PT1831252E - Formulações de proteínas de fusão de análogos de glp-1 - Google Patents
Formulações de proteínas de fusão de análogos de glp-1 Download PDFInfo
- Publication number
- PT1831252E PT1831252E PT05854150T PT05854150T PT1831252E PT 1831252 E PT1831252 E PT 1831252E PT 05854150 T PT05854150 T PT 05854150T PT 05854150 T PT05854150 T PT 05854150T PT 1831252 E PT1831252 E PT 1831252E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- glu
- gly
- lys
- ser
- glp
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
ΡΕ1831252 1
DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE ANÁLOGOS DE GLP-1"
CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado com formulações de análogos peptidicos do tipo glucagon fundidos com proteínas que têm o efeito de estabilizar as proteínas de fusão. Estas formulações podem ser usadas para tratar diabetes, assim como uma variedade de outras condições ou perturbações.
FUNDAMENTO DO INVENTO
Análogos e derivados de péptido tipo glucagon-1 (GLP-1) são promissores em ensaios clínicos para o tratamento de diabetes tipo 2. GLP-1 induz numerosos efeitos biológicos, tais como estimulação da secreção de insulina, inibição da secreção de glucagon, inibição do esvaziamento gástrico, inibição da mobilidade gástrica ou da mobilidade intestinal e indução da perda de peso. Uma característica importante de GLP-1 é a sua capacidade para estimular a secreção de insulina sem o risco associado de hipoglicemia que é observada quando se usa terapia com insulina ou alguns tipos de terapias orais que actuam através do aumento da expressão de insulina. 2 ΡΕ1831252 A utilidade da terapia que envolve os péptidos GLP-1 tem sido limitada pelo facto de GLP-l(l-37) ser pouco activa e os dois péptidos truncados naturais, GLP-1(7-37)OH e GLP-1(7-36)NH2, são rapidamente eliminados in vivo e possuem semi-vidas in vivo extremamente curtas. É conhecido que a dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV), produzida endogenamente, inactiva os péptidos GLP-1 circulantes através da remoção dos residuos histidina e alanina N-terminais e é uma justificação importante para a curta semi-vida in vivo. Têm sido desenvolvidas várias abordagens para prolongar a semi-vida de eliminação de um péptido GLP-1 ou reduzir a eliminação do péptido do corpo, mantendo ao mesmo tempo a actividade biológica. Uma abordagem envolve a fusão do péptido GLP-1 com o fragmento Fc de uma imunoglobulina. As imunoglobulinas tipicamente possuem semi-vidas de circulação in vivo longas.
Por exemplo, as moléculas de IgG podem ter uma semi-vida no Homem até 23 dias. A fracção Fc da imunoglobulina é responsável, em parte, por esta estabilidade in vivo. As proteínas de fusão GLP-l-Fc tiram partido da estabilidade proporcionada pela fracção Fc de uma imunoglobulina, ao mesmo tempo que preservam a actividade biológica da molécula GPL-1. 3 ΡΕ1831252
Ainda que esta abordagem seja plausível para fármacos de GLP-1 (Ver WO 02/46227), existe uma preocupação geral relativamente à antigenicidade de várias proteínas de fusão quando administradas repetidamente durante períodos de tempo prolongados. Isto é especialmente uma preocupação para os fármacos da fusão GLP-l-Fc uma vez que um doente com diabetes deve ser tratado durante o resto da vida uma vez diagnosticada a doença. Ainda, a proteína de fusão com Fc pode ser uma preocupação se a fracção Fc mantiver funções efectoras indesejáveis. Esta abordagem é o foco de PCT/US 04/15595 (W02005/000892), em que os problemas associados à potencial imunogenicidade e actividade efectora associadas à administração das fusões GLP-l-Fc são ultrapassados através da identificação de proteínas de fusão GLP-l-Fc específicas que possuam um risco reduzido da indução de uma resposta imune após administração repetida e prolongada e sem terem função efectora.
As proteínas de fusão desta natureza são tecnicamente muito grandes e complexas para serem produzidas sinteticamente ou pela via recombinante em células bacterianas. Estas proteínas de fusão são tipicamente produzidas em células de mamífero, tais como CHO, 293 ou NSO. Foi observado que as proteínas de fusão produzidas em células de mamífero são mais facilmente susceptíveis à degradação por proteases endógenas e alteração química do que as proteínas que não sejam de fusão produzidas em células bacterianas. Pensa-se que este problema esteja 4 ΡΕ1831252 ultrapassado no presente invento. Descobriu-se que uma formulação compreendendo uma fusão GLP-l-Fc tamponada entre aproximadamente pH e aproximadamente pH 8,5 proporciona uma maior estabilidade química.
SUMÁRIO DO INVENTO
Para ultrapassar o problema da estabilidade química das fusões GLP-l-Fc, os presentes inventores desenvolveram uma formulação de solução estável. Em particular, os inventores descobriram que uma formulação compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma fusão GLP-l-Fc a um pH entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 8,5, de preferência entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 7,5, entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 7, entre aproximadamente pH 6,5 e aproximadamente pH 7,5, ou entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 6,5 e mesmo mais de preferência, entre pH 6 e aproximadamente pH 6,5, proporciona estabilidade química inesperadamente e consideravelmente superior comparativamente com as fusões GLP-l-Fc a um pH fora das gamas descritas. A presente descrição inclui métodos de tratamento de doentes que sofram de diabetes mellitus não dependentes e dependentes de insulina, obesidade e várias outras perturbações e condições compreendendo a administração das formulações das fusões de GLP-l-Fc. 5 ΡΕ1831252
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
As proteínas de fusão compreendem um composto GLP-1 fundido com uma fracção Fc de uma imunoglobulina, um análogo de uma fracção Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento de uma fracção Fc de uma imunoglobulina. 0 extremo C do composto GLP-1 pode ser fundido directamente, ou fundido através de um elemento de ligação peptídico, ao extremo N de uma proteína de fusão com Fc. Estas proteínas de fusão são biologicamente activas e possuem uma semi-vida aumentada comparativamente com GLP-1 nativa. Os compostos GLP-1 que constituem parte da proteína de fusão incluem polipéptidos tendo entre cerca de vinte cinco e cerca de trinta e nove aminoácidos naturais ou não naturais que possuem homologia suficiente com GLP-1(7-37)OH nativa, de forma que apresentam actividade insulinotrópica através da ligação ao receptor GLP-1 das células β do pâncreas. Um composto GLP-1 tipicamente compreende um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de GLP-1(7-37)OH, um análogo de GLP-1(7-37)OH, um fragmento de GLP-1(7-37)OH ou um fragmento de um análogo de GLP-1(7-37)OH.
Exemplos de proteínas de fusão úteis nas formulações incluem proteínas de fusão compreendendo um análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em 6 ΡΕ1831252 a) (SEQ ID NO:1)
HiS'Xaôg-GÍtt-Gly*Thr“PSbe‘Tlír-Ser“As|>»V»USer’Scf-Tyf'L«»“OI»-'Gt«’ GJn-AI^AIa^LysOI^^-lte-Ata-T^Leu-VaJ-Lys-Gty-Gly-Cly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; b) (SEQ ID NO:2) Hís-Xâ^<íl«4jIy-':llM-#heorbr-Ser-:A^A^KSer-$er--Tyr--L««;-'GlH'Gíu- G!n-AÍa-AÍ8-i.ys->Glo*I%e*lle*Âla*Típ‘Leu*Lys*Asi3*<31y-Giy'<íly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; c) (SEQ ID NO:3)
His-Xâi8-Glii>Gíy-1ltr‘-Pifô“I^r>Ser-A$p'Val>Ser-Scr-Tyr*Lea-G1u-Gly·'
Glfi-Aía-Aís-Lys-Gíii-Phff-Uc^AIa-Trp-Lca-Vai-Ly^-Giy-Giy*^ em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; d) (SEQ ID NO:4)
His-XsârGiu ‘Gly-Thr^l^tt-Tíw-Ser-A^V ai -Ser“Se?»Tyr*Le« -€31 b*G lw* Gin- A1»*A lá- Ly.s-G!u-Phe-ífç-Á I a-T jp-Leu-Lys^AsB-Gly-Gly-í^ em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; e) (SEQ ID NO:5)
His-Xasg-Gia-Giy-Thr-Phe-Thr-SeF-Âsp-Val^Ser-Ser-Tyr-Leíii-Gíu-Gja''
Qn-Ajs-Ala-Lys»Gl«*Pfee>{le»A]a-Típ*LÈU^Valv.Lys«Gly»G!y 7 ΡΕ1831252 em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; f) (SEQ ID NO:6) HíS»XaarGluOíy*Tbr»Pbe*Thr-Sèf*As-p«-Val-Stt*Ser*Tyr-.Leu*G}u-Glu·' Gln-AIa-Ala^jLys-GItt^B-n^Aiâ-Tfp-L^i-Lys-Asn-Giy-Gíy -em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; fundida com a fracção Fc de uma imunoglobulina compre endendo a sequência de SEQ ID NO:7
Al»*Gl»'Ser-LyS''Tyr“Gíy-Pm»F^r»*Cys.-Pfo«Fro*CjfS'PrO''Alf'PrO“ XMjé-Xaat^Xaató-GJy-CíJy-PfQ^Scr^Vâí-Phe^Leu-l^evpFo^PK^Lys-FFo
Lys».Aip'Tiff*lJeu-·M«^líe*Seι-Ar¾’Tli^l,m-<3iβ·'V^*T1ιf<:ysμVâl:- V85-Vâl-Asp-Vsl-Sef«Glíi*Glii«A8.p»iPit)<-Giu-VaJ-Gln-I%e-Á$»Tip‘ 'T3ff“VaI"Asp*Cl5?-ValOíti«Vai*HiS‘Asa»Alâ»L^Tbr‘l<yS'líí«>*Arg-
GiuOlu^Gln-Phe^Xaâ^Ser-Thr-Tyr^Afg-VâJ-Vai-Ser-Val-Lev-llir·' Vâ!4^u-His<Hii-Asp-T^'iei!'^^^“Gíy*LyS‘0ÍS'Tyr“LyS''CyS''LyS‘· ¥al - Ser-ÂsB-Lys-òly-íve íí-Fre-Sêr “Ser-Ue*GliS'Ly s “Tiir-Ile-Seb ί3?8*Αΐ3^&'*Οΐ3Ρ-01«“Ι^·ο·"Α^-<3ΐΒ-ΡΓθ-ΟΙ«*ν«ί*Τ^Γ'·ΤΐΜΤ»Ί»βΒ“Ρκ)' .Pro~S«^GÍii*GJo4jlU“Mei“TlirjLp-AsO'GkA^bSer4^y“Tíií-*Cp’· l^a-Val-iys^Oly^Pbft-TybPm^etA^^Ileaia^Vsi^Glis^Ttp-Giy- Sér-Asa*Gly-din-Pp©‘GlB“A«B-Asn*T>Y-l.ys«Thir*Thr«Ff0'í*R)‘V8l- ^«^^^^^^‘^♦Plie-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Tlír-V^»
Asp-Ly®-$ef“A:í'g-Tfp''Oíft43ÍU“G;iy-AsnA%NPbe-.Ser-Gys-Sef-VãÍ" Μδί·Ηιί*03ΗΆΐ3»ΐΛα-Ηίδ-Α®ϊ-Ηίδ-Τ}?ί«·ηΐΓ^ιί8-.^”δθΓ-Ιβ»*8βΓ' U»-$cr»U»-Gly-Xaaí3s (SEQ E> NO:?) em que: ΡΕ1831252
Xaa na posição 16 é Pro ou Glu;
Xaa na posição 17 é Phe, Vai ou Ala;
Xaa na posição 18 é Leu, Glu ou Ala;
Xaa na posição 80 é Asn ou Ala; e
Xaa na posição 230 é Lys ou está ausente. 0 extremo C da fracção de análogo GLP-1 e o extremo N da fracção Fc das proteínas de fusão são, de preferência, fundidos um com o outro através de 1, 1,5 ou 2 repetições de um elemento de ligação peptídico rico em G tendo a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8).
