커를, 본 명세서에서 포괄적으로 「펩타이드 링커」라고 한다. 또한, 본 명세서에서, HSA와 성장 호르몬이 「펩타이드 결합을 통하여」 결합하고 있다고 할 때에는, 양자가 직접 펩타이드 결합에 의해 결합하고 있는 경우와 양자가 펩타이드 링커와의 결합에 의해 결합하고 있는 경우를 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서, HSA와 성장 호르몬이 직접 또는 펩타이드 링커를 통하여 결합하고 있는 경우, 상기 화합물인 「사람 혈청 알부민-hGH 융합 단백질 (HSA-hGH 융합 단백질)」은, 「사람 혈청 알부민 융합 hGH (HSA 융합 hGH)」라고 할 수도 있다. 사람 혈청 알부민 변이체-hGH 융합 단백질 (HSA 변이체-hGH 융합 단백질)에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명에 있어서, HSA와 성장 호르몬이 펩타이드 링커를 통하여 결합하고 있을 때, 그 링커는, 바람직하게는 1 내지 50개, 보다 바람직하게는 1 내지 17개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 예를 들어, 2 내지 17개, 2 내지 10개, 10 내지 40개, 20 내지 34개, 23 내지 31개 또는 25 내지 29개의 아미노산으로 구성되는 것이며, 또한 예를 들어, 1개의 아미노산 잔기만, 또는 2개, 3개, 5개, 6개 또는 20개의 아미노산 잔기로 구성되는 것이다. 펩타이드 링커로 결합된 HSA 부분이 HSA로서의 기능을 유지하고 또한 성장 호르몬의 부분도 생리적 조건 하에서 성장 호르몬의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 펩타이드 링커를 구성하는 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신, 세린으로 구성되는 것이다. 펩타이드 링커의 적합한 예로서, 1개의 글리신, 1개의 세린, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 4), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 5) 및 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열번호 6)로 이루어진 것, 및 이들 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 것을 들 수 있다. 이들 아미노산 서열 중 어느 1종이 2 내지 10회, 혹은 2 내지 5회 연속해서 이루어진 서열을 갖는 것도, 펩타이드 링커로서 적합하게 사용할 수 있고, 또한, 이들 아미노산 서열 중 어느 2종 이상이 조합되어 1 내지 10회, 혹은 2 내지 5회 연속해서 이루어진 서열을 갖는 것도, 펩타이드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다. 이들 아미노산 서열의 어느 2종 이상이 조합된 펩타이드 링커의 적합한 것으로서, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어서 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 5)이 3개 연속해서 이루어진 합계 20개의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
2개의 다른 폴리펩타이드를 결합하는 방법으로서는, 예를 들어, 한쪽의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 하류에, 인프레임에서 다른 쪽의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 결합시킨 DNA를 삽입한 발현 벡터를 작제하고, 이 발현 벡터를 이용하여 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 융합 단백질로서 발현시키는 방법이 일반적이며, 본 발명에서 이용할 수 있다.
재조합체로서 형질 전환 세포에 발현시킴으로써 HSA-hGH 융합 단백질을 생성시키는 경우, 성장 호르몬의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드가, HSA의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단의 어느 하나에 결합된 형태의 융합 단백질을 얻을 수 있다. 유전자 조작 기술을 이용하여 제조된 HSA-hGH 융합 단백질은, 특히, 재조합 HSA-hGH 융합 단백질이라고 한다.
HSA의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드의 N 말단측에 성장 호르몬의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드를 결합시키는 경우, 성장 호르몬의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 하류에, HSA의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 인프레임에서 결합시킨 DNA를 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 펩타이드 링커를 통하여 2개의 폴리펩타이드를 간접적으로 결합시키는 경우에는, 2개의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 사이에, 상기 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임에서 삽입된다.
HSA의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 C 말단측에 성장 호르몬의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 결합시키는 경우, 성장 호르몬의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 상류에, HSA의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 인프레임에서 결합시킨 DNA를 삽입한 발현 벡터가 사용된다. 펩타이드 링커를 통하여 2개의 폴리펩타이드를 간접적으로 결합시키는 경우에는, 2개의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 사이에, 상기 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임에서 삽입된다.
HSA-hGH 융합 단백질을 숙주 세포에 산생시키기 위해서는, 그것들 중 어느 하나를 코드하는 DNA를 삽입한 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된다. 이를 위해 사용할 수 있는 숙주 세포는, 그러한 발현 벡터를 도입함으로써 HSA-hGH 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 한 특별히 제한은 없고, 포유 동물 세포, 효모, 식물 세포, 곤충 세포 등의 진핵 생물 세포, 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 중 어느 것이라도 좋지만, 포유 동물 세포가 특히 적합하다. 단, 당쇄 수식된 단백질로서 발현시킬 경우의 숙주 세포는 포유 동물 세포, 효모, 식물 세포, 곤충 세포 등의 진핵 생물 세포에서 선택된다. 통상 야생형의 HSA의 320번째의 아미노산 잔기가 트레오닌이 됨으로써 생기는 Asn-Tyr-Thr로 표시되는 서열 부분의 Asn 잔기, 또는 Asn-X-Thr (「X」는 프롤린 이외의 아미노산 잔기)로 표시되는 서열 중의 Asn 잔기는, HSA-hGH 융합 단백질의 발현을 진핵 생물 세포에서 시킴으로써 N-결합형 글리코시드화된다.
포유 동물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우, 상기 포유 동물 세포의 종류에 대하여 특별히 한정은 없지만, 사람, 마우스, 차이니즈 햄스터 유래의 세포가 바람직하고, 특히 차이니즈 햄스터 난소 세포 유래의 CHO 세포, 또는 마우스 골수종에 유래하는 NS/0 세포가 바람직하다. 또한 이때 HSA-hGH 융합 단백질을 코드하는 DNA 단편을 삽입하여 발현시키기 위해 이용하는 발현 벡터는, 포유 동물 세포 내에 도입했을 때 상기 유전자의 발현을 가져오는 것이라면 특별히 한정 없이 사용할 수 있다. 발현 벡터에 삽입된 상기 유전자는, 포유 동물 세포 내에서 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 서열 (유전자 발현 제어 부위)의 하류에 배치된다. 본 발명에서 사용할 수 있는 유전자 발현 조절 부위로서는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 사람 신장 인자 1α (EF-1α) 프로모터, 사람 유비퀴틴 C프로모터를 들 수 있다.
이러한 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 발현 벡터에 삽입되어 있는 단백질을 발현하게 되지만, 그 발현량은 개개의 세포에 의해 다르며 동일하지 않다. 따라서, HSA-hGH 융합 단백질을 효율적으로 생산하기 위해서는, 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포로부터, 이것들의 발현 레벨이 높은 세포를 선택하는 스텝이 필요해진다. 이 선택 스텝을 행하기 위해, 발현 벡터에는 선택 마커로서 작용하는 유전자가 삽입되어 있다.
선택 마커로서 가장 일반적인 것은 퓨로마이신, 네오마이신 등의 약제를 분해하는 효소 (약제 내성 마커)이다. 포유 동물 세포는 통상 일정 농도 이상의 이들 약제의 존재 하에서 사멸한다. 하지만, 약제 내성 마커 유전자가 삽입된 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 발현된 약제 내성 마커에 의해 상기 약제를 무독화 또는 약독화할 수 있으므로, 상기 약제 존재 하에서도 생존 가능해진다. 선택 마커로서 약제 내성 마커가 삽입된 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하고, 그 약제 내성 마커에 대응하는 약제를 함유하는 선택 배지 중에서, 예를 들어, 그 약제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 약제 존재 하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 약제 내성 마커와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입된 목적의 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 상기 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또한, 선택 마커로서, 글루타민 합성효소 (GS)를 사용할 수도 있다. 글루타민 합성효소는, 글루타민산과 암모니아로부터 글루타민을 합성하는 효소이다. 포유 동물 세포를, 글루타민 합성효소의 저해제, 예를 들어, L-메티오닌설폭시민 (MSX)을 함유하고, 또한 글루타민을 함유하지 않는 선택 배지 중에서 배양하면, 세포는 통상 사멸한다. 하지만, 선택 마커로서 글루타민 합성효소가 삽입된 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하면, 상기 세포에서는, 글루타민 합성효소의 발현 레벨이 상승하게 되므로, 보다 고농도의 MSX 존재 하에서도 증식 가능해진다. 이 때, MSX의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 MSX 존재 하에서도 증식 가능한 세포를 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, 글루타민 합성효소와 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입된 목적의 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 상기 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
또한, 선택 마커로서, 디하이드로엽산 리덕타아제 (DHFR)를 사용할 수도 있다. DHFR을 선택 마커로서 사용할 경우, 발현 벡터를 도입한 포유 동물 세포는, 메토트렉세이트, 아미노프테린 등의 DHFR 저해제를 함유하는 선택 배지 중에서 배양된다. DHFR 저해제의 농도를 서서히 상승시키면서 배양을 계속하면, 보다 고농도의 DHFR 저해제 존재 하에서도 증식 가능한 세포가 얻어진다. 이때 사용되는 선택 배지는, 하이포크산틴 및 티미딘을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 선택된 세포에서는, DHFR과 함께, 일반적으로, 발현 벡터에 삽입한 목적의 단백질을 코드하는 유전자의 발현량도 증가하고, 결과적으로 상기 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 선택된다.
목적의 단백질을 코드하는 유전자의 하류측에 내부 리보솜 결합 부위 (IRES: internal ribosome entry site)를 통하여, 선택 마커로서 글루타민 합성효소 (GS)를 배치한 발현 벡터가 알려져 있다 (국제특허공보 WO2012/063799, WO2013/161958). 이들 문헌에 기재된 발현 벡터는, HSA-hGH 융합 단백질의 제조에 특히 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 목적의 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 제1 유전자 발현 제어 부위, 및, 그 하류에 상기 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 내부 리보솜 결합 부위, 및 추가로 하류에 글루타민 합성효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한, 상기 제1 유전자 발현 제어 부위의 또는 이것과는 별도의 제2 유전자 발현 제어 부위의 하류에 디하이드로엽산 리덕타아제 유전자 또는 약제 내성 유전자를 추가로 포함하여 이루어진 발현 벡터는, HSA-hGH 융합 단백질의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이 발현 벡터에 있어서, 제1 유전자 발현 제어 부위 또는 제2 유전자 발현 제어 부위로서는, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 사람 신장 인자-1α 프로모터 (hEF-1α 프로모터), 사람 유비퀴틴 C 프로모터가 적합하게 사용되는데, hEF-1α 프로모터가 특히 적합하다.
또한, 내부 리보솜 결합 부위로서는, 피코르나바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 타일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B형 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스의 게놈, 또는 사람 면역 글로불린 중쇄 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비토락스 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자의 5' 비번역 영역에 유래하는 것이 적합하게 사용되지만, 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 유래하는 내부 리보솜 결합 부위가 특히 적합하다. 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 사용하는 경우, 야생형의 것 이외에, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것도 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 이 발현 벡터에 있어서, 적합하게 사용되는 약제 내성 유전자는, 바람직하게는 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 유전자이고, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자이다.
