JP2008518615A - 修飾成長ホルモン - Google Patents

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Abstract

修飾成長ホルモンポリペプチド、修飾成長ホルモンポリペプチドをコードする核酸分子および修飾成長ホルモンポリペプチドを作出する方法を提供する。また、修飾成長ホルモンポリペプチドを用いた治療法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
シーリー・ギュヨン（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｇｕｙｏｎ）、ギレス・ボラリー（Ｇｉｌｌｅｓ Ｂｏｒｒｅｌｌｙ）、リラ・ドリタンティ（Ｌｉｌａ Ｄｒｉｔｔａｎｔｉ）、およびマニュエル・ヴェガ（Ｍａｎｕｅｌ Ｖｅｇａ）の、標題「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＧＲＯＷＴＨ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」で、２００４年１１月４日出願の、米国仮特許出願第６０／６２５，６５２号明細書、およびシーリー・ギュヨン（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｇｕｙｏｎ）、ギレス・ボラリー（Ｇｉｌｌｅｓ Ｂｏｒｒｅｌｌｙ）、リラ・ドリタンティ（Ｌｉｌａ Ｄｒｉｔｔａｎｔｉ）、およびマニュエル・ヴェガ（Ｍａｎｕｅｌ Ｖｅｇａ）の、標題「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＧＲＯＷＴＨ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」で、２００５年８月８日に出願された、米国仮特許出願第６０／７０６，６９７号明細書に対する優先権の利益を主張する。許可された場合、これら出願の各々の主題は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
本出願は、２００３年９月８日に出願され、米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／６５８，８３４号明細書、およびリーン・ガンティール（Ｒｅｎｅ Ｇａｎｔｉｅｒ）、シーリー・ギュヨン（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｇｕｙｏｎ）、マニュエル・ヴェガ（Ｍａｎｕｅｌ Ｖｅｇａ）、およびリラ・ドリタンティ（Ｌｉｌａ Ｄｒｉｔｔａｎｔｉ）の、標題「ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＣＹＴＯＫＩＮＥＳ ＦＯＲ ＨＩＧＨＥＲ ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ，ＴＨＥ ＣＹＴＯＫＩＮＥＳ ＡＮＤ ＥＮＣＯＤＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ」のＰＣＴ出願国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットに関連している。また、本出願は、２００３年９月８日に出願された米国特許出願第１０／６５８，３５５号明細書、およびリーン・ガンティール（Ｒｅｎｅ Ｇａｎｔｉｅｒ）、シーリー・ギュヨン（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｇｕｙｏｎ）、クルス・ラモス・ヒューゴー（Ｃｒｕｚ Ｒａｍｏｓ Ｈｕｇｏ）、マニュエル・ヴェガ（Ｍａｎｕｅｌ Ｖｅｇａ）およびリラ・ドリタンティ（Ｌｉｌａ Ｄｒｉｔｔａｎｔｉ）の、標題「ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＵＳＩＮＧ ＴＷＯ−ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＳＣＡＮＮＩＮＧ」のＰＣＴ出願国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットに関連している。許可された場合、これら出願の各々の主題は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
非修飾タンパク質および野生型タンパク質とは異なる性質を有する修飾成長ホルモン（ＧＨ）タンパク質を提供する。これらのタンパク質をコードする核酸分子を、修飾成長ホルモンタンパク質を用いた治療および診断の方法として提供する。
臨床使用のために治療用タンパク質を送達することは、製薬科学にとっての課題である。これらのタンパク質は、一旦血流に入ると、代謝、ならびに腎臓における濾過（糸球体）または血中のタンパク質分解などのタンパク質除去に関する通常の経路を用いたクリアランスを含む種々の生理学的過程によって、短時間のうちに循環から継続的に除去される。後者は、経口投与および静脈内または筋肉内注射において治療薬として用いられるタンパク質の半減期に影響を及ぼす制限的過程であることが多い。タンパク質のこれらの投与経路に関連した問題はよく知られており、それらを解決するために種々の戦略が用いられてきた。
その投与および生体同化作用の改善に対する多くの臨床研究と努力の中心となってきたタンパク質ファミリーは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）などのサイトカインファミリーである。ヒト成長ホルモンは、１９１２年にハーベイ・クッシング（Ｈａｒｖｅｙ Ｃｕｓｈｉｎｇ）によって発見された。１９５６年、内分泌学者のモーリス・ラーベン（Ｍａｕｒｉｃｅ Ｒａｂｅｎ）は、このホルモンをヒトおよびサルから単離し、１９５８年に矮小体躯症の子供に注射した。その時以来、バイオ医薬品として承認されたｈＧＨの使用は、２つの時期を経た。１９５８年から１９８５年の第一期の間、ｈＧＨはヒト脳下垂体の抽出物から得られた。ＧＨは熱によって破壊されるため、これらの抽出物は加熱できず、クロイツフェルト−ヤコブ病を引き起こす可能性のある物質などの他の生物学的汚染物質から完全に精製することができない。１９８５年、ＦＤＨは抽出ｈＧＨの使用を禁じた。ｈＧＨの製薬的使用における第２期は、１９８３年にアメリカ議会で可決されたオーファンドラッグ条例の到来と時を同じくした、組換えＤＮＡテクノロジーの出現と共に始まった。組換えＤＮＡに基づいたテクノロジーは、工業的な量において、哺乳動物または細菌の細胞培養物のいずれかから、インビトロで組換えｈＧＨを作製することを可能にした。
ヒトＧＨは、小児成長ホルモン欠乏症、成人成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全、ＡＩＤＳ関連悪液質および短腸症候群などの種々の疾患、障害および病態の治療に承認されている。したがって、成長ホルモンは他のサイトカインと同様に、重要な治療薬である。天然の変異体は、投与、バイオアベイラビリティ、および短い半減期という上記の問題と同様に望ましくない副作用を有することが多い。このように、バイオ治療薬として使用するためにＧＨの性質改善が求められている。したがって、本明細書における目的の中で、治療特性の改善されたＧＨ変異体を提供することが目的の１つである。
概要
非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質安定性の増大を示す修飾成長ホルモン（ＧＨ）が、本明細書で提供される。成長ホルモンの使用は、ヒトおよび他の動物において十分に確立されている。ＧＨの現行の使用法では、血流中および貯蔵条件下での不安定性により、頻回および反復適用が必要である。本明細書に提供される修飾ＧＨは、安定性の改善を示し、それによって、血流中および／または貯蔵条件下での安定性増大などのタンパク質半減期の増加を有する変異体である。このような安定性増大には、プロテアーゼに対する耐性によって評価した安定性および／または耐熱性が含まれる。
本明細書に提供される修飾成長ホルモンポリペプチドは、タンパク質安定性の増大を示す。提供される変異体の中には、非修飾ＧＨポリペプチドに比較して、１つまたは複数のアミノ酸の位置で修飾されているものがある。本明細書に提供される修飾成長ホルモンポリペプチドは、前駆体形態および成熟形態、より長い形態およびより短い形態を含み；修飾は成熟形態に比較して記述される。当業者は、不変残基のアラインメントなどによって、特定のポリペプチド上の対応する位置を容易に決定できる。
非修飾成長ホルモンに比較して、成熟ヒト成長ホルモンの１から５５、５７、５８、６０から６３、６７から８７、８９〜９１、９３、９５から１００、１０２から１２８、１３１から１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１８２、１８４、１８５および１８７から１９１のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置における１つから５つのアミノ酸置換を含有する修飾成長ホルモンポリペプチドが本明細書に提供され、成熟ヒト成長ホルモンは配列番号１で示されるアミノ酸残基の配列を含有する。配列が、配列番号１で示されるポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体およびイソ型が存在することは当然であり、またこのようなポリペプチドは、本明細書に示されるポリペプチドに対応する遺伝子座において修飾できる。修飾成長ホルモンは、配列番号１またはシグナル配列を含む前駆体を示す７１２の非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質安定性の増大を示す。
非修飾成長ホルモンに比較して、成熟ヒト成長ホルモンに対して、１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の位置のいずれかの１つまたは複数において生じる１つまたは複数の単一アミノ酸残基の置換を含有する修飾成長ホルモンポリペプチドが本明細書に提供され、成熟ヒト成長ホルモンは、配列番号１で示されるアミノ酸残基の配列を有し、該修飾成長ホルモンは、配列番号１または７１２で示されるアミノ酸の配列を含有する非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質安定性の増大を示す。
非修飾成長ホルモンに比較して、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を有し、該置換の位置が、配列番号１で示される成熟ヒト成長ホルモンの１３、２７、２８、５４〜５６、５９、６４から６６、７９、８５、８８、９０、９２、９４、１０１、１１４、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３、１４５から１４７、１６１、１８３、１８４および１８６に対応する位置ではない修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。特定の一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質安定性の増大を示す。タンパク質安定性の増大は、血清半減期の増加として現われる。
配列番号１、７１２または７１３で示される成熟ヒト成長ホルモンの１から５５、５７、５８、６０から６３、６７から８７、８９〜９１、９３、９５〜１００、１０２から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１８２、１８４、１８５および１８７から１９１のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置における非修飾成長ホルモンに比較して、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を有する修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。本明細書に提供される特定の一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質安定性の増大を示し、９位が置換される場合は、置換アミノ酸は、プロリンではなく、１４位が置換される場合は、置換アミノ酸は、セリンではなく、１３位または２７位が置換される場合は、置換アミノ酸は、バリンではなく、２８位が置換される場合は、置換アミノ酸は、フェニルアラニンではなく、５４位が置換される場合は、置換アミノ酸は、チロシンではなく、５５位、７９位、８５位または１８４位が置換される場合は、置換アミノ酸は、アラニンではなく、９０位が置換される場合は、置換アミノ酸は、イソロイシンではなく、１１４位または１６１位が置換される場合は、置換アミノ酸は、メチオニンではなく、１２０位または１２６位が置換される場合は、置換アミノ酸は、アルギニンではない。
本明細書に提供される修飾成長ホルモンは、以下の位置の１つまたは複数にアミノ酸置換を含む：成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの１、２、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１９、２０、２３、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４８、５２、５４、６１、７０、７３、７４、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８６、８７、８９、９３、９７、１０３、１０７、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２４、１２５、１２７、１２８、１３９、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７６、１７７、１７８、および１９１位。一実施形態において、該位置としては、成熟ヒト成長ホルモンのＦ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ６、Ｒ８、Ｌ９、Ｆ１０、Ｄ１１、Ｍ１４、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｆ２５、Ｄ２６、Ｙ２８、Ｅ３０、Ｆ３１、Ｅ３２、Ｅ３３、Ｙ３５、Ｐ３７、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｆ４４、Ｌ４５、Ｐ４８、Ｌ５２、Ｆ５４、Ｐ６１、Ｋ７０、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｌ７６、Ｒ７７、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｌ８２、Ｗ８６、Ｌ８７、Ｐ８９、Ｌ９３、Ｆ９７、Ｙ１０３、Ｄ１０７、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｋ１１５、Ｄ１１６、Ｌ１１７、Ｅ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｒ１２７、Ｌ１２８、Ｆ１３９、Ｄ１５３、Ｄ１５４、Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｋ１５８、Ｙ１６０、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｙ１６４、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｍ１７０、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｆ１７６、Ｌ１７７、Ｒ１７８、およびＦ１９１が挙げられる。一実施形態において、位置は以下のように置換される：ＨまたはＱによるＲの置換、Ｈ、ＱまたはＮによるＥの置換、ＱまたはＮによるＫの置換、ＮまたはＱによるＤの置換、ＩまたはＶによるＭの置換、ＡまたはＳによるＰの置換、ＩまたはＨによるＹの置換、ＩまたはＶによるＦの置換、ＨまたはＳによるＷの置換、およびＩまたはＶによるＬの置換。例えば、このような置換としては、Ｆ１Ｉ（すなわち、成熟ヒト成長ホルモン（例えば、配列番号１または７１２）のアミノ酸の１位に対応する位置におけるＩによるＦの置換）、ＦＩＶ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｓ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ６Ｉ、Ｌ６Ｖ、Ｒ８Ｈ、Ｒ８Ｑ、Ｌ９Ｉ、Ｌ９Ｖ、Ｆ１０Ｉ、Ｆ１０Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｄ１１Ｑ、Ｍ１４Ｉ、Ｍ１４Ｖ、Ｌ１５Ｉ、Ｌ１５Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１９Ｈ、Ｒ１９Ｑ、Ｌ２０Ｉ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｆ２５Ｉ、Ｆ２５Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｄ２６Ｑ、Ｙ２８Ｈ、Ｙ２８Ｉ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｎ、Ｆ３１Ｉ、Ｆ３１Ｖ、Ｅ３２Ｑ、Ｅ３２Ｈ、Ｅ３２Ｎ、Ｅ３３Ｑ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｎ、Ｙ３５Ｈ、Ｙ３５Ｉ、Ｐ３７Ａ、Ｐ３７Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｑ、Ｅ３９Ｈ、Ｅ３９Ｎ、Ｋ４１Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｆ４４Ｉ、Ｆ４４Ｖ、Ｌ４５Ｉ、Ｌ４５Ｖ、Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｓ、Ｌ５２Ｉ、Ｌ５２Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｆ５４Ｖ、Ｐ６１Ａ、Ｐ６１Ｓ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｑ、Ｌ７３Ｉ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｑ、Ｅ７４Ｈ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ７５Ｉ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ７６Ｖ、Ｒ７７Ｈ、Ｒ７７Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８２Ｉ、Ｌ８２Ｖ、Ｗ８６Ｈ、Ｗ８６Ｓ、Ｌ８７Ｉ、Ｌ８７Ｖ、Ｐ８９Ａ、Ｐ８９Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｆ９７Ｉ、Ｆ９７Ｖ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｉ、Ｄ１０７Ｎ、Ｄ１０７Ｑ、Ｙ１１１Ｈ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１２Ｑ、Ｌ１１３Ｉ、Ｌ１１３Ｖ、Ｌ１１４Ｉ、Ｌ１１４Ｖ、Ｋ１１５Ｎ、Ｋ１１５Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｉ、Ｌ１１７Ｖ、Ｅ１１８Ｑ、Ｅ１１８Ｈ、Ｅ１１８Ｎ、Ｅ１１９Ｑ、Ｅ１１９Ｈ、Ｅ１１９Ｎ、Ｌ１２４Ｉ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｒ１２７Ｈ、Ｒ１２７Ｑ、Ｌ１２８Ｉ、Ｌ１２８Ｖ、Ｆ１３９Ｉ、Ｆ１３９Ｖ、Ｄ１５３Ｎ、Ｄ１５３Ｑ、Ｄ１５４Ｎ、Ｄ１５４Ｑ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５６Ｖ、Ｌ１５７Ｉ、Ｌ１５７Ｖ、Ｋ１５８Ｎ、Ｋ１５８Ｑ、Ｙ１６０Ｈ、Ｙ１６０Ｉ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６３Ｉ、Ｌ１６３Ｖ、Ｙ１６４Ｈ、Ｙ１６４Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｆ１６６Ｖ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｎ、Ｄ１６９Ｑ、Ｍ１７０Ｉ、Ｍ１７０Ｖ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｎ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｈ、Ｅ１７４Ｎ、Ｆ１７６Ｉ、Ｆ１７６Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｌ１７７Ｖ、Ｒ１７８Ｈ、Ｒ１７８Ｑ、Ｆ１９１ＩおよびＦ１９１Ｖが挙げられる。
他の実施形態において、本明細書に提供される修飾成長ホルモンは、以下の位置の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む：配列番号１に示されるアミノ酸残基の配列を含有する成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの１、２、５、９、１１、１４、１６、２３、２６、３８、４１、４２、７３、７４、８１、８７、１１１、１１２、１１６、１１９、１２４、１２５、１５３、１５６、１５７、１５８、１６２、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７８および１９１位。一実施形態において、該位置としては、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドのＦ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ９、Ｄ１１、Ｍ１４、Ｒ１６、Ｌ２３、Ｄ２６、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ８１、Ｌ８７、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｄ１５３、Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｋ１５８、Ｌ１６２、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｌ１７７、Ｒ１７８およびＦ１９１が挙げられる。例えば、このような置換としては、限定はしないが、Ｆ１Ｉ（すなわち、成熟成長ホルモンのアミノ酸１位に対応する位置におけるＩによるＦの置換）、Ｐ２Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ９Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｍ１４Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８７Ｖ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｅ１１９Ｑ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｄ１５３Ｎ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５７Ｉ、Ｋ１５８Ｎ、Ｌ１６２Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｑ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｎ、Ｅ１７４Ｈ、Ｌ１７７Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｒ１７８ＱおよびＦ１９１Ｉが挙げられる。特定の一実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を有する成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドにおいて、Ｆ１位がＩまたはＶによって置換される場合、Ｐ２位はＡによって置換される。
他の実施形態において、本明細書に提供される修飾成長ホルモンは、以下の位置の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む：配列番号１に示されるアミノ酸残基の配列を含有する成熟ヒト成長ホルモンの６、９、１３、１５、１７、２０、２３、２４、１０５、１１０、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４および１２８位。一実施形態において、該位置としては、成熟ヒト成長ホルモンのＬ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８が挙げられる。一実施形態において、位置は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓおよび／またはＴによって置換される。例えば、このような置換としては、Ｌ６Ｅ（すなわち、成熟成長ホルモンのアミノ酸６位に対応する位置におけるＥによるＬの置換）、Ｌ６Ｄ、Ｌ６Ｋ、Ｌ６Ｒ、Ｌ６Ｎ、Ｌ６Ｑ、Ｌ６Ｓ、Ｌ６Ｔ、Ｌ９Ｅ、Ｌ９Ｄ、Ｌ９Ｋ、Ｌ９Ｒ、Ｌ９Ｎ、Ｌ９Ｑ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ａ１３Ｅ、Ａ１３Ｄ、Ａ１３Ｋ、Ａ１３Ｒ、Ａ１３Ｎ、Ａ１３Ｑ、Ａ１３Ｓ、Ａ１３Ｔ、Ｌ１５Ｅ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｋ、Ｌ１５Ｒ、Ｌ１５Ｎ、Ｌ１５Ｑ、Ｌ１５Ｓ、Ｌ１５Ｔ、Ａ１７Ｅ、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｋ、Ａ１７Ｒ、Ａ１７Ｎ、Ａ１７Ｑ、Ａ１７Ｓ、Ａ１７Ｔ、Ｌ２０Ｅ、Ｌ２０Ｄ、Ｌ２０Ｋ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｎ、Ｌ２０Ｑ、Ｌ２０Ｓ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２３Ｅ、Ｌ２３Ｄ、Ｌ２３Ｋ、Ｌ２３Ｒ、Ｌ２３Ｎ、Ｌ２３Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｔ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ１０５Ｅ、Ａ１０５Ｄ、Ａ１０５Ｋ、Ａ１０５Ｒ、Ａ１０５Ｎ、Ａ１０５Ｑ、Ａ１０５Ｓ、Ａ１０５Ｔ、Ｖ１１０Ｅ、Ｖ１１０Ｄ、Ｖ１１０Ｋ、Ｖ１１０Ｒ、Ｖ１１０Ｎ、Ｖ１１０Ｑ、Ｖ１１０Ｓ、Ｖ１１０Ｔ、Ｌ１１３Ｅ、Ｌ１１３Ｄ、Ｌ１１３Ｋ、Ｌ１１３Ｒ、Ｌ１１３Ｎ、Ｌ１１３Ｑ、Ｌ１１３Ｓ、Ｌ１１３Ｔ、Ｌ１１４Ｅ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｋ、Ｌ１１４Ｒ、Ｌ１１４Ｎ、Ｌ１１４Ｑ、Ｌ１１４Ｓ、Ｌ１１４Ｔ、Ｌ１１７Ｅ、Ｌ１１７Ｄ、Ｌ１１７Ｋ、Ｌ１１７Ｒ、Ｌ１１７Ｎ、Ｌ１１７Ｑ、Ｌ１１７Ｓ、Ｌ１１７Ｔ、Ｉ１２１Ｅ、Ｉ１２１Ｄ、Ｉ１２１Ｋ、Ｉ１２１Ｒ、Ｉ１２１Ｎ、Ｉ１２１Ｑ、Ｉ１２１Ｓ、Ｉ１２１Ｔ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｎ、Ｌ１２４Ｑ、Ｌ１２４Ｓ、Ｌ１２４Ｔ、Ｌ１２８Ｅ、Ｌ１２８Ｄ、Ｌ１２８Ｋ、Ｌ１２８Ｒ、Ｌ１２８Ｑ、Ｌ１２８Ｎ、Ｌ１２８ＳおよびＬ１２８Ｔが挙げられる。
配列番号１に示されるアミノ酸残基の配列を含有する成熟ヒト成長ホルモンの６、９、１３、１５、１７、２０、２３、２４、１０５、１１０、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４および／または１２８位における１つまたは複数の単一アミノ酸置換をさらに有し、１３位が置換される場合、置換アミノ酸はバリンではなく、１１４位が置換される場合、置換アミノ酸はメチオニンではない、上記のいずれかの修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。一実施形態において、該位置としては、Ｌ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８が挙げられる。一実施形態において、位置は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓおよび／またはＴによって置換される。例えば、このような置換としては、Ｌ６Ｅ、Ｌ６Ｄ、Ｌ６Ｋ、Ｌ６Ｒ、Ｌ６Ｎ、Ｌ６Ｑ、Ｌ６Ｓ、Ｌ６Ｔ、Ｌ９Ｅ、Ｌ９Ｄ、Ｌ９Ｋ、Ｌ９Ｒ、Ｌ９Ｎ、Ｌ９Ｑ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ａ１３Ｅ、Ａ１３Ｄ、Ａ１３Ｋ、Ａ１３Ｒ、Ａ１３Ｎ、Ａ１３Ｑ、Ａ１３Ｓ、Ａ１３Ｔ、Ｌ１５Ｅ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｋ、Ｌ１５Ｒ、Ｌ１５Ｑ、Ｌ１５Ｎ、Ｌ１５Ｓ、Ｌ１５Ｔ、Ａ１７Ｅ、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｋ、Ａ１７Ｒ、Ａ１７Ｎ、Ａ１７Ｑ、Ａ１７Ｓ、Ａ１７Ｔ、Ｌ２０Ｅ、Ｌ２０Ｄ、Ｌ２０Ｋ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｎ、Ｌ２０Ｑ、Ｌ２０Ｓ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２３Ｅ、Ｌ２３Ｄ、Ｌ２３Ｋ、Ｌ２３Ｒ、Ｌ２３Ｎ、Ｌ２３Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｔ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ１０５Ｅ、Ａ１０５Ｄ、Ａ１０５Ｋ、Ａ１０５Ｒ、Ａ１０５Ｎ、Ａ１０５Ｑ、Ａ１０５Ｓ、Ａ１０５Ｔ、Ｖ１１０Ｅ、Ｖ１１０Ｄ、Ｖ１１０Ｋ、Ｖ１１０Ｒ、Ｖ１１０Ｎ、Ｖ１１０Ｑ、Ｖ１１０Ｓ、Ｖ１１０Ｔ、Ｌ１１３Ｅ、Ｌ１１３Ｄ、Ｌ１１３Ｋ、Ｌ１１３Ｒ、Ｌ１１３Ｎ、Ｌ１１３Ｑ、Ｌ１１３Ｓ、Ｌ１１３Ｔ、Ｌ１１４Ｅ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｋ、Ｌ１１４Ｒ、Ｌ１１４Ｎ、Ｌ１１４Ｑ、Ｌ１１４Ｓ、Ｌ１１４Ｔ、Ｌ１１７Ｅ、Ｌ１１７Ｄ、Ｌ１１７Ｋ、Ｌ１１７Ｒ、Ｌ１１７Ｎ、Ｌ１１７Ｑ、Ｌ１１７Ｓ、Ｌ１１７Ｔ、Ｉ１２１Ｅ、Ｉ１２１Ｄ、Ｉ１２１Ｋ、Ｉ１２１Ｒ、Ｉ１２１Ｎ、Ｉ１２１Ｑ、Ｉ１２１Ｓ、Ｉ１２１Ｔ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｎ、Ｌ１２４Ｑ、Ｌ１２４Ｓ、Ｌ１２４Ｔ、Ｌ１２８Ｅ、Ｌ１２８Ｄ、Ｌ１２８Ｋ、Ｌ１２８Ｒ、Ｌ１２８Ｑ、Ｌ１２８Ｎ、Ｌ１２８ＳおよびＬ１２８Ｔが挙げられる。
非修飾成長ホルモンに比較して、置換される位置の数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、上記のいずれかの修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。一実施形態において、本明細書に提供される修飾成長ホルモンは、以下の位置の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む：配列番号１に示されるアミノ酸の配列を含有する成熟ヒト成長ホルモンの５６、５９、６４、６５、６６、８８、９２、９４、１０１、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３，１４５、１４６、１４７、１８３、および１８６位。一実施形態において、該位置としては、Ｅ５６、Ｐ５９、Ｒ６４、Ｅ６５、Ｅ６６、Ｅ８８、Ｆ９２、Ｒ９４、Ｌ１０１、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、Ｋ１４５、Ｆ１４６、Ｄ１４７、Ｒ１８３およびＥ１８６位が挙げられる。一実施形態において、位置は以下のように置換される：Ｑ、ＮおよびＨのいずれかによるＥの置換、ＳまたはＡによるＰの置換、ＨまたはＱによるＲの置換、ＩまたはＶによるＬまたはＦの置換、ＱまたはＮによるＫまたはＤの置換、ＨまたはＩによるＹの置換。例えば、このような置換としては、Ｅ５６Ｑ、Ｅ５６Ｎ、Ｅ５６Ｈ、Ｐ５９Ｓ、Ｐ５９Ａ、Ｒ６４Ｈ、Ｒ６４Ｑ、Ｅ６５Ｑ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ６５Ｈ、Ｅ６６Ｑ、Ｅ６６Ｎ、Ｅ６６Ｈ、Ｅ８８Ｑ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８８Ｈ、Ｆ９２Ｉ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｈ、Ｒ９４Ｑ、Ｌ１０１Ｖ、Ｌ１０１Ｉ、Ｅ１２９Ｑ、Ｅ１２９Ｎ、Ｅ１２９Ｈ、Ｄ１３０Ｑ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｓ、Ｐ１３３Ａ、Ｒ１３４Ｈ、Ｒ１３４Ｑ、Ｋ１４０Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｙ１４３Ｈ、Ｙ１４３Ｉ、Ｋ１４５Ｑ、Ｋ１４５Ｎ、Ｆ１４６Ｉ、Ｆ１４６Ｖ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｎ、Ｒ１８３Ｈ、Ｒ１８３Ｑ、Ｅ１８６Ｑ、Ｅ１８６ＮおよびＥ１８６Ｈが挙げられる。
一実施形態において、上記の修飾成長ホルモンはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。特定の一実施形態において、アミノ酸置換は、ヒト下垂体成長ホルモンまたはヒト胎盤成長ホルモンにおいてなされる。あるいは、上記の修飾成長ホルモンは非ヒト成長ホルモンである。
１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１または２２２のアミノ酸長を有する修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。他の実施形態において、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９または１９０のアミノ酸長を有する修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
一実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１に示される成長ホルモン配列においてなされる。他の実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号７１２に示される前駆体成長ホルモン配列においてなされる。１つまたは複数のアミノ酸置換が、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または天然アミノ酸と非天然アミノ酸の組み合わせである修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
修飾成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドおよび修飾前駆体ヒト成長ホルモンポリペプチドが本明細書に提供される。
一定の実施形態において、該修飾成長ホルモンは、裸のポリペプチド鎖である。
該成長ホルモンが、ペギル化、アルブミン化、グリコシル化されているか、または他の化学的方法で処置されている修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
１つまたは複数の偽野生型変異をさらに有する修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。特定の一実施形態において、偽野生型変異は、非修飾成長ホルモンのアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせであり得る。
一態様において、該修飾成長ホルモンは、耐タンパク質分解性として現れる安定性の増加を示す。一定の実施形態において、耐タンパク質分解性の増大は、プロテアーゼに曝露された際に、血清、血液、唾液、消化液において、またはインビトロで生じる。一実施形態において、耐タンパク質分解性の増大は、修飾成長ホルモンが経口投与された場合、または消化管に存在する場合に、該修飾成長ホルモンによって示される。プロテアーゼは、例えば、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢ、トリプシン、トリプシン（Ａｒｇブロック）、トリプシン（Ｌｙｓブロック）、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、臭化シアン、ヨードゾベンゾエート、ミクソバクターＰ．、アルミラリア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）、管腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼおよびヒドロラーゼの１つまたは複数であり得る。一実施形態において、該修飾ポリペプチドは、タンパク質分解に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％より耐性である。
プロテアーゼがゼラチナーゼＢである一実施形態において、該修飾ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎにおける開裂に対して耐性である。一態様において、該修飾ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎの後で開裂できる。他の態様において、該ポリペプチドは、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎの各々の残基、またはそれらの組み合わせにおいて修飾でき、そのことによって、該修飾ペプチドを、ゼラチナーゼＢによりさらに耐タンパク質分解性にする。一実施形態において、該修飾ポリペプチドは、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎの各々の残基、またはそれらの組み合わせにおいて、ゼラチナーゼＢによるタンパク質分解に対して、少なくとも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％より耐性である。一実施形態において、プロテアーゼに対する耐性は、本明細書に記載されたアッセイのいずれかによって経験的に試験することができる。
一態様において、該修飾成長ホルモンは、耐熱性の増大として現れる安定性の増加を示す。一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、約２０℃から約４５℃の温度における耐熱性を増大させる。一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、対象の体温における耐熱性を増大させる。特定の一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、約３７℃の温度における耐熱性を増大させる。
一態様において、該修飾成長ホルモンは、インビボまたはインビトロでの半減期の増大として現れる安定性の増加を示す。一実施形態において、安定性の増加は、対象に投与した際の半減期の増大として現れる。該修飾成長ホルモンの半減期（血清安定性）は、非修飾成長ホルモンの半減期に比較して、１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、および少なくとも５００％、またはそれ以上などの量で増加し得る。他の実施形態において、該修飾成長ホルモンの半減期（血清安定性）は、非修飾成長ホルモンの半減期に比較して、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、および１０００倍、またはそれ以上などの量で増加し得る。
一態様において、該修飾成長ホルモンは、非修飾成長ホルモンと比較して、生物活性の増加を示す。他の態様において、該修飾成長ホルモンは、非修飾成長ホルモンに比較して、生物活性の低下を示す。一実施形態において、生物活性は、インビトロでの細胞増殖を測定することによって評価される。一定の実施形態において、該修飾成長ホルモンは、成長ホルモン受容体に結合する。
非修飾成長ホルモンと比較して、耐タンパク質分解性の増大を示し、かつ耐熱性の低下を示す修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
非修飾成長ホルモンと比較して、耐熱性の増加を示し、かつ耐タンパク質分解性の低下を示す修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
本明細書に記載された修飾成長ホルモンのいずれかの２つ以上を有するライブラリーが本明細書に提供される。
本明細書に記載された修飾成長ホルモンをコードするヌクレオチドの配列を含有する核酸分子が本明細書に提供される。本明細書に記載された複数の分子を有する核酸分子のライブラリーが本明細書に提供される。
本明細書に記載された核酸分子を含有するベクターが本明細書に提供される。本明細書に記載された核酸分子またはベクターを担持する細胞が本明細書に提供される。一実施形態において、該細胞は真核生物細胞、原核生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などである。また、複数のベクターを有するライブラリーが本明細書に提供される。
ｉ）核酸またはベクターを細胞内に導入すること、およびｉｉ）コードされた修飾成長ホルモンが発現する条件下で該細胞を培養すること、を含むステップを有する修飾成長ホルモン発現方法が本明細書に提供される。一実施形態において、該ベクターは、真核生物細胞、原核生物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などの中で存在する。一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、グリコシル化される。一実施形態において、該細胞は真核生物細胞である。
導出した予め決められた性質または活性を有する修飾標的タンパク質を作製する方法が本明細書に提供され、該方法は、ａ）導出標的タンパク質と、予め決められた性質または活性を有する本明細書に記載された修飾成長ホルモンとの間の構造的に相同な座を同定することによって、ｉｓ−ＨＩＴ標的アミノ酸が決定される、標的タンパク質上のアミノ酸置換の際に、導出した予め決められた性質または活性の提供ができる１つまたは複数のｉｓ−ＨＩＴ標的アミノ酸を選択するステップ；ｂ）各標的タンパク質上にただ１つのアミノ酸置換が生じる、導出した予め決められた性質または活性の提供ができるアミノ酸置換により、各標的アミノ酸を置換し、候補ｌｅａｄタンパク質を形成するステップ；ｃ）アドレス可能なアレイに含有させた細胞において、核酸分子から各候補ｌｅａｄタンパク質を発現させるステップ；およびｄ）各候補ＬＥＡＤタンパク質をアッセイして、非修飾タンパク質とは異なる、予め決められた性質または活性を有する１つまたは複数のタンパク質を同定し、そのことによって、ＬＥＡＤである導出標的タンパク質を同定するステップ、を含む。一実施形態において、該方法は、さらに、ｅ）導出タンパク質と修飾成長ホルモンとの３次元構造を比較して、それらの主鎖間の高一致領域、構造的に相同な領域として指摘されたを領域を同定するステップ；およびｆ）修飾成長ホルモンの構造的に相同な領域内の構造的に関連したｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置に対応する導出タンパク質上のｉｓ−ＨＩＴに構造的相同な座を同定するステップ、を含む。一実施形態において、予め決められた性質または活性は、タンパク質安定性、インビボでのタンパク質半減期、耐熱性または耐タンパク質分解性である。上記の方法によって産生された修飾サイトカインが本明細書に提供される。
本明細書に記載された方法のいずれかによって産生された修飾成長ホルモンポリペプチドが本明細書に提供される。
配列番号２〜６９、７５、７６、８５〜１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３〜１５４、１６４、１６５、１７６〜２１６、２２２〜３５１に示されたアミノ酸の配列のいずれか、またはその生物活性部分を有する修飾成長ホルモンが本明細書に提供される。
本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドのいずれかを含む製薬組成物が本明細書に提供される。製薬組成物は、さらに、結合剤、増量剤、滑剤、崩壊剤および湿潤剤などの製薬的に許容できる賦形剤を含むことができる。
該製薬組成物は、経口、経鼻、または肺投与用に製剤化できる。特定の一実施形態において、該製薬組成物は、経口投与用に製剤化される。製薬製剤における製薬組成物中の修飾成長ホルモンは、野生型サイトカインに比較して、唾液への曝露、胃腸管内のプロテアーゼへの曝露、および低ｐＨ条件への曝露から選択された条件下で、半減期の増加を示す。