As proteínas de fusão úteis nas formulações do presente invento compreendem uma fracção do análogo GLP-1 e uma fracção Fc. A fracção do análogo GLP-1 e a fracção Fc compreendem substituições na sequência GLP-1 nativa e na sequência lgG4 humana, respectivamente, que proporcionam à proteína maior potência e estabilidade in vivo comparativamente com GLP-1 nativa ou análogos de GLP-1 não fundidos com uma sequência Fc, ao mesmo tempo baixando o potencial de indução de formação de anticorpos após administração prolongada e repetida no Homem. GLP-1 nativa é processada in vivo, de forma que os primeiros 6 aminoácidos são clivados da molécula. Assim, como descrito na literatura, ao extremo amina de GLP-1 foi atribuído o número 7 e ao extremo carboxilo o número 37. Os outros aminoácidos no polipéptido são numerados consecu- 9 ΡΕ1831252 tivamente como se mostra em SEQ ID NO:9. Por exemplo, a posição é alanina e a posição 22 é glicina. 0 péptido processado pode ainda ser modificado de forma que o resíduo glicina C-terminal seja removido e substituído com um grupo amida. Assim, GPL-1(7-37)OH e GLP-1(7-36)amida representam as duas formas nativas da molécula. GLP-1(7-37)OH tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9:
Gia-Aja-^AIa^Lys^Glu-Fbe-lie^AlfrTíp-Leu-Val^Lys^CJy-Aif-^Gíly (SBQ IDNO:9) A fracção do análogo GLP-1 da proteína de fusão compreende três substituições primárias nas posições 8, 22 e 36 relativamente a GLP-1(7-37) nativa. A substituição na posição 8 reduz a velocidade a que a enzima endógena dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) inactiva o análogo. DPP-IV cliva GLP-1 nativa entre o 2o e o 3o aminoácido (entre a posição 8 e 9) e a molécula resultante é menos activa. Assim, a proteína de fusão útil nas formulações do presente invento são resistentes a DPP-IV. A substituição na posição 22 reduz o potencial da molécula para agregar e aumenta a potência da molécula. A substituição na posição 36 no contexto do análogo com alterações em 8 e 22, assim como no contexto da proteína de fusão completa, reduz o risco de que a proteína de fusão induza uma resposta imune neutralizante após administração repetida e prolongada no
Homem. 10 ΡΕ1831252 O extremo C do análogo GLP-1 é, de preferência, uma das seguintes sequências: Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:10); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:ll); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:12); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:13); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-(SEQ ID NO:14); e Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:15).
As proteínas de fusão úteis nas formulações do presente invento possuem uma fracção Fc que deriva de IgG4 humana, mas compreende uma ou mais substituições comparativamente com a sequência humana selvagem. Como aqui é usado, a fracção Fc de uma imunoglobulina tem o significado normalmente atribuído ao termo na área da imunologia. Especificamente, este termo refere-se a um fragmento de anticorpo que não possui as duas regiões de ligação ao antigénio (os fragmentos Fab) do anticorpo. A fracção Fc consiste na região constante de um anticorpo derivada de ambas as cadeias pesadas, as quais se associam através de interacções não covalentes e ligações dissulfureto. A porção Fc pode incluir as regiões de charneira e prolonga-se através dos domínios CH2 e CH3 do extremo C do anticorpo. A fracção Fc pode ainda incluir um ou mais locais de glicosilação.
Existem cinco tipos de imunoglobulinas humanas com diferentes funções efectoras e propriedades farmaco-cinéticas. igG é o mais estável dos cinco tipos, tendo uma semi-vida sérica no Homem de aproximadamente 23 dias. Existem quatro subclasses de imunoglobulinas (Gl, G2, G3 e 11 ΡΕ1831252 G4), cada uma das quais possui diferentes funções biológicas conhecidas como funções efectoras. Estas funções efectoras são de um modo geral mediadas através da interacção com o receptor Fc (FcyR) ou através da ligação Clq e fixação do complemento. A ligação de FcyR pode conduzir a citólise mediada por células e dependente de anticorpos, enquanto que a ligação a factores do complemento pode conduzir à lise celular mediada pelo complemento. Ao desenharem-se as proteínas de fusão Fc em que a fracção Fc é utilizada apenas pela sua capacidade para prolongar a semi-vida, é importante minimizar qualquer função efectora. Assim, as proteínas de fusão úteis nas formulações do presente invento derivam da região Fc de IgG4 humana devido à sua capacidade reduzida para se ligar a FcyR e a factores do complemento quando comparado com outros subtipos de IgG. IgG4, no entanto, elimina células alvo no Homem [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 106:427-433]. Devido às proteínas de fusão terem como alvo as células beta do pâncreas para induzir a expressão de insulina, usando uma região derivada de lgG4 numa proteína de fusão com Fc poderá iniciar-se uma resposta imune contra as células beta pancreáticas através da interacção da proteína de fusão com o receptor GLP-1 presente nas células beta pancreáticas. Assim, a região Fc de IgG4 que é parte das proteínas de fusão possui substituições que eliminam a função efectora. A fracção Fc de IgG4 das proteínas de fusão pode conter uma ou mais substituições: substituição de glutamato por prolina no resíduo 233, fenilalanina por alanina ou valina no resíduo 234 e leucina por alanina ou 12 ΡΕ1831252 glutamato no resíduo 235 (numeração EU, Kabat, E.A. et al.r (1991) Sequences of proteins of immunologicâl interest, 5a Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication n° 91-3242). Estes resíduos correspondem às posições 16, 17 e 18 em SEQ ID NO: 7. Ainda, a remoção do local de glicosilação ligado em N na região Fc de IgG4 através da substituição de Asn por Ala no resíduo 297 (numeração EU), que corresponde à posição 80 de SEQ ID NO: 7, é uma outra forma de assegurar que a actividade efectora residual está eliminada no contexto da proteína de fusão.
Ainda, a fracção Fc de IgG4 das proteínas de fusão possui uma substituição que estabiliza o dímero da cadeia pesada e evita a formação de meias cadeias Fc de IgG4. As proteínas de fusão preferencialmente existem como dímeros ligados por ligações dissulfureto e várias interacções não covalentes. lgG4 selvagem possui um motivo Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEQ ID NO:16) que começa no resíduo 224 (numeração EU) . Este motivo numa única cadeia de análogo GLP-l-Fc forma ligações dissulfureto com o motivo correspondente de uma cadeia de análogo GLP-l-Fc. No entanto, a presença de serina no motivo causa a formação de proteínas de fusão de cadeia simples. O presente invento inclui proteínas de fusão Fc em que a sequência IgG4 é ainda modificada de forma que serina na posição 228 (numeração EU) é substituída com prolina (resíduo de aminoácido 11 em SEQ ID NO:7). 13 ΡΕ1831252 0 resíduo lisina C-terminal presente na molécula nativa pode ser removido na fracção Fc derivada de lgG4 das proteínas de fusão aqui discutidas (posição 230 de SEQ ID NO: 7; lisina eliminada referida como des-K). As proteínas de fusão expressas nalguns tipos de células (tais como células NSO) em que a lisina é codificada pelo codão C-terminal são heterogéneas por uma fracção delas possuir lisina como aminoácido C-terminal e uma fracção não possuir lisina. A deleção é devida à acção de proteases durante a expressão nalguns tipos de células de mamífero. Assim, para evitar esta heterogeneidade, prefere-se que as construções de expressão da fusão com Fc não possuam um codão C-terminal para lisina.
