MXPA04004385A

MXPA04004385A - Variaciones de hormona de crecimiento en humanos y sus usos.

Info

Publication number: MXPA04004385A
Application number: MXPA04004385A
Authority: MX
Inventors: Ulied Angeles
Original assignee: Univ Cardiff
Priority date: 2001-11-12
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2004-11-29
Also published as: AU2002341215A1; BR0213957A; WO2003042245A3; CA2463639A1; JP2005518786A; WO2003042245A2; WO2003042245B1; US20050233417A1; EP1444262A2

Abstract

La presente invencion se relaciona a mutaciones de hormona de crecimiento que surgen de manera natural; a un metodo para detectarlas y su uso en la clasificacion de pacientes para irregularidades de hormona de crecimiento o para producir proteinas variantes adecuadas para tratar tales irregularidades. En un aspecto, se describen variantes de GH1, seleccionadas del grupo que consiste de : (a) (i) +480 C?? T; (ii) +446 C?? T; (iii) +1491 C??G; (iv) -60 G??A; (v) -40 a-39 GG??CT; (vi) -360 A??G; y (vii) +748 A??G (donde las cifras se refieren al numero de posicion de nucleotido de GH1, contando desde TSS); (b) una secuencia sustancialmente homologa a, o que hibrida a la secuencia (a) bajo condiciones severas; (c) una secuencia sustancialmente homologa a, o que hibrida a las secuencias (a) o (b) pero para la degeneracion del codigo genetico; y (d) un oligonucleotido especifico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c) anteriores.

Description

VARIACIONES DE HORMONA DE CRECIMIENTO EN HUMANOS Y SUS USOS La presente invención se relaciona a mutaciones de hormona de crecimiento que surgen de manera natural; a un método para detectarlas y a su uso en la clasificación de pacientes para irregularidades de la hormona de crecimiento o para producir proteínas variantes adecuadas para tratar tales irregularidades . Se entendió hace más de un siglo que la estatura humana fue influenciada por factores heredados. Aunque la estatura pequeña familiar, con su modo normalmente recesivo de herencia, se reconoció tan anteriormente como 1912, fue un cuarto de siglo adicional antes de que tales familias llegaran a ser apropiadamente documentadas en la literatura científica. El reconocimiento de que la estatura pequeña recesivamente heredada fue comúnmente asociada con la deficiencia de hormona de crecimiento (GH) aislada, solamente provino en 1966. La estatura pequeña asociada con la deficiencia de GH se ha estimado que ocurre con una incidencia de entre 1/4000 y 1/10000 nacimientos vivos. La mayoría de estos casos son tanto esporádicos como idiopáticos, pero entre 5 y 30% tienen un primer grado relativo afectado consistente con una etiología genética para la condición. La confirmación de la etiología genética de la deficiencia de GH provino del análisis genético molecular de la estatura pequeña familiar y la demostración temprana de lesiones mutacionales en los genes de hormona de crecimiento expresada por la pituitaria (GH1) de individuos afectados. La estatura pequeña familiar también puede ser causada por la mutación en un número de otros genes (por ejemplo, POU1F1, PROP1 y GHRHR) y es importante distinguir estas diferentes formas de la condición. La hormona de crecimiento (GH) es una hormona muítifuncional que promueve el crecimiento postnatal de los tejidos esqueléticos y blandos a través de una variedad de efectos. La controversia permanece en cuanto a la contribución relativa de las acciones directas e indirectas de la GH. Con una parte, los efectos directos de la GH se han demostrado en una variedad de tejidos y órganos, y receptores de GH se han documentado en un número de tipo de células. Por otra parte, una cantidad sustancial de datos indica que una porción mayor de los efectos de la GH son mediados a través de las acciones del factor I de crecimiento similar a la insulina dependiente de la GH (IGF-I) . El IGF-I es producido en muchos tejidos, principalmente el higado, y actúa a través de su propio receptor para aumentar la proliferación y maduración de muchos tejidos, incluyendo hueso, cartilago y músculo esquelético. Además de promover el crecimiento de los tejidos, la GH también se ha mostrado que ejerce una variedad de otros efectos biológicos, incluyendo efectos lactogénicos, diabetogénicos y lipoliticos y anabólicos de proteínas, asi como retención de sodio y agua. Cantidades adecuadas de GH se necesitan por toda la infancia para mantener el crecimiento normal. Los recién nacidos con deficiencia de GH son usualmente de longitud y peso normal. Algunos pueden tener un micropene o hipoglucemia en ayunas en conjunción con el bajo crecimiento postnatal lineal, que llega a ser progresivamente retardado con la edad. En aquellos con deficiencia de hormona de crecimiento aislada (IGHD), la maduración esquelética es usualmente retardada en asociación con su retraso de altura. La obesidad truncal, la apariencia facial más joven que la esperada para su edad cronológica y la dentición secundaria retardada son frecuentemente presentes. Los cambios de la piel similares a aquellos observados en el envejecimiento prematuro pueden ser observados en adultos afectados. La IGHD familiar comprende varios desórdenes diferentes con modos característicos de herencia. Esas formas de IGHD conocidas que están asociadas con defectos en el sitio del gen GH1 son mostradas en la Tabla 1 junto con los diferentes tipos de lesión implícita hasta ahora detectados . Tabla 1: Clasificación de desórdenes heredados que implican el gen GH1 Desorden Modo de Tipos de lesión de Proteina Estado de herencia gen responsables GH deficiencia IGHD IA Recesivo Supresiones grandes, Ausente Estatura pequeña autosomal micro-supresiones, severa. mutaciones de no Anticuerpos Anti- sentido GH frecuentemente producidos en el tratamiento con GH, que dan por resultado pobre respuesta al mismo. IGHD IB Recesivo Mutaciones de sito Deficiente Estatura pequeña. autosomal de empalme Los pacientes usualmente responden bien a la GH exógena .

IGHD II Dominante Sitio de empalme y Deficiente Estatura pequeña. autosomal mutaciones Los pacientes intrónicas. usualmente mutaciones de mal responden bien a sentido la GH exógena. La caracterización de estas lesiones ha ayudado a proporcionar explicaciones para las diferencias en la severidad clínica, modo de herencia y la propensión a la formación de anticuerpo en respuesta a la GH exógenamente administrada, entre estas formas de IGHD. La mayoría de los casos son esporádicos y se asumen que surgen de traumatismos o defectos cerebrales que incluyen edema cerebral, anomalías cromosómicas, histiocitosis, infecciones, radiación, displasia septo-óptica, trauma o tumores que afectan el hipotálamo o la pituitaria. Los exámenes de formación d^ imagen de resonancia magnética detectan las anomalías hipotalámicas o de la pituitaria en aproximadamente 12% de pacientes que tienen IGHD. Aunque la estatura pequeña, velocidad de altura' o velocidad de crecimiento retardada, y la maduración esquelética retardada todas son observadas con deficiencia d GH, ninguna de estas es específica para este desorden; otra.*: enfermedades sistémicas pueden dar por resultado tales síntomas. Por toda esta especificación, 'velocidad de altura' y velocidad de crecimiento ambas se van a considerar que significan la proporción de cambio de la altura del sujeto del paciente, tal como es medido en centímetros por año. Las pruebas de estimulación para demostrar la deficiencia de GH usan L-Dopa, hipoglucemia inducida por insulina, arginina, insulina-arginina, clonidina, glucagón o propranolol. Las respuestas pico de GH inadecuadas (usualmente <7-10 ng/mL) difieren de prueba a prueba. La prueba para deficiencias concomitantes de LH, FSH, TSH y ACTH deben ser realizadas para determinar el grado de la disfunción de la pituitaria y para planear el tratamiento óptimo . La GH derivada recombinante está disponible por todo el mundo y es administrada mediante inyección subcutánea. Para obtener un efecto óptimo, los niños con IGHD son usualmente iniciados en la terapia de reemplazo tan pronto como es establecida su diagnosis. La dosificación inicial de GH recombinante está basada en el peso del cuerpo o el área de superficie, pero la cantidad exacta usada y la frecuencia de administración puede variar entre diferentes protocolos. La dosificación se incrementa con el peso del cuerpo incrementado a un máximo durante la pubertad. Después, el tratamiento con GH debe ser temporalmente descontinuado mientras que la capacidad secretoria de GH del individuo es reevaluada. Aquellos con deficiencia de GH confirmada reciben una dosis menor de GH exógena durante la vida adulta. Las condiciones que son tratadas con GH incluyen (i) aquellas en las cuales se ha probado eficacia y (ii) una variedad de otras en las cuales su uso se ha reportado pero no aceptado como práctica estándar. Los desórdenes en los cuales el tratamiento con GH ha probado eficacia incluyen deficiencia de GH, ya sea aislada o en asociación con la deficiencia de hormona de pituitaria combinada (CPHD) y el síndrome de Turner. Las respuestas clínicas de los individuos con los primeros dos desórdenes para la terapia de reemplazo de GH varían dependiendo de: (i) la severidad de la deficiencia de GH y sus efectos adversos en el crecimiento, la edad en la cual se comienza el tratamiento, el peso en el nacimiento, el peso actual y la dosis de GH; y (ii) reconocimiento y respuesta al tratamiento de deficiencias asociadas tal como la deficiencia de hormona de tiroides; y (iii) si el tratamiento es complicado por el desarrollo de anticuerpos anti-GH. El efecto del tratamiento para individuos con síndrome de Turner varía con la severidad de su estatura pequeña, su complemento cromosómico y la edad en la cual se comenzó el tratamiento. Desórdenes adicionales en los cuales el uso de GH ha sido reportado, incluyen el tratamiento de ciertas displasi s esqueléticas tales como acondroplasia, síndrome de Prader-Willi, supresión del crecimiento secundaria a esteroides exógenos o en asociación con enfermedades inflamatorias crónicas tal como artritis reumatoide, en la falla renal crónica, estatura pequeña idiopá ica extrema, síndrome de Russell-Silver y retardo del crecimiento intrauterino. La caracterización de la IGHD familiar al nivel genético molecular es importante por varias razones. La identidad del sitio implicado indicará no solamente la severidad probable del retardo del crecimiento sino, más importantemente la apropiabilidad o de otra manera los diversos regimenes terapéuticos ahora disponibles. Además, la detección de las lesiones de gen implícitas sirven para confirmar la etiología genética de la condición. Esto también puede tener valor de pronóstico en predecir (i) la severidad del retardo de crecimiento y (ii) la probabilidad de la formación de anticuerpo ánti-GH subsecuente al tratamiento con GH. En algunos casos, el conocimiento de la(s) lesión(es) patológica (s) también ayudar a explicar un modo inusual de herencia del desorden y por lo tanto es esencial para el asesoramiento de las familias afectadas. Finalmente, la caracterización de las lesiones mutacionales responsables para casos de IGHD que manifiestan una molécula de GH disfuncional (opuesto a no funcional) podrían producir nuevos discernimientos en la estructura y la función de GH. Al nivel celular, una molécula de GH individual enlaza dos moléculas de receptor de GH (GHR) provocándolas que se dimerizen. La dimerización de las dos moléculas de GHR enlazadas a GH se cree que es necesaria para la transducción de señal, que está asociada con la tirosina quinasa JAK2. Se ha sugerido que los diversos efectos de GH pueden ser mediados por un solo tipo de molécula GHR que puede poseer diferentes dominios citoplásmicos o sitios de fosforilación en diferentes tejidos. Cuando son activados por JAK2, estos diferentes dominios citoplásmicos pueden conducir a distintas rutas de fosforilación, una para efectos de crecimiento y otros para varios efectos metabólicos . GH es una proteina de 22 kDa secretada por las células somatótrofas de la pituitaria anterior. Los estudios cristalográficos de rayos X han mostrado que GH comprende un núcleo de dos pares de alfa hélices paralelas arregladas de un modo de arriba-arriba-abajo-abajo. Esta estructura es establecida por dos enlaces de disulfuro intramoleculares (Cys53-Cysl65 y Cysl82-Cys 189) . Dos moléculas de receptor de hormona de crecimiento (GHR) enlazan a dos sitios estructuralmente distintos sobre la molécula de GH, un proceso que procede secuencialmente mediante el enlace de GHR primero en el sitio 1 y luego en el sitio 2. El enlace de GHR a GH aumenta en potencia la dimerización de las moléculas de GHR. Los estudios de mutagénesis de exploración de la molécula de GH han producido un cuadro de las interacciones de enlace entre GH y su receptor, mientras que la mutagénesis dirigida al sitio se ha usado para sondear la función de residuos, específicos. Asi, la sustitución de Glyl20 (en la tercera alfa hélice de la GH humana) por Arg da por resultado la pérdida de enlace de GHR al sitio 2 bloqueando de esta manera la dimerización de GHR. De manera similar, el residuo Phe44 de la proteina de GH humana es importante para el enlace del receptor de prolactina. Finalmente, los residuos Aspll5, Glyll9, Alal22 y Leul23 se han mostrado que son críticos para el potencial aumentador de crecimiento de la molécula de GH de murino. La interacción del GHR dimerizado con la proteina de tirosina intracelular quinasa JAK2 conduce la fosforilación de tirosina de las moléculas de transducción de señal corriente abajo, la estimulación de las quinasas de le proteina activada por mitógeno (MAP) y la inducción de transductores de señal y activadores de transcripción (proteínas STAT) . De esta manera, GH es capaz de influir en la expresión de múltiples genes a través de un número de diferentes rutas de señalización. Varias isoformas de GH diferentes son generadas de la expresión del gen GHl (la secuencia de referencia GHl es mostrada en la Figura 4) . En 9% de las transcripciones de GHl, el exón 2 es empalmado a un sitio de empalme aceptor alternativo de 45 bp en el exón 3, para suprimir de esta manera los residuos de aminoácido 32 a 46 y generar una isoforma de 20 kDa en lugar de la proteina de 22 kDa normal. Esta isoforma de 20 kDa se presenta que es capaz de estimular el crecimiento y la diferenciación. Los factores implicados en la determinación de la selección del sitio de empalme aceptor alternativo no son todavía caracterizados pero son claramente de una naturaleza compleja. Una isoforma de 17.5 kDa, que resulta de la ausencia de los codones 32 a 71 codificados por el exón 3, también se ha detectado en cantidades pequeñísimas en el tejido de tumor de pituitaria. Los productos de empalme que carecen de ya sea los exones 3 y 4 o los exones 2, 3 y 4 han sido reportados en el tejido de pituitaria pero estos aparecen para codificar productos de proteina inactivo. Una variante glucosilada de 24 kDa de la GH también ha sido descrita. La secuencia de aminoácidos de la isoforma de 22 kDa mayor es presentada en la Figura 5, la cual muestra la secuencia de nucleótidos de la región de codificación del gen G 1 y la secuencia de aminoácidos de la proteina que incluye el péptido guia de 26 aminoácidos. Los números laterales se refieren a la numeración del residuo de aminoácido. Los números en negritas que flanquean las flechas verticales especifican los limites del exón. El codón de terminación es marcado con un asterisco. El gen que codifica la hormona de crecimiento de pituitaria (GH1) está localizado en el cromosoma 17q23 dentro de una agrupación de cinco genes relacionados (Figura 1) . Esta agrupación de 66.5 kb ahora se ha secuenciado en su totalidad [Chen y colaboradores, Genomics 4 479-497 (1989) y ver la Figura 4)]. Los otros sitios presentes en la agrupación del gen de hormona de crecimiento son dos genes de somatomamotropina coriónicos {CSH1 y CSH2) , un pseudogen de somatomamotropina coriónico (CSHP1) y un gen de hormona de crecimiento (GH2) . Estos genes son separados por regiones intergénicas de 6 a 13 kb en longitud, yacen en la misma orientación transcripcional, son placentalmente expresados y están bajo el control de un mejorador especifico de tejido corriente abajo. El sitio GH2 codifica una proteina que difiere de la hormona de crecimiento derivada de GHl en los 13 residuos de aminoácido. Todos los cinco genes comparten una estructura muy similar con los cinco exones interrumpidos en las posiciones idénticas por los intrones cortos, 260bp, 209bp, 92bp y 253bp en longitud en el caso de GHl (Figura 2) . El exón 1 del gen GHl contiene 60 bp de la secuencia 5' no traducida (aunque un sitio de iniciación transcripcional alternativo está presente en -54), los codones -26 a -24 y el primer nucleótido del codón -23 correspondiente al inicio de la secuencia guia de 26 aminoácidos. El exón 2 codifica al resto del péptido guia y los primeros 31 aminoácidos de la GH madura. Los exones 3-5 codifican los aminoácidos 32-71, 72-126 y 127-191, respectivamente. El exón 5 también codifica la secuencia 3' no traducida de 112bp que culmina en el sitio de poliadenilación. Un elemento de secuencia repetitivo AIu está presente lOObp 3' al sitio de poliadenilación de GHl. Aunque los cinco genes relacionados son altamente homólogos por todas sus regiones flanqueantes y de codificación 5' , ellos divergen en sus regiones flanqueantes 3' . Los genes GHl y GH2 difieren con respecto a sus patrones de empalme de mRNA. Como es mencionado en lo anterior, en 9% de las transcripciones de GHl, el exón 2 es empalmado a un sitio de empalme aceptor alternativo de 5bp en el exón 3 para generar una isoforma de 20 kDa en lugar de 22 kDa normal. El gen GH2 no es alternativamente empalmado de esta manera. Una tercera variante de 17.5 kDa, que carece de los 40 aminoácidos codificados por el exón 3 del GHl, también ha sido reportada. Los sitios CSH1 y CSH2 codifican proteínas de secuencia idéntica y son 93% homólogos a la secuencia de GHl al nivel de DNA. Por comparación con las secuencias del gen CSH el gen CSHP1 contiene 25 sustituciones de nucleótido dentro de sus "exones" más una transición G?A en la posición +1 obligada del sitio de empalme donador del intrón 2 que parcialmente inactiva su expresión. Un número de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción bialélicos (RFLPs) se han reportado dentro de la región del gen GH. Cinco de estos (dos BglII, dos MspI, un £fíncl) ocurren en caucásicos y negros mientras que un polimorfismo BamH ocurre predominantemente en negros . El fuerte desequilibrio de enlace se ha observado entre estos polimorfismos, consistente con el origen revolucionario relativamente reciente de la agrupación de genes. Los polimorfismos HincII y BamHI ocurren inmediatamente 5' al gen GHl. Un polimorfismo Rsa ocurre en la región de promotor GHl resultando de un dimorfismo A/G en el nucleótido -75 mientras que un polimorfismo Sphl relativamente frecuentemente permanece para ser completamente caracterizado. Un polimorfismo de repetición de número variable altamente informativo (83% de heterocigosidad) se ha localizado cerca de 19 kb 3' al gen GH1; formateado por PCR, los 18 alelos distintos de este polimorfismo pueden ser distinguidos por el tamaño de fragmentos (201 a 253bp) . Finalmente, el promotor de gen Gffl/región 5' -no traducida se ha encontrado que muestra un muy alto nivel de polimorfismo de secuencia con 17 nucleótidos variantes dentro de un estiramiento de 570 bp (Tabla 2A) : Tabla 2A: Polimorfismos conocidos en el promotor de gen GB1 humano/región 5' no traducida [después de Giordano y colaboradores, Human Genetics 100 249-255 (1997) y Wagner y colaboradores, E r. J. Endocrinol. 137 474-481] . (Figura 3) .