또한, 예를 들어, 목적의 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 사람 신장 인자-1α 프로모터, 그 하류에 상기 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한 다른 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 디하이드로엽산 리덕타아제 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터로서, 상기 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, HSA-hGH 융합 단백질의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 발현 벡터로서, WO2013/161958에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
또한, 예를 들어, 목적의 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 사람 신장 인자-1α 프로모터, 그 하류에 상기 단백질을 코드하는 유전자, 또한 하류에 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 및 또한 하류에 글루타민 합성효소를 코드하는 유전자를 포함하고, 또한 다른 유전자 발현 제어 부위 및 그 하류에 약제 내성 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터로서, 상기 내부 리보솜 결합 부위가, 야생형의 내부 리보솜 결합 부위에 포함되는 복수의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것인 발현 벡터는, HSA-hGH 융합 단백질의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 발현 벡터로서, WO2012/063799에 기재된 pE-mIRES-GS-puro 및 WO2013/161958에 기재된 pE-mIRES-GS-mNeo를 들 수 있다.
야생형의 마우스 뇌심근염 바이러스 게놈의 5' 비번역 영역에 유래하는 내부 리보솜 결합 부위의 3' 말단에는 3개의 개시 코돈 (ATG)이 존재하고 있고, 그 3개의 개시 코돈을 포함하는 서열 부분은 서열번호 7 (5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3': 개시 코돈의 ATG를 대문자로 나타낸다)로 표시된다. 이 서열 부분 중의 개시 코돈 중의 일부가 파괴된 것으로서, 예를 들어, 서열번호 8 (5'-atgataagcttgccacaaccatg-3')로 표시되는 것이 있고, 상기의 pE-mIRES-GS-puro 및 pE-mIRES-GS-mNeo는, 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 IRES를 갖는 발현 벡터이다.
본 발명에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질을 코드하는 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 도입된 포유 동물 세포는, 이러한 발현 레벨이 높은 세포를 선택하기 위해서, 선택 배지 중에서 선택 배양된다.
선택 배양에 있어서, DHFR을 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 DHFR 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, DHFR 저해제가 메토트렉세이트의 경우, 바람직하게는 0.25 내지 5μM이고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5μM이며, 더욱 바람직하게는 약 1.0μM이다.
GS를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 GS 저해제의 농도를 단계적으로 상승시킨다. 그 최대 농도는, GS 저해제가 MSX의 경우, 바람직하게는 10 내지 1000μM 등이고, 예를 들어, 20 내지 500μM, 20 내지 80μM, 20 내지 30μM이다. 또한 이때, 일반적으로 글루타민을 함유하지 않는 배지가 선택 배지로서 사용된다.
퓨로마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 퓨로마이신의 최대 농도는, 바람직하게는 3 내지 30μg/mL이고, 보다 바람직하게는 5 내지 20μg/mL이며, 더욱 바람직하게는 약 10μg/mL이다.
네오마이신을 분해하는 효소를 선택 마커로서 사용하는 경우, 선택 배지에 포함되는 G418의 최대 농도는, 바람직하게는 0.1 내지 2mg/mL이고, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 약 1mg/mL이다.
또한, 포유 동물 세포의 배양을 위한 배지로서는, 선택 배양에서 사용하는 배지, 후술하는 재조합 단백질을 생산하기 위해 사용하는 배지 (재조합 단백질 생산용 배지) 둘다, 포유 동물 세포를 배양하여 증식시킬 수 있는 것이라면, 특별히 한정 없이 사용할 수 있지만, 바람직하게는 무혈청 배지가 사용된다. HSA는 혈청 중에 포함되는 성분을 흡착하는 성질을 가지므로, 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 HSA를 생산한 경우에는, 혈청 중의 불순물을 흡착한 HSA가 얻어지는 것으로부터, 그 후의 공정에서 이 불순물을 제거할 필요가 생긴다.
본 발명에서, HSA-hGH 융합 단백질은, 특히, 이것들을 발현하고 있는 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻어지는 것이다. 무혈청 배지를 사용함으로써, HSA-hGH 융합 단백질로의 불순물의 흡착량을 저감할 수 있으므로, 그 후의 정제 공정을 간소화할 수 있다.
선택 배양에 의해 선택된 HSA-hGH 융합 단백질의 발현 레벨이 높은 세포가 HSA-hGH 융합 단백질의 생산에 사용된다 (HSA-hGH 융합 단백질 산생 세포). HSA-hGH 융합 단백질의 생산은, HSA-hGH 융합 단백질 산생 세포를 HSA-hGH 융합 단백질 생산용 배지 중에서 배양함으로써 행하여진다. 이 배양을 생산 배양이라고 한다.
본 발명에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질 생산용 배지로서 사용되는 무혈청 배지로서는, 예를 들어, 아미노산을 3 내지 700mg/L, 비타민류를 0.001 내지 50mg/L, 단당류를 0.3 내지 10g/L, 무기염을 0.1 내지 10000mg/L, 미량 원소를 0.001 내지 0.1mg/L, 뉴클레오시드를 0.1 내지 50mg/L, 지방산을 0.001 내지 10mg/L, 비오틴을 0.01 내지 1mg/L, 하이드로코르티손을 0.1 내지 20μg/L, 인슐린을 0.1 내지 20mg/L, 비타민 B12를 0.1 내지 10mg/L, 푸트레신을 0.01 내지 1mg/L, 피루브산 나트륨을 10 내지 500mg/L, 및 수용성 철 화합물을 함유하는 배지가 적합하게 사용된다. 원하는 바에 의해, 티미딘, 하이포크산틴, 관용의 pH 지시약 및 항생 물질 등을 배지에 첨가해도 좋다.
HSA-hGH 융합 단백질 생산용 배지로서 사용되는 무혈청 배지로서, DMEM/F12배지 (DMEM과 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 사용해도 좋고, 이들 각 배지는 당업자에게 주지이다. 추가로 또한, 무혈청 배지로서, 탄산수소 나트륨, L-글루타민, D-글루코오스, 인슐린, 나트륨 셀레나이트, 디아미노부탄, 하이드로코르티손, 황산철 (II), 아스파라긴, 아스파라긴산, 세린 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 것인, DMEM (HG)HAM 개량형 (R5) 배지를 사용해도 좋다. 또한 시판의 무혈청 배지, 예를 들어, CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지 (Thermo Fisher Scientific사), IS cho-VTM 배지 (Irvine Scientific사), EX-CELLTM302 배지, EX-CELLTM Advanced 배지 또는 EX-CELLTM325-PF 배지 (SAFC Biosciences사) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있다.
HSA-hGH 융합 단백질 생산용 배지에는, 적절히, 대두, 밀, 벼 등의 식물 유래의 가수분해물을 1 내지 50g/L (예를 들어, 1 내지 5g/L)을 첨가할 수도 있다. 가장 일반적으로 사용되는 것은, 대두 유래의 단백질 가수분해물이다. 단, HSA-hGH 융합 단백질은, HSA-hGH 융합 단백질 생산용 배지에, 벼 등의 식물 유래의 가수분해물, 예를 들어, 대두 유래의 단백질 가수분해물을 첨가하지 않고 제조할 수 있다.
생산 배양 종료 후의 배양액은, HSA-hGH 융합 단백질의 정제를 위한 크로마토그래피 공정에 제공된다. 단, 크로마토그래피 공정에 제공되는 것은, 배양액으로부터 세포 등이 제거된 배양 상청이다. 배양액으로부터 배양 상청을 얻는 방법으로서는, 막 필터에 의한 여과, 원심 분리 등이 있다.
본 발명에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질의 정제를 위한 크로마토그래피 공정의 각각은, 필요에 따라서, 단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 비이온성 계면 활성제의 존재 하에서 행하여져도 좋다. 어떤 비이온성 계면 활성제를 사용하는지에 대하여 특단의 한정은 없지만, 폴리소르베이트계 계면 활성제가 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다. 그러한 비이온성 계면 활성제의 농도는, 바람직하게는 0.005% (w/v) 내지 0.1% (w/v)이고, 보다 바람직하게는 0.005% (w/v) 내지 0.05% (w/v)이며, 예를 들어, 0.01% (w/v), 0.05% (w/v) 등이다.
HSA-hGH 융합 단백질의 정제 공정은, 실온 또는 저온에서 행할 수 있지만, 바람직하게는 저온에서, 특히 1 내지 10℃에서 행할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질의 정제 공정은, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정과, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정을 포함하는 것이다. 단, 이들 크로마토그래피 공정에 1 또는 복수의 크로마토그래피 공정을 추가할 수도 있다. 이러한 추가의 크로마토그래피 공정으로서는, 예를 들어, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정, 소수성 컬럼 크로마토그래피 공정, 색소 친화성 컬럼 크로마토그래피 공정, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질의 정제 공정은, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정과, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정을, 이 순으로 포함하는 것이다. 단, 이들 크로마토그래피 공정에 1 또는 복수의 크로마토그래피 공정을 추가할 수도 있다. 이러한 추가의 크로마토그래피 공정으로서는, 예를 들어, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정, 소수성 컬럼 크로마토그래피 공정, 색소 리간드 컬럼 크로마토그래피 공정 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정을 들 수 있다. 추가의 크로마토그래피는, 어떤 인접한 스텝 사이에 추가해도 좋고, 또는, 최초의 크로마토그래피 공정, 마지막의 크로마토그래피 공정으로서 추가해도 좋다.
본 발명의 일 실시형태에서의, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정과, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정과, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정을, 이 순으로 포함하는 정제 공정에 대하여 이하에 상술한다.
제1 컬럼 크로마토그래피 공정은, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 여기서, 항체는, HSA 또는 hGH 중 어느 하나에 친화성을 갖는 것이라도 좋지만, 바람직하게는 hGH에 친화성을 갖는 것이다. 예를 들어, 사람 성장 호르몬에 대한 항체를 결합시킨 담체를 포함하는 것인, Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific사)는, 적합하게 사용할 수 있다.
hGH에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로 이용한 컬럼 크로마토그래피 컬럼을 이용하는 경우, HSA-hGH 융합 단백질은, 미리 완충액으로 평형화시킨 칼럼에 부친다. 여기에서, 완충액의 종류에 특별히 한정은 없지만, Tris-HCl 완충액이 바람직하고, 그 농도는, 바람직하게는 5 내지 50mM이고, 보다 바람직하게는 10 내지 30mM이다. 또한, 그 pH는, 바람직하게는 6.7 내지 7.3, 보다 바람직하게는 6.9 내지 7.1, 더욱 바람직하게는 약 7.0으로 조정된다. 컬럼으로부터의 HSA-hGH 융합 단백질의 용출은, 바람직하게는 글리신-염산을 사용하여 행해진다. 글리신-염산의 농도는, 바람직하게는 20 내지 100mM이고, 보다 바람직하게는 40 내지 60mM이며, 더욱 바람직하게는 약 50mM이다. 또한, 그 pH는 바람직하게는 2.0 내지 4.0, 보다 바람직하게는 2.8 내지 3.2, 그리고 더욱 바람직하게는 약 3.0으로 조정된다. 용출액의 pH는, 바로 중성 부근, 예를 들어, pH6.4 내지 7.0으로 조정된다.