Prefere-se que o aminoácido C-terminal da fracção do análogo GLP-1 aqui discutido seja fundido com o extremo N da fracção Fc de IgG4 através de um elemento de ligação rico em glicinas. A função e a estabilidade in vivo das proteínas de fusão podem ser optimizadas através da adição de pequenos péptidos que funcionam como elementos de ligação para evitar interacções de domínios potencialmente indesejáveis. Ainda, um elemento de ligação rico em glicinas proporciona alguma flexibilidade estrutural, de forma que a fracção do análogo GLP-1 possa interagir produtivamente com o receptor GLP-1 nas células alvo, como sejam as células beta do pâncreas. Estes elementos de ligação, no entanto, podem aumentar significativamente o risco de a proteína de fusão ser imunogénica in vivo. Assim, prefere-se que o comprimento não seja maior do que o 14 ΡΕ1831252 necessário para evitar interacções de domínios indesejáveis e/ou optimizar a actividade biológica e/ou estabilidade. 0 elemento de ligação rico em glicina preferido compreende a sequência: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8). Apesar de mais cópias deste elemento de ligação puderem ser usadas nas proteínas de fusão, prefere-se que seja utilizada uma única cópia deste elemento de ligação a ser usado para minimizar o risco de imunogenicidade associado à administração prolongada e repetida.
As fusões GLP-lFc preferidas incluem as seguintes proteínas: Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P), Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) , Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, N297A) , Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1(7-37)-lL-IgG4(S228P, F234, L235A, N297A), Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) , Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1,5L-IgG4(S228P, N297A), Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1(7-37)-1,5L-IgG4(S228P, F234A, L235A, N297A), Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 ( 7-37)-2L-IgG4 (S228P) , Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) , Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, N297A) e Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P, F234A, L235A, N297A) e as formas Vai8 e des-K de todas as descritas atrás. A nomenclatura aqui usada para referir proteínas de fusão específicas é definida como se segue: substituições específicas da fracção GLP-1 da proteína de fusão estão indicadas usando o aminoácido específico a ser 15 ΡΕ1831252
substituído seguido do número do resíduo. GLP-l(7-37) indica que a fracção GLP-1 da proteína de fusão madura começa com His na posição 7 e termina com Gly na posição 37. L refere-se a um elemento de ligação com a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8). 0 número que precede imediatamente o L refere-se ao número de elementos de ligação que separam a fracção GLP-1 da fracção Fc. Um elemento de ligação especificado como 1,5L refere-se à sequência Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:17). IgG4 refere-se a um análogo da sequência Fc de IgG4 humana especificada como SEQ ID NO: 7. As substituições na fracção Fc de IgG4 da proteína de fusão estão indicadas entre parêntesis. 0 aminoácido selvagem é especificado pela sua abreviatura comum seguida do número da posição no contexto da totalidade da sequência lgG4, usando o sistema de numeração EU, seguido do aminoácido a ser substituído naquela posição especificado pela sua abreviatura comum.
As proteínas de fusão possuem actividade biológica. A actividade biológica refere-se à capacidade da proteína de fusão para se ligar e activar o receptor GLP-1 in vivo e induzir uma resposta. As respostas incluem, mas não estão limitadas a secreção da insulina, supressão de glucagon, inibição do apetite, perda de peso, indução de saciedade, inibição de apoptose, indução da proliferação das células beta hepáticas e diferenciação das células beta pancreáticas. Um número representativo de proteínas de ΡΕ1831252 fusão GLP-1 foi testado relativamente à actividade in vitro e in vivo. Foi demonstrada actividade in vitro baseada na capacidade da proteína de fusão para interagir com o receptor GLP-1 humano e activá-lo. (Ver PCT/US 04/15595 (W02005/000892)) . Foram usadas as células HEK293 que expressam em excesso o GLP-1 humano. A activação do receptor GLP-1 nestas células causa activação de adenilil-ciclase que, por sua vez, induz a expressão de um gene repórter conduzida por um elemento de resposta a AMP cíclico V (CRE). O pH das formulações de fusão GLP-l-Fc foi ajustado para proporcionar estabilidade aceitável, para manter a solubilidade e a actividade insulinotrópica da fusão GLP-l-Fc e ser aceitável para administração parentérica. O pH das formulações de fusão GLP-l-Fc é, de preferência, ajustado entre pH 6 e pH 8,5, de preferência entre aproximadamente pH 6 e pH 7,5, entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 7, entre aproximadamente pH 6,5 e aproximadamente pH 7,5, ou entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 6,5 e mesmo mais de preferência, aproximadamente pH 6 ou aproximadamente 6,5.
As formulações compreendendo uma fusão GLP-l-Fc do presente invento podem, facultativamente, englobar um tampão farmaceuticamente aceitável. No entanto, a selecção e concentração do tampão deverá ser tal que a formulação possa ser ajustada às gamas descritas que proporcionam estabilidade e actividade insulinotrópica. Exemplos de 17 ΡΕ1831252 tampões farmaceuticamente adequados incluem tampões de fosfato tipo fosfato de sódio dibásico, TRIS, acetato, como seja acetato de sódio, citrato, como seja citrato de sódio, tartarato de sódio, aminoácidos básicos tais como histidina, lisina ou arginina, ou aminoácidos neutros tais como glicina e glicina-glicina. Outros tampões farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na área. De preferência, o tampão é seleccionado do grupo consistindo em citrato, fosfato e TRIS. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que a selecção do tampão está dependente das gamas de pH e do pKa do tampão. De preferência, a concentração de um tampão é entre cerca de 1 mM e 30 mM. Mesmo mais preferencialmente, a concentração é entre cerca de 4 mM e 14 mM ou entre cerca de 5 mM e 20 mM. Ainda mais de preferência, a concentração é entre cerca de 10 mM e 20 mM. Mesmo mais de preferência, a concentração é entre aproximadamente 10 mM e aproximadamente 20 mM.
As formulações do presente invento podem facultativamente englobar um conservante. No entanto, a selecção e concentração do conservante deverá ser tal que a formulação possa ser ajustada às gamas descritas que proporcionam estabilidade aceitável e actividade insulinotrópica. O conservante refere-se a um composto que é adicionado a uma formulação farmacêutica para actuar como um agente antimicrobiano. Uma formulação parentérica deve estar de acordo com regras de eficácia de conservante para ser um produto multi-usos comercialmente viável. Entre os conservantes conhecidos na área como sendo eficazes e 18 ΡΕ1831252 aceitáveis nas formulações parentéricas estão os conservantes fenólicos, alquilparabenos, álcool benzilico, clorobutanol, resorcionol e outros conservantes semelhantes e várias misturas dos mesmos. Exemplos de derivados fenólicos incluem cresóis e fenol ou uma mistura de cresóis e fenol. Exemplos de cresóis incluem meta-cresol, orto-cresol, para-cresol, cloro-cresol ou misturas dos mesmos. Alquilparabenos referem-se a um alquilparabeno Ci a C4, ou misturas dos mesmos. Exemplos de alquilparabenos incluem metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno ou butilpara-beno. A concentração do conservante é conhecida dos familiarizados com a matéria. As concentrações devem ser suficientes para manter a eficácia do conservante através da inibição do crescimento microbiano. 0 conservante preferido é meta-cresol ou fenol. Em geral, a concentração de meta-cresol está entre aproximadamente 2,0 e aproximadamente 8,0 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml a cerca de 4,5 ml e cerca de 2,0 mg/ml a cerca de 4.0 mg/ml. Uma concentração muito preferida do conservante na formulação é cerca de 2,7 mg/ml. Numa outra realização, a concentração de fenol é entre cerca de 2,0 e cerca de 10.0 mg/ml e cerca de 4,0 a cerca de 8,0 mg/ml. Uma concentração muito preferida de conservante na formulação é cerca de 5,0 mg/ml.
As formulações do presente invento podem, facultativamente, englobar um agente de isotonicidade. No entanto, a selecção e a concentração do agente de isoto- 19 ΡΕ1831252 nicidade deverão ser tais que formulação possa ser ajustada às gamas descritas que proporcionam estabilidade e actividade insulinotrópica aceitáveis. Os agentes de isoto-nicidade referem-se aos compostos que são fisiologicamente tolerados e conferem uma tonicidade adequada à formulação para prevenir o fluxo de água através das membranas celulares. Exemplos de tais compostos incluem glicerina (ou glicerol), sais, e.g., NaCl, e açúcares, e.g., dextrose, manitol e sucrose. Estes compostos são normalmente usados para tais fins em concentrações conhecidas. Um ou mais agentes de isotonicidade podem ser adicionados para ajustar a força iónica ou tonicidade. O agente de isotonicidade preferido é NaCl. A concentração de NaCl é, de preferência, entre cerca de 10 mM e 500 mM, mais de preferência está entre cerca de 50 mM e 200 mM, e mais preferido é cerca de 150 mM. Numa outra realização, o agente de isotonicidade preferido é manitol. A concentração do manitol é, de preferência, entre cerca de 1% (peso (p)/volume (v)) e 10% (p/v) e mais de preferência está entre cerca de 2% (p/v) e 8% (p/v) . Numa outra realização, o agente de isotonicidade preferido é glicerina. A concentração da glicerina é, de preferência, entre cerca de 12 mg/ml e 25 mg/ml, de preferência entre cerca de 12 mg/ml e 20 mg/ml, e mais de preferência é cerca de 17 mg/ml.