修飾成長ホルモンポリペプチドが本明細書における製薬組成物に提供され、該修飾としては、タンパク質分解性消化部位の除去またはタンパク質構造の安定性増大が挙げられる。製薬組成物における該修飾成長ホルモンは、タンパク質半減期または胃腸管内のバイオアベイラビリティの増加を示す。タンパク質半減期（血清安定性）は、野生型タンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、またはそれ以上の量で増加し得る。あるいは、タンパク質半減期は、野生型タンパク質に比較して、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上の量で、増加し得る。
１つまたは複数のプロテアーゼの存在下、タンパク質の半減期（血清安定性）の増加が、本明細書に提供される。一実施形態において、該修飾成長ホルモンの生物活性が、野生型成長ホルモンに比較して増加される。
タンパク質の半減期は、限定はしないが、唾液への曝露、胃腸管内のプロテアーゼへの曝露、および低ｐＨ条件（例えば、胃）への曝露などの１つまたは複数の条件への曝露後に増加し得る。
ボーマン・バーク阻害剤、結合ボーマン・バーク阻害剤、アプロチニンおよびカモスタットなどのプロテアーゼ阻害剤を使用せずに調製される製薬組成物が本明細書に提供される。
液剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤などの剤形で経口投与されるために製剤化される製薬組成物が本明細書に提供される。一実施形態において、該丸剤または錠剤は、咀嚼できる。胃実施形態において、該丸剤または錠剤は、舌上または口腔中の唾液に曝露された際に溶解する。一実施形態において、カプセル剤中の該製薬組成物は液体形態にある。一実施形態において、該製薬組成物が液体の場合、該液体は例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり得る。
修飾成長ホルモンポリペプチドの放出制御のために製剤化された製薬組成物が、本明細書に提供される。このような一実施例において、該製薬組成物は、錠剤または舐剤の形態である。舐剤は、該修飾成長ホルモンを、口腔の粘膜、咽喉の粘膜または胃腸管に送達する。また、該舐剤は、中でも、無水結晶質マルトースおよびステアリン酸マグネシウムなどの賦形剤と共に製剤化できる。
保護的化合物なしで製剤化された製薬組成物が本明細書に提供される。このような一実施形態において、該修飾成長ホルモンは、腸のプロテアーゼに対して抵抗性を示す。
製薬組成物は、さらに、懸濁化剤、乳化剤、非水媒体、および／または保存剤などの１つまたは複数の製薬的に許容できる添加剤と共に製剤化できる。
本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子、または本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を有するベクター、および製薬的に許容できる賦形剤の製薬組成物が本明細書に提供される。
成長ホルモン媒介の疾患または病態に罹っている対象を、本明細書に記載された製薬組成物のいずれかを投与することによって治療する方法が、本明細書に提供される。
成長ホルモン媒介の疾患または病態に罹っている対象を、本明細書に記載された製薬組成物の１つを投与することによって治療する方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、成長ホルモン媒介の疾患または病態としては、限定はしないが、成長欠乏障害、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の障害性免疫機能、異化作用病、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、クローン病などの慢性炎症障害または栄養障害、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛が挙げられる。特定の実施形態において、成長欠乏障害は、ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群、およびサラセミアの中から選択できる。一実施形態において、対象の症状が寛解または除去される。
限定はしないが、パッケージング材料、および該パッケージング材料内に含有された本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドの製薬組成物などの製品が本明細書に提供される。特定の一実施形態において、製品内にパッケージされた製薬組成物は、成長ホルモン媒介の疾患または病態の治療に有効であり、該パッケージング材料は、該修飾成長ホルモンが成長ホルモン媒介の疾患または病態の治療に使用されることを示すラベルを含む。
成長ホルモンの投与によって治療される疾患または病態に罹っている対象の治療用薬剤を調製するために、本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドの製薬組成物の使用が本明細書に提供される。前記使用の一実施形態において、成長ホルモンの疾患または病態としては、限定はしないが、成長欠乏障害、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の障害性免疫機能、異化作用病、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、クローン病などの慢性炎症障害または栄養障害、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛が挙げられる。前記使用の特定の一実施形態において、成長欠乏障害は、ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群、およびサラセミアの中から選択できる。
本明細書に記載された修飾成長ホルモンポリペプチドの製薬組成物、修飾成長ホルモンポリペプチドを投与するためのデバイス、および任意に投与の説明書を含むキットが本明細書に提供される。
成長ホルモンの投与によって治療される疾患または病態に罹っている対象の治療用薬剤の剤形化のための、本明細書に提供された修飾成長ホルモンポリペプチドのいずれかの使用が本明細書に提供される。成長ホルモンの投与によって治療される疾患または病態に罹っている対象の治療のための、本明細書に提供された製薬組成物の使用が本明細書に提供される。一実施形態において、該疾患または病態は、成長欠乏障害、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の障害性免疫機能、異化作用病、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、クローン病などの慢性炎症障害または栄養障害、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛が挙げられる。一態様において、成長欠乏障害は、ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群、およびサラセミアのいずれかである。

図面の簡単な説明
図１は、太字で示したタンパク質分解に感受性のアミノ酸を有する成熟野生型ヒト成長ホルモンの配列を示す図である。
図２は、ｉｓ−ＨＩＴに関する候補置換性アミノ酸の同定に用いられる「点受容変異」（ＰＡＭ２５０）マトリクスを示す図である。元のアミノ酸は横軸に、置換性アミノ酸は縦軸に示されている。同一残基に与えられた値は、灰色の四角で示されている。マトリクスにおける最高値は、黒色の四角で示されており、２つの残基間の置換の最高の発生に対応している。
図３は、代表的な修飾成長ホルモン変異体の活性曲線を示す図である。
詳細な説明
概要
Ａ．定義
Ｂ．成長ホルモン
１．成長ホルモンの構造
２．成長ホルモン受容体との相互作用
３．バイオ医薬品としての成長ホルモン
Ｃ．成長ホルモンを修飾する代表的方法
１．１Ｄスキャニング
２．３Ｄスキャニング
３．２Ｄスキャニング（制限的合理的変異誘発）
ａ．インシリコＨＩＴの同定
ｂ．置換アミノ酸の同定
ｃ．修飾ポリペプチドの構築および生物学的アッセイ
Ｄ．修飾成長ホルモンポリペプチド
１．タンパク質分解部位の除去による耐タンパク質分解性の増大
ａ．タンパク質分解部位の除去により修飾された成長ホルモンポリペプチドの性質
ｂ．タンパク質分解部位の除去により修飾された成長ホルモンポリペプチドの作出
ｃ．さらなる修飾成長ホルモンポリペプチド
ｄ．耐タンパク質分解性の増大による成長ホルモン変異体の評価
２．耐熱性の増大
ａ．耐熱性修飾成長ホルモンポリペプチドの性質
ｉ．分子内結合の創出
ｉｉ．らせん間極性相互作用の増加
ｂ．耐熱性修飾成長ホルモンポリペプチドの評価
３．超ＬＥＡＤおよびさらなる成長ホルモン修飾
Ｅ．修飾成長ホルモンポリペプチドの作製
１．発現系
ａ．原核生物発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫および昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
２．精製
３．融合タンパク質
４．ポリペプチド修飾
５．ヌクレオチド配列
Ｆ．修飾成長ホルモン活性（１つまたは複数）の評価
１．インビトロアッセイ
２．非ヒト動物モデル
３．臨床アッセイ
Ｇ．剤形化／投与
Ｈ．治療的使用
１．成長欠乏
２．悪液質
３．抗老化
４．腎性骨ジストロフィー
５．膵臓線維症
６．他の病態
Ｉ．製品およびキット
Ｊ．実施例
Ａ．定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられる専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に認識されているのと同じ意味を有する。本明細書全体の開示を通して引用された全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、ウェブサイトおよび他の出版物は、別に記述されない限り、参照としてそれらの全体が援用されている。本明細書における用語に関して複数の定義がある場合、この節における定義が優先される。ＵＲＬまたは他のこのような識別子またはアドレスの引用がなされる場合、このような識別子は変わることがあり得、また、インターネット上での特定の情報の出入りがあり得るが、インターネットの探索によって等価な情報を見出すことができることは当然である。それらの引用は、このような情報の入手可能性および一般的普及の証拠となる。
本明細書に用いられる「成長ホルモン」ポリペプチド（本明細書ではＧＨとも称される）とは、限定はしないが、下垂体および胎盤の組織などの組織における細胞から抽出された、限定はしないが、組換え作製されたポリペプチド、合成的に作製されたポリペプチドおよびＧＨなどの任意のＧＨポリペプチド（タンパク質）を言う。ＧＨポリペプチドとしては、シグナル配列および成熟成長ホルモンポリペプチドを有する前駆体成長ホルモンポリペプチドが挙げられる。ＧＨポリペプチドとしては、限定はしないが、ヒトおよび非ヒト動物源などの種々の種の関連ポリペプチドが挙げられる。ＧＨポリペプチドアミノ酸配列は、種々の数のアミノ酸残基を含有し得る。例えば、ＧＨポリペプチドは、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、および２２２またはそれ以上のアミノ酸を有し得る。また、ＧＨポリペプチドは、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、または１９０のアミノ酸など、１９１のアミノ酸より短いこともあり得、該ポリペプチドは、成熟ＧＨポリペプチドの活性を保持する。ヒトＧＨ（ｈＧＨ）としては、ＧＨ、個体内または種内の対立遺伝子変異イソ型、核酸からの合成分子、ヒトの組織および細胞から単離されたタンパク質、非ヒトの組織および細胞から単離されたタンパク質、およびそれらの修飾形態が挙げられる。代表的なｈＧＨ配列は、配列番号１、７１２および７１３で示される。代表的な成熟ｈＧＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１で示される。代表的な前駆体成長ホルモンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７１２および７１３で示される。このような前駆体ポリペプチドのシグナルペプチドは、２６のアミノ酸長である。個体および種の中の対立遺伝子変異体に加えて、胎盤から単離されたいくつかのイソ型（配列番号７１３）および下垂体から単離されたイソ型（配列番号７１２）が存在する。また、ヒトＧＨには、機能的に活性である上で十分な長さのＧＨ断片が含まれる。ＧＨの修飾形態の機能性を判定するサイトカインアッセイが通常の当業者に知られている。任意に、ｈＧＨは、配列番号１、７１２および７１３で示されるアミノ酸配列に比較して、以下の変異体：Ｐ６Ｓ、Ｈ２２Ｄ、Ｇ３４Ｎ、またはＡ１２７Ｖを有さない。非ヒト源の代表的なＧＨポリペプチドとしては、限定はしないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ラット、ウサギ、ウマ、霊長類および鳥類のＧＨポリペプチドが挙げられる。代表的な非ヒト成長ホルモン配列は、配列番号７１４および７１５で示される。非ヒトＧＨには、ＧＨ、対立遺伝子変異イソ型、核酸からの合成分子、非ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、およびそれらの修飾形態が含まれる。また、非ヒトＧＨには、機能的に活性である上で十分な長さのＧＨ断片が含まれる。ＧＨの修飾形態の機能性を判定するサイトカインアッセイが通常の当業者に知られている。
本明細書に用いられる、ＧＨポリペプチド（タンパク質）の「活性」または「性質」とは、評価し得るＧＨタンパク質によって示される活性または性質を言う。このような活性としては、限定はしないが、耐タンパク質分解性、耐熱性、半減期の増加および細胞増殖活性が挙げられる。
本明細書に用いられる「耐タンパク質分解性」とは、同一の条件下、同一のプロテアーゼによる非修飾ポリペプチドの開裂に比較して、該プロテアーゼによる修飾ポリペプチドの標的アミノ酸残基の開裂の何らかの量の減少を言う。耐タンパク質分解性の増大を示す修飾ポリペプチドは、タンパク質分解に対して、非修飾ポリペプチドよりも、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、．．．２０％、．．．３０％、．．．４０％、．．．５０％、．．．６０％、．．．７０％、．．．８０％、．．．９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい耐性を示す。
「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」または「ペプチダーゼ」は、交換可能に用いられ、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を称する。「セリンプロテアーゼ」に関する機構は、セリンによる標的ペプチド結合の求核性攻撃に基づく。アスパルテートまたは金属に結合したシステイン、トレオニンまたは水分子もまたこの役割を演じることができる。セリン、ヒスチジンおよびアスパルテートの整列した側鎖はほとんどのセリンプロテアーゼに共通した触媒的三連構造を構成する。セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、該酵素の活性中心におけるセリン残基の存在を特徴とするペプチダーゼの１クラスを構成している。セリンプロテアーゼは、血液凝固、炎症ならびに原核生物と真核生物双方における消化酵素など、体内の広範囲の機能に寄与する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂溝の形状である。アミノ酸残基は、ポリペプチド基質（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．Ｐｊ）ならびにそれらそれぞれの結合サブ部位（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）のＮからＣの語で標識化される。該開裂はＰ１とＰ１’の間で触媒される。
本明細書に用いられる「ＧＨポリペプチドの一部」とは、該完全長ポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を示す任意の部分を言う。
本明細書に用いられる「天然成長ホルモン」とは、天然の生物によって産生される成長ホルモンを言う。例えば、ヒトは下垂体成長ホルモンおよび胎盤成長ホルモンを産生する。代表的な天然ヒト下垂体成長ホルモンおよび胎盤成長ホルモンは、配列番号１、７１２および７１３で示される。哺乳動物などの他の動物は、例えば、ウシ天然成長ホルモン、例えば、配列番号７１４、およびアカゲザル天然成長ホルモン、例えば、配列番号７１５などの天然成長ホルモンを産生する。
本明細書に用いられる「成長ホルモン媒介疾患、障害または病態」とは、成長ホルモンによる治療が、該疾患または障害の何らかの症状または発現を寛解させる任意の疾患または障害を言う。代表的な成長ホルモン媒介疾患および障害としては、限定はしないが、成長欠乏障害（ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群、およびサラセミアなど）、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の障害性免疫機能、異化作用病、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、慢性炎症障害または栄養障害（クローン病など）、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛が挙げられる。
本明細書に用いられる「成長ホルモン欠乏」は、正常な成長、発達および／または代謝にとって必要な量よりも低いまたは不十分な量の天然成長ホルモンしか対象が産生しない任意の疾患、障害または病態である。成長ホルモン欠乏は、より高次の脳、視床下部、または下垂体におけるＧＨ軸の破損から生じ得る。この機能不全は、先天性でもあり得るし、後天性でもあり得る。先天的成長ホルモン欠乏は、下垂体異常（ＭＲＩで見られる）に関連し得るか、または他の下垂体欠乏、視神経形成不全、および透明中隔の不在を含み得る視中隔形成異常（ド・モルジャー（ｄｅ Ｍｏｒｓｉｅｒ）症候群）などの症候群の一部であり得る。一方、後天性成長ホルモン欠乏は、外傷、感染（例えば、脳炎、髄膜炎）、頭部放射線照射（ソマトトロビンは下垂体中で最も放射線照射に鋭敏な細胞のようである）、および／または他の全身性疾患（例えば、組織球症）から生じ得る。
本明細書に用いられる「治療」は、病態、障害または疾患の症状が寛解するか、または他の場合、有利に変化する任意の様式を意味する。治療はまた、本明細書に提供される修飾成長ホルモンおよび組成物の任意の薬剤的使用を包含する。
疾患または病態を有する対象を「治療すること」によって、治療後に患者の症状が部分的にまたは全体的に軽減するか、または静的に留まることが意味される。治療された対象は、症状の部分的または全体的な軽減を示す。したがって、治療は予防、療法および／または治癒を包含する。治療はまた、本明細書に提供される修飾成長ホルモンおよび組成物の任意の薬剤的使用を包含する。
本明細書に用いられる語句の「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、薬剤、化合物、材料、またはある化合物の組成物の量が、所望の治療効果（例えば、疾患症状の寛解）を生じる上で有効な量であることを意味する。
当該方法によって治療される「患者」または「対象」は、哺乳動物（すなわち、ヒトまたは非ヒト動物）を意味する。一実施形態において、哺乳動物は、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サルなど）、家畜（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ）、または齧歯類（例えば、マウスまたはラット）などであり得る。特に、哺乳動物はヒトである。
本明細書に用いられる「指向化された導出方法」とは、天然タンパク質、合成タンパク質またはタンパク質ドメインなどのタンパク質を、異なるまたは既存の、天然または人口的、化学的または生物学的環境において作用する、および／または新たな機能を誘導する、および／または所与の活性を増大または減少させる、および／または所与の特徴を調節する能力などの割合を変化させるように、「調整する」方法を言う。代表的な指向化導出方法は、他の中でも、米国特許出願第１０／０２２，２４９号明細書；および米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書に記載された合理的指向化導出方法が挙げられる。
本明細書に用いられる「二次元合理的変異誘発スキャニング（２Ｄスキャニング）」とは、特定のタンパク質配列の二次元がスキャンされ、（１）第１の次元は、異なるアミノ酸によって置換される、タンパク質配列に沿った特定のアミノ酸残基を同定するための、ｉｓ−ＨＩＴ標的位と称されるものであり、（２）第２の次元は、特定のｉｓ−ＨＩＴ標的を置換するために選択される、置換性アミノ酸と称されるアミノ酸タイプである、本明細書に提供される処理を言う。
本明細書に用いられる「インシリコ」とは、コンピュータを用いて実施される調査および実験を言う。インシリコ法としては、限定はしないが、分子モデリング試験および生体分子ドッキング実験が挙げられる。
本明細書に用いられる「ｉｓ−ＨＩＴ」とは、ｉ）導出する特定のタンパク質の性質、ｉｉ）タンパク質のアミノ酸配列、および／またはｉｉｉ）個々のアミノ酸の既知の性質に基づいて同定された、標的タンパク質配列に沿った、インシリコ同定されたアミノ酸位置を言う。タンパク質配列上のこれらのｉｓ−ＨＩＴ座は、実験的生物学的方法を使用せずに同定される。例えば、一旦、最適化されるべきタンパク質の特徴が選択されたら、異なるアミノ酸による置換によってタンパク質適合性の改善が可能なアミノ酸位置を判定するために、多様な情報源または以前の知見（例えば、タンパク質の一次、二次または三次構造、文献、特許）が探索される。このステップでは、「インシリコ」のタンパク質分析が利用される。導出される特徴に関与し得る、標的タンパク質の一次配列に沿った全ての可能な候補アミノ酸位置が、本明細書において、「インシリコＨＩＴ」（「ｉｓ−ＨＩＴ」）と称される。このステップの間に同定された全てのｉｓ−ＨＩＴのライブラリー（コレクション）が、本明細書に提供される二次元スキャニング法の第１の次元（標的残基位置）となる。
ｉｓ−ＨＩＴ同定の文脈において、本明細書に用いられる「予め決定された導出性質または導出活性の提供を受け入れることができる」とは、置換された場合に、導出される所望の活性を生じると思われる性質または特徴を有することが、インシリコ分析に基づいて考えられる、タンパク質上のアミノ酸位置を言う。置換アミノ酸同定の文脈において、「予め決定された導出性質または導出活性の提供を受け入れることがができる」という語句は、非修飾出発タンパク質における元のアミノ酸の置換に用いられた場合に、導出される所望の活性を生じると思われる性質または特徴を有することが、インシリコ分析に基づいて考えられる、特定のアミノ酸タイプを言う。
本明細書に用いられる「ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）」とは、対象となっているものの構造を同定するために、またはそれらを含有する変異タンパク質または細胞と相互作用する試験化合物を同定するために、対象となっているタンパク質をコードする核酸を含有する試験タンパク質または細胞のサンプルなどの大量のサンプルを試験する処理を言う。ＨＴＳ操作は、自動化を受け入れることができ、典型的には、サンプル調製、アッセイ操作およびその後の大量のデータ処理を扱うために、コンピュータ化されている。
アミノ酸置換および／または置換アミノ酸の同定に関して選択されたタンパク質配列に沿ったｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置の同定の文脈で用いられる場合、本明細書に用いられる用語の「制限された」とは、アミノ酸置換のために、タンパク質主鎖上の全てのアミノ酸より少ないアミノ酸；および／または非修飾出発タンパク質に存在する元のアミノ酸の置換に利用できる残りの１９のアミノ酸全てよりも少ないアミノ酸、が置換のために選択されることを意味する。本明細書に提供される方法の特定の実施形態において、タンパク質主鎖上の全てのアミノ酸より少ないアミノ酸がアミノ酸置換のために選択されるように、ｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置は制限される。他の実施形態において、置換性アミノ酸は、非修飾出発タンパク質に存在する天然アミノ酸の置換に利用できる残りの１９のアミノ酸全てよりも少ないアミノ酸が置換性アミノ酸として選択されるように、置換性アミノ酸が制限される。代表的な一実施形態において、タンパク質主鎖上の全てのアミノ酸より少ないアミノ酸が、アミノ酸置換のために選択され、かつ、天然アミノ酸の置換に利用できる残りの１９のアミノ酸全てよりも少ないアミノ酸が、置換のために選択されるように、ｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置を同定するためのスキャンと置換性アミノ酸の双方が制限される。
本明細書に用いられる「候補ＬＥＡＤ」は、変更が求められている何らかの属性的、化学的、物理的または生物学的性質における変更を有する可能性があると考えられる変異タンパク質である。本明細書における方法では、候補ＬＥＡＤは一般に、あるタンパク質またはそのドメインにおけるｉｓ−ＨＩＴ座を、典型的には、ＰＡＭ分析を用いて得られるような、残りの１９のアミノ酸の制限されたサブセットまたは全てによって、系統的に置換することによって作製される。候補ＬＥＡＤは、本明細書におけるハイスループット法によって試験された、当業者に知られている他の方法によっても作製できる。
本明細書に用いられる「ＬＥＡＤ」は、特定の属性的、化学的、物理的または生物学的性質に関して、その活性が最適化されるか、または改善されることが証明された「候補ＬＥＡＤ」である。本明細書における目的に関して、「ＬＥＡＤ」は、対象となっている機能に関して、非修飾および／または野生型（天然）タンパク質と、典型的に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上異なる活性を有する。一定の実施形態において、活性における変化は、非修飾標的タンパク質の活性の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％である。他の実施形態において、活性における変化は、非修飾標的タンパク質の活性の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％以下である。さらに他の実施形態において、活性における変化は、非修飾標的タンパク質の活性の少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上である。活性の増大または減少のいずれかであり得る所望の変化は、対象となっている機能または性質に依存する（例えば、約１０％、約２０％など）。ＬＥＡＤは、「超ＬＥＡＤ」を作製するために、同一のタンパク質分子上の「ｉｓ−ＨＩＴ」標的位置の複数（２以上）の置換によって、さらに最適化できる。
本明細書に用いられる用語の「超ＬＥＡＤ」とは、２つ以上のＬＥＡＤ分子に存在する単一変異を、単一タンパク質分子内に組み合わせることによって得られるタンパク質変異体（変異形）を言う。したがって、本明細書に提供される修飾タンパク質の文脈において、語句の「１つまたは複数の単一アミノ酸置換を含んでなるタンパク質」は、それぞれのタンパク質に関して、本明細書に記載された変異の２つ以上の任意の組み合わせを包含する。例えば、本明細書に提供される、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を有する修飾タンパク質は、開示された置換位置における、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸置換の任意の組み合わせを有し得る。超ＬＥＡＤ変異分子のコレクションが作出され、試験され、アドレス可能なアレイにおいて、１つずつ表現型に関して特性化される。超ＬＥＡＤ変異分子は、種々の数およびタイプのＬＥＡＤ変異を含有する。導出される特定の特徴に関して、さらに改善された適合性を示す分子が超ＬＥＡＤと称される。超ＬＥＡＤは、当業者に知られている他の方法によっても作製でき、本明細書に記載されたハイスループット法によって試験することができる。超ＬＥＡＤは、対象となっている機能に関して、誘導されるＬＥＡＤ変異体の少なくとも１つの、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上などの所望の量で、ＬＥＡＤの改善された活性と異なる活性を典型的に有する。ＬＥＡＤと同様に、超ＬＥＡＤに関する活性の変化は、「導出される」活性に依存する。活性の増大または減少のいずれかであり得る所望の変化は、対象となっている機能または性質に依存する。
本明細書に用いられる、修飾成長ホルモンが非修飾成長ホルモンに比較して、抗炎症活性（または別の活性）よりも大きな増殖活性（または他の活性）を有するという言及は、非修飾または天然の形態に比較して、各活性の変化の絶対値を比較している。
本明細書に用いられる語句の「変化した座」とは、異なる置換アミノ酸によって置換され、所望の変化した表現型または活性を生じるＬＥＡＤまたは超ＬＥＡＤにおけるｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置を言う。
本明細書に用いられる「曝露された残基」は、残基表面の１５％超が溶媒に曝露されていることを示す。
本明細書に用いられる語句の「構造的相同性」とは、２つ以上のタンパク質主鎖間のスペースにおける一致の程度を言う。同一のタンパク質構造、折りたたみを採用し、スペースにおける三次元構造の重ね合わせの際に類似性を示すタンパク質主鎖は、構造的に相同性であると考えることができる。構造的相同性は、配列相同性ではなくて、三次元相同性に基づいている。２つの異なるタンパク質間の構造的相同性に基づいて相同性であると言われるこれらタンパク質における２つのアミノ酸は、必ずしも、配列に基づいた相同性領域に存在する必要はない。例えば、互いの間の所与のスペース位置または確定領域において、３．５、３．０、２．５、２．０、１．７または１．５オングストローム（Å）未満の平方自乗平均（ＲＭＳ）偏差を有するタンパク質主鎖は、その領域において、構造的に相同性であると考えることができ、それらの主鎖間に「高い一致」を有すると言われる。ある一定の程度の構造的相同性を共有する２つ以上の異なるタンパク質配列上に位置している実質的に等価な（例えば、「構造的に関連した」）アミノ酸位置は、本明細書では、同等の機能的任務を有していると考えられ、やはり、「構造的に相同性の座」であると、本明細書において言われる。そして、これら２つのアミノ酸は、これらの配列をアラインさせた際、該アミノ酸配列上の正確な一次線状位置が互いに対合しないとしても、互いに構造的に類似であるか、または構造的に関連していると言うことができる。構造的の関連しているアミノ酸は、これらの配列を古典的な配列相同性の規則に従ってアラインさせた際、遠くに離れている場合もあり得る。本明細書に用いられる「構造的相同体」は、構造的相同性によって作製されるタンパク質である。
本明細書に用いられる「非修飾標的ポリペプチド」、「非修飾ポリペプチド」、「非修飾サイトカイン」、「非修飾ＧＨ」、「非修飾成長ホルモン」またはそれらの文法的変型は、本明細書に提供される方法を用いて修飾に関して選択される出発ポリペプチド（タンパク質）を言う。出発非修飾標的ポリペプチドは、天然の、野生型のタンパク質であり得る。また、出発非修飾標的ポリペプチドは、天然の野生型イソ体とは異なってはいるが、それにも関わらず、後に本明細書で作製される修飾ポリペプチドに比較して、出発非修飾標的ポリペプチドと称されるように、先に変化させるか、または変異させることができる。このように、非修飾参照タンパク質に比較して、特定の生物活性における所望の増大または減少を有するように先に修飾した、当業界に知られている既存のポリペプチドを、出発「非修飾標的タンパク質」として、本明細書において選択し使用することができる。例えば、１つまたは複数の単一アミノ酸の変化によってその天然形態から修飾され、タンパク質分解に対する抵抗性などの所望の活性における増大または減少のいずれかを有するポリペプチドが、同一の、または異なる生物活性いずれかのさらなる修飾のために、出発非修飾標的ポリペプチドとして、本明細書に提供された方法によって利用することができる。
同様に、非修飾または参照タンパク質に比較して、ある特定の生物活性における増大または減少などの所望の変化を有するように先に修飾された、当業界に知られている既存のポリペプチドを、他の構造的に相同性の標的ポリペプチド上の構造的に相同性の座を同定するために、本明細書に提供されたとおり、選択し使用することができる。例えば、１つまたは複数の単一アミノ酸の変化によって修飾され、所望の活性（例えば、タンパク質分解に対する耐性）における増大または減少のいずれかを有するポリペプチドを、構造的に相同性の標的ポリペプチド上の、好適な置換アミノ酸によって置換でき、所望の生物活性における増大または減少に関して試験できる対応する構造的に相同性の座を同定するために、本明細書に提供された方法によって利用することができる。
本明細書に用いられる「変異体」または「成長ホルモン変異体」または「修飾成長ホルモン」とは、非修飾ＧＨポリペプチドに比較して、１つまたは複数の変異を有する成長ホルモンポリペプチドを言う。１つまたは複数の変異は、１つまたはアミノ酸の置換、挿入、欠失および／またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書に用いられるタンパク質の「アミノ酸位置に対応する位置（１つまたは複数）」とは、特定の参照タンパク質との配列および／または構造的アラインメントに基づいて、互いに対応することが決定されているアミノ酸位置を言う。例えば、配列番号１で示されるヒト成長ホルモンのアミノ酸位置に対応する位置は、配列番号１で示されるアミノ酸の配列を、対象となっている特定のＧＨポリペプチドとアラインすることによって経験的に決定することができる。対応位置は、マニュアルのアラインメント用いて当業者により、または多数の入手できるアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）を用いることによって決定することができる。また、対応位置は、例えば、タンパク質構造のコンピュータシミュレート化アラインメントを用いることによって構造アラインメントに基づくこともできる。ポリペプチドのアミノ酸が開示された配列におけるアミノ酸に対応しているということは、該ポリペプチドと開示された配列とをアラインメントした際に、ＧＡＰ演算法などの標準的なアラインメント演算法を用いて、同一性または相同性が最大化される（保存アミノ酸をアラインさせた場合）と同定されるアミノ酸を言う。本明細書に用いられる「対応する位置に」とは、他の参照核酸分子またはタンパク質における位置に関連したある核酸分子またはタンパク質における対象となっている位置（すなわち、塩基ナンバーまたは残基ナンバー）を言う。他の参照タンパク質における位置に対しての対象となっている位置は、例えば、前駆体タンパク質、対立遺伝子変異体、異種タンパク質、他の種の同一タンパク質のアミノ酸配列などにおけるものであり得る。対応位置は、対合ヌクレオチドまたは残基の数が最大化するように配列を比較しアラインすることによって決定できる。例えば、配列間の同一性は、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、より特定的には９９％超であり得る。次いで対象となっている位置に、参照核酸分子またはポリペプチドの配列において割り当てられたナンバーが与えられる。成熟非修飾ＧＨポリペプチドに比較して、修飾ＧＨポリペプチドで、修飾ポリペプチドのアミノ酸残基１は、成熟非修飾ＧＨポリペプチドのアミノ酸残基１に対応することを、通常の当業者は認識されるであろう。また、前駆体非修飾ＧＨポリペプチドに比較して、修飾前駆体ＧＨポリペプチドで、修飾ポリペプチドのアミノ酸残基１は、非修飾ＧＨポリペプチドのアミノ酸残基１に対応することも、通常の当業者は認識されるであろう。また、修飾前駆体ＧＨポリペプチドのアミノ酸残基２７は、前駆体ポリペプチドの２６個のアミノ酸シグナル配列のため、成熟非修飾ＧＨポリペプチドのアミノ酸残基１に対応する。このように、通常の当業者は、修飾および非修飾ＧＨポリペプチドにおける「対応する」アミノ酸残基を決定することができる。
本明細書に用いられる用語の「相同性」および「同一性」は、交換可能に用いられるが、タンパク質に関する相同性は保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、対応位置を同定するためには、最高の配列対合が得られるようにアミノ酸配列をアラインさせる（例えば：「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編集、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８年；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編集、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３年；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、パートＩ、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編集、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）ニュージャージー州（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ホン・ヘインジ，Ｇ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．），アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴェリュー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編集、エム・ストックトン・プレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年；カリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３頁（１９８８年）を参照）。
本明細書に用いられる「配列同一性」とは、同一アミノ酸の数を言う（相同性はまた、保存的アミノ酸置換も含む）。配列同一性は、標準的なアラインメント演算法プログラムによって決定でき、各供給者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーと共に用いられる。実質的に相同性の核酸分子は、典型的に、対象となっている核酸の全長にわたって、または該全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％、または９０％にわたって、中等度ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーでハイブリダイズすると考えられる。また、ハイブリダイズする核酸分子におけるコドンの位置に縮退コドンを含有する核酸分子が考慮される。（タンパク質では、相同性判定のために、同一アミノ酸と同様に、保存的アミノ酸をアラインすることができ、この場合、同一性のパーセンテージおよび相同性のパーセンテージは変化する）。任意の２つの核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一性である」かどうかは、例えば、ピヤソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８年）におけるデフォルトパラメーターを用い、「ＦＡＳＴ Ａ」プログラムなどの公知のコンピュータ演算法を使用して決定することができる。（他のプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（デヴェリュー．Ｊ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（Ｉ）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（アッチュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁（１９９０年））；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、マーチンＪ．ビショップ（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンジエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９４年、およびカリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３頁（１９８８年）が挙げられる）。例えば、バイオテクノロジー情報国立センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースのＢＬＡＳＴ関数を用いて同一性を決定することができる。他の市販の、または公共的に入手できるプログラムとしては、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（マジソン、ウィスコンシン州（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））およびウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）の「ギャップ」プログラム（マジソン、ウィスコンシン州（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウオーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）によって改定された（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１年）ＧＡＰコンピュータプログラム（例えば、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０年）を用いて、例えば、配列情報を比較することによって決定することができる。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、アラインした類似記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうち短い方の記号の総数で割ったものとして、類似性を確定する。ＧＡＰプログラムに関するデフォルトパラメーターは以下を含む：（１）シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）およびデイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）編、ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ、国立生物医学研究基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、３５３−３５８頁（１９７９年）に記載されたような、単項比較マトリクス（同一性では１の値および非同一性では０の値を含む）およびグリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５頁（１９８６年）の加重比較マトリクス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー、および、各ギャップにおける各記号について、さらに０．１０のペナルティー；および（３）端部ギャップについてはペナルティーなし。したがって、本明細書に用いられる用語の「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の比較を示す。
本明細書に用いられる用語の「に少なくとも９０％同一性である」とは、参照ポリペプチドに比較して、９０％から１００％の同一性パーセントを言う。９０％以上のレベルの同一性は、例示を目的として、１００アミノ酸長の試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとを比較した場合、該試験ポリペプチドにおける１０％（すなわち、１００のうち１０）以下のアミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なっていることを示している。試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間に、同様な比較を行うことができる。このような違いは、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点変異として表され得るか、または最大に許容できる、例えば、１０／１００のアミノ酸の違い（およそ９０％の同一性）までの種々の長さの１つまたは複数の位置に集合してあり得る。違いは、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失として定められる。約８５％〜９０％以上の相同性または同一性のレベルでは、結果はプログラムおよびギャップパラメーターセットとは独立となり、このような高レベルの同一性は、しばしばソフトウェアに頼ることなく、容易に評価することができる。