제2 컬럼 크로마토그래피 공정은, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로 이용하는 것이다. 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용하는 컬럼 크로마토그래피로서 적합한 것으로서, 하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피와 플루오로아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 들 수 있는데, 하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피가 특히 바람직하다. 이것들은, 칼슘 이온에 의한 금속 친화성과, 인산기에 의한 양이온 교환의 양쪽에 의한 상호 작용을 이용하여, 협잡물을 제거하기 위한 것이다.
하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 경우에 대하여, 이하에 상술한다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 이용하는 담체에 대해서는 특단의 한정은 없고, 세라믹성이라도, 결정성이라도 좋지만, 특히 바람직한 담체의 하나로서, CHT Type II, 40μm (Bio-Rad Laboratories사)를 들 수 있다.
제1 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 용출액은, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼에 부쳐지기 전에, pH와 도전율이 조정된다. 이때, pH는, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 보다 바람직하게는 6.8 내지 7.2, 더욱 바람직하게는 6.9 내지 7.1로 조정된다. 또한, 도전율은, 바람직하게는 0.4 내지 0.8S/m, 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.7S/m으로 조정된다.
pH와 도전율을 조정한 용출액은, 미리 완충액으로 평형화된 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼에 부쳐진다. 여기에서, 완충액의 종류에 특별히 한정은 없지만, MES 완충액이 바람직하고, 그 농도는, 바람직하게는 5 내지 50mM이고, 보다 바람직하게는 10 내지 30mM이며, 예를 들어, 20mM이다. 또한, 그 pH는, 바람직하게는 6.7 내지 7.3, 보다 바람직하게는 6.9 내지 7.1, 더욱 바람직하게는 약 7.0으로 조정된다. 또한, 완충액은 인산 이온을 포함하고, 그 농도는 바람직하게는 0 내지 3mM이고, 보다 바람직하게는 0 내지 2mM이며, 예를 들어, 1mM이다.
하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터의 HSA-hGH 융합 단백질의 용출은, 인산 이온의 농도를 높인 완충액을 이용하여 행하여진다. 이때의 인산 이온의 농도는, 바람직하게는 20 내지 50mM이고, 보다 바람직하게는 25 내지 40mM이며, 더욱 바람직하게는 25 내지 35mM이고, 예를 들어, 30mM이다.
제3 컬럼 크로마토그래피 공정은, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이고, 협잡 단백질을 제거하기 위한 것이다. 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에서 어느 양이온 교환 수지를 사용하는지에 대하여 특별히 한정은 없지만, 약 양이온 교환 수지가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 소수성 상호 작용 및 수소 결합 형성의 양쪽에 기초하는 선택성을 갖는 약 양이온 교환 수지이다. 예를 들어, Capto MMC (GE Healthcare) 등과 같은, 페닐기, 아미드 결합, 및 카르복실기를 갖고 또한 소수성 상호 작용 및 수소 결합 형성에 기초하는 선택성을 갖는 약 양이온 교환 수지는 적합하게 사용할 수 있다.
제2 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 용출액은, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 부쳐지기 전에, pH와 도전율이 조정된다. 이때, pH는, 바람직하게는 5.3 내지 6.2, 보다 바람직하게는 5.4 내지 6.1, 더욱 바람직하게는 5.6 내지 5.8로 조정된다. 또한, 도전율은, 바람직하게는 0.5 내지 0.9S/m, 보다 바람직하게는 0.6 내지 0.8S/m로 조정된다.
pH와 도전율을 조정한 용출액은, 미리 완충액으로 평형화된 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 부쳐진다. 여기에서, 완충액의 종류에 특별히 한정은 없지만, MES 완충액이 바람직하고, 그 농도는, 바람직하게는 30 내지 70mM이고, 보다 바람직하게는 40 내지 60mM이며, 예를 들어, 50mM이다. 또한, 그 pH는, 바람직하게는 5.4 내지 6.0, 보다 바람직하게는 5.6 내지 5.8, 예를 들어, 5.7로 조정된다. 또한, 완충액은 염을 포함하고, 염이 중성염일 때의 완충액 중에서의 농도는 바람직하게는 30 내지 150mM이고, 보다 바람직하게는 50 내지 120mM이며, 더욱 바람직하게는 80 내지 120mM이고, 예를 들어, 100mM이다. 이때의 중성염은, 바람직하게는 염화 나트륨, 염화 칼륨인데, 특히 바람직하게는 염화 나트륨이다.
양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로부터의 HSA-hGH 융합 단백질의 용출은, 중성염의 농도를 높인 완충액을 이용하여 행하여진다. 이때의 중성염의 농도는, 바람직하게는 400 내지 600mM이고, 보다 바람직하게는 500 내지 600mM이며, 더욱 바람직하게는 530 내지 570mM이고, 예를 들어, 550mM이다.
제4 컬럼 크로마토그래피 공정은, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 사이즈 배제 크로마토그래피는, 분자 사이즈에 기초하여, 특히 엔도톡신 등의 저분자의 협잡물, HSA-hGH 융합 단백질의 다량체나 분해물을 제거하기 위한 것이다.
사이즈 배제 크로마토그래피 공정에 있어서, 컬럼은 미리 평형화된다. 여기에서, 완충액의 종류에 특별히 한정은 없지만, 인산 완충액이 바람직하고, 그 농도는, 바람직하게는 5 내지 20mM이고, 보다 바람직하게는 8 내지 12mM이며, 예를 들어, 10mM이다. 그 pH는, 바람직하게는 6.6 내지 7.4, 보다 바람직하게는 7.0 내지 7.4, 예를 들어, 7.2로 조정된다. 또한, 완충액은 의약품 첨가물로서 사용할 수 있는 이당류를 함유하는 것이라도 좋다. 이러한 이당류는, 바람직하게는 수크로오스이고, 그 농도는, 바람직하게는 60 내지 90mg/mL이고, 보다 바람직하게는 70 내지 80mg/mL이고, 예를 들어, 75mg/mL이다. 이 제1 내지 제4 컬럼 크로마토그래피 공정에 의해, 실질적으로 순수한 HSA-hGH 융합 단백질이 얻어진다.
HSA-hGH 융합 단백질의 정제 공정에 있어서, 바이러스 불활화 공정을 원하는 바에 의해 추가할 수 있다. 바이러스 불활화 공정은, 임의의 2개의 크로마토그래피 공정의 사이에 실시해도 좋고, 또한, 최초의 크로마토그래피 공정 전에, 또는 마지막의 크로마토그래피 공정 후에 실시해도 좋다. 또한, 바이러스 불활화 공정은 HSA-hGH 융합 단백질의 정제 공정에 있어서, 1회 실시해도 좋고, 2회 실시해도 좋고, 또는 3회 이상 실시해도 좋다.
크로마토그래피 공정이, HSA-hGH 융합 단백질에 친화성을 갖는 항체를 결합시킨 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정 (제1 컬럼 크로마토그래피 공정)과, 인산기에 대한 친화성을 갖는 재료를 고정상으로서 사용한 컬럼 크로마토그래피 공정 (제2 컬럼 크로마토그래피 공정)과, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정 (제3 컬럼 크로마토그래피 공정)과, 및 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정 (제4 컬럼 크로마토그래피 공정)을, 이 순으로 포함하는 것인 경우, 바이러스 불활화 공정은, 바람직하게는, 제1 컬럼 크로마토 그래피 공정과 제2 컬럼 크로마토그래피 공정의 사이에 있어서, 또는/및 제4 컬럼 크로마토그래피 공정의 후에서 실시된다. 어떤 바이러스 불활화 공정을 적용할지에 대하여 특별히 한정은 없지만, 용매-계면 활성제법 또는 필터 여과법을 적합하게 적용할 수 있다. 용매-계면 활성제법은, 바이러스를 불활화해야 할 용액에, 유기 용매와 계면 활성제를 첨가함으로써, 바이러스를 불활화시키는 방법이다. 용매-계면 활성제법이 적용되는 경우, HSA-hGH 융합 단백질을 함유하는 용액에 유기 용매와 비이온성 계면 활성제를 첨가하여 혼합하고, 이 혼합액이, 예를 들어, 3시간을 넘어 인큐베이트된다. 용매-계면 활성제법에서 사용되는 용액은, HSA-hGH 융합 단백질이 적어도 2시간 안정적으로 유지되는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 중성 부근에 pH가 조정된 글리신 완충액, 인산 완충액, MES 완충액, Tris-HCl 완충액, 또는 이것들의 혼합물에, 유기 용매와 비계면 활성제가 혼합된 것이 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 어떤 비이온성 계면 활성제를 이용하는지에 대해서도 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 및 triton X-100을, 단독으로 또는 이것들을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트 80은 특히 적합한 비이온성 계면 활성제의 하나이고, 단독으로 또는 다른 비이온성 계면 활성제와 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 어떤 유기 용매를 사용하는지에 대해서도 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 트리 (n-부틸포스페이트)를 사용할 수 있다. 폴리소르베이트 80과 트리 (n-부틸포스페이트)를 조합하여 사용할 경우, 혼합액 중의 폴리소르베이트 80의 농도는 0.3 내지 2%, 예를 들어, 1%이고, 트리 (n-부틸포스페이트)의 농도는 0.1 내지 0.5%, 예를 들어, 0.3%이고, 혼합액은 2 내지 5시간, 예를 들어, 3시간 인큐베이트된다.
필터 여과법은, 바이러스를 제거해야 할 용액을, 바이러스를 제거하는 성능을 갖는 여과막 (바이러스 제거막)으로 여과하여, 바이러스를 제거하는 방법이다. 필터 여과법에서 사용되는 여과막은, 바람직하게는 평균 구멍직경이 17 내지 21nm의 것이며, 그 재질은 예를 들어, 재생 셀룰로오스이다. 필터 여과법이 적용되는 경우, HSA-hGH 융합 단백질을 함유하는 용액을 바이러스 제거막에 통과시킨다. 예를 들어, 제1 컬럼 크로마토그래피 공정과 제2 컬럼 크로마토그래피 공정의 사이에서 용매-계면 활성제법에 의해 바이러스 불활화를 행하고, 제4 컬럼 크로마토그래피 공정 후에, 필터 여과법에 의해 바이러스 불활화를 행함으로써, 보다 확실하게 바이러스 제거를 행할 수 있다.
또한, 바이러스 제거막에 의한 방법은, 바이러스 제거 공정이라고 말할 수도 있지만, 본 발명에서는, 바이러스 불활화 공정의 한 수법이라고 할 수도 있다.
본 발명에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질은, HSA가 결합하고 있지 않은 원래의 성장 호르몬에 비하여, 혈중에서의 안정성이 높아지고 반감기가 길어진다. 투여 경로나 투여량에 의해 변동은 하지만, 피하주사로 필리핀 원숭이에게 투여했을 때의 혈중 반감기 (t1/2β)가 예를 들어, 5시간 이상으로, 혈중에서 극히 안정하게 된다. 예를 들어, HSA 변이체-사람 성장 호르몬 융합 단백질의 혈중 반감기 (t1/2β)는, 0.5 내지 10mg/kg의 용량으로 수컷 필리핀 원숭이에 단회 피하 투여했을 때, 혈중 반감기 (t1/2β)는, 5 내지 40시간이다.
본 발명에 있어서, HSA 변이체-성장 호르몬 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 의약은, 주사제로서 정맥, 근육 내, 복강 내 또는 피하에 투여할 수 있다.
사람 성장 호르몬에는, 주로 분자량이 22kDa인 것 (22kDa 사람 성장 호르몬, 본 명세서에서 22K 사람 성장 호르몬)과 20kDa인 것 (20kDa 사람 성장 호르몬, 본 명세서에서 20K 사람 성장 호르몬)의 분자량이 다른 2종류가 있다. 22K 성장 호르몬은, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 191개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 통상, 「사람 성장 호르몬 (또는 hGH)」이라고 말할 때에는, 이 22K 성장 호르몬을 의미하지만, 본 명세서에 있어서, 단순히 「사람 성장 호르몬 (또는 hGH)」라고 말할 때에는, 22K 사람 성장 호르몬과 20K 사람 성장 호르몬의 양쪽을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 단순히 「22K 사람 성장 호르몬 (또는 22KhGH)」이라고 말할 때에는, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 야생형의 22KhGH에 더하여, 이에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산이, 치환, 결실 및/또는 부가된 것인 22KhGH 변이체로서 성장 촉진 활성을 갖는 것도 포함된다. 치환, 결실 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 개수는, 각 변이 타입에 대하여, 바람직하게는 1 내지 8개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 4개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개이다. 여기서 22KhGH 변이체의 아미노산 서열은, 서열번호 9로 표시되는 야생형의 22KhGH의 아미노산 서열과, 바람직하게는 85% 이상의 동일성을, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다.
야생형의 20K 사람 성장 호르몬은, 야생형의 22K 성장 호르몬 (서열번호 9)을 구성하는 191개의 아미노산 중 N 말단으로부터 세어 32번째 내지 46번째의 15개의 아미노산이 결실된 것에 상당하고, 176개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열 (서열번호 10)로 이루어진, 성장 촉진 활성을 갖는 단백질이다. 단, 본 명세서에 있어서, 단순히 「20K 사람 성장 호르몬 (또는 20KhGH)」라고 말할 때에는, 서열번호 10으로 표시되는 야생형의 20KhGH에 더하여, 상기 서열에 대하여, 1개 또는 복수개의 아미노산이, 치환, 결실, 및/또는 부가된 것에 상당하는 20KhGH의 변이체로서 성장 촉진 활성을 갖는 것도 포함된다. 치환, 결실 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 개수는, 각 변이 타입에 대하여, 바람직하게는 1 내지 8개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 4개이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개이다. 여기서 20KhGH 변이체의 아미노산 서열은, 서열번호 10으로 표시되는 야생형의 20KhGH의 아미노산 서열과, 바람직하게는 85% 이상의 동일성을, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다.
본 발명에 있어서, 여러 가지 hGH 변이체에서의 통상의 야생형 hGH와 비교했을 때의 각 변이의 위치 및 그 형식 (결실, 치환, 부가)은, 양 hGH의 아미노산 서열의 얼라인먼트에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 야생형 hGH의 아미노산 서열과 변이를 가한 hGH의 아미노산 서열의 동일성은, 주지의 상 동성 계산 알고리즘을 이용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그러한 알고리즘으로서, BLAST (Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘 (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)) 등이 있다.
상기의 hGH의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환은, 예를 들어, 아미노산의 그 측쇄 및 화학적 성질에서 관련성이 있는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 이러한 아미노산 패밀리 내에서의 치환은, hGH의 기능에 큰 변화를 가져오지 않는 (즉, 보존적 아미노산 치환인) 것이 예측된다. 이러한 아미노산 패밀리로서는, 예를 들어, 이하의 것이 있다:
(1) 산성 아미노산인 아스파라긴산과 글루타민산,
(2) 염기성 아미노산인 히스티딘, 라이신, 및 아르기닌
(3) 방향족 아민산인 페닐알라닌, 티로신, 트립토판,
(4) 수산기를 갖는 아미노산 (하이드록시아미노산)인 세린과 트레오닌,
(5) 소수성 아미노산인 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신,
(6) 중성의 친수성 아미노산인 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민,
(7) 펩타이드쇄의 배향에 영향을 주는 아미노산인 글리신과 프롤린,
(8) 아미드형 아미노산 (극성 아미노산)인 아스파라긴과 글루타민,
(9) 지방족 아미노산인, 알라닌, 류신, 이소류신, 및 발린,
(10) 측쇄가 작은 아미노산인 알라닌, 글리신, 세린, 및 트레오닌,
(11) 측쇄가 특히 작은 아미노산인 알라닌과 글리신.
hGH 유전자를 도입한 대장균을 이용하여 재조합 단백질로서 제조된 분자량 약 22KD의 hGH를 유효 성분으로서 함유하는 제제 (hGH 제제)가, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에서의 저신장, SGA성 저신장증, 누난 증후군에서의 저신장증, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에서의 저신장, 및 연골이영양증에서의 저신장의 치료제로서 널리 임상 사용되고 있다. hGH 제제는, 이들 질환에서 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 경우에서 특히 효과를 나타낸다. hGH 제제는, 피하 또는 근육 내에 투여됨으로써 성분의 hGH가 혈중을 순환하고, 그 성장 촉진 활성에 의해 환자의 성장을 촉진하는 효과를 발휘한다. 또한, hGH 제제는, 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 치료제로서 널리 임상 사용되고 있다. 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에서는, 지질 대사 이상이 확인되는데, hgH 제제의 투여에 의해, 환자의 지질 대사 등이 정상화되고, 환자의 QOL이 개선된다. AIDS에 의한 소모의 치료제로서도 성장 호르몬은 임상 응용되고 있다. 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 성인 성장 호르몬 분비 부전증 등의 hGH 제제로서는, 예를 들어, 그로우젝트 (등록상표)가 있다.
HSA 변이체와 hGH의 융합 단백질을 제작하는 경우, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 결합시킬 구체적 방법으로서는, 예를 들어, 한쪽의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 하류에, 인프레임에서 다른 쪽의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터를 작제하고, 이 발현 벡터를 이용하여 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 단백질로서 발현시키는 방법이 일반적이고, 본 발명에서 이용할 수 있다.
재조합 단백질로서 형질 전환 세포에 발현시키는 방법에 의해 HSA 변이체와 hGH의 융합 단백질을 제작할 때, hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 N 말단측 또는 C 말단측 중 어느 하나에, 직접, 또는 링커를 통하여 간접적으로 결합된다.
HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 N 말단측에 hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 결합시키는 경우, hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 하류에, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 인프레임에서 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 이용된다. 2개의 폴리펩타이드를 펩타이드 링커를 통하여 간접적으로 결합시키는 경우에는, 2개의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 사이에, 상기 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임에서 배치된다.
HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 C 말단측에 hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 결합시키는 경우, hGH의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 상류에, HSA 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 유전자를 인프레임에서 결합시킨 DNA 단편을 삽입한 발현 벡터가 이용된다. 2개의 폴리펩타이드를 펩타이드 링커를 통하여 간접적으로 결합시키는 경우에는, 2개의 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 사이에, 상기 링커를 코드하는 DNA 서열이 인프레임에서 배치된다.
본 발명에 있어서, HSA 변이체와 hGH의 융합 단백질 (HSA-hGH 융합 단백질의 일종)의 적합한 일례로서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HSA (A320T)의 N 말단에, 링커를 통하지 않고, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 22K 사람 성장 호르몬의 C 말단을 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HSA-hGH 융합 단백질을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 이 순서로 HSA (A320T)와 22KhGH를 결합시킨 것을, 「22K 사람 성장 호르몬-mHSA」 또는 「22K hGH-mHSA」라고 한다. 마찬가지로, HSA (A320T)의 C 말단에, 링커를 통하지 않고, 22K 사람 성장 호르몬의 N 말단이 펩타이드 결합에 의해 결합한 것을 「mHSA-22K 사람 성장 호르몬」 또는 「mHSA-22KhGH」라고 한다.
또한, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 사람 혈청 알부민 (A320T)의 N 말단에, 링커를 통하지 않고, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 20K 사람 성장 호르몬의 C 말단을 펩타이드 결합에 의해 결합시킨 것인, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HSA-hGH 융합 단백질을, 「20K 사람 성장 호르몬-mHSA」 또는 「20KhGH-mHSA」라고 한다. 마찬가지로, 사람 혈청 알부민 (A320T)의 C 말단에, 링커를 통하지 않고, 20K 사람 성장 호르몬의 N 말단이 펩타이드 결합에 의해 결합한 것을 「mHSA-20K 사람 성장 호르몬」 또는 「mHSA-20KhGH」라고 한다.
본 발명에 있어서, HSA-hGH 융합 단백질은, 피하주사로 필리핀 원숭이에 투여했을 때의 혈중 반감기 (t1/2β)가 대강 5시간 이상으로 혈중에서 극히 안정해지는 것을 특징으로 한다. 투여량에 의해 변동은 하지만, 예를 들어, 4mg/kg의 용량으로 수컷 필리핀 원숭이에 단회 피하 투여했을 때의, mHSA-22KhGH 및 22KhGH-mHSA의 혈중 반감기 (t1/2β)는 20 내지 35시간이다.
본 발명에서의 HSA-hGH 융합 단백질은, 의약으로서 사용할 수 있다. HSA-hGH 융합 단백질은, 사람 성장 호르몬과 HSA의 기능을 생체 내에서 협동시킬 수 있다.
본 발명에서의 HSA-hGH 융합 단백질은, 혈중에서 극히 안정하다. 따라서, 본 발명에 의하면 사람 성장 호르몬을 혈중에서 안정화시켜서 장시간에 걸쳐 활성을 유지한 상태에서 혈중에 머무를 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질은, 의약으로서 이용한 경우, 사람 성장 호르몬과 비교해서 투여 빈도 또는/및 투여량을 줄이는 것이 가능해진다. 예를 들어, 사람 성장 호르몬은 매일 투여가 필요하지만, 상기 융합 단백질이면, 투여 빈도를 예를 들어, 3 내지 30일마다로 하는 것도 가능해진다. 또한, 치료 기간 중의 의약의 총 투여량을, 예를 들어, 몰비로 1/3 이하 (예를 들어, 1/3 내지 1/10)로까지 줄이는 것도 가능해진다.
본 발명에서의 HSA-hGH 융합 단백질은, 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증, 터너 증후군에서의 저신장, 만성 신부전에 의한 저신장증, 프레더 윌리 증후군에서의 저신장증, 연골이영양증에서의 저신장증, SGA성 저신장증, 또는 누난 증후군에서의 저신장증을 대상 질환으로 하는 의약으로서 사용할 수 있다. hGH 제제는, 이들 질환에서 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 경우에서 특히 효과를 나타낸다. 기타, 본 발명에서의 HSA-hGH 융합 단백질은, 성인 성장 호르몬 분비 부전증, AIDS에 의한 소모, 및 거식증에 의한 소모를 대상 질환으로 하는 의약으로서 사용할 수 있지만, 이에 한하지 않고, 성장 호르몬이 갖는 연골 형성 촉진, 단백질 동화 촉진 등의 성장 촉진 활성, 체조성 및 지질 대사 개선 작용 등의 생리 활성을, 장기에 걸쳐 작용시킴으로써 증상이 개선될 수 있는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다.
22KhGH-mHSA를 치료 목적으로 사람에게 투여할 때의 용법 용량에, hGH의 약효가 나타나는 한 특별히 한정은 없다. 22KhGH-mHSA의 용법 용량을 이하에 예시하지만, 용법 용량은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 성장 호르몬 분비 부전성 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.01 내지 0.7mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 터너 증후군에서의 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.015 내지 1.4mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 만성 신부전에 의한 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.01 내지 1.4mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 프레더 윌리 증후군에서의 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.012 내지 0.98mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 연골이영양증에서의 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.015 내지 1.4mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 SGA성 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.012 내지 1.9mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 성인 성장 호르몬 분비 부전증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.001 내지 0.34mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA를, 골단선 폐쇄를 동반하지 않는 누난 증후군에서의 저신장증의 환자에 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.013 내지 1.8mg/Kg 체중이다. 22KhGH-mHSA, AIDS에 의해 소모된 환자에게 투여할 경우, 1회당의 바람직한 투여량은 0.005 내지 0.4mg/Kg 체중이다. 단, 투여량은 환자의 검사 소견 등에 의해, 적절히 변경되어야 할 것이다. 또한, 이들 질환에서의, 바람직한 22KhGH-mHSA의 투여 간격은, 7 내지 30일마다 1회이고, 환자의 검사 소견 등에 의해, 7 내지 14일마다, 10 내지 20일마다, 또는 14 내지 21일마다 1회로 적절히 변경되어야 하는 것이다. 또한, 투여 방법은, 바람직하게는 피하 주사, 근육 내 주사 또는 정맥 주사이고, 보다 바람직하게는 피하 주사 또는 근육 내 주사이다.
본 발명에서의 수성 의약 조성물은, 유효 성분으로서 혈청 알부민과 성장 호르몬을 결합시킨 단백질, 방부제, 주로 안정화제로서 수크로오스와 비이온성 계면 활성제, 및 pH 조정제로서 완충제를 함유하여 이루어진 것이다.
수성 의약 조성물에 포함되는 혈청 알부민과 성장 호르몬을 결합시킨 단백질 (특히 22KhGH-mHSA)의 농도는, 바람직하게는 10 내지 100mg/mL이고, 보다 바람직하게는 15 내지 70mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 30 내지 65mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60mg/mL이며, 예를 들어, 50mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 방부제로서는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 페놀이 바람직하다. 방부제로서 페놀이 사용되는 경우, 수성 의약 조성물에 함유되는 페놀의 농도는, 바람직하게는 0.5 내지 12mg/mL이고, 보다 바람직하게는 3 내지 9mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 4 내지 8mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 5 내지 7mg/mL이며, 예를 들어, 6mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 수크로오스의 농도는, 바람직하게는 10 내지 150mg/mL이고, 보다 바람직하게는 50 내지 100mg/mL이며, 더욱 바람직하게는 60 내지 90mg/mL이고, 보다 더 바람직하게는 70 내지 80mg/mL이며, 예를 들어, 75mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 함유되는 비이온성 계면 활성제로서는, 폴리소르베이트나 폴록사머 등을 단독으로 또는 이것들을 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188 (폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜)이 특히 적합하다. 또한, 수성 의약 조성물에 함유되는 비이온성 계면 활성제의 농도는, 0.15 내지 10mg/mL인 것이 바람직하고, 1.0 내지 4.5mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 1.5 내지 4.5mg/mL인 것이 더욱 바람직하고, 2 내지 4mg/mL인 것이 보다 더 바람직하고, 2.5 내지 3.5mg/mL인 것이 보다 더 바람직하고, 예를 들어, 3mg/mL이다.
수성 의약 조성물에 포함되는 완충제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 한 특별히 한정은 없지만, 인산 완충제가 바람직하다. 완충제로서 인산 완충제가 사용될 경우, 수성 의약 조성물에 함유되는 인산 완충제의 농도는, 바람직하게는 1 내지 30mM이고, 보다 바람직하게는 2 내지 20mM이며, 더욱 바람직하게는 5 내지 15mM이고, 예를 들어, 약 10mM이다. 또한, 완충제에 의해 조정되는 수성 의약 조성물의 pH는, 바람직하게는 5.0 내지 8.0이고, 보다 바람직하게는 6.0 내지 7.8이며, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.6이고, 보다 더 바람직하게는 7.0 내지 7.4이며, 예를 들어, 7.2이다. 또한, 수성 의약 조성물의 생리 식염수에 대한 삼투압비는, 예를 들어, 1.0 내지 1.3으로 조정된다.
본 발명의 수성 의약 조성물의 적합한 조성으로서, 혈청 알부민과 성장 호르몬을 결합한 단백질 (특히 22KhGH-mHSA)의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 방부제의 농도가 0.5 내지 12mg/mL이며, 수크로오스의 농도가 10 내지 150mg/mL이고, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.15 내지 10mg/mL이며, 방부제의 농도가 0.5 내지 12mg/mL이고, 완충제의 농도가 1 내지 30mM이며, pH가 5.0 내지 8.0인 것을 들 수 있다.
본 발명의 추가적인 수성 의약 조성물의 적합한 조성으로서, 혈청 알부민과 성장 호르몬을 결합시킨 단백질 (특히 22KhGH-mHSA)의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 75mg/mL이고, 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30)글리콜의 농도가 3mg/mL이며, 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 인산 완충제의 농도가 10mM이며, pH가 7.0 내지 7.4인 것을 들 수 있다. 각 성분의 농도는, 상기의 바람직한 농도의 어느 하나로 각각 변경하는 것이 가능하다.
본 발명의 추가적인 수성 의약 조성물의 적합한 조성으로서, 혈청 알부민과 성장 호르몬을 결합시킨 단백질 (특히 22KhGH-mHSA)의 농도가 15 내지 70mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 인산 완충제의 농도가 10mM이며, pH가 7.0 내지 7.4인 것을 들 수 있다. 각 성분의 농도는, 상기의 바람직한 농도의 어느 하나로 각각 변경하는 것이 가능하다.
본 발명의 HSA-hGH 융합 단백질 (특히 22KhGH-mHSA)을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 의약은, 주사제로서 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 또는 뇌실 내에 투여할 수 있다. 이들 주사제는, 동결 건조 제제 또는 수성 액제 (수성 의약 조성물)로서 공급할 수 있다. 수성 액제로 하는 경우, 바이알에 충전한 형태로 해도 좋고, 주사기에 미리 충전한 것인 프리필드형의 제제로서 공급할 수도 있다. 동결 건조 제제의 경우, 사용 전에 수성 매질에 용해하여 복원해서 사용한다.
[실시예]
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.
[실시예 1] 22KhGH-HSA 발현용 벡터의 구축
22KhGH의 C 말단과 야생형 HSA (서열번호 1)의 N 말단을 결합시킨 것인, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을, 22KhGH-HSA로 하였다. 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 중, 1 내지 191번째의 아미노산 잔기가 22KhGH의 아미노산 서열에 상당하고, 192 내지 776번째의 아미노산 잔기가 HSA의 아미노산 서열에 상당한다. 22KhGH-HSA를 코드하는 유전자 (22KhGH-HSA 유전자)를 포함하는 서열번호 16으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA를 화학적으로 합성하였다. 이 서열에 있어서, 염기 11 내지 88이 hGH의 리더 펩타이드를, 염기 89 내지 661이 성숙형 hGH를, 염기 662 내지 2416이 성숙형 HSA를 각각 코드한다. 이 DNA를 제한 효소 (MluI 및 NotI)로 소화하고, pE-mIRES-GS-puro의 MluI 부위와 NotI 부위의 사이에 삽입함으로써, 22KhGH-HSA 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-HSA)를 구축하였다. 또한, pE-mIRES-GS-puro는, 국제 특허공보 WO2012/063799 등에 작제 방법이 기재되어 있어 주지의 것이다.
[실시예 2] 22KhGH-mHSA 발현용 벡터의 구축
22KhGH (서열번호 9)의 C 말단과 HSA (A320T) (서열번호 3)의 N 말단을 결합시킨 것인, 서열번호 11에 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을, 22KhGH-mHSA로 하였다. 실시예 1에서 작제한 pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-HSA)를 주형으로 하여, 프라이머 YA082 (서열번호 13) 및 프라이머 YA083 (서열번호 14)을 이용하여, PCR에 의해 22KhGH-mHSA를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA 단편을 셀프 어닐시켜서, 22KhGH-mHSA 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-mHSA)를 구축하였다.
[실시예 3] 22KhGH-mHSA 발현 세포주의 제작
22KhGH-mHSA를 발현시키기 위한 세포를 다음과 같이 해서 제작하였다. 차이니즈 햄스터의 난소에 유래하는 세포인 CHO-K1 세포에, Gene Pulser Xcell 일렉트로포레이션 시스템 (Bio Rad사)을 이용하여, 실시예 2에서 작제한, 22KhGH-mHSA 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-mHSA)를 도입하였다. 발현 벡터를 도입한 세포를, 16μM 티미딘, 100μM 히포크산틴, 10mg/L 인슐린, L-메티오닌설폭시민 (SIGMA사) 및 퓨로마이신 (SIGMA사)을 포함하는 CD OptiCHOTM 배지 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 선택 배양하였다. 선택 배양시에는, L-메티오닌설폭시민 및 퓨로마이신의 농도를 단계적으로 상승시켜서, 최종적으로 L-메티오닌설폭시민의 농도를 300μM, 퓨로마이신의 농도를 10μg/mL로 하여, 보다 높은 약제 내성을 나타내는 세포를 선택적으로 증식시켰다. 그 다음에, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96웰 플레이트 위에 선택 배양으로 선택된 세포를 파종하고, 단일 세포 유래의 콜로니가 형성될 때까지 약 10일간 배양하여, 세포를 클론화하였다. 클론화한 세포를 더 배양해서 증식시킨 후, 16μM 티미딘, 100μM히포크산틴, 300μM L-메티오닌설폭시민, 및 10% (v/v) DMSO 함유 CD OptiCHOTM 배지에 현탁시키고나서 동결 튜브에 분주하고, 액체 질소 중에서 보존하였다. 이 세포를 22KhGH-mHSA 발현 세포주로 하였다.
[실시예 4] 22KhGH-mHSA 발현 세포의 전배양
실시예 3에서 제작한 22KhGH-mHSA 발현 세포주를, 37℃ 워터 배스 중에서 융해하고, 16μM 티미딘, 100μM 히포크산틴 및 300μML-메티오닌설폭시민을 포함하는 무혈청 배지의 EX-CELL Advanced 배지 (전배양용 배지, SIGMA사)에 현탁시켜서 원심하여 세포를 침전시켜, 상청을 제거하였다. 침전시킨 세포를, 2×105개/mL 이상의 밀도에서 전배양용 배지에 현탁하고, 37℃, 5% CO2 존재하에서 2 내지 4일간 배양하였다. 세포수가 적어도 1.0×1011개로 증식할 때까지 배양 규모를 확대시키면서, 이 배양을 반복하였다.
[실시예 5] 22KhGH-mHSA 발현 세포의 생산 배양
전배양에서 증식시킨 세포를, 세포 농도가 4×105개/mL의 밀도로, 200L의 용량의 16μM의 티미딘 및 100μM의 히포크산틴을 포함하는 무혈청 배지인 EX-CELL Advanced 배지 (생산 배양용 배지, SIGMA사)에 현탁시켰다. 이 현탁액을, Xcellerex200L 배양 시스템 (XDR200)의 1회용 배양조 내에서, 임펠러로 100rpm의 속도로 교반하면서, 37℃, 포화 산소량 40%, pH를 6.9로 유지하여 10일간 배양하였다.
[실시예 6] 22KhGH-mHSA의 정제
(정제 공정 1: 하베스트 공정/농축 1공정)
생산 배양 종료 후, 배양액을, Millistak+ (등록상표) HC 포드 필터 그레이드 D0HC (1.1m2×2, Merck사)를 이용하여 여과하고, 이어서 Millistak+HC 포드 필터 그레이드 X0HC (1.1m2×1, Merck사)를 이용하여 여과해서 세포를 제거하고, 다시, Opticap SHC XL3 (구멍직경: 0.5/0.2μm, Merck사)으로 여과하여 배양 상청을 얻었다. 얻어진 배양 상청을, 미리 순수로 세정한 후, PBS로 평형화한 분획 분자량 30kDa의 한외 여과막 장치 (Pellicon3 카세트 울트라셀 PLCTK 멤브레인 장착 1.14m2, Merck사)를 이용하여 농축하였다. 한외 여과막 장치로부터 농축 후의 용액을 회수하였다. 또한 장치 안을, PBS를 통하여 세정하고, 이 세정액을 먼저 회수한 농축 후의 용액에 맞추어 중량을 약 15kg으로 조정한 것을 농축 배양액으로 하였다. 이어서, 농축 배양액을, 구멍직경의 최대부가 0.5μm이고 최소부가 0.2μm인 친수성 필터 (Opticap SHC XL600, Merck사)를 이용하여 여과하였다. 여과 후, 농축 배양액의 pH 및 도전율이 각각 7.0±0.3, 1.2±0.4S/m임을 확인하였다.
(정제 공정 2: 제1 크로마토그래피 공정 (어피니티 컬럼 크로마토그래피 공정))
Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific)을 충전한 QS 컬럼 (컬럼 체적: 4.2 내지 5.2L, 베드 높이: 15.0±1.5cm, Merck사)을, 컬럼 체적의 1배용의 50mM 글리신 염산 완충액 (pH3.0), 또한 컬럼 체적의 1배용의 0.01M 수산화 나트륨 수용액으로 세정한 후, 컬럼 체적의 4배용의 20mM Tris-HCl 완충액 (pH7.0)으로 평형화하였다. 이어서, 정제 공정 1에서 얻어진 농축 배양액의 1/4량을 컬럼에 부하하여, 22KhGH-mHSA를 컬럼에 흡착시켰다. 이어서, 컬럼 체적의 5배용의 200mM 아르기닌 및 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액 (pH7.0), 또한 컬럼 체적의 5배용의 20mM Tris-HCl 완충액 (pH7.0)으로 컬럼을 세정하였다. 이어서, 컬럼 체적의 5배용의 50mM 글리신 염산 완충액 (pH3.0)을 컬럼에 공급하여, 22KhGH-mHSA를 용출시켰다. 용출액은, 용출액량의 1/5 용량의 250mM MES 완충액 (pH7.0)을 미리 넣은 용기에 회수하여 pH가 6.7±0.3이 되도록 즉시 중화하였다. 정제 공정 2는 4 내지 8℃의 냉온 하에서 실시하고, 또한, 정제 공정 2의 전체를 통하여 컬럼에 공급되는 용액의 선 유속은 200cm/hour로 하였다. 또 1L의 어피니티 컬럼 담체당에 부하되는 22KhGH-mHSA의 상한은 7g으로 하였다.
(정제 공정 3: 바이러스 불활화 공정)
정제 공정 2에서 얻어진 용출액을 25℃로 가온하고, 이 용출액에, 그 액량의 1/19 용량의 20.0% (w/v) 폴리소르베이트 80을 함유하는 6.0% (v/v) 트리 (n-부틸)포스페이트 수용액을 가하여, 25℃에서 3시간 교반하였다.
(정제 공정 4: 제2 크로마토그래피 공정 (하이드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피 공정))
정제 공정 3에서 바이러스 불활화 처리를 행한 획분을 8℃로 냉각하고, 1M Tris-HCl 완충액 (pH8.8)과, 4M NaCl을 함유하는 20mM MES 완충액 (pH7.0)을 적량 첨가하여 pH 및 도전율을 각각 7.0±0.1 및 0.6±0.1S/m으로 조정하고, 구멍직경 0.2μm의 친수성 필터 (Merck사)를 이용하여 여과하였다. 이어서, 이하의 크로마토그래피를 냉장 (선 유속: 200cm/hour)에서 실시하였다.
하이드록시아파타이트 담체인 CHT Type II, 40μm (Bio-Rad Laboratories사)를 충전한 QS 컬럼 (컬럼 체적: 8.8 내지 10.8L, 베드 높이: 20.0±2.0cm, Merck사)을, 200mM 인산 완충액 (pH7.0), 이어서, 1M NaOH 수용액, 또한 200mM 인산 완충액 (pH7.0)으로 세정한 후, 4배용의 50mM NaCl 및 1mM 인산 이수소나트륨을 함유하는 20mM MES 완충액 (pH7.0)으로 평형화하였다. 이어서, 상기의 여과액을 컬럼에 부하하고 22KhGH-mHSA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 다음에, 3배용의 50mM NaCl 및 1mM 인산 이수소나트륨을 함유하는 20mM MES 완충액 (pH7.0)으로 컬럼을 세정하였다. 이어서, 50mM NaCl 및 30mM 인산 이수소나트륨을 함유하는 20mM MES 완충액 (pH7.0)을 컬럼에 공급하여 22KhGH-mHSA를 용출시켰다. 정제 공정 4는 4 내지 8℃의 냉온 하에서 실시하고, 또한, 정제 공정 4의 전체를 통하여 컬럼에 공급되는 용액의 선 속도는 200cm/hour로 하였다. 또한 1L의 하이드록시아파타이트 담체당에 부하되는 22KhGH-mHSA의 상한은 13g으로 하였다.
(정제 공정 5: 제3 크로마토그래피 공정 (멀티모달 약 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정))
정제 공정 4에서 얻어진 용출액에, 이것과 같은 체적의 50mM NaCl을 함유하는 20mM MES 완충액 (pH5.7)을 첨가한 후, 희염산을 첨가하여, pH 및 도전율을 각각 5.7±0.1, 0.7±0.1S/m로 조정하였다. 그 후, 구멍직경 0.5/0.2μm의 친수성 필터 (Merck사)를 사용하여 여과하였다.
프리 팩 컬럼 RTP Capto MMC 10L (컬럼 체적: 8.8 내지 10.8L, 베드 높이: 20.0±2.0cm, Merck사)을, 1M NaOH 수용액, 이어서 1M NaCl을 함유하는 50mM 인산 완충액 (pH7.0)을 이용하여 세정한 후, 4배용의 100mM NaCl을 함유하는 50mM MES 완충액 (pH5.7)으로 평형화하였다. 그 다음에 상기의 여과액을 컬럼에 부하하여 22KhGH-mHSA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 다음에, 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 50mM MES 완충액 (pH5.7)으로 컬럼을 세정하였다. 이어서, 550mM NaCl을 함유하는 50mM MES 완충액 (pH5.7)을 컬럼에 공급하여 22KhGH-mHSA을 용출시켰다. 정제 공정 5는 4 내지 8℃의 냉온 하에서 실시하고, 또한, 정제 공정 5의 전체를 통하여 컬럼에 공급되는 용액의 선 유속은 200cm/hour로 하였다. 또한 1L의 멀티모달 약 양이온 교환 담체당에 부하되는 22KhGH-mHSA의 상한은 11.5g으로 하였다.
(정제 공정 6: 농축 2 공정)
분획 분자량 30kDa의 한외 여과막 (Pellicon3 카세트 울트라셀 PLCTK 멤브레인 1.14m2, Merck사)에 순수를 통액하여 충분히 세정한 후, 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)으로 평형화하였다. 정제 공정 5에서 얻어진 용출액을, 이 한외 여과막을 이용하여 농축하였다. 농축 후의 용액에 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)을 첨가하여, 흡광도 (280nm)를 23±3으로 조정하였다. 이 농축 공정은 실온에서 실시하였다.
(정제 공정 7: 제4 크로마토그래피 공정 (사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 공정)
정제 공정 6에서 얻어진 농축액을 구멍직경 0.5/0.2μm의 친수성 필터 (Merck사)를 이용하여 여과하였다. 사이즈 배제 크로마토그래피용의 수지인 FractogelTM BioSEC 수지 (Merck사)를 충전한 QS 컬럼 (컬럼 체적: 25.4 내지 31.1L, 베드 높이: 40.0±4.0cm, Merck사)을 0.5M NaOH 수용액으로 세정한 후, 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)으로 평형화하였다. 이어서, 상기의 여과액을 컬럼에 부하하고, 이어서, 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)을 공급하였다. 이 때, 사이즈 배제 컬럼으로부터의 용출액의 유로에, 용출액의 흡광도를 연속적으로 측정하기 위한 흡광 광도계를 배치하여, 280nm의 흡광도를 모니터하고, 280nm로 흡수 피크를 나타낸 획분을, 22KhGH-mHSA를 포함하는 획분으로서 회수하고, 이것을 22KhGH-mHSA 정제품으로 하였다. 정제 공정 7은 실온 하에서 실시하고, 또한, 정제 공정 7의 전체를 통하여 컬럼에 공급되는 용액의 선 유속은 30cm/hour 이하로 하였다. 또한 멀티모달 약 양이온 교환 담체에 부하되는 22KhGH-mHSA를 함유하는 여과액의 액량은, 담체의 체적의 8% 이하로 하였다.
(정제 공정 8: 농축 3 공정)
중공사막 (ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge, 분획 분자량 30kDa, GE 헬스케어사)를, 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)으로 평형화하였다. 이 중공사막을 이용하여, 정제 공정 7에서 얻어진 22KhGH-mHSA 정제품을 농축하고, 22KhGH-mHSA의 농도를 85mg/mL로 조정하였다. 얻어진 농축액에, 그 액량의 1/29의 용량의 90mg/mL 폴록사머 188과 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)을 첨가하여 혼합하고, 구멍직경 0.5/0.2μm의 친수성 필터 (Merck사)를 이용하여 여과하였다. 이 농축 공정은 실온에서 실시하였다.
(정제 공정 9: 바이러스 제거 공정)
3mg/mL 폴록사머 188과 75mg/mL 수크로오스를 함유하는 10mM 인산 완충액 (pH7.2)를 제작하였다. 이 완충액을 이용하여, 바이러스 제거막 (프라노바 20N, 막 면적: 0.12m2, 재질: 재생 셀룰로오스, 아사히 카세이 메디컬사)을 평형화시켰다. 이 바이러스 제거막에, 압력 98kPa 이하에서, 정제 공정 8에서 얻어진 여과액을 통하여 여과하였다. 이 바이러스 제거 공정은 실온에서 실시하였다.
(정제 공정 10: 원약화 (原藥化) 공정)
실온에서, 정제 공정 9에서 얻어진 여과액을 구멍직경 0.2μm의 친수성 필터 (Merck사)로 여과하여, 22KhGH-mHSA 원약으로 하였다.
[실시예 7] 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 1
실시예 6에서 얻은 22KhGH-mHSA 원약을 이용하여, 15mg/mL 22KhGH-mHSA 및 20mM 인산 완충제를 함유하고, pH가 다른, 표 1에 표시되는 조성을 갖는 6종류의 수성 의약 조성물 (처방 1-1 내지 1-6)을 조제하였다.
상기 6종류의 수성 의약 조성물을 각각 1.5mL씩 유리제 바이알에 충전하고, 암소에서, 5℃에서 1주간, 또는 40℃에서 1주간 정치 보존하였다. 정치 후, 각 용액 중에 포함되는 22KhGH-mHSA의 단량체, 그 중합체, 및 그 분해물인 저분자체의 비율을, 실시예 13에 나타내는 SE-HPLC 분석에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 여기서, 암소에서 5℃에서 1주간, 및 40℃에서 1주간 정치 후의 용액에 포함되는 중합체 및 저분자체의 비율이, 어느 것도 대강 2% 이하인 것을, 안정한 수성 의약 조성물의 조건으로 미리 정하였다. 표 2의 결과는, 이 측정 조건 하에서는, 22KhGH-mHSA의 안정한 수성 의약 조성물을 얻기 위해서는, pH를 6.0 이상으로 하는 것이 바람직하고, 특히 pH를 6.5 내지 7.5로 하는 것이 바람직한 것을 나타낸다.
[실시예 8] 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 2
실시예 6에서 얻은 22KhGH-mHSA 원약을 사용하여, 15mg/mL 22KhGH-mHSA 및 20mM 인산 완충제를 함유하고, 수크로오스 및 염화 나트륨의 농도가 다른, 표 3에 표시되는 조성을 갖는 3종류의 수성 의약 조성물 (처방 2-1 내지 2-3)을 조제하엿다. 어느 용액도 pH는 7.0으로, 삼투압비는 약 1.0으로 조정하였다. 단백질 물성 해석 장치 (Optim1000, AVACTA사)를 이용하여, 큐벳 (UNi, UNCHAINED LABS사)에 측정 시료를 9μL 넣고, 20.0℃에서 96.0℃까지 1℃씩 큐벳을 가온하여, 각 온도에 대하여 파장 473nm에서의 정적 광산란 강도를 측정하였다.
정적 광산란 강도의 측정 결과의 그래프를 도 1에 나타낸다. 도 1에서 세로축이 정적 광산란 강도를 나타내고, 이 정적 광산란 강도와 용액 중에 포함되는 단백질이 응집됨으로써 생기는 미립자의 농도와의 사이에는 양의 상관 관계에 있다. 응집이 생기기 시작하는 온도는 처방 2-1 내지 2-3에서 거의 같지만, 온도를 상승시킴으로써 생기는 미립자의 양은, 염화 나트륨의 농도가 높을수록 많은 경향이 있다. 따라서, 용액 중에 포함되는 22KhGH-mHSA의 응집을 억제하기 위해서는, 수성 의약 조성물에 첨가하는 부형제로서 염화 나트륨보다도 수크로오스가 바람직하다고 할 수 있다.
[실시예 9] 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 3
실시예 6에서 얻은 22KhGH-mHSA 원약을 사용하여, 35mg/mL 22KhGH-mHSA, 20mM 인산 완충제, 및 70mg/mL 수크로오스를 함유하고, 비이온성 계면 활성제 (폴록사머 188)의 농도가 다른, 표 4에 나타난 조성을 갖는 6종류의 수성 의약 조성물 (처방 3-1 내지 3-6)을 조제하였다. 어느 용액도 pH는 7.2로, 삼투압비는 약 1.0으로 조정하였다.
상기 6종류의 수성 의약 조성물을 각각 1mL씩 유리제 바이알에 충전하고, 실온 환경 하에서 240왕복/분으로 24시간 진탕하였다. 진탕 전 및 진탕 후에서의 각 용액 중에 포함되는 22KhGH-mHSA 전체에서 차지하는 중합체의 비율을, 실시예 13에 나타내는 SE-HPLC 분석에 의해 측정하고, 진탕 후의 중합체 함량 (%)으로부터 진탕 전의 중합체 함량 (%)을 뺀 값을 중합체 증가량 (%)으로서 구하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 이 조건 하에서는, 폴록사머 188의 농도를 1.0mg/mL 이상으로 함으로써 중합체의 생성을 억제할 수 있고, 그 농도를 1.5mg/mL 이상으로 함으로써 중합체의 생성을 거의 억제할 수 있다. 또한, 폴록사머 188을 포함하지 않는 처방 3-1에서는, 중합체가 다량으로 생성하였기 때문에 측정값을 얻을 수 없었다.
그 다음에, 22KhGH-mHSA의 농도를 130mg/mL로 하여, 20mM 인산 완충제 및 70mg/mL 수크로오스를 함유하고, 비이온성 계면 활성제 (폴록사머 188)의 농도가 다른, 표 6에 표시되는 조성을 갖는 5종류의 수성 의약 조성물 (처방 4-1 내지 4-5)을 조제하였다. 어느 용액도 pH는 7.2로, 삼투압비는 약 1.0으로 조정하였다.
상기 5종류의 수성 의약 조성물을 각각 0.8mL씩 유리제 바이알에 충전하고, 실온 환경 하에서 240왕복/분으로 24시간 진탕하였다. 진탕 후, 각 용액 중에 포함되는 22KhGH-mHSA 전체에서 차지하는 중합체 및 저분자체의 비율을, 실시예 13에 나타내는 SE-HPLC 분석에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 처방 4-1 내지 4-5의 어디에서도, 중합체 함량 (%) 및 저분자체 함량 (%)의 값은, 진탕 전의 값과 거의 변화는 없고 (진탕 전의 데이터는 나타내지 않는다), 중합체 함량 (%) 및 저분자체 함량 (%)의 값은, 모든 처방에서 동등하다.
[실시예 10] 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 4
실시예 6에서 얻은 22KhGH-mHSA 원약을 사용하여, 35mg/mL 22KhGH-mHSA, 20mM 인산 완충제, 70mg/mL 수크로오스, 1.0mg/mL 비이온성 계면 활성제 (폴록사머 188) 및 방부제로서 3.3mg/mL 페놀을 함유하는, 표 8에 표시되는 조성을 갖는, pH가 다른 3종류의 수성 의약 조성물 (처방 5-1 내지 5-3)을 조제하였다.
상기 3종류의 수성 의약 조성물을 각각 1mL씩 유리제 바이알에 충전하고, 암소에서 5℃ 또는 25℃에서 2개월 정치 보존하였다. 5℃에서 정치한 것에 대해서는, 2주간 후, 1개월 후 및 2개월 후에, 25℃에서 정치한 것에 대해서는 1개월 후 및 2개월 후에, 실시예 13에 기재된 SE-HPLC 분석, 및 실시예 15에 기재된 미립자 수 분석을 행하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
SE-HPLC 측정에 의한 중합체 함량에 대하여 보면, pH7.2로 조정한 처방 5-3에서는 5℃에서 1개월간 정치한 경우, 25℃에서 2개월간 정지한 경우의 어느쪽에서도 거의 변화는 없다. 한편, pH6.2로 조정한 처방 5-1에서는, 5℃에서 1개월간 정치한 경우, 25℃에서 2개월간 정치한 경우의 어느쪽에서도 중합체의 함량의 계시적 (繼時的)인 증가가 관찰된다. 또한, pH6.7로 조정한 처방 5-2에서는, 5℃에서 1개월간 정치한 경우에는, 중합체의 함량에 변화는 없지만, 25℃에서 2개월간 정지한 경우에는 중합체의 계시적인 증가가 관찰된다. SE-HPLC 측정에 의한 저분자체 함량에 대하여 보면, 5℃에서 1개월간 정치한 경우에는, 처방 5-1 내지 5-3의 어느 쪽에서도 거의 변화는 없다. 한편, 25℃에서 2개월간 정치한 경우에는, 어느 처방에서도 저분자체 함량의 증가가 관찰되지만, 그 정도는 경미하다. 미립자수 분석에 대하여 보면, pH7.2로 조정한 처방 5-3에서는, 10μm 이상 및 25μm 이상의 미립자수가, 처방 5-1 및 5-2와 비교하여 대폭으로 감소하고 있다.
[실시예 11] 수성 의약 조성물의 제제 설계
상기 실시예 7 내지 10에서 나타낸 결과로부터, 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 제제 처방의 적합한 것의 일예로서, 50mg/mL 22KhGH-mHSA, 10mM인산 완충제, 75mg/mL 수크로오스, 3mg/mL 폴록사머 188 및 6mg/mL 페놀을 함유하고, pH를 7.2, 삼투압비를 약 1.0으로 조정한, 표 10에 표시되는 조성을 갖는 것 (처방 6)을 설계할 수 있다. 이 수성 의약 조성물은, 0.5 내지 10mL의 액량으로, 유리제 또는 플라스틱제의 바이알, 앰플, 또는 주사기에 충전·봉입할 수 있다. 주사기에 미리 충전한 것은 프리필드형의 제제로서 공급할 수도 있다. 보존 온도는 2 내지 10℃, 예를 들어, 4℃가 바람직하고, 온도 기록이 가능한 냉장고 중에서 보존이 상정된다.
[실시예 12] 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물의 안정성의 검토 5
표 10에 표시되는 조성을 갖는, 처방 6의 수성 의약 조성물을 조제하고, 붕규산 유리제 카트리지에 1.7mL를 충전하고, 암소, 5℃에서 12개월 정치 보존하였다. 3개월 후, 6개월 후, 및 12개월 후에 실시예 14에 기재된 성상 시험, 실시예 16에 기재된 불용성 이물 검사 및 pH 측정, 실시예 13에 기재된 SE-HPLC 분석, 실시예 15에 기재된 미립자수 분석, 및 실시예 17에 기재된 22KhGH-mHSA 정량을 행하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 어느 검사값에도 큰 변화는 없고, 처방 6은 22KhGH-mHSA를 함유하는 수성 의약 조성물로서 적어도 12개월간은 안정된 것을 알 수 있다. 또한, 표 11 중, 정량법 (대비이론값 (%))은, 처방 6을 조제시의 22KhGH-mHSA의 양을 100%로 했을 때의, 실제의 정량값 (%)을 나타낸다.
[실시예 13] SE-HPLC 분석 (SE-HPLC를 이용한 22KhGH-mHSA의 중합체, 단량체 및 저분자체 함량의 측정)
인산 이수소나트륨 2수화물 및 염화 나트륨을 물에 용해하고, 인산을 0.1M, 염화 나트륨을 0.2M 함유하는 인산염 완충 용액을 조제하였다. 또한, 시험 대상인 각각의 수성 의약 조성물과 같은 조성이고, 또한 22KhGH-mHSA 및 페놀을 포함하지 않는 용액을 조제하고, 이것을 시료 희석액으로 하였다.
시험의 대상인 수성 의약 조성물을, 시료 희석액을 이용하여 단백질 농도가 2.0mg/mL가 되도록 조정하여, 시료 용액으로 하였다.
HPLC 장치 (LC-20A, 시마즈 세사쿠쇼사) 및 컬럼 (TSKgel G3000SWXL, 토소사)을 이용하여, 하기의 표 12에 나타내는 조건에서 측정을 행하였다. 단, 유량에 대해서는 반드시 표 12에 나타낸 조건에 한정되지 않고, 주피크의 유지 시간이 12분 부근이 되도록 적절히 조정하였다. 대표적인 크로마토그램을 도 2에 나타낸다. 시료 용액의 측정에 의해 얻어진 크로마토그램 위, 유지 시간 12분 부근에 검출되는 주피크를 단량체, 주피크보다 앞에 검출되는 피크를 중합체, 주피크보다 뒤에 검출되는 피크를 저분자체로 하고, 각 피크의 면적으로부터 주피크 함량 (%), 중합체 함량 (%), 저분자체 함량 (%)을 산출하였다. 또한, 23.5분 부근에 검출되는 피크는 페놀 유래이기 때문에, 해석에서 제외하였다. 또한, 시료 희석액의 측정에 의해 얻어진 크로마토그램 위에 검출된 피크와 같은 피크에 대해서도, 시료 용액의 해석으로부터 제외하였다.
[실시예 14] 성상 시험
색의 비교액으로서, 하기를 사용하였다.
(1) Color Reference Solutions B 세트 (갈색, 시그마 알드리치사)
(2) Color Reference Solutions BY 세트 (대갈황색, 시그마 알드리치사)
(3) Color Reference Solutions Y 세트 (황색, 시그마 알드리치사)
시험의 대상인 수성 의약 조성물이 든 용기 (바이알 등)를, 흑색 및 백색의 배경을 이용하여 용기 측면에서 관찰하여, 색조 및 명징성을 확인하였다. 색조의 판단에 있어서는, 색의 비교액을 사용해도 좋은 것으로 하였다.
[실시예 15] 미립자수의 측정
측정 조건: 플로우 사이트 입자 화상 해석 장치 (FlowCam VS-1, FLUID IMAGING TECHNOLOGIES사)를 이용하여, 하기의 표 13에 나타내는 조건으로 측정을 행하였다. 플로 셀 (FC80FV-5, FLUID IMAGING TECHNOLOGIES사)을 사용하여, 시험 의 대상인 수성 의약 조성물에 포함되는 미립자수 (개/mL)를 실시하였다. 미립자수는, 10μm 이상 및 25μm 이상의 직경을 갖는 것의 개수를 각각 측정하였다.
[실시예 16] 불용성 이물 검사, pH의 측정, 및 삼투압비 측정의 방법
불용성 이물 검사, pH의 측정, 및 삼투압비 측정에 대해서는, 일본 약국방에서 정하는 일반적 수법에 의해 실시하였다. 또한, 불용성 이물 검사는, 용이하게 검출되는 불용성 이물의 유무를 육안으로 확인하는 검사법이다.
[실시예 17] 22KhGH-mHSA의 정량 (Bradford법)
농도 기지의 22KhGH-mHSA 용액을 물로 희석하고, 22KhGH-mHSA를 각각 1.0, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2mg/mL 함유하는 용액을 조제하고, 각각 표준 용액 1 내지 5로 하였다. 시험의 대상인 수성 의약 조성물을, 단백질 농도가 0.4 내지 0.8mg/mL의 범위에 들어가도록 물로 희석하여, 시료 용액으로 하였다.
쿠마시 시액에 의한 반응: PierceTM Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC사)에 포함되는 Pierce Coomasie Assay Reagent를, 15mL 원심관에 5mL씩, 측정에 필요한 본수 만큼 채취하였다. 이어서, Pierce Coomasie Assay Reagent를 채취한 15mL 원심관에 각각 물 (블랭크용), 표준 용액 1 내지 5, 및 시료 용액을 100μL씩 첨가하고, 전도 혼화한 후 10분간, 실온에서 정치하여 반응시켰다. 반응 후 신속하게, 분광 광도계 (UV-2600, 시마즈 세사쿠쇼사)를 이용하여, 측정용 셀 (큐벳, 광로 길이 10mm, 광로 폭 10mm, 자르스타트사)에 측정 시료를 2mL 이상 넣어 파장 595nm로 흡광도 측정을 행하였다. 표준 용액 1 내지 5의 흡광도를 Y축, 이론 단백질 농도를 X축에 취하고, 회귀 직선 (검량선)을 작성하여, 시료 용액의 흡광도로부터 단백질 농도를 산출하였다.
본 발명에 의하면, 혈청 알부민과 성장 호르몬이 연결된 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약을, 수성 의약 조성물의 형태로, 시장에 유통시킬 수 있다.
[서열표 프리텍스트]
서열번호 1: 야생형의 사람 혈청 알부민의 아미노산 서열
서열번호 2: 사람 혈청 알부민 Redhill의 아미노산 서열
서열번호 3: 사람 혈청 알부민 변이체 (A320T)의 아미노산 서열
서열번호 4: 링커의 아미노산 서열의 예 1
서열번호 5: 링커의 아미노산 서열의 예 2
서열번호 6: 링커의 아미노산 서열의 예 3
서열번호 7: 야생형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위의 부분 염기 서열
서열번호 8: 변이형 마우스 뇌심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 결합 부위의 부분 염기 서열, 합성
서열번호 9: 22K 사람 성장 호르몬의 아미노산 서열
서열번호 10: 20K 사람 성장 호르몬의 아미노산 서열
서열번호 11: 22KhGH-mHSA의 아미노산 서열
서열번호 12: 20KhGH-mHSA의 아미노산 서열
서열번호 13: 프라이머 YA082, 합성 서열
서열번호 14: 프라이머 YA083, 합성 서열
서열번호 15: 22KhGH-HSA의 아미노산 서열
서열번호 16: 22KhGH-HSA 유전자를 포함하는 염기 서열, 합성 서열
[서열표]
1226JP_ST25_TXT
<110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd.
<120> Pharmaceutical Preparation Containing Fusion Proteins of Human Serum Albumin and Human Growth Hormone
<130> 1226JP
<150> P2019-197978
<151> 2019-10-30
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<212> PRT
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1 5 10 15
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<213> Homo sapiens
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Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Amino acid sequence of human serum albumin mutant (A320T)
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Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Thr
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Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
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<213> Artificial Sequence
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<223> Amino acid sequence of an exemplified linker 2
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of an exemplified linker 3
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<211> 23
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<213> Murine encephalomyocardinitis virus
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Partial nucleotide sequence of IRES from mutant type murine
encephalomyocardinitis virus
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
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Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn
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Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 22KhGH-mHSA
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Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
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Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
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Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
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Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
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Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
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<220>
<223> Amino acid sequence of 20KhGH-mHSA
<400> 12
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Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
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Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
260 265 270
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
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Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
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340 345 350
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
355 360 365
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515 520 525
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
530 535 540
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
545 550 555 560
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
565 570 575
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
580 585 590
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
595 600 605
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
610 615 620
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
625 630 635 640
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
645 650 655
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
660 665 670
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
675 680 685
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
690 695 700
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
705 710 715 720
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
725 730 735
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
740 745 750
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
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Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
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100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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385 390 395 400
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420 425 430
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450 455 460
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
515 520 525
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530 535 540
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
595 600 605
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
610 615 620
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
675 680 685
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
690 695 700
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
705 710 715 720
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
725 730 735
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
740 745 750
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
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Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence containing 22KhGH-HSA gene, synthetic sequence
<400> 16
acgcgtcacc atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg 60
cctgccctgg cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga 120
caacgctatg ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt 180
tgaagaagcc tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc 240
cctctgtttc tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc 300
caacctagag ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca 360
gttcctcagg agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta 420
tgacctccta aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg 480
cagcccccgg actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca 540
caacgatgac gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga 600
caaggtcgag acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt 660
cgatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa 720
agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt 780
aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga 840
aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct 900
tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga 960
atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt 1020
tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata 1080
tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa ctccttttct ttgctaaaag 1140
gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc 1200
aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg 1260
tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag 1320
ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacag atcttaccaa 1380
agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct 1440
tgccaagtat atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga 1500
aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc 1560
tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc 1620
tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa tatgcaagaa ggcatcctga 1680
ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg 1740
ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct 1800
tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga 1860
gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac 1920
tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat gttgtaaaca 1980
tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtggtcc tgaaccagtt 2040
atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc 2100
cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa 2160
agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga 2220
gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagctcgtg aaacacaagc ccaaggcaac 2280
aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctgcaa 2340
ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgttg ctgcaagtca 2400
agctgcctta ggcttataag cggccgc 2427
Claims (19)
- 사람 혈청 알부민과 사람 성장 호르몬의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어진 수성 의약 조성물로서, 상기 융합 단백질의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 수크로오스의 농도가 10 내지 150mg/mL이며, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.15 내지 10mg/mL이고, 방부제의 농도가 0.5 내지 12mg/mL이며, 완충제의 농도가 1 내지 30mM이고, pH가 5.0 내지 8.0인, 수성 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 농도가 15 내지 70mg/mL인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수크로오스의 농도가 50 내지 100mg/mL인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제의 농도가 1.5 내지 4.5mg/mL인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방부제가 페놀인, 수성 의약 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 페놀의 농도가 3 내지 9mg/mL인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제가 인산 완충제인, 수성 의약 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 인산 완충제의 농도가 2 내지 20mM인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH가 6.0 내지 7.8인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH가 6.5 내지 7.6인, 수성 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 농도가 10 내지 100mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160)폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이며, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 수성 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 농도가 15 내지 70mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160)폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 수성 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 농도가 50mg/mL이고, 상기 수크로오스의 농도가 75mg/mL이며, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜로서, 상기 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜의 농도가 3mg/mL이고, 상기 방부제가 페놀로서, 상기 페놀의 농도가 6mg/mL이고, 상기 완충제가 인산 완충제로서, 상기 인산 완충제의 농도가 10mM이고, 상기 pH가 7.0 내지 7.4인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 것인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 것인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 것인, 수성 의약 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 수성 의약 조성물.
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