As formulações do presente invento podem, facultativamente, englobar um estimulador de solubilidade. 20 ΡΕ1831252
No entanto, a selecção e concentração do estimulador de solubilidade deverá ser tal que a formulação possa ser ajustada às gamas descritas que proporcionam estabilidade aceitável e actividade insulinotrópica. Os estimuladores de solubilidade proporcionam estabilidade, de forma que a fusão GLP-l-Fc permaneça solúvel durante um período de tempo prolongado nas condições de armazenamento. De preferência, o estimulador da solubilidade é nicotinamida. Em geral, a concentração de nicotinamida é entre 0,01 e 2 molar. Outras gamas preferidas da concentração de nicotinamida são: entre 0,05 molar e 1,5 molar; entre 0,1 molar e 1,0 molar; entre 0,1 molar e 0,5 molar; entre 0,5 molar e 1,0 molar; e entre 0,15 molar e 0,25 molar.
Outros aditivos, tais como um solubilizante farmaceuticamente aceitável tipo Tween 20© (monolaurato de oxietileno(20)sorbitano), Tween 40® (monopalmitato de oxi-etileno(20)sorbitano), Tween 80® (mono-oleato de oxietileno (20) sorbitano) , Pluronic F68® (copolímeros de blocos de polioxietileno polioxipropileno) e PEG (polietileno-glicol) podem facultativamente ser adicionados à formulação. De preferência, o solubilizador é Tween 20® ou Tween 80®. Em geral, a concentração de Tween 20® ou Tween 80® está entre 0,001% e 0,05%. Outras gamas preferidas das concentrações de Tween 20® ou Tween 80® são: entre 0,005% e 0,05%; entre 0,0075% e 0,05%; e entre 0,01% e 0,05%. A administração das formulações pode ser através de qualquer via conhecida como sendo eficaz pelo médico 21 ΡΕ1831252 assistente. A administração parentérica periférica é um desses métodos. A administração parentérica é normalmente entendida na literatura médica como a injecção de uma forma de dosagem no corpo através de uma seringa estéril ou outro dispositivo mecânico, como seja uma bomba de infusão. As vias parentéricas periféricas podem incluir as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.
As formulações podem também ser adequadas à administração pelas vias oral, rectal, nasal ou vias respiratórias inferiores, as quais são vias não parentéricas. De entre estas vias não parentéricas, a via respiratória inferior e a via oral são preferidas.
As formulações compreendendo uma fusão GLP-l-Fc podem ser usadas para tratar uma larga variedade de doenças e condições. As fusões GLP-l-Fc exercem os seus efeitos biológicos principalmente actuando através de um receptor referido como "receptor de GLP-1". Os indivíduos com doenças e/ou condições que respondem favoravelmente à estimulação do receptor de GLP-1 ou à administração de compostos GLP-1 podem assim ser tratados com as fusões GLP-l-Fc. Estes indivíduos são referidos como "necessitados de tratamento com compostos GLP-1" ou como "necessitados da estimulação do receptor de GLP-1". Estão incluídos indivíduos com diabetes não dependentes de insulina, diabetes dependentes de insulina, choque (ver WO 00/16797), enfarte do miocárdio (ver WO 98/08531), obesidade (ver WO 22 ΡΕ1831252 98/19698), alterações catabólicas após cirurgia (ver Patente U.S. N° 6006753), dispepsia funcional e sindrome do intestino irritável (ver WO 99/64060) . Também estão incluídos indivíduos que requeiram tratamento profilático com um composto GLP-1, e.g., sujeitos ao risco de desenvolvimento de diabetes não dependentes de insulina (ver WO 00/07617). Os indivíduos com tolerância diminuída à glucose ou com glicemia de jejum alterada, indivíduos cujo peso do corpo é cerca de 25% acima do peso normal para a altura e massa corporal, indivíduos com uma pancreatectomia parcial, indivíduos tendo um ou os dois pais com diabetes não dependentes de insulina, indivíduos que tenham tido diabetes gestacional e indivíduos que tenham tido pancreatite aguda ou crónica estão em risco de desenvolver diabetes não dependentes de insulina.
Uma quantidade eficaz das fusões GLP-l-Fc no contexto da formulação descrita é a quantidade que resulta num efeito terapêutico e/ou profilático sem causar efeitos secundários inaceitáveis quando administrado a um indivíduo necessitado de estimulação do receptor de GLP-1. Um "efeito terapêutico pretendido" inclui um ou mais dos seguintes: 1) uma melhoria dos sintomas associados à doença ou condição; 2) um atraso no estabelecimento dos sintomas associados com a doença ou condição; 3) aumento da longevidade comparativamente com a ausência do tratamento; e 4) maior qualidade de vida comparativamente com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" de uma fusão GLP-l-Fc para o tratamento de diabetes é a quantidade que resultará num 23 ΡΕ1831252 maior controlo da glucose no sangue do que na ausência de tratamento, resultando assim num retardamento do estabelecimento das complicações diabéticas tais como retino-patia, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" de uma fusão GLP-l-Fc para a prevenção de diabetes é a quantidade que retardará, comparativamente com a ausência de tratamento, o estabelecimento de niveis elevados de glucose no sangue que requerem tratamento com fármacos anti-hipoglicémicos tais como sulfonil-ureias, tiazolidi-nodionas, insulina e/ou bisguanidinas. A dose de proteina de fusão eficaz para normalizar a glucose no sangue de um doente dependerá de uma série de factores, entre as quais estão incluídas, sem limites, o sexo, o peso e a idade do indivíduo, a gravidade da incapacidade para regular a glucose no sangue, a via de administração e a biodisponibilidade, o perfil farmaco-cinético da proteína de fusão, a potência e a formulação. As doses podem ser na gama de 0,01 a 1 mg/Kg de peso de corpo, de preferência na gama de 0,05 a 0,5 mg/Kg de peso de corpo.
Prefere-se que a proteína de fusão seja administrada uma vez de duas em duas semanas ou uma vez semanalmente. Dependendo da doença a ser tratada, pode ser necessário administrar a proteína de fusão mais frequentemente do que duas a três vezes por semana. 24 ΡΕ1831252 0 presente invento será agora descrito apenas como exemplo não limitante com referência aos Exemplos que se seguem.
EXEMPLOS
Ensaio in vitro de activação do receptor de GLP- 1: Células HEK-293 que expressam o receptor de GLP-1 humano, usando um sistema CRE-blam, foram semeadas entre 20000 e 40000 células/alvéolo/100 μΐ de meio DMEM com 10% FBS numa placa de 96 alvéolos revestida com poli-d-lisina, de fundo preto plano. No dia após a sementeira, o meio foi removido e adicionados 80 μΐ de meio DMEM sem plasma. No terceiro dia após sementeira, adicionou-se a cada alvéolo 20 μΐ de meio DMEM sem plasma com 0,5% de BSA contendo diferentes concentrações de várias proteínas de fusão GLP-1-Fc para gerar uma curva de dose-resposta. De um modo geral, usaram-se catorze diluições contendo entre 3 nanomolar a 30 nanomolar da proteína de fusão GLP-l-Fc para gerar uma curva de dose-resposta, a partir da qual foram determinados valores de EC50. Após 5 horas de incubação com a proteína de fusão, 20 μΐ do substrato da β-lactamase (CCF2/AM, Pan Vera LLC) foram adicionados e a incubação continuou durante 1 hora, após o que a fluorescência foi determinada num citofluorímetro. O ensaio está descrito em Zlokarnik, et al., (1998), Science, 278:84-88. 25 ΡΕ1831252
Ensaio de activação do receptor de GLP-1 in vitro Células HEK-293 que expressam estavelmente o receptor GLP-1 humano, usando um sistema CRE-Luciferase, foram semeadas a 30000 células/alvéolo/80 μΐ de meio DMEM F12 com baixa concentração de soro em placas de 96 alvéolos. No dia após a sementeira, aliquotas de 20 μΐ da proteína a testar, dissolvidas em 0,5% de BSA, foram misturadas e incubadas com as células durante 5 horas. De um modo geral, 12 diluições contendo 3 pM a 3 nM foram preparadas numa concentração de 5X para cada proteína a testar, antes da adição às células, para gerar uma curva de dose-resposta a partir da qual foram determinados os valores de ECso. Após incubação, 100 μΐ do reagente de Luciferase foram adicionados directamente a cada placa e misturados suavemente durante 2 minutos. As placas foram colocadas num luminómetro Tri-lux e calculada a luz emitida resultante da expressão da luciferase.
Efeito de Tween, NaCl e pH na estabilidade de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37) -lL-IqG4 (S228P, F234A, L235A) :
Determinaram-se os efeitos de tween-20 (±0,01%), NaCl (0,150 e 500 mM) e pH (6,5, 7,5 e 8,5) na estabilidade química de 0,5 mg/ml de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1L-IgG4(S228P, F234A, L235A). Uma matriz completa destas condições foi preparada misturando o respectivo tampão 2X com uma solução a 1 mg/ml de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37) -lL-IgG4(S228P, F234A, L235A) dissolvido em fosfato 20 mM, Tris 20 mM, pH 7,5. A composição final da solução foi 26 ΡΕ1831252 filtrada através de filtros Millex-GV 0,2 micron para frascos de HPLC e incubada a 37°C. Periodicamente, em vários pontos de tempo foram removidas amostras e analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa e electroforese em gel.