本明細書に用いられる「単一アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸の他のアミノ酸による置換を言う。この置換は、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。タンパク質における１つのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換される場合、そのタンパク質におけるアミノ酸の総数は変化しない。
本明細書に用いられる語句の「各標的タンパク質上に１つだけのアミノ酸置換が生じる」とは、１つのアミノ酸の変化によって標的タンパク質の非修飾形態と異なるような標的タンパク質の修飾を言う。例えば、一実施形態において、変異誘発は、作出された個々の各変異体が各々単一の変異誘発反応の単一産物であるように、タンパク質主鎖上のただ１つのｉｓ−ＨＩＴ標的位置における単一アミノ酸残基の置換によって実施される（例えば、アドレス可能なアレイにおいて個々に）。単一アミノ酸置換変異誘発反応は、ｉｓ−ＨＩＴ標的位置の各々において選択された置換アミノ酸の各々について繰り返される。したがって、複数の変異タンパク質分子が生じ、それによって、各変異タンパク質は、ただ１つのｉｓ−ＨＩＴ標的位置における単一アミノ酸置換を含有する。
単一または複数のアミノ酸置換の文脈における、本明細書に用いられる語句の「偽野生型」は、所与のアミノ酸位置における天然のアミノ酸などの元のものとは異なっているが、特定のタンパク質活性の測定可能な変化を導入することなく、その位置で天然のものと置換できるアミノ酸である。元のアミノ酸とは異なっているが、元のタンパク質と実質的に同じレベル（すなわち、タンパク質に依って、少なくとも１０％、５０％、７０％、９０％、９５％、１００％）、およびタイプの所望の活性を依然として誘発するアミノ酸の配列を有するタンパク質が選択されるように、変異分子の集合をコードする核酸分子セットの集団が作出され、表現型に関して特性化される。
本明細書に用いられる「裸のポリペプチド鎖」とは、翻訳後に修飾、または別に化学的に修飾されておらず、共有結合したアミノ酸のみを含有しているポリペプチドを言う。
本明細書に用いられる「ポリペプチド複合体」は、化学的修飾または翻訳後修飾によって作製されたポリペプチドを含む。異なる修飾としては、限定はしないが、ペギル化、アルブミン化、グリコシル化、ファルニシル化、リン酸化および／または当業界に知られている他のポリペプチド修飾が挙げられる。
本明細書に用いられる「アウトプットシグナル」とは、経時的に追跡でき、所望の場合は、定量化できるパラメータを言う。例えば、組換えタンパク質が細胞に導入される場合、その組換えタンパク質を含有する細胞は多数の変化を受ける。モニターすることができ、形質転換またはトランスフェクションの評価に用いられるこのような変化のいずれかがアウトプットシグナルであり、該細胞はレポーター細胞と称され；コードしている核酸はレポーター遺伝子と称され、コードしている核酸を含む構築体はレポーター構築体である。アウトプットシグナルとしては、限定はしないが、酵素活性、蛍光、発光、産生される産物の量および他のこのようなシグナルが挙げられる。アウトプットシグナルは、プラスミドウィルスに挿入された異種遺伝子（導入遺伝子）などの遺伝子または遺伝子産物の発現を含む。アウトプットシグナルは時間（「ｔ」）の関数であり、該組成物に用いられたタンパク質の量に関連している。タンパク質の濃度がより高いと、アウトプットシグナルはより高い場合もあり得るし、より低い場合もあり得る。いずれかの特定の濃度では、アウトプットシグナルは、時間の関数として、プラトーに達するまで増加する。また、アウトプットシグナルは、細胞、発現している異種遺伝子、および生物学的薬剤の間の相互作用を測定することもできる。
本明細書に用いられるヒル（Ｈｉｌｌ）式は、薬剤（すなわち、試験化合物または試験物質）の濃度と測定された応答とを関連づけた数学的モデルである。
Figure 2008518615
 式中、ｙは、応答、シグナルなどの測定された変数、ｙｍａｘは、達成可能な最大応答、〔Ｄ〕は、薬剤のモル濃度、〔Ｄ５０〕は、該薬剤に対する最大応答の５０％を生じる濃度、ｎは、勾配パラメーターであり、薬剤が単一の部位に結合し、部位間の協同作用がない場合は１である。Ｈｉｌｌプロットは、遊離受容体対ｌｏｇ〔Ｄ〕（Ｍ）に対するリガンド占有受容体の比率のｌｏｇ１０である。勾配はｎであり、１超の勾配は、結合部位間の協同作用を示し、１未満の勾配は、結合の異質性を示す。この等式は、複雑な生物学的系における相互作用を評価するための方法に用いられている（ＰＣＴ／ＦＲ００／０３５０３号明細書に基づいたＰＣＴ出願国際公開第０１／４４８０９号パンフレットを参照）。
Ｈｉｌｌベースの分析（ＰＣＴ／ＦＲ００／０３５０３号明細書に基づいたＰＣＴ出願国際公開第０１／４４８０９号パンフレット）において、本明細書に用いられるパラメーター、π、κ、τ、ε、η、θは以下のとおりである：
πは、アッセイ（細胞ベース）系に作用する生物学的薬剤の力価であり；
κは、生物学的薬剤に対する応答を誘発するアッセイ系の抵抗性の定数であり；
εは、アッセイ系に及ぼす、生物学的薬剤によって引き起こされる過程または反応の全体的効率であり；
τは、生物学的薬剤の明らかな滴定濃度であり；
θは、生物学的薬剤の絶対的滴定濃度であり；
ηは、生物学的過程または反応の異質性である。
特に、本明細書に用いられるパラメーターのπ（力価）またはκ（抵抗性の定数）は、それぞれ、アッセイ系における応答を生じるための試験薬剤の力価、および該薬剤に応答する該アッセイ系の抵抗性を評価するために用いられる。
本明細書に用いられるε（効率）は、生物学的または薬理学的応答を誘発するための全体的反応の効率（生物学的薬剤およびアッセイ系を一緒にして）を評価するための、Ｈｉｌｌ曲線（または、一般に、他の任意のＳ字形または線形近似のもの）の変曲点における勾配である。
本明細書に用いられるτ（見かけの滴定濃度）は、生物学的薬剤の限界希釈または見かけの滴定濃度を測定するために用いられる。
本明細書に用いられるθ（絶対的滴定濃度）は、生物学的薬剤の絶対的限界希釈または絶対的滴定濃度を測定するために用いられる。
本明細書に用いられるη（異質性）は、Ｈｉｌｌ係数値または抵抗性の定数における急激な変化によって反映される、全体的反応に沿った不連続相の存在を測定する。
本明細書に用いられる「変異体のライブラリー（集合）をコードする核酸分子セットの集団」とは、個々のプラスミドまたは他の個々の媒体が個々の遺伝子変異体を担持するような、遺伝子変異体を担持する（コードする）プラスミドまたは他の媒体のライブラリーを言う。該ライブラリーの各要素（メンバー）は、適切なアドレス可能なアレイにおいて個々にというように、他のものから物理的に分離され、独立した変異誘発反応の単一産物として作出されている。このようなタンパク質のライブラリーが考慮される場合は、そのように記述される。
本明細書に用いられる「レポーター細胞」は、例えば、タンパク質またはウィルスへの曝露などの条件、またはその外部もしくは内部環境の変化に応答して、「レポートする」、すなわち経験する細胞である。
本明細書に用いられる「レポーター」または「レポーター部分」とは、細胞によって発現されたタンパク質などの、対象となっている分子の検出を可能にする任意の部分を言う。レポーター部分としては、限定はしないが、例えば、赤色、青色および緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、ＬａｃＺおよび他の検出可能なタンパク質ならびに遺伝子産物が挙げられる。細胞内発現では、レポーター部分をコードする核酸分子を、対象となっているタンパク質との融合タンパク質として、または対象となっているプロモーターの制御下で発現させることができる。
本明細書に用いられる「表現型」とは、遺伝子型（遺伝子の配列）の身体的、生理的または他の発現を言う。本明細書における方法では、遺伝子型の変化から生じる表現型が評４価される。
本明細書に用いられる「活性」は、この用語の最も広い意味で、タンパク質またはタンパク質変異体が、ある系（生物学的、化学的または物理的な系のいずれか）と相互作用する際に、それらによって引き起こされる何らかの性質の該系における何らかの変化（酵素反応における産物量の変化、細胞増殖、免疫原性、毒性における変化）を意味する。また、プロアナーゼに対する抵抗性、タンパク質分解、血清または血液とのインキュベーションに関して、本明細書に用いられる用語の「活性」、「高活性」または「低活性」は、プロテアーゼ／血液または血清処理「後」とプロテアーゼ／血液または血清処理「前」との間の比率生物活性または残部生物活性（細胞増殖）を意味する。
本明細書に用いられる「活性」とは、導出される機能または性質を言う。活性部位とは、活性または機能を与えることを担う、またはそれに寄与する部位を言う。導出される活性または活性部位（該活性を与えるか、または、該活性を与えることに寄与する機能または性質および部位）は、タンパク質の自然活性とは関係なくてもよい。例えば、それは、免疫原性を与えるための、タンパク質上の「活性部位」（免疫原性部位またはエピトープ）であり得る。
本明細書に用いられる「活性」、「生物活性」および「薬理活性」は、限定はしないが、タンパク質分解に対する耐性、生物学的効率、形質導入効率、遺伝子／導入遺伝子発現、差異的遺伝子発現および誘導活性、力価、後代生産性、毒性、細胞毒性、免疫原性、細胞増殖活性および／または細胞分化活性、形態形成活性、治療的活性、筋肉質量の増加、薬理活性、細胞／組織親和性および送達などの生物学的製薬の何らかの活性を意味する。本明細書に用いられる修飾ＧＨポリペプチドは、非修飾ＧＨポリペプチドの活性の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、．．．２０％、．．．３０％、．．．４０％、．．．５０％、．．．６０％、．．．７０％、．．．８０％、．．．９０％、．．．９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％を保持する。さらに他の実施形態において、活性の変化は、非修飾ＧＨの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上大きい。活性は、例えば、下記の実施例に記載されたものなどのアッセイを用いて測定できる。
本明細書に提供されるアミノ酸の種々の配列において生じる、本明細書に用いられるアミノ酸は、それらの公知の三文字または一文字の略号（表１を参照）によって同定される。種々の核酸断片において生じるヌクレオチドは、当業界でルーチンに用いられている標準的な一文字呼称によって呼称される。
本明細書に用いられるアミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは２つ以上のアミノ酸を含んでなる。本明細書の目的に関して、アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類縁体を含む。これらは、α炭素が側鎖を有するアミノ酸を含む。
本明細書に用いられる任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に関する略号は、別に指示しない限り、それらの一般的使用法、認められた略号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６頁（１９７２年）に従う。各天然Ｌ−アミノ酸は、標準的な三文字コード（もしくは一文字コード）または接頭語の「Ｌ」を付けた標準的な三文字コード（もしくは一文字コード）によって識別され、接頭語の「Ｄ」は、そのアミノ酸の立体異性体形態がＤであることを示す。
本明細書に用いられるアミノ酸残基とは、そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を言う。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態にあると考えられる。「Ｄ」異性体形態にあるようにデザインされた残基を、所望の機能的性質が保持される限り、該ポリペプチドによって任意のＬ−アミノ酸残基の替わりに置換できる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を言う。ＣＯＯＨは、ポリペプチドカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシ基を言う。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５２−３５５９頁（１９６９年）に記載された標準的ポリペプチド命名法に従って、アミノ酸残基の略号は、以下の表１示される：
Figure 2008518615
本明細書に式で示される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の慣例的な方向で左から右への方向性を有することを認識される必要がある。また、語句の「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に挙げられたアミノ酸ならびに修飾アミノ酸および異例のアミノ酸も含むように広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の最初または終りのダッシュが、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、またはＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示すことを認識する必要がある。
本明細書に用いられる「天然」アミノ酸とは、ポリペプチドに生じる２０個のＬ−アミノ酸を言う。
本明細書に用いられる用語の「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸に類似した構造を有するが天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するために構造的に修飾した、天然アミノ酸に類似した構造を有する有機化合物を言う。したがって、非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類縁体を含み、また、限定はしないが、アミノ酸のＤ立体異性体を含む。代表的な非天然アミノ酸は本明細書に記載されており、当業者に知られている。
本明細書に用いられる核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）などのそれらの類縁体ならびにそれらの混合物が挙げられる。核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。蛍光標識または放射性標識などの検出可能な標識によって任意に標識化できるプローブまたはプライマーを言う場合に、一本鎖分子が考えられる。このような分子は、典型的に、ライブラリーのプロービングまたはプライミングのために統計的に独特な低コピー数（典型的には５未満、一般的には３未満）であるような長さのものである。一般に、プローブまたはプライマーは、対象となっている遺伝子に相補的な、または同一な、少なくとも１４、１６、または３０の連続した配列を含有する。プローブまたはプライマーは、１０、１４、１６、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸塩基長であり得る。
本明細書に用いられる、ＧＨタンパク質および他のサイトカインなどの２つ以上のタンパク質上の「対応する構造的関連」位置とは、タンパク質間の三次元重なりを最大化する構造的相同性に基づいて決定されたアミノ酸位置を言う。
本明細書に用いられる用語の「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の比較を意味する。例えば、試験ポリペプチドは、参照ポリペプチドに、９０％以上同一性である任意のポリペプチドとして定義できる。本明細書に用いられる用語の少なくとも「に９０％同一性」とは、参照ポリペプチドに対して９０％から１００％の同一性％を言う。９０％以上のレベルにおける同一性は、例示を目的とすれば、１００アミノ酸長の試験ポリペプチドと参照ポリペプチドとが比較されることを示している。試験ポリペプチドにおける１０％以下の（すなわち、１００のうち１０の）アミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なっている。試験ポリペプチドと参照ポリペプチドとの間で同様な比較をすることができる。このような違いは、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点変異として表され得るか、または最大に許容できる、例えば、１０／１００のアミノ酸の違い（およそ９０％の同一性）までの種々の長さの１つまたは複数の位置に集合してあり得る。違いは、核酸またはアミノ酸の置換、または欠失として定められる。
本明細書に用いられる語句の「配列関連タンパク質」とは、互いに少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性または相同性を有するタンパク質を言う。
本明細書に用いられる非関連タンパク質または「配列非関連タンパク質」のファミリーとは、互いに５０％未満、４０％未満、３０％未満または２０％未満のアミノ酸同一性または相同性を有するタンパク質を言う。
本明細書に用いられる用語の「実質的に同一性の」または「同様な」は、関連業者に認識されているように、文脈によって変化することもまた当然である。
本明細書に用いられる、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの異種または外来核酸は、交換可能に用いられ、それが存在するゲノムの一部として天然には生じないか、または天然に生じるものとは異なるゲノムにおける座（１つまたは複数）に見られるＤＮＡまたはＲＮＡを言う。異種核酸としては、それが導入される細胞にとって内在性ではないが、他の細胞から得られたか、または合成的に調製された核酸が挙げられる。必ずしもそうではないが一般に、このような核酸は、それが発現される細胞によって通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。本明細書における異種ＤＮＡは、それが発現される細胞または座にとって、当業者が異種または外来として認識または考慮すると考えられる任意のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。また、異種ＤＮＡまたはＲＮＡは、転写、翻訳、または他の制御可能な生化学的過程に影響を及ぼすことによって内在性ＤＮＡの発現を媒介または変化させるＲＮＡまたはタンパク質をコードすることができる。異種核酸の例としては、限定はしないが、薬剤耐性を与えるタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療的有効物質をコードする核酸、および抗体など他のタイプのタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
このように、本明細書において、「異種ＤＮＡ」または「外来ＤＮＡ」は、該ゲノムに見られる相手側のＤＮＡ分子の正確な方向および位置において存在しないＤＮＡ分子を含む。それはまた、他の生物または種の（すなわち、外因性）ＤＮＡ分子を言うこともできる。
本明細書に用いられる「核酸分子またはポリペプチドまたは他の生体分子に関して単離された」は、該核酸またはポリペプチドが、該ポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝子環境から分離されたことを意味する。また、それは、天然の状態から変化したことを意味し得る。例えば、この用語が本明細書で使用される場合、生きた動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ていないが、その天然状態の共存物質から分離されたこの同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されている」。したがって、組換え宿主細胞内で産生および／または含有されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されていると考えられる。また、組換え宿主細胞から、または天然源から、部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」として意図されている。例えば、ある化合物の組換え生産された型は、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｇｅｎｅ、６７：３１−４０頁（１９８８年）に記載された１ステップ法によって実質的に精製できる。単離された、または精製されたという用語は時には交換可能に用いられる。
このように、「単離された」は、該核酸は、該生物（存在する場合）の天然ゲノムにおいて、対象となっている核酸をコードする遺伝子に直接フランクするそれらの遺伝子のコード配列が無いことを意味する。単離されたＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもあり得、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリイドＤＮＡ、または合成ＤＮＡであり得る。それは、出発ＤＮＡ配列と同一でもあり得るし、また、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、付加、または置換により、そのような配列と異なる場合もあり得る。
生物学的な細胞または宿主から作製された調製物を言う場合、「単離された」または「精製された」は、対象となっているＤＮＡまたはポリペプチドの粗製抽出物などの、指示されたＤＮＡまたはポリペプチドを含有する任意の細胞抽出物を意味する。例えば、ポリペプチドの場合、精製された調製物は、個々の技法または一連の調製用または生化学的技法に従って得ることができ、対象となっているＤＮＡまたはポリペプチドは、これらの調製物において、種々の精製段階で存在し得る。例えば、該操作としては、限定はしないが、硫酸アンモニウム分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離および電気泳動が挙げられる。
「実質的に純粋な」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物は、異なるＤＮＡまたはタンパク質が、天然状態では通常関連している天然物質が無い調製物を、当然意味する。「本質的に純粋な」は、対象となっているＤＮＡまたはタンパク質の少なくとも９５％を含有する「高度に」精製された調製物を意味することを、当然意味する。
対象となっているＤＮＡまたはタンパク質を含有する細胞抽出物は、対象となっているタンパク質を発現するか、または対象となっているＤＮＡを含有する細胞から得られた均一な調製物または無細胞調製物を、当然意味する。用語の「細胞抽出物」は、培養培地、特に、該細胞を除去した使用済み培養培地を含むことが意図されている。
本明細書に用いられる「標的薬剤」とは、抗体、受容体、またはリガンドなどの他の標的分子に結合できる任意の分子を言う。
本明細書に用いられる「受容体」とは、他の分子に（または多の分子によって）特異的に結合する生物学的に活性な分子を言う。用語の「受容体タンパク質」は、特異的受容体のタンパク質の性質を特に示すために用いることができる。
本明細書に用いられる「組換え」とは、遺伝子操作の結果として形成された任意の後代を言う。
本明細書に用いられる「プロモーター領域」とは、それが操作可能に結合しているＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの一部を言う。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始にとって十分なＤＮＡの特定領域を含む。プロモーター領域のこの部分は「プロモーター」と称される。また、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始の活性を調節する配列を含む。調節の性質に依って、プロモーターは構成的でもあり得るし、また、シス作用性またはトランス作用性の因子によって調節もされ得る。
本明細書に用いられる語句の「操作可能に結合した」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおいて、配列またはセグメントがＤＮＡの一片に共有結合していて、それによって、１つのセグメント上の制御または調節配列が、他のセグメントの発現または複製または他のこのような制御を制御するか、または可能にすることを一般に意味する。これらの２つのセグメントは必ずしも連続的である必要はない。遺伝子発現に関し、適切な分子、例えば、転写活性化タンパク質が調節配列に結合した場合に遺伝子発現を制御するかまたは可能にするような仕方で、ＤＮＡ配列と調節配列が結合している。
本明細書に用いられる、組換えＤＮＡ法を用いることによる組換え手段による生産は、クローン化ＤＮＡによってコードされたタンパク質を発現させるために、遺伝子のクローニング発現、ならびに遺伝子シャッフリングおよび所望の特異性を目的としたスクリーニングによるファージ表示などの方法を含む分子生物学の周知の方法を使用することを意味する。
本明細書に用いられる「スプライス変異体」とは、１つ超のタイプのｍＲＮＡを生じる、ゲノムＤＮＡの一次転写体の差異的プロセッシングによって作製された変異体を言う。
本明細書に用いられる「組成物」とは、２つ以上の産物または化合物の任意の混合物を言う。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書に用いられる「組み合わせ」とは、２つ以上の単位体の間の任意の結合を言う。
本明細書に用いられる「製造品」とは、製造され販売される製品を言う。本出願を通して用いられるこの用語は、パッケージングの製品に含有された修飾成長ホルモンポリペプチドおよび核酸を包含する意味がある。
本明細書に用いられる「キット」は、限定はしないが、投与、診断、および生物学的な活性または性質の評価などを目的とした、本明細書に提供される修飾成長ホルモンポリペプチドまたは核酸分子と他の単位体との組み合わせを言う。
本明細書に用いられるある産物「に実質的に同一性の」とは、実質的に同一性の産物が該産物の替わりに使用できるように、十分に類似していて、対象となっている性質が十分に不変であることを言う。
本明細書に用いられる用語の「ベクター」とは、それが結合した他の核酸を輸送することのできる核酸分子を言う。代表的なベクターの１つのタイプは、エピトープ、すなわち、染色体外の複製ができる核酸である。代表的なベクターは、それらが結合している核酸の自律複製および／または発現のできるものであり；このようなベクターは、複製源を典型的に含む。また、ベクターは、宿主の染色体内に組み込むためにデザインできる。操作可能に結合している遺伝子の発現を指令することのできるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形態にあり、これらは一般に、それらのベクター形態において染色体に結合していない、環状二本鎖ＤＮＡループと称される。プラスミドが、ベクターの最も一般的な使用形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。
本明細書に用いられるベクターはまた、「ウィルスベクター」または「ウィルス性ベクター」も含む。ウィルス性ベクターは、外来遺伝子を細胞に移入する（媒体またはシャトルとして）ために、外来遺伝子に操作可能に結合している操作されたウィルスである。
本明細書に用いられる「対立遺伝子」は、本明細書において、「対立遺伝子変異体」と交換可能に用いられ、遺伝子またはその部分の代替形態を言う。対立遺伝子は、相同染色体上の同一の座または位置を占める。対象がある遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、その対象は、その遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合であると言われる。対象がある遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その対象は、その遺伝子に関してヘテロ接合であると言われる。ある特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチド、またはいくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なっていることがあり得、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。また、ある遺伝子の対立遺伝子は、変異を含有する遺伝子の形態でもあり得る。
本明細書に用いられる用語の「遺伝子」または「組換え遺伝子」とは、オープンリーディングフレームを含んでなり、少なくとも１つのエキソン、および任意にイントロンコード配列を含む核酸分子を言う。遺伝子は、ＲＮＡかＤＮＡのいずれかであり得る。遺伝子は、コード領域の前にある領域および後にある領域（リーダーおよびトレーラー）を含み得る。本明細書に用いられる「イントロン」とは、ｍＲＮＡの成熟中にスプライスアウトされる、所与の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を言う。本明細書に用いられる用語の「コード配列」とは、タンパク質に存在するアミノ酸の配列をコードする遺伝子のその部分を言う。
本明細書に用いられる「配列番号で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」とは、特定の配列番号を有するアミノ酸配列をコードする核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を言う。用語の「相補鎖」は、本明細書において、用語の「補体」と交換可能に用いられる。核酸鎖の補体は、コード鎖の補体でも非コード鎖の補体でもあり得る。二本鎖核酸を言う場合、特定の配列番号を有するアミノ酸配列をコードする核酸の補体は、特定の配列番号で示されるアミノ酸配列をコードする鎖の相補鎖を言うか、または特定の核酸配列の相補鎖のヌクレオチド配列を有する任意の核酸を言う。ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を言う場合、この核酸の補体は、特定の核酸配列ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸である。
本明細書に用いられる用語の「センス鎖」とは、二本鎖核酸分子によってコードされるアミノ酸の配列をコードするｍＲＮＡの配列を有する二本鎖核酸分子のその鎖を言う。
本明細書に用いられる用語の「アンチセンス鎖」とは、二本鎖核酸分子によってコードされるアミノ酸の配列をコードするｍＲＮＡの配列の補体である二本鎖核酸分子のその鎖を言う。
本明細書に用いられる「アレイ」とは、３つ以上のメンバーを含有する、核酸分子などの要素の集合を言う。アドレス可能なアレイは、典型的には、固相支持体上の位置により、または色、蛍光、電気的シグナル（すなわち、ＲＦ、マイクロ波、または対象となっている分子の相互作用を実質的に変化させない他の周波数）、バーコードまたは他のシンボル体系、化学的または他のこのような標識などの確認可能なまたは検出可能な標識により、アレイのメンバーが確認できるものである。一定の実施形態において、アレイのメンバーは、固相の表面上の個別の確認可能な座に固定化されるか、またはミクロスフェアまたは他の粒子支持体（本明細書においてはビーズと称される）に固定などをした確認可能な標識に直接的または間接的に結合させるか、または別に会合させ、溶液に懸濁させるか、または表面に塗布される。
本明細書に用いられる「支持体」（マトリクス支持体、マトリクス、不溶性支持体または固体支持体とも称される）とは、対象となっている分子、典型的には、生体分子、有機分子または生体特異的リガンドが結合または接触する任意の固体、半固体または不溶性支持体を言う。このような材料としては、限定はしないが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、および固相合成、アフィニティー分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、免疫アッセイおよび他のこのような適用のための支持体として使用される他の材料などの、化学的および生物学的分子合成および分析のための親和性マトリクスまたは支持体として用いられる任意の材料が挙げられる。本明細書におけるマトリクスは、粒子であり得るか、またはマイクロタイターのディッシュまたはウェル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のこのような材料などの連続表面の形態であり得る。粒子の場合、該粒子は典型的に、５〜１０ｍｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する。本明細書で集合的に「ビーズ」と称されるこのような粒子は、球状であることが多いが、必ずしもそうとは限らない。しかしこのような記述は、該マトリクスの幾何学的形状を制約するものではなく、それはランダムな形状、針状、線維状、および長形状などの任意の形状であり得る。液相において使用できるおよそ球状のビーズ、特にミクロスフェアもまた考慮されている。ビーズは、追加成分が本明細書における方法および分析を妨害しない限り、磁石を用いる分離のために、磁性または常磁性粒子（例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、オスロ（Ｏｓｌｏ）、ノルウェー（Ｎｏｒｗａｙ））を参照）などの追加成分を含み得る。
本明細書に用いられる「マトリクス」または「支持体粒子」とは、個別の粒子の形態にあるマトリクス材料を言う。該粒子は任意の形状ならびに寸法を有するが、典型的には、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、１ｍｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下の少なくとも１つの寸法を有し、典型的には、１００ｍｍ３以下、５０ｍｍ３以下、１０ｍｍ３以下、１ｍｍ３以下、１００μｍ３以下のサイズを有し、立法ミクロンの桁であり得る。このような粒子は、集合的に「ビーズ」と呼ばれる。
本明細書に用いられる、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に対する略号は、別に指示されない限り、一般的な使用法、認められている略号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１：９４２−９４４頁（１９７２年）に従う。
Ｂ．成長ホルモン
ソマトトロピンとしても知られている成長ホルモン（ＧＨ）は哺乳動物などの動物において産生されるペプチドホルモンである。ＧＨは下垂体前葉のソマトトロピン細胞によて産生されるタンパク質のサイトカインファミリーのメンバーである。ＧＨはタンパク質、炭水化物および脂質の代謝に及ぼす作用を介して、身体の成長において役割を演じている。ＧＨはまた、胎盤においても産生される。胎盤ＧＨは、母親と胎児の代謝の調節に役割を演じている。下垂体成長ホルモンは、下垂体前葉から分泌されるソマトトロピンホルモンである。成長ホルモン（ＧＨ）の放出は、視床下部から分泌される成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）によって調節される（例えば、アスコリ（Ａｓｃｏｌｉ）ら、（１９９６年）「Ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、１３６３−１３８２頁、マックグローヒル、ニューヨーク（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。成長ホルモンは、偶発的および拍動的な様式で放出される（例えば、ブルック（Ｂｒｏｏｋ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２１：７６７−７８２頁（１９９２年）を参照）。
成長ホルモンは、ヒトおよび他の哺乳動物において研究されている。ＧＨに対する薬物動態応答はヒトにおいて研究されている。これらの応答は以下の２つのカテゴリーに分類される：１）インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）の産生、脂肪組織におけるトリグリセリド加水分解の促進、および肝臓のグルコース生産の促進などの直接的な応答；および２）同化作用、ならびに軟骨形成、骨格成長、および軟組織成長などの、ＩＧＦ−Ｉにより媒介される成長促進（アスコリ（Ａｓｃｏｌｉ）ら、１９９６年）などの、ｈＧＨの介在的応答。
肝臓はＩＧＦ−Ｉを産生する主要器官である。肝臓ＩＧＦ−Ｉの誘導は、ＩＧＦ−ＩｍＲＮＡの転写増加によるｈＧＨの曝露に依存している（例えば、マシューズＬＳ（Ｍａｔｈｅｗｓ ＬＳ）、ノルシュテットＧ（Ｎｏｒｓｔｅｄｔ Ｇ）、およびパルマイターＲＤ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ＲＤ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３４３−９３４７頁（１９８６年）を参照）。循環におけるＩＧＦ−Ｉの主要な形態は、４０ｋＤａのインスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）および８５ｋＤａの酸不安定性サブユニットと会合した１５０ｋＤａの複合体である（例えば、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１８４３−１１８４８頁（１９８９年）を参照）。血漿中を循環しているこの複合体は、成長促進のために、ＩＧＦ−Ｉを肝臓から作用部位へと輸送するのに役立っている。全体として、ＧＨは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、および酸不安定性サブユニットの調節に主要な役割を演じている（例えば、クーファー（Ｋｕｐｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：３９１−３９６頁（１９９３年）を参照）。
１．成長ホルモンの構造
ＧＨポリペプチドは、４つのらせん間ループ（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤおよびＤＥ）によって結合している４つのアルファらせん（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）から構成されるらせんの束からなる単一ドメインタンパク質である。ジスルフィド架橋はＧＨの構造をさらに安定化することができる。例えば、ヒト成長ホルモンイソ型は、２つのジスルフィド架橋（成熟鎖のシステイン５３〜１６５および１８２〜１８９）を有する。これらの２つの架橋はループＡＢとＤＥを互いに結合させる。ジスルフィド架橋の存在は安定性および受容体との生産的結合に寄与すると考えられる。
種々の種の成長ホルモンポリペプチドは、アミノ酸の保存配列を共有している（例えば、アブデル−メグイド（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４３４−３７頁（１９８７年）を参照）。配列の保存性は、該タンパク質の特にアルファらせん領域で特に高い。成長ホルモンポリペプチドは、典型的には約２００のアミノ酸である。成熟ヒト成長ホルモンは、１９１〜２２２のアミノ酸を含有し、２６のアミノ酸ペプチドシグナルを除去した後、２２ｋＤａの分子量を有する。一般にＧＨは、シグナル配列が開裂するとより小型のポリペプチドへと成熟する大型のポリペプチド（すなわち、前駆体ポリペプチド）として産生され；成熟ＧＨは約１９１のアミノ酸である。
成長ホルモンは、非相同タンパク質であり、１８０、１９１、２０２、２１６、２１７および２２２のアミノ酸長である形態において存在する。非相同成長ホルモンポリペプチドの例としては、限定はしないが、配列番号１、ならびに７１２〜７１５で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。一実施形態において、成長ホルモンポリペプチドは、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、または２２２のアミノ酸長を有する。ヒトでは、下垂体（ｈＧＨ−Ｎ）および胎盤（ｈＧＨ−Ｖ）成長ホルモンの遺伝子は、２１７のアミノ酸ポリペプチドをコードする。また、例えば、交互のスプライシングから生じるＧＨのさらなるイソ型も存在する。例えば、下垂体ＧＨの２１４のアミノ酸イソ型が存在する。ＧＨの胎盤と下垂体のイソ型は、該タンパク質全体にわたって配列類似性を共有している。例えば、成熟ＧＨの胎盤イソ型（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ−００２０５０．１）および成熟ＧＨの下垂体イソ型（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ−０００５０６．２）タンパク質配列は成熟ＧＨタンパク質配列間に１３のアミノ酸の違いを示す。
２．成長ホルモン受容体との相互作用
成長ホルモンとその受容体との間の界面は、ＧＨ／受容体複合体の結晶学的構造の分解および変異誘発試験を用いて特性化できる。該複合体は、１つのリガンド分子（ＧＨ）および２つの受容体分子から形成される。その結果、ＧＨ分子上には、受容体との相互作用部位が２つある。該複合体の見かけの解離定数はナノモルの範囲内にある（およそ０．３ｎＭのＫｄ）が、これら２つの部位は同じ親和性で相互作用するわけではない。相互作用の１つの部位（部位１と称する）は高親和性であるが、他方の部位（部位２と称する）は、低親和性である。親和性におけるこの差は、異なった界面表面積に反映している（部位１は１３００Å、部位２は８５０Å）。
界面に位置するＧＨの数個の残基のみが受容体との結合にとって重要であると思われる。これらの残基は主に疎水性残基である。この疎水性残基のアラニンへの変異は、複合体ホルモン／受容体の結合定数（ｋｏｎ）には影響を及ぼさないが、その解離定数（ｋｏｆｆ）を増大させる。したがって、これらの変異によって、複合体の解離促進による低親和性がもたらされる。これらの変異誘発結果は、該ホルモンが高速の衝突である単純な現象によって受容体と結合すること、および結合部位における疎水性残基の側鎖の役割は、いったんホルモンが受容体に到達したら、結合状態に維持することであることを示している。特定の極性残基、荷電および非荷電残基もまた、ＧＨのその受容体への結合にとって重要である。これらの極性残基は、結合部位におけるｈＧＨの疎水性残基と受容体との正しいパッキングを維持する。
３．バイオ薬剤としての成長ホルモン
成長ホルモンは治療薬として投与される。例えば、ヒトにおいて、ＧＨは、他の疾患もあるが中でも、小児および成人の成長欠乏症、ターナー症候群およびＡＩＤＳ消耗の治療のための治療薬として用いられる。ＧＨによる治療は十分に確立された療法である。ＧＨを投与される対象は、該薬剤の、しばしば毎日ベースの、きわめて頻度の高い反復適用を受けさせられる。例えば、ＧＨの補充は通常、毎日の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって与えられる（例えば、アルバートソン−ウィクランド（Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ−Ｗｉｋｌａｎｄ）ら、Ａｃｔａ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ．７５：８９−９７頁（１９８６年）を参照）。ＧＨの高頻度の反復適用の必要性は、血流中および保存条件下でのその不安定性による。
したがって、血清およびインビトロ（例えば、製造、精製および貯蔵条件中）でのＧＨ安定性（半減期）の改善によって、薬剤としての有用性および有効性が改善されると考えられる。したがって、プロテアーゼに対する抵抗性および／または耐熱性の増大によって評価される安定性の改善を示し、それによってタンパク質半減期の増加を有するＧＨタンパク質の変異体が本明細書に提供される。安定性の改善を示す変異体は、血流中および／または保存条件下での増大した安定性を有する。
Ｃ．成長ホルモンを修飾するための代表的方法
修飾成長ホルモンタンパク質が本明細書に提供される。修飾成長ホルモン（本明細書において、変異体とも称される）は、非修飾成長ホルモンに比較して、安定性が増大する。安定性（例えば、インビボでのタンパク質の半減期）の増大によって、血清中に十分な薬剤濃度を維持するために必要とされる注射回数の減少をもたらすことができ、したがって、ｉ）治療される対象、特にヒト対象に対してより高い快適性および彼らによる受容、ｉｉ）同等な生物学的効果を達成するために必要なより低い用量、およびｉｉｉ）その結果、（用量依存性）副作用の減弱化がもたらされる。