Ubicación del nucleótido Polimorfismo (nucleótidos alternativos) -476 GA -364 G/T -339 AG -308 T/G -301 T/G -278 T/G -272 a -276 CCAGA/SMRRR -75 A/G -57 G/T -31 ñG -6 G/A -1 T/A/C +3 G/C +16 A/G +26 A/C +59 T/G Los polimorfismos en las posiciones -1, +3 y +59 se predicen que causan sustituciones de aminoácidos en la proteina GFDTA, putativamente codificados por esta región de], promotor de gen GHl (ver enseguida) . Algunas de las varianteí de secuencia ocurren en las mismas posiciones en la cual el gen GHl difiere de los otros genes placentalmente expresados sugiriendo que el mecanismo podria ser la conversión del gen y que los genes placentales han servido como donadores de la.'s secuencias convertidas . En un estudio de niños pequeños de prepubertad con insuficiencia de GH, Hasegawa y colaboradores, [J. Clin. Endocrinol Metab 85 1290-1295 (2000)] reportaron una asociación entre tres polimorfismos en el gen GHl [IVS4 C?T 1101, ' T/G -278 y T/G -57] y tanto la secreción de GH y la altura.

Puesto que se reportaron las primeras supresiones del gen GHl, una variedad de lesiones más sutiles han sido descritas. En algunos casos, estas lesiones se han asociado con tipos inusuales de deficiencia de GH y son potencialmente importantes como un medio para obtener nuevos discernimientos en la estructura y la función de la GH. El gen que codifica la hormona de crecimiento (GHl) fue uno de los primeros genes humanos a ser clonados y las primeras supresiones de gen grandes (tipo 6.7kb) responsables para la deficiencia de hormona de crecimiento heredada fueron pronto detectados por el manchado de Southern. Todas las supresiones grandes que implican el gen GHl resultan en deficiencias severas (tipo IA) , caracterizado por la ausencia total de GH. Aproximadamente 70% de las supresiones caracterizadas del gen GHl son de 6.7 kb en longitud, mientras que la mayoría del resto son de 7.6 kb o 7.0 kb (Tabla 2B - Supresiones grandes que implican el gen GHl, o en la vecindad del gen GHl, que ocasionan deficiencia de GH y estatura pequeña) . Tabla 2B: Supresiones grandes que implican al, o en la vecindad del gen GHl Tamaño de Sitios Comentarios ¿Anticuerpos supresión implicados de (kb) postratamiento presente? 6.7 GH1 Familia suiza Si 6.7 GH1 Familia japonesa Si 6.7 GHl Familia argentina de Si ascendencia española. Homocigota 6.7 GH1 Familia austríaca Si 6.7 GH1 Familia brasileña Si 6.7 GH1 Paciente con estatura Si pequeña y fibrosis cistica 6.7 GH1 Varios No 7.6 GH1 Familias iraqui, No yemenita e irani 7.6 GH1 Familia italiana. Si Homocigota . Matrimonio consanguíneo 7.6 GH1 Familias italiana y Si turca 7.6 GH1 Familia española No 7.6 GH1 Varios Si 7.0 GH1 Familia canadiense Si 7.0 GH1 Familia mexicana Si 7.0 GH1 Familia china. No - Sin Homocigota tratamiento con GH 45 GHl, CSHP1, Familia turca. Si CSH1, GH2 Homocigota. Matrimonio consanguíneo 45 GHl, CSHP1, Familia italiana. Si CSH1, GH2 Homocigota 45 GHl, CSHP1, Familia italiana. Si CSH1, GH2 Homocigota . Matrimonio consanguíneo 45 GHl, CSHP1, Familia "asiática" No CSH1, GH2 ? CSH1, GH2, Familia italiana. No CSH2 Heterocigota ? CSH1, GH2, Familia danesa. No CSH2 Compuesto heterocigoto para supresiones no idénticas Doble (i) GHl Origen francés (Gitano) . Si (6.7kb) Homocigoto . Matrimonio (ii) CSH1, consanguíneo . GH2, CSH2 (~32kb) Además, varios ejemplos de supresiones mucho más infrecuentes han sido reportados. En años recientes, se han hecho varios intentos para apartarse del manchado de Southern hacia los procedimientos basados en PCR como una herramienta de clasificación de mutación.' Las supresiones del gen GHl homocigotas han sido muy fácilmente detectadas mediante la purificación de PCR del gen GHl y las regiones flanqueantes seguidas por la digestión con enzima de restricción con los productos de PCR resultantes. Aunque este procedimiento ha sido usado exitosamente para excluir la homocigocidad para una supresión de GHl en embarazos en riesgo, sin embargo es incapaz de distinguir la homocigocidad para el gen de tipo silvestre de la heterocigosidad para una supresión de gen. Esto también no lograría detectar supresiones diferentes de las supresiones relativamente cortas de 6.7, 7.0 y 7.6 kb que retiran solamente el gen GHl. Se han diseñado cebadores de PCR que inmediatamente flanquean al gen GHl y que generan un fragmento de 790bp de las muestras de DNA de control. La ausencia de este fragmento se mantuvo que es indicativa de una supresión de gen GHl pero el uso de "fragmentos de PCR no específicos" como controles internos para la amplificación de PCR debe hacer la conflabilidad de este método un poco sospechosa. Asi como supresiones grandes, tres micro-supresiones del gen GHl han sido reportadas; dos de estos pacientes también fueron heterocigotos para la supresión del gen GHl de 6.7 kb (Tabla 3). Tabla 3: Micro-supresiones en el gen GHl que ocasionan deficiencia de GH y estatura pequeña Tipo de Supresión Codón ¿Anticuerpos deficiencia (Las letras minúsculas (La numeración de postdenotan las bases suprimidas. es relativa al tratamiento ? Especifica la ubicación del codón de presentes? codón numexado inmediatamente iniciación corriente abajo) . traduce!onal ATO en -26) . IA GCCTG~CTCTGcCTGCCCTGGC -11 Si II CCCCAGGCGGggatgggggagacctgta Intrón 3 (del+28 No GTCAGAGCCC a +45) IA TCTGT^TTCTCagAGTCTATTCC 54 No Solamente siete diferentes sustituciones de pares bases individuales se han reportado de adentro de la región de codificación del gen GH1 (Tabla 4) . Tabla 4: Sustituciones de pares bases individuales en la región de codificación GH1 que causan deficiencia de GH y estatura pequeña Tipo de Sustitución Sustitución Codón ¿Anticuerpos. deficiencia de nucleótido de aminoácido (la numeración de postes relativa al tratamiento codón de presentes? Iniciación traduccional ATO en -26) IA ACA—GCA Thr-Ala -24 No ?? TGG?TAG Trp-Term -7 No ?? GAG— AG Glu-Term -4 Si II CGC-TGC Arg-Cys 77 No 7 CCC—CTC Pro—Leu 89 No GAC-GGC Asp--Gly 112 No CGC-.CAC Arg?His 183 No Dos de estas sustituciones de pares de bases . individuales son mutaciones de no sentido que convierten residuos de aminoácido Trp-7 y Glu-4 en el péptido de señal a codones de detención. Estas mutaciones son las únicas lesiones de gen GHl conocidas que causan deficiencia de tipo IA que no son supresiones de genes. Puesto que estas lesiones predicen la terminación de la traducción dentro del péptido de señal, ellas serian incompatibles con la producción de una molécula de GH funcional. Las otras cinco sustituciones de pares bases individuales (incluyendo R? en el codón 77, descrito en el documento EPA 790 305 con relación al tratamiento del gigantismo) son mutaciones de mal sentido que resultan en la producción de moléculas de hormona de crecimiento disfuncionales. Tales mutaciones que surgen de manera natural son mucho más informativas que las mutaciones artificialmente inducidas, en que las primeras pueden ser, en principio, relacionadas directamente con el fenotipo clínico, es decir, la altura del paciente en cuestión. Las sustituciones de pares de bases individuales en la región de promotor de posible significado patológico fueron primero buscadas al secuenciar la región de promotor del gen GHl (entre -60 y +70 con relación al sitio de iniciación transcripcional) en tres pacientes Chinos con IGHD IA y 2 controles. Varias diferencias se observaron pero estas fueron probables polimorfismos y no se caracterizaron adicionalmente. Como es mencionado en lo anterior, la región de promotor del gen GHl subsecuentemente se ha mostrado que exhibe un muy alto nivel de polimorfismo de secuencia con 17 nucleótidos variantes dentro un estiramiento de 570 bp (Figura 3) . Sin embargo, estas variantes de secuencia no se encontraron que sean sobre-representadas en los pacientes como es comparado con los controles. La variación del promotor de GHl también se ha investigado por separado y un total de 22 sitios polimórficos variantes fueron detectados, principalmente sustituciones de pares bases individuales: 17 de estos ocurrieron en una región de 550 bp 5' al codón de iniciación ATG, tres ocurrieron alrededor de la posición -1075 5' ATG, y dos ocurrieron dentro del intrón 1 (IVS1) en las posiciones 76 y 219 respectivamente [Wagner y colaboradores, Eur J Endocrinol 137 474-81 (1997)]. Todas excepto cuatro de estas variantes no se observaron en los controles, pero estas cuatro variantes no se consideraron que son la causa de la deficiencia de hormona de crecimiento. Solamente uno de los sitios variantes ocurrió dentro de una secuencia homologa a un sitio de enlace de factor de transcripción: la presencia alternativa de las secuencias CCAGA y GAGAG en -333 dentro de un sitio de enlace de NF-1 potencial (pero no probado) . Por lo tanto, hasta la fecha no se han reportado mutaciones de significado patológico en el promotor del gen GH1. Las sustituciones de pares de bases individuales que afectan el empalme de mRNA también han sido descritas en el gen GH1. La mayoría están asociadas con una forma dominante comparativamente rara de deficiencia de GH (Tabla 5) . Tabla 5: Sustituciones de pares de bases individuales que afectan el empalme de mRNA y que causan deficiencia de GH y estatura pequeña. Tipo de Sustitución de Sitio de fmpalmft Origen etno-deficiencia nucleótido/posición geográfico/cigosidad II G—A, +1 IVS3 donador Suecia, Norteamérica, Europa del Norte, Sudáf ica, Chile/heteroc goto II o?c, +1 IVS3 donador Turco/heterocigoto II T-C, +2 IVS3 donador Ruso/heterocigoto II G-.A, +5 IVS3 donador Chileno/heterocigoto II G-C, +5 IVS3 donador Japonés/heterocigoto II T-C, +6 IVS3 donador Turco/heterocigoto Asiát ico/heterocigoto II G—A, +28 IVS3. donador ?/he erocigoto IB G-C, +1 IVS donador Saudi Arabe/hornocigoto IB G-T, +1 IVS4 donador Saudi Arabe/homocigoto IB G—C, +5 IVS4 donador Beduino/heteroeigoto Las transversiones en el sitio de empalme del intrón 4 donador se han mostrado mediante el análisis de expresión in vitro de mR A de células transfectadas para activar un sitio de empalme reservado dentro del exón 4, 73bp 5' al sitio de empalme de exón 4 donador. Esto predecirla la generación de un producto aberrantemente empalmado que carece de los aminoácidos 103-126 codificado por el exón 4 y, como una consecuencia de un desplazamiento en la estructura de lectura, la incorporación de 94 aminoácidos novedosos incluyendo 29 resultantes de la lectura a través de la región de no codificación 3' normalmente no traducida del gen GH1. Puesto que la región de la proteina de GH codificada por los exones 4 y 5 se piensa que es importante para corregir la dirección de la proteina a los gránulos secretorios, se ha predicho que esta proteina aberrante no seria secretada normalmente. Sin embargo, nada de anticuerpos a la GH exógena se han observado en pacientes con deficiencia de GH tipo IB. La evitación de la intolerancia inmune asi 23 puede indicar que por lo menos algo del producto de proteina aberrante podría ser secretado y que podría ser parcialmente estable a la circulación. Las siete mutaciones de empalme conocidas dentro de IVS3 (Tabla 5) están asociadas con un estado de deficiencia de tipo II que manifiesta la herencia dominante autosomal a través de las familias afectadas. Los pacientes con deficiencia de GH con mutaciones de GH1 de truncamiento o supresiones de genes homocigotas están en riesgo considerable de desarrollar anticuerpos anti-GH en el tratamiento con GH. En contraste, los inventores no están enterados de cualquiera de los reportes que describen la formación de alo-anticuerpo en pacientes con ya sea mutaciones de mal sentido o sustituciones de pares base individuales dentro de sitios de empalme. Hasta ahora no se han reportado otras correlaciones entre el genotipo mutante y el fenotipo clínico. Los datos necesarios en la literatura publicada son escasos y muy variables en calidad, pero los inventores han intentado un meta-análisis tosco como un medio para medir si o no pacientes con supresiones de genes grandes difieren de pacientes con mutaciones de sitio de empalme en términos de sus secuelas clínicas y fenotipicas. La altura de los pacientes con supresiones GHl se encontró que es en promedio 7.3 SD por debajo del promedio ajustado a la edad (n=29), como es comparado con un promedio de 5.4 SD por debajo del promedio (n=17) para los pacientes con mutaciones de empalme GH1. Aunque el retardo de enve ecimiento del hueso fue más grande y la velocidad de crecimiento menor en los pacientes con supresión, tales descubrimientos son muy difíciles de interpretar puesto que ellos pueden ser sometidos a prejuicio de comprobación. Puesto que la mayoria de los casos de deficiencia de GH familiar hasta ahora descritos son heredados como una cualidad recesiva autosomal, algunos ejemplos del estado de deficiencia heredados son probables que no sean reconocidos debido a su tamaño pequeño de familia. De manera sim lar, los casos de deficiencia de GH que resultan de las mutaciones de nuevo del gen GH1 podrían ser clasificados por esporádicos, y una explicación genética para el desorden no seria aspirada ni buscada. Finalmente, dependiendo de los criterios usados para definir el estado de deficiencia, puede ser que la extensión completa del espectro tanto fenotipico como genotipico de la deficiencia de GH nunca puede llegar a tener atención clinica. Por estas razones, los estimados actuales de la prevalencia de la deficiencia de GH podrían ser incorrectos y por lo tanto pueden subestimar seriamente la prevalencia real en esta población. La definición de IGHD favorecida por muchos, combina (a) el retardo de crecimiento severo, frecuentemente - como es mencionado en lo anterior - definido como <-4.5 SD en altura; (b) la respuesta de GH reducida a la estimulación/provocación (es decir un nivel de GH en el suero de <4ng/ml); y (c) ninguna otra causa para el retardo del crecimiento. La adherencia estricta a las definiciones formales de lo que constituye la deficiencia de GH y la aceptación muy uniforme de estos criterios, especialmente el criterio (b) , en la selección de pacientes para el estudio [Shalet SM y colaboradores, Endocrine Rev 19 203-223 (1998)] habría servido para asegurar que el espectro mutacional de GH1 descrito no fue solamente lejos de lo completo sino también no representativo del espectro mutacional más amplio. Los inventores han propuesto que la moderación de los criterios aplicados en la selección de pacientes para estudio sería probablemente conducir a la inclusión de pacientes cuya falla de crecimiento es una manifestación de una porción diferente del espectro de deficiencia de GH, y que por lo tanto podría proporcionar un conjunto novedoso de lesiones mutacionales implícitas. Algunas de estas lesiones novedosas podrían dar origen a moléculas GH estables, pero disfuncionales que exhibirían reactividad inmunológica normal pero poco o nada de actividad biológica. En la base de los resultados de la prueba de radio-inmunoensayo, las moléculas GH disfuncionales habrían sido erróneamente consideradas como normales. Si tales variantes disfuncionales fueran presentadas para ser comunes, entonces se seguiría que la deficiencia de GH está siendo sub-diagnosticada como un resultado de la dependencia actual de los inventores en las "pruebas de función" de GH basadas en radioinmunoensayo. Además, esto demostrarla una necesidad urgente para el desarrollo de un ensayo de diagnóstico funcional real. Los inventores por lo tanto han investigado una variedad de grupos de pacientes y sorprendentemente encontraron nuevas variantes de GH1 junto con algunas variantes de proteina GH correspondientes codificadas de tal manera . Por consiguiente, la presente invención proporciona una variante de GH1, seleccionada del grupo que consiste de: (a) (i) +480 C ? T; (ii) +446 C ? T; (iii) +1491 C - G; (iv) -60 G - A; (v) -40 a -39 GG - CT (vi) -360 A - G; y (vii) +748 A - G (donde las cifras se relacionan al número de posición del nucleótido de GH1, contando desde TSS); (b) una secuencia sustancialmente homóloga a, o que híbrida las secuencias (a) bajo condiciones severas. c) una secuencia sustancialmente homóloga a, o que hibrida a las secuencias (a) o (b) pero para la degeneración del código genético; y (d) un oligonucleótido especifico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c) anteriores. Por "sustancialmente homólogo" en la presente se propone que la secuencia de ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de sus bases de nucleótido con aquellos de la secuencia (a) , en posiciones igualadas a la secuencia, con la condición de que hasta seis bases pueden ser omitidas o adicionadas en la misma, y además con la condición de que la mutación especificada es conservada. De preferencia, la secuencia tiene por lo menos 90% de homología y más preferidas son las secuencias que tienen por lo menos 95% de homología con la secuencia (a) . Tales secuencias homólogas codifican una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica, incluyendo actividad funcional, como las proteínas correspondientes codificadas por las variaciones de secuencia de ácido nucleico de la invención. Los oligonucleótidos "específicos para" cualquiera de estas secuencias de ácido nucleico (a) a (c) anteriores, son útiles para identificar y aislar las secuencias de esta invención, y comprenden una secuencia única que codifica un fragmento único de la secuencia de aminoácidos del péptido correspondiente . Las variantes preferidas de acuerdo con (a) anterior, son: (a) (i) +480 C - T; y (ii) +446 C - T. En particular, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico como es definida en lo anterior, en donde la secuencia es una secuencia de DNA o RNA, tal como cDNA o mRNA. La presente invención por lo tanto también proporciona una transcripción de una variante de GHl, tal como una proteina (después en la presente 'variante de GH' ) que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de GHl, en donde la variante de GH1 es una de acuerdo con esta invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona una variante de GH, con referencia a hGH, seleccionada de: (i) Thr27lle, por ejemplo, que es codificada por la variante de Gíf2(a) (i) como es definido en lo anterior (específicamente, +480 C ? T ) ; (ii) Argl6Cys, por ejemplo, que es codificada por la variante de GHl (a ) (ii) como es definido en lo anterior (específicamente, +446 C ? T ) ; (iii) Ilel79Met, que es codificada por la variante de GHlI(a) (i) como es definido en lo anterior (específicamente, +1491 C ? G) ; (iv) Asn47Asp, que es codificada por la variante de GHl(a) como es definido en lo anterior (específicamente, +748 A - G) . Las varxantes preferidas de GHl anterior, son: (i) Thr27lle, por ejemplo, que es codificada por la variante de GHl {a) (i) como es definido en lo anterior (específicamente; +480 C ? T); (ii) Argl6Cys, por ejemplo, que es codificada por la variante de GHl(a) (ii) como es definido en lo anterior (específicamente, +446 C -» T) ; y (iii) Ilel79Met, que es codificada por la variante de GHl ( a ) (i) como es definido en lo anterior (específicamente, +1491 C G) . Las variantes de GHl anteriores especialmente preferidas son: (i) Thr27Ile, por ejemplo, que es codificada por la variante de GHl{a.) (i) como es definido en lo anterior (específicamente, +480 C -»· T ) ; y (ii) Argl6Cys, por ejemplo, que es codificada por la variante de GHl(a) (ii) como es definido en lo anterior (específicamente, +446 C — T) . Las variantes de GHl identificadas en lo anterior o proteína codificada de esta manera pueden dar origen a las siguientes ventajas: 1. Expansión del espectro conocido de las mutaciones del gen GHl mediante la identificación y la caracterización de nuevas lesiones . 2. Evaluación de la "función de las mutaciones del gen GH1 en la etiología de la estatura pequeña. 3. Identificación del modo de herencia de las lesiones de gen GH1 novedosas . 4. Elucidación de la relación entre el genotipo mutante y el fenotipo clínico. Esto se considera esencial para la detección temprana y el manejo clínico apropiado de la deficiencia de GH. 5. Evaluación de los efectos de las nutaciones de GH1 sobre la . estructura y la función de la molécula GH. Esto es particularmente importante para la estimación de aquellos niños con un fenotipo clínico en el extremo más moderado del espectro clínico de estatura pequeña. En este grupo de pacientes, se puede producir GH disfuncional que es inmunológicamente activo y por lo tanto se encuentra dentro del rango normal en las pruebas de función de GH. 6. Desarrollo de pruebas de diagnóstico de DNA rápidas para la deficiencia de GH heredada. Por lo tanto, la caracterización de las lesiones de GH1 que surgen de manera natural, adicionales, promete ser de importancia considerable para los estudios de la estructura, función y expresión de GH. Los estudios de variantes de secuencia de codificación novedosas deben incrementar el entendimiento no solamente en función de GH, sino también de las interacciones entre GH y su receptor (GHR) y el proceso de la transducción de señal mediada por GHR. Los discernimientos obtenidos podrian ser relevantes para el diseño racional de una nueva generación de agentes terapéuticos. De manera similar, los estudios de las lesiones de GHl que surgen de manera natural en la región de promotor deben proporcionar nuevos discernimientos en el control de ..a expresión del gen GHl. Asi, se puede observar que un amplio espectro de lesiones mutacionales necesariamente mejoraria en el entendimiento de la relación entre el genotipo mutante y el fenotipo clinico en formas heredadas de la deficiencia de GH. Claramente, estos estudios son esenciales para la detección temprana y el manejo clinico apropiado de la deficiencia de GH familiar. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de clasificación para clasificar un paciente que se sospecha de tener GH disfuncional, el método de clasificación que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos del gen GHl humano del paciente; y (b) comparar una región de la secuencia obtenida de la muestra de prueba con la región correspondiente de una secuencia predeterminada caracterizada en que la secuencia predeterminada es seleccionada de una variante de GHl de la presente invención. Más específicamente, el método de clasificación de la invención es caracterizado en que la secuencia predeterminada es un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante, la región que incorpora por lo menos una variación seleccionada de aquellas definidas en la presente, cuando es comparada con la región correspondiente de la secuencia de tipo silvestre. De preferencia, la muestra de prueba comprende DNA genómico, que puede ser extraído por métodos convencionales. Convenientemente, la presente invención proporciona un método de clasificación para clasificar un individuo que se sospecha de disfunción de GH, el método de clasificación que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos de gen GHl humano de un individuo; y (b) comparar una región de la secuencia obtenida de la muestra de prueba con la región correspondiente de una secuencia predeterminada en donde la secuencia predeterminada es seleccionada de una variante de GHl de acuerdo con esta invención. La secuencia predeterminada es de preferencia un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante de acuerdo con esta invención, la región que incorpora por lo menos una variación cuando es comparada con la región correspondiente de la secuencia de tipo silvestre. La primera muestra de prueba o la muestra de prueba en los métodos de clasificación de esta invención de preferencia comprende DNA genómico. En el método de clasificación de la invención, la etapa de comparación puede ser llevada a cabo de manera convencional, por ejemplo, al secuenciar la región apropiada del gen GH1, particularmente en el caso donde relativamente pocas variantes van a ser detectadas/comparadas. Donde números relativamente grandes de variantes están implicados, la tecnología de chip de DNA puede ser empleada, tal como en donde el chip es un dispositivo analítico paralelo en miniatura que es usado para clasificar simultáneamente ya sea las mutaciones conocidas múltiples o para todas las mutaciones posibles, mediante la hibridación del · DNA de muestra marcado (cDNA o DNA genómico derivado del paciente) a micro-arreglos de sondas de oligonucleótido especificas de mutación inmovilizadas sobre un soporte sólido [Southern, Trends Genet 12 110-115 (1996)]. La ventaja de un método de clasificación de DNA de acuerdo con la invención sobre las pruebas actuales incluye: 1. Esto implica, para el paciente, solamente una sola prueba de sangre que puede ser realizada en una clínica. La admisión al hospital, la supervisión médica prolongada y el muestreo de sangre repetido no serian requeridos como es el caso de la mayoría de pruebas actualmente disponibles. Por lo tanto existiría una reducción en el gasto incurrido/ el uso del tiempo del especialista y la angustia causada para cada paciente probado. 2. La diagnosis más temprana de la deficiencia de GH funcional en pacientes podría ser posible. La facilidad con la cual la clasificación de DNA puede ser realizada permitiría al médico clínico considerar tal investigación mucho más antes en el manejo de un paciente que de otra manera podría ser el caso. Actualmente, debido a los problemas inherentes en las pruebas para la secreción de GH, los doctores estimarán niños en la clínica de pacientes externos durante un período largo de tiempo, algunas veces varios años, antes de que ellos sometan a un niño a un IST. La diagnosis temprana de una etiología genética para la deficiencia de GH haría posible el tratamiento más temprano con la GH, para de esta manera llevar hacia delante la oportunidad para tratar pacientes apropiadamente por meses, o aún años en individuos con un fenotipo menos severo. 3. Más pacientes podrían ser probados para la disfunción de GH. La facilidad de la prueba de DNA permitiría al doctor desempeñarla como parte de la estimación inicial de todos los pacientes pequeños en su primera visita a la clínica endocrina. Esto es probable para revelar pacientes con lesiones del gen GH1 que causan problemas de crecimiento severo y también aquellos con lesiones más moderadas (por ejemplo, mutaciones de mal sentido en la región de codificación) . Estos pacientes pueden no haber venido a la atención clinica debido a que sus problemas clinicos/fenotipicos no habrian sido lo bastante severos para garantizar un IST, pero ellos no obstante podrian aun beneficiarse del tratamiento con GH. 4. La identificación temprana de los pacientes que requieren tratamiento de toda la vida con GH seria posible. Estos pacientes podrian ser identificados y tratados apropiadamente sin recursos para ya sea la prueba inicial o la re-prueba para la secreción de GH, o el uso de un periodo sin GH para estimar su progreso (un "experimento sin tratamiento") . 5. La identificación fácil y temprana de los miembros de la familia con la disfunción de GH podria ser disponible. Una vez que la lesión genética responsable para los problemas de crecimiento ha sido identificada en un individuo, es relativamente fácil estimar otros miembros de la familia para la misma lesión genética y averiguar si ellos también ganarían beneficio del tratamiento con GH. 6. La precisión de la diagnosis debe incrementarse. Las pruebas para la secreción de GH son notorias par su variabilidad en términos de reproductibilidad de los resultados del ensayo, tanto dentro y entre los laboratorios.

La clasificación de DNA haría este problema una cosa del pasado. Además, los resultados de la prueba de secreción de GH pueden ser muy difíciles de interpretar en ciertas situaciones, por ejemplo, si el paciente es también hipotiroide o tiene pubertad retardada. La clasificación de DNA quitaría esta duda y prevendría el retardo en La iniciación del tratamiento de GH para aquellos pacientes e\ quienes su uso sería beneficioso. Por consiguiente, la presente invención además proporciona un kit adecuado para el uso en llevar a cabo el método de clasificación de la invención, el kit comprende: (a) un oligonucleótido que tiene un secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante, la región que incorpora por lo menos una variación de la secuencia de tipo silvestre correspondiente seleccionada de variaciones de acuerdo con la presente invención; y (b) un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de tipo silvestre er la región especificada en (a); y, opcionalmente, (c) uno o más reactivos, adecuados para llevar a cabo la PCR para amplificar regiones deseadas del DNA del paciente. Tales reactivos pueden incluir, por ejemplo, cebadores de PCR correspondientes a un exón del gen GHl, y/o cebadores definidos en la presente; y/u otros reactivos para el uso en PCR, tal como la polimerasa de DNA Taq.

De preferencia, los oligonucleótidos en el kit comprenden en el rango de 20 a 25 pares de bases, tal como 20 pares de bases para las secuencias variantes y ya sea 20 para la del tipo silvestre en el caso donde la variante es una sustitución de par dé base individual o 25 pares de bases donde la variante es una supresión de 5 pares de bases . En cualquier caso, los oligonucleótidos deben ser seleccionados para ser únicos para la región seleccionada y no repetidos en otra parte en el genoma. Obviamente, en la situación donde se desean clasificar múltiples variaciones, tal como en el rango de 15 a 20. o más, esto necesitaría un kit que comprende hasta 40 oligonucleótidos o más . En el método de clasificación alternativo, por lo tanto, usando la tecnología de chip de DNA., la presente invención proporciona una pluralidad de oligonucleótidos como es definido en el componente (a) anterior del kit, inmovilizado sobre un soporte sólido. Otros métodos de detección de nucleótido podrían ser utilizados, tales como los métodos de amplificación de señal que son los promotores en la nanotecnologia (tales como Q-Dots) . También, los métodos de detección de molécula individual podrían ser empleados (tal como STM) . Caso en el cual, el kit de acuerdo con esta invención puede comprender uno o más reactivos para el uso en tales métodos alternativos .

Alternativamente, el método de clasificación y el kit correspondiente de acuerdo con esta invención pueden estar basados en uno o más llamados 'marcadores suplentes' que son indicativos de o correlacionados con la presencia de una variante de GHl o una variante de GH, tales como proteínas/secuencias de aminoácidos, por ejemplo, anticuerpos específicos para una variante de GH o una variante de GHl. Tal "marcador suplente" puede comprender: (a) cualquier biomolécula (que incluye, pero no limitada a, nucleótidos, proteínas, azúcares y lípidos); (b) un compuesto químico (incluyendo, pero no limitado a, fármacos, metabolitos de los mismos y otros compuestos químicos); y/o (c) una característica física, cuya ausencia, presencia o cantidad en un individuo es medible y correlacionada con la presencia de una variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la presente invención. Además, los métodos de clasificación alternativos, adecuados, de acuerdo con esta invención pueden además comprender la obtención de una muestra de prueba que comprende una variante de GH (es decir, una secuencia de proteina/péptido que comprende una variación de hGH, tal como una codificada por una variante de GHl de esta invención) que es identificable mediante los métodos de secuencia de proteina convencionales (incluyendo la espectroscopia de masas, análisis de micro-arreglo, pirosecuenciación-, etc.) y/o métodos de detección basados en anticuerpo (por ejemplo ELISA) , y llevar a cabo uno o más de tales métodos de secuenciación de proteina. En estos casos alternativos, el kit de acuerdo con esta invención puede comprender uno o más reactivos para el. uso en tales métodos alternativos. Las variantes de GHl de esta invención pueden tener usos adicionales, tales como estándares en una prueba de clasificación de disfunción de GH. Por ejemplo, las variantes diferentes de aquellas donde la variación está en la región de promotor del gen GHl pueden ser usadas para tratar un paciente en donde la producción de GH es sobreestimulada, tal como en los casos de gigantismo por pituitaria o acromegalia. La presente invención además proporciona: (a) para el uso de una o más de las variantes de GH o una variante de GHl que comprende dos mutaciones de terminación para la identificación de individuos quienes no producen alguna hormona de crecimiento en todo y quienes serian clasificados como GHD clásico por las técnicas de diagnóstico convencionales; (b) una variante de GH o una variante de GHl que conduce al enlace modificado de GH al receptor de hormona de crecimiento o su proteina de enlace (es decir el portador para GH in vivo) , puesto que el transporte de la variante de GH de la pituitaria al enlazar a su proteina de enlace es deteriorada o inhibida conduciendo a la destrucción de la proteina no enlazada con rumbo al receptor de tejido; (c). una variante de GH o una variante de GHl capaz de interrumpir la formación de la forma de almacenamiento del dimero del zinc en la proteina de GH en la pituitaria; (d) una variante de GH o una proteina expresada por una variante de GHl, que es una proteina con propiedades antagonistas al receptor de GH y cuyo enlace de receptor constante determina la cantidad de GH extraño (dosis) necesario para tratar un paciente para superar la potencia y la acción inhibitoria de la proteina variante; es decir, la proteina variante compite con el tipo silvestre para enlazar al receptor; (e) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para métodos terapéuticos, de diagnóstico o de detección; (f) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para la determinación de la susceptibilidad a una enfermedad en un individuo; (g) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para la determinación de la susceptibilidad a una enfermedad, incluyendo diabetes, obesidad, infección, cánceres o condiciones cardiacas; (h) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para determinar los defectos del enlace de GH y/o los defectos del almacenamiento de la pituitaria; (i) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para la determinación de la dosis de diagnóstico del tratamiento antagonista en la acromegalia; (j) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento médico; (k) uso de la variante de GHl de acuerdo con la invención para el uso en terapia génica; (1) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para la determinación de uno o más polimorfismos asociados con un estado de enfermedad; y (m) uso de la variante de GH o una variante de GHl de acuerdo con la invención para la preparación de una composición terapéutica, composición de diagnóstico o kit, o kit de detección para la prevención, tratamiento, diagnóstico o detección de una condición asociada con o causada por la disfunción de GH en un individuo. (n) un oligonucleótido de aproximadamente 20 nucleótidos en longitud que tiene la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante, la región que incorpora por lo menos una variación de la secuencia de tipo silvestre correspondiente, la variación que comprende uno o más de éstos de acuerdo con esta invención; (o) un oligonucleótido que comprende el complemento del oligonucleótido de (n); (p) un oligonucleótido de (n) , en donde el nucleótido correspondiente a la variación está ubicado en el extremo 3' de la molécula; (q) una sonda de DNA de una sola hebra que hibrida a un gen GHl variante y no a un gen GHl de tipo silvestre, en donde el gen GHl variante es seleccionado de aquellos de acuerdo con esta invención; (r) un arreglo de moléculas de ácido nucleido unidas a un soporte sólido, el arreglo que comprende una sonda de DNA de una sola hebra de acuerdo con (q) ; (s) un método de clasificación para clasificar un individuo que se sospecha de disfunción de GH, el método de clasificación que comprende las etapas de: (i) obtener una muestra de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos del gen GHl humano del individuo; y (ii) comparar la secuencia de una región del gen GHl humano del individuo correspondiente a una región de un gen GHl variante de acuerdo con (n) ; (t) un método de acuerdo con (s), en donde la etapa de comparación implica la hibridación con la secuencia predeterminada; (u) un método de acuerdo con (s), en donde la etapa de comparación comprende la amplificación de por lo menos una porción de un ácido nucleico que codifica GHl humano; (v) un método de acuerdo con (s), en donde la etapa de comparación comprende amplificar por lo menos una porción de un ácido nucleico que codifica GHl humano con uno o más oligonucleótidos seleccionados de aquellos descritos en la presente; (w) un oligonucleótido de amplificación seleccionado de aquellos descritos en la presente; (x) un kit de diagnóstico que comprende los componentes requeridos para la determinación de la identidad de una o más variaciones (incluyendo sustituciones, inserciones o supresiones con respecto al tipo silvestre) de un gen GHl del individuo, como es descrito en la presente, en particular una variación de acuerdo con una o más de (n) a (q) , anteriores, y especialmente un kit de diagnóstico que comprende un oligonucleótido para el uso en la amplificación de u segmento de tal gen que comprende un sitio polimórf co; (y) un anticuerpo especifico para una variación como es descrita en la presente de la secuencia hGH de referencia y el anticuerpo que es capaz de distinguir entre la variante y los aminoácidos de tipo silvestre correspondientes en la posición de aminoácido indicada; y (z) un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo de acuerdo con (y) . La presente invención además proporciona una composición que comprende una variante de GH de esta invención en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable para la misma. Además, la invención proporciona: (a) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención; (b) una célula huésped que comprende el vector (a), tal como una célula huésped bacteriana y (c) un proceso para preparar una variante de GH de acuerdo con esta invención, el proceso que comprende: (i) cultivar la célula huésped (b) ; y (ii) recuperar del medio de cultivo la variante de GH de esta manera producida. (d) una proteina o secuencia de aminoácidos que está en el medio de cultivo y codificada o expresada por una secuencia, vector, o célula como es definido en lo anterior. La presente invención ahora será ilustrada con referencia a los siguientes Ejemplos. Ejemplo 1A — Selección de Pacientes-Estudio en Gran Bretaña Fuentes de Pacientes Niños con estatura pequeña se han identificado a través de la referencia al Regional Paediatric Growth, Endocrine and Diabetes Service én la University ,of ales College of Medicine in Cardiff y mediante la colaboración con otros centros de Gran Bretaña (esto es, Newport, Birmingham, Bristol, Wrexham, Liverpool, Stoke-on-Trent, Portsmouth y Southampton) . Una historia clínica completa se ha tomado incluyendo la historia de la familia, genealogía; documentación de parámetros de crecimiento e investigaciones endocrinas previamente realizadas. La auxologia precisa se registró cada vez que es posible para el caso de Índice, los padres y los hermanos. Muestras de sangre para el análisis genético molecular se tomaron del caso de Índice y de los parientes cercanos apropiados. Familias adicionales fueron asignadas por el profesor John A. Phillips III (Nashville, TN, EUA) , Dr Mohamad Maghnie (Pavia, Italia) y Dr. Tamas Niederland (Gyor, Hungría) . Hasta la fecha, se han colectado muestras de 83 familias deficientes de GH. Los resultados que relacionan a los primeros 70 pacientes son dados en la especificación de patente copendiente de los inventores No. PCT/GB01/2126. Criterios usados Los criterios usados para la selección de pacientes fueron: (i) Crecimiento por debajo del limite inferior del por ciento de rango de altura objetivo, definido como un patrón de crecimiento [delineado por una serie de mediciones de altura; Brook CDG (Ed) Clinical Paediatric Endocrinology 3a Ed, Capitulo 9, pl41 (1995, Black ell Science)] que, cuando es graficado en un diagrama de altura estándar [Tanner y colaboradores, Arch Dis Child 45 755-762 (1970)], predice una altura de adulto para el individuo que está fuera del rango de altura de adulto objetivo estimado del individuo, <;1 estimado que está basado en las alturas de los padres del individuo; (ii) Velocidad de altura <25= centil [Tanner JM, Whitehouse RH Atlas of Children' s Gro th (1982, London: Academic Press)]; y Butler y colaboradores, Ann Hum Biol 17 177-198 (1990) son fuentes para la estadística que hacen posible una determinación de este criterio, esto es, que la velocidad de altura del paciente es menor que el 25- centil para la edad del paciente] ; (iii) Retardo de la edad del hueso de por los menos 2, por ejemplo, 3.5-4 años cuando es comparado con la edad cronológica, excepto en niños de 5 o menos años de edad o en aquellos con evidencia clinica de desarrollo de la pubertad [la escala de Tanner-Whitehouse para estimar los años del retardo de la edad del hueso es descrita por Tanner JM, Whitehouse RH, Cameron N y colaboradores, en Assessment of Skeletal Maturity and Prediction of Adult Height (1983, Londres: Academic Press)]. La estimación del retardo de la edad del hueso es un individuo es sometido a un nivel más alto de variación, cuando es llevado a cabo más de una vez, entre más joven es el individuo, asi, por ejemplo, estimaciones múltiples de un niño de edad de 2 puede dar por resultado un retardo de la edad del hueso" que varia por +/-6 meses, pero en la edad de 3 puede variar por +/-4 meses, y asi sucesivamente; (iv) Todas las otras investigaciones normales; y (v) Pruebas de secreción de hormona de crecimiento normales . Los criterios (iv) y (v) pueden ser resumidos como "patología no identificable", diferente a la posibilidad de un defecto axial de GH que podria tener en cuenta la falla de crecimiento observada. Además, el criterio clave para la inclusión en este estudio fue que el médico clínico que estima al niño debe haber tenido suficiente interés con respecto al patrón de crecimiento del niño para garantizar la prueba de secreción de GH. Los niños seleccionados mostraron un fenotipo clínico que dio por resultado interés clínico suficiente para tener la prueba de secreción de GH garantizada, sin considerar el tipo de prueba, los resultados de la prueba, o en realidad si el niño es propuesto para la prueba . En la Tabla 5B: *GH FT: pico: Significa unidades (IU/L) de actividad en una o más pruebas de función de hormona de crecimiento estándares. 'Aleatorio' denota la medición de GH tomada aleatoriamente. ND denota 'prueba no hecha' . El centil de altura es incluido para demostrar que no es un criterio de selección esencial tener una altura sustancialmente por debajo del 502 centil; los inventores han encontrado variaciones en G /GHl que ocurren aún en pacientes que no tienen una altura sustancialmente reducida. Los pacientes en cursivas produjeron muestras que muestran variaciones . Aquellos también en negritas mostraron variaciones novedosas . Tabla 5B: Pacientes estudiados y resultados de los criterios usados Paciente Centil de Centil de Retardo de GH FTr ico No. Altura Velocidad la Edad del (v) • de Hueso Crecimiento (años) (iii) (ü) 71 0.4 <25 1.3 72 <25 73 <25 74 <25 6.8 en 13; 75 «0.4 <25 0.5 en 14 N en 19 76a 0.4 <25 0 en 10.5 18.3 76b <0.4 <25 1 en 8 16.4 77 <0.4 <25 78 <0.4 <25 79 <0.4 <25 80 <0.4 <25 81 <0.4 <25 82 <0.4 <25 <0.4 <25 Aleatorio 83 normal 84 <0.4 <25 85 <0.4 <25 86 <0.4 <25 Ejemplo 1B-Selección de Pacientes - Estudio en Andalucia Un grupo de pacientes diferentes fue establecido en Andalucia, España. Cincuenta pacientes se seleccionaron en la base de su clasificación como FSS, es decir que muestran estatura pequeña familiar, como es definido por Ranke en Hormone Research _45 (Suppl 2) 64-66 (1996). Tales pacientes tienen por lo menos un miembro de la familia genética que exhibe estatura pequeña. Paciente B53, altura: -2.0 SD altura de la madre 149.5 cm(-2.15 SD) altura del padre: 163.3 (-1.71 SD) prueba de GH pico: 18.1 ng/ml (clonidina) IGF-I: 94 ng/ml IGFBP-3:2.03 mg/L BD: 10/6/91 Paciente B49, altura: -2.7 SD altura de la madre 138.9 c'm(-3.88 SD) altura del padre: 165.4 (-1.40 SD) prueba de GH pico: 10.4 ng/ml (propanolol) IGF-I: 94 ng/ml IGFBP-3:2.97 mg/L BD: 13/12/92 Paciente B4, Altura: -2.1 SD altura de la madre 163.4 cm(-1.7 SD) altura del padre: 148.7 cm(-2.3 SE) IGF-I: 99 ng/ml IGFBP-3:2.1 mg/L Ejemplo 2 - Amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de un fragmento especifico de GH1 La amplificación por PCR de un fragmento especifico de GH1 de 3.2 kb se ha realizado sobre los pacientes seleccionados según el Ejemplo 1 y los controles. El DNA genómico se extrajo de linfocitos del paciente por procedimientos estándares . Los cebadores de oligonucleótido GH1F ( 5' GGGAGCCCCAGCAATGC 3'; -615 a -599) y GH1R ( 5' TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3'/ +2598 a +2616) se diseñaron para corresponder a las secuencias especificas de GH1 para amplificar por PCR un fragmento de DNA genómico individual de 3.2 kb que contiene el gen GHl humano usando el sistema de alta fidelidad de ExpandMR (Roche) .

Dos tubos de PCR de 0.65 mi de pared delgada, separados se usaron para cada reacción. El primer tubo contuvo 500 nanogramos (ng) de cada cebador (GH1F y GH1R) , 200 uM de dATP, dTTP, dCTP y dGTP y 200 ng de DNA genómico del paciente completado a un volumen final de 25 µ? con agua estéril. El segundo tubo contuvo 5 µ? de solución reguladora de reacción lOx completada a un volumen final de 24.25 µ? coi agua estéril. Ambos tubos se colocaron sobre hielo durante 5 minutos. Después de este tiempo, 0.75 µ? de mezcla de polimerasa Ex andí se adicionó al segundo tubo, los contenidos se mezclaron y se transfirieron al primer tubo. El tubo se centrifugó durante 30 segundos y la mezcla de reacción se cubrió con 30 µ? de aceite mineral claro (Sigma) . La mezcla de reacción luego se colocó en un ciclador térmic programable de PCR con 480 o 9700 (Perkin Elmer) ajustado a 95°C. La mezcla de reacción luego se amplificó bajo las siguientes condiciones: 95°C durante 2 minutos seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos. Para los últimos 20 ciclos, la etapa de alargamiento a 68 °C se incrementó por 5 segundos por ciclo. Esto fue seguido por una incubación adicional a 68 "C durante 7 minutos y la reacción luego se enfrió a 4°C antes del análisis adicional. Para cada conjunto de reacciones, un blanco (control negativo) también se ajustó. La reacción del blanco contuvo todos los reactivos aparte del DNA genómico y se usó para asegurar que ninguno de los reactivos fueran contaminados . Un décimo de volumen (5 µ?) se analizó en un gel de agarosa al 1.5% para estimar si la amplificación de PCR ha sido exitosa antes de que se realizara la PCR empalmada. Aquellas muestras que se han amplificado por PCR exitosamente luego se diluyeron 1 en 100 antes del uso para la PCR empalmada . Ejemplo 3 - PCR empalmada La PCR empalmada se realizó en los fragmentos producidos en el Ejemplo 2 para generar, en cada caso, siete sub-fragmentos sobrepuestos que conjuntamente se extienden en el gen de GH1 completo. Además, la Región del Control del Sitio ha sido amplificado por PCR (ver el Ejemplo 5) en todos los tres pacientes. Los siete sub- fragmentos sobrepuestos del producto de PCR de 3.2 kb inicial fueron amplificados por PCR usando la polimerasa de DNA Taq Gold (Perkin-Elmer) . Los oligonucleótidos usados para estas reacciones son listados en la Tabla 6 junto con sus localizaciones de secuencia como es determinado de la secuencia de referencia del gen GH1. Una alícuota de 1 µ? del producto de PCR largo diluido (3.2 kb) se colocó en un tubo de PCR de 0.2 mi de pared delgada o en una cavidad de una placa microtitulo de 96 cavidades . A esto se adicionó 5 µ? de solución reguladora de reacción lOx, 500ng del par de cebadores apropiados (por ejemplo, GH1DF y GH1DR) , dATP, dTTP, dCTP y dGTP a una concentración final de 200 uM, agua estéril a un volumen de 49.8 µ?, seguido por 0.2 µ? de polimerasa Taq Gold. El tubo o placa de microtitulo luego se colocó en un ciclador térmico Primus 96 (MWG B otech) y se cicló como sigue: 12 min a 95°C seguido por 32 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 58°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos. Este fue seguido por una incubación adicional a 72 °C durante 10 minutos y la reacción luego se enfrió a 4°C antes del análisis adicional. Un décimo de volumen (5 µ?) de la mezcla de reacción se analizó sobre un gel de agarosa al 0.8% para determinar que la reacción se ha desempeñado antes de que se realizara la cromatografía líquida de alta presión de desnaturalización (DHPLC) sobre un sistema de análisis de fragmento de DNA WAVE" (Transgenomic Inc. Crewe, Cheshire, Uk) . Para aumentar la formación del heterodúplex, el producto de PCR se desnaturalizó a 95 °C durante 5 minutos, seguido por el re-templado gradual a 50°C durante 45 minutos. Los productos se cargaron sobre una columna de DNAsep (Transgenomic Inc.) y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo lineal (BDH Merck) de 2%/min en una solución reguladora de acetato de trietilamina 0.1M (TEAA pH 7.0), a un gasto de flujo constante de 0.9 ml/minuto. Los puntos de inicio y finales del gradiente se ajustaron de acuerdo con el tamaño del producto de PCR. El análisis tomó 6.5-8.5 minutos por muestra amplificada, incluyendo el tiempo requerido para la regeneración y el equilibrio de la columna. Las muestras se analizaron a las temperaturas de fusión (TM) determinadas usando el software DHPLCMelt (http: //insertion. stanford.edu/melt.html) y listadas en la Tabla 6. Los fragmentos de DNA eluidos fueron detectados por un detector de UV-C (Transgenomic Inc.). Tabla 6: Cebadores de oligonucleótido usados para el análisis de DHPLC i la secuenciación de DNA Fragmento Cebador Secuencia (5' a 3') Posición Temperatura de fusión de DHPLC 1 GH1DF CTCCGCGTTCAGGTTGGC -309 a -292 60°C GF1DR CTTGGGATCCTTGAGCTGG -8 a +11 2 GH2DF GGGCAACAGTGGGAGAGAAG -59 a -40 63°C GH2DR CCTCCAGGGACCAGGAGC +222 a +239 3 GH3DF CATGTAAGCCCAGTATTTGGCC +189 a +210 62°C GH3DR CTGAGCTCCTTAGTCTCCTCCTCT +563 a +586 4 GH4DF GACTTTCCCCCGCTGGGAAA +541 a +560 62°C GH DR GGAGAAGGCATCCACTCACGG +821 a +841 5 GH5DF TCAGAGTCTATTCCGACACCC +772 a +792 62°C GH5DR GTGTTTCTCTAACACAGCTCTC +1127 a +1148 6 GH6DF TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA +1099 a 62°C +1122 GH6DR CGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCAT +1410 a + CG 1435 7 GH7DF TTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTC +1369 a 57°C y G +1393 62°C GH7DR CTTGGTTCCCGAATAGACCCCG +1731 a +1752 Con respecto a las muestras obtenidas de los pacientes seleccionados de acuerdo con el Ejemplo 1A anterior, los siguientes procedimientos (Ejemplos 4 & 5) se llevaron a cabo: Ejemplo 4 — Secuenciación de DNA de los fragmentos de PCR largos específicos de GH1 Clones que contienen el fragmento de PCR largo especifico de GH1 se secuenciaron con el kit de secuenciación BigDye (RTM) (Perkin Elmer) en ya sea tubos de 0.2 mi o placas de microtitulo de 96 cavidades en un ciclador térmico de PCR Primus 96 (MWG) o 9700 (Perkin Elmer) los cebadores de oligonucleótido usados para la secuenciación fueron: GH1S1 ( 5' TGGTCAGTGTTGGAACTGC 3': -556 A -537); GH3DF (5'CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC* 3' : +189 A +210); GH4DF ( 5 ' GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG 3' : +541 A +560); y GH6DF (5'TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA 3' : +1099 A +1122). 1 µg de DNA clonado se secuenció con 3.2 pmol del cebador apropiado y 4 µ? de la mezcla de secuenciación BigDye en un volumen final de 20 µ?. El tubo o placa de microtitulo luego se colocó en el ciclador térmico y se cicló como sigue: 2 minutos 96°C seguido por 30 ciclos de 96°C durante 30 segundos, 50°C durante 15 segundos 60°C durante 4 minutos. La reacción luego se enfrió a 4°C antes de la purificación. La purificación se realizó al adicionar 80 µ? de isopropanol al 75% a la reacción de secuenciación completada. Esto luego se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción luego se centrifugó a 14,000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante luego se retiró y se adicionaron 250 µ? de isopropanol al 75% al precipitado. La muestra se mezcló y se centrifugó durante 5 minutos a 14,000 rpm a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y la pelotilla se secó a 75°C durante 2 minutos. Las muestras luego se analizaron sobre un secuenciador de DNA ABI Prism 377 o 3100. Ejemplo 5 — Mutaciones del gen GH1 y Polimorfismos (a) Ejemplo 1A Pacientes (Gran Bretaña) Dos nuevas mutaciones se han encontrado en el grupo de pacientes de los inventores en la región del promotor de gen GH1: una sustitución de par de base individual y un indel . (i) La sustitución -60 G ? A se encontró en 2/25 alelos mutantes en la muestra de pacientes de los inventores (en forma heterocigota en pacientes 57 y 75) . Esta mutación ocurrió dentro de u;x estiramiento de cinco Gs en el elemento de respuesta de vitamina D (Alonso y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 247: 882-887 (1998)) en una base que es conservada en todos los mamiferos. Esto es consistente con la importancia funcional de este nucleótido. Esta variación está siempre asociada con el haplotipo de promotor 19, que es ur. bajo expresor. (ii) El indel -40 a -39 GG ? C en el paciente 76A podria haber sido modelado mediante la conversión del gen (la secuencia de donador del primero que es GH2, CSH2 o CSHP1 y el segundo, CSH1 o CSH2) . Tabl 2 Nuevas mutaciones del gen GHl encontradas en los pacientes con deficiencia de 6H Paciente Mutación Confirmada Con irmada Estudios (clonación) (PCR/ de la secuenciación) familia 57 -60 G - A Si Si Maternal 75 -60 G —> A Si Si TBC 76A -217 A ? G Si No No en -40 a -39 padres GG - CT ¿De novo? Ejemplo IB Pacientes (Barcelona) Tres mutaciones de importancia patológica potencial se encontraron en el análisis de secuencia de los 50 pacientes de estatura pequeña familiar de Barcelona: -360 A-»G (Paciente B4), GTC-ATC en +1029 (Val 110?Ile) (Paciente B53; esta variación también es descrita en la especificación de patente copendiente no. PCT/GB01/2126) y ATC-ATG en +1491 (Ilel79--Met) (Paciente 49). Puesto que cuatro alelos Helio se observaron en la muestra de control (una frecuencia de 0.025), esta variante ocurre a frecuencias polimórficas en la población general. La modelación molecular sugirió que esta sustitución podria ejercer un efecto nocivo sobre la estructura de GH el residuo ValllO evolucionariamente conservado forma parte del núcleo hidrofóbico en el extremo N-terminal de la hélice 3, y su reemplazo por lie con su cadena lateral más larga seria esperado que ocasione impedimento estérico. Consistente con esta prevención, la variante IlellO está asociada con una habilidad notablemente reducida (40% de lo normal) para activar la ruta de transducción de señal JAK/STAT. La sustitución Valll0-»Ile aparece por lo tanto para representar un polimorfismo funcional que está asociado con una reducción en la actividad de GH y que es potencialmente capaz de influir en la estatura. Esta variación está asociada con el haplotipo de promotor 2, que tiene actividad completamente normal . Con respecto a la variación Ilel79Met: Ilel79 está posicionado en la superficie de la proteina hGH centralmente en la hélice 4. En el complejo hGHbp/hGH 2:1, Ilel79 interactúa directamente con los residuos de 'punto factible' del sitio 1, TRP104 y TRP169. Por lo tanto es probable que una sustitución de Ilel79 con un residuo de metionina interferiría con una restricción estérica precisa en el sitio 1, resultando un cambio significante en el funcionamiento de la hGH. (c) Estudios de la variación de la secuencia de codificación GH1 en los controles Un total de 80 controles Británicos sanos de origen Caucásico también se clasificaron para las variantes, usando el método de los Ejemplos 2 y 3, dentro de la región de codificación del gen GH1. Cinco ejemplos de sustituciones silenciosas encontradas en individuos únicos se observaron [GAC-??? en Asp26, TCG-TCC en Ser85, TCG—TCA en Ser85, ACG-ACA en Thrl23 y AAC-AAT en Asnl09] . La variante polimórfica Thrl23 se ha reportado previamente (Counts y colaboradores, Endocr Genet 2 55-60 (2001)).

Además, tres sustituciones de mal sentido se observaron [ACC-ATC, Thr27?Ile; AAC—GAC, Asn47-Asp; GTC—ATC, ValllO-Ile, 1, 1 y 4 alelos respectivamente/160 alelos]; solamente la sustitución ValllO—lie se ha encontrado en el estudio de pacientes descrito en la especificación de patente copendiente de los inventores no. PCT/GB01/2126 (paciente 66) . La modelación molecular sugirió que esta sustitución podría ejercer un efecto nocivo sobre la estructura de GH; ValllO forma parte del núcleo hidrofóbico en el extremo N-terminal de la hélice 3 y su reemplazo por lie con su cadena lateral más larga ocasionarla impedimento estérico. Así, puede ser que mientras la sustitución ValllO—lie en las poblaciones tanto de control como de pacientes, no obstante es capaz de influenciar la estatura. Otros comentarios se aplican como en el Ejemplo 5(b) anterior. Esto a pesar de que la insuficiencia relativa de las mutaciones de mal sentido en la población de control se argumenta en favor del significado patológico de las lesiones encontradas en el grupo de pacientes . (d) Resultados Adicionales Además de las asociaciones de haplotipo de promotor mencionadas con respecto a ValllOIle y -60G-*A anterior, se ha encontrado que el -24Thr—Ala (ver la Tabla 4, anterior) está siempre asociado con el haplotipo de promotor 21, que es un bajo expresor; y -48G-A (descrito en la especificación de patente copendiente de los xnvéntores no. PCT/GB01/2126) está siempre asociado con el haplotipo de promotor 2, que es un expresor normal. Ejemplo 6 - Estudios adicionales, que incluyen la identificación de la Variación Argl6Cys Expresión y ensayo in vitro de la actividad biológica de las variantes de 6H Un cDNA de GH1 de tipo silvestre clonado fue amplificado por PCR usando los cebadores GHCDNA5 ( 5' AAGCTTGCAATGGCTACAGGCTCCC 3'; -3 a +16) y GHCDNA3 (5' ACCGGTCTAGAAGCCACAGCTCCC 3'; +636 a +654), donde los sitios de restricción no modelados para HíndIII y Agrel son subrayados. Este fragmento de PCR se dirigió con HíndIII y Agel, clonado en el vector de expresión de insecto pIZ/V5-His (Invitrogen) y se verificó la secuencia. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó en el cDNA de GH1 de tipo silvestre usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El vector luego se transfectó usando Cellfectin en células de insecto High Five (Invitrogen) cultivadas en el medio SFM Express Five (Invitrogen) . Las células establemente transfectadas se seleccionaron en la base de su resistencia a zeocina. El medio se cosechó cuando las células han crecido a 80% de confluencia durante dos periodos de 7 dias sucesivos . La GH humana en los sobrenadantes de cultivo se cuantificó por IRMA. (Nichols Institute Diagnostics) . Con la excepción de la variante Argl6Cys (que no mostró reactividad cruzada en el IRMA) , la reactividad cruzada de las variantes de GH y la GH de tipo silvestre expresada en la célula de insecto en al IRMA se confirmó que es igual a aquel de la preparación de referencia del ensayo (calibrada contra la preparación de referencia del National Institutes of Health NIAMDD-hGH-RP-1 ) por análisis dilucional. La variante Argl6Cys se cuantificó mediante el manchado de Western, al comparar la intensidad de la banda de variante con aquellas producidas por las cantidades conocidas de GH de tipo silvestre. 10 µ? de medio de cultivo de células de insecto que expresan la variante Argl6Cys se corrieron en un gel de poliacrilamida al 12% junto con cantidades variantes de GH de tipo silvestre (7-53 ng) . El gel se electromanchó sobre la membrana de PVDF como es descrito (Le is y colaboradores, 2002), se sondeó con un anticuerpo de GH antihumano (Lab Vision), se diluyó 1:500 y se visualizó mediante la quimioluminiscencia aumentada (ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech) . Las películas se analizaron mediante la densitometria de formación de imagen y una curva estánda se construyó para la GH de tipo silvestre. Esta curva luego se usó para la cuantificación de la variante Argl6Cys (promedio de 6 mediciones separadas) . La cuantificación con IRMA se confirmó mediante el manchado de Western. Cantidades iguales de GH variante y GH tipo silvestre se cargaron y la intensidad y el peso molecular (22kD) de las bandas de la variante y de tipo silvestre se encontraron que son indistinguibles en todos los casos . Las células HK293, transfectadas con el receptor de GH humano de longitud completa (GHR) y seleccionadas sobre la base de la expresión de GHR elevada (células HK293HÍ) , se usaron para analizar la actividad biológica de las variantes de GH (Ross y colaboradores, Mol Endocrinol 11 265-73 (1997), von Laue y colaboradores, J Endocrinol 165 301-11 (2000) ) . Las células se colocaron en placas de 24 cavidades (100,000 células por cavidad) durante 24 horas en DMEM.F-12 (1:1) que contiene FCS al 10%. Las células se co-transfectaron durante la noche usando un reactivo de transfección basado en lipido (FuGENE 6, Roche Molecular Biochemicals) , con una construcción de gen reportador de luciferasa sensible a STAT5 (Ross y colaboradores, ibid) y un vector de expresión de ß-galactosidasa constitutivamente expresado (pCHUO; Amersham Pharmacia Biotech) para corregir la eficiencia de transfección. Las células luego se incubaron con la GH variante y la GH de tipo silvestre diluidas a un rango estándar conocido de concentraciones (0.1-lOmM) en DMEM.F-12 libre de suero (1:1) que contiene dexametasona 2.5xl0~7M durante 6 horas para permitir la dimerización de GHR, la activación de STAT5 y la expresión de luciferasa. Después de la incubación, las células se lisaron y la luciferasa se midió en un luminómetro de microplaca (Applied Biosystems) usando el sistema de ensayo de luciferasa Promega. La expresión de luciferasa asi proporcionó una medición del grado de activación de GHR y por consiguiente la actividad biológica de la variante de GH. Los experimentos se llevaron a cabo por cuadruplicado y se repitieron por lo menos 3 veces . El análisis estadístico de los datos del ensayo de luciferasa se llevó a cabo mediante el análisis de variación (ANOVA) con comparaciones subsecuentes usando la prueba de comparación múltiple de Student-Newman-Keuls . Estudios de secreción de GH en células mamlferas La linea de células de pituitaria de rata (GC) se transfectO con un plásmido pGEM-T que contiene un fragmento de 3.2 kb que se extiende sobre el gen de GH1 de tipo silvestre completo (bajo el control del haplotipo de promotor 1) y construcciones equivalentes para las variantes de mal sentido bajo el control de sus haplotipos asociados. Las células se colocaron en placas de 24 cavidades (200,000 células por cavidad) y se cultivaron durante la noche en D EM que contiene suero de caballo al 15% y FCS al 2.5% (medio completo) . Las células se co-transfectaron con 500 ng de plásmido GH1 y el vector de expresión de ß-galactosidasa (pCHUO; Amersham Pharmacia Biotech) usando el reactivo de transfección basado en lipido Tfx-20 (Promega) . La transfección se llevó a cabo en 200 µ? de medio libre de suero que contiene 1 µ? de Tf?-20/cavidad durante 1 hr, después de lo cual se adicionó 0.5 mi de medio completo a cada cavidad. Las células se cultivaron durante 48 hrs, el medio se cosechó y las células se lisaron para el ensayo de ß-galactosidasa para corregir las diferencias en la. eficiencia de transfección. Con la excepción de Argl6Cys, GH en el medio se cuantificó para todas las variantes usando una IRMA, de GH humana (Nichols Institute Diagnostics) que no mostró reactividad cruzada con la GH de rata. Debido a la falta de reactividad cruzada de la variante Argl6Cys en el IRMA GH, esta variante se cuantificó usando una ELISA de GH humana (DRG Diagnostics) . La variante Argl6Cys completamente reaccionó cruzadamente en este ensayo, diluyéndose en paralelo con la curva estándar, mediante que la GH de rata no mostró reactividad cruzada. Los resultados para la variante Argl6Cys se compararon con la GH de tipo silvestre cuantificado usando el kit ELISA en el mismo experimento. Los experimentos se realizaron y los datos se analizaron como es descrito para el ensayo de actividad biológica. Caracterización funcional de las variantes de mal sentido Las mutaciones de mal sentido en la proteina madura se modelaron mediante el reemplazo simple del residuo de aminoácido apropiado en la estructura cristalográfica de rayos X de la GH humana. La mayoría de las mutaciones de mal sentido se encontraron que son compatibles con un modelo de deformación estructural de la molécula GH (concomítantemente deteriorando el plegamiento de la proteína y por consiguiente reduciendo la bioactividad) , antes que con un modelo de una proteína disfuncional pero normalmente plegada. Sin embargo, tres de las mutaciones de mal sentido (Argl6Cys, Lys41Arg, Thrl75Ala) se localizaron en regiones de la molécula de GH conocidas que interactúan con el GHR (De Vos y colaboradores, Science 255 306-12 (1992)). En realidad, dos de los aminoácidos implicados (Lys41 y Thrl75) están entre los 8 residuos claves previamente identificados que son necesarios para la afinidad de enlace estrecha entre el sitio 1 de la GH y el GHR (Cunningham y Wells 234 554-63 (1993); Clackson y Wells Sciende 267 383-6 (1995); Wells Proc Nati Acad Sci Usa 93 1996) ) . Trece de las variantes de mal sentido de GH se expresaron en células de insecto, la excepción que es Leu-llPro que no se secretó en el medio de cultivo. Un sistema de ensayo de gen reportador de luciferasa luego se usó para analizar su actividad de transducción de señal. Para GH que es biológicamente activa, esta debe enlazar a dos moléculas de GHR para activar de esta manera la dimerización del receptor. Esto luego activa la tirosina quinasa intracelular JAK-2 que, a su vez, activa el factor de transcripción STAT5 por fosforilación. STAT5 fosforilado dimeriza, translocaliza al núcleo y enlaza a los promotores responsivos de STAT5 para cambiar la expresión de los genes responsivos de GH. El ensayo de la actividad biológica de GH usado aquí requiere todas las etapas de esta ruta para s r funcional. Seis variantes (Thr27Ile, Lys41Arg, Asn47As , Ser71Phe, Serl08Arg y Thrl75Ala) se encontraron que estái. asociadas con una habilidad significativamente reducida para activar la ruta de transducción de señal JA /STAT mientras que las siete restantes (Thr-24Ala, AspllAsn, Argl6Cys, Glu74Lys, Gln91Leu, Serl08Cys y VallOIle) mostraron actividad funcional normal o casi normal (Figura 6) . En principio, estas últimas variantes podrían haber ejercido sus efectos nocivos sobre una ruta de transducción de señal diferente a JAK/STAT o sus efectos nocivos pueden no haber sido manifestados en un sistema estático in vitro. Alternativamente, estas variantes podrían haber comprometido el empalme de mRNA de GUI, plegamiento de GH, secreción o estabilidad, o pueden haber ejercido sus efectos adversos en el eje de GH de otra manera. Finalmente, ellos podrían simplemente haber sido variantes neutras raras sin efecto fenotípico. Para explorar adicionalmente estas posibilidades, los estudios de secreción de las variantes de mal sentido de . GH se realizaron en células GC pituitaria de rata. El gen GH1 de tipo silvestre, bajo el control del haplotipo de promotor 1 de GH1, se transfectó en las células GC y se mostró que es responsable para la secreción de la GH humana (como es medido por IRMA, usando un anticuerpo especifico de GH humana) a una concentración de 64 pM durante un periodo de 48 hr. Cada variante de GH se analizó bajo el control de su haplotipo de promotor asociado con el nivel de secreción de GH medido que es expresado como un porcentaje del tipo silvestre (Figura 7) . Puesto que la secreción reducida con respecto al tipo silvestre puede ser ya sea completa o parcialmente atribuible a la expresión reducida que resulta de la posesión de un haplotipo de promotor de baja expresión, antes que al efecto directo de la mutación de mal sentido, los niveles empíricamente deseados de expresión para cada haplotipo de promotor próximo asociados fueron comparados directamente (Figura 7) . Aunque la cantidad de GH secretada por la variante Ala-24 fue ~63% que la del Thr-24 de tipo silvestre, el haplotipo de promotor 21 asociado muestra solamente 58% de la actividad de promotor asociada con el haplotipo de promotor 1 de tipo silvestre. Por lo tanto puede ser deducido que la mutación Thr-24A tiene poco o nada de efecto en la secreción de GH y que la secreción reducida manifestada por el alelo que lleva Ala-24 es atribuible solamente a la presencia in cis de un haplotipo de promotor de baja expresión. Aunque la actividad del promotor reducida es probablemente también suficiente para tener en cuenta la secreción reducida de las variantes AspllAsn y Asn47Asp, el bajo nivel de secreción de las variantes Lys41Arg y Ser71Phe funcionalmente deterioradas probablemente no es explicable solamente en términos del haplotipo de promotor de baja expresión asociado. En contraste, una construcción de GH1 que contiene la mutación Leu-llPro secretó GH no medible a pesar de estar asociado con un promotor que expresa normalmente (haplotipo 2) . De manera similar, la secreción reducida manifestada por las variantes Argl6Cys, Glu74Lys, Gln81Leu, Serl08Cys y ValllOIle no podria ser atribuida a un haplotipo de promotor de baja expresión y por lo tanto es probable que se una consecuencia de las mutaciones de mal sentido introducidas. Junto con la mutación de péptido guia Leu-llPro, estas cinco variantes por lo tanto comprenden un grupo distinto en que comprometen la secreción de GH antes que la actividad funcional. La secreción de las variantes Thr27lle y Thrl75Ala fue comparable a la del tipo silvestre mientras que aquella de la Serl08Arg se elevó. Un solo ejemplo de una sustitución ValllOIle novedosa se encontró entre los individuos con estatura pequeña seleccionados de acuerdo con los criterios mencionados en lo anterior. Sin embargo, puesto que cuatro alelos IlellO también se observaron en el grupo de control (correspondiente a una frecuencia de alelo de 0.013), esta variante se puede considerar como un polimorfismo en la población general. La modulación molecular sugirió que esta sustitución podria ejercer un efecto nocivo en la estructura de la GH. En realidad, el residuo ValllO evolucionariamente conservado forma parte del núcleo hidrofóbico en el extremo N-terminal de la hélice 3, y su reemplazo por lie con su cadena lateral más larga seria esperada que ocasione impedimento estérico. Consistente con esta predicción, una sustitución ValllOPhe se ha reportado como una causa de IGHD de tipo II dominante autosomal (Binder y colaboradores, J Clin Endocrin Metab £6 3877-81 (2001)). Puesto que la variante IlellO reportada aqui mostró secreción significativamente reducida, esto se puede considerar como un polimorfismo funcional. La adopción de los criterios mencionados anteriormente para la selección clínica se presentan que han sido instrumentales en permitirnos detectar las lesiones del gen GH1 novedosas en las probandas probadas. En realidad, las mutaciones funcionalmente significantes se encontraron que ocurren significativamente de manera más frecuente entre los individuos seleccionados (6/41) que entre los individuos no seleccionados [7/154; relación de desigualdad: 3.6, 95% de intervalo de confidencia (CI) : 1.0-12.9]. Si el polimorfismo funcional ValllOIle fuera excluido de esta comparación, la relación de desigualdad seria 7.0 (95% CI: 1.4-39.0). La prevalencia de las lesiones · del gen GHl funcionalmente significantes en el grupo fue, sin embargo, significativamente menor que en el grupo de pacientes de IGHD sin las supresiones de gen GHl grandes (6/11; relación de desigualdad: 25.2; 95% CI: 5-1-132.2). El uso exitoso de los criterios mencionado anteriormente para enriquecer las mutaciones de gen GHl novedosas demuestra que la identificación de los portadores de las lesiones del gen GHl pueden ser obtenidas con referencia a los parámetros auxológicos y la edad del hueso, sin considerar los resultados de las pruebas de secreción de GH. Por otra parte, puesto que las probandas encontradas que poseen una lesió de gen GHl no difieren significativamente de las probandas sin portador en términos de cualquier parámetro fenotípico de laboratorio clínico medido, es improbable que muchos portadores podrían ser fácilmente identificados entre las probandas sin recurrir al uso de la secuenciación de DNA como una técnica de clasificación. De las variantes identificadas de acuerdo con este Ejemplo, Leu-llPro, Lys41Arg, Asn47Asp, Ser71Phe, SerlOSArg, Thrl75Ala, Glu74Lys, Gln91Leu, Serl08Cys y ValllOlle son descritas en la especificación de patente copendiente de los inventores no. PCT/GB01/2126. Las variantes Thr27lle, que muestra una. habilidad reducida para activar la ruta de JA /STAT, y Argl6Cys, que reduce la secreción en las células de pituitaria de rata después de la asignación se ha hecho para el nivel de expresión atribuible al haplotipo de promotor próximo de GHl asociado, e Ilel79Met que muestra una habilidad reducida para activar la ruta de transducción de señal de ??.? Quinasa son descritas aqui por primera vez, y, en los primeros dos casos, referidos en las Figuras 6 y 7 como T271 y R16C, respectivamente. Ejemplo 7 - Activación de la ruta de MAP quinasa mediante la variación Ilel79Met Digestión proteolítica de la variante de GH Tripsina, quimotripsina o proteinasa K (todas de Sigma, Poole, UK) se adicionaron a una concentración final de 0.1 µg II?l a 100 µ? de medio de cultivo cosechado de células de insecto que expresan ya sea GH de tipo silvestre o la variante Ilel79Met (60 nM) y luego se incubaron a 37°C durante 1 hr. Estudios previos dependientes de la dosis en la GH de tipo silvestre indicaron que 0.1 pg/ml fue la concentración en la cual se inició la degradación por todas las tres enzimas. Después del periodo de tratamiento de 1 hr, 10 µ? de inhibidor de tripsina-quimi otripsina (500 g/ml) se adicionó para detener las digestiones de tripsina y quimotripsina y 1 µ? de PMSF (0.1 M) se adicionó para detener la digestión de la proteinasa . Cada reacción luego se incubó durante 15 minutos adicionales a 37 °C. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE sobre un gel al 12% usando un aparato mini gel (Bio-Rad Laboratories) . Una cantidad equivalente de GH de tipo silvestre no digerida y variante Ilel79Met que se ha incubado durante 1 hr a 37 °C también se corrió sobre el gel. El gel se electromanchó sobre la membrana de PVDF como es descrito previamente (Lewis y colaboradores, Neuroendocrilogy 2002. 14, 361-367), se sondeó con un anticuerpo de GH anti-humano monoclonal de ratón (Lab Vision, Fremont, Ca, USA), se diluyó 1:500, se detectó usando un conjugado de IgG anti ratón-HRP (1:5000, Amersham Biosciences) y se visualizó mediante la quimioluminiscencia aumentada (ECL Plus, Amersham Biosciences) . Las películas se analizaron usando el sistema de formación de imagen digital Alpha Imager 1200 (Alpa Innotech Corp, San Leandro, Ca, USA) y los resultados se expresaron como la cantidad de GH que queda después de la digestión de la enzima como un porcentaje de GF no digerida. Los experimentos se repitieron 3 veces y se estimaron estadísticamente por una prueba t de dos extremos . Activación de Ja ruta MAP quinasa La habilidad de la variante Ilel79Met para activar la ruta de transducción de señal de MAP quinasa al mismo grado como la GH de tipo silvestre se investigó al estimular preadipocitos 3T3-F442A con GH de tipo silvestre y la variante Ile79Met (20 nM durante 15 mins) . Las células luego se lisaron y se analizaron mediante SDS-PAGE sobre un gel al 10% como es descrito en lo anterior. El gel se manchó sobre la membrana de PVDF y se sondeó usando anticuerpos que detectan las formas activadas ( fosforiladas) de p42/p44 MA.P quinasa (Cell Signaling Technology) y STAT 5 (Upstate Biotechnology) . Las manchas se procesaron, se visualizaron usando ECL Plus (Amersham) y las imágenes se analizaron como es descrito en lo anterior. Caracterización funcional de la variante Ilel79Met La conservación evolucionista del residuo hidrofóbico Ilel79 se examinó mediante la alineación de secuencia múltiple ClustalW de proteínas de GH ortólogas de 19 vertebrados (Kra czak y colaboradores, Gene 1999, 237, 143-151) . Este residuo es una valina hidrofóbica en todos los vertebrados excepto la tortuga, indicando que la sustitución por lie e.i la raza humana es conservativa. La comparación con los genes parálogos de la agrupación de GH humana reveló que el residuo análogo a Ilel79 es Met en CSH1, CSH2 y el pseudogen CSH (CSHP1) . Esto es consistente con la sustitución Ilel79Met conservativa que se ha modelado mediante la conversión del gen. La sustitución Ilel79Met luego se modeló mediante el reemplazo del residuo en la estructura cristalográfica de rayos X de la GH humana. Ilel79 se encuentra en la hélice 4 donde es parcialmente expuesto, permitiendo las interacciones idrofóbicas con la cadena lateral del residuo Trpl69 de GHR de "punto factible". Las interacciones adicionales con el GHR ocurren entre la cadena lateral y los átomos de la cadena principal de Ilel79 y los átomos de la cadena principal de los residuos de GHR Lysl67 y Glyl68. El reemplazo de la cadena lateral de Ilel79 con la cadena lateral de metionina indica que estas interacciones hidrofóbicas pueden ser conservadas en la sustitución. La variante Ilel79Met se expresó en células de insecto y un sistema de ensayo de gen reportador de luciferasa (11, 12) se usó para analizar su actividad de transducción de señal. Para la GH que es biológicamente activa, ésta debe enlazar a dos moléculas de GHR para de esta manera activar la dimerización del receptor. La dimerización de GHR activa la tirosina quinasa intracelular JAK2 que a su vez activa el factor de transcripción STAT5 por fosforilación. STAT5 fosforilado se dimeriza, se translocaliza al núcleo y se enlaza a los promotores responsivos de STAT5 para de esta manera cambiar la expresión de los genes responsivos de GH. El ensayo de la actividad biológica de GH usado aqui requiere todas las etapas de esta ruta para ser funcional. La variante Ilel79Met se encontró que muestra habilidad normal (99 ± 4% de tipo silvestre) para activar la señal de transducción de señal JA /STAT. Sin embargo, el estudio anterior diseñado para estimar la habilidad de la variante Ilel79Met para activar la ruta de MAP quinasa indicó' un nivel considerablemente reducido de activación en respuesta a la variante (5.7 veces el nivel basal de activación) como es comparado con el tipo silvestre (14.5 veces el nivel basal de activación). Esto contrastó con su habilidad para activar STAT5 al mismo nivel como la GH de tipo silvestre [20.5 veces para el tipo silvestre (Ilel79) contra 22.5 veces para la variante Metl79] . Los datos de STAT5 confirmaron el resultado del bioensayo de luciferasa responsivo de STAT5 que muestra el mismo nivel de actividad entre la GH de tipo silvestre y la variante Ilel79Met. Para explorar estas posibilidades adicionalmente, la secreción de la variante Ilel79Met se estudió en las células GC de pituitaria de rata. El gen GHl de tipo silvestre, bajo el control del haplotipo de promotor 1 de GHl se transfectó en las células GC y se mostró que es responsable para la secreción de la GH humana (como es medido por RIA usando un anticuerpo especifico de Gi?2 humana) a una concentración de 64 pM durante un periodo de 48 hr. La variante Ile79Met (también bajo el control del haplotipo de promotor 1 de GHl con el cual es asociado in cis en el paciente B49) luego se analizó, y el nivel secreción de GH medido se expresó como un porcentaje del tipo silvestre. Puesto que la secreción se encontró que es 97 ± 4% del valor del tipo silvestre, se puede deducir que esta mutación es probable que tenga poco o nada de efecto sobre la secreción de GH. Finalmente, la variante Ilel79Met también se estimuló con tripsina, quimotripsina y proteinasa K para determinar si fue más susceptible a la segmentación proteolitica que la GH de tipo silvestre. Sin embargo, -.a variante 179Met se probó similarmente resistente a 1¿J segmentación proteolitica como la GH de tipo silvestre, indicando que no hubo diferencias significantes en el plegamiento de la proteina entre las dos formas de GH. En esta estimación inicial los inventores examinaron la habilidad de la variante Ilel79Met para activar la ruta de transducción de señal JAK/STAT y encontraron que es indistinguible de la del tipo silvestre. La secreción y la estabilidad de esta variante también se presentaron que son normales . Los inventores luego examinaron la habilidad de la variante para activar la ruta de transducción de señal de ??.? quinasa y encontraron que es significativamente disminuida. Los inventores creen por lo tanto que esta variante es disfuncional en que manifiesta habilidad reducida para activar la ruta de transducción de señal de ??? quinasa. Por consiguiente, ésta representa otra variante importante del gen de Hormona de Crecimiento que es probable que muestre reactividad inmunológica normal pero no actividad biológica.

Claims

REIVXNDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado o recom inante, caracterizado porque comprende una variante de la secuencia de ácido nucleico de hormona de crecimiento humana, G 1, la variante que comprende una variación seleccionada del grupo que consiste de: (i) +480 C ? T; (ii) +446 C ? T; (üi) +1491 C ? G; . (iv) -60 G ? A; (v) -40 a -39 GG - CT; (vi) -360 A ? G; y (vii) +748 A - G (donde las cifras se refieren al número de posición de nucleótido de GH1 humana de tipo silvestre de referencia, contando desde el sitio de inicio de transcripción TSS); o (b) un oligonucleótido especifico para cualquiera de las secuencias (a) anteriores y que comprende una variación seleccionada de (i) a (vii) .
2. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia (a) es seleccionada de: (a) (i) +480 C -+ T; y (ii) +446 C -» T.
3. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque es una secuencia de cDNA.
4. Un aminoácido codificado por una variante de GH1 , caracterizado porque la variante de GH1 es una de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una variante de GH humana, definida con referencia a la hGH (Figura 5, SEQ ID NO: 2), caracterizada porque es seleccionada de: (i) Thr27Ile; (iij Argl6Cys; (iii) Ilel79Met (iv) Thr27Ile; y (v) Asn47Asp.
6. Una variante de conformidad con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizada porque comprende Thr27Ile
7. Una variante de conformidad con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizada porque comprende Argl6Cys.
8. Una variante de conformidad con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizada porque comprende Ilel79Met.
9. Un método de clasificación in vitro para clasificar a un paciente que se sospecha de tener GH disfuncional, el método de clasificación comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos del gen GHl humano o una secuencia de polipéptido codificada de esta manera, del paciente; y (b) comparar una región de la secuencia obtenida de la muestra de prueba con la región correspondiente de una. secuencia predeterminada caracterizado en que la secuencia predeterminada es seleccionada de una variante de GHl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una variante de hGH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, respectivamente.
10. Un método de clasificación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia predeterminada es un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante, la región que incorpora por lo menos una variación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuando es comparada con la región correspondiente de la secuencia de tipo silvestre.
11. Un método de clasificación de conformidad con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizado porque la muestra de prueba comprende DNA genómico.
12. Un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la etapa de comparación incluye la etapa de secuenciar la región apropiada del gen GHl y/o emplea tecnología de chip de DNA, en donde el chip es un dispositivo analítico paralelo en miniatura que es usado para clasificar simultáneamente ya sea para mutaciones conocidas múltiples o para todas las mutaciones posibles, mediante la hibridación del DNA. de muestra marcado.
13. Un método de clasificación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de comparación comprende la identificación del polipéptido mediante métodos de secuenciación de proteina, que incluyen la espectroscopia de masas, análisis de microarreglo y pirosecuenciación y/o métodos de detección basados en anticuerpo, incluyendo ELISA.
14. Un kit adecuado para el uso en llevar a cabo un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, el kit caracterizado porque comprende : (a) un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región de un gen GHl variante, la región que incorpora por lo menos una variación de la secuencia de tipo silvestre correspondiente seleccionada de las variaciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y (b) un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de tipo silvestre en la región especificada en (a) ; y, opcionalmente, (c) uno o más reactivos adecuados para llevar a cabo la PCR para amplificar regiones deseadas del DNA del paciente.
15. Un kit de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el (los) reactivo (s) comprende uno o má:, de: cebadores de PCR correspondientes a un exón del gen GHl, y/o cebadores definidos anteriormente en la presente, y/u otros reactivos para uso en PCR, incluyendo la polimerasa de DNA Taq.
16. Un método de clasificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 o un kit de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque emplea uno o más 'marcadores suplentes' que son indicativos de o correlacionados con la presencia de una variante de GHl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una variante de GH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.
17. Un método o kit de clasificación de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el 'marcador suplente' es o incluye: (a) cualquier biomolécula (incluyendo, pero no limitados a, nucleótidos, proteínas, incluyendo anticuerpos específicos para la variante de GH o la variante de GHl, azúcares y lipidos) ; (b) un compuesto químico (incluyendo, pero no limitado a, fármacos y metabolitos de los mismos); y/o (c) una característica física, cuya ausencia, presencia o cantidad en un individuo es medible y correlacionada con la presencia de la variante de GH o la variante de GHl.
18. El uso de una variante de GHl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una variante de GH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque se realiza en un método terapéutico, de diagnóstico o de detección.
19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es para la determinación de la susceptibilidad de un individuo a una enfermedad seleccionada de diabetes, obesidad, infección, cánceres o condiciones cardíacas.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es para la determinación de los defectos de enlace de GH y/o los defectos de almacenamiento de la pituitaria en un individuo.
21. El uso de una variante de GHl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es en la terapia génica.
22. El uso de una variante de GHl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una variante de GH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizada porque es para la preparación de una composición terapéutica, composición o kit de diagnóstico, o kit de detección para prevenir, tratar, diagnosticar o detectar condiciones asociadas con, o causadas por la disfunción de GH en un individuo.
23. Un anticuerpo especifico para una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 , caracterizado porque el anticuerpo es capaz de distinguir entre la variante y los aminoácidos de tipo silvestre correspondientes .
24. Una composición, caracterizada porque comprende una variante de GH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable para la misma.
25. Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
26. Una célula huésped, caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 25, incluyendo una célula huésped bacteriana.
27. Un proceso para preparar una variante de GH de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, el proceso caracterizado porque comprende: (i) cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 26; y (ii) recuperar del medio de cultivo la variante de GH producida de esta manera.
28. Una proteina o secuencia de aminoácidos codificada o expresada por una secuencia, vector o célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 25 o 26, caracterizada porque la proteina o secuencia de aminoácidos está en un medio de cultivo.