Identificação dos componentes de formulação para as amostras A-R (todas continham 0,5 mg/ml de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1(7-37)-lL-IgG4(S228P, F234A, L235A), fosfato 20 mM e Tris 20 mM) Código da formulação Tween-20 (%) NaCl (mM) pH A 0 0 6,5 B 0 0 7,5 C 0 0 8,5 D 0 150 6,5 E 0 150 7,5 F 0 150 8,5 G 0 500 6,5 H 0 500 7,5 I 0 500 8,5 J *—I o o 0 6,5 K o o I—* 0 7,5 L 0, 01 0 8,5 M *—1 o o 150 6,5 N T-1 o o 150 7,5 0 0, 01 150 8,5 P 0, 01 500 6,5 Q *—1 o o 500 7,5 R o o 1—* 500 8,5 27 ΡΕ1831252
Alteração percentual do pico principal a 37°C para várias condições da solução GLP-Fc, conforme monitorizado por HPLC de exclusão por tamanho Código de formulação—> A B C D E F Tempo (semanas, 37°C) 0 98,96 98, 96 98,96 98,96 98,96 98,96 0,57 98,87 98, 73 98,95 98,89 98,89 98,58 1 98,36 98,63 98,69 98,39 98,4 98,48 2 97,9 98,39 98,53 98,09 98,2 98,25 3 97, 77 98,39 98,74 98,01 97,94 98,32 Código de formulação—> G H I J K L Tempo (semanas, 37°C) 0 CO co CO Oh CO co co Oh CO co co Oh CO co co Oh CO co co Oh CO co ^o Oh 0,57 98,85 98,69 98,37 98,67 98,42 98,63 1 98,53 98,5 98,13 98,2 98,33 2 98,27 98,02 98,28 97,54 97,81 98,13 3 98,19 97,96 98,22 97,42 97, 74 98,15 Código de formulação—> M N 0 P Q R Tempo (semanas, 37°C) 0 98,96 98,96 98,96 98,96 98,96 98,96 0,57 98,25 98,24 97,91 98,15 98,15 97, 79 1 98,78 97,85 98 97,88 97,8 97,6 2 97,28 97,48 97,66 97,73 97,81 97, 47 3 96,94 97,18 97,52 97,49 97,53 97,22 28 ΡΕ1831252
Alteração percentual do pico principal a 37°C para várias condições da solução GLP-Fc, conforme monitorizado por HPLC de fase reversa Código de formulação—> A B C D E F Tempo (semanas, 37°C) 0 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 0,57 77,3 77,1 75,8 77,9 75,3 76,4 1 70,2 69,4 69,2 73,4 73,6 69,1 2 67,2 66,1 62 73,3 67,5 63,6 3 65,2 62,6 57,3 66 61,2 58,8 Código de formulação—> G H I J K L Tempo (semanas, 37°C) 0 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 0,57 77,4 76,9 75,8 74,9 75,3 75,4 1 72,6 73,3 72,5 69,5 69 70, 7 2 73,2 66,6 65,8 65,4 63,9 61,96 3 64,8 62,4 58,9 63,6 60,4 57, 7 Código de formulação—> M N 0 P Q R Tempo (semanas, 37°C) 0 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 78,2 0,57 76,2 75,9 73,9 75 72,9 75,3 1 71,4 72,3 69,8 75,7 71,2 71 2 67,5 63,5 59,4 65,2 68,5 61,4 29 ΡΕ1831252
Velocidade linear de degradação (alteração percentual no pico principal por semana quando da incubação a 37°C) como monitorizado por HPLC de exclusão por tamanho ou de fase reversa
Alteração percentual no pico principal por semana quando da incubação a 37°C Código da Dados da exclusão Dados da fase formulação por tamanho reversa A -0, 44 -0,98 B -0,19 -10,8 C -o,i -11,2 D -0, 35 -5, 8 E co o 1 -5,9 F -0,2 -11,2 G -0,28 -6, 9 H -0,36 -6,1 I -0,2 -7,2 J -0,55 -10, 9 K -0,39 -11,5 L -0,27 -9, 4 M -0, 65 -8,5 N -5,6 -7,4 0 -0,4 -10, 6 P -0,42 -3,4 Q -0,4 -9,2 R -0,47 -9,1 ΡΕ1831252 30 Método de HPLC por exclusão de tamanho:
As amostras foram injectadas numa coluna Tosohas TSK3000-SW-XL (5 micron, 7,8x300 mm) pré-equilibrada em PBS IX, pH 7,4 mais 10% de acetonitrilo (v/v) de tampão móvel (tampão da bomba A). O tampão A correu a 0,5 ml/min isocrático e a proteína foi detectada a 214 nm. Método de HPLC de fase reversa:
As amostras foram injectadas numa coluna Zorbax 300SB-C8 (4,6 x 50 mm) pré-equilibrada em 0,1% TFA (v/v) de tampão móvel (tampão da bomba A) . O tampão da bomba B consiste em 0,085% TFA em acetonitrilo (v/v). Correu-se o gradiente que se segue e o material foi detectado a 214 nm.
Tempo % tampão da bomba B 0 30 5 30 35 45 40 90 45 90 50 25 65 25 31 ΡΕ1831252 Método de electroforese em gel:
As colheitas em diferentes pontos de tempo foram diluídas em tampão de amostra NuPage LDS 4X (conc final lx) e aquecidas a 95°C durante 5 minutos. As amostras arrefecidas foram aplicadas num gel 4-12% bis-tris NuPage. 0 gel foi corrido a voltagem constante (200 volts) durante 50-60 min em tampão MOPS e corado com SimplyBlue SafeStain.
Estabilidade de Gli8-Glu22-Gli3l5-GLP-1 (7-37) -1L-IgG4(S228P, F234A, L235A) e efeito de Tween-20: A estabilidade de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1L-IgG4(S228P, F234A, L235A) a 0,3 mg/ml em PBS IX a pH 7,5 foi avaliada através da monitorização do aumento da turbidez a 350 nm em condições de tensão acelerada (agitação com barra de agitação hidrofóbica em PBS a 37°C). O efeito do tween-20 na redução da agregação
Solução de aditivo Tempo para a turbidez aumentar >0,05 DO a 350 nm Nenhum <6 hr 0,001% Tween-20 16 hr 0,005% Tween-20 27 hr 0,01% Tween-20 >65 hr 0,02% Tween-20 >65 hr 0,05% Tween-20 >65 hr 32 ΡΕ1831252
Solubilidade de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1L-IgG4(S228P, F234A, L235A) em função do pH da solução: A solubilidade de Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-1L-IgG4(S228P, F234A, L235A) em função do pH foi determinada diluindo uma solução stock com várias soluções tamponadas a diferentes valores de pH, permitindo que a solução se equilibrasse, centrifugação para remoção de qualquer material precipitado, depois análise do sobrenadante relativamente à concentração proteica reminiscente. 0 stock de proteína congelada em PBS foi dialisado contra água a pH de aproximadamente 8. Após diálise, o stock de proteína foi filtrado através de um filtro Millex-GV de 0,22 micron e concentrado para * 12 mg/ml usando um sistema de centrifugação Ultrafree lavado (4 ml, MWCO 5000 daltons, a 7000xg). Esta solução concentrada foi diluída a 1:1 com solução stock de tampão 2X (volume final de 50 μΐ em tubos eppendorf de 0,5 ml) e foi deixada a equilibrar durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. A solução foi centri-fugada (14000 xg durante 5 minutos) para sedimentar qualquer material insolúvel. Removeu-se 10 μΐ de sobrenadante e combinou-se com 40 μΐ de água a pH 8. Foram efectuadas duas réplicas para cada amostra. A concentração de GLP-Fc solúvel foi determinada por HPLC em fase reversa contra uma curva padrão. ΡΕ1831252 33
Efeito das acondições da solução na solubilidade
Concentração proteica (mg/ml) Condição da formulação Média Desvio padrão (n=2) Citrato 20 mM, pH 3 5, 8 0,4 Citrato 20 mM, pH 4 4,1 0,3 Citrato 20 mM, pH 5 4,5 O O Citrato 20 mM, pH 6 5, 5 o o Fosfato 20 mM, pH 6 5, 8 0,1 Fosfato 20 mM, pH 7 5, 8 0,4 Fosfato 20 mM, pH 7 (réplica #1) 6,0 0,1 Fosfato 20 mM, pH 7 (réplica #2) 5, 8 o o Fosfato 20 mM, pH 8 5, 5 o o Tris 20 mM, pH 8 6,1 0,1 Citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 3 0,4 o o Citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 4 N) co 0,1 Citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 5 6,0 o o Citrato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6 5,3 0,1 Fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7 5, 9 o o Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8 6,0 0,1 Citrato 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 3 5, 8 o o Citrato 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 4 1,0 o o Citrato 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 5 1,3 o o Citrato 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 6 5,5 0,1 Fosfato 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 7 6,2 0,1 Tris 20 mM, 3 mg<ml m-Cresol, pH 8 6,0 o o 34 ΡΕ1831252
Efeito do pH da solução na estabilidade, conforme monitorizado por HPLC de fase reversa:
Gli8-Glu22-Gli36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) foi dialisado contra água ajustada a aproximadamente pH 8. Após diálise, este stock de proteina foi filtrado (Millex-GV 0,2 micron) e concentrado para >2mg/ml usando um sistema de centrifugação Ultrafree lavado. A concentração proteica foi determinada por UV e preparadas várias formulações diluindo os stocks de tampão de formulação para lx mantendo a concentração proteica final a 1 mg/ml. O pH da solução foi testado e ajustado caso necessário. No final, estas soluções foram filtradas (Millex-GV 0,22 micron, 4 mm) para frascos de HPLC de 1,8 ml, esterilizados, com tampas de rosca. Os frascos foram colocados a 37°C e colhidas amostras ao longo do tempo que foram analisadas por HPLC de fase reversa, cromatografia de exclusão por tamanho e electroforese em gel. É apresentada a alteração percentual do pico principal monitorizada por cromatograf ia de exclusão por tamanho e por HPLC de fase reversa. Numa tabela, estão apresentadas as velocidades de degradação lineares obtidas ajustando a curva do tempo de incubação a 37°C com a pureza do pico principal para os dados de HPLC por exclusão de tamanho e de fase reversa. ΡΕ1831252 35
Identificação dos parâmetros da formulação Código da formulação PH Tampão (10mM) Aditivo 3C 3, 0 Citrato nenhum 4C 4,0 Citrato nenhum 5C 5, 0 Citrato nenhum 6C 6,0 Citrato nenhum 6CN 6,0 Citrato NaCl 150 mM 6CC 6,0 Citrato 3 mg/ml m-Cresol 6P 6,0 Fosfato nenhum 7P-R1 7,0 Fosfato Nenhum, réplica #1 7P-R2 7,0 Fosfato Nenhum, réplica #2 7P-R3 7,0 Fosfato Nenhum, réplica #3 7PN 7,0 Fosfato NaCl 150 mM 7PC 7,0 Fosfato 3 mg/ml m-Cresol 8P co o Fosfato nenhum 8T co o Tris Nenhum A alteração na percentagem do pico principal quando do armazenamento a 37°C. Os dados foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho.