ＧＨの安定性増大は、例えば、プロテアーゼ標的残基または配列の破壊によって、および／または（ｉｉ）タンパク質の耐熱性の増大によって達成できる。非修飾または野生型ＧＨに比較して生物活性を変化させないまま安定性を増大させるＧＨの修飾を達成することができる。修飾成長ホルモンタンパク質を創製するために当業界に知られている任意の方法を使用することができる。本明細書に記載された方法では、修飾は２Ｄスキャニング変異誘発（例えば、国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットおよび国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットを参照）を用いて選択されている。
プロテアーゼ、プロテイナーゼまたはペプチダーゼは、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する。セリンプロテアーゼは、血液凝集、炎症、ならびに原核生物および真核生物双方における消化酵素などの、身体におけるある範囲の機能に寄与している。セリンプロテアーゼは、配列特異的である。プロテアーゼ活性化のカスケードは、血液凝集および補体を制御するが、他のプロテアーゼは、種々の細胞または細胞外コンパートメントにおけるシグナル経路、酵素活性化および分解的機能に関与している。
セリンプロテアーゼとしては、限定はしないが、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、ゼラチナーゼＢおよびゼラチナーゼＡなどのマトリクスメタロプロテイナーゼ、ＮＳ３、エラスターゼ、Ｘａ因子、グランザイムＢ、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡおよびＰＳＡが挙げられる。キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼは、膵臓腺房細胞によって合成されて小腸内に分泌され、ペプチド結合の加水分解の触媒を担っている。これらの３つの酵素は全て、それらのＸ線構造によって示されるとおり、構造が類似している。これらの消化セリンプロテアーゼの各々は、開裂部位の周囲のアミノ酸残基および側鎖に基づいて、ポリペプチド鎖の種々の領域を標的にする。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂溝としての形状である。アミノ酸残基は、ポリペプチド基質のＮからＣの名称（Ｐｉ、．．．、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、．．．、Ｐｊ）およびそれらそれぞれの結合サブ部位（Ｓｉ、．．．、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、．．．、Ｓｊ）で標識される。開裂はＰ１とＰ１’の間で触媒される。キモトリプシンは、嵩高い疎水性アミノ酸残基によってフランクされたペプチド結合の開裂を担う。特定の残基としては、疎水性ポケットにぴったり適合するフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。トリプシンは正に荷電したアミノ酸残基によってフランクされたペプチド結合の開裂を担う。キモトリプシンの疎水性ポケットを有する替わりに、ポケットの後部にアスパラギン酸残基が存在する。次いでこれは、アスパラギンやリジンなどの正に荷電した残基と相互作用することができる。エラスターゼは、アラニン、グリシンおよびバリンなどの小型の中性アミノ酸残基によってフランクされたペプチド結合の開裂を担う。トリプシンおよびキモトリプシンの内にあるポケットは、今度はバリンおよびトレオニンによって裏打ちされ、それを単なるくぼみにして、これらの小型アミノ酸残基を収容することができる。
セリンプロテアーゼは、原核生物および真核生物に遍在しており、止血、線維素溶解、補体形成および食事性タンパク質の消化などの重要で多様な生物学的機能に役立っている。セリンプロテアーゼの中でも、ゼラチナーゼＢ（マトリクスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭ９）およびゼラチナーゼＡなどのマトリクスメタロプロテイナーゼがある。それに対する抵抗性が増大するプロテアーゼとしては、例えば、限定はしないが、唾液、血液、血清、腸、胃、血液、細胞ライセート、細胞および他のものなど、体液および身体組織に見出されるものが挙げられる。これらは全てのタイプのプロテアーゼを含む。
原則として、変異誘発に基づくタンパク質の特異的導出のために記載されたいくつかの一般的アプローチがある。コンホメーション安定性および／または耐タンパク質分解性の増大を達成する目的で、これらのいずれかを単独で、または組み合わせて、ＧＨなどのポリペプチドの修飾に使用することができる。このような方法としては、出発タンパク質配列におけるアミノ酸が、同一分子上で同時に生じる異なるアミノ酸位置における単一または複数置換のいずれかで、２０個のアミノ酸の全て（または一群）によって置換されるランダム変異誘発が挙げられる。他の方法である限定ランダム変異誘発では、２０個のアミノ酸の全てまたはＤＮＡバイアス残基のいずれかが導入される。該バイアスは、それぞれ確率的に、または半確率的に、前もって「導出された」生物活性に関与していることが知られている、タンパク質の限定された、または予め決められた領域内の、タンパク質の配列ではなくＤＮＡの配列に基づいている。また、修飾ｈＧＨ変異体を構築するために、１Ｄスキャニング、２Ｄスキャニングおよび３Ｄスキャニングなどの合理的変異誘発の方法を用いることができる。
１．１Ｄスキャニング（「合理的変異誘発」）
１Ｄスキャニングとも称される合理的変異誘発は、２ステップの過程であり、同時係属中の米国特許出願第１０／０２２，２４９号明細書（米国特許出願公開第２００３−０１３４３５１−Ａ１号明細書）に記載されている。簡単に述べると、第１のステップで、ｈＧＨ（配列番号１）などの出発タンパク質配列におけるアミノ酸の各々全てが、指示された参照アミノ酸（例えば、アラニン）によって置換される、完全長アミノ酸スキャニングが実施される。一度に各タンパク質分子上の１つだけのアミノ酸が置換される。これらのアミノ酸位置はＨＩＴと称される。第２のステップでは、ステップ１で同定された個々のＨＩＴ位置に存在するアミノ酸が各分子で互いに異なるように、分子の新たな集合が作り出される。ステップ１で同定されたＨＩＴ位置の各々に２０のアミノ酸全て（残りの１９）が導入されるが；個々の各分子は、原則として、ただ１つのアミノ酸置換を含有する。タンパク質活性における所望の変化（改善など）もたらす新たに作出された変異体はＬＥＡＤと称される。当該方法は、他のものの中でも、出発タンパク質に比較して所望の変化した活性を示すタンパク質を作製することを目的として、タンパク質に沿った予想されていない領域におけるアミノ酸の予想されていない新たな配列を同定することを可能にする。さらに、第２のステップのための標的領域（ＨＩＴおよび周囲のアミノ酸）の選択は、第１のステップで得られた活性についての実験的データに基づいているため、タンパク質の構造および／または機能についての予備知識は必要ない。
２．３Ｄスキャニング
同時係属中の米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書および米国特許出願第１０／６８５，３５５号明細書ならびにＰＣＴ出願国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットおよび第２００４／０２２５９３号パンフレットに記載された３Ｄスキャニングは、変異誘発に関する可能な標的部位（ｉｓ−ＨＩＴ）の同定に基づいたタンパク質の合理的導出のさらなる方法である。該方法では、比較されるタンパク質の基礎となっている配列とは無関係に、構造的に関連したタンパク質間のタンパク質主鎖の折りたたみパターンの比較を用いる。対象となっているタンパク質上に、構造的に関連したアミノ酸位置がいったん同定されたら、構築およびスクリーニングに関する候補ＬＥＡＤを同定するために、ＰＡＭ分析などの好適なアミノ酸置換基準を用いることができる。
３．２Ｄスキャニング（限定合理的変異誘発）
タンパク質の合理的進展のための２Ｄスキャニング（または限定合理的変異誘発）法（同時係属中の米国特許出願第１０／６８５，３５５号明細書および米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書ならびに国際公開第２００４０２２５９３号パンフレットおよび第２００４０２２７４７号パンフレットを参照）は、二次元上のスキャニングに基づいている。第１の次元は、ｉｓ−ＨＩＴ標的位置を同定するための、タンパク質配列に沿ったアミノ酸位置である。第２の次元は、特定のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸位置を置換するために選択されたアミノ酸タイプのスキャニングである。本明細書に提供された２Ｄスキャニング法の利点は、タンパク質主鎖状の全アミノ酸未満が、アミノ酸置換用に選択され；および／または天然アミノ酸などの元のアミノ酸の置換に利用できる残りの１９の全アミノ酸未満が置換用に選択されるように、少なくとも１つの、典型的にはアミノ酸位置および／または置換アミノ酸を限定できることである。
ｉ）導出すべき特定のタンパク質の性質（すなわち、耐タンパク質分解性）、ｉｉ）タンパク質のアミノ酸配列、およびｉｉｉ）個々のアミノ酸の既知の性質、に基づいて、タンパク質配列に沿った多数の標的位置を、「ｉｓ−ＨＩＴ標的位置」として、インシリコで選択される。ｉｓ−ＨＩＴ標的位置のこの数は、導出される具体的な特徴に関して可能で妥当な全ての標的位置が含まれるような、可能で妥当な多さである。特に、ｉｓ−ＨＩＴ標的位置の限定数が置換用に選択される実施形態では、最適化される特定のタンパク質上のｉｓ−ＨＩＴ標的位置は、残りの１９のアミノ酸全て、または、より多くの場合、タンパク質活性に及ぼす所望の作用を有すると考えられる選択されたアミノ酸を含んでなる、より限定された群のいずれかであり得る。他の実施形態において、置換アミノ酸の限定数が用いられる限り、タンパク質主鎖に沿った全てのアミノ酸位置を、アミノ酸置換用のｉｓ−ＨＩＴ標的位置として選択することができる。次いで、作り出された個々の各変異体が各々の単一の変異誘発反応の単一の産物であるように、タンパク質主鎖状の特定のｉｓ−ＨＩＴ標的位置における単一アミノ酸残基の置換による変異誘発が実施される（例えば、アドレス可能なアレイにおいて個々に）。変異ＤＮＡ分子が互いに物理的に分離され、各々が独立した変異誘発反応の単一産物であるように、アドレス可能なアレイなどにおいて、該変異ＤＮＡ分子がデザインされ、変異誘発により作出され、個々にクローン化される。変異ＤＮＡ分子の集合から誘導された変異タンパク質分子もまた、アドレス可能なアレイにおける様式化などによって、互いに物理的に分離される。したがって、複数の変異タンパク質分子が作製される。各変異タンパク質は、ｉｓ−ＨＩＴ標的位置の一箇所だけに単一のアミノ酸置換を含有する。次いで、タンパク質発現および適切な活性の測定後、個々の各タンパク質変異分子について、活性評価を個々に実施する。この方法の実際の例は、変異ｈＧＨ分子が作製される実施例に示されている。
変化した、典型的には改善された、標的タンパク質活性をもたらす新たに作製されたタンパク質はＬＥＡＤと称される。この方法は、一度に１つの、他の実施形態においては限定数の、アミノ酸位置におけるアミノ酸置換および配列変化に基づいて、特定の活性（耐タンパク質分解性の増大など）に関するタンパク質改善のための間接的探索に依っている。その結果、出発タンパク質より（特定の標的活性または他の特性において）良好な、または異なる性能の、タンパク質に沿ったいくつかの領域における修飾アミノ酸配列を有する最適化されたタンパク質が同定され単離される。
ＧＨ上の２Ｄスキャニングは、抗タンパク質分解性の改善および耐熱性の改善などのタンパク質安定性の改善した変異体の作出に用いられた。このような修飾を達成するために、ｈＧＨのインシリコ分析を用いて、アミノ酸位置を選択した。
ａ．インシリコＨＩＴの同定
タンパク質の方向付けられた導出のための２Ｄスキャニング法は、導出される特徴に直接的または間接的に関与していると考えられるタンパク質配列に沿った特定のアミノ酸およびアミノ酸位置（本明細書において、ｉｓ−ＨＩＴと称される）の同定および選択（インシリコ分析を用いて）を含む。認識されるように、提供される２Ｄスキャニング法は、以下の２つのステップを含む。第１のステップは、導出される活性に関して標的となり得る可能性のある全ての可能なアミノ酸位置を同定するための、該タンパク質のアミノ酸の標的配列のインシリコ探索である。これは、例えば、任意の公知の標準的ソフトウェアを用いて、該タンパク質上の変化させる性質に及ぼすアミノ酸残基の効果を評価することによって達成される。インシリコ分析の項目は、修飾される性質の関数である。
これらのアミノ酸位置または標的配列は、いったん同定されたら、「ｉｓ−ＨＩＴ」（インシリコＨＩＴ）と称される。インシリコＨＩＴは、耐タンパク質分解または耐熱性の増大などの「導出」特性に関与している可能性のあるアミノ酸位置（または標的位置）として定義される。タンパク質配列における全てのアミノ酸位置の中でのｉｓ−ＨＩＴの識別は、タンパク質の二次または三次構造についての情報に加えて、各位置におけるアミノ酸のタイプに基づいて行うことができる。インシリコＨＩＴは、導出特性に関与する可能性のある全ての可能なアミノ酸、アミノ酸位置または標的配列が表されるような変異分子の集合を構成する。この段階では、アミノ酸またはアミノ酸位置の間で、理論的に強力な識別は行われない。インシリコＨＩＴ位置は、該タンパク質配列の全長にわたって分布している。標的ｈＧＨタンパク質上の、一度に１つの、または限定数のｉｓ−ＨＩＴアミノ酸が置換される。
タンパク質上の特定のアミノ酸が導出される特性に関与している可能性があるかどうかを判定するために、種々のパラメーターを解析することができ、典型的には、インシリコＨＩＴを判定するために、当初事項の限定数（典型的に２以下）が用いられる。例えば、本明細書に記載されているとおり、ｈＧＨの耐熱性を増大させるため、第１の条件は、該分子の安定化に寄与し得る化学的架橋におけるその寄与可能性などの該分子の耐熱性に関連したアミノ酸の性質である。第２の事項は、該タンパク質構造に沿ったそれらのアミノ酸の特定の位置に典型的に関連している。
本明細書に提供された方法によるｉｓ−ＨＩＴ同定の第１ステップの間に、該タンパク質配列に沿った個々の各アミノ酸は、それがｉｓ−ＨＩＴの候補であるかどうかを評価するために、個々に考慮される。この探索は１つずつ行われ、該アミノ酸がｉｓ−ＨＩＴの候補と考えられるかどうかの判定は、（１）アミノ酸のタイプ；（２）該タンパク質における位置および既知の場合はタンパク質の構造；および（３）配列およびスペースにおけるそのアミノ酸とその近傍アミノ酸との間の予想される相互作用に基づく。
ｉｓ−ＨＩＴは、タンパク質安定性に寄与するｈＧＨの多数の性質に関して同定された。これらの性質としては、１）らせん間の塩類（極性）相互作用の増大；２）らせん間のＨ結合相互作用の増大および３）プロテイアゼ感受性部位の除去、が挙げられる。
ｂ．置換性アミノ酸の同定
ｉｓ−ＨＩＴ標的位置が選択されたならば、次のステップは、導出される特性に関する活性レベルを変化させるために、各ｉｓ−ＨＩＴ位置における天然アミノ酸などの元のアミノ酸と置き換わるアミノ酸を同定することである。各ｉｓ−ＨＩＴ位置における天然アミノ酸などの元のアミノ酸と置き換えるために使用される置換性アミノ酸のセットは、異なり得、特定のｉｓ−ＨＩＴ位置に特異的であり得る。置換性アミノ酸の選択には、重要な（例えば、触媒性、結合性など）残基の疎水性、電荷および極性などの物理化学的性質を保存し、タンパク質の他の性質（すなわち、タンパク質安定性）を変化させる必要性が考慮される。特定のｉｓ−ＨＩＴ標的タンパク質を置換するために使用できる残りの１９の非天然（または元のものでない）アミノ酸の置換性アミノ酸の数は、具体的な修飾のための性質に依って、１から約１９までまでの範囲、およびその間のいずれかである。
置換性アミノ酸（本明細書において、「置換アミノ酸」とも称される）を選択する多数の方法が当業界に十分に知られている。一定のアミノ酸置換が異なる種の関連タンパク質に一般的に生じることが、タンパク質化学者により判断されている。該タンパク質はこれらの置換によっても依然として機能するため、置換されたアミノ酸は、タンパク質の構造および機能に適合している。これらの置換は、化学的に類似したアミノ酸に対するものが多いが、他のタイプの変化も、比較的稀ではあるが生じ得る。
多数のタンパク質における最も一般的な、および最も稀な変化のタイプを知ることによって、タンパク質配列の任意のセットに関するアラインメントおよびアミノ酸置換の予測を補助することができる。この目的のためにアミノ酸置換マトリクスが用いられる。多数のマトリクスを入手することができる。このようなマトリクスの詳細な提示は、同時係属中の米国特許出願第１０／６８５，３５５号明細書および米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書ならびに国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットおよび第２００４／０２２７４７号パンフレットに見ることができ、これらはそれらの全体が本明細書に援用されている（許可された場合）。このようなマトリクスもまた、当業界に、例えば、下記の挙げた参考文献において知られており、入手できる。
アミノ酸置換において、アミノ酸は水平方向および垂直方向にリストされ、各マトリクスの位置に、関連タンパク質配列のアラインメントにおいて１つのアミノ酸が他のアミノ酸と対になったと考えられる頻度を反映するスコアが入る。アミノ酸「Ａ」がアミノ酸「Ｂ」に変化する確立は、逆に「Ｂ」が「Ａ」に変化する確立と同一であると仮定される。任意の２つの配列で、系統樹における先祖アミノ酸は通常不明であるため、この仮定がなされる。また、置換の可能性は、２つのアミノ酸の出現頻度の産物およびそれらの化学的および物理的類似性に依存するであろう。このモデルの予想は、アミノ酸頻度は進化時間にわたって変化しないであろうというものである（デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５（３）：３４５−３５２頁（１９７８年））。いくつかの代表的なアミノ酸置換マトリクスとしては、限定はしないが、ブロック置換マトリクス（ＢＬＯＳＵＭ）（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９頁（１９９２年））、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：２７５−２８２頁（１９９２年））、ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）（ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４３３−１４４５頁（１９９２年））、フィッチ（Ｆｉｔｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１６（１）：９−１６頁（１９６６年））、フェング（Ｆｅｎｇ）（フェング（Ｆｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２１：１１２−１２５頁（１９８５年））、マクラクラン（ＭｃＬａｃｈｌａｎ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６１：４０９−４２４頁（１９７１年））、グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８５：８６２−８６４頁（１９７４年））、ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、１２：２１９−２３６頁（１９７９年））、ラオ（Ｒａｏ）（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、２９：２７６−２８１頁（１９８７年））、リスラー（Ｒｉｓｌｅｒ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０４：１０１９−１０２９頁（１９８８年））、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：７１６−７３８頁（１９９３年））、およびＰｏｉｎｔ Ａｃｃｅｐｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＰＡＭ）（デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、Ａｔｌａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ．Ｓｔｒｕｃｔ．５：３４５−３５２頁（１９７８年））が挙げられる。
インシリコで実施される上記に示された２つのステップの成果は：（１）変異誘発の標的であるアミノ酸位置が同定されること（ｉｓ−ＨＩＴと称される）；および（２）ｉｓ−ＨＩＴにおける天然アミノ酸などの元のアミノ酸に対する置換性アミノ酸が同定され、天然分子と性能の異なることが予想される候補ＬＥＡＤ変異分子の集合が提供されること、である。これらは、所望の最適化された（または改善されたまたは変化させた）生物活性に関してアッセイされる。
ｃ．修飾ポリペプチドの構築および生物学的アッセイ
上記のとおりｉｓ−ＨＩＴを選択したら、置換性アミノ酸を導入する。変異タンパク質は典型的に、組換えＤＮＡ法を用いて調製し、最適化された特定の生物活性（特性）に関して、適切な生物学的アッセイにおいて評価する。変異タンパク質を調製する代表的な方法は、当業界に周知の方法を用いて、天然遺伝子などの元の遺伝子の変異誘発によるものである。作製された個々の各変異体が、各々の単一の独立した変異誘発反応の単一産物であるように、変異分子はアドレス可能なアレイなどにおいて１つずつ作製される。個々の変異誘発反応は、それらが互いに物理的に分離されているアドレス可能なアレイなどにおいて、別々に行われる。それぞれの変異タンパク質をコードする核酸分子セットの集団を調製したら、対応する変異タンパク質の産生のため、各々を適切な細胞内に、別々に１つずつ導入する。これもまた、例えば、それぞれの変異タンパク質をコードする核酸分子の各セットが、マルチウェルマイクロタイタープレートのウェル内などにおける個別の場所に限定された細胞内に導入されるアドレス可能なアレイにおいて、実施することができる。個々の各変異タンパク質を、個々に表現型に関して特性化し、最適化される特性（すなわち、導出される特性）にとって適切なアッセイを用いて、定量的に評価する。このステップもまた、アドレス可能なアレイにおいて実施することができる。天然分子などの元の分子に比較して所望の増大または減少した性能を示す変異体を同定し、ＬＥＡＤと称する。変異ＤＮＡ分子の作製過程の最初から性能結果の読取りおよび分析まで、各候補ＬＥＡＤ変異体は、アドレス可能なアレイにおいて、それ自体のアドレスからというように、個々に作出され、生産され、分析される。この過程は自動化することができる。
Ｄ．修飾成長ホルモンポリペプチド
耐タンパク質分解性の増大によって、および／または耐熱性の増大によって、ポリペプチドの安定性および半減期を増加させる方法が本明細書に提供される。プロテアーゼ（血液、血清、胃腸など）によるタンパク質分解に対する耐性を増大させるために、成長ホルモンなどのポリペプチドを修飾する方法が本明細書に提供され、それによって修飾ポリペプチドはインビトロおよび／またはインビボで半減期の増加を示す。タンパク質分解性酵素をペプチド阻害剤に接触させ、それによって、プロテアーゼ（血液、血清、胃腸など）の生物活性を阻害する方法が、本明細書に提供される。この接触の結果、タンパク質分解を受け易いポリペプチドが、インビトロまたはインビボで半減期の増加を示す。プロテアーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を増大させるために、ポリペプチドを修飾し、タンパク質分解性酵素をペプチド阻害剤に接触させ、それによって、プロテアーゼの生物活性を阻害する方法が、本明細書に提供される。また、前記方法によって作出された修飾ポリペプチドが本明細書に提供される。耐タンパク質分解性および／または耐熱性の増大によって評価される安定性の改善を示す修飾成長ホルモンポリペプチド；これらの性質の所有、それによるインビトロまたはインビボでの半減期の増加を示す修飾ポリペプチドが本明細書に提供される。
耐タンパク質分解性および／または耐熱性の増大によって評価される安定性の改善を示す修飾ＧＨポリペプチド；これらの性質の所有、それによるインビトロまたはインビボでの半減期の増加を示す修飾ポリペプチドが本明細書に提供される。
プロテアーゼに対する耐性および／または耐熱性の増大によって評価される安定性の改善を示す修飾（変異体、変異型など）ＧＨ（本明細書において修飾ＧＨポリペプチドとも称される）が本明細書に提供される。このような修飾ＧＨポリペプチドは、インビトロ（例えば、製造、精製および貯蔵中）およびインビボでの増加した半減期を有し得る。一実施形態において、本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、少なくとも同等の生物活性を与える。例えば、該修飾ＧＨポリペプチドは、ＧＨ特異的細胞増殖活性によって評価した際、非修飾および／または野生型天然ＧＨポリペプチドに比較して、少なくとも同等の生物活性を与える。
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、ヒトＧＨ変異体を含む。本明細書に提供された修飾ＧＨポリペプチド配列番号１で示されたアミノ酸配列に比較して、修飾されている。ｈＧＨポリペプチドの出所は、任意のヒト組織またはヒト細胞のタイプであり得る。ヒトＧＨポリペプチドは、配列番号１、７１２および７１３で示されるものなどのポリペプチド配列を含む。本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドはまた、非ヒト出所のＧＨ変異体を含む。例えば、修飾ＧＨポリペプチドは、ウシ、ラット、ウサギ、ヒツジ、霊長類、ウマ、ブタ、サル、ヒヒ、テナガザル、マカク、ゴリラ、オランウータンおよびチンパンジーのＧＨなどの哺乳動物ＧＨの変異体であり得る。修飾ＧＨポリペプチドはまた、種々のＧＨ配列のハイブリッドであるポリペプチドおよび当業界で知られているＧＨ配列から構築された合成ＧＨ配列も含む。
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、ＧＨ安定性に寄与しているサイトカインの特定の構造特性を変化させる。本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、耐タンパク質分解性の増大および／または耐熱性の増大を有する変異体を含む。したがって、本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、血清中に十分な薬剤濃度を維持するために必要とされる注射回数の減少などの利点を有するＧＨを提供し、したがって、例えば、対象によるより高い快適性および受容性、同等な生物学的効果を達成するために必要な用量の低下および副作用の減弱がもたらされる。
ＧＨのコンホメーション安定性を増大させるために、アミノ酸置換によってＧＨに構造的修飾が行われる。このような修飾は、ＧＨのコンホメーション安定性を増大させる一方、必要な生物活性（例えば、細胞増殖活性）を改善または維持するものを含む。これらの修飾により、プロテアーゼに対する耐性および／または耐熱性の増大によって評価した際に安定性の改善を有するＧＨ変異体がもたらされる。このような修飾ＧＨポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボで天然ＧＨに比較して、タンパク質半減期の増加を示す。これらの修飾は、タンパク質分解に対して感受性のアミノ酸の標的配列の破壊、溶媒との極性相互作用を増大させるための疎水性断片の修飾およびＧＨの特定のらせん間の極性相互作用の増大を含む。
ＧＨにおける構造的修飾は、ＧＨ全体の安定性増大を目的とした、ＧＨ配列内の種々の位置における１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換の組み合わせを含む。このような組み合わせは、プロテアーゼに対する抵抗性および／または耐熱性の増大によって評価した際の安定性を増大させるために使用できる。例えば、１つまたは複数のカテゴリーにおける２つ以上の修飾を組み合わせることができ、該カテゴリーは、例えば、タンパク質分解に対して感受性の標的配列の破壊、溶媒との極性相互作用を増大させるための疎水性断片の修飾、らせん間の極性相互作用の増大およびらせん間相互作用の増大、から選択される。さらに、このようなカテゴリーにおける１つまたは複数の修飾を、ＧＨ安定性を増大させるために、任意の公知のタイプの１つまたは複数の修飾と組み合わせることができ、例えば、ＧＨにおけるプロテイナーゼ感受性部位を除去する修飾を耐熱性を増大させる任意の公知のタイプの修飾と組み合わせることができる。
また、本明細書に提供される変異体の中でも、天然または野生型ＧＨに比較して２つ以上の修飾を有する修飾ＧＨポリペプチドがある。一例において、ｈＧＨは修飾下垂体ｈＧＨである。修飾ＧＨポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の修飾位置を有するものを含む。２つ以上の修飾は、同じ性質の２つ以上の修飾、例えば、ｈＧＨの耐熱性を改変する２つの修飾、またはプロテアーゼに対する抵抗性を改変する２つの修飾を含み得る。他の実施形態において、２つ以上の修飾は、各々がＧＨ安定性に寄与する性質の組み合わせを含む。例えば、修飾ＧＨポリペプチドは、ＧＨの耐熱性を変化させる１つまたは複数の修飾およびプロアナーゼ感受性部位を除去する１つまたは複数の修飾を含み得る。一実施形態において、成熟成長ホルモンのアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する修飾成長ホルモンポリペプチドがあり、ここで、９位が置換される場合は、置換性アミノ酸はプロリンではなく；１３位が置換される場合は、置換性アミノ酸はバリンではなく；１４位が置換される場合は、置換性アミノ酸はセリンではなく；５４位が置換される場合は、置換性アミノ酸はプロリンではなく；５６位が置換される場合は、置換性アミノ酸はアスパルテートではなく；６４位が置換される場合は、置換性アミノ酸はメチオニンではなく；６５位が置換される場合は、置換性アミノ酸はバリンまたはアラニンではなく；６６位が置換される場合は、置換性アミノ酸はグルタミンまたはリシンではなく；９２位が置換される場合は、置換性アミノ酸はロイシンではなく；１２０位が置換される場合は、置換性アミノ酸はアルギニンではなく；１２６位が置換される場合は、置換性アミノ酸はアルギニンではなく；１２９位が置換される場合は、置換性アミノ酸はトレオニンではなく；１３３位が置換される場合は、置換性アミノ酸はヒスチジンまたはアルギニンではなく；１３４位が置換される場合は、置換性アミノ酸はロイシンではなく；１４０位が置換される場合は、置換性アミノ酸はアスパラギンではない。１つ超のｉｓ−ＨＩＴ部位における置換を有し、安定性の改善を示すＧＨ変異体は、超ＬＥＡＤと呼ばれる。ＧＨ超ＬＥＡＤは、野生型または非修飾ＧＨに比較して、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０超のアミノ酸変化を含有し得る。
上記の修飾成長ホルモンのいずれかが本明細書に提供され、ここで、置換される位置の数は、非修飾成長ホルモンに比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一実施形態において、本明細書に提供される修飾成長ホルモンは、以下の位置の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む：配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する成熟ヒト成長ホルモンの５６、５９、６４、６５、６６、８８、９２、９４、１０１、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３、１４５、１４６、１４７、１８３、および１８６。一実施形態において、該位置としては、Ｅ５６，Ｐ５９、Ｒ６４、Ｅ６５、Ｅ６６、Ｅ８８、Ｆ９２、Ｒ９４、Ｌ１０１、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、Ｋ１４５、Ｆ１４６、Ｄ１４７、Ｒ１８３およびＥ１８６が挙げられる。一実施形態において、位置は以下のとおり置換される：Ｑ、ＮおよびＨによるＥの置換、ＳまたはＡによるＰの置換、ＨまたはＱによるＲの置換、ＩまたはＶによるＬまたはＦの置換、ＱまたはＮによるＫまたはＤの置換、およびＨまたはＩによるＹの置換。例えば、このような置換としては、Ｅ５６Ｑ、Ｅ５６Ｎ、Ｅ５６Ｈ、Ｐ５９Ｓ、Ｐ５９Ａ、Ｒ６４Ｈ、Ｒ６４Ｑ、Ｅ６５Ｑ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ６５Ｈ、Ｅ６６Ｑ、Ｅ６６Ｎ、Ｅ６６Ｈ、Ｅ８８Ｑ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８８Ｈ、Ｆ９２Ｉ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｈ、Ｒ９４Ｑ、Ｌ１０１Ｖ、Ｌ１０１Ｉ、Ｅ１２９Ｑ、Ｅ１２９Ｎ、Ｅ１２９Ｈ、Ｄ１３０Ｑ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｓ、Ｐ１３３Ａ、Ｒ１３４Ｈ、Ｒ１３４Ｑ、Ｋ１４０Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｙ１４３Ｈ、Ｙ１４３Ｉ、Ｋ１４５Ｑ、Ｋ１４５Ｎ、Ｆ１４６Ｉ、Ｆ１４６Ｖ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｎ、Ｒ１８３Ｈ、Ｒ１８３Ｑ、Ｅ１８６Ｑ、Ｅ１８６ＮおよびＥ１８６Ｈが挙げられる。
１．タンパク質分解性部位の除去による耐タンパク質分解性の増大
ＧＨなどの治療用タンパク質に関する対象となっている修飾の中でも、コンホメーションの安定性を増大させるものがある。コンホメーションの安定性は、タンパク質分解に対するタンパク質の耐性の増大によって達成できる。このような安定性の増大は、必要な生物活性を維持しつつプロテアーゼ耐性（したがって、タンパク質半減期）の増加を含み得る。このような変化は、より長時間持続する治療用タンパク質の作製にとって有用である。
ａ．タンパク質分解性部位の除去により修飾された成長ホルモンポリペプチドの性質
タンパク質分解に対する修飾ＧＨの耐性増大によるインビトロまたはインビボ安定性の増大したＧＨポリペプチドの修飾が本明細書に提供される。修飾ＧＨポリペプチドの中でも、以下を目的として修飾されたＧＨ変異体が本明細書に提供される：１）らせん間の塩類（極性）相互作用の増大；２）らせん間のＨ結合相互作用の増大および３）プロテアーゼ感受性部位の除去。
一実施例において、安定性の増大する修飾ＧＨポリペプチドはヒトＧＨポリペプチドである。プロテアーゼ（血液、血清、腸など）、血液ライセートまたは血清のいずれかによって誘発された際に安定性の増大をもたらすｈＧＨ上のアミノ酸変化を同定するために、２Ｄスキャニングの方法論が用いられた。プロアナーゼ、血液ライセートまたは血清に対するタンパク質安定性の増大により、本明細書において、特定のタンパク質分子に関するより長時間のインビボでの半減期が提供され、したがって、対象に対して必要な注射回数の減少が提供されると考えられる。一実施例において、修飾ｈＧＨの生物活性は、アッセイにおいて、適切な細胞に加えられた際に細胞増殖を促進させる修飾ＧＨの能力を測定することによって評価される。生物活性の測定前に、ｈＧＨ分子を、種々のインキュベーション時間または注射後時間の間、血液、血清、または腸のプロテアーゼ（インビトロアッセイで）、または血清／腸（マウスにおけるインビボアッセイで）に曝露することができる。測定された生物活性は、タンパク質分解性混合物への曝露後の残留生物活性に対応する。修飾ＧＨの生物活性を、プロテアーゼ安定性および生物活性に及ぼす修飾の効果の測定値として非修飾ＧＨと比較することができる。一実施例において、非修飾ＧＨは、野生型、天然ＧＨである。他の実施例において、非修飾ＧＨは、さらなる修飾を導入するための出発材料として用いられたＧＨの変異体である。また、修飾ＧＨを、プロテアーゼ感受性および／または生物活性を比較するために、このようなアッセイにおいて任意の公知のＧＨポリペプチドと比較することもできる。さらに、本明細書における修飾ＧＨポリペプチドを評価するために、タンパク質安定性、プロテアーゼ抵抗性ならびにプロテアーゼ感受性およびＧＨ生物活性を評価するための当業界に知られている任意のアッセイを用いることができる。
実質的な変化なしに必要な生物活性を維持し、血液、血清または腸のプロテアーゼによる消化をより受けにくくされ、したがって、循環におけるより長時間の半減期を示すＧＨ分子が本明細書に提供される。このようなＧＨ分子としては、治療適用のための十分な生物活性を有する修飾ＧＨポリペプチドが挙げられる。
プロテアーゼ抵抗性の増大した修飾ＧＨポリペプチドが本明細書に提供される。代表的な実施形態において、本明細書に提供されるＧＨ変異体のインビトロまたはインビボでの半減期（血清安定性）は、ヒト血液、ヒト血清または１つまたは複数のプロテアーゼを含有するインビトロ混合物のいずれかにおける天然ＧＨの半減期と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、またはそれ以上のから選択される量で増大する。他の実施形態において、本明細書に提供されるＧＨ変異体のインビトロまたはインビボでの半減期（血清安定性）は、ヒト血液、ヒト血清または１つまたは複数のプロテアーゼを含有するインビトロ混合物のいずれかにおける天然ＧＨの半減期と比較して、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上から選択される量で増大する。代表的な一実施形態において、このようなＧＨ変異体は、ヒトＧＨポリペプチドを修飾することによって作出される。このような代表的な一実施形態において、ＧＨ変異体は、ヒト下垂体ＧＨポリペプチドを修飾することによって作出される。
ｂ．タンパク質分解性部位の除去によって修飾された成長ホルモンポリペプチドの作出
タンパク質分解性部位の除去によって安定性の増大した変異体を作出する一実施例において、下垂体ｈＧＨが修飾された。耐タンパク質分解性であるｈＧＨ変異体のデザインにおける第１のステップは、該タンパク質配列に沿ったタンパク質分解を受け易い部位の同定を含む。考えられる選択されたプロテアーゼのリスト（表２）ならびに本明細書に記載された他の血液、血清および腸のプロテアーゼに基づいて、それらのプロテアーゼによって標的にされ得るｈＧＨにおける全てのアミノ酸およびアミノ酸配列の完全なリストがインシリコで先ず決定された。プロテアーゼの標的（ｈＧＨ配列に沿ったアミノ酸およびアミノ酸配列）は、インシリコＨＩＴ（ｉｓ−ＨＩＴ）と呼ばれる。体内のプロテアーゼ混合物は、組成物中できわめて複雑であるため、所与のタンパク質配列における大多数の残基はタンパク質分解の標的になり得る。
タンパク質分解に対して耐性であるｈＧＨ変異体のデザインにおける第２のステップは、ｉｓ−ＨＩＴにおけるｈＧＨの天然アミノ酸と置換した場合、該タンパク質が（ｉ）タンパク質分解に対して耐性となり、（ｉｉ）野生型ｈＧＨタンパク質と同等の生物活性のレベルを誘発するような適切な置換性アミノ酸を同定することを含む。置換性アミノ酸の選択には、一定のプロテアーゼの広範囲の標的特異性およびＧＨの重要な（例えば、触媒性、結合性など）残基の疎水性、電荷および極性などの物理化学的性質を保存する必要性を考慮しなければならない。
２Ｄスキャニング法の一部として、いわゆる「許容点変異」（ＰＡＭ；デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、１９７８年（図２）。本来、タンパク質配列間のアラインメントを生じさせるために開発されたＰＡＭ値は、アミノ酸間の進化距離を反映する確立マトリクスの形態で入手可能である。参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的および機能的に類似した、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合および他のこのような相互作用を形成する能力などの化学的性質を有する置換である。保存的置換は、「許容点変異」の形態におけるＰＡＭマトリクス基準により、最高適合スコアを示す。タンパク質機能に影響を及ぼすことなく保存的変異を作り出す手段として、ｉｓ−ＨＩＴに対する候補置換性アミノ酸を同定するために、２Ｄスキャニングの枠内でＰＡＭ２５０マトリクスが用いられる。ＰＡＭ２５０マトリクスにおいて最高値を有し、「保存的置換」または「許容点変異」に対応する少なくとも２つのアミノ酸が、各ｉｓ−ＨＩＴにおける置換用に選択された。システイン残基によるアミノ酸の置換は、明らかに避けられる。この変化は、分子間ジスルフィド結合の形成を導く可能性があると考えられるからである。
簡単に述べると、ＰＲＯＴＥＯＬ演算法（オンラインｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒで、およびｂｉｏｉｎｆｏ．ｈｋｕ．ｈｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ａｎａｌｙｓｅｑ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｅｏｌ＿ｉｎ．ｐｌで）を用いて、表２におけるプロテアーゼに対する基質として認識できる、１９１のアミノ酸のｈＧＨタンパク質（配列番号１）に沿った残基のリストが確立された（図１）。プロテアーゼ、それらのタンパク質分解特異性および登録されているポリペプチドアミノ酸配列に基づいて、該演算法によってタンパク質分解消化マップが作成される。
Figure 2008518615
表２は、多数の選択されたプロテアーゼおよび化学的処理を用いた、タンパク質分解の標的であるいくつかのアミノ酸位置のインシリコ同定を示している。
ｉｓ−ＨＩＴが同定され、ｈＧＨのタンパク質分解に対するより高い耐性のためにＬＥＡＤが作出された。ｉｓ−ＨＩＴ位置の各々における天然アミノ酸およびタンパク質分解に対する耐性の増大のための置換性アミノ酸としては、限定はしないが、Ｈおよび／またはＱによるＲ；Ｈ、Ｑおよび／またはＮによるＥ；Ｑおよび／またはＮによるＫ；Ｎおよび／またはＱによるＤ；Ｉおよび／またはＶにおるＭ；Ａおよび／またはＳによるＰ；Ｉおよび／またはＨによるＹ；Ｉおよび／またはＶによるＦ；Ｈおよび／またはＳによるＷ；Ｉおよび／またはＶによるＬが挙げられる（表３を参照）。Ｉｓ−ＨＩＴおよびＬＥＡＤは、タンパク質分解を受け易い特定の領域における修飾を含み得る。
一実施形態において、修飾のために選択される領域は、配列番号１のアミノ酸１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の中から選択される成熟ヒト成長ホルモンにおける位置に対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。他の実施形態において、修飾される位置は、１つまたは複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の位置に対応する。一実施形態において、ＧＨは、非修飾成長ホルモンに比較して、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を含み、該置換位置は、配列番号１の１３、２７、２８、５４〜５６、５９、６４から６６、７９、８５、８８、９０、９２、９４、１０１、１１４、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３、１４５から１４７、１６１、１８３、１８４および１８６の位置に対応する位置ではない位置である。
例えば、下垂体ｈＧＨは、配列番号１で示された成熟ヒト成長ホルモンのアミノ酸位置１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の中から選択される対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。他の実施形態において、胎盤のｈＧＨが、このような対応位置において修飾される。胎盤ｈＧＨを下垂体ｈＧＨとアラインさせ、下垂体ｈＧＨ、例えば、配列番号１の位置に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置が選択される。他の実施形態において、非ヒト源のＧＨ、例えば、ウシ、ヒツジまたはサルのＧＨが修飾される。このような位置のアラインメントおよび選択は、任意のＧＨポリペプチドにより、それを下垂体ｈＧＨとアラインさせ、修飾のために対応位置を選択することによって実施できる。
一実施形態において、下垂体ｈＧＨに対応する位置が選択され（ｉｓ−ＨＩＴ）、耐タンパク質分解性を増大させるアミノ酸置換が行われる（ＬＥＡＤ）。位置としては、限定はしないが、Ｆ１Ｉ／Ｐ２Ａ、Ｆ１Ｉ／Ｐ２Ｓ、Ｆ１Ｖ／Ｐ２Ａ、Ｆ１Ｖ／Ｐ２Ｓ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ６Ｉ、Ｌ６Ｖ、Ｒ８Ｈ、Ｒ８Ｑ、Ｌ９Ｉ、Ｌ９Ｖ、Ｆ１０Ｉ、Ｆ１０Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｄ１１Ｑ、Ｍ１４Ｉ、Ｍ１４Ｖ、Ｌ１５Ｉ、Ｌ１５Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１９Ｈ、Ｒ１９Ｑ、Ｌ２０Ｉ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｆ２５Ｉ、Ｆ２５Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｄ２６Ｑ、Ｙ２８Ｈ、Ｙ２８Ｉ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｎ、Ｆ３１Ｉ、Ｆ３１Ｖ、Ｅ３２Ｑ、Ｅ３２Ｈ、Ｅ３２Ｎ、Ｅ３３Ｑ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｎ、Ｙ３５Ｈ、Ｙ３５Ｉ、Ｐ３７Ａ、Ｐ３７Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｑ、Ｅ３９Ｈ、Ｅ３９Ｎ、Ｋ４１Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｆ４４Ｉ、Ｆ４４Ｖ、Ｌ４５Ｉ、Ｌ４５Ｖ、Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｓ、Ｌ５２Ｉ、Ｌ５２Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｆ５４Ｖ、Ｅ５６Ｑ、Ｅ５６Ｈ、Ｅ５６Ｎ、Ｐ５９Ａ、Ｐ５９Ｓ、Ｐ６１Ａ、Ｐ６１Ｓ、Ｒ６４Ｈ、Ｒ６４Ｑ、Ｅ６５Ｑ、Ｅ６５Ｈ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ６６Ｑ、Ｅ６６Ｈ、Ｅ６６Ｎ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｑ、Ｌ７３Ｉ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｑ、Ｅ７４Ｈ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ７５Ｉ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ７６Ｖ、Ｒ７７Ｈ、Ｒ７７Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８２Ｉ、Ｌ８２Ｖ、Ｗ８６Ｈ、Ｗ８６Ｓ、Ｌ８７Ｉ、Ｌ８７Ｖ、Ｅ８８Ｑ、Ｅ８８Ｈ、Ｅ８８Ｎ、Ｐ８９Ａ、Ｐ８９Ｓ、Ｆ９２Ｉ、Ｆ９２Ｖ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｒ９４Ｈ、Ｒ９４Ｑ、Ｆ９７Ｉ、Ｆ９７Ｖ、Ｌ１０１Ｉ、Ｌ１０１Ｖ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｉ、Ｄ１０７Ｎ、Ｄ１０７Ｑ、Ｙ１１１Ｈ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１２Ｑ、Ｌ１１３Ｉ、Ｌ１１３Ｖ、Ｌ１１４Ｉ、Ｌ１１４Ｖ、Ｋ１１５Ｎ、Ｋ１１５Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｉ、Ｌ１１７Ｖ、Ｅ１１８Ｑ、Ｅ１１８Ｈ、Ｅ１１８Ｎ、Ｅ１１９Ｑ、Ｅ１１９Ｈ、Ｅ１１９Ｎ、Ｌ１２４Ｉ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｒ１２７Ｈ、Ｒ１２７Ｑ、Ｌ１２８Ｉ、Ｌ１２８Ｖ、Ｅ１２９Ｑ、Ｅ１２９Ｈ、Ｅ１２９Ｎ、Ｄ１３０Ｎ、Ｄ１３０Ｑ、Ｐ１３３Ａ、Ｐ１３３Ｓ、Ｒ１３４Ｈ、Ｒ１３４Ｑ、Ｆ１３９Ｉ、Ｆ１３９Ｖ、Ｋ１４０Ｎ、Ｋ１４０Ｑ、Ｙ１４３Ｈ、Ｙ１４３Ｉ、Ｋ１４５Ｎ、Ｋ１４５Ｑ、Ｆ１４６Ｉ、Ｆ１４６Ｖ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１５３Ｎ、Ｄ１５３Ｑ、Ｄ１５４Ｎ、Ｄ１５４Ｑ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５６Ｖ、Ｌ１５７Ｉ、Ｌ１５７Ｖ、Ｋ１５８Ｎ、Ｋ１５８Ｑ、Ｙ１６０Ｈ、Ｙ１６０Ｉ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６３Ｉ、Ｌ１６３Ｖ、Ｙ１６４Ｈ、Ｙ１６４Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｆ１６６Ｖ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｎ、Ｄ１６９Ｑ、Ｍ１７０Ｉ、Ｍ１７０Ｖ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｎ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｈ、Ｅ１７４Ｎ、Ｆ１７６Ｉ、Ｆ１７６Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｌ１７７Ｖ、Ｒ１７８Ｈ、Ｒ１７８Ｑ、Ｒ１８３Ｈ、Ｒ１８３Ｑ、Ｅ１８６Ｑ、Ｅ１８６Ｈ、Ｅ１８６Ｎ、Ｆ１９１ＩおよびＦ１９１Ｖが挙げられる（表４および配列番号２〜２２３を参照）。このような変異体に関して、第１のアミノ酸（一文字の略号）は、置換されているアミノ酸に対応し、その数は配列番号１に関連するｈＧＨにおける位置に対応し、第２のアミノ酸（一文字の略号）は、その位置におけるアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に対応する。修飾のために用いられるＧＨは、他の哺乳動物ＧＨ、および胎盤ＧＨなどの任意のＧＨであり得る。適切なアラインメントによって評価した対応位置を同定し、修飾する。
ｃ．さらなる修飾成長ホルモンポリペプチド
特定の実施形態において、候補ＬＥＡＤアミノ酸によって置換された１つまたは複数のｉｓ−ＨＩＴ部位における１つまたは複数のアミノ酸を含有する変異ＧＨ分子を作出することもできる。１つまたは複数のｉｓ−ＨＩＴにおける１つまたは複数の変異を担持し、かつプロテアーゼ耐性の改善を示す変異タンパク質は、ＬＥＡＤ（１つのｉｓ−ＨＩＴにおける１つの変異）および超ＬＥＡＤ（１つ超のｉｓ−ＨＩＴにおける変異）と呼ばれる。
さらなる実施形態において、プロテアーゼ耐性の改善を示す変異分子、ＬＥＡＤおよび超ＬＥＡＤは、本明細書に記載されたものなどのタンパク質安定性を与えるさらなる変異によってさらに修飾することができる。例えば、プロテアーゼ耐性ＬＥＡＤおよび超ＬＥＡＤは、１）らせん間の塩類（極性）相互作用の増大；２）らせん間のＨ結合相互作用の増大および３）耐タンパク質分解性をもたらす他の修飾、などの変異を含有させるために修飾できる。
ｄ．増大した耐タンパク質分解性を有する修飾成長ホルモンポリペプチドの評価
修飾ＧＨポリペプチドの耐タンパク質分解性の増大は、タンパク質安定性、プロテアーゼ感受性およびプロテアーゼ耐性および／またはＧＨ生物活性を評価するための、当業界に知られている任意の方法によって評価することができる。一実施例において、プロテアーゼ耐性は、１つまたは複数のプロテアーゼと共に修飾ＧＨポリペプチドをインキュベートし、次いで、未処置対照に比較した残留生物活性を評価することによって測定する。修飾ＧＨポリペプチドを、同様の条件下で処置した非修飾および／または野生型天然ＧＨと比較し、特定の変異体が非修飾ＧＨよりも大きな生物活性を保持しているかどうかを判定することができる。生物活性は、増加した筋肉質量、抗老化および増殖活性の測定など、当業界に知られている任意の方法によって評価することができる。
修飾ＧＨポリペプチドを評価するために、プロテアーゼ耐性の動態学的試験を用いることもできる。例えば、修飾ＧＨポリペプチドを、１つまたは複数のプロテアーゼと共にインキュベートし、一連の時点にわたってサンプルを採取する。各々の時点で、プロテアーゼを不活化し、次いで、サンプルをＧＨ生物活性に関して試験する。修飾ＧＨポリペプチドを未処置対照および非修飾および／または野生型ＧＨに対する同様な処置と比較して、修飾ＧＨポリペプチドのプロテアーゼ耐性を判定することができる。
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、例えば、限定はしないが、唾液、血液、血清、腸、胃、血液、細胞ライセート、細胞および他のものなどの体液および組織に見られるものなどのプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性増大を示す。修飾としては、限定はしないが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、およびトリプシン、管腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ＮＳ３、エラスターゼ、因子Ｘａ、グランザイムＢ、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ｔＰＡおよびＰＳＡなど、１つまたは複数のプロテアーゼに対する耐性が挙げられる。
タンパク質分解に対する耐性とは、同じプロテアーゼによる同じ条件下での非修飾ポリペプチドの開裂に比較して、該プロテアーゼによる修飾ポリペプチドの標的アミノ酸残基の減少した開裂の任意の量を言う。本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドは、タンパク質分解に対して、非修飾ＧＨポリペプチドよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、．．．２０％、．．．３０％、．．．４０％、．．．５０％、．．．６０％、．．．７０％、．．．８０％、．．．９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい耐性を示す。
ゼラチナーゼＢに対してより耐性である修飾ＧＨポリペプチドが提供される。ゼラチナーゼＢにより開裂される非修飾ＧＨポリペプチドよりも、ゼラチナーゼＢによる開裂に対してポリペプチドをより耐性にする修飾。Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎまたは対応する配列を典型的に含む配列において、または該配列の近傍で、ゼラチナーゼＢによりポリペプチドは開裂される。この領域内で、またはこの領域に対して、５、１０、１５、または約２０アミノ酸Ｃ末端またはＮ末端以内などの近傍で、開裂が生じ得る。ゼラチナーゼＢによりポリペプチドにおいて開裂される正確なアミノ酸は、必要ならば経験的に決定することができる。したがって、アミノ酸Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎの配列内の、または対応するアミノ酸内の、またはこの配列もしくは対応する配列の前または後の残基内のアミノ酸において修飾されているポリペプチドが本明細書に提供される。修飾ポリペプチドは、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎの各残基において、もしくはそれらの組み合わせにおいて、またはこの領域の近傍のアミノ酸において修飾することができ、それによって、非修飾ポリペプチドに比較して、ゼラチナーゼＢによるタンパク質分解に対し、該修飾ペプチドをより耐性にする。該修飾ポリペプチドは、ゼラチナーゼＢによるタンパク質分解に対し、非修飾ポリペプチドよりも、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％より耐性であり得る。一実施形態において、プロテアーゼに対する耐性は、本明細書に記載されるアッセイのいずれかによって経験的に試験することができる。
一実施形態において、プロテアーゼ耐性を増大させる修飾のために同定された位置としては、例えば、Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ９、Ｄ１１、Ｍ１４、Ｒ１６、Ｌ２３、Ｄ２６、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｅ５６、Ｅ６５、Ｅ６６、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ８１、Ｌ８７、Ｌ１０１、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｄ１４７、Ｄ１５３、Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｋ１５８、Ｌ１６２、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｄ１７１、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｌ１７７、Ｒ１７８およびＦ１９１が挙げられる。非修飾ｈＧＨに比較して、プロテアーゼ耐性の増大を示す修飾ＧＨポリペプチドとしては、限定はしないが、Ｆ１Ｉ、Ｐ２Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ９Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｍ１４Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｅ５６Ｑ、Ｅ５６Ｎ、Ｅ６５Ｑ、Ｅ６６Ｑ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８７Ｖ、Ｌ１０１Ｖ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｅ１１９Ｑ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｐ１３３Ａ、Ｒ１３４Ａ、Ｒ１３４Ｈ、Ｋ１４０Ｎ、Ｄ１４７Ｎ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１５３Ｎ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５７Ｉ、Ｋ１５８Ｎ、Ｌ１６２Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｑ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｎ、Ｅ１７４Ｈ、Ｌ１７７Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｒ１７８ＱおよびＦ１９１Ｉなどが同定されている。
２．耐熱性の増大
修飾ＧＨポリペプチドの中で、耐熱性の改善によって安定性を増大させるために修飾されたＧＨポリペプチドが本明細書に提供される。このような修飾としては、例えば、らせん間の塩類（極性）相互作用およびらせん間のＨ結合相互作用の増大を挙げることができる。
ａ．耐熱性修飾成長ホルモンポリペプチドの性質
一実施例において、耐熱性増大を示す修飾ＧＨポリペプチドは、ヒトＧＨポリペプチドである。耐熱性の改善をもたらすＧＨポリペプチド上のアミノ酸変化を同定するために、２Ｄスキャニング方法論を用いることができる。例えば、本明細書に記載されているとおり、ｈＧＨの耐熱性を増大させるための第１の条件は、該分子の安定化に寄与し得る化学的架橋に寄与する可能性があるような分子の耐熱性に関連したアミノ酸の性質である。第２の前提は、該タンパク質構造に沿ったアミノ酸の特定の位置に典型的に関連している。ＧＨポリペプチドのコンホメーションの安定性を増大させるために、アミノ酸を置換するが、必要な生物活性（例えば、細胞増殖活性）を改善または維持する、ＧＨポリペプチド配列におけるいくつかの構造的修飾を行うことができる。代表的実施形態において、これらの修飾により、耐熱性の増大により評価した際に安定性の改善した修飾ＧＨポリペプチドがもたらされる。このような修飾ＧＨポリペプチドは、非修飾および／または野生型天然ＧＨポリペプチドに比較して、タンパク質半減期の増加を示す。これらの修飾としては、溶媒との極性相互作用を増大させる疎水性断片の修飾および特定のらせん間の極性相互作用の増大が挙げられる。
一実施形態において、本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドのインビトロまたはインビボでの半減期（血清安定性）は、２０℃から４５℃の間の特定の熱的条件に晒した天然ＧＨの半減期に比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、および少なくとも５００％、またはそれ以上、から選択される量で増加する。一実施例において、耐熱性は室温（例えば、約２５℃）で評価される。他の実施例において、耐熱性は、哺乳動物の体温、例えば、ヒトでは約３７℃、で評価される。他の実施形態において、本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドのインビトロまたはインビボでの半減期（血清安定性）は、２０℃から４５℃の間の特定の熱的条件、例えば、室温（例えば、約２５℃）および／または哺乳動物の体温（例えば、約３７℃でのヒト体温）におけるインキュベーションに晒した天然ＧＨの半減期に比較して、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、またはそれ以上から選択される量で増加する。
ｉ．分子内結合の創出
ｈＧＨポリペプチドの全体的構造安定性を増大させるため、および耐熱性を改善するために、対向したらせん間に分子結合を創出する。特定の一実施形態において、電荷を付加するか、またはこれらのらせん間の極性相互作用を増大させることによって、らせんＡおよびＣを安定化させた。らせんが互いに対向する領域において、アミノ酸およびｉｓ−ＨＩＴとして選択されたアミノ酸位置を方向づける。ｉｓ−ＨＩＴの選択では、溶媒許容性を考慮することができる。
修飾ｈＧＨポリペプチドのより高い耐熱性のために、ｉｓ−ＨＩＴを同定し、ＬＥＡＤを創出する。ｉｓ−ＨＩＴ位置の各々における天然アミノ酸としては、限定はしないが、Ｌ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８を挙げることができる（表５を参照）。ｉｓ−ＨＩＴ位置の各々における天然アミノ酸は、他のアミノ酸：Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＴを有する、極性相互作用を増大させる残基によって置換された。
ｉｓ−ＨＩＴおよびＬＥＡＤは、熱的安定性に寄与する特定の領域における修飾を含むことができる。一実施形態において、修飾のために選択される領域は、下垂体ｈＧＨ（配列番号１）内の位置に対応する領域において、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。これらの領域における位置としては、例えば、１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の位置が挙げられる。例えば、下垂体ｈＧＨは、配列番号１の１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の位置のいずれかに対応するアミノ酸位置に、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むように修飾される。他の実施形態において、胎盤ｈＧＨが修飾される。胎盤ｈＧＨ（配列番号７１２）を、下垂体ｈＧＨ（配列番号１）とアラインさせ、１つまたは複数のアミノ酸位置を、下垂体ｈＧＨの１から１２、１４から２６、２９から５３、５７、５８、６０から６３、６７から７８、８０から８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５から１００、１０２から１１３、１１５から１２８、１３１、１３２、１３５から１３９、１４１、１４２、１４４、１４８から１６０、１６２から１８２、１８５および１８７から１９１の位置から選択する。アラインメントおよび位置の選択は、任意のＧＨポリペプチドにより、それを下垂体ｈＧＨとアラインさせ、修飾のために対応する位置を選択することによって実施することができる。
一実施形態において、下垂体ｈＧＨに対応する位置を選択し（ｉｓ−ＨＩＴ）、耐熱性を増大させるために、アミノ酸置換を行う（ＬＥＡＤ）。特定の実施形態において、耐熱性の増大をもたらすアミノ酸置換としては、Ｌ６Ｅ、Ｌ６Ｄ、Ｌ６Ｋ、Ｌ６Ｒ、Ｌ６Ｎ、Ｌ６Ｑ、Ｌ６Ｓ、Ｌ６Ｔ、Ｌ９Ｅ、Ｌ９Ｄ、Ｌ９Ｋ、Ｌ９Ｒ、Ｌ９Ｎ、Ｌ９Ｑ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ａ１３Ｅ、Ａ１３Ｄ、Ａ１３Ｋ、Ａ１３Ｒ、Ａ１３Ｎ、Ａ１３Ｑ、Ａ１３Ｓ、Ａ１３Ｔ、Ｌ１５Ｅ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｋ、Ｌ１５Ｒ、Ｌ１５Ｎ、Ｌ１５Ｑ、Ｌ１５Ｓ、Ｌ１５Ｔ、Ａ１７Ｅ、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｋ、Ａ１７Ｒ、Ａ１７Ｎ、Ａ１７Ｑ、Ａ１７Ｓ、Ａ１７Ｔ、Ｌ２０Ｅ、Ｌ２０Ｄ、Ｌ２０Ｋ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｎ、Ｌ２０Ｑ、Ｌ２０Ｓ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２３Ｅ、Ｌ２３Ｄ、Ｌ２３Ｋ、Ｌ２３Ｒ、Ｌ２３Ｎ、Ｌ２３Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｔ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ１０５Ｅ、Ａ１０５Ｄ、Ａ１０５Ｋ、Ａ１０５Ｒ、Ａ１０５Ｎ、Ａ１０５Ｑ、Ａ１０５Ｓ、Ａ１０５Ｔ、Ｖ１１０Ｅ、Ｖ１１０Ｄ、Ｖ１１０Ｋ、Ｖ１１０Ｒ、Ｖ１１０Ｎ、Ｖ１１０Ｑ、Ｖ１１０Ｓ、Ｖ１１０Ｔ、Ｌ１１３Ｅ、Ｌ１１３Ｄ、Ｌ１１３Ｋ、Ｌ１１３Ｒ、Ｌ１１３Ｎ、Ｌ１１３Ｑ、Ｌ１１３Ｓ、Ｌ１１３Ｔ、Ｌ１１４Ｅ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｋ、Ｌ１１４Ｒ、Ｌ１１４Ｎ、Ｌ１１４Ｑ、Ｌ１１４Ｓ、Ｌ１１４Ｔ、Ｌ１１７Ｅ、Ｌ１１７Ｄ、Ｌ１１７Ｋ、Ｌ１１７Ｒ、Ｌ１１７Ｎ、Ｌ１１７Ｑ、Ｌ１１７Ｓ、Ｌ１１７Ｔ、Ｉ１２１Ｅ、Ｉ１２１Ｄ、Ｉ１２１Ｋ、Ｉ１２１Ｒ、Ｉ１２１Ｎ、Ｉ１２１Ｑ、Ｉ１２１Ｓ、Ｉ１２１Ｔ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｎ、Ｌ１２４Ｑ、Ｌ１２４Ｓ、Ｌ１２４Ｔ、Ｌ１２８Ｅ、Ｌ１２８Ｄ、Ｌ１２８Ｋ、Ｌ１２８Ｒ、Ｌ１２８Ｎ、Ｌ１２８Ｑ、Ｌ１２８ＳおよびＬ１２８Ｔが挙げられる。一実施形態において、このようなアミノ酸置換は、下垂体ｈＧＨ（配列番号１；表６および配列番号２２４〜３５１を参照）において行われる。
ｉｉ．らせん間極性相互作用の増大
ｈＧＨポリペプチドのらせんＡおよびＣの疎水性領域は、溶媒への曝露から保護される。これらの疎水性領域は、らせんＡとＣの相互作用から創出され、ｈＧＨ構造の全体的安定化に役割を演じる。らせんＡおよびＣの疎水性領域の変化はまた、溶媒との極性相互作用を促進し、それによってタンパク質のコンホメーションを安定化させるために行うこともできる。
一実施形態において、らせんＡおよびＣの疎水性領域に電荷を付加し、したがって、耐熱性を増大させるために、タンパク質導出を目的として、２Ｄスキャニング法が用いられる。耐熱性の増大は、インビトロでのタンパク質半減期の増加および／またはインビボでのタンパク質半減期の増大として現れ得る。本明細書に記載されたとおり、安定の高い、より持続性のタンパク質、またはより長時間のタンパク質半減期を有するタンパク質をデザインし、作出する方法は、例えば、ｉ）らせんＡおよびＣの相互作用ならびに疎水性領域の創出に寄与し得るタンパク質配列上のいくつかのまたは全ての可能な標的部位（これらの部位は、本明細書において、ｉｓ−ＨＩＴと称され）を同定すること；ｉｉ）該特異的なｉｓ−ＨＩＴにおける１つまたは複数の元の（天然などの）アミノ酸を置換すると、その置換によってｉｓ−ＨＩＴの安定性は増大するが、同時に、該タンパク質の必要な生物活性および特異性が維持または改善されることが予想できるような、各ｉｓ−ＨＩＴに特異的な適切な置換性アミノ酸（候補ＬＥＡＤ）を同定すること；ｉｉｉ）全ての特異的ｉｓ−ＨＩＴ標的位置に特異的置換性アミノ酸（候補ＬＥＡＤ）を系統的に導入し、対応する変異候補リード分子を含有するライブラリーを作出すること、を含む。修飾ＧＨポリペプチドが作出され、生産される。次いで、各変異分子がただ１つのｉｓ−ＨＩＴ部位に最初にアミノ酸置換を含有するように、アドレス可能なアレイにおいて、修飾ＧＨポリペプチドを、１つずつ表現型に関して特性化することができる。特定の実施形態において、変異分子はまた、候補ＬＥＡＤアミノ酸によって置換された複数のＨＩＴ部位を含有する引き続くラウンドにおいても作出できる（超ＬＥＡＤ）。
さらなる実施形態において、これらの候補ＬＥＡＤは、本明細書に記載されたような安定性をタンパク質に与えるさらなる変異によってさらに修飾することができる。例えば、候補ＬＥＡＤは、例えば、らせん間相互作用の増大および／またはプロテアーゼ感受性の除去を含むように修飾することができる。
ｂ．耐熱性修飾成長ホルモンポリペプチド類の評価
修飾ＧＨポリペプチド類の耐熱性は、タンパク質、安定性、熱変性および／または生物活性を評価するために当業界に公知の任意の方法により評価できる。一例において、耐熱性の動態は、特定の温度、例えば、２０℃から４５℃の間で活性を試験することにより測定される。一例において、耐熱性は３７℃で評価される。手短に言うと、修飾ＧＨポリペプチド類は、選択された温度でインキュベートされ、サンプルは未処理対照と比較して残存生物活性を評価するために種々の時点で採取される。評価は、例えば、ＧＨ活性に関する細胞増殖アッセイを含むことができる。耐熱性は、同様の処置で活性を維持する非修飾ＧＨの能力と比較して、特定の温度で経時的に生物活性を維持する修飾ＧＨポリペプチドの能力に基づいて評価される。
３．超ＬＥＡＤおよび追加の成長ホルモン修飾
ＧＨ修飾はまた、２つ以上の修飾を組合わせることを含み得る。例えば、２つ以上のＬＥＡＤを、単一の新規分子に組合わせることができる。耐タンパク質分解性を増加させる修飾は、本明細書に提供されているか、または当業界に公知の他の修飾と組合わせて耐タンパク質分解性を増加させることができる。耐熱性を増加させる修飾は、本明細書に提供されているか、または当業界に公知の他の修飾と組合わせて耐熱性を増大させることができる。耐熱性を増大させる修飾は、本明細書に提供されているか、または当業界に公知の他の修飾と組合わせて耐タンパク質分解性を増大させることができる。耐熱性および／またはプロテアーゼ安定性を増加させる修飾はまた、生物活性、受容体相互作用などの他の機能性を変えるＧＨに対する修飾、翻訳後のタンパク質修飾に影響を及ぼす修飾、および当業界に知られた任意の他の修飾と組合わせることができる。
１つのポリペプチドにおいて修飾を組合わせるための多くの技法が知られている。例えば、超ＬＥＡＤ変異タンパク質を作出する目的で個々のＬＥＡＤ分子に存在する複数変異を、単一変異タンパク質上に組立てるために付加方向性変異誘発（ＡＤＭ）を使用できる（同時係属中の米国出願第１０／６５８，３５５号明細書；米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットならびに国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットを参照）。ＡＤＭは、連続超ＬＥＡＤ変異タンパク質を創出するために、第１のＬＥＡＤ変異タンパク質の創出後の各ステップにおいて、新たなＬＥＡＤ変異を、先のＬＥＡＤ変異タンパク質上に付加する反復複数ステップ法である。
新規な超ＬＥＡＤ変異分子の集合をコードする核酸分子のセット集団を、創出し、試験し、表現型に関して１つずつアドレス可能なアレイにおいて特性化する。超ＬＥＡＤ変異分子は、ＬＥＡＤ変異の種々の変数およびタイプを含有する分子である。導出される特定の形体に関してさらに改善された適合性を示す分子は、超ＬＥＡＤと称される。超ＬＥＡＤは、当業者に公知の他の方法により創出でき、本明細書のハイスループット法により試験できる。本明細書の目的のために、超ＬＥＡＤは典型的に、対象となっている機能または生物活性を誘導する少なくとも１種のＬＥＡＤ変異体から少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上などの所望の量により、ＬＥＡＤの改善された活性とは異なる対象となっている機能または生物活性に関する活性を有する。さらに他の実施形態において、活性の変化は、活性の変化を誘導する少なくとも１種のＬＥＡＤ分子よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、および１０００倍、またはそれ以上の倍数で大きい。ＬＥＡＤと同様に、超ＬＥＡＤに関する活性の変化は、「導出される」活性に依存する。活性の増大または減少のいずれかであり得る所望の変化は、対象となっている機能または性質に依存する。
２つ以上の変異の組合せを創出するために使用できる別の方法では、「複数重なりプライマー伸張」と称されるオリゴヌクレオチド媒介変異誘発を用いている（同時係属中の米国特許出願第１０／６５８，３５５号明細書；米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットならびに国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットを参照）。超ＬＥＡＤＳを形成する目的で変異ＬＥＡＤの合理的な組合せのためにこの方法を使用できる。この方法により、公知の配列の小さなタンパク質またはタンパク質領域にわたって幾つかの変異の同時導入を可能にする。典型的には、長さが凡そ７０塩基のオリゴヌクレオチド（より長いオリゴヌクレオチドでは誤差が増加することから）の重なりは、典型的に凡そ２０の塩基の領域に互いに重なるように変異ＬＥＡＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）からデザインされる。典型的に、約７０塩基が、重なりオリゴヌクレオチドを創出するために使用されるが、さらに使用のための重なりオリゴヌクレオチドの長さは、約３０塩基から約１００塩基までの範囲であり得る。同様に、重なりオリゴヌクレオチドの重なり領域は、典型的に約２０塩基であるが、本明細書に使用のための他の重なり領域の長さは、約５塩基から約４０塩基までの範囲であり得る。これらの重なりオリゴヌクレオチド（点変異を含むかまたは除外する）は、ＰＣＲ（予想外の変異を避けるためにプルーフリーディングポリメラーゼ、例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いる）の第１のステップにおけるテンプレートおよびプライマーとして作用して少量の完全長遺伝子を創出する。第１のＰＣＲから生じた完全長遺伝子は、次にフランキングプライマーを用いるＰＣＲの第２のステップにおいて選択的に増幅され、引き続くクローニングを促進させるために各々が制限部位によりタグ化される。１つの複数重なり伸張法により、ＬＥＡＤ変異タンパク質から誘導された複数変異を有する候補超ＬＥＡＤタンパク質をコードする完全長（複数変異）核酸分子が生じる。
Ｅ．修飾成長ホルモンポリペプチドの産生
１．発現系
ヒトＧＨポリペプチドは、ｈＧＨをコードする核酸分子の宿主細胞、宿主動物への導入および／またはインビトロでｈＧＨをコードする核酸分子からの発現など、タンパク質産生のための当業界に公知の任意の方法により産生できる。発現宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫細胞、およびヒト細胞系ならびに遺伝子導入動物などの哺乳動物細胞が挙げられる。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現タンパク質上に存在する種々のタイプの翻訳後修飾が異なり得る。発現宿主の選択は、これら、および制御および安全性の考慮事項、生産コスト、精製の必要性ならびに方法などの他の因子に基づいて行うことができる。
真核生物宿主における発現としては、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）およびピチアパストリア（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉａ）などの酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞および鱗翅類（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）細胞などの昆虫細胞、植物およびタバコ、トウモロコシ、コメ、藻類およびウキクサなどの植物細胞における発現を挙げることができる。また発現のための真核細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞系が挙げられる。真核生物発現宿主としてはまた、遺伝子導入動物における産生、例えば、ミルクおよび卵における産生などが挙げられる。
多くの発現ベクターを、ｈＧＨの発現に利用できる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択により影響される。このような選択は、十分に当業技術者の技術範囲内にある。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび場合によってはエンハンサー、翻訳シグナル、転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、典型的に形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。幾つかの場合、ベクターのコピー数を増幅させるために複製源を使用できる。
ａ．原核生物発現
原核生物、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、大量のｈＧＨを産生する系を提供する（例えば、プラティス（Ｐｌａｔｉｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３１（２）：２２２−３０頁（２００３年）；カリザデー（Ｋｈａｌｉｚｚａｄｅｈ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２）：６３−６９頁（２００４年）を参照）。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡便かつ迅速な技法である。大腸菌の発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するために、また宿主細胞に対する幾つかの毒性を示すタンパク質を発現するために有用である誘導性プロモーターを含有できる。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター，ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７ならびにＳＰ６ＲＮＡプロモーター、および温度制御λＰＬプロモーターが挙げられる。
ヒトＧＨは、大腸菌の細胞質内環境において発現できる。該細胞質は、還元性環境であり、幾つかの分子に関して、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオールトレオトールおよびβ−メルカプトエタノールなどの還元剤ならびに変性剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素）を、タンパク質を再可溶化させるために使用できる。代替のアプローチは、酸化環境およびシャペロニン様ならびにジスルフィドイソメラーゼを提供し、溶解性タンパク質の産生をもたらし得る細菌の細胞周辺腔におけるｈＧＨの発現である。典型的には、タンパク質を細胞周辺に方向づける対象のタンパク質にリーダー配列を融合させる。次に該リーダーは、細胞周辺内のシグナルペプチダーゼにより除去される。細胞周辺標的リーダー配列の例としては、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子から誘導されるリーダーが挙げられる。幾つかの場合において、細胞周辺発現は、発現タンパク質の培養培地への漏出を可能にする。タンパク質の分泌物により、培養上澄液から迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、浸透圧性溶解により細胞周辺から得ることができる。細胞質発現と同様に、幾つかの場合においてタンパク質は不溶性になる可能性があり、変性剤および還元剤が、可溶化およびリフォールディングを促進させるために使用できる。誘導および増殖温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る。典型的に２５℃から３７℃の間の温度が使用される。発現タンパク質の溶解性を増加させるために変異もまた使用できる。典型的に、細菌は、アグリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が、機能のためにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞からの精製後にグリコシル化をインビトロで加えることができる。
ｂ．酵母
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびピチアパストリア（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉａ）などの酵母は、ｈＧＨに関して有用な発現宿主である（例えば、スココ（Ｓｋｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（Ｐｔ３）：２５７−２６５頁（２００３年）を参照）。酵母は、エピソーム複製ベクターまたは相同的組換えによる安定な染色体組込みにより形質変換できる。典型的には、遺伝子発現を制御するために誘導性プロモーターが使用される。このようなプロモーターの例としては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７ならびにＧＡＬ５、ＣＵＰ１などのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のためにＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択性マーカーを含むことが多い。酵母で発現されたタンパク質は、しばしば溶解性である。Ｂｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどのシャペロニンとの共発現により、発現レベルおよび溶解性を改善できる。さらに、酵母で発現されたタンパク質は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）からの酵母接合型アルファ因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアルクスラアデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合を用いて分泌を方向づけることができる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼなどに対するプロテアーゼ開裂部位は、ポリペプチドが分泌経路に流出するため、それらから融合配列を除去するための操作ができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいてグリコシル化できる。
ｃ．昆虫および昆虫細胞
特にバキュロウィルス発現を用いる昆虫および昆虫細胞は、ｈＧＨなどの成長ホルモンを発現するのに有用である（例えば、ムネタ（Ｍｕｎｅｔａ）ら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６５（２）：２１９−２３頁（２００３年）を参照）。血リンパにおける発現など、昆虫細胞および昆虫幼生は、高レベルのタンパク質を発現し、高級真核生物により使用される殆どの翻訳後修飾を可能にする。バキュロウィルスは、安全性を改善し、真核生物発現の調節の問題を減じる限定された宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、高レベル発現のためにバキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを用いる。一般に使用されるバキュロウィルス系としては、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウィルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウィルス、カイコガ（ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多汗症ウィルス（ＢｍＮＰＶ）およびスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、プソイダレチアユニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナウスプレキシップス（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）から誘導されるＳｆ９などの昆虫細胞系が挙げられる。高レベル発現に関して、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウィルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合させる。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確に処理され、発現タンパク質を培養培地に分泌させるために使用できる。さらに、細胞系プソイダレチアユニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナウスプレキシップス（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と同様にグリコシル化パターンによりタンパク質を産生する。
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。シュニーダー（Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ）２（Ｓ２）、Ｋｃ細胞（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（セスジヤブカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））などの細胞系を、発現のために使用できる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下、高レベルの発現を誘導するために使用できる。発現ベクターは、典型的にネオマイシンおよびヒグロマイシンなどの選択性マーカーの使用により維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を、ＧＨポリペプチドを発現するために使用できる。発現構築体は、アデノウィルスなどのウィルス感染により、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡへの移入により、電気穿孔およびミクロ注入などの物理的手段により、哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞に関する発現ベクターは、典型的にｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザク（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列）およびポリアデニル化要素を含む。ベクターは、しばしば高レベル発現のために転写プロモーター−エンハンサー類、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長い末端配列を含む。これらのプロモーター−エンハンサー類は、多くの細胞型において活性である。組織および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現のために使用できる。代表的なプロモーター／エンハンサー領域としては、限定はしないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウィルス、アルブミン、アルファ胎児タンパク質、アルファ１−抗トリプシン、ベータ−グロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２などの遺伝子からのものおよび性腺刺激ホルモン放出遺伝子制御が挙げられる。その構築体により細胞を選択し維持するために、発現構築体と共に選択性マーカーが使用できる。選択性マーカー遺伝子の例としては、限定はしないが、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼが挙げられる。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞シグナル伝達分子との融合により、細胞表面上の活性状態においてタンパク質発現を方向づけることができる。
多くの細胞系は、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞など、哺乳動物の発現に利用できる。代表的な細胞系としては、限定はしないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他のミエローマ細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞系、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、およびＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地から分泌されるタンパク質の精製を促進させる無血清培地における使用を可能にするために順応させた細胞系もまた入手可能である。このような一例としては、無血清ＥＢＮＡ−１細胞系がある（ファム（Ｐｈａｍ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−４２頁（２００３年））。
ｅ．植物
遺伝子導入植物細胞および植物を、ｈＧＨの発現に使用できる。発現構築体を、典型的には微粒子銃などの直接的ＤＮＡ移入およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介移入を用いて、またアグロバクテリウム媒介形質転換により植物に移入する。発現ベクターは、プロモーターならびにエンハンサー配列、転写終結要素および転写制御要素を含み得る。発現ベクターおよび形質転換技法は、アラビドプシスおよびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主とに通常区分される。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチンならびにＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択性マーカーが、しばしば形質転換細胞の選択および維持を促進させるために使用される。形質転換植物細胞は、細胞、集合体（カルス組織）として培養物に維持できるか、または全植物体へと再生できる。遺伝子導入植物細胞はまた、タンパク質を産生するために操作された藻類を含み得る（例えば、メイフィールド（Ｍａｙｆｉｅｌｄ）ら（２００３年）ＰＮＡＳ １００：４３８−４４２頁を参照）。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、このことが、これらの宿主におけるｈＧＨを産生の選択に影響を及ぼし得る。
２．精製
宿主細胞からのＧＨポリペプチドの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系に依存する。分泌された分子では、一般にタンパク質は、細胞除去後の培養培地から精製される。細胞内発現では、細胞を溶解し、抽出物からタンパク質を精製できる。遺伝子導入植物および動物などの遺伝子導入生物が発現に使用される場合、溶解細胞を抽出するための出発材料として組織または臓器を使用できる。さらに、遺伝子導入動物産生としては、採取できるミルクまたは卵におけるポリペプチドの産生を挙げることができ、必要ならば、さらにタンパク質を当業界において標準的な方法を用いて抽出し、さらに精製できる。
成長ホルモンは、限定はしないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、粒度分率およびゲルろ過クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィなど、当業界に公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて精製できる。アフィニティ精製技法もまた、調製物の効率および純度を改善するために利用できる。例えば、ＧＨに結合する抗体、受容体および他の分子は、アフィニティ精製に使用できる。発現構築体はまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合またはＨｉｓ６などのタンパク質にアフィニティタグを付加するために操作でき、アフィニティは、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂により精製される。純度は、ゲル電気泳動、着色および分光光度法など、当業界に公知の任意の方法により評価できる。
３．融合タンパク質
標的化剤および修飾ＧＨポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた提供される。好適な経路により投与されるために製剤化されるこのような融合タンパク質を含有する製薬組成物が提供される。融合タンパク質は、任意の順序で、修飾ＧＨと抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンドなどの試剤、および変異タンパク質を標的細胞または組織に方向づけるための他の試剤とを結合させることにより形成される。結合は、リンカーを経て直接的または間接的に達成できる。融合タンパク質は、組換えまたはヘテロ二官能性剤またはチオール結合または他のこのような結合などを介した化学結合により化学的に製造できる。融合タンパク質は、細胞によるタンパク質の取込みを促進させる大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのさらなる成分を含有できる（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第０１／３２７１１号パンフレットを参照）。
４．ポリペプチド修飾
修飾ＧＨポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖として、または複合体として調製できる。幾つかの適用に関して、翻訳後修飾または他の化学的修飾なしで「裸の」形態で修飾ＧＨを調製することが望ましいといえる。裸のポリペプチド鎖は、ＧＨを翻訳後修飾しない好適な宿主において調製できる。ポリペプチドは、インビトロ系で化学的ポリペプチド合成を用いても調製できる。他の適用に関して、ペギル化、アルブミン化、グリコシル化、リン酸化または他の公知の修飾など、特定の修飾が望ましいといえる。このような修飾は、インビトロまたは例えば、このような修飾を生じる好適な宿主において修飾ＧＨを産生することによって成すことができる。
５．ヌクレオチド配列
哺乳動物細胞における発現のために、本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドをコードする核酸分子、または誘導性プロモーターなどのプロモーターに操作可能で結合される融合タンパク質もまた提供されている。このようなプロモーターとしては、限定はしないが、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーター；ＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質に応答するＥ２遺伝子プロモーターなどのアデノウィルスプロモーター；ＰＶ Ｅ２タンパク質に応答するＰＢＶ ｐ８９プロモーターなどのＰＶプロモーター；およびＨＩＶまたはＰＶまたは発癌遺伝子により活性化される他のプロモーターが挙げられる。
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチドはまた、遺伝子移入ベクターにおいて細胞に送達できる。該移入ベクターはまた、成長ホルモン媒介疾患または病態の治療用、成長欠乏、ＨＩＶ感染、修飾ＧＨが投与される他のものの治療用にさらなる治療剤をコードできる。修飾ＧＨポリペプチドをコードする移入ベクターは、核酸を対象に投与することにより全身的に使用できる。例えば、移入ベクターは、アデノウィルスベクターなどのウィルスベクターであり得る。ＧＨをコードするベクターはまた、幹細胞に取り込むことができ、治療部位に幹細胞を移植または植え付けることによって、幹細胞を対象に投与できる。
Ｆ．修飾成長ホルモンポリペプチド活性の評価
ＧＨ生物活性は、インビトロおよび／またはインビボで評価できる。例えば、ＧＨ変異体は、非修飾および／または野生型ＧＨと比較してインビボで評価できる。ＧＨ変異体はまた、生物活性、安定性（例えば、半減期）および治療効果を確認するためにインビボで試験できる。インビボアッセイとしては、動物モデルにおけるＧＨアッセイならびにヒトへの投与が挙げられる。
１．インビトロアッセイ
インビトロアッセイとしては、タンパク質アッセイおよび生物活性に関するアッセイが挙げられる。安定性アッセイとしては、プロテアーゼ耐性、熱安定性および当業界に公知の他のタンパク質構造の判定ならびにコンフォメーションアッセイを挙げることができる。生物活性に関するアッセイは、その受容体とのＧＨ相互作用の測定またはＧＨ細胞経路に対するＧＨ変異体の効果を判定する細胞ベースアッセイを含み得る。生物学的アッセイの一例としては、細胞ベース増殖アッセイである。手短に言うと、修飾ＧＨポリペプチドを、Ｎｂ２−１１Ｃ細胞（ラットリンパ腫細胞系）などの細胞系において細胞増殖を刺激する能力に関して試験する。細胞を、非修飾ＧＨまたは修飾ＧＨポリペプチドにより処置する。インキュベーション後、細胞増殖を、例えば、細胞カウンティングおよび／または生存細胞数（例えば、生存株を用いて）を測定することにより測定する。「力価」は、非修飾および／または野生型ＧＨポリペプチドの「力価」と比較して、ＧＨの濃度とその活性（すなわち、細胞増殖活性）を測定することにより算出できる。
２．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルは、成長ホルモン変異体の活性および安定性を評価するための有用な手段である。例えば、非ヒト動物は、疾患または病態に関するモデルとして使用できる。非ヒト動物に、疾患および／または表現型誘導物質を注入してから、成長ホルモン変異体を投与して疾患進行に対する効果をモニターすることができる。遺伝子モデルもまた有用である。１つまたは複数の遺伝子の過剰発現、発現不足またはノックアウトにより疾患または病態を模倣するマウスなどの動物を作製できる。このような動物は、当業界に周知の遺伝子導入動物生産技法により、または天然あるいは誘導変異株を用いて作製できる。成長抑制に関連する疾患の有用な非ヒト動物モデルの例としては、限定はしないが、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）株（ｄｗ／ｄｗ）の成長ホルモン欠乏矮化ラットなどの矮化動物、自然発症矮化ラット（ＳＤＲ）；成長ホルモン欠乏矮化マウス（ｌｉｔ／ｌｉｔまたは「小マウス」）、エイムス矮化マウス（Ｐｒｏｐ１１ｄｆ）、バイエル（Ｂａｙｅｒ）矮化マウス、スネル（Ｓｎｅｌｌ）の矮化マウス（Ｐｉｔ１ｄｗ）；矮化株のブタ、プードルおよびブラーミン（Ｂｒａｈｍｉｎ）ウシ；成長ホルモン受容体ノックアウトマウス（ＧＨＲ−／−）；ラットなどの下垂体切除動物；モルモットおよびラロン型マウスなどの成長ホルモン効果に抵抗性の動物種および株が挙げられる。
これらの非ヒト動物モデルは、野生型成長ホルモンと比較して成長ホルモン変異体の生物活性をモニターするために使用できる。ＧＨ活性の最も一般的なタイプのインビボバイオアッセイは、下垂体切除ラット（エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２２：４８３−４９２頁（１９３８年）；マルクス（Ｍａｒｘ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３０：１−１０頁（１９４２年）；およびグリースベック（Ｇｒｅｅｓｂｅｃｋ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２０：２５８２−２５９０頁（１９８７年））または矮化「小」マウス（ベリニ（Ｂｅｌｌｉｎｉ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：２０５１−２０５５頁（１９９３年））における体重増加である。手短にいうと、矮化マウスは、浸透圧ミニポンプにより変異体または野生型ＧＨの連続皮下投与で処置できる。処置プロトコルに従って、ＧＨ生物活性を示す変数としては、限定はしないが、体重増加、体内組成物（身体質量に関連する水、脂肪、タンパク質）の変化、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦＢＰ−３産生が挙げられ、成長ホルモン受容体ｍＲＮＡのレベル（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより測定）、空腹時脂質プロフィル、血糖およびインスリンレベルを測定できる。
ＧＨ活性のインビボバイオアッセイの別の一般的なタイプは、下垂体切除ラットに対する脛骨プレートアッセイである（グリースパン（Ｇｒｅｅｓｐａｎ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４５：４５５−４６３頁（１９４９年））。手短に言うと、下垂体切除術を、青春期直前オスマウスにおいて実施する。２週間に亘って１週当り２グラム未満増加の動物を、ＧＨ注入用に選択する。ミニ浸透圧ポンプに、修飾ＧＨポリペプチドを満たし、腹部皮下に入れる。食餌および水の摂取ならびに体重を、投与プロトコル前、投与プロトコル時に測定する。動物を大動脈穿刺により出血させ、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡにより血清を分析してホルモンの血清濃度を評価する。立体顕微鏡下で骨端幅を、銀染色脛骨の分析により測定し、入射光蛍光顕微鏡によりメタクリレート埋設脛骨断片において蓄積長軸方向骨成長を測定することにより成長速度を評価できる。
ＧＨの調節および活性における変化を特徴とする他の疾患および障害の処置のための、ＧＨ変異体の確認および試験に有用な他の好適な非ヒト動物モデルとしては、限定はしないが、ＡＩＤＳ消耗のＳＩＶ（サル免疫不全ウィルス）−感染マカクモデル；嚢胞性線維症のｃｆｔｒ−／−マウスモデル；クローン病のｍｄｒ１ａ−／−またはＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウスモデル；および慢性腎疾患の腎切除マウスまたはラットモデルが挙げられる。
さらに動物モデルは、成長ホルモン変異体の安定性、半減期およびクリアランスをモニターするために使用できる。このようなアッセイは、成長ホルモン変異体を比較し、さらに非ヒト動物およびヒト試験のための用量および用量措置を算出するために有用であり得る。例えば、修飾成長ホルモンは、マウスの尾静脈に注射できる。次いで血液サンプルを、注射後の時点（数分後、数時間後および数日後など）で採取してから、限定はしないが、血清または血漿などの体内サンプルにおける成長ホルモン変異体のレベルを、特定の時点で、例えば、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫アッセイによりモニターできる。
３．臨床アッセイ
臨床使用を目的に成長ホルモンの生物活性を評価するために、多くのアッセイが利用できる。このようなアッセイとしては、受容体結合、受容体活性化、タンパク質の安定性ならびにインビボでの半減期の評価および表現型アッセイが挙げられる。代表的なアッセイとしては、限定はしないが、放射性受容体アッセイ（ツシマ（Ｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３７：３４４−３３７頁（１９７３年）；およびレスニアク（Ｌｅｓｎｉａｋ）ら、Ｎａｔｕｒｅ２４１：２０−２２頁（１９７３年））、受容体調節アッセイ（ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５０：６２−６９頁（１９８０年））、およびＮｂ２細胞系を用いる細胞増殖バイオアッセイ（タナカ（Ｔａｎａｋａ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５１：１０５８−１０６３頁（１９８０年））などの臨床使用に好適なインビトロＧＨバイオアッセイが挙げられる。他の技法としては、対象の血清中の濃度測定においてｈＧＨに関するバイオアッセイ系を確立するためにｈＧＨ受容体を発現するマウスプロＢ細胞リンパ腫細胞系の使用を挙げることができる（イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８５（１１）：４２７４−４２７９頁（２０００年））。
表現型アッセイおよびＧＨ処置の治療効果を評価するアッセイとしては、非修飾および／または野生型ＧＨまたはプラセボにより処置された対象と比較して、ＧＨの血清レベルの評価（例えば、肥満度指数（ＢＭＩ）を補正して、投与前および最初の投与後、最終投与直後、中間時点などの投与後時点の血清中ＧＨおよび脳下垂体前葉ホルモンの測定）、経時的症状の寛解などのＧＨ治療に対する表現型応答が挙げられる。例えば、成長を刺激する治療において、アッセイとしては、成長速度測定、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、およびＧＨＲＨの血清レベルの測定を挙げることができる。空腹時脂質プロフィル、グルコースおよびインスリンは、放射免疫アッセイによっても測定できる。
Ｇ．製剤／投与
ｈＧＨ変異体ポリペプチド、ｈＧＨ融合タンパク質または核酸分子をコードするものなど、本明細書で生産された変異体を含有する製薬組成物は、該ポリペプチドの選択された量を、１種または複数種の生理的に許容できる担体または賦形剤と混合することにより任意の従来様式で製剤化できる。担体または賦形剤の選択は、投与技術職の技術内にあり、多くのパラメータに依存する。これらとしては、例えば、投与様式（すなわち、全身、経口、鼻腔、肺、局所または任意の他の様式）および治療を受ける障害が挙げられる。本明細書に提供される製薬組成物は、単回用量（直接）投与用または希釈用あるいは他の変法用に製剤化できる。製剤中の化合物濃度は、投与された際、目的の治療に有効な量の送達にとって効果的である。典型的に該組成物は、単回用量投与用に製剤化される。組成物を製剤化するために、治療を受ける病態が軽減されるか、または寛解されるように、化合物またはその混合物の重量分率を有効な濃度で選択された媒体中に溶解、懸濁、分散または他に混合する。本明細書に提供される化合物の投与に好適な製薬用担体または媒体としては、特定の投与様式に好適である当業者に公知の任意のこのような担体が挙げられる。
ポリペプチド類は、該組成物中に単独の製薬的活性成分として製剤化できるか、または他の活性成分と組合わせることができる。該ポリペプチド類は、抗体などの標的化剤への結合などにより、送達のために標的化できる。組織標的化リポソームなどのリポソーム懸濁液もまた、製薬的に許容できる担体として好適であり得る。これらは、当業者に公知の方法に従って調製できる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているとおりに調製できる。リポソーム送達としてはまた、コラーゲンゲルおよびフィブロネクチンで修飾されたリポソームなどの製薬マトリクスなどの遅延放出製剤を挙げることができる（例えば、ウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７４（９）：９２２−５頁（１９８５年）を参照）。
活性化合物は、治療を受ける対象に対して望ましくない副作用の無い治療的に有用な効果を発揮するための十分な量で製薬的に許容できる担体に含まれる。治療的に有効な濃度は、本明細書に提供されたアッセイなど、公知のインビトロおよびインビボ系で化合物を試験することにより経験的に決定できる。活性化合物は、液体、半液体または固体形態で任意の適切な経路、例えば、経口、経鼻、肺、非経口、静脈内、皮内、皮下、または局所に投与でき、各投与経路に好適な様式で製剤化される。
修飾ｈＧＨおよび生理的に許容できる塩類ならびに溶媒和は、吸入（口腔または鼻腔のいずれかを介して）、経口、肺、経皮、非経口または直腸投与による投与のために製剤化できる。吸入による投与に関して、修飾ｈＧＨは、加圧パックからのエーロゾルスプレー提供または好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用してネブライザーの形態で送達できる。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するバルブを用意することにより計測できる。吸入器または注入器に使用するため、例えば、ゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、治療用化合物とラクトースまたは澱粉などの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化できる。
肺への肺投与に関して、修飾ｈＧＨは、好適な噴射剤の使用によるネブライザー、ターボネブライザー、またはミクロプロセッサ制御計量用量経口吸入器からのエーロゾルスプレー提供の形態で送達できる。一般に、粒径は、０．５から５ミクロンなどの範囲で小さい。肺投与のために製剤化された製薬組成物の場合、界面活性剤は、一般に使用されない。肺薬物送達は、全身投与の有望な非侵襲的方法である。肺は、主として吸収にとって高表面積、薄い肺胞上皮、広範な血管分布、肝初回通過代謝の欠如、および比較的低い代謝活性のために、薬物送達にとって魅力的な経路となっている。
修飾ｈＧＨポリペプチド類は、デポー剤として製剤化できる。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注入により投与できる。したがって、例えば、治療化合物を、好適なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容できる油中の乳濁液として）、イオン交換樹脂と共に、またはわずかに溶解性の誘導体、例えば、わずかに溶解性の塩として製剤化できる。
修飾ｈＧＨを、注入（例えば、大量瞬時投与または連続点滴）による非経口投与用に製剤化できる。注射用製剤は、添加保存剤と共に単位剤形（例えば、アンプルまたは多用量容器）で提供できる。該組成物は、油性または水性媒体中、懸濁液、溶液または乳濁液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有できる。他に、活性成分は、好適な媒体、例えば、使用前に無発熱物質滅菌水により構成するために、凍結乾燥粉末形態であり得る。
活性剤は、ゲル剤、クリーム剤、およびローション剤の形態で、皮膚（経皮）および眼などの粘膜に対する局所適用、および眼あるいは大槽内または脊髄内への適用など、局部または局所適用のための製剤化できる。このような溶液、特に眼科使用を目的としたものは、適切な塩類により０．０１％〜１０％等張液および約５〜７のｐＨとして製剤化できる。化合物は、吸入などによる局所適用のためにエーロゾルとして製剤化できる（例えば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドの送達に関するエーロゾルを記載している米国特許第４，０４４，１２６号明細書、米国特許第４，４１４，２０９号明細書および米国特許第４，３６４，９２３号明細書を参照）。
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活化および排泄、投与計画、投与量ならびに当業者に公知の他の因子に依存する。さらに本明細書に記載されているように、投与量は、非修飾ｈＧＨの投与に関して当業界に公知の投与量および非修飾および／または天然のｈＧＨと比較して、修飾ｈＧＨの性質と活性（例えば、安定性と生物活性）の比較を用いて経験的に決定できる。
所望ならば、製薬組成物は、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含有できるパッケージ、キットまたはディスペンサーデバイスにおいて提供できる。例えば、パッケージは、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与に関する使用説明書を添付できる。活性剤を含有する製薬組成物は、パッケージング材料、本明細書に提供された薬剤、該薬剤が用意される障害を示すラベルを含有する製品として包装できる。
修飾ＧＨポリペプチドの中で、経口送達に修正可能な条件に対して安定性を増大させる修飾ＧＨポリペプチドが本明細書に提供される。経口送達は、口腔および／または胃腸管への投与を含むことができる。このような修飾としては、唾液への曝露、胃腸管内のプロテアーゼへの曝露、胃の低ｐＨおよび／または腸内のｐＨ条件などの特定のｐＨ条件への曝露など、１つまたは複数の条件下でのタンパク質半減期の増加を挙げることができる。修飾としては、ゼラチナーゼＡおよびゼラチナーゼＢなど、胃の低ｐＨにおける１つまたは複数のプロテアーゼに対する耐性を挙げることができる。修飾としてはまた、耐熱性、混合および空気混入（例えば、咀嚼）に対する耐容性などの潜在的変性またはコンフォメーション変化条件に対する総合的安定性の増大を挙げることができる。
経口送達に対する適合性のために修飾された成長ホルモンポリペプチドは、本明細書に記載された任意の方法を用いて調製できる。例えば、タンパク質の合理的な導出に関する２Ｄ−および３Ｄ−走査変異誘発法（同時係属中の米国特許出願第１０／６５８，３５５号明細書；米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書および国際公開第２００４／０２２５９３号パンフレットならびに国際公開第２００４／０２２７４７号パンフレットを参照）は、修飾ＧＨポリペプチドを調製するために使用できる。経口送達にとって好適性を目的としたＧＨの修飾としては、ＧＨのタンパク質分解消化部位の除去および／またはＧＨ構造の総合的安定性の増加を挙げることができる。このような修飾ＧＨは、経口送達の１つまたは複数の条件において非修飾および／または野生型天然ＧＨと比較して、タンパク質の半減期増加を示す。例えば、修飾ＧＨは、口腔、咽喉（例えば、粘膜内層を介して）、胃腸管においてまたは全身的にタンパク質の半減期および／または生物学的利用能を増加させることができる。
一実施形態において、本明細書に提供された修飾ＧＨ類のインビトロまたはインビボの半減期（血清安定性）は、経口送達のために１つまたは複数の条件に曝露された天然のＧＨの半減期と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、および少なくとも５００％、またはそれ以上から選択される量で増加する。他の一実施形態において、本明細書に提供された修飾ＧＨ類のインビトロまたはインビボの半減期（血清安定性）は、経口送達のために１つまたは複数の条件に曝露された天然のＧＨの半減期と比較した場合、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、および１０００倍、またはそれ以上から選択される倍数の量で増加する。
一例において、修飾ＧＨの半減期は、１種または複数種のプロテアーゼの存在下での半減期の増加により評価される。修飾ＧＨは、１種または複数種のプロテアーゼと混合し、次いで好適な反応時間後、生物活性および／またはタンパク質構造を評価できる。また半減期の評価は、対象の体温などの上昇温度への曝露；胃液および／または擬似胃液への暴露；特定のｐＨ条件および／または２つ以上の条件の組合せへの曝露を含み得る。１つまたは複数の条件への曝露後、ＧＨ構造の生物活性および／または評価を用いて、適切な対照（すなわち、非修飾および／または野生型ＧＨタンパク質）と比較して、修飾ＧＨの半減期を評価できる。
修飾ｈＧＨポリペプチド類は、錠剤、カプセル剤または液剤、または経口投与用の他の好適な媒体などにおいて、経口投与用に製剤化できる。経口送達用に修飾ＧＨを含有する製薬組成物の調製としては、修飾ＧＨと当業界に公知で本明細書に記載されている経口用製剤との製剤化を挙げることができる。製剤化された組成物は、プロテアーゼ阻害剤および／またはプロテアーゼ、ｐＨおよび経口送達への他の条件の曝露の際に、非修飾および野生型ＧＨの安定化にとって必要な他の成分の添加を必要としない。例えば、このような組成物は、アクチノニンまたはエピアクチノニンおよびそれらの誘導体；ボーマン・バーク阻害剤およびその複合体；アプロチニンおよびカモスタットなどの化合物の不在下で安定性を示す。
さらに、本明細書に提供されている修飾ＧＨが、タンパク質安定性の増大を示すことから、製薬組成物の投与において非修飾対応物よりも適応性がある。典型的に、経口摂取ＧＨは、朝食前（すなわち、消化酵素が活性化される前）に投与する。本明細書の修飾ＧＨは、消化酵素プロテアーゼ耐性を示し、消化酵素が存在し、活性である条件下で１日または他の期間、修飾ＧＨを含有する製薬組成物を投与する能力を提供できる。
経口投与に関して、該製薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）：滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）：崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム）：または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬的に許容できる賦形剤と共に従来の手段により調製された、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当業界に周知の方法によりコーティングできる。錠剤は、筋肉質量を増加させるサプリメントとして摂取できる。経口投与用液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができるか、またはそれらは、使用前に水または他の好適な媒体との構成のために乾燥製品として提供できる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル類、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存剤（例えば、ｐヒドロキシ安息香酸メチルあるいはプロピルまたはソルビン酸）などの製薬的に許容できる添加物と共に従来の手段により調製できる。該製剤はまた、適切な場合、緩衝塩類、風味剤、着色剤および／または甘味剤を含有できる。
経口投与用製剤は、持続放出または徐放性を与えるか、または活性化合物の胃または小腸通過後に放出のために製剤化できる。経口投与用組成物は、錠剤、カプセル剤、液剤、舐剤の形態、および経口投与に好適な他の形態をとることができる。経口投与に好適な製剤としては、舐剤および製薬製剤を口腔、咽喉および／または胃腸管の粘膜に送達する他の製剤が挙げられる。舐剤は、賦形剤、例えば、無水結晶性マルトースおよびステアリン酸マグネシウムなどの好適な成分と共に製剤化できる。本明細書に注記されているように、修飾ＧＨ類は、血液または腸管プロテアーゼに対する耐性を示し、さらなるプロテアーゼ阻害剤または他の保護化合物無しで製剤化できる。経口投与用製剤としてはまた、プロテアーゼ耐性または特定のｐＨ条件などの他の条件における安定性をも付与する１種または複数種のさらなる成分と共に製剤化された耐タンパク質分解性の修飾ＧＨを挙げることができる。
ｈＧＨポリペプチド類をコードする核酸分子および遺伝子療法に好適であるそれらをコードする発現ベクターの製薬組成物もまた提供される。該タンパク質の送達ではなく、核酸分子を、リンパ球などの細胞を取り出し、それらへの核酸の導入、宿主または適合性レシピエントへの再導入などにより、インビボ（例えば、全身的または他の経路により）、またはエキソビボで投与できる。
ヒトＧＨポリペプチド類は、核酸分子の発現により細胞および組織に送達できる。ヒトＧＨポリペプチド類は、エキソビボ技法およびインビボ直接発現など、ｈＧＨポリペプチド類をコードする核酸分子として投与できる。
核酸は、当業者に公知の任意の方法により細胞および組織に送達できる。単離核酸配列を、さらなる操作のためにベクター内に取り込むことができる。本明細書に用いられるように、ベクター（またはプラスミド）は、異種ＤＮＡをその発現または複製を目的として細胞に導入するために使用される個別の要素を称す。このような媒体の選択および使用は、十分に当業技術者の範囲内にある。
コードしている核酸分子を発現することよってｈＧＨポリペプチド類を投与する方法は、組換えベクターの投与を含む。該ベクターは、複製源の包含などによりエピソームのままで残るようにデザインできるか、または細胞の染色体に組み込むようにデザインできる。ヒトＧＨポリペプチド類は、非ウィルスベクターを用いるエキソビボ遺伝子発現療法にも使用できる。例えば、調節配列に操作的に結合させるか、またはゲノム位置における調節配列に操作的に結合されて配置されるように、ｈＧＨポリペプチドをコードしている核酸をゲノム位置に組み込むことなどにより、ｈＧＨポリペプチドが発現されるように細胞を操作できる。次いでこのような細胞を、治療の必要な患者などの対象に局所的または全身に投与できる。
ウィルスベクターとしては、例えば、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルスが挙げられ、また遺伝子療法用にデザインされた他のウィルスを使用できる。ベクターは、エピソームのままで残り得るか、または治療対象の染色体に組み込むことができる。治療の必要な対象に投与されるｈＧＨポリペプチドを、ウィルスによって発現させることができる。遺伝子療法に好適なウィルスベクターとしては、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルスおよび上記の他のウィルスが挙げられる。例えば、アデノウィルス発現技法は、当業界に周知であり、アデノウィルスの生産および投与法もまた周知である。アデノウィルス血清型は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビルメリーランド州（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ））から入手できる。アデノウィルスは、エキソビボで使用できる。例えば、細胞を治療の必要な患者から単離し、ｈＧＨポリペプチド発現アデノウィルスベクターにより形質導入される。好適な培養期間後、形質導入された細胞を、対象に局所的および／または全身に投与される。あるいは、ｈＧＨポリペプチド発現アデノウィルス粒子を単離し、対象の疾患または病態を予防、治療または改善する治療的有効量の送達のために、製薬的に許容できる担体中で製剤化される。典型的に、アデノウィルス粒子は、対象の体重１ｋｇ当り１個の粒子から１０１４個の粒子、一般に対象の体重１ｋｇ当り１０６個または１０８個の粒子から１０１２個の粒子間範囲の用量で送達される。幾つかの状況において、細胞表面膜タンパク質または標的細胞、標的細胞上の受容体に関するリガンドに特異的な抗体など、細胞を標的とする薬剤と共に核酸源を提供することが望ましい。
該核酸分子を、人工染色体および他の非ウィルスベクターに導入できる。イソ型をコードし、発現するためにＡＣＥＳなどの人工染色体（リンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（２１）：ｅ１７２頁（２００４年）を参照）を操作できる。手短に言うと、哺乳動物の人工染色体（ＭＡＣ）類は、自己複製非組込みフォーマットにおいて遺伝子情報の最大積載量を細胞に導入する手段を提供する。ＭＡＣ類の中でユニークな哺乳動物の付随ＤＮＡベース人工染色体発現（ＡＣＥ）は、異なる種の細胞系においてデノボで再生的に作出でき、宿主細胞の染色体から容易に精製できる。次いで精製された哺乳動物ＡＣＥ類を、ＡＣＥシステムを用いて選択圧の不在下、意図された期間、安定に維持される種々のレシピエント細胞に再導入できる。このアプローチを用いて、１つまたは２つの遺伝子標的の特異的挿入が、ＬＭＴＫ（−）細胞およびＣＨＯ細胞で達成されている。
さらに別の方法は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）でクローン化された完全アデノウィルスゲノム（Ａｄ２；ケトナー（Ｋｅｔｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６１８６−６１９０頁（１９９４年））およびＹＡＣクローンの特異的領域を標的にするアデノウィルス配列を含有するプラスミド、対象の遺伝子に関する発現カセットおよび陽性ならびに陰性選択性マーカーを出発とする、酵母における２ステップ遺伝子置換法である。
修飾ＧＨポリペプチド類をコードする核酸を、リポソームなどの媒体中にカプセル化できるか、または細菌細胞、特に弱毒化細菌などの細胞に導入できるか、あるいはウィルスベクターに導入できる。例えば、リポソームを使用する場合、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいて内在化を受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質、を標的にし、および／またはそれらの取込みを促進するために、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を使用できる。
エキソビボ法およびインビボ法では、ｈＧＨポリペプチドをコードする核酸分子は、好適なドナーまたは治療を受ける対象に由来する細胞に導入される。核酸を治療目的のために導入できる細胞としては、例えば、限定はしないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；特に造血幹細胞または始原細胞、たとえば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児性肝、および他の供給源から得られたそれらの幹細胞などの種々の幹細胞または始原細胞など、治療を受ける疾患または病態に適切な任意の所望の利用できる細胞型が挙げられる。
エキソビボ治療に関して、治療を受ける対象または治療を受ける対象の細胞に適合したドナーから細胞を取り出し、核酸をこれらの単離細胞に導入し、修飾された細胞を対象に投与する。治療としては、例えば、患者に移植される多孔性膜内にカプセル化されるなどの直接投与が挙げられる（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号明細書および米国特許第５，２８３，１８７号明細書を参照）。哺乳動物細胞への核酸のインビトロでの移入に好適な技法としては、リポソームおよびカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔法、ミクロ注入法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、およびリン酸カルシウム沈殿法が挙げられる。ＤＮＡ送達法は、インビボでのｈＧＨポリペプチドを発現するために使用できる。このような方法としては、電気穿孔、超音波および燐酸カルシウム沈殿送達などを用いる局所および全身送達など、核酸のリポソーム送達および裸のＤＮＡ送達のリポソーム送達が挙げられる。他の技法としては、ミクロ注入、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、ミクロ細胞媒介遺伝子移入およびスフェロプラスト融合が挙げられる。
ｈＧＨポリペプチドのインビボ発現は、さらなる分子の発現に関連させることができる。例えば、ｈＧＨポリペプチドの発現は、改変ウィルスなどにおいてまたは細胞毒ウィルスで発現されて、細胞毒産物の発現と関連させることができる。このようなウィルスは、治療効果の目標である特定の細胞型に標的化できる。発現ｈＧＨポリペプチドを、ウィルスの細胞毒性を増強させるために使用できる。
ｈＧＨポリペプチドのインビボ発現は、核酸分子をコードするｈＧＨポリペプチドを、細胞特異的または組織特異的プロモーターなどの特異的制御配列に操作的に結合させることを含み得る。ヒトＧＨポリペプチドはまた、標的細胞型および／または組織において特異的に感染し、および／または複製するベクターから発現できる。ｈＧＨポリペプチド発現を選択的に調節するために、誘導性プロモーターを使用できる。
裸の核酸分子の形態またはベクター、人工染色体、リポソームおよび他の媒体中の核酸分子を、全身投与、局所投与、局部投与および他の経路の投与により対象に投与できる。インビボで全身の場合、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞に標的化できる。
投与はまた、典型的に細胞または組織を標的とするベクターまたは細胞の投与などにより直接的であり得る。例えば、腫瘍細胞および増殖が、ｈＧＨポリペプチドのインビボ発現のための標的細胞であり得る。ｈＧＨポリペプチドのインビボ発現に使用される細胞としてはまた、患者の自己由来の細胞が挙げられる。これらの細胞を、患者から取り出し、ｈＧＨポリペプチドの発現のための核酸を導入し、次いで注入または移植などにより患者に投与できる。
本明細書に提供されるポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、任意の好適な方法により作製できる。配列番号２〜６９、７５、７６、８５〜１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３〜１５４、１６４〜１６５、１７６〜２１６、２２２および２２３またはそれらの機能性断片のいずれかで示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子など、上記の核酸分子を含んでなる核酸ベクターがさらに提供される。上記の核酸分子を含んでなる核酸ベクターおよびこれらのベクターを含有する細胞がさらに提供される。
Ｈ．治療使用
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチド類および核酸分子は、非修飾ＧＨが使用されている病態のいずれの治療にも使用できる。本節では、修飾ＧＨポリペプチド類の代表的な使用法および投与方法を提供する。これら記載された療法は、代表的なものであり、ＧＨの適用を限定するものではない。
本明細書に提供される修飾ＧＨポリペプチド類は、ＧＨが治療に使用される種々の療法ならびに診断法における使用を目的としている。このような方法としては、限定はしないが、下記に掲げられた生理的および医学的病態の治療方法が挙げられる。本明細書に提供された修飾ＧＨポリペプチド類は、安定性が改善されることにより、対応するインビボ活性ならびに治療効果の改善を示す。
特に、修飾ＧＨポリペプチド類は、天然タンパク質が治療に使用されている治療法における使用を目的としている。障害の治療としては、限定はしないが、成長欠乏障害（限定はしないが、ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群、およびサラセミアなど）、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の免疫機能障害、異化作用病（呼吸不全および火傷に関連するものなど）、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、慢性炎症障害または栄養障害（クローン病など）、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛を挙げることができる。修飾ＧＨポリペプチド類および修飾ＧＨポリペプチド類をコードする核酸分子もまた、他の生物学的製剤および小分子化合物などの他の療法と組合わせて投与できる。
修飾ＧＨポリペプチド類による疾患および病態の治療は、限定はしないが、皮下注射、経口、経鼻、肺および経皮投与など、本明細書に記載された好適な製剤を用いて任意の好適な経路により達成できる。必要ならば、特定の投与量および期間ならびに治療プロトコルは、経験的に判定できるか、または外挿できる。例えば、組換えならびに天然ＧＨポリペプチドの代表的な用量は、適切な投与量を判定するための出発点として使用できる。より安定でインビボ半減期の増加した修飾ＧＨポリペプチド類は、減少用量およびまたは減少回数で有効であり得る。ＧＨおよび組換え形態による治療および療法のために本明細書に提供された投与量は、代表的な投与量である。しかしながら、このような代表的な投与量は、ＧＨ変異体に関する投薬措置を選択する際のガイダンスを提供できる。本明細書に提供された変異ＧＨポリペプチド類は、安定性の増加を示すことから、投与量および投与措置は、非修飾成長ホルモンのものとは異なり得る。具体的な投与量および措置は、経験的に判定できる。
投与量レベルは、通常の当業者にとって明らかであると考えられ、個体の体重、全身的健康状態、年齢、使用される具体的な化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物併用、疾患または病態の重症度および過程、疾患／病態に対する対象の体質および治療医師の判定などの種々の因子に基づいて判定されるであろう。単位剤形を製造するために担体材料と組合わせることができる活性成分量は、治療を受ける対象および特定の投与様式に依り変わる。
対象の病態が改善されたら、本明細書に提供された化合物または組成物の維持用量が投与でき、必要ならば；投与量、剤形、または投与回数、あるいはそれらの組合せを変えることができる。幾つかの場合、対象は、疾患症状の再発に基づいて長期の間欠的治療を必要となり得る。
１．成長欠乏
幼児から成人への成長は、多くの遺伝子およびホルモン、ならびに栄養、食事、運動、および休息が関与する複雑な過程である。成長ホルモンは、成長および発育の中心であり、個体の身長を調節する重要なホルモンである。成長ホルモン欠乏は、しばしば脳の下垂体または視床下部における問題に起因する疾患である。成長ホルモン欠乏は、ＧＨが下垂体に存在しない場合か、またはＧＨが下垂体に存在するが、それを放出するのに必要なホルモン（ＧＨＲＨ）を欠いている場合に生じ得る。成長抑制は、成長ホルモン（ＧＨ）系の欠乏のために小児の正常な成長が遅速化するか、または停止する医学的病態である。
小児におけるＧＨ欠乏には２つの異なるタイプ、すなわち先天性および後天性のものがある。
先天性の成長ホルモン欠乏は、胎児が子宮内で発育している間に、脳下垂体または視床下部の問題からより生じるが、一方、後天性成長ホルモンの欠乏は、脳下垂体または視床下部周辺領域が、何らかの仕方で損傷を受ける場合に生じる。幾つかの場合において、成長ホルモンの欠乏の原因は確認できない（「特発性」）。このような場合としては、プラーダーヴィリ症候群（ＧＨ欠乏および短身長を特徴とする先天性障害）、ターナー症候群（少女のみに出現し、短身長を特徴とする遺伝子欠乏）、慢性腎不全（小児における成長抑制をしばしば引き起こし得る腎機能障害）、およびサラセミア（重篤な貧血症を引き起こすヘモグロビン合成の不均衡およびＧＨ分泌減少および短身長を引き起こし得る奇形赤血球を特徴とする遺伝性病態）が挙げられる。
成長欠乏は、小児に影響を及ぼすばかりでなく、成人にとっても重要な問題となり得る。成人におけるＧＨ欠乏は、限定はしないが：中枢肥満症などの体組成の変化；血中脂質；筋強度；骨組成；運動能力およびエネルギー；心血管の危険性；および心理的健康（例えば、社会的隔離およびうつ状態）など、多くの生理的帰結を伴う具体的臨床症候群である。さらに下垂体機能不全対象は、ＧＨ欠乏に起因し得る心血管疾患からの死亡率の危険性が増加する可能性のあることが調査により示されている。成人のＧＨ欠乏は、下垂体あるいは下垂体周辺腫瘍、またはこれらの病態を管理するために使用される手術／放射線の直接的結果から生じ得る。一般性が低いが、成人のＧＨ欠乏は、小児時代に獲得した欠陥から発生する。
成長欠乏の治療的処置として使用される組換えＧＨは、体内で通常産生されると考えられるＧＨを補足し、および／またはＧＨを補充する。成人および小児用の治療は、ＧＨの全身投与を含み得る。例えば、ＧＨは、単独で、または他の治療剤と併用して、他の治療剤の前に、他の治療剤と共に断続的に、または他の治療剤の後に投与できる。投与の形態としては、ＧＨ注入が挙げられるが、これに限定されない。修飾ＧＨポリペプチドおよび本明細書に記載された修飾ＧＨ類をコードする核酸は、成長欠乏療法に使用できる。本明細書の修飾ＧＨ類は、タンパク質安定性の増大および半減期の改善を示し、それによって製薬組成物の治療有効性を改善する。したがって修飾ＧＨは、より長い持続性のより安定な成長欠乏療法を送達するために使用できる。修飾ＧＨを用いる治療改善の例としては、限定はしないが、例えば、低用量、投与回数の減少および／または低下、副作用の減少および治療効果の増大が挙げられる。
本明細書に提供される修飾ＧＨ類の投与量および措置は、経験的に判定できる。例えば、血清安定性などの性質の改善のため、投与量は、非修飾ＧＨの同等量よりも少なくできる。非修飾ＧＨの投与量は、修飾ＧＨの投与量を判定するための指針として使用できる。非修飾ＧＨと比較した修飾ＧＨの活性レベルおよび半減期などの因子を、このような判定を行うために使用できる。
成長欠乏の治療のためにＧＨ療法の目的の中に、同じ性別および同様の年齢の健康な人と同等な生理的レベルへのＧＨの長期補充がある。ＧＨの投与措置は、限定はしないが、対象の年齢；思春期状態；対照の耐容性および副作用の発生率；組換えであれ天然であれＧＨの供給源などの多くの因子に依存し得る。例えば、組換えＧＨの効力は、下垂体ＧＨの効力の約三分の一である。具体的な用量および投与措置は、経験的に判定できる。非修飾下垂体ＧＨの代表的な用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／週（０．３ＩＵ／ｋｇ／週）であり得；組換え非修飾ＧＨの代表的な用量は、ＧＨＤ小児に対して０．１８から０．３ｍｇ／ｋｇ／週であり得る（マクギリブレイ（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：５２７−５３０頁（１９９８年））。成長ホルモン欠乏小児に投与されるＧＨの平均用量は、皮下注射により投与される０．３ｍｇ／ｋｇ／週に分割された毎日の用量である。小児おけるＧＨ欠乏障害の治療における他の代表的な用量としては、慢性腎不全小児に対して０．３５ｍｇ／ｋｇ／週；ターナー症候群小児に対しては０．３７５ｍｇ／ｋｇ／週；特発性短身長小児に対しては０．３ｍｇ／ｋｇ／週；および子宮内成長抑制小児に対しては０．７ｍｇ／ｋｇ／週が挙げられる（例えば、バンス（Ｖａｎｃｅ）ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４１（６）：１２０６−１２１６頁（１９９９年）を参照）。
成人におけるＧＨの出発用量は、典型的には皮下注射による０．０１〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／週である。３５才までの対象の最大毎日用量は、典型的に０．１８ｍｇ／ｋｇ／週であり、より高齢の対象に対しては０．０９ｍｇ／ｋｇ／週である。成長ホルモン補充についての種々の治療試験において、非修飾成長ホルモンの用量は、約０．０４ｍｇ／ｋｇ／週から約０．１８ｍｇ／ｋｇ／週までの範囲である（バンス（Ｖａｎｃｅ）ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４１（６）：１２０６−１２１６頁（１９９９年）を参照）。他には（例えば、ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓを参照）、体重に関係なく１０５〜２１０ｍｇ／週の出発用量が推奨されている（例えば、成長ホルモン欠乏成人の診断および治療用のコンセンサスガイドライン（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）：成人の成長ホルモン欠乏に関する成長ホルモン研究協会ワークショップの概説（Ｓｕｍｍａｒｙ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ａｄｕｌｔｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８３：３７９−３８１頁（１９９８年）を参照）。
２．悪液質
ＡＩＤＳ消耗および悪液質の他の形態とは、身体がエネルギーに関して主として体脂肪供給に頼る代わりに、生体筋肉および臓器組織（除脂肪体重）を消費することにさせる代謝障害を称す。ＡＩＤＳ消耗の人々は、典型的に筋肉組織、身体臓器、血液細胞およびリンパ液を含む５〜１０％以上の除脂肪体重の喪失を経験する。ＨＩＶの人々の生存を延長させる抗ウィルス療法にもかかわらず、ＡＩＤＳ消耗は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの人々において依然として健康不良の主要な原因の１つである。ＡＩＤＳ消耗の罹患率の推定値は、ＨＩＶ感染個体の４〜３０％の範囲である。未処置のままのＡＩＤＳ消耗は、死亡率と直接関連することが調査により証明されている。同様の消耗の出現は、他の疾患、例えば、癌に関連して見られる。
本明細書に提供される修飾ＧＨ類の投与量および措置は、経験的に判定できる。非修飾ＧＨの投与量は、修飾ＧＨの投与量を判定するための指針として使用できる。非修飾ＧＨと比較した修飾ＧＨの活性レベルおよび半減期などの因子を、このような判定を成すために使用できる。本明細書に提供される修飾ＧＨ類は、タンパク質の安定性を増大させ、半減期を改善し、次いでＡＩＤＳ消耗の治療において、より長い持続性のより安定な治療効果を送達する。組換えＧＨは、ＡＩＤＳ消耗治療のために１９９６年に米国ＦＤＡから承認を受けた。悪液質の治療に使用される非修飾成長ホルモン療法の推奨される初期の成人投与量は、６回または７回の皮下注射に分割された０．０４ｍｇ／ｋｇ／週以下である。用量は、個々の対象要件に従い治療の対象耐容性に依って４週から８週の間隔で最大０．０８ｍｇ／ｋｇ／週まで増加できる（Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（登録商標）に関する添付文書を参照）。これらの代表的な投与量は、非修飾体と比較した修飾ＧＨの性質と活性のさらなる判定と共に修飾ＧＨポリペプチド類の投与措置の判定の指針として使用できる。
３．抗老化
老化は、ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモンおよび下垂体機能の低下と関連し；しばしば「ソマトポーズ（ｓｏｍａｔｏｐａｕｓｅ）」と呼ばれる。したがって、下垂体ホルモンとしてＧＨはまた、３０才代から年齢と共に低下すること報告されている（例えば、コーパス（Ｃｏｒｐａｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １４：２０−３９頁（１９９３年）を参照）。病的に減少するＧＨは、脂肪の増加、筋肉質量の減少、および骨質量の減少など、加齢と共に見られる多くの変化と関連する。成長ホルモン欠乏高齢個体における成長ホルモンの補充により、生活の質が改善でき、骨および筋肉質量を増強でき、心血管の危険性を減少させることができる。
本明細書に記載されているように、本明細書に提供される修飾ＧＨ類の投与量および投与措置は、経験的に判定できる。本明細書に提供される修飾ＧＨの初期の治療的用量は、非修飾成長ホルモンに対して承認された推奨される初期の成人投与量の指針を用いて判定でき、次いで修飾ＧＨから生じる治療効果の改善に従って滴定される。６１才から８１才までの高齢男性対象における組換えｈＧＨ療法の代表的な皮下投与は、０．０３ｍｇ／体重１ｋｇを、朝に１週３回の投与であり得；注射間隔は、１日または２日である（ホルモン１ミリグラム当り２．６ＩＵ）（例えば、ルドマン（Ｒｕｄｍａｎ）ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２３（１）：１−６頁（１９９０年）を参照）。高齢女性対象における組換えｈＧＨ療法の代表的な皮下投与は、０．０２５ｍｇ／体重１ｋｇ／日であり得る（ボネロ（Ｂｏｎｅｌｌｏ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４４（９）：１０３８−４２頁（１９９６年））。これらの用量を、修飾および非修飾ＧＨポリペプチドの性質の比較と共に用いて修飾ＧＨの投与量を判定できる。例えば、本明細書に提供された修飾ＧＨ類は、タンパク質の増大した安定性、改善された半減期を有し、次いでより長い持続性のより安定な抗老化治療効果を送達する。
４．腎性骨ジストロフィー
高ターンオーバーから低ターンオーバーまでの病巣範囲の種々の骨格障害を含み、双方が骨塩量の減少およびより高い骨折発生率に導く腎性骨ジストロフィーは、慢性腎不全に患っている対象に共通している。臨床試験では、成長ホルモン欠乏対象ならびに血液透析をしている慢性腎疾患に患っている対象における骨ターンオーバーおよび骨塩量を改善するための治療として、組換えヒトＧＨ療法の陽性効果が示されている（例えば、コーツマン（Ｋｏｔｚｍａｎｎ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １７（１）：８７−９４頁（２００４年）を参照）。ＧＨならびにＩＧＦ−１は、骨代謝および骨塩量に対して著しい効果を有する。ＧＨは、軟骨細胞の成長および機能を刺激し、ならびに骨芽細胞尾および破骨細胞を刺激し、コラーゲン合成を誘導することにより直接的または間接的に骨ターンオーバーを増加できることによって、長期の骨成長を増強させる。
本明細書に提供される修飾ＧＨ類の投与量および投与措置は、経験的に判定できる。本明細書に提供される修飾ＧＨの最初の治療的用量は、非修飾成長ホルモンに承認された推奨される初期の成人投与量の指針を用いて判定でき、次いで修飾ＧＨから生じる治療効果の改善に従って滴定される。血液透析をしている慢性腎不全に患っている成人対象の代表的投与量は、最初の４週間の治療中は、各透析セッション後、１週当り３回の０．１２５ＩＵ／ｋｇ（４０．５μｇ／ｋｇ）、その後は０．２５ＩＵ／ｋｇ（８１μｇ／ｋｇ）のＧＨ皮下注射であり得る。ＧＨ治療の長さと投与量は、対象の耐容性に従って変わり得る（コーツマン（Ｋｏｔｚｍａｎｎ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ１７（１）：８７−９４頁（２００４年））。非修飾ＧＨと比較して修飾ＧＨの性質および活性の比較は、代替投与量および投与措置を判定するために使用できる。
５．嚢胞性線維症
嚢胞性線維症に患っている対象、特に小児の対象は、直線的成長不良、不十分な体重増加、およびタンパク質異化作用の問題を有する。複数の研究により、ＧＨで治療された小児において身長および体重の改善が示されている。ＧＨ治療は、努力性肺活量の改善、運動耐容性の改善および骨蓄積をもたらすことが他の研究により示されている。入院期間および静脈内抗生物質コースの減少により測定されるように、ＧＨ治療が臨床状況を改善することが、さらに他の研究により判明している（例えば、ハーディンＤ．Ｓ．（Ｈａｒｄｉｎ Ｄ．Ｓ．）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１（補遺１）：Ｓ８１−８５頁（２００４年）を参照）。
本明細書に提供される修飾ＧＨ類の投与量および投与措置は、経験的に判定できる。例えば、非修飾ＧＨからの投与量および投与ならびに修飾ＧＨと非修飾ＧＨとの性質および活性の比較が判定に使用できる。嚢胞性線維症に患っている小児対象の代表的投与としては、限定はしないが、０．３ｍｇ／ｋｇ／週までの毎日の皮下ＧＨ注射量が挙げられる（ハーディンＤ．Ｓ．（Ｈａｒｄｉｎ Ｄ．Ｓ．）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１（補遺１）：Ｓ８１−８５頁（２００４年）を参照）。本明細書に提供される修飾ＧＨの初期の治療的用量は、非修飾成長ホルモンを用いた治療に関して推奨された初期の成人用量であり得、その後、本明細書に提供される修飾ＧＨのより長い持続性および治療効果の改善に従って滴定される。本明細書に提供される修飾ＧＨ類は、増大したタンパク質安定性、および改善された半減期を有する。このような修飾ＧＨは、嚢胞性線維症対象の治療において、より長い持続性のより安定な治療効果を送達でき、低投与量および投与回数の減少を可能にすることができる。
６．他の病態
多くの他の生理的または病理的病態は、ＧＨ療法に対する標的の可能性がある。これらの生理的または病理的病態としては、限定はしないが、例えば、呼吸不全および火傷と関連するものなどのストレス、エネルギー減少、体力の減少、異化作用病（例えば、ハート（Ｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３３（６）：８２７−３４頁（２００１年）を参照）、手術からの回復（例えば、イェオ（Ｙｅｏ）ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍ．ＩＧＦ Ｒｅｓ．１３（６）：３６１−７０頁（２００３年）を参照）、充血性心筋症（例えば、アダマポーラス（Ａｄａｍａｐｏｌｏｕｓ）ら、Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．２４（２４）：２１８６−９６頁（２００３年）を参照）、肝臓移植および肝切除後の肝再生（例えば、ルオ（Ｌｕｏ）ら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０（９）：１２９２−６頁（２００４年）を参照）、短腸症候群、クローン病などの慢性炎症障害または栄養障害（例えば、スローニム（Ｓｌｏｎｉｍ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２（２２）：１６３３−７頁（２０００年）を参照）、若年性慢性関節炎（例えば、サハ（Ｓａｈａ）ら、Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１（７）：１４１３−７頁（２０００年）を参照）、男性不妊症障害（例えば、オベセン（Ｏｖｅｓｅｎ）ら、Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ．６６（２）：２９２−８頁（１９９６年）を参照）、ＨＩＶ感染対象の障害性免疫機能、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病などの他の障害（例えば、セイカリー（Ｓｅｉｋａｌｙ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１００（５）：８７９−８４頁（１９９７年）を参照）、ヌーナン症候群（例えば、ヌールダム（Ｎｏｏｒｄａｍ）ら、Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．９０（８）：８８９−９４頁（２００１年）を参照）、肥満、ダウン症候群、二分脊椎、および線維筋痛（例えば、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０４（３）：２２７−３１頁（１９９８年）を参照）が挙げられる。
Ｉ．製品およびキット
修飾成長ホルモンポリペプチド類および核酸は、パッケージング材料、修飾ＧＨポリペプチド、成長ホルモン疾患または障害を治療するのに有効である本明細書に提供された修飾ＧＨまたはその誘導体あるいは生物活性部分をコードする核酸分子、修飾ＧＨポリペプチドまたは核酸分子が成長ホルモン疾患または障害を治療するために使用されることを示すラベルを含有する製品としてパッケージできる。
本明細書に提供される製品は、パッケージング材料を含有する。製薬製品のパッケージングに使用のパッケージング材料は、当業者に周知である。例えば、米国特許第５，３２３，９０７号明細書、米国特許第５，０５２，５５８号明細書および米国特許第５，０３３，３５２号明細書を参照されたい。製薬パッケージング材料の例としては、限定はしないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、および投与および治療の選択された製剤および意図された様式に好適な任意のパッケージング材料が挙げられる。本明細書に提供された化合物および組成物の広範囲の製剤は、任意のＧＨ疾患または障害に対する種々の治療用として考慮されている。
修飾ＧＨポリペプチド類および核酸分子はまた、キットとして提供できる。キットは、修飾ＧＨおよび投与用の品目を含むことができる。例えば、修飾ＧＨは、投与用デバイス、例えば、シリンジ、吸入器、またはアプリケーターと共に供給できる。キットは、投与量、投与措置などの適用に関する取扱い説明書、および投与様式に関する取扱い説明書を含むことができる。キットはまた、修飾ＧＨおよび診断用品目を含むことができる。例えば、このようなキットは、成長ホルモンの濃度、量または活性、あるいは対象の成長ホルモン調節系を測定する品目を含むことができる。
以下の実施例は、あくまで例示を目的として挙げられ、本発明の範囲を限定する意図はない。
Ｊ．実施例
実施例１
ｐＮＡＵＴ、哺乳動物細胞発現プラスミドにおけるＧＨをコードするクローニングｃＤＮＡ
ＧＨタンパク質（配列番号１を参照）をコードする核酸分子を、選択変異の作出前に哺乳動物の発現ベクターにクローン化した。次に、予めデザインされた標的変異体の集団を、各々個々の変異体を創出し、個々に処理し、アドレス可能なアレイにおいて互いに物理的に分離されるように出した。
ｈＧＨ−ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴキット（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてヒト脳下垂体ｍＲＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からインビトロ合成により得られた。最初に、ｈＧＨコード化ｃＤＮＡを、プライマー：順方向ＧＨ１（配列番号７０２）および逆方向ＧＨ１ ＲＥＶ（配列番号７０３）を用いてＰＣＲ増幅によりクローン化した。ＰＣＲ増幅産物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクター（ｐＴＯＰＯ−ＴＡ）にクローン化し、ｐＴＯＰＯ−ｈＧＨ４（配列番号７１７）と称されるプラスミドを作製した。
ｈＧＨコードｃＤＮＡの配列を、配列決定することにより確認した。配列決定されたｃＤＮＡを、クローンのいずれかの末端上のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を作出したプライマーＨＧＨＦＯＲＨＩＮＤ（配列番号７０４）およびＨＧＨＲＥＶ（配列番号７０５）を用いて増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩによる制限後、ｈＧＨコードｃＤＮＡを含有するＰＣＲ断片を、ｐＵＣ−ＣＭＶｈＧＨｐＡの対応する部位にサブクローン化してｐＮＡＵＴ−ｈＧＨ（配列番号７１６）を作製した。
ｈＧＨを発現するために、ｈＧＨコードｃＤＮＡ断片を、プライマーｈＧＨＦＯＲＰＥＴ（配列番号７０６）およびｈＧＨＲＥＶＰＥＴ（配列番号７０７）を用い、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅した。該プライマーは、それぞれ順方向および逆方向の制限部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを作出する。大腸菌産生収率を最適化するために、順方向プライマーはまた、ヒトから大腸菌にプロリン２およびプロリン５コドンを変更させるように（ＣＣＡからＣＣＧおよびＣＣＣからＣＣＧに）デザインされ、また、逆方向体はＳＴＯＰコドンを変更させるように（ＴＡＧからＴＡＡに）デザインされた。ＰＣＲ断片は、ｐＥＴ−２４（インビトロゲン；配列番号７１８）にサブクローン化された。大腸菌のｈＧＨ収率を最適化するために、さらなる変更がｈＧＨ配列において成された。変異誘発のサイクルは、それぞれプライマー：ｈＧＨＡＲＧ８ＦＯＲ（配列番号７０８）およびｈＧＨＡＲＧ８ＲＥＶ（配列番号７０９）ならびにｈＧＨＡＲＧ１６ＦＯＲ（配列番号７１０）およびｈＧＨＡＲＧ１６ＲＥＶ（配列番号７１１）を用いて、ヒトから細菌にＡｒｇ８およびＡｒｇ１６コドンを変更させるように使用された。生じた構築体を、配列決定により確認した。生じたプラスミドは、ｐＥＴ−２４Ｎａｕｔ−ｈＧＨ（配列番号７１８を参照）と称された。
実施例２
２ＤスキャニングによるＧＨ変異体のデザイン
本明細書に記載され、また（米国特許出願公開第２００４−０１３２９７７−Ａ１号明細書および米国特許出願第１０／６５８，３５５号明細書）に記載されている２Ｄスキャニングテクノロジーは、改善された耐タンパク質分解性および／または改善された耐熱性を有するｈＧＨ変異体をデザインし、得るために使用された。ｉｓ−ＨＩＴ類は、（１）導出されるタンパク質の性質（すなわち、耐タンパク質分解性または耐熱性）；（２）アミノ酸配列；および（３）個々のアミノ酸の性質に基づいて同定した。
ａ．ｈＧＨのより高い耐タンパク質分解性を目的として創出されたＬＥＡＤＳ
変異体は、２Ｄスキャニングを用いてデザインされた。下垂体ｈＧＨ（配列番号１）上で選択された位置（ｉｓ−ＨＩＴ類）は、（ナンバリングは成熟タンパク質のアミノ酸位置に対応する）：Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ６、Ｒ８、Ｌ９、Ｆ１０、Ｄ１１、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｆ２５、Ｄ２６、Ｙ２８、Ｅ３０、Ｆ３１、Ｅ３２、Ｅ３３、Ｙ３５、Ｐ３７、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｆ４４、Ｌ４５、Ｐ４８、Ｌ５２、Ｆ５４、Ｅ５６、Ｐ５９、Ｐ６１、Ｒ６４，Ｅ６５，Ｅ６６，Ｋ７０、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｌ７６、Ｒ７７、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｌ８２、Ｗ８６、Ｌ８７、Ｅ８８、Ｐ８９、Ｆ９２，Ｌ９３、Ｒ９４、Ｆ９７、Ｌ１０１，Ｙ１０３、Ｄ１０７、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｋ１１５、Ｄ１１６、Ｌ１１７、Ｅ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｒ１２７、Ｌ１２８、Ｅ１２９，Ｄ１３０，Ｐ１３３，Ｒ１３４，Ｆ１３９、Ｋ１４０、Ｙ１４３、Ｋ１４５、Ｆ１４６、Ｄ１４７、Ｄ１５３、Ｄ１５４、Ｌ１５６、Ｋ１５８、Ｙ１６０、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｙ１６４、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｍ１７０、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｆ１７６、Ｌ１７７、Ｒ１７８、Ｒ１８３、Ｅ１８６、およびＦ１９１であった。上記に掲げ、図１に示されたｉｓ−ＨＩＴ位置の各々における天然アミノ酸は、置換マトリクスＰＡＭ２５０により定義された残基により置換された（図２）。実際に実施された残基の置換を表３に掲げている。ｈＧＨの合計２２２の変異体を作出した。表４および配列番号２〜２２３を参照されたい。
Figure 2008518615
耐タンパク質分解性の増大したＧＨ変異体を作製するために選択された置換アミノ酸（表３の右欄）により置換されるｉｓ−ＨＩＴ類にアミノ酸（表３の左欄）。
Figure 2008518615
ｂ．ｈＧＨのより高い耐熱性を目的として創出されたＬＥＡＤＳ
表５は、２Ｄスキャニングを用いてｈＧＨ上に確認された耐熱性の増加を目的としたｉｓ−ＨＩＴ類のリストを示す。番号は、成熟タンパク質のものに対応する１６位（ｉｓ−ＨＩＴ類）が同定された。ｉｓ−ＨＩＴ標的位置が選択されると、各ｉｓ−ＨＩＴ標的位置に対する置換アミノ酸が同定された。各ｉｓ−ＨＩＴに特異的で適切な置換アミノ酸は、タンパク質の必要な生物活性（すなわち、ＧＨ活性）を維持または改善し、タンパク質の安定性を増加させるために作出された。
特定のｉｓ−ＨＩＴ標的位置で単一アミノ酸残基を１つづつ置換することにより変異誘発を実施した。作出された各変異体は、個々の変異誘発反応の単一産物であった。置換されたアミノ酸は、タンパク質の構造および機能と適合性であった。各ｉｓ−ＨＩＴ位置に対する候補置換アミノ酸を選択するために、アミノ酸置換マトリクスを使用した。表５に示されたｉｓ−ＨＩＴ位置の各々での天然アミノ酸が、他のアミノ酸：Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴとの極性相互作用を増加させる残基により置換された。（表６および配列番号２２４〜３５１参照）。
耐熱性を増加させるために、ｈＧＨ（配列番号１）のらせんＡおよびＣに同定されたｉｓ−ＨＩＴ位置は、Ｌ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８である（表５を参照）。特定のアミノ酸（例として、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）など）が、各ｉｓ−ＨＩＴ位置でのアミノ酸に置換し、したがってらせんＡおよびＣの領域にさらなるらせん間結合を導入するアミノ酸として選択された（表６を参照）。
Figure 2008518615
Figure 2008518615
実施例３
変異誘発
下記のｈＧＨ ｃＤＮＡにおける適切な部位特異的変異を作出するために一連の変異誘発プライマーをデザインした。変異誘発反応は、テンプレートとしてｐＮａｕｔ−ｈＧＨ（配列番号７１６）を用いて、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キット（インビトロゲン）により実施された。個々の各変異誘発反応は、変異誘発プライマー（センスおよびアンチセンス）（配列番号３５２〜７０１）の対を含有する。各反応に関して、１０ピコモルの各センス変異誘発プライマーを、３０ｎｇのテンプレート、１０ピコモルのアンチセンス変異誘発プライマー、および１．２５ＵのＰｆｕターボポリメラーゼ（インビトロゲン）と混合した。ＤＮＡアニーリングを可能にするために、ＰＣＲプレートを９５℃で３０秒間インキュベートした。伸長および連結反応は、９５℃で３０秒間、５０℃で１分間および６８℃で８分間の１４サイクルで実施された。親のプラスミドを除去するために、５ＵのＤｐｎＩ（バイオラブス（ＢｉｏＬａｂｓ））による制限を実施した。適格細胞の形質転換は、２０μｌの適格細胞（ＨＴ−９６、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））および１ｎｇのプラスミドＤＮＡにより達成された。プラスミドＤＮＡの単離は、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ（登録商標）９６ターボＭａｎｉｐｒｅｐｓキット（マーチェリー−ネーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ））により実施された。変異プラスミドの選択は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンにより実施された。形質転換は、真核生物発現プラスミドに関してはアンピシリン、原核生物発現プラスミドに関してはカナマイシンにより選択された。タンパク質をコードする候補ＬＥＡＤ ｈＧＨ変異体プラスミドの集団を作出するために導入された各変異を、配列決定により確認した。ｈＧＨのＬｅａｄ変異体は、最初にｐＮａｕｔ−ｈＧＨプラスミドにおいて作出した。変異体は、対応するプライマー（配列番号３５２〜７０１）を用いて原核生物発現プラスミド（ｐＥＴ−ｈＧＨ）において再度作出した。変異の存在は、配列決定により検証した。
Figure 2008518615
実施例４
哺乳動物細胞における天然および修飾ｈＧＨポリペプチド類の産生
ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞（例えば、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）から入手でき；また、クルーイト（Ｋｒｕｙｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ９０：３２８８−３２９５頁（１９９７年）を参照）を、１０％ＳＶＦおよびジェネテシンを添加したダルベッコＭＥＭ−ＧｌｕｔａｍａｘＩ−ピルビン酸ナトリウム培地中で培養した。細胞を７％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で増殖した。天然または変異体ｈＧＨの産生を一過性トランスフェクションにより実施した。１％のＳＶＦを添加したＤＭＥＭ中、細胞を５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し；４０時間後、１タンパク質当り２ウェルにおいてＰＥＩ（２５ＫＤａ；シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて細胞に形質移入し；ＥＬＩＳＡおよび生物活性の判定のための陰性対照を有するために、２ウェルは偽形質移入した。２４時間後、上澄液を採取し、サンプルを９６ウェルプレート中に一定分割し、ＥＬＩＳＡ（ｈＧＨ ＥＬＩＳＡ、ロッシュ）による標準化またはスクリーニングのために−２０℃で保存した。
実施例５
修飾ｈＧＨ変異体ポリペプチド類の生物活性の分析
第一次スクリーニングとして、各変異体を、平行して少なくとも２つの以下の評価基準に関して個々に試験した：（ｉ）ｈＧＨ生物活性（インビトロ細胞ベースアッセイ、下記を参照）；（ｉｉ）耐タンパク質分解性；（ｉｉｉ）耐熱性。全ての試験に関して、連続希釈曲線を作成し、「ＥＣ５０」の数値を個々の各変異体に関して得た。天然ｈＧＨ（配列番号１）を産生させ、ｈＧＨ変異体に対して、用いられた同じプロトコルを用いて処理し、全体の工程を通して参照基準としてた。ＮＩＢＳＣ、ＵＫから得られた国際ｈＧＨ基準もまた、第二次参照基準として用いた。全ての処理および試験は、三通り行った。
ａ．細胞増殖アッセイ
標準的なインビトロＧＨ生物活性を各変異体に関して測定し、Ｎｂ２−１１Ｃ細胞（ラットリンパ腫細胞系）に対する細胞増殖活性において天然ｈＧＨ（配列番号１）と比較した。細胞増殖活性に関する用量（濃度）−応答（活性）実験は、生物活性の「力価」または各変異体に関するＥＣ５０の算出を可能にした。特定のプロテアーゼ、選択されたプロテアーゼ、ヒト血清またはヒト血液の混合物などの原核生物サンプルによるインキュベーション後に同じ系における細胞増殖活性を測定した。原核生物サンプルによるインキュベーション後の活性評価は、プロテアーゼへの曝露の際に残存する細胞増殖活性および半減期のそれぞれの動態測定を可能にした。
プロテアーゼへの曝露後の残留生物活性を、Ｎｂ２−１１細胞（ラットリンパ芽球）を用いる増殖細胞アッセイにより測定された。Ｎｂ２−１１細胞を、１０％のＳＶＦおよび１０％のウマ血清（ＥＳ）を添加したフィッシャー培地中で培養した。増殖アッセイ２４時間前に、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。次に細胞を、０．５〜０．８×１０６細胞／ｍｌの密度で１０％のＥＳのみを添加したフィッシャー培地中で培養した。培養２４時間後、細胞を４×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、前処理された天然ｈＧＨまたは変異体の６０００ｐｇ／ｍｌと０．３ｐｇ／ｍｌとの間で３倍連続希釈（１２点）により三通りの処理をした。ＮＩＢＳＣ ｈＧＨを各増殖アッセイ関して内部対照として用いた。
天然または変異体ｈＧＨ（プロテアーゼで前処理）による４８時間の処理後、Ｎｂ２−１１細胞の増殖を測定した。１ウェル当り２０μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ＡＱ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。このアッセイでは、テトラゾリウムＭＴＳの可溶性ホルマザンへの変換を測定する。サンプルは、４９０ｎｍにおいてＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｒｅａｄｅｒ（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ））で読み取った。
ｂ．耐タンパク質分解性アッセイ
産生されたｈＧＨ量（天然ならびに各変異体ｈＧＨに関して）のＥＬＩＳＡによる測定後；１５ｎｇの天然ｈＧＨまたは変異体を含有する１５０μｌまでの上澄液を、上澄液中の全タンパク質の１重量％のプロテアーゼ（血清の１％、１％の血清中の全タンパク質の濃度は６００μｇ／ｍｌであるため、１％のプロテアーゼは、ｈＧＨの量のみでなくタンパク質の全量を基準にした）の混合物で処理した。ｈＧＨ変異体は、耐性分子を確認するためにプロテアーゼで処理した。天然ｈＧＨと比較した変異体ｈＧＨ分子の相対的耐性を、プロテアーゼの混合物（以下のプロテアーゼ（１重量％、シグマ（Ｓｉｇｍａ））：α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、およびトリプシンを各々１．５ｐｇ含有）への曝露（１２０分、２５℃）により測定した。インキュベーション時間の終了時に、１０ｍｌＤＭＥＭ中、１／１０００希釈のミニＥＤＴＡフリー錠剤（ロッシュ）を含有する１０μｌの抗プロテアーゼ完全培地を、プロテアーゼ活性を阻害するために各反応液に加えた。次に処理サンプルを用いて、残存活性を測定した。
プロテアーゼへの曝露の経時的残存ｈＧＨ活性パーセントを、１．５ｐｇのプロテアーゼ混合物を用いて動態学的試験により評価した。プロテアーゼの混合物は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（シグマ）２００μｇ／ｍｌ；トリプシン（シグマ）４００μｇ／ｍｌおよびα−キモトリプシン（シグマ）４００μｇ／ｍｌのストック溶液から各々新しいアッセイのために新鮮に調製した。インキュベーション時間（時間単位で）は：０、０．０８、０．２５、０．５、０．７５、１、２、４、６および８であった。手短に言うと、２０μｌの各タンパク質分解サンプル（プロテアーゼ、血清、血液）を、４００ｐｇ／ｍｌおよび８００ｐｇ／ｍｌで１００μｌのｈＧＨに加え、示されたような種々の時間でインキュベートした。適切な時点で、１０μｌの抗プロテアーゼ混合物、完全ミニＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ；１錠を１０ｍｌのＤＭＥＭに溶解してから１／５００に希釈）を各ウェルに加えて、タンパク質分解反応を中止させた。次いで生物活性アッセイを、記載されたように各サンプルに実施して、各時点で残存活性を測定した。
ｅ．耐熱性アッセイ
耐熱性の動態を評価するために、個々のｈＧＨ変異体を、温度を上昇させたインキュベーションの時点を増やしながら試験した。産生されたタンパク質量（各々個々のｈＧＨ変異体および天然ｈＧＨに関して）をＥＬＩＳＡにより測定後、１Ｘ抗プロテアーゼカクテル混合物（ミニＥＤＴＡフリー、ロッシュ）を添加した２５０μｌのＤＭＥＭ血清フリー培地に０．４ｎｇの天然ｈＧＨまたは修飾ｈＧＨを加え、ディープウェルプレート中３７℃でインキュベートする。
時点を増やして（０、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８時間）、５％ＳＶＦを添加した３８０μｌのＤＭＥＭ培地を、２０μｌの一定分割量（最終濃度１２０００ｐｇ／ｍｌのｈＧＨ）に加える。サンプルを直ちに凍結させ、−２０℃で保存する。
各分子（天然ｈＧＨであっても変異体ｈＧＨ類であっても）に関して、３７℃での各インキュベーション時点での残存生物活性（ＮＢ２−１１Ｃ細胞に対する細胞増殖アッセイ；上記参照）を測定する。
実施例６
ＧＨ変異体の評価
プロテアーゼ耐性および各々個々の変異体の力価など、種々の生物活性は、数学的モデルおよびアルゴリズム（ＮａｕｔＳｃａｎ；仏国特許第９９１５８８４号明細書；また上記のＰＣＴ／ＦＲ００／０３５０３号明細書に基づいたＰＣＴ出願国際公開第０１／４４８０９号パンフレット）を用いて解析した。
データは、各々個々の変異体の性能の重要な数値指標を用いるヒル（Ｈｉｌｌ）式ベースモデルを用いて処理した。手短に言うと、ヒル式は、測定された応答に対する薬物（すなわち、試験化合物または物質）の濃度に関連する数学的モデルである。
Figure 2008518615
 ｙは、応答、シグナルなどの測定された変数、ｙｍａｘは、達成可能な最大応答、〔Ｄ〕は、薬剤（例えば、ＧＨまたは修飾ＧＨ）のモル濃度、〔Ｄ５０〕は、該薬剤に対する最大応答の５０％を生じる濃度、ｎは、勾配パラメーターであり、薬剤が単一の部位に結合し、部位間の協同作用がない場合は１である。ヒルプロットは、遊離受容体対ｌｏｇ〔Ｄ〕（Ｍ）に対するリガンド占有受容体の比率のｌｏｇ１０である。勾配はｎであり、１超の勾配は、結合部位間の協同作用を示し、１未満の勾配は、結合の異質性を示す。この式は、複雑な生物学的系における相互作用を評価するための方法に用いられており、パラメーター、π、κ、τ、ε、η、θは以下のとおりである：
πは、アッセイ（細胞ベース）系に作用する生物学的薬剤の力価であり；
κは、生物学的薬剤に対する応答を誘発するアッセイ系の抵抗性の定数であり；
εは、生物学的または薬理学的応答を誘発するための全体的反応の効率（生物学的薬剤およびアッセイ系を一緒にして）を評価するための、ヒル曲線（または、一般に、他の任意のＳ字形または線形近似のもの）の変曲点における勾配であり；
τは、生物学的薬剤の限界希釈または見かけの滴定濃度を測定するために用いられ；
θは、生物学的薬剤の絶対的限界希釈または絶対的滴定濃度を測定するために用いられ；
ηは、生物学的過程または反応の異質性であり、ηは、ヒル係数値または抵抗性の定数における急激な変化によって反映される、全体的反応に沿った不連続相の存在を測定する。
修飾ＧＨポリペプチド類を、ＥＣ５０として評価されるそれらの個々の性能値に基づいて評価した。具体的な生物活性（すなわち、タンパク質質量１単位当りの生物活性；単位数／ｍｇタンパク質）は、細胞ベース増殖アッセイにおいて変異体の連続希釈を用いて各変異体について測定した（実施例５を参照）。各曲線に関して１２の希釈がなされ、各希釈は、三通りアッセイされた。連続希釈アッセイからのデータを用いて、５０％活性（ＥＣ５０）を達成するのに必要な濃度が得られた。実験点を、以下のとおりＮＥＭＯ（Ｎｅｗｌｙ ｅｖｏｌｖｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）ソフトウェア（ナウチラスバイオテック（Ｎａｕｔｉｌｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に組み込まれたＧｎｕｐｌｏｔ５．０（図面データ曲線に関するソフトウェア；ｇｎｕｐｌｏｔ．ｉｎｆｏでオンラインで入手可能）を用いてＳ字曲線にフィットさせた。Ｓ字曲線へのフィッティングに用いられた式は以下のとおりであった：
Ｓｉｇ（ｘ）＝ｂａｓｅ＋ｐｍａｘ＊（ｘ ｅｘｐ．ｎｕ）／Ｘ ｅｘｐ．ｎｕ）＋ｋａｐｐａ
式中、ｂａｓｅ、ｐｍａｘ、ｎｕおよびｋａｐｐａは、以下のとおり各曲線に関するパラメータである：ｂａｓｅ＝０．１，ｐｍａｘ＝１、ｋａｐｐａ＝５０００、ｎｕ＝２．５および５と１５０との間のｎ。Ｇｎｕｐｌｏｔは、フィッティング曲線上の各実験点と理論値点との間の距離の二乗和を最小にしながら実験データにフィットする最良曲線を見出すまで「ｎ」回フィッティングを繰り返す。各変異に関するフィッティング曲線が得られたら、対応するＥＣ５０および具体的活性を曲線から算出する。代表的な曲線を図３に示す。
評価リストの上部のものを、ＬＥＡＤとして選択した。表８は、記載された全ての候補ＬＥＡＤ変異体に関する生物活性（ＥＣ５０）および耐タンパク質分解性（「変化なし」、「増大」または「低下」）データを、天然ｈＧＨ（配列番号１および本明細書に記載されたＮＩＢＳＣ ＧＨ標品）と比較して示している。ＥＣ５０の算出は、２回の測定平均値に基づいている。修飾ｈＧＨタンパク質のＥＣ５０は、野生型ｈＧＨポリペプチド類と比較して、総じて低下した。
Figure 2008518615
Figure 2008518615
Figure 2008518615
実施例７
ラットにおけるヒト成長ホルモンの薬物動態試験
ａ．ｈＧＨポリペプチド類の調製
ａ．１ 細胞培養
大腸菌株ＢＬＲは、プラスミドモノマー収率を改善し、それぞれの配列を含有する標的プラスミドの安定化を助長することができるＢＬ２１のｒｅｃＡ誘導体（ノバゲン）である。
ａ．２ ベクター：修飾ｐＥＴ−２４ａ
ｐＥＴ−２４ａ（＋）ベクター（ノバゲン）は、Ｎ末端Ｔ７−Ｔａｇ（登録商標）配列、任意のＣ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ（登録商標）配列および選択性マーカー、カナマイシンを保有している。ｈＧＨ ｃＤＮＡ配列を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に導入した。Ｈｉｓ−Ｔａｇ（登録商標）およびＦ１複製源は、このベクターから取り出されている。大腸菌株ＢＬＲ（ノバゲン）を、ｐＥＴ２４Ｎａｕｔ−ｈＧＨベクター（配列番号７１９）により形質転換し、４％ＬＢブロス（ＬＢ−Ｂｒｏｔｈ粉末、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン（シグマ）と共に培養した。
ａ．３ 過剰発現誘導
一晩培養後、細菌を、ＯＤ６０００．０７まで希釈し、ＯＤ６０００．６（８．７×１０６細胞／ｍＬと推定）まで増殖させた。ｈＧＨ ｃＤＮＡ配列の過剰発現は、０．５Ｍ ＩＰＴＧ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を３時間（推定ダブリング時間は４５分であった）加えることによって開始された。最終ＯＤ６００は、１．８から２．２（ＳＯＰ−ＰＲＤ−００１／０２）であり、生産量は、約３０から４０ｍｇ／Ｌであると推定した。
ａ．４ 細胞除去、分離および破壊
ｈＧＨタンパク質は、大腸菌の過剰発現およびタンパク質の性質（大きな疎水領域）のため、封入小体中に見られた。リゾチーム（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｒｅｆ．８３７０５９）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２（塩化カルシウム二水和物、シグマウルトラ）および１Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅフリー、ロッシュ）による細菌溶解により、該封入小体を細胞から放出させた。１０，０００ｇで１５分間の遠心分離により、９０％の１ステップ収率および＞６０％の推定純度で該封入小体を収穫した。純度は、ブルークーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ｈＧＨ Ｅｌｉｓａキット、ロッシュ）の組合せにより推定された。封入小体の脂質不純物は、０．５％トリトンＸ−１００（カルロ・エルバ（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）により２回洗浄し、次いで５％グリセロール（シグマ、Ｒｅｆ．Ｇ−５１５０）により２回洗浄する標準的な方法を用いて処理された。ステップ収率は９０％であり、純度で凡そ＞７０％であった。
ａ．５ 生成物の可溶化およびリホールディング
６Ｍの塩化グアニジニウムにより、５：１容量で３０分間、変性処理を行った後、トリス５０ｍＭ ｐＨ８、ＥＤＴＡ １０ｍＭ、Ｌ−Ａｒｇ ０．２Ｍ（シグマ）および５％のグリセロールにより、５０：１容量等価に希尺してリホールディングを行った。２０×容量比において、一晩同じ緩衝液中、第１の透析によって、過剰の塩化グアニジニウムを除去した後、８０×比容量で、トリスｐＨ８ １０ｍＭ緩衝液において、第２の透析を行った（２回繰り返した）。このステップにより、予測純度９５％で８０％の収量が得られる。
ａ．６ クロマトグラフィー
アニオン交換カラム（ＩＥＣ）Ｑ−セファロースＦＦ ２０ｍＭＬ（アマシャム）により、４℃で５０ｍＭ トリス（ｐＨ８）平衡化／充填条件、１２０ｃｍ／時間の流速、引き続き、５０ｍＭ トリス（ｐＨ８）および２００ｍＭ ＮａＣｌ中に溶出させるクロマトグラフィーを行った。このステップにより、予測純度＞９０％で８０％の収量が得られる。忍容できるエンドトキシン濃度に達するために、アフィニティーＰａｋ Ｄｅｔｏｘｙ−Ｇｅｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖｉｎｇ Ｇｅｌ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、製造番号２０３４４）を用いた。
ｂ．インビボ試験
オスのＳＤラットにおいて、ｈＧＨ変異体および天然ｈＧＨタンパク質の薬物動態プロフィルを試験した（６匹のラット／分子）。試験されたＬＥＡＤは：野生型に比較して、Ｆ１Ｉ／Ｐ２Ａ、Ｄ１１Ｎ、Ｍ１４Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ１０１Ｖ、Ｄ１１６Ｑ、Ｅ１１９Ｑ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｋ１４０Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、Ｌ１７７Ｉ、Ｒ１７８ＱおよびＦ１９１Ｉであった。ラットの体重１ｋｇ当り２ｍｇのｈＧＨで、皮下（ＳＣ）注射により投与を行った。１５分（ｍｉｎ）から９６時間（ｈｒ）の間、時点を増加させて、血液サンプルを尾部から採取し、ドットブロット法でワットマン紙Ｎｏ．２上に回収した。４℃で４８時間、５ｍｍ２の紙からＰＢＳ中中にｈＧＨの溶出を行った。溶出されたｈＧＨの量は、ｈＧＨに特異的な市販のＥＬＩＳＡ（ロッシュ）により測定した。
注射後３時間までに、野生型ｈＧＨポリペプチドは分解したが、他方、注射後２４時間目および３０時間目の血清中に修飾ｈＧＨポリペプチドが見られた。したがって、本明細書に提供される修飾ｈＧＨポリペプチドは、インビボで、野生型ｈＧＨポリペプチドよりもタンパク質分解に関して安定である。
変更は当業者にとって明らかであるため、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図されている。
太字で示したタンパク質分解に感受性のアミノ酸を有する成熟野生型ヒト成長ホルモンの配列を示す図である。 ｉｓ−ＨＩＴに関する候補置換性アミノ酸の同定に用いられる「点受容変異」（ＰＡＭ２５０）マトリクスを示す図である。元のアミノ酸は横軸に、置換性アミノ酸は縦軸に示されている。同一残基に与えられた値は、灰色の四角で示されている。マトリクスにおける最高値は、黒色の四角で示されており、２つの残基間の置換の最高の発生に対応している。 代表的な修飾成長ホルモン変異体の活性曲線を示す図である。

Claims (99)

  1. 非修飾成長ホルモンと比較して、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの１〜５５、５７、５８、６０〜６３、６７〜８７、８９〜９１、９３、９５〜１００、１０２〜１２８、１３１〜１３２、１３５〜１３９、１４１、１４２、１４４、１４８〜１８２、１８４、１８５および１８７〜１９１のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置における１つから５つのアミノ酸置換を含んでなる修飾成長ホルモンポリペプチドであって、
    成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでなり、
    前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、配列番号１または７１２の非修飾成長ホルモンポリペプチドに比較して、タンパク質の安定性増大を示す、修飾成長ホルモンポリペプチド。
  2. 非修飾成長ホルモンと比較して、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの１〜１２、１４〜２６、２９〜５３、５７、５８、６０〜６３、６７〜７８、８０〜８４、８６、８７、８９、９１、９３、９５〜１００、１０２〜１１３、１１５〜１２８、１３１、１３２、１３５〜１３９、１４１、１４２、１４４、１４８〜１６０、１６２〜１８２、１８５および１８７〜１９１のアミノ酸位置のいずれかに対応する位置で１つまたは複数の単一アミノ酸置換を含んでなる修飾成長ホルモンポリペプチドであって、
    成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでなり、
    前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、配列番号１または７１２の非修飾成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドに比較して、タンパク質の安定性増大を示す、修飾成長ホルモンポリペプチド。
  3. 非修飾成長ホルモンポリペプチドと比較して、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を含んでなる修飾成長ホルモンポリペプチドであって、
    前記置換位置が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでなる成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置５６、５９、６４〜６６、８８、９２、９４、１０１、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３、１４５〜１４７、１８３および１８６に対応する位置ではなく、
    前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質の安定性増大を示す、修飾成長ホルモンポリペプチド。
  4. 非修飾成長ホルモンポリペプチドと比較して、１つまたは複数の単一アミノ酸置換を含んでなる修飾成長ホルモンポリペプチドであって、
    前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでなる成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置１〜５５、５７、５８、６０〜６３、６７〜８７、８９〜９１、９３、９５〜１００、１０２〜１２８、１３１、１３２、１３５〜１３９、１４１、１４２、１４４、１４８〜１８２、１８４、１８５および１８７〜１９１から選択される位置に対応し、
    ９位が置換される場合、置換アミノ酸は、プロリンではなく、
    １４位が置換される場合、置換アミノ酸は、セリンではなく、
    １３位または２７位が置換される場合、置換アミノ酸は、バリンではなく、
    ２８位が置換される場合は、置換アミノ酸は、フェニルアラニンではなく、
    ５４位が置換される場合は、置換アミノ酸は、チロシンではなく、
    ５５位、７９位、８５位または１８４位が置換される場合、置換アミノ酸は、アラニンではなく、
    ９０位が置換される場合、置換アミノ酸は、イソロイシンではなく、
    １１４位または１６１位が置換される場合、置換アミノ酸は、メチオニンではなく、
    １２０位または１２６位が置換される場合、置換アミノ酸は、アルギニンではなく、
    前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、非修飾成長ホルモンに比較して、タンパク質の安定性増大を示す、修飾成長ホルモンポリペプチド。
  5. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンの位置１、２、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１９、２０、２３、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４５、４８、５２、５４、６１、７０、７３、７４、７５、７６、７７、８０、８１、８２、８６、８７、８９、９３、９７、１０３、１０７、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２４、１２５、１２７、１２８、１３９、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７４、１７６、１７７、１７８、および１９１の中から選択される位置に対応する、請求項１または４に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  6. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ６、Ｒ８、Ｌ９、Ｆ１０、Ｄ１１、Ｍ１４、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｌ２０、Ｌ２３、Ｆ２５、Ｄ２６、Ｙ２８、Ｅ３０、Ｆ３１、Ｅ３２、Ｅ３３、Ｙ３５、Ｐ３７、Ｋ３８、Ｅ３９、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｆ４４、Ｌ４５、Ｐ４８、Ｌ５２、Ｆ５４、Ｐ６１、Ｋ７０、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｌ７６、Ｒ７７、Ｌ８０、Ｌ８１、Ｌ８２、Ｗ８６、Ｌ８７、Ｐ８９、Ｌ９３、Ｆ９７、Ｙ１０３、Ｄ１０７、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｋ１１５、Ｄ１１６、Ｌ１１７、Ｅ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｒ１２７、Ｌ１２８、Ｆ１３９、Ｄ１５３、Ｄ１５４、Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｋ１５８、Ｙ１６０、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｙ１６４、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｍ１７０、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｆ１７６、Ｌ１７７、Ｒ１７８、およびＦ１９１の中から選択される位置に対応する、請求項５に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  7. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、ＨまたはＱによるＲの置換、Ｈ、ＱまたはＮによるＥの置換、ＱまたはＮによるＫの置換、ＮまたはＱによるＤの置換、ＩまたはＶによるＭの置換、ＡまたはＳによるＰの置換、ＩまたはＨによるＹの置換、ＩまたはＶによるＦの置換、ＨまたはＳによるＷの置換、およびＩまたはＶによるＬの置換の中から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  8. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｆ１Ｉ、ＦＩＶ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｓ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ６Ｉ、Ｌ６Ｖ、Ｒ８Ｈ、Ｒ８Ｑ、Ｌ９Ｉ、Ｌ９Ｖ、Ｆ１０Ｉ、Ｆ１０Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｄ１１Ｑ、Ｍ１４Ｉ、Ｍ１４Ｖ、Ｌ１５Ｉ、Ｌ１５Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１９Ｈ、Ｒ１９Ｑ、Ｌ２０Ｉ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｆ２５Ｉ、Ｆ２５Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｄ２６Ｑ、Ｙ２８Ｈ、Ｙ２８Ｉ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｎ、Ｆ３１Ｉ、Ｆ３１Ｖ、Ｅ３２Ｑ、Ｅ３２Ｈ、Ｅ３２Ｎ、Ｅ３３Ｑ、Ｅ３３Ｈ、Ｅ３３Ｎ、Ｙ３５Ｈ、Ｙ３５Ｉ、Ｐ３７Ａ、Ｐ３７Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ３９Ｑ、Ｅ３９Ｈ、Ｅ３９Ｎ、Ｋ４１Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｆ４４Ｉ、Ｆ４４Ｖ、Ｌ４５Ｉ、Ｌ４５Ｖ、Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｓ、Ｌ５２Ｉ、Ｌ５２Ｖ、Ｆ５４Ｉ、Ｆ５４Ｖ、Ｐ６１Ａ、Ｐ６１Ｓ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｑ、Ｌ７３Ｉ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｑ、Ｅ７４Ｈ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ７５Ｉ、Ｌ７５Ｖ、Ｌ７６Ｉ、Ｌ７６Ｖ、Ｒ７７Ｈ、Ｒ７７Ｑ、Ｌ８０Ｉ、Ｌ８０Ｖ、Ｌ８１Ｉ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８２Ｉ、Ｌ８２Ｖ、Ｗ８６Ｈ、Ｗ８６Ｓ、Ｌ８７Ｉ、Ｌ８７Ｖ、Ｐ８９Ａ、Ｐ８９Ｓ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ９３Ｖ、Ｆ９７Ｉ、Ｆ９７Ｖ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｉ、Ｄ１０７Ｎ、Ｄ１０７Ｑ、Ｙ１１１Ｈ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１２Ｑ、Ｌ１１３Ｉ、Ｌ１１３Ｖ、Ｌ１１４Ｉ、Ｌ１１４Ｖ、Ｋ１１５Ｎ、Ｋ１１５Ｑ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｉ、Ｌ１１７Ｖ、Ｅ１１８Ｑ、Ｅ１１８Ｈ、Ｅ１１８Ｎ、Ｅ１１９Ｑ、Ｅ１１９Ｈ、Ｅ１１９Ｎ、Ｌ１２４Ｉ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｒ１２７Ｈ、Ｒ１２７Ｑ、Ｌ１２８Ｉ、Ｌ１２８Ｖ、Ｆ１３９Ｉ、Ｆ１３９Ｖ、Ｄ１５３Ｎ、Ｄ１５３Ｑ、Ｄ１５４Ｎ、Ｄ１５４Ｑ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５６Ｖ、Ｌ１５７Ｉ、Ｌ１５７Ｖ、Ｋ１５８Ｎ、Ｋ１５８Ｑ、Ｙ１６０Ｈ、Ｙ１６０Ｉ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６３Ｉ、Ｌ１６３Ｖ、Ｙ１６４Ｈ、Ｙ１６４Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｆ１６６Ｖ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｎ、Ｄ１６９Ｑ、Ｍ１７０Ｉ、Ｍ１７０Ｖ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｎ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｈ、Ｅ１７４Ｎ、Ｆ１７６Ｉ、Ｆ１７６Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｌ１７７Ｖ、Ｒ１７８Ｈ、Ｒ１７８Ｑ、Ｆ１９１ＩおよびＦ１９１Ｖの中から選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  9. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置１、２、５、９、１１、１４、１６、２３、２６、３８、４１、４２、７３、７４、８１、８７、１１１、１１２、１１６、１１９、１２４、１２５、１５３、１５６、１５７、１５８、１６２、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７８および１９１の中から選択される位置に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  10. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置Ｆ１、Ｐ２、Ｐ５、Ｌ９、Ｄ１１、Ｍ１４、Ｒ１６、Ｌ２３、Ｄ２６、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｙ４２、Ｌ７３、Ｅ７４、Ｌ８１、Ｌ８７、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｌ１２４、Ｍ１２５、Ｄ１５３、Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｋ１５８、Ｌ１６２、Ｆ１６６、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｄ１７１、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｌ１７７、Ｒ１７８およびＦ１９１の中から選択される位置に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  11. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｆ１Ｉ、Ｐ２Ａ、Ｐ５Ｓ、Ｌ９Ｖ、Ｄ１１Ｎ、Ｍ１４Ｖ、Ｒ１６Ｈ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｖ、Ｄ２６Ｎ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ４１Ｑ、Ｙ４２Ｈ、Ｙ４２Ｉ、Ｌ７３Ｖ、Ｅ７４Ｎ、Ｌ８１Ｖ、Ｌ８７Ｖ、Ｙ１１１Ｉ、Ｄ１１２Ｎ、Ｄ１１６Ｑ、Ｅ１１９Ｑ、Ｌ１２４Ｖ、Ｍ１２５Ｉ、Ｍ１２５Ｖ、Ｄ１５３Ｎ、Ｌ１５６Ｉ、Ｌ１５７Ｉ、Ｋ１５８Ｎ、Ｌ１６２Ｉ、Ｆ１６６Ｉ、Ｒ１６７Ｈ、Ｒ１６７Ｑ、Ｋ１６８Ｎ、Ｋ１６８Ｑ、Ｄ１６９Ｑ、Ｄ１７１Ｎ、Ｄ１７１Ｑ、Ｋ１７２Ｑ、Ｅ１７４Ｑ、Ｅ１７４Ｎ、Ｅ１７４Ｈ、Ｌ１７７Ｖ、Ｌ１７７Ｉ、Ｒ１７８ＱおよびＦ１９１Ｉの中から選択される、請求項１０に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  12. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンの位置６、９、１３、１５、１７、２０、２３、２４、１０５、１１０、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４および１２８の中から選択される位置に対応する、請求項１または４に記載の修飾成長ホルモン。
  13. 前記１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置Ｌ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８の中から選択される位置に対応する、請求項１または４に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  14. 前記１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴの中から選択される、請求項１３に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  15. 前記単一アミノ酸置換が、Ｌ６Ｅ、Ｌ６Ｄ、Ｌ６Ｋ、Ｌ６Ｒ、Ｌ６Ｎ、Ｌ６Ｑ、Ｌ６Ｓ、Ｌ６Ｔ、Ｌ９Ｅ、Ｌ９Ｄ、Ｌ９Ｋ、Ｌ９Ｒ、Ｌ９Ｎ、Ｌ９Ｑ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ａ１３Ｅ、Ａ１３Ｄ、Ａ１３Ｋ、Ａ１３Ｒ、Ａ１３Ｎ、Ａ１３Ｑ、Ａ１３Ｓ、Ａ１３Ｔ、Ｌ１５Ｅ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｋ、Ｌ１５Ｒ、Ｌ１５Ｎ、Ｌ１５Ｑ、Ｌ１５Ｓ、Ｌ１５Ｔ、Ａ１７Ｅ、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｋ、Ａ１７Ｒ、Ａ１７Ｎ、Ａ１７Ｑ、Ａ１７Ｓ、Ａ１７Ｔ、Ｌ２０Ｅ、Ｌ２０Ｄ、Ｌ２０Ｋ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｎ、Ｌ２０Ｑ、Ｌ２０Ｓ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２３Ｅ、Ｌ２３Ｄ、Ｌ２３Ｋ、Ｌ２３Ｒ、Ｌ２３Ｎ、Ｌ２３Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｔ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ１０５Ｅ、Ａ１０５Ｄ、Ａ１０５Ｋ、Ａ１０５Ｒ、Ａ１０５Ｎ、Ａ１０５Ｑ、Ａ１０５Ｓ、Ａ１０５Ｔ、Ｖ１１０Ｅ、Ｖ１１０Ｄ、Ｖ１１０Ｋ、Ｖ１１０Ｒ、Ｖ１１０Ｎ、Ｖ１１０Ｑ、Ｖ１１０Ｓ、Ｖ１１０Ｔ、Ｌ１１３Ｅ、Ｌ１１３Ｄ、Ｌ１１３Ｋ、Ｌ１１３Ｒ、Ｌ１１３Ｎ、Ｌ１１３Ｑ、Ｌ１１３Ｓ、Ｌ１１３Ｔ、Ｌ１１４Ｅ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｋ、Ｌ１１４Ｒ、Ｌ１１４Ｎ、Ｌ１１４Ｑ、Ｌ１１４Ｓ、Ｌ１１４Ｔ、Ｌ１１７Ｅ、Ｌ１１７Ｄ、Ｌ１１７Ｋ、Ｌ１１７Ｒ、Ｌ１１７Ｎ、Ｌ１１７Ｑ、Ｌ１１７Ｓ、Ｌ１１７Ｔ、Ｉ１２１Ｅ、Ｉ１２１Ｄ、Ｉ１２１Ｋ、Ｉ１２１Ｒ、Ｉ１２１Ｎ、Ｉ１２１Ｑ、Ｉ１２１Ｓ、Ｉ１２１Ｔ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｎ、Ｌ１２４Ｑ、Ｌ１２４Ｓ、Ｌ１２４Ｔ、Ｌ１２８Ｅ、Ｌ１２８Ｄ、Ｌ１２８Ｋ、Ｌ１２８Ｒ、Ｌ１２８Ｑ、Ｌ１２８Ｎ、Ｌ１２８ＳおよびＬ１２８Ｔの中から選択される、請求項１４に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  16. 成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置６、９、１３、１５、１７、２０、２３、２４、１０５、１１０、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４および１２８の中から選択される位置に対応する１つまたは複数の単一アミノ酸置換をさらに含んでなり、
    １３位が置換される場合、置換アミノ酸はバリンではなく、
    １１４位が置換される場合、置換アミノ酸はメチオニンではない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  17. 前記１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、位置Ｌ６、Ｌ９、Ａ１３、Ｌ１５、Ａ１７、Ｌ２０、Ｌ２３、Ａ２４、Ａ１０５、Ｖ１１０、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１７、Ｉ１２１、Ｌ１２４およびＬ１２８の中から選択される１つまたは複数の位置に対応する、請求項１６に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  18. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴの中から選択される、請求項１６または１７に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  19. 前記１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、Ｌ６Ｅ、Ｌ６Ｄ、Ｌ６Ｋ、Ｌ６Ｒ、Ｌ６Ｎ、Ｌ６Ｑ、Ｌ６Ｓ、Ｌ６Ｔ、Ｌ９Ｅ、Ｌ９Ｄ、Ｌ９Ｋ、Ｌ９Ｒ、Ｌ９Ｎ、Ｌ９Ｑ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ａ１３Ｅ、Ａ１３Ｄ、Ａ１３Ｋ、Ａ１３Ｒ、Ａ１３Ｎ、Ａ１３Ｑ、Ａ１３Ｓ、Ａ１３Ｔ、Ｌ１５Ｅ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｋ、Ｌ１５Ｒ、Ｌ１５Ｑ、Ｌ１５Ｎ、Ｌ１５Ｓ、Ｌ１５Ｔ、Ａ１７Ｅ、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｋ、Ａ１７Ｒ、Ａ１７Ｎ、Ａ１７Ｑ、Ａ１７Ｓ、Ａ１７Ｔ、Ｌ２０Ｅ、Ｌ２０Ｄ、Ｌ２０Ｋ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｎ、Ｌ２０Ｑ、Ｌ２０Ｓ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２３Ｅ、Ｌ２３Ｄ、Ｌ２３Ｋ、Ｌ２３Ｒ、Ｌ２３Ｎ、Ｌ２３Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｔ、Ａ２４Ｅ、Ａ２４Ｄ、Ａ２４Ｋ、Ａ２４Ｒ、Ａ２４Ｎ、Ａ２４Ｑ、Ａ２４Ｓ、Ａ２４Ｔ、Ａ１０５Ｅ、Ａ１０５Ｄ、Ａ１０５Ｋ、Ａ１０５Ｒ、Ａ１０５Ｎ、Ａ１０５Ｑ、Ａ１０５Ｓ、Ａ１０５Ｔ、Ｖ１１０Ｅ、Ｖ１１０Ｄ、Ｖ１１０Ｋ、Ｖ１１０Ｒ、Ｖ１１０Ｎ、Ｖ１１０Ｑ、Ｖ１１０Ｓ、Ｖ１１０Ｔ、Ｌ１１３Ｅ、Ｌ１１３Ｄ、Ｌ１１３Ｋ、Ｌ１１３Ｒ、Ｌ１１３Ｎ、Ｌ１１３Ｑ、Ｌ１１３Ｓ、Ｌ１１３Ｔ、Ｌ１１４Ｅ、Ｌ１１４Ｄ、Ｌ１１４Ｋ、Ｌ１１４Ｒ、Ｌ１１４Ｎ、Ｌ１１４Ｑ、Ｌ１１４Ｓ、Ｌ１１４Ｔ、Ｌ１１７Ｅ、Ｌ１１７Ｄ、Ｌ１１７Ｋ、Ｌ１１７Ｒ、Ｌ１１７Ｎ、Ｌ１１７Ｑ、Ｌ１１７Ｓ、Ｌ１１７Ｔ、Ｉ１２１Ｅ、Ｉ１２１Ｄ、Ｉ１２１Ｋ、Ｉ１２１Ｒ、Ｉ１２１Ｎ、Ｉ１２１Ｑ、Ｉ１２１Ｓ、Ｉ１２１Ｔ、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４Ｎ、Ｌ１２４Ｑ、Ｌ１２４Ｓ、Ｌ１２４Ｔ、Ｌ１２８Ｅ、Ｌ１２８Ｄ、Ｌ１２８Ｋ、Ｌ１２８Ｒ、Ｌ１２８Ｑ、Ｌ１２８Ｎ、Ｌ１２８ＳおよびＬ１２８Ｔの中から選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  20. 非修飾成長ホルモンと比較して、置換される位置の数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、請求項２〜２０のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  21. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる成熟ヒト成長ホルモンポリペプチドの位置５６、５９、６４、６５、６６、８８、９２、９４、１０１、１２９、１３０、１３３、１３４、１４０、１４３、１４５、１４６、１４７、１８３、および１８６の中から選択されるものに対応する１つまたは複数の単一アミノ酸置換をさらに含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  22. 前記アミノ酸置換が、位置Ｅ５６、Ｐ５９、Ｒ６４、Ｅ６５、Ｅ６６、Ｅ８８、Ｆ９２、Ｒ９４、Ｌ１０１、Ｅ１２９、Ｄ１３０、Ｐ１３３、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、Ｋ１４５、Ｆ１４６、Ｄ１４７、Ｒ１８３およびＥ１８６の中から選択される１つまたは複数の位置に対応する、請求項２１に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  23. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｑ、ＮおよびＨのいずれかによるＥの置換、ＳまたはＡによるＰの置換、ＨまたはＱによるＲの置換、ＩまたはＶによるＬまたはＦの置換、ＱまたはＮによるＫまたはＤの置換、ＨまたはＩによるＹの置換の中から選択される、請求項２１または２２に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  24. 前記１つまたは複数の単一アミノ酸置換が、Ｅ５６Ｑ、Ｅ５６Ｎ、Ｅ５６Ｈ、Ｐ５９Ｓ、Ｐ５９Ａ、Ｒ６４Ｈ、Ｒ６４Ｑ、Ｅ６５Ｑ、Ｅ６５Ｎ、Ｅ６５Ｈ、Ｅ６６Ｑ、Ｅ６６Ｎ、Ｅ６６Ｈ、Ｅ８８Ｑ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８８Ｈ、Ｆ９２Ｉ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｈ、Ｒ９４Ｑ、Ｌ１０１Ｖ、Ｌ１０１Ｉ、Ｅ１２９Ｑ、Ｅ１２９Ｎ、Ｅ１２９Ｈ、Ｄ１３０Ｑ、Ｄ１３０Ｎ、Ｐ１３３Ｓ、Ｐ１３３Ａ、Ｒ１３４Ｈ、Ｒ１３４Ｑ、Ｋ１４０Ｑ、Ｋ１４０Ｎ、Ｙ１４３Ｈ、Ｙ１４３Ｉ、Ｋ１４５Ｑ、Ｋ１４５Ｎ、Ｆ１４６Ｉ、Ｆ１４６Ｖ、Ｄ１４７Ｑ、Ｄ１４７Ｎ、Ｒ１８３Ｈ、Ｒ１８３Ｑ、Ｅ１８６Ｑ、Ｅ１８６ＮおよびＥ１８６Ｈの中から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  25. ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  26. 前記アミノ酸置換が、ヒト下垂体成長ホルモンポリペプチドまたはヒト胎盤成長ホルモンポリペプチドにおいてなされる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  27. 非ヒト成長ホルモンポリペプチドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  28. 成熟成長ホルモンポリペプチドである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  29. 前駆体成長ホルモンポリペプチドである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  30. １９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１または２２２のアミノ酸長を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  31. １つまたは複数のアミノ酸置換が、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、および天然アミノ酸と非天然アミノ酸の組み合わせの中から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  32. 裸のポリペプチド鎖である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  33. 前記成長ホルモンが、ペギル化、アルブミン化、またはグリコシル化されている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  34. １つまたは複数の偽野生型変異をさらに含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  35. 前記偽野生型変異が、非修飾成長ホルモンのアミノ酸残基の挿入、欠失および置換の１つまたは複数の中から選択される、請求項３４に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  36. 安定性の増加が、耐タンパク質分解性の増大として現れる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  37. 前記耐タンパク質分解性の増大が、プロテアーゼに曝露された際に、血清、血液、唾液、消化液において、またはインビトロで生じる、請求項３６に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  38. 前記耐タンパク質分解性の増大が、修飾成長ホルモンが経口投与された場合、または消化管に存在する場合に、該修飾成長ホルモンによって示される、請求項３６に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  39. 前記耐タンパク質分解性の増大が、前記非修飾成長ホルモンと比較して、１種または複数種のプロテアーゼに対する耐性の増大を含んでなり、前記プロテアーゼが、トリプシン、トリプシン（Ａｒｇブロック）、トリプシン（Ｌｙｓブロック）、クロストリパイン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、臭化シアン、ヨードゾベンゾエート、ミクソバクターＰ．、アルミラリア、管腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ゼラチナーゼＢおよびゼラチナーゼＡの中から選択される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  40. 前記安定性の増加が、耐熱性の増大として現れる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  41. 約２０℃から約４５℃の温度で耐熱性の増大を有する、請求項４０に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  42. 対象の体温で耐熱性の増大を有する、請求項４０に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  43. 約３７℃の温度で耐熱性の増大を有する、請求項４０に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  44. 前記安定性の増加が、インビボまたはインビトロでの半減期の増大として現れる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  45. 前記安定性の増加が、対象に投与された場合に半減期の増大として現れる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  46. 前記修飾成長ホルモンの半減期が、非修飾成長ホルモンの半減期と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、および少なくとも５００％、またはそれ以上の中から選択される量で増加される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  47. 前記修飾成長ホルモンの半減期が、非修飾成長ホルモンポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、および１０００倍、またはそれ以上の倍数の中から選択される量で増加される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  48. 非修飾成長ホルモンと比較して、生物活性の増大を有する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  49. 非修飾成長ホルモンと比較して、生物活性が減少する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  50. 生物活性が、インビトロでの細胞増殖を測定することによって評価される、請求項４８または４９に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  51. 前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、成長ホルモン受容体に結合する、請求項４８または４９に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  52. 前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、非修飾成長ホルモンと比較して、耐タンパク質分解性の増大を示し、かつ耐熱性の減少を示す、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  53. 前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、非修飾成長ホルモンポリペプチドと比較して、耐熱性の増大を示し、かつ耐タンパク質分解性の減少を示す、請求項１〜３５または４０〜５１のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチド。
  54. 請求項１〜５３のいずれか一項に記載の２つ以上の修飾成長ホルモンポリペプチドを含んでなるライブラリー。
  55. 請求項１〜５３のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
  56. 請求項５５に記載の複数の分子を含んでなる核酸分子のライブラリー。
  57. 請求項５５に記載の核酸分子を含含んでなるベクター。
  58. 請求項５７に記載のベクターを含んでなる真核生物細胞。
  59. 請求項５７に記載のベクターを含んでなる原核生物細胞。
  60. 請求項５７に記載の複数のベクターを含んでなるライブラリー。
  61. ｉ）請求項５５に記載の核酸または請求項５７に記載のベクターを細胞内に導入すること、および
    ｉｉ）前記コードされた修飾成長ホルモンポリペプチドが発現する条件下で前記細胞を培養すること、を含んでなる修飾成長ホルモンペプチドを発現させる方法。
  62. 前記細胞が、真核生物細胞である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、グリコシル化される、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 配列番号２〜６９、７５、７６、８５〜１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３〜１５４、１６４、１６５、１７６〜２１６、２２２〜３５１に示されたアミノ酸の配列のいずれか、またはそれらの生物活性部分を含んでなる修飾成長ホルモンポリペプチド。
  65. 請求項１〜５３および６４のいずれか一項に記載の修飾成長ホルモンポリペプチドを含んでなる製薬組成物。
  66. 製薬的に許容できる賦形剤をさらに含んでなる、請求項６５に記載の製薬組成物。
  67. 前記製薬組成物が、経口、経鼻、または肺投与用に製剤化される、請求項６５に記載の製薬組成物。
  68. 前記製薬組成物が、経口投与用に製剤化される、請求項６５に記載の製薬組成物。
  69. 前記修飾成長ホルモンが、非修飾成長ホルモンと比較して、唾液への曝露、胃腸管内のプロテアーゼへの曝露、および低ｐＨ条件への曝露の中から選択された条件下で、半減期の増加を示す、請求項６８に記載の製薬組成物。
  70. 前記修飾が、タンパク質分解性消化部位の除去またはタンパク質構造の安定性増大を含んでなる、請求項６５に記載の製薬組成物。
  71. 前記修飾成長ホルモンポリペプチドが、タンパク質の半減期または胃腸管内のバイオアベイラビリティの増加を示す、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の製薬組成物。
  72. タンパク質の半減期が、非修飾成長ホルモンの半減期と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、またはそれ以上の中から選択される量で増加される、請求項７１に記載の製薬組成物。
  73. タンパク質半減期が、非修飾成長ホルモンの半減期と比較して、少なくとも６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、および１０００倍、またはそれ以上の中から選択される量で増加される、請求項７１に記載の製薬組成物。
  74. 前記修飾成長ホルモンの生物活性が、非修飾成長ホルモンに比較して増加される、請求項７１に記載の製薬組成物。
  75. タンパク質の半減期が、唾液への曝露、胃腸管内のプロテアーゼへの曝露、および低ｐＨ条件への曝露の中から選択された１つまたは複数の条件への暴露後に増加される、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の製薬組成物。
  76. 前記製薬組成物が、プロテアーゼ阻害剤を使用せずに調製される、請求項６７に記載の製薬組成物。
  77. 前記プロテアーゼ阻害剤が、ボーマン・バーク阻害剤、結合ボーマン・バーク阻害剤、アプロチニンおよびカモスタットの中から選択される、請求項７６に記載の製薬組成物。
  78. 前記賦形剤が、結合剤、増量剤、滑剤、崩壊剤および湿潤剤の中から選択される、請求項６６に記載の製薬組成物。
  79. 前記製薬組成物が、液剤、丸剤、錠剤およびカプセル剤の中から選択される形態での投与用に製剤化される、請求項６８に記載の製薬組成物。
  80. 前記丸剤または錠剤が、咀嚼可能である、請求項７９に記載の製薬組成物。
  81. 前記カプセル剤中の製薬組成物が、液体形態にある、請求項７９に記載の製薬組成物。
  82. 前記液体が、溶液、シロップおよび懸濁液の中から選択される、請求項７９に記載の製薬組成物。
  83. 前記製薬組成物が、前記修飾成長ホルモンポリペプチドの放出制御のために製剤化される、請求項６７に記載の製薬組成物。
  84. 前記組成物が、錠剤または舐剤の形態にある、請求項８３に記載の製薬組成物。
  85. 前記舐剤が、前記修飾成長ホルモンポリペプチドを口腔の粘膜、咽喉の粘膜または胃腸管に送達する、請求項８４に記載の製薬組成物。
  86. 前記舐剤が、賦形剤と共に製剤化される、請求項８４に記載の製薬組成物。
  87. 前記賦形剤が、無水結晶質マルトースおよびステアリン酸マグネシウムから選択される、請求項８３に記載の製薬組成物。
  88. 前記製薬組成物が、保護的化合物なしで製剤化される、請求項６５〜８７のいずれか一項に記載の製薬組成物。
  89. 前記修飾成長ホルモンが、胃腸のプロテアーゼに対する耐性を示す、請求項８８に記載の製薬組成物。
  90. 製薬的に許容できる添加物をさらに含んでなる、請求項６５〜８９のいずれか一項に記載の製薬組成物。
  91. 前記添加物が、懸濁化剤、乳化剤、非水媒体および保存剤の中から選択される、請求項９０に記載の製薬組成物。
  92. 請求項５５に記載の核酸分子または、請求項５７に記載のベクターを含んでなる製薬組成物。
  93. パッケージング材料およびパッケージング材料内に含有される、請求項６５〜９２のいずれか一項に記載の製薬組成物を含んでなる製品。
  94. 前記修飾成長ホルモンが、成長ホルモンの疾患または障害の治療に有効であり、前記パッケージング材料は、前記修飾成長ホルモンが、成長ホルモンの疾患または障害の治療に使用されることを示す標識を含む、請求項９３に記載の製品。
  95. 請求項６５〜９２のいずれか一項に記載の製薬組成物、修飾ＧＨポリペプチドの投与用デバイスおよび任意に投与用の取扱い説明書ならびに試薬を含んでなるキット。
  96. 成長ホルモンの投与により治療される疾患または病態を患っている対象の治療用医薬品の調製のための、請求項６５〜９２のいずれか一項に記載の製薬組成物の使用。
  97. 成長ホルモンの投与により治療される疾患または病態を有する対象の治療用医薬品の調製のための、請求項１〜５３および６４のいずれか一項に記載の成長ホルモンポリペプチドの使用。
  98. 前記疾患または病態が、成長欠乏障害、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の免疫機能障害、異化作用病、手術回復、充血性心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗しょう症、胎児性軟骨異栄養症／低軟骨形成症、骨格形成異常症、クローン病などの慢性炎症障害または栄養障害、短腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ染色体低リン酸血症くる病、ダウン症候群、二分脊椎、ヌーナン症候群、肥満症、障害性筋強度および線維筋痛の中から選択される、請求項９６または９７に記載の使用。
  99. 前記成長欠乏障害が、ターナー症候群、子宮内発育遅延、特発性短身長、プラーダーヴィリ症候群およびサラセミアの中から選択される、請求項９８に記載の使用。
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