Tempo 3C 4C 5C 6C 6CN 6CC 6P (semanas) 0,43 43,81 0 94,27 95,74 94,37 94, 45 94,7 1 40,13 0 93,14 94,73 92, 98 92, 79 93, 85 2,43 36,26 0 91, 72 94,22 92,29 90, 77 93,1 3,43 35,85 0 91,27 93,84 91,51 89, 44 92,51 36 ΡΕ1831252
Tempo (semanas) 7P-R1 7P-R2 7P-R3 7PN 7PC 8P 8T 0,43 95, 98 95, 95 96,02 93, 93 95,86 95, 89 97, 08 1 95,22 95,03 95,22 92, 95 95,18 95, 26 96,92 2,43 94, 71 94, 5 94, 84 91,76 94, 76 94, 94 97, 05 3,43 94, 05 93, 65 94, 09 91,24 94,02 94,67 97, 02 A alteração na percentagem do pico principal quando do armazenamento a 37°C. Os dados foram analisados por cromatografia de fase reversa.
Tempo (semanas) 3C 4C 5C 6C 6CN 6CC 6P 0,43 34, 04 39, 35 51, 93 57, 96 57,29 58, 42 55, 76 1 2 6,64 39,48 49, 85 58, 49 53,32 55, 87 2,43 33, 09 40, 36 44,61 52, 05 51,24 51, 34 49, 44 3,43 28,17 28, 51 36,78 48, 4 50,43 50, 42 49, 84
Tempo (semanas) 7P-R1 7P-R2 7P-R3 7PN 7PC 8P 8T 0,43 55, 74 55, 36 55, 01 56,09 58,67 49, 14 54, 44 1 53, 72 54 53,22 52, 4 55,96 46,84 54, 48 2,43 45, 7 47 45, 97 47, 07 51,49 38, 7 51, 22 3,43 44,16 42 43,22 42, 62 49,74 34,25 47, 89 37 ΡΕ1831252
Velocidade de degradação a 37°C, conforme monitorizado por HPLC de exclusão por tamanho ou de fase reversa.
Alteração percentual no pico principal por semana quando da incubação a 37°C Código da Dados da exclusão Dados da fase formulação por tamanho reversa 3C -2,6 -0, 71 4C Precipitado -3, 0 5C -0, 98 -4, 9 6C -0, 57 -3, 5 6P -0, 68 -2,1 7P-R1 -0, 58 -4,1 7P-R2 -0, 69 -4, 6 7P-R3 -0, 57 -4,1 8P -0, 36 -5,1 8T 0, 003 -2, 2 6CN -0, 85 -2,1 6CC -1,6 -2,7 7PN -0, 87 -4,3 7PC -0, 55 -3, 0 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly and Company <120> Formulações de proteínas de fusão de análogos de GLP-1 <130> X-17003 <150> 60/641690 <151> 2004-12-22 38 ΡΕ1831252 < 16 Ο > 17 <17Ο> Patentln versão 3.3 < 210 > 1 <211> 31 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2) . . (2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai <400> 1 hIs xaa Glu Gly thf Phe Thr Ser Asp vai ser Ser Tyr leu Glu Glu 1 5 10 ' 15
Gin Ala Ala lys Glu PHe lie Ala Ttp leu vai t.ys Gly Gly Gly 20 25 ' 30 <210> 2 <211> 31 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai <400> 2 wi$ xaa Gly Glv Thr Thr ser A&p vai ser 'ser Tyr léu Glu Glu 1 ' s Ί0 15
Slrt Ala Ala Lys Gly àhe lie. Ala Trp leu Lys ASrt Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> 39 ΡΕ1831252 <2 21> MISC_FEATURE < 2 2 2 > (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai <400> 3
His xaa Glu Gly 'Thr Phe Thr ser asp vai ser ser ryr U« ely-çlu 1 5 10 15
Gin Ala·Ala tys Glu Phe ile Ala Trp teu vai tys Gly Gly pre 20 25 30' <210> 4 <211> 31 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai <400> 4
His xaa. Glw Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Gly Glu 1..... 5 10 15
Gin Ala. Ala Lys 61« Phe lie Ala Trp leu ly$ ASA Gly Gly Prò· 2fc 25 30 <210> 5 <211> 30 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai <400> 5 mís xaa 61« Gly Thr Pji« Thr ser Asp Vai Ser ser tyr teu Glu Glu 1 5 m 15
Gin Ala Ala tys 61 u Pite xle Ala Trp leu vai Lys Gly Gly 20 25 1 30' 40 ΡΕ1831252 < 210 > 6 <211> 30 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2) <223> Xaa na posição 2 é seleccionado entre Gly e Vai < 4 0 0 > 6 HU xaa. 61« Thr Hie Thr ser Asp vai ser Ser iyr Léu 61 u 61 u 1 5 10 15
Slrt Alá Ala Lys 6lis Pite Xle Ala irp Leu Lys asa Gly Gly ?ô 25 30 <210> 7 <211> 230 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) .. (16) <223> Xaa na posição 16 é Pro ou Glu <220> < 2 21 > MISC_FEATURE < 2 2 2 > (17)..(17) <223> Xaa na posição 17 é Phe, Vai ou Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18) .. (18) < 2 2 3 > Xaa na posição 18 é Leu, Glu ou Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80) .. (80) <223> Xaa na posição 80 é Asn ou Ala <220> < 2 21 > MISC_FEATURE < 2 2 2 > (230) .. (230) <223> Xaa na posição 230 é Lys ou está ausente <400> 7 ΡΕ1831252 41
Ala Glu ser Lys Tyr Gly Pro pro cys pro pro cys pro Ala Pro xaa 1 s 10 15 xaa xaa Gly dy 20 Pro ser Vai Phe Leu 25 phe Pró Pro lys Pro 30 Lys Asp Thr leu .«et 35 lie Ser Arg Thr Pro 40 Glu vai Thr Cys vai 45 vai vai ASP vai Gin Gly ASp pro Glu vai Glrs phe ASP Trp Tyr vai Asp Gly SÒ 53 60 vai Glu vai Hl $ ASO Ala Lys Thr Lys pro Arg G1U Glu 61 fi Phe xaa 65 70 75' 80 ser Thr Tyr ιΑ·Γ|5|: vai 8$ vai Ser vai. Leu Thr 90 Vai leu His Glo ASP 95 Trp Leu Asa Gly Ly$ Glu Tyr Lys cys lys vai Ser Asn Lys Gly teu pro 100 105 110 Ser Ser lie Glu i.y$ Thr xle ser Lys Ala Lys Gly G1r Pro Arg Glu 115 120 12$ Pro Gin vai Tyr Thr leu Pro Pro ser Gin Glu Glu «et Thr tys Aso no 135 140 Gin vai ser Leu Thr Cys Leis Vâl Lys Gly pfte Tyr pro ser ASp Ile 14 S 150 155 ISO Ala vai Gl li Trp g! y. 165 ser ASO Cl y €lí5 Pro 170 Glu ASÕ ASO Tyr ÍR Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe teu Tyr Ser Arg ISO 185 190 Leu Thr Vai 195 Asp Lys Ser Arg Trp 200 Glu Glu Gly A sn vai 205 phe ser cys Ser vai «et His Glu Ala Leu His ÂSIT HÍS Tyr Thr Glo Lys ser leu m m 220 ser “5 ·-*. f im Ser teu Gly Xaa <210> 8 <211> 15 <212 PRT> <213> Artificial m zm <220> <223> Construção sintética 42 ΡΕ1831252 < 4 Ο Ο > 8 Cíly Gly 6ly «ly Ser Gly 61 y Gly Gly Ser Gly 6ly 61 y 6ly Ser 1 § - 10 i s <210> 9 <211> 31 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 9
Bis Ais Gly Gly Thr Phe rírr ser Asp vai Ser ser' Tyr teu Glu Gly 2 $ 10 1$
Oiti A1& Ais Lys Glu Phe xle Ala Trp teu Vai Lys Gly Arg Gly 20 25 . 30 <210> 10 <211> 7 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 10
Trp tetf vai Lys Gly Gly Gly 1 5 <210> 11 < 211 > 7 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 11
Trp Ley Lys As« Gly Gly Gly
1 S <210> 12 < 211 > 7 <212 PRT> <213> Artificial <220> 43 ΡΕ1831252 <223> Construção sintética <400> 12
Trp lku vai tys Gly 6ly Pro 1 s 1 <210> 13 <211> 7 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 13
Trp teu ty$ çly Pre <210> 14 <211> 6 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 14
Trp Leu vai Lys 61 v Cly 1 S <210> 15 <211> 6 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 15
Trp teu Lys ftso ely Sly 1. 5 ‘ <210> 16 <211> 6 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 16 44 ΡΕ1831252 pro pro Cys Ρ ro Ser Cys <210> 17 <211> 22 <212 PRT> <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 17
Ci1y S«r Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly 61 y 1 S ' 10 15'
Ser Gly Gly Gly Gly Sêr
Lisboa, 11 de Setembro de 2009
Claims (12)
- ΡΕ1831252 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação de solução estável compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma fusão GLP-l-Fc, a um pH entre aproximadamente pH 6 e aproxima-damente pH 8,5, em que a fusão GLP-l-Fc compreende um análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência seleccionada entre: a) (SEQ ID NO:1) fundida com a fracção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência SEQ ID NO:7. em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; b) (SEQ ID NO:2) HÍS'-Xaa**-Q«-Gty“Tht“Piie'Thr''Ser-’Ásp'Val-'Ser-Sef-TyF“Le»^0la-Glw- G.te-Ã{3-:Aía-Lys-Gíu-]¾e“13¢:'Al{»*Tí|)·L·eu*Lys-Asκ-G.iy'Gíy-Gíy em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; 2 ΡΕ1831252 C) (SEQ ID NO:3) Hi$*Xaag*GI«»Giy»Thr''iPiie-Iltr’'Sier''Ásp'VaJ’’Ser’-SeF”Tyf*Í^a-*GÍu*GÍu·'' Gin«Ala~Ala"Lys-GI»-iBte-]le*À)a-Tip-Le»*Vâl*L^Gly'-Giy”BR> em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; d) (SEQ ID NO:4) HÍS'Xáág‘Glu -Gly-Thf-Fhe-Thr-Ser-Asp* V al -Ser-Ser-T yr~Le« -01 a-G li8" Gin- Ala-A ía · Lys-G I u -Pbe-Ιϊ e-A l a~T φ- Leu -Ly s* Asn-G! jhGI y-Pro em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; e) (SEQ ID NO:5) ’HiiS“Xa68‘Giw-^j]y-,Th.r’-Phe-ThF'-Sgr-Asp-Vai“SeF’Ser*TyT“.LeB-Gíij*'Giu Gln-Á Aía-Lys~G.lu *Phe* íle» Ala-T rp-Leu - VM-Lys-G 1 y-Ό ly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; f) (SEQ ID NO:6) His-XaarOÍ«‘Gly-Tlir''Fbe»T1ir“Ser'Asp''Va[.3ef.Ser»Tyr*ieu*GÍ»-G!u- Gla^AJe-Ala^Lys-GIw-.Fhe-lfe-Ala-Tip-Lett-Lya-Asn-Oly-dy em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; fundida com a fracção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência de SEQ ID NO:7 3 ΡΕ1831252 Ala-GlU"Ser"Ly$4'yr*Gly-Pf<^Pro-Cv&-PrO'Pro-Cys-Pm-AÍ3':fVci·' Xaaifl-Xaa^-Xaa^-Gly-Gly-Prío-SeT-Val-Phe-Lí.ii-Pfte-Pro-Fro-Lys-Pfo·· Ly^Asp*Thr*Leu-Mei”'ííe-Ser-Afg'’T1if»l^o-<jl»-V«J»'nir«Cy$*Vtl- Val-Va!-Asp^V8{-$ét*0ío-GJu-A«p>'Fro*G!u*V8J-Glis-Rie-AsR.Tip* Tyr*'V^-A^p-GÍy-Vtí~OJe”Vnj.HiS“Asn<'Ala»Lys*'nir*LyS'l,iFô*Arg- Glu-G1u-Gta-Phe*Xaâ^-Ser*Thr-Tyr"Árg*VãtA;a]-Sef-VâPLei^Tiír* V»í-Leu.Hfe^l^A%Trp-U».AsiJ»01y-Lys^a--Tyr-Lys^:yjÍ.tys> Val-Ser-A^-L^-01y*U«’Pi^S«r^lte><5to-LyS“Thr-lte^Sey* Lys*Ala»]L)®“Gly-0)ii-Fm»Afg*GlB-Pro-GÍ».Val-iy*Tbf*LeB“Pk>- J^o-$êf"GíH-Gití<llt^Me^Tlír4.,p-Asn'Gl.ri‘V.ai-Ser-U!U“'rhi**C>'i5'' Létí*Val-Lys-G!y-PÍ5e'Tyr"Pfí>-'Ser'Asp"Ilé*Ali-V'sl*GÍt3*Trp'-Gk!" Ser-AsinA^iy-GÍR-rVo-GhJ-A^-Asfl-TytvLys-ThrTIir-Pto-P.rtí^Va]- i4ítí~A^--Ser»Asp”GÍy*Ser*P}íe*|%e*Í^wAyr'SavAfg-JUii*11jr-VâP Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gín^Gtu-Qy-Asii-Vaf-Phe-Ser-CysAcr-Vai- Met-His-Gl y--ÂÍ8' Leu-H Í S* Asfj-H ís-Tyr-Th.r-G]íjr^Lys-Ser^a-Ser·’ JU»“$er*U8-Gly-X8ite» (SEQID NO:?} em que: Xaa na posição 16 é Pro ou Glu; Xaa na posição 17 é Phe, Vai ou Ala; Xaa na posição 18 é Leu, Glu ou Ala; Xaa na posição 80 é Asn ou Ala; e Xaa na posição 230 é Lys ou está ausente.
- 2. A formulação de solução estável, da reivindicação 1, em que o pH é entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente 7,5.
- 3. A formulação de solução estável, da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, em que o pH se situa entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH7. 4 ΡΕ1831252
- 4. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o pH se situa entre aproximadamente pH 6 e aproximadamente pH 6,5.
- 5. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH é de aproximadamente pH 6.
- 6. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH é de aproximadamente pH 6,5.
- 7. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação ainda compreende monolaurato de polioxietileno(20)sorbi-tano.
- 8. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a formulação ainda compreende monoleato de polioxietileno(20)sorbitano.
- 9. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a formulação ainda compreende NaCl.
- 10. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a formulação ainda compreende m-Cresol. 5 ΡΕ1831252
- 11. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 7, 9 e 10 em que a formulação ainda compreende monolaurato de polioxietileno(20)-sorbitano, NaCl e m-Cresol.
- 12. A formulação de solução estável, de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 8, 9 e 10 em que a formulação ainda compreende monoleato polioxietileno(20)sorbitano, NaCl e m-Cresol. Lisboa, 11 de Setembro de 2009 1 ΡΕ1831252 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição W0 3MS227A í.iS S4i55SS W W02«SS88892 A WOSS167S7A 8K>S8S®S3t A * W0SS5SSSSA * USSS3S7SSA * WGSSS4QSSA * WGSS07S17Â * WO «8641888 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Issafis «É:A c&j. Βφ. âmmef.. IWS. wt. WS, * 2te&sroífc et s:L 'Ss^ttoà.' 1SS& sei. S4-Sê 42^433 ' * KssbsL aí^SsQusnoas-ísí: Pisteíris et âsmu· nafopest !fí?e?sst Hss8ís and ki.wvs;'! Sesvass, EattseSCâ, fcSG, fiih Ps&ífc.#';>5 *39*
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64169004P | 2004-12-22 | 2004-12-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PT1831252E true PT1831252E (pt) | 2009-09-17 |
Family
ID=36123207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT05854150T PT1831252E (pt) | 2004-12-22 | 2005-12-15 | Formulações de proteínas de fusão de análogos de glp-1 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090232807A1 (pt) |
EP (2) | EP1831252B1 (pt) |
JP (1) | JP2008525452A (pt) |
KR (1) | KR100879662B1 (pt) |
CN (1) | CN101044162B (pt) |
AT (1) | ATE435235T1 (pt) |
AU (1) | AU2005319432A1 (pt) |
BR (1) | BRPI0519393A2 (pt) |
CA (1) | CA2589647A1 (pt) |
CY (1) | CY1109269T1 (pt) |
DE (1) | DE602005015257D1 (pt) |
DK (1) | DK1831252T3 (pt) |
EA (1) | EA011166B1 (pt) |
ES (1) | ES2326906T3 (pt) |
HK (1) | HK1107570A1 (pt) |
IL (1) | IL183285A0 (pt) |
MX (1) | MX2007007565A (pt) |
NO (1) | NO20073372L (pt) |
PL (1) | PL1831252T3 (pt) |
PT (1) | PT1831252E (pt) |
SI (1) | SI1831252T1 (pt) |
UA (1) | UA87009C2 (pt) |
WO (1) | WO2006068910A1 (pt) |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100888022B1 (ko) * | 2006-12-21 | 2009-03-09 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 면역글로불린 Fc와 인간 아포리포단백질(a)크링글절편의 융합단백질 LK8Fc |
JP2008169195A (ja) | 2007-01-05 | 2008-07-24 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体 |
DE602008005155D1 (de) * | 2007-07-10 | 2011-04-07 | Lilly Co Eli | Glp-1-fc fusionsprotein-formulierung |
EP2031064A1 (de) * | 2007-08-29 | 2009-03-04 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Verfahren zur Steigerung von Proteintitern |
EP2435061A4 (en) | 2009-05-28 | 2013-03-27 | Amylin Pharmaceuticals Inc | DAMPING GLP-1 RECEPTOR AGONIST COMPOUNDS |
EP2496249B1 (en) | 2009-11-03 | 2016-03-09 | Amylin Pharmaceuticals, LLC | Glp-1 receptor agonist for use in treating obstructive sleep apnea |
AU2010353685B2 (en) * | 2010-05-17 | 2014-09-25 | Betta Pharmaceuticals Co., Ltd. | Novel glucagon like peptide analogs, composition, and method of use |
CN102533655A (zh) * | 2010-12-21 | 2012-07-04 | 青岛黄海制药有限责任公司 | 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法 |
WO2012088157A2 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Glp-1 receptor agonists for islet cell transplantation |
KR20130049671A (ko) | 2011-11-04 | 2013-05-14 | 한미사이언스 주식회사 | 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법 |
US10441665B2 (en) | 2012-07-25 | 2019-10-15 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Liquid formulation of long acting insulinotropic peptide conjugate |
AR094821A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-09-02 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada |
UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
RU2652783C2 (ru) | 2012-12-21 | 2018-05-03 | Санофи | Двойные агонисты glp1/gip или тройные агонисты glp1/gip/глюкагона |
CN104173275A (zh) * | 2013-05-21 | 2014-12-03 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 度拉鲁肽注射剂及其制备方法 |
CN104371019B (zh) | 2013-08-13 | 2019-09-10 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质 |
TW201609796A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 非醯化之艾塞那肽-4(exendin-4)胜肽類似物 |
TW201609797A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
WO2015086729A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Dual glp-1/gip receptor agonists |
WO2015086728A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists |
US20170128589A1 (en) * | 2014-03-31 | 2017-05-11 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglogulin fc fragment linkage |
TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物 |
TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑 |
US9932381B2 (en) | 2014-06-18 | 2018-04-03 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists |
CN104327187B (zh) * | 2014-10-11 | 2018-06-08 | 上海兴迪金生物技术有限公司 | 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白 |
WO2016077806A1 (en) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | AskGene Pharma, Inc. | Fusion proteins with dual receptor agonist activities |
DK3257524T3 (da) * | 2015-02-11 | 2020-11-23 | Gmax Biopharm Llc | Stabiliseret opløsningspræparat af farmaceutisk glp-1r-antistoffusionsprotein |
US10993993B2 (en) * | 2015-05-28 | 2021-05-04 | Immunoforge Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treating muscle atrophy or sarcopenia including glucagon-like peptide (GLP-1) or GLP-1 receptor agonist |
AR105319A1 (es) | 2015-06-05 | 2017-09-27 | Sanofi Sa | Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico |
TW201706291A (zh) | 2015-07-10 | 2017-02-16 | 賽諾菲公司 | 作為選擇性肽雙重glp-1/升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽(exendin-4)衍生物 |
CR20180378A (es) | 2015-12-23 | 2018-12-06 | Amgen Inc | Método para tratar o mejorar trastornos metabólicos con proteínas de unión para el receptor peptídico inhibidor gástrico (gipr) en combinación con agosnistas de glp-1 |
GB201621987D0 (en) * | 2016-12-22 | 2017-02-08 | Archer Virgil L See Archer Sheri A Arecor Ltd | Novel composition |
JOP20190177A1 (ar) * | 2017-01-17 | 2019-07-16 | Amgen Inc | طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr) |
KR20200019122A (ko) | 2017-06-20 | 2020-02-21 | 암젠 인크 | Glp-1 작용제와 조합하여 위 저해 펩타이드 수용체(gipr)에 대한 결합 단백질을 이용하여 대사 장애를 치료하거나 또는 개선시키는 방법 |
BR112020007817A2 (pt) | 2017-11-21 | 2020-10-06 | Eli Lilly And Company | método de uso e composições contendo dulaglutido |
TWI829687B (zh) | 2018-05-07 | 2024-01-21 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | 包含glp-1促效劑與n-(8-(2-羥基苯甲醯基)胺基)辛酸之鹽的固體組成物 |
TWI705820B (zh) | 2018-06-22 | 2020-10-01 | 美商美國禮來大藥廠 | Gip/glp1促效劑組合物 |
JP2022525883A (ja) | 2019-03-15 | 2022-05-20 | イーライ リリー アンド カンパニー | 保存製剤 |
CA3056663C (en) | 2019-04-05 | 2022-10-18 | Jeffrey S. RIESMEYER | Use of dulaglutide in reducing risk of cardiovascular events in patients with type 2 diabetes mellitus |
US20210187077A1 (en) * | 2019-12-23 | 2021-06-24 | Idaho State University | GLP-1 Agonist Conjugates for Sustained Glycemic Control |
CA3241537A1 (en) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | Jiangyu YAN | Fusion protein of glp-1 and gdf15 and use thereof |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5118666A (en) * | 1986-05-05 | 1992-06-02 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
NZ292124A (en) * | 1994-07-29 | 1998-10-28 | Smithkline Beecham Plc | Il-4 antagonist comprising a fusion of a mutant il-4-antibody fragment |
GB9511935D0 (en) * | 1995-06-13 | 1995-08-09 | Smithkline Beecham Plc | Novel compound |
US6376653B1 (en) * | 1998-09-28 | 2002-04-23 | Smithkline Beecham Plc | Tie2 antagonist antibodies |
CA2716959A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Eli Lilly And Company | Glp-1 fusion proteins |
WO2002079415A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
US20030191056A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
CN1802386B (zh) * | 2003-06-12 | 2010-12-15 | 伊莱利利公司 | Glp-1类似物融合蛋白质 |
-
2005
- 2005-12-15 KR KR1020077014068A patent/KR100879662B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2005-12-15 PT PT05854150T patent/PT1831252E/pt unknown
- 2005-12-15 UA UAA200706803A patent/UA87009C2/ru unknown
- 2005-12-15 JP JP2007548310A patent/JP2008525452A/ja not_active Withdrawn
- 2005-12-15 EP EP05854150A patent/EP1831252B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-15 DE DE602005015257T patent/DE602005015257D1/de active Active
- 2005-12-15 CN CN2005800355972A patent/CN101044162B/zh active Active
- 2005-12-15 AT AT05854150T patent/ATE435235T1/de active
- 2005-12-15 WO PCT/US2005/045376 patent/WO2006068910A1/en active Application Filing
- 2005-12-15 BR BRPI0519393-1A patent/BRPI0519393A2/pt active Search and Examination
- 2005-12-15 SI SI200530779T patent/SI1831252T1/sl unknown
- 2005-12-15 AU AU2005319432A patent/AU2005319432A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-15 DK DK05854150T patent/DK1831252T3/da active
- 2005-12-15 EA EA200701364A patent/EA011166B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-12-15 CA CA002589647A patent/CA2589647A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-15 ES ES05854150T patent/ES2326906T3/es active Active
- 2005-12-15 US US11/720,939 patent/US20090232807A1/en not_active Abandoned
- 2005-12-15 MX MX2007007565A patent/MX2007007565A/es active IP Right Grant
- 2005-12-15 PL PL05854150T patent/PL1831252T3/pl unknown
- 2005-12-15 EP EP09160182A patent/EP2168982A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-05-17 IL IL183285A patent/IL183285A0/en unknown
- 2007-06-29 NO NO20073372A patent/NO20073372L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-11-30 HK HK07113118.3A patent/HK1107570A1/xx unknown
-
2009
- 2009-08-06 CY CY20091100832T patent/CY1109269T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2007007565A (es) | 2007-07-24 |
ATE435235T1 (de) | 2009-07-15 |
DK1831252T3 (da) | 2009-10-05 |
IL183285A0 (en) | 2007-09-20 |
BRPI0519393A2 (pt) | 2009-01-20 |
EA011166B1 (ru) | 2009-02-27 |
CA2589647A1 (en) | 2006-06-29 |
UA87009C2 (ru) | 2009-06-10 |
EP1831252B1 (en) | 2009-07-01 |
AU2005319432A1 (en) | 2006-06-29 |
EP1831252A1 (en) | 2007-09-12 |
KR20070089187A (ko) | 2007-08-30 |
DE602005015257D1 (pt) | 2009-08-13 |
WO2006068910A1 (en) | 2006-06-29 |
EP2168982A1 (en) | 2010-03-31 |
CY1109269T1 (el) | 2014-07-02 |
PL1831252T3 (pl) | 2009-11-30 |
CN101044162B (zh) | 2010-10-27 |
ES2326906T3 (es) | 2009-10-21 |
US20090232807A1 (en) | 2009-09-17 |
EA200701364A1 (ru) | 2007-10-26 |
CN101044162A (zh) | 2007-09-26 |
KR100879662B1 (ko) | 2009-01-20 |
SI1831252T1 (sl) | 2009-12-31 |
NO20073372L (no) | 2007-07-16 |
HK1107570A1 (en) | 2008-04-11 |
JP2008525452A (ja) | 2008-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PT1831252E (pt) | Formulações de proteínas de fusão de análogos de glp-1 | |
KR102670157B1 (ko) | 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
US8809499B2 (en) | Fusion protein of human fibroblast growth factor-21 and exendin-4 | |
KR102668200B1 (ko) | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
JP6182600B2 (ja) | 線維芽細胞増殖因子21タンパク質 | |
CN110028587B (zh) | 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白 | |
CA2813087A1 (en) | Engineered polypeptides having enhanced duration of action | |
KR20180052545A (ko) | 융합 단백질을 포함하는 간염증, 간섬유화 및 간경화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
US20230002460A1 (en) | Long-acting gdf15 fusion protein and pharmaceutical composition comprising same | |
KR20220125289A (ko) | Fgf-21 접합체 제제 | |
KR20220095204A (ko) | 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질을 함유하는 수성 의약 조성물 | |
EP4180452A1 (en) | Fusion protein including glucagon-like peptide-1 and interleukin-1 receptor antagonist and use thereof | |
US11981718B2 (en) | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation | |
US20240238380A1 (en) | Composition for combination therapy comprising growth differentiation factor-15 variant and glucagon-like peptide-1 receptor agonist | |
US20240254187A1 (en) | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation | |
KR102676582B1 (ko) | 갑상선 자극 호르몬 수용기(thyrotropin receptor, TSHR) 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 | |
RU2795548C2 (ru) | Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, включающая слитые белки | |
CA3085252A1 (en) | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation | |
KR20240087545A (ko) | 이중 작용 단백질 및 이의 용도 | |
AU2020204470B1 (en) | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |