CN114728043B - 含有血清白蛋白与生长激素的融合蛋白的水性药物组合物 - Google Patents
含有血清白蛋白与生长激素的融合蛋白的水性药物组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114728043B CN114728043B CN202080076140.0A CN202080076140A CN114728043B CN 114728043 B CN114728043 B CN 114728043B CN 202080076140 A CN202080076140 A CN 202080076140A CN 114728043 B CN114728043 B CN 114728043B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- amino acid
- hsa
- fusion protein
- hgh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 110
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title abstract description 31
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title abstract description 30
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title abstract description 28
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 title abstract description 10
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 title abstract description 10
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 110
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 98
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 32
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 38
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 37
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 14
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 33
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 abstract description 24
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 abstract description 13
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 abstract description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 156
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 66
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 57
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 56
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 50
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 39
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 32
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 16
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 15
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 15
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 12
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 12
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 11
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 10
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 9
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 9
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 9
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 9
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 9
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 9
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 9
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 9
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 9
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 8
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 8
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 7
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 5
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010029748 Noonan syndrome Diseases 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 4
- 108010054737 albumin Redhill Proteins 0.000 description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150077543 st gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 3
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical class [H]ON([H])[*] 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 2
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700024069 Drosophila Ubx Proteins 0.000 description 1
- 241000709691 Enterovirus E Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 241000710209 Theiler's encephalomyelitis virus Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012572 advanced medium Substances 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008380 degradant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940077441 fluorapatite Drugs 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002506 iron compounds Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/05—Phenols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了水性药物组合物，其含有血清白蛋白与生长激素连接而成的蛋白。该水性药物组合物含有人血清白蛋白与人生长激素的融合蛋白作为有效成分而构成，该融合蛋白的浓度为10～100mg/mL，蔗糖的浓度为10～150mg/mL，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～10mg/mL，防腐剂的浓度为0.5～12mg/mL，缓冲剂的浓度为1～30mM，pH为5.0～8.0。
Description
技术领域
本发明涉及例如含有血清白蛋白与生长激素的融合蛋白作为有效成分的药物的、在溶液状态下储存稳定的水性药物组合物，更详细而言，涉及进一步含有蔗糖和非离子性表面活性剂作为稳定化剂的水性药物组合物。
背景技术
人生长激素(hGH)是在下丘脑的控制下由垂体前叶分泌的蛋白。hGH除了显示软骨形成促进、蛋白同化促进等生长促进活性以外，还显示身体组成和脂质代谢改善作用。hGH分泌少的儿童与健康儿童相比会出现呈身材矮小的生长激素分泌缺乏性身材矮小症。
含有分子量约22KD的hGH作为有效成分的制剂(hGH制剂)作为生长激素分泌缺乏性身材矮小症、Turner综合征中的身材矮小、SGA (Small-for-Gestational Age：小于胎龄儿)性身材矮小症、Noonan综合征中的身材矮小症、慢性肾功能不全导致的身材矮小症、Prader-Willi综合征中的身材矮小症、软骨营养不良中的身材矮小症的治疗药在临床上广泛应用，所述hGH是使用引入了hGH基因的大肠杆菌以重组蛋白的形式制造的。在这些疾病中不伴有骨骺线闭合的情况下，hGH制剂会特别取得效果。hGH制剂被给予至皮下或肌肉内而在血中循环，通过其生长促进活性取得促进患者生长的效果。另外，hGH制剂还作为成人生长激素分泌缺乏症的治疗药在临床上广泛应用。在成人生长激素分泌缺乏症的患者中观察到脂质代谢异常等各种异常，通过给予hGH制剂，患者的脂质代谢正常化等，患者的QOL得到改善。作为针对生长激素分泌缺乏性身材矮小症、成人生长激素分泌缺乏症等的hGH制剂，例如有Growject (注册商标)。
hGH在血浆中的半衰期小于20分钟，给予至患者的hGH快速从血中消失。因此，为了在患者中实质性地发挥hGH的药效，需要对患者每周3次肌肉内给予hGH、或每天皮下给予hGH。这样的频繁给药成为患者的负担。因此，如果可通过增加hGH在血浆中的稳定性来延长半衰期而减少对患者的hGH给药次数，则可减轻患者的负担，因此优选。
就人血清白蛋白(HSA)而言，其成熟型是由585个氨基酸构成的蛋白。HSA是血浆蛋白中量最多的成分，血浆中的半衰期长达14～20天。HSA有助于调节血浆渗透压，同时还具有与血中的阳离子、脂肪酸、激素类、胆红素等其他内源性物质和药剂等外源性物质结合以将它们进行转运的功能。通常，与HSA结合的物质难以被器官吸收，可在血中循环更长时间。
已知人血清白蛋白(HSA)有多个天然变体。人血清白蛋白Redhill是其中之一(非专利文献1、2)。与由585个氨基酸构成的上述普通的人血清白蛋白的氨基酸序列相比，人血清白蛋白Redhill的不同之处在于：从其N末端侧起第320位的氨基酸残基是苏氨酸而不是丙氨酸，并且在其N末端添加有一个精氨酸残基，由586个氨基酸构成。通过将上述丙氨酸变更为苏氨酸，白蛋白Redhill在其氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列，该序列中的Asn (天冬酰胺)残基发生N-结合型糖苷化。因此，与上述普通的人血清白蛋白相比，观察到白蛋白Redhill的分子量高达2.5kDa。
有人报道了：通过使HSA与hGH结合来增加hGH在血浆中的稳定性的方法(专利文献1～8)。使HSA与hGH结合而得的蛋白如下制作：制作引入了表达载体的转化细胞并培养该细胞，所述表达载体插入有使编码hGH的基因与编码HSA的基因在框内结合而得的DNA，从而在培养基中或细胞内以重组蛋白的形式制得。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2017/154869；
专利文献2：WO2017/159540；
专利文献3：日本特表2003-530838号公报；
专利文献4：日本特表2005-514060号公报；
专利文献5：日本特表2000-502901号公报；
专利文献6：日本特表2008-518615号公报；
专利文献7：日本特表2013-501036号公报；
专利文献8：日本特表2013-518038号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
在上述背景下，本发明的一个目的在于：提供含有人白蛋白与人生长激素的融合蛋白作为有效成分的药物的、水性药物组合物，该水性药物组合物稳定到可在市场上流通的程度。
用于解决课题的手段
本发明人在针对上述目的的研究中反复进行了探讨，结果发现了化合物(人血清白蛋白突变体-hGH融合蛋白)在含有蔗糖和非离子性表面活性剂的水性药物组合物中稳定，该化合物是使人血清白蛋白突变体与人生长激素(hGH)结合而得的，该突变体包含与由585个氨基酸构成的普通人血清白蛋白相比从其N末端起第320位的氨基酸残基即丙氨酸被苏氨酸取代而得的氨基酸序列，从而完成了本发明。即，本发明包括以下内容。
1. 水性药物组合物，其是含有人血清白蛋白与人生长激素的融合蛋白作为有效成分而构成的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为10～100mg/mL，蔗糖的浓度为10～150mg/mL，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～10mg/mL，防腐剂的浓度为0.5～12mg/mL，缓冲剂的浓度为1～30mM，pH为5.0～8.0。
2. 上述1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为15～70mg/mL。
3. 上述1或2所述的水性药物组合物，其中，该蔗糖的浓度为50～100mg/mL。
4. 上述1～3中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂的浓度为1.5～4.5mg/mL。
5. 上述1～4中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
6. 上述1～4中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂为选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的物质。
7. 上述1～6中任一项所述的水性药物组合物，其中，该防腐剂为苯酚。
8. 上述7所述的水性药物组合物，其中，该苯酚的浓度为3～9mg/mL。
9. 上述1～8中任一项所述的水性药物组合物，其中，该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
10. 上述9所述的水性药物组合物，其中，该磷酸缓冲剂的浓度为2～20mM。
11. 上述1～10中任一项所述的水性药物组合物，其中，该pH为6.0～7.8。
12. 上述1～10中任一项所述的水性药物组合物，其中，该pH为6.5～7.6。
13. 上述1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为10～100mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该非离子性表面活性剂为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该防腐剂为苯酚，该苯酚的浓度为6mg/mL，该缓冲剂为磷酸缓冲剂，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
14. 上述1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为15～70mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该非离子性表面活性剂为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该防腐剂为苯酚，该苯酚的浓度为6mg/mL，该缓冲剂为磷酸缓冲剂，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
15. 上述1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为 50mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该非离子性表面活性剂为聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该防腐剂为苯酚，该苯酚的浓度为6mg/mL，该缓冲剂为磷酸缓冲剂，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
16. 上述1～15中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的氨基酸序列是与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有85%以上的同一性的序列。
17. 上述1～15中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的氨基酸序列是与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性的序列。
18. 上述1～15中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的氨基酸序列是与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有95%以上的同一性的序列。
19. 上述1～15中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的氨基酸序列是具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列的序列。
发明效果
根据本发明，例如可将含有人白蛋白与人生长激素结合而成的蛋白作为有效成分的药物制成稳定到可在市场上流通的程度的水性药物组合物。
附图说明
[图1] 图1是显示实施例的静态光散射强度的测定结果的图。纵轴表示473nm的静态光散射强度(任意单位)，横轴表示温度。图中，(a)、(b)和(c)分别为配方2-1、2-2和2-3的测定结果。
[图2A] 图2A显示实施例10中的配方5-1的刚刚调制后的SE-HPLC图。纵轴表示215nm的吸光度(任意单位)，横轴表示保留时间(分钟)。
[图2B] 图2B是将图2A沿纵轴方向放大的图。图中，峰1对应于22KhGH-mHSA的单体，峰2对应于其聚合物，峰3对应于其低分子物，峰4对应于苯酚。
具体实施方式
本说明书中，当仅称“人血清白蛋白”或“HSA”时，除由SEQ ID NO: 1所示的585个氨基酸残基构成的普通野生型人血清白蛋白以外，只要是具有结合血中的内源性物质和药剂等外源性物质进行搬运的功能等作为普通野生型人血清白蛋白的功能的物质即可，无需特别区分，还包含HSA的突变体，该突变体相当于针对SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列有1个或多个氨基酸残基被取代、缺失和/或添加(本说明书中，氨基酸残基的“添加”是指在序列的末端或内部追加残基。)而得的突变体。在将氨基酸残基用其他氨基酸残基取代的情况下，进行取代的氨基酸残基的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。在缺失氨基酸残基的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。例如，SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的N末端或C末端的氨基酸残基已缺失的、由584个氨基酸残基构成的突变体也包含在人血清白蛋白中。另外，可将这些氨基酸残基的取代与缺失组合。而且，可以是在普通野生型HSA或其突变体的氨基酸序列中或该氨基酸序列的N末端侧或C末端侧添加1个或多个氨基酸残基而得的突变体。此时所添加的氨基酸残基的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。
作为将这些氨基酸的取代、缺失和添加这3种突变中的至少2种突变组合引入而得的HSA的突变体，优选具有针对SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列进行0～10个氨基酸残基的缺失、0～10个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代、以及0～10个氨基酸残基的添加而形成的氨基酸序列的突变体。更优选针对SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的这些缺失、取代和/或添加的氨基酸残基的个数分别优选为5个以下、进一步优选为3个以下。
在本发明中，“人血清白蛋白Redhill” (HSA-Redhill)的术语是指人血清白蛋白的变体，由SEQ ID NO: 2所示的586个氨基酸残基构成。人血清白蛋白Redhill相当于：相对于由SEQ ID NO: 1所示的585个氨基酸构成的野生型人血清白蛋白的氨基酸序列，从N末端起第320位的氨基酸残基是苏氨酸而不是丙氨酸、并且在N末端添加有一个精氨酸残基的突变体。通过将该丙氨酸取代成苏氨酸，白蛋白Redhill在其氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分，该序列部分中的Asn (天冬酰胺)残基发生N-结合型糖苷化。因此，与普通野生型白蛋白(SEQ ID NO: 1)相比，观察到白蛋白Redhill的分子量高达2.5kDa。
在本发明中，“人血清白蛋白突变体” (HSA突变体)的术语是指相对于普通野生型HSA (SEQ ID NO: 1)的上述突变体，其中SEQ ID NO: 2所示的变体(HSA-Redhill)除外。本发明中优选的HSA突变体，除从野生型HSA的氨基酸序列的N末端起第320位的丙氨酸被取代成苏氨酸而得的突变体即SEQ ID NO: 3所示的突变体以外，只要是具有结合血中的内源性物质和药剂等外源性物质进行搬运的功能等作为普通野生型人血清白蛋白的功能的突变体即可，还包括具有以下的氨基酸序列的突变体：相对于SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列有1个或多个氨基酸残基被取代成其他的氨基酸、缺失或添加而得的氨基酸序列，其中以从SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的N末端起第318位的天冬酰胺残基和第320位的苏氨酸残基在这2个残基之间经由脯氨酸以外的单一氨基酸残基(X)通过肽键连接的状态保存。在将该氨基酸序列中的氨基酸残基用其他氨基酸残基取代的情况下，进行取代的氨基酸残基的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。在使氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。例如，可以是SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的N末端或C末端的氨基酸残基已缺失的、由584个氨基酸残基构成的突变体。另外，还可以是组合有这些氨基酸残基的取代和缺失的突变体。而且，可以是在这些突变体的氨基酸序列中或该氨基酸序列的N末端侧或C末端侧添加有1个或多个氨基酸残基的突变体。即，可以是相对于SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列将氨基酸的取代、缺失和添加这3种突变中的至少2种突变组合引入而得的突变体，该突变体进行了0～10个氨基酸残基的缺失、0～10个氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基、并进一步添加了0～10个氨基酸残基。然而，从SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的N末端起第318～320位的氨基酸残基必须是天冬酰胺-X-苏氨酸(“X”为脯氨酸以外的氨基酸残基)，优选为天冬酰胺-酪氨酸-苏氨酸。需要说明的是，人血清白蛋白突变体只要保持作为人血清白蛋白的功能，就包括在人血清白蛋白中。这里，人血清白蛋白突变体的氨基酸序列与SEQ IDNO: 1所示的普通野生型HSA的氨基酸序列具有优选85%以上的同一性、更优选90%以上的同一性、进一步优选95%以上的同一性。
在本发明中，各种HSA突变体中的与普通野生型HSA比较时的各突变的位置及其形式(缺失、取代、添加)可通过两个HSA的氨基酸序列的比对容易地确认。需要说明的是，在本发明中，野生型HSA的氨基酸序列与加入了突变的HSA的氨基酸序列的同一性可利用周知的相似性计算算法容易地算出。例如，作为这样的算法，有BLAST (Altschul SF. J Mol.Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson和Lipman的类似性检索法(Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 85. 2444 (1988))、Smith和Waterman的局部相似性算法(Adv. Appl. Math.2. 482-9 (1981))等。
上述HSA氨基酸序列中的氨基酸用其他氨基酸进行的取代例如发生在氨基酸家族内，该氨基酸家族内的氨基酸在它们的侧链和化学性质方面具有关联性。预测这样的氨基酸家族内的取代不会给HSA的功能带来大的改变(即，为保守的氨基酸取代)。作为这样的氨基酸家族，例如有以下的氨基酸：
(1) 作为酸性氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸；
(2) 作为碱性氨基酸的组氨酸、赖氨酸和精氨酸；
(3) 作为芳族氨基酸的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；
(4) 作为具有羟基的氨基酸(羟基氨基酸)的丝氨酸和苏氨酸；
(5) 作为疏水性氨基酸的蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
(6) 作为中性亲水性氨基酸的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；
(7) 作为影响肽链取向的氨基酸的甘氨酸和脯氨酸；
(8) 作为酰胺型氨基酸(极性氨基酸)的天冬酰胺和谷氨酰胺；
(9) 作为脂肪族氨基酸的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
(10) 作为侧链小的氨基酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；
(11) 作为侧链特别小的氨基酸的丙氨酸和甘氨酸。
在后述的实施例中使人生长激素与人血清白蛋白突变体结合而得的蛋白中的人血清白蛋白突变体(HSA突变体的典型的一例)相对于由585个氨基酸构成的野生型人血清白蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的不同之处仅在于：从N末端起第320位的氨基酸残基是苏氨酸而不是丙氨酸(SEQ ID NO: 3)。根据该不同，该HSA突变体(称为“HSA (A320T)”。)在其氨基酸序列中产生以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分，在该序列部分中Asn (天冬酰胺)残基可发生N-结合型糖苷化。
在本说明书中，“人血清白蛋白与人生长激素的融合蛋白”或“人血清白蛋白-hGH融合蛋白(HSA-hGH融合蛋白)”是指使HAS与生长激素结合而得的蛋白。这里，使这些蛋白“结合”例如包括使它们通过肽键连接，但并不限于此。另外，使这些蛋白“结合”不仅是指使一方的N末端与另一方的C末端之间直接通过肽键连接，还包括使两种蛋白经由接头间接地结合。特别是，在人血清白蛋白为人血清白蛋白突变体时，是指“人血清白蛋白突变体与人生长激素的融合蛋白”或“人血清白蛋白突变体-hGH融合蛋白(HSA突变体-hGH融合蛋白)”。即，人血清白蛋白突变体-hGH融合蛋白包括在人血清白蛋白-hGH融合蛋白中。“人血清白蛋白与人生长激素的融合蛋白”也可称为HAS连接hGH。
这里，“接头”是位于上述2个多肽之间使两者通过共价键结合的结构部分，并非来自HSA (包括HSA突变体)和作为其结合对方的生长激素的任一者的末端。接头可以是与两个多肽进行肽键合的单一的氨基酸残基或由2个以上的氨基酸残基构成的肽链部分(肽接头)，在本说明书中将这些由1个以上的氨基酸残基构成的接头统称为“肽接头”。另外，在本说明书中，当说到HSA与生长激素“经由肽键”结合时，包括两者直接通过肽键结合的情况和两者通过与肽接头的结合进行结合的情况。需要说明的是，本说明书中，在HSA与生长激素直接或经由肽接头结合的情况下，作为该化合物的“人血清白蛋白-hGH融合蛋白(HSA-hGH融合蛋白)”也可称为“人血清白蛋白融合hGH (HSA融合hGH)”。关于人血清白蛋白突变体-hGH融合蛋白(HSA突变体-hGH融合蛋白)也同样。
在本发明中，当HSA与生长激素经由肽接头结合时，其接头优选由1～50个、更优选由1～17个、进一步优选由1～10个、更进一步优选由1～6个氨基酸残基构成，例如是由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个或25～29个氨基酸构成的接头，例如进一步是仅由1个氨基酸残基、或由2个、3个、5个、6个或20个氨基酸残基构成的接头。只要通过肽接头结合的HSA部分保持作为HSA的功能并且生长激素部分也可在生理条件下发挥生长激素的生理活性即可，对构成肽接头的氨基酸残基或氨基酸序列没有限定，优选为由甘氨酸和丝氨酸构成的接头。作为肽接头的合适例子，可列举：由一个甘氨酸、一个丝氨酸、Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO: 5)和Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6)构成的接头、以及包含这些氨基酸序列而构成的接头。具有这些氨基酸序列中的任一种连续2～10次或2～5次构成的序列的接头也可适合用作肽接头，另外，具有这些氨基酸序列中的任意两种以上组合并连续1～10次或2～5次构成的序列的接头也可适合用作肽接头。作为这些氨基酸序列中的任意两种以上组合而成的肽接头的适合的例子，可列举：包含在氨基酸序列Gly-Ser之后有连续3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 5)而成的总计20个氨基酸序列的接头。
作为使2个不同的多肽结合的方法，例如通常是下述方法：制作在编码一个多肽的基因的下游插入了在框内结合有编码另一个多肽的基因的DNA的表达载体，对使用该表达载体而转化的宿主细胞进行培养，从而以重组融合蛋白的形式表达，该方法可在本发明中利用。
在通过以重组体的形式在转化细胞中表达而产生HSA-hGH融合蛋白的情况下，可得到包含生长激素的氨基酸序列而构成的多肽结合于包含HSA的氨基酸序列而构成的多肽的N末端或C末端的任一末端的形式的融合蛋白。利用基因重组技术制造的HSA-hGH融合蛋白特别称为重组HSA-hGH融合蛋白。
在使包含生长激素的氨基酸序列而构成的多肽与包含HSA的氨基酸序列而构成的多肽的N末端侧结合的情况下，使用在编码包含生长激素的氨基酸序列而构成的多肽的基因的下游插入了DNA的表达载体，该DNA在框内结合有编码包含HSA的氨基酸序列而构成的多肽的基因。在经由肽接头使2个多肽间接地结合的情况下，在编码2个多肽的基因之间在框内插入编码该接头的DNA序列。
在使包含生长激素的氨基酸序列的多肽与包含HSA的氨基酸序列的多肽的C末端侧结合的情况下，使用在编码包含生长激素的氨基酸序列的多肽的基因的上游插入了DNA的表达载体，该DNA在框内结合有编码包含HSA的氨基酸序列的多肽的基因。在经由肽接头使2个多肽间接地结合的情况下，在编码2个多肽的基因之间在框内插入编码该接头的DNA序列。
为了使HSA-hGH融合蛋白在宿主细胞中产生，将插入有编码它们的任一者的DNA的表达载体引入到宿主细胞中。为此可使用的宿主细胞只要是通过引入这样的表达载体可使HSA-hGH融合蛋白表达的宿主细胞即可，没有特别限定，可以是哺乳动物细胞、酵母、植物细胞、昆虫细胞等真核生物细胞、大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞的任一种，但哺乳动物细胞特别适合。然而，在以进行了糖链修饰的蛋白的形式表达的情况下的宿主细胞选自哺乳动物细胞、酵母、植物细胞、昆虫细胞等真核生物细胞。通过使普通野生型HSA的第320位的氨基酸残基成为苏氨酸而产生的以Asn-Tyr-Thr表示的序列部分的Asn残基、或以Asn-X-Thr(“X”表示脯氨酸以外的氨基酸残基)表示的序列中的Asn残基，通过在真核生物细胞中进行HSA-hGH融合蛋白的表达，而进行N-结合型糖苷化。
在使用哺乳动物细胞作为宿主细胞的情况下，对该哺乳动物细胞的种类没有特别限定，优选来自人、小鼠、中国仓鼠的细胞，特别优选来自中国仓鼠卵巢细胞的CHO细胞、或来自小鼠骨髓瘤的NS/0细胞。另外，此时用于插入编码HSA-hGH融合蛋白的DNA片段使其表达的表达载体只要是引入到哺乳动物细胞内时进行该基因的表达的表达载体即可，可无特别限定地使用。插入到表达载体中的该基因配置在DNA序列(基因表达控制位点)的下游，该DNA序列可在哺乳动物细胞内调节基因的转录频率。作为本发明中可使用的基因表达控制位点，例如可列举：来自巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、人延伸因子-1α (EF-1α)启动子、人泛素C启动子。
引入了这样的表达载体的哺乳动物细胞表达插入在表达载体中的蛋白，但其表达量不一样，根据各个细胞而不同。因此，为了高效地生产HSA-hGH融合蛋白，需要从引入了表达载体的哺乳动物细胞中选择它们的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该选择步骤，在表达载体中插入起到选择标志物作用的基因。
作为选择标志物，最普通的是降解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(耐药性标志物)。哺乳动物细胞通常在一定浓度以上的这些药剂的存在下会死亡。然而，引入了插入有耐药性标志物基因的表达载体的哺乳动物细胞，可利用所表达的耐药性标志物使上述药剂无毒或减毒，因此即使在上述药剂的存在下也可存活。将插入有作为选择标志物的耐药性标志物的表达载体引入到哺乳动物细胞中，在含有与其耐药性标志物对应的药剂的选择培养基中，例如若边缓慢地提升其药剂浓度边继续培养，则可得到即使在更高浓度的药剂存在下也可增殖的细胞。在如此操作而选择的细胞中，通常与耐药性标志物一起插入到表达载体中的编码目标蛋白的基因的表达量也增加，其结果，选择该蛋白的表达水平高的细胞。
另外，作为选择标志物，也可使用谷氨酰胺合成酶(GS)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。若在含有谷氨酰胺合成酶的抑制剂、例如L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)、并且不含谷氨酰胺的选择培养基中培养哺乳动物细胞，则细胞通常会死亡。然而，若将插入有作为选择标志物的谷氨酰胺合成酶的表达载体引入到哺乳动物细胞中，则在该细胞中谷氨酰胺合成酶的表达水平提升，因此即使在更高浓度的MSX存在下也可增殖。此时，若边缓慢地提升MSX的浓度边继续培养，则可得到即使在更高浓度的MSX存在下也可增殖的细胞。在如此操作而选择的细胞中，通常与谷氨酰胺合成酶一起插入到表达载体中的编码目标蛋白的基因的表达量也增加，其结果，选择该蛋白的表达水平高的细胞。
另外，作为选择标志物，也可使用二氢叶酸还原酶(DHFR)。在使用DHFR作为选择标志物的情况下，引入了表达载体的哺乳动物细胞是在含有甲氨蝶呤、氨基蝶呤等DHFR抑制剂的选择培养基中进行培养。若边缓慢地提升DHFR抑制剂的浓度边继续培养，则可得到即使在更高浓度的DHFR抑制剂的存在下也可增殖的细胞。此时所使用的选择培养基优选不含次黄嘌呤和胸苷。在如此操作而选择的细胞中，通常与DHFR一起插入到表达载体中的编码目标蛋白的基因的表达量也增加，其结果，选择该蛋白的表达水平高的细胞。
已知有在编码目标蛋白的基因的下游侧经由内部核糖体结合位点(IRES：internal ribosome entry site)配置有作为选择标志物的谷氨酰胺合成酶(GS)的表达载体(国际专利公报WO2012/063799、WO2013/161958)。这些文献中记载的表达载体可特别适合用于HSA-hGH融合蛋白的制造。
例如，用于表达目标蛋白的表达载体，其包含第1基因表达控制位点、以及在其下游的编码该蛋白的基因、在更下游的内部核糖体结合位点、以及在更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在上述第1基因表达控制位点或与其不同的第2基因表达控制位点的下游还包含二氢叶酸还原酶基因或耐药性基因而构成，该表达载体可适用于HSA-hGH融合蛋白的制造。在该表达载体中，作为第1基因表达控制位点或第2基因表达控制位点，适合使用来自巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、人延伸因子-1α启动子(hEF-1α启动子)、人泛素C启动子，但hEF-1α启动子特别适合。
另外，作为内部核糖体结合位点，适合使用来自下述基因组或基因的5’非翻译区的内部核糖体结合位点，所述基因组或基因为：选自小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、Theiler氏鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇B型病毒的病毒的基因组；或选自人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蝇触角基因、果蝇Ultrabithorax基因的基因，来自小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体结合位点特别适合。在使用来自小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体结合位点的情况下，除野生型的内部核糖体结合位点以外，野生型的内部核糖体结合位点所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体结合位点也可适合使用。另外，在该表达载体中，适合使用的耐药性基因优选为嘌呤霉素或新霉素抗性基因，更优选为嘌呤霉素抗性基因。
另外，例如，用于表达目标蛋白的表达载体，其包含人延伸因子-1α启动子、在其下游的编码该蛋白的基因、在更下游的来自小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体结合位点、以及在更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在另一个基因表达控制位点及其下游还包含二氢叶酸还原酶基因，其中该内部核糖体结合位点是野生型的内部核糖体结合位点所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体结合位点，该表达载体可适合用于HSA-hGH融合蛋白的制造。作为这样的表达载体，可列举：WO2013/161958中记载的表达载体。
另外，例如，用于表达目标蛋白的表达载体，其包含人延伸因子-1α启动子、在其下游的编码该蛋白的基因、在更下游的来自小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体结合位点、以及在更下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因，并且在另一个基因表达控制位点及其下游还包含耐药性基因，其中该内部核糖体结合位点是野生型的内部核糖体结合位点所含的多个起始密码子中的一部分被破坏的内部核糖体结合位点，该表达载体可适合用于HSA-hGH融合蛋白的制造。作为这样的表达载体，可列举：WO2012/063799中记载的pE-mIRES-GS-puro和WO2013/161958中记载的pE-mIRES-GS-mNeo。
在来自野生型小鼠脑心肌炎病毒基因组的5’非翻译区的内部核糖体结合位点的3’末端存在3个起始密码子(ATG)，包含这3个起始密码子的序列部分用SEQ ID NO: 7 (5’-ATGataatATGgccacaaccATG-3’：起始密码子的ATG用大写字母表示)表示。作为该序列部分中的起始密码子中的一部分被破坏的序列，例如有SEQ ID NO: 8 (5’-atgataagcttgccacaaccatg-3’)所示的序列，上述的pE-mIRES-GS-puro和pE-mIRES-GS-mNeo是具有包含SEQ ID NO: 8所示序列的IRES的表达载体。
在本发明中，将引入了插入有编码HSA-hGH融合蛋白的DNA片段的表达载体的哺乳动物细胞在选择培养基中进行选择培养，以选择它们的表达水平高的细胞。
在选择培养中，在使用DHFR作为选择标志物的情况下，使选择培养基中所含的DHFR抑制剂的浓度阶段性地提升。在DHFR抑制剂为甲氨蝶呤的情况下，其最大浓度优选为0.25～5μM、更优选为0.5～1.5μM、进一步优选为约1.0μM。
在使用GS作为选择标志物的情况下，使选择培养基中所含的GS抑制剂的浓度阶段性地提升。在GS抑制剂为MSX的情况下，其最大浓度优选为10～1000μM等、例如为20～500μM、20～80μM、20～30μM。另外，此时通常使用不含谷氨酰胺的培养基作为选择培养基。
在使用降解嘌呤霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中所含的嘌呤霉素的最大浓度优选为3～30μg/mL、更优选为5～20μg/mL、进一步优选为约10μg/mL。
在使用降解新霉素的酶作为选择标志物的情况下，选择培养基中所含的G418的最大浓度优选为0.1～2mg/mL、更优选为0.5～1.5mg/mL、进一步优选为约1mg/mL。
另外，作为用于培养哺乳动物细胞的培养基，只要选择培养中使用的培养基、后述的用于生产重组蛋白的培养基(重组蛋白生产用培养基)均为可培养哺乳动物细胞以使其增殖的培养基，则可无特别限定地使用，优选使用无血清培养基。由于HSA具有吸附血清中所含的成分的性质，所以在使用含有血清的培养基生产HSA的情况下，可得到吸附有血清中的杂质的HSA，因此在之后的工序中需要去除该杂质。
在本发明中，HSA-hGH融合蛋白是特别在无血清培养基中培养表达它们的细胞而得的融合蛋白。通过使用无血清培养基，可减少杂质在HSA-hGH融合蛋白上的吸附量，因此可简化之后的纯化工序。
通过选择培养而选择的HSA-hGH融合蛋白的表达水平高的细胞被用于生产HSA-hGH融合蛋白(产生HSA-hGH融合蛋白的细胞)。HSA-hGH融合蛋白的生产通过在HSA-hGH融合蛋白生产用培养基中培养产生HSA-hGH融合蛋白的细胞来进行。将该培养称为生产培养。
在本发明中，作为用作HSA-hGH融合蛋白生产用培养基的无血清培养基，例如适合使用含有3～700mg/L的氨基酸、0.001～50mg/L的维生素类、0.3～10g/L的单糖类、0.1～10000mg/L的无机盐、0.001～0.1mg/L的微量元素、0.1～50mg/L的核苷、0.001～10mg/L的脂肪酸、0.01～1mg/L的生物素、0.1～20μg/L的氢化可的松、0.1～20mg/L的胰岛素、0.1～10mg/L的维生素B12、0.01～1mg/L的腐胺、10～500mg/L的丙酮酸钠和水溶性铁化合物的培养基。根据需要，可在培养基中添加胸苷、次黄嘌呤、常规的pH指示剂和抗生素等。
作为用作HSA-hGH融合蛋白生产用培养基的无血清培养基，可使用DMEM/F12培养基(DMEM与F12的混合培养基)作为基本培养基，上述各培养基为本领域技术人员所周知。而且，作为无血清培养基，还可使用DMEM (HG) HAM改良型(R5)培养基，其包含碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸铁(II)、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和聚乙烯醇。而且，也可使用市售的无血清培养基、例如CD OptiCHOTM培养基、CHO-S-SFM II培养基或CD CHO培养基(Thermo Fisher Scientific公司)、IS cho-VTM 培养基(Irvine Scientific公司)、EX-CELLTM302培养基、EX-CELLTM高级培养基或EX-CELLTM325-PF培养基(SAFC Biosciences公司)等作为基本培养基。
在HSA-hGH融合蛋白生产用培养基中，还可适当添加1～50g/L (例如1～5g/L)的来自大豆、小麦、水稻等植物的水解物。最常用的是来自大豆的蛋白水解物。然而，无需在HSA-hGH融合蛋白生产用培养基中添加来自水稻等植物的水解物、例如来自大豆的蛋白水解物，即可制造HSA-hGH融合蛋白。
生产培养结束后的培养液被供于用于纯化HSA-hGH融合蛋白的层析工序。然而，供于层析工序的培养液是从培养液中去除了细胞等的培养上清。作为由培养液中得到培养上清的方法，有利用膜滤器进行的过滤、离心分离等。
在本发明中，用于纯化HSA-hGH融合蛋白的各层析工序根据需要可在非离子性表面活性剂的存在下进行，以防止蛋白的非特异性吸附。对使用哪种非离子性表面活性剂没有特别限定，优选使用聚山梨醇酯类表面活性剂，更优选为聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。这样的非离子性表面活性剂的浓度优选为0.005% (w/v)～0.1% (w/v)、更优选为0.005%(w/v)～0.05% (w/v)、例如为0.01% (w/v)、0.05% (w/v)等。
HSA-hGH融合蛋白的纯化工序可在室温或低温下进行，可优选在低温下、特别是1～10℃下进行。
在本发明的一个实施方式中，HSA-hGH融合蛋白的纯化工序包括：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序、阳离子交换柱层析工序、以及尺寸排阻柱层析工序。然而，也可在这些层析工序中加入1个或多个层析工序。作为这样的追加的层析工序，例如可列举：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序、阳离子交换柱层析工序、阴离子交换柱层析工序、疏水性柱层析工序、色素亲和性柱层析工序、以及尺寸排阻柱层析工序。
在本发明的一个实施方式中，HSA-hGH融合蛋白的纯化工序依次包括：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序、阳离子交换柱层析工序、以及尺寸排阻柱层析工序。然而，也可在这些层析工序中加入1个或多个层析工序。作为这样的追加的层析工序，例如可列举：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序、阳离子交换柱层析工序、阴离子交换柱层析工序、疏水性柱层析工序、色素配体柱层析工序和尺寸排阻柱层析工序。追加的层析可加在任何相邻的步骤之间，或者可作为最初的层析工序、最后的层析工序加入。
以下，对本发明的一实施方式中的纯化工序进行详述，该纯化工序依次包括：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序、阳离子交换柱层析工序和尺寸排阻柱层析工序。
第一柱层析工序采用：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析。这里，抗体可以是对HSA或hGH的任一者具有亲和性的抗体，优选为对hGH具有亲和性的抗体。例如，可适合使用捕获选择人生长激素亲和基质(Capture selectHuman Growth Hormone Affinity Matrix) (Thermo Fisher Scientific公司)，其包含结合有抗人生长激素的抗体的载体。
在采用使用结合有对hGH具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析柱的情况下，在预先用缓冲液平衡化的柱上加载HSA-hGH融合蛋白。这里，对缓冲液的种类没有特别限定，优选Tris-HCl缓冲液，其浓度优选为5～50mM、更优选为10～30mM。另外，其pH优选调节至6.7～7.3、更优选6.9～7.1、进一步优选约7.0。从柱上洗脱HSA-hGH融合蛋白优选使用甘氨酸-盐酸来进行。甘氨酸-盐酸的浓度优选为20～100mM、更优选为40～60mM、进一步优选为约50mM。另外，其pH优选调节至2.0～4.0、更优选2.8～3.2、进一步优选约3.0。洗脱液的pH被立即调节至中性附近、例如pH 6.4～7.0。
第二柱层析工序使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相。作为使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析，其适合的柱层析可列举：羟磷灰石柱层析和氟磷灰石柱层析，特别优选羟磷灰石柱层析。这些是用于利用基于钙离子的金属亲和力与基于磷酸基的阳离子交换的双方的相互作用来去除夹杂物。
以下，对采用羟磷灰石柱层析的情况进行详述。对用于羟磷灰石层析的载体没有特别限定，可以是陶瓷性，也可以是结晶性，作为特别优选的载体之一，可列举：CHT II型(40μm) (Bio-Rad Laboratories公司)。
通过第一柱层析工序得到的洗脱液在加载到羟磷灰石层析柱之前要调节pH和电导率。此时，pH优选调节至6.5～7.5、更优选6.8～7.2、进一步优选6.9～7.1。另外，电导率优选调节至0.4～0.8S/m、更优选0.5～0.7S/m。
将已调节pH和电导率的洗脱液加载到预先用缓冲液平衡化的羟磷灰石层析柱。这里，对缓冲液的种类没有特别限定，优选MES缓冲液，其浓度优选为5～50mM、更优选为10～30mM、例如为20mM。另外，其pH优选调节至6.7～7.3、更优选6.9～7.1、进一步优选约7.0。另外，缓冲液包含磷酸根离子，其浓度优选为0～3mM、更优选为0～2mM、例如为1mM。
从羟磷灰石层析柱上洗脱HSA-hGH融合蛋白使用已提高了磷酸根离子浓度的缓冲液进行。此时，磷酸根离子的浓度优选为20～50mM、更优选为25～40mM，进一步优选为25～35mM、例如为30mM。
第三柱层析工序采用阳离子交换柱层析，用于去除夹杂蛋白。对在阳离子交换柱层析中使用哪种阳离子交换树脂没有特别限定，优选弱阳离子交换树脂，更优选为具有基于疏水性相互作用和氢键形成的双方的选择性的弱阳离子交换树脂。例如，像Capto MMC(GE Healthcare)等具有苯基、酰胺键和羧基且具有基于疏水性相互作用和氢键形成的选择性的弱阳离子交换树脂可适合使用。
通过第二柱层析工序得到的洗脱液在加载到阳离子交换柱层析之前要调节pH和电导率。此时，pH优选调节至5.3～6.2、更优选5.4～6.1、进一步优选5.6～5.8。另外，电导率优选调节至0.5～0.9S/m、更优选0.6～0.8S/m。
对已调节pH和电导率的洗脱液加载到预先用缓冲液平衡化的阳离子交换柱层析。这里，对缓冲液的种类没有特别限定，优选MES缓冲液，其浓度优选为30～70mM、更优选为40～60mM、例如为50mM。另外，其pH优选调节至5.4～6.0、更优选5.6～5.8、例如5.7。另外，缓冲液含有盐，盐为中性盐时，其在缓冲液中的浓度优选为30～150mM、更优选为50～120mM、进一步优选为80～120mM、例如为100mM。此时，中性盐优选为氯化钠、氯化钾，特别优选为氯化钠。
通过阳离子交换柱层析洗脱HSA-hGH融合蛋白使用已提高了中性盐浓度的缓冲液进行。此时，中性盐的浓度优选为400～600mM、更优选为500～600mM、进一步优选为530～570mM、例如为550mM。
第四柱层析工序采用尺寸排阻层析。尺寸排阻层析用于根据分子尺寸、特别是去除内毒素等低分子的夹杂物、HSA-hGH融合蛋白的多聚体或降解物。
在尺寸排阻层析工序中，柱预先被平衡化。这里，对缓冲液的种类没有特别限定，优选磷酸缓冲液，其浓度优选为5～20mM、更优选为8～12mM、例如为10mM。其pH优选调节至6.6～7.4、更优选7.0～7.4、例如7.2。另外，缓冲液可以是含有可用作药品添加剂的二糖的缓冲液。这样的二糖优选为蔗糖，其浓度优选为60～90mg/mL、更优选为70～80mg/mL、例如为75mg/mL。通过该第一至第四柱层析工序得到实质上纯粹的HSA-hGH融合蛋白。
在HSA-hGH融合蛋白的纯化工序中，根据需要还可追加病毒失活工序。病毒失活工序可在任意的2个层析工序之间实施，也可在最初的层析工序之前、或在最后的层析工序之后实施。另外，在HSA-hGH融合蛋白的纯化工序中，病毒失活工序可实施1次，也可实施2次，或者可实施3次以上。
在层析工序依次包括：使用结合有对HSA-hGH融合蛋白具有亲和性的抗体的材料作为固定相的柱层析工序(第一柱层析工序)、使用对磷酸基具有亲和性的材料作为固定相的柱层析工序(第二柱层析工序)、阳离子交换柱层析工序(第三柱层析工序)和尺寸排阻柱层析工序(第四柱层析工序)的情况下，病毒失活工序优选在第一柱层析工序与第二柱层析工序之间、或/和第四柱层析工序之后实施。对应用怎样的病毒失活工序没有特别限定，溶剂-表面活性剂法或滤器过滤法可适合应用。溶剂-表面活性剂法是通过在应该将病毒失活的溶液中添加有机溶剂和表面活性剂来使病毒失活的方法。在应用溶剂-表面活性剂法的情况下，在含有HSA-hGH融合蛋白的溶液中添加有机溶剂和非离子性表面活性剂进行混合，培养该混合液例如超过3小时。溶剂-表面活性剂法中使用的溶液只要是使HSA-hGH融合蛋白稳定地保持至少2小时的溶剂即可，没有特别限定，可适合使用在pH调节至中性附近的甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、或它们的混合物中混合了有机溶剂和非表面活性剂的溶剂。另外，对使用哪种非离子性表面活性剂也没有特别限定，例如可将聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和triton X-100单独使用或将它们任意地组合使用。聚山梨醇酯80是特别适合的非离子性表面活性剂之一，可单独或与其他非离子性表面活性剂组合使用。另外，对使用哪种有机溶剂也没有特别限定，例如可使用磷酸三正丁酯。在将聚山梨醇酯80和磷酸三正丁酯组合使用的情况下，混合液中的聚山梨醇酯80的浓度为0.3～2%、例如为1%，磷酸三正丁酯的浓度为0.1～0.5%、例如为0.3%，将混合液培养2～5小时、例如3小时。
滤器过滤法是利用具有去除病毒的性能的滤膜(病毒去除膜)过滤应该去除病毒的溶液以去除病毒的方法。滤器过滤法中使用的滤膜优选平均孔径为17～21nm，其材质例如为再生纤维素。在应用滤器过滤法的情况下，使含有HSA-hGH融合蛋白的溶液通过病毒去除膜。例如，在第一柱层析工序与第二柱层析工序之间利用溶剂-表面活性剂法进行病毒失活，在第四柱层析工序之后利用滤器过滤法进行病毒失活，从而可更可靠地进行病毒的去除。
需要说明的是，使用病毒去除膜进行的方法也可称为病毒去除工序，但在本发明中也可称为病毒失活工序的一种方法。
在本发明中，与未结合HSA的原始的生长激素相比，HSA-hGH融合蛋白在血中的稳定性提高，半衰期变长。虽然根据给药途径或给药量而变动，但在通过皮下注射对食蟹猴给药时，血中半衰期(t1/2 β)例如为5小时以上，在血中非常稳定。例如，关于HSA突变体-人生长激素融合蛋白的血中半衰期(t1/2 β)，在以0.5～10mg/kg的剂量对雄性食蟹猴进行单次皮下给药时，血中半衰期(t1/2 β)为5～40小时。
在本发明中，含有HSA突变体-生长激素融合蛋白作为有效成分而构成的药物，能以注射剂的形式对静脉内、肌肉内、腹腔内或皮下给药。
人生长激素主要有分子量不同的以下2种：分子量为22kDa的人生长激素(22kDa人生长激素、在本说明书中记作22K人生长激素)和分子量为20kDa的人生长激素(20kDa人生长激素、在本说明书中记作20K人生长激素)。22K生长激素是具有SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的、由191个氨基酸构成的蛋白。通常，提及“人生长激素(或hGH)”时是指该22K生长激素，在本说明书中，仅提及“人生长激素(或hGH)”时，包括22K人生长激素和20K人生长激素这两者。
在本说明书中，当仅提及“22K人生长激素(或22KhGH)”时，除具有SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的野生型22KhGH以外，还包括相对于此有1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加而得的序列即22KhGH突变体，其具有生长促进活性。可被取代、缺失和/或添加的氨基酸的个数根据各突变类型优选为1～8个、更优选为1～4个、进一步优选为1～2个。这里，22KhGH突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO: 9所示的野生型22KhGH的氨基酸序列优选具有85%以上的同一性、更优选90%以上的同一性、进一步优选95%以上的同一性。
野生型20K人生长激素相当于在构成野生型22K生长激素(SEQ ID NO: 9)的191个氨基酸中从N末端数起第32位～第46位的15个氨基酸已缺失的序列，是包含由176个氨基酸构成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)的、具有生长促进活性蛋白。然而，在本说明书中，当仅提及“20K人生长激素(或20KhGH)”时，除SEQ ID NO: 10所示的野生型20KhGH以外，还包括与相对于该序列有1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加而得的序列相当的20KhGH的突变体，其具有生长促进活性。可被取代、缺失和/或添加的氨基酸的个数根据各突变类型优选为1～8个、更优选为1～4个、进一步优选为1～2个。这里，20KhGH突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO: 10所示的野生型20KhGH的氨基酸序列优选具有85%以上的同一性、更优选90%以上的同一性、进一步优选95%以上的同一性。
在本发明中，各种hGH突变体中的与普通野生型hGH比较时的各突变的位置及其形式(缺失、取代、添加)可通过两个hGH的氨基酸序列的比对容易地确认。需要说明的是，在本发明中，野生型hGH的氨基酸序列与加入了突变的hGH的氨基酸序列的同一性可利用周知的相似性计算算法容易地算出。作为这样的算法，例如有BLAST (Altschul SF. J Mol.Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson和Lipman的类似性检索法(Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 85. 2444 (1988))、Smith和Waterman的局部相似性算法(Adv. Appl. Math.2. 482-9 (1981))等。
上述hGH氨基酸序列中的氨基酸用其他氨基酸进行的取代例如发生在氨基酸家族内，该氨基酸家族内的氨基酸在它们的侧链和化学性质方面具有关联性。预测这样的氨基酸家族内的取代不会给hGH的功能带来大的改变(即，为保守的氨基酸取代)。作为这样的氨基酸家族，例如有以下的氨基酸家族：
(1) 作为酸性氨基酸的天冬氨酸和谷氨酸；
(2) 作为碱性氨基酸的组氨酸、赖氨酸和精氨酸；
(3) 作为芳族氨基酸的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；
(4) 作为具有羟基的氨基酸(羟基氨基酸)的丝氨酸和苏氨酸；
(5) 作为疏水性氨基酸的蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
(6) 作为中性亲水性氨基酸的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；
(7) 作为影响肽链取向的氨基酸的甘氨酸和脯氨酸；
(8) 作为酰胺型氨基酸(极性氨基酸)的天冬酰胺和谷氨酰胺；
(9) 作为脂肪族氨基酸的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
(10) 作为侧链小的氨基酸的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；
(11) 作为侧链特别小的氨基酸的丙氨酸和甘氨酸。
含有分子量约22KD的hGH作为有效成分的制剂(hGH制剂)作为生长激素分泌缺乏性身材矮小症、Turner综合征中的身材矮小、SGA性身材矮小症、Noonan综合征中的身材矮小症、由慢性肾功能不全引起的身材矮小症、Prader-Willi综合征中的身材矮小症、以及软骨营养不良中的身材矮小症的治疗药在临床上广泛应用，所述hGH是使用引入了hGH基因的大肠杆菌以重组蛋白的形式制造的。在这些疾病中不伴有骨骺线闭合的情况下，hGH制剂特别取得效果。通过对皮下或肌肉内给予hGH制剂，成分hGH在血中循环，通过其生长促进活性发挥促进患者生长的效果。另外，hGH制剂还作为成人生长激素分泌缺乏症的治疗药在临床上广泛应用。虽然在成人生长激素分泌缺乏症患者中观察到脂质代谢异常，但通过给予hGH制剂，患者的脂质代谢等正常化，患者的QOL得到改善。生长激素还作为由AIDS引起的消瘦的治疗药在临床上应用。作为生长激素分泌缺乏性身材矮小症、成人生长激素分泌缺乏症等的hGH制剂，例如有Growject (注册商标)。
在制作HSA突变体与hGH的融合蛋白的情况下，作为使包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽与包含hGH的氨基酸序列的多肽结合的具体方法，例如通常是下述方法：制作在编码一个多肽的基因的下游插入了在框内结合有编码另一个多肽的基因的DNA片段的表达载体，对使用该表达载体而转化的宿主细胞进行培养，从而以重组蛋白的形式表达，该方法可在本发明中利用。
在利用以重组蛋白的形式在转化细胞中表达的方法制作HSA突变体与hGH的融合蛋白时，包含hGH的氨基酸序列的多肽直接或经由接头间接地与包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端侧或C末端侧的任一末端结合。
在使包含hGH的氨基酸序列的多肽与包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的N末端侧结合的情况下，使用在编码包含hGH的氨基酸序列的多肽的基因的下游插入有DNA片段的表达载体，该DNA片段在框内结合有编码包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因。在使2个多肽经由肽接头间接地结合的情况下，在编码2个多肽的基因之间在框内配置编码该接头的DNA序列。
在使包含hGH的氨基酸序列的多肽与包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的C末端侧结合的情况下，使用在编码包含hGH的氨基酸序列的多肽的基因的上游插入有DNA片段的表达载体，该DNA片段在框内结合有编码包含HSA突变体的氨基酸序列的多肽的基因。在使2个多肽经由肽接头间接地结合的情况下，在编码2个多肽的基因之间在框内配置编码该接头的DNA序列。
本发明中，作为HSA突变体与hGH的融合蛋白(HSA-hGH融合蛋白的一种)的适合的一例，可列举：具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列的HSA-hGH融合蛋白，其是在具有SEQID NO: 3所示的氨基酸序列的HSA (A320T)的N末端不经由接头而通过肽键结合有具有SEQID NO: 9所示的氨基酸序列的22K人生长激素的C末端的融合蛋白。本发明中，将使HSA(A320T)与22KhGH依次结合而成的融合蛋白称为“22K人生长激素-mHSA”或“22KhGH-mHSA”。同样，将在HSA (A320T)的C末端不经由接头而通过肽键结合有22K人生长激素的N末端的融合蛋白称为“mHSA-22K人生长激素”或“mHSA-22KhGH”。
另外，将在具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的人血清白蛋白(A320T)的N末端不经由接头而通过肽键结合有具有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的20K人生长激素的C末端的融合蛋白、即具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的HSA-hGH融合蛋白称为“20K人生长激素-mHSA”或“20KhGH-mHSA”。同样，将在人血清白蛋白(A320T)的C末端不经由接头而通过肽键结合有20K人生长激素的N末端的融合蛋白称为“mHSA-20K人生长激素”或“mHSA-20KhGH”。
在本发明中，HSA-hGH融合蛋白的特征在于：通过皮下注射对食蟹猴给药时的血中半衰期(t1/2 β)大约为5小时以上，在血中非常稳定。虽然根据给药量而变化，但例如以4mg/kg的剂量对雄性食蟹猴单次皮下给药时，mHSA-22KhGH和22KhGH-mHSA的血中半衰期(t1/2 β)为20～35小时。
本发明中的HSA-hGH融合蛋白可用作药物。HSA-hGH融合蛋白可使人生长激素和HSA的功能在生物体内协同作用。
本发明中的HSA-hGH融合蛋白在血中非常稳定。因此，根据本发明，可使人生长激素在血中稳定化，以长时间保持活性的状态滞留在血中。因此，该融合蛋白在用作药物的情况下，与人生长激素相比可减少给药频率或/和给药量。例如，人生长激素需要每天给药，但如果是该融合蛋白，则也可将给药频率设为例如每3～30天。另外，还可将治疗期间的药物总给药量例如以摩尔比计减少至1/3以下(例如1/3～1/10)。
本发明中的HSA-hGH融合蛋白可用作以生长激素分泌缺乏性身材矮小症、Turner综合征中的身材矮小、由慢性肾功能不全引起的身材矮小症、Prader-Willi综合征中的身材矮小症、软骨营养不良中的身材矮小症、SGA性身材矮小症、或Noonan综合征中的身材矮小症为对象疾病的药物。在这些疾病中不伴有骨骺线闭合的情况下，hGH制剂特别取得效果。此外，本发明中的HSA-hGH融合蛋白还可用作以成人生长激素分泌缺乏症、由AIDS引起的消瘦和由厌食症引起的消瘦为对象疾病的药物，但并不限于此，可用作通过使生长激素所具有的软骨形成促进、蛋白同化促进等生长促进活性、身体组成和脂质代谢改善作用等生理活性长期地作用而可改善症状的疾病的治疗药。
对以治疗为目的对人给予22KhGH-mHSA时的用法剂量没有特别限定，只要显示hGH的药效即可。以下，示例22KhGH-mHSA的用法剂量，但用法剂量并不限于这些。
在对不伴有骨骺线闭合的生长激素分泌缺乏性身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.01～0.7mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的Turner综合征中的身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.015～1.4mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的由慢性肾功能不全引起的身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.01～1.4mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的Prader-Willi综合征中的身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.012～0.98mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的软骨营养不良中的身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.015～1.4mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的SGA性身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.012～1.9mg/Kg体重。在对成人生长激素分泌缺乏症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.001～0.34mg/Kg体重。在对不伴有骨骺线闭合的Noonan综合征中的身材矮小症患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.013～1.8mg/Kg体重。在对因AIDS而消瘦的患者给予22KhGH-mHSA的情况下，每次的优选给药量为0.005～0.4mg/Kg体重。然而，给药量应该根据患者的检查所见等适当变更。另外，这些疾病中的优选的22KhGH-mHSA的给药间隔为每7～30天1次，应根据患者的检查所见等适当变更为每7～14天、每10～20天或每14～21天1次。另外，给药方法优选为皮下注射、肌肉内注射或静脉注射，更优选为皮下注射或肌肉内注射。
本发明中的水性药物组合物是含有作为有效成分的使血清白蛋白与生长激素结合而得的蛋白、防腐剂、主要作为稳定化剂的蔗糖和非离子性表面活性剂、以及作为pH调节剂的缓冲剂而构成的。
水性药物组合物中所含的使血清白蛋白与生长激素结合而得的蛋白(特别是22KhGH-mHSA)的浓度优选为10～100mg/mL、更优选为15～70mg/mL、进一步优选为30～65mg/mL、更进一步优选为40～60mg/mL、例如为50mg/mL。
作为水性药物组合物中所含的防腐剂，只要是药剂学上可接受的防腐剂即可，没有特别限定，优选苯酚。在使用苯酚作为防腐剂的情况下，水性药物组合物中所含的苯酚的浓度优选为0.5～12mg/mL、更优选为3～9mg/mL、进一步优选为4～8mg/mL、更进一步优选为5～7mg/mL、例如为6mg/mL。
水性药物组合物中所含的蔗糖的浓度优选为10～150mg/mL、更优选为50～100mg/mL、进一步优选为60～90mg/mL、更进一步优选为70～80mg/mL、例如为75mg/mL。
作为水性药物组合物中所含的非离子性表面活性剂，可将聚山梨醇酯或泊洛沙姆等单独或将它们组合使用。作为聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80特别适合，作为泊洛沙姆，泊洛沙姆188 (聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)特别适合。另外，水性药物组合物中所含的非离子性表面活性剂的浓度优选为0.15～10mg/mL、更优选为1.0～4.5mg/mL、进一步优选为1.5～4.5mg/mL、更进一步优选为2～4mg/mL、更进一步优选为2.5～3.5mg/mL、例如为3mg/mL。
水性药物组合物中所含的缓冲剂只要是药剂学上可接受的缓冲剂即可，没有特别限定，优选磷酸缓冲剂。在使用磷酸缓冲剂作为缓冲剂的情况下，水性药物组合物中所含的磷酸缓冲剂的浓度优选为1～30mM、更优选为2～20mM、进一步优选为5～15mM、例如为约10mM。另外，利用缓冲剂调节的水性药物组合物的pH优选为5.0～8.0、更优选为6.0～7.8、进一步优选为6.5～7.6、更进一步优选为7.0～7.4、例如为7.2。另外，水性药物组合物与生理盐水的渗透压比例如调节至1.0～1.3。
作为本发明的水性药物组合物的合适的组成，可列举：使血清白蛋白与生长激素结合而得的蛋白(特别是22KhGH-mHSA)的浓度为10～100mg/mL，防腐剂的浓度为0.5～12mg/mL，蔗糖的浓度为10～150mg/mL，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～10mg/mL，防腐剂的浓度为0.5～12mg/mL，缓冲剂的浓度为1～30mM，pH为5.0～8.0。
作为本发明的水性药物组合物的更合适的组成，可列举：使血清白蛋白与生长激素结合而得的蛋白(特别是22KhGH-mHSA)的浓度为10～100mg/mL，蔗糖的浓度为75mg/mL，聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，苯酚的浓度为6mg/mL，磷酸缓冲剂的浓度为10mM，pH为7.0～7.4。各成分的浓度可分别变更为上述任一种优选的浓度。
作为本发明的水性药物组合物的更合适的组成，可列举：使血清白蛋白与生长激素结合而得的蛋白(特别是22KhGH-mHSA)的浓度为15～70mg/mL，蔗糖的浓度为75mg/mL，聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，苯酚的浓度为6mg/mL，磷酸缓冲剂的浓度为10mM，pH为7.0～7.4。各成分的浓度可分别变更为上述任一种优选的浓度。
含有本发明的HSA-hGH融合蛋白(特别是22KhGH-mHSA)作为有效成分而构成的药物能以注射剂的形式对静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下或脑室内给药。这些注射剂能以冷冻干燥制剂或水性液体制剂(水性药物组合物)的形式供给。在制成水性液体制剂的情况下，可以是填充至小瓶中的形态，也可制成预先填充至注射器中的制剂即预灌封式制剂进行供给。在冷冻干燥制剂的情况下，在临用前溶于水性介质中进行复原后使用。
实施例
以下，参照实施例来更详细地说明本发明，但并不意图本发明受到实施例的限定。
[实施例1] 22KhGH-HSA表达用载体的构建
将使22KhGH的C末端与野生型HSA (SEQ ID NO: 1)的N末端结合而成的、具有SEQID NO: 15所示的氨基酸序列的蛋白作为22KhGH-HSA。SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列中，第1～191位的氨基酸残基相当于22KhGH的氨基酸序列，第192～776位的氨基酸残基相当于HSA的氨基酸序列。化学合成了包含编码22KhGH-HSA的基因(22KhGH-HSA基因)的、具有SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的DNA。在该序列中，碱基11～88编码hGH的前导肽，碱基89～661编码成熟型hGH，碱基662～2416编码成熟型HSA。将该DNA用限制酶(MluI和NotI)消化，并插入至pE-mIRES-GS-puro的MluI位点与NotI位点之间，从而构建了作为22KhGH-HSA表达用载体的pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-HSA)。需要说明的是，pE-mIRES-GS-puro的制作方法记载于国际专利公报WO2012/063799等中，为人所周知。
[实施例2] 22KhGH-mHSA表达用载体的构建
将使22KhGH (SEQ ID NO: 9)的C末端与HSA (A320T) (SEQ ID NO: 3)的N末端结合而成的、具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列的蛋白作为22KhGH-mHSA。以实施例1中制作的pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-HSA)为模板，使用引物YA082 (SEQ ID NO: 13)和引物YA083 (SEQ ID NO: 14)，通过PCR扩增了包含编码22KhGH-mHSA的基因的DNA片段。使该DNA片段自身退火，构建了作为22KhGH-mHSA表达用载体的pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-mHSA)。
[实施例3] 22KhGH-mHSA表达细胞株的制作
如下操作，制作了用于表达22KhGH-mHSA的细胞。使用Gene Pulser Xcell电穿孔系统(Bio Rad公司)，向来自中国仓鼠卵巢的细胞即CHO-K1细胞中引入了实施例2中制作的作为22KhGH-mHSA表达用载体的pE-mIRES-GS-puro (22KhGH-mHSA)。将已引入表达载体的细胞使用包含16μM胸苷、100μM次黄嘌呤、10mg/L胰岛素、L-蛋氨酸亚砜亚胺(SIGMA公司)和嘌呤霉素(SIGMA公司)的CD OptiCHOTM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)进行选择培养。在选择培养时，使L-蛋氨酸亚砜亚胺和嘌呤霉素的浓度阶段性地提升，最终使L-蛋氨酸亚砜亚胺的浓度为300μM、嘌呤霉素的浓度为10μg/mL，选择性地使显示更高耐药性的细胞增殖。然后，利用临界稀释法在96孔板上接种通过选择培养而选择的细胞，使每1个孔接种1个以下的细胞，直到形成来自单一细胞的集落培养约10天，将细胞克隆化。进一步培养已克隆化的细胞使其增殖后，悬浮于含有16μM胸苷、100μM次黄嘌呤、300μM L-蛋氨酸亚砜亚胺和10% (v/v) DMSO的CD OptiCHOTM培养基中，之后分装到冷冻管中，在液氮中保存。将该细胞作为22KhGH-mHSA表达细胞株。
[实施例4] 22KhGH-mHSA表达细胞的预培养
将实施例3中制作的22KhGH-mHSA表达细胞株在37℃水浴中解冻，悬浮于包含16μM胸苷、100μM次黄嘌呤和300μM L-蛋氨酸亚砜亚胺的无血清培养基的EX-CELL高级培养基(预培养用培养基、SIGMA公司)中，进行离心，使细胞沉淀，去除上清。将已沉淀的细胞以2×105个/mL以上的密度悬浮于预培养用培养基中，在37℃、5% CO2存在下培养2～4天。边扩大培养规模边重复进行该培养，直至细胞数增殖到至少1.0×1011个。
[实施例5] 22KhGH-mHSA表达细胞的生产培养
将通过预培养而增殖的细胞以细胞浓度为4×105个/mL的密度悬浮于200L容量的包含16μM胸苷和100μM次黄嘌呤的无血清培养基即EX-CELL高级培养基(生产培养用培养基、SIGMA公司)中。在Xcellerex 200L培养系统(XDR200)的一次性使用的培养槽内，使用叶轮以100rpm的速度搅拌该悬浮液，同时在37℃、溶解氧量40%、pH维持于6.9的条件下培养10天。
[实施例6] 22KhGH-mHSA的纯化
(纯化工序1：Harvest工序/浓缩1工序)
生产培养结束后，使用Millistak+ (注册商标) HC Pod Filter Grade D0HC(1.1m2×2、Merck公司)过滤培养液，然后使用Millistak+HC Pod Filter Grade X0HC(1.1m2×1、Merck公司)进行过滤以去除细胞，再用Opticap SHC XL3 (孔径：0.5/0.2μm、Merck公司)进行过滤，得到了培养上清。所得的培养上清使用截留分子量30kDa的超滤膜装置(安装有Pellicon 3盒式ULTRAcel PLCTK膜、1.14m2，Merck公司)进行浓缩，该超滤膜装置预先用纯水洗涤后用PBS平衡化。从超滤膜装置回收浓缩后的溶液。再使PBS通过装置内部进行洗涤，将该洗涤液与之前回收的浓缩后的溶液合并，重量调节至约15kg，将其作为浓缩培养液。然后，使用孔径的最大部为0.5μm、最小部为0.2μm的亲水性滤器(Opticap SHCXL600、Merck公司)过滤浓缩培养液。过滤后，确认到浓缩培养液的pH和电导率分别为7.0±0.3、1.2±0.4S/m。
(纯化工序2：第一层析工序(亲和柱层析工序))
将填充有捕获选择人生长激素亲和基质(Thermo Fisher Scientific公司)的QS柱(柱体积：4.2～5.2L，床高：15.0±1.5cm，Merck公司)用柱体积的1倍容量的50mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗涤，再用柱体积的1倍容量的0.01M氢氧化钠水溶液进行洗涤，之后用柱体积的4倍容量的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)进行平衡化。然后，在柱上加载纯化工序1中得到的浓缩培养液的1/4量，使22KhGH-mHSA吸附于柱。然后，用柱体积的5倍容量的含有200mM精氨酸和0.05% (w/v)聚山梨醇酯80的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)洗涤柱，再用柱体积的5倍容量的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)洗涤柱。然后，对柱供给柱体积的5倍容量的50mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)，使22KhGH-mHSA洗脱。洗脱液回收至预先装有洗脱液量的1/5容量的250mM MES缓冲液(pH7.0)的容器中，立即进行中和使pH为6.7±0.3。纯化工序2在4～8℃的低温下进行实施，另外，通过整个纯化工序2后供给至柱的溶液的线性流速设为200cm/小时。另外，每1L的亲和柱载体上所加载的22KhGH-mHSA的上限设为7g。
(纯化工序3：病毒失活工序)
将纯化工序2中得到的洗脱液加热到25℃，在该洗脱液中加入其液量的1/19容量的含有20.0% (w/v)聚山梨醇酯80的6.0% (v/v)的磷酸三正丁酯水溶液，在25℃下搅拌3小时。
(纯化工序4：第二层析工序(羟磷灰石柱层析工序))
将通过纯化工序3进行了病毒失活处理的组分冷却至8℃，适量加入1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.8)和含有4M NaCl的20mM MES缓冲液(pH7.0)，将pH和电导率分别调节至7.0±0.1和0.6±0.1S/m，使用孔径0.2μm的亲水性滤器(Merck公司)进行过滤。然后，在冷蔵(线性流速：200cm/小时)下实施以下的层析。
将填充有作为羟磷灰石载体的CHT II型(40μm) (Bio-Rad Laboratories公司)的QS柱(柱体积：8.8～10.8L、床高：20.0±2.0cm、Merck公司)用200mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，然后用1M的NaOH水溶液进行洗涤，再用200mM的磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，之后用4倍容量的含有50mM NaCl和1mM磷酸二氢钠的20mM MES缓冲液(pH7.0)进行平衡化。然后，将上述滤液加载到柱上，使22KhGH-mHSA吸附于柱。然后，用3倍容量的含有50mM NaCl和1mM磷酸二氢钠的20mM MES缓冲液(pH7.0)洗涤柱。然后，对柱供给含有50mM NaCl和30mM磷酸二氢钠的20mM MES缓冲液(pH7.0)，使22KhGH-mHSA洗脱。纯化工序4在4～8℃的低温下进行实施，另外，通过整个纯化工序4后供给至柱的溶液的线性流速设为200cm/小时。另外，每1L的羟磷灰石载体上所加载的22KhGH-mHSA的上限设为13g。
(纯化工序5：第三层析工序(多模式弱阳离子交换柱层析工序))
在通过纯化工序4得到的洗脱液中添加与其等体积的含有50mM NaCl的20mM MES缓冲液(pH5.7)，之后添加稀盐酸，将pH和电导率分别调节至5.7±0.1、0.7±0.1S/m。之后，使用孔径0.5/0.2μm的亲水性滤器(Merck公司)进行过滤。
将预填充柱RTP Capto MMC 10L (柱体积：8.8～10.8 L，床高：20.0±2.0cm，Merck公司)使用1M NaOH水溶液进行洗涤，然后使用含有1M NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，之后用4倍容量的含有100mM NaCl的50mMMES缓冲液(pH5.7)进行平衡化。然后，将上述滤液加载到柱上，使22KhGH-mHSA吸附于柱。然后，用5倍容量的含有100mMNaCl的50mM MES缓冲液(pH5.7)洗涤柱。然后，对柱供给含有550mM NaCl的50mM MES缓冲液(pH5.7)，使22KhGH-mHSA洗脱。纯化工序5在4～8℃的低温下进行实施，另外，通过整个纯化工序5后供给至柱的溶液的线性流速设为200cm/小时。另外，每1L的多模式弱阳离子交换载体上所加载的22KhGH-mHSA的上限设为11.5g。
(纯化工序6：浓缩2工序)
对截留分子量30kDa的超滤膜(Pellicon 3盒式ULTRAcel PLCTK膜、1.14m2，Merck公司)通入纯水以充分地进行洗涤，之后用含有75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行平衡化。将纯化工序5中得到的洗脱液使用该超滤膜进行浓缩。在浓缩后的溶液中添加含有75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)，将280nm的吸光度调节至23±3。该浓缩工序在室温下进行实施。
(纯化工序7：第四层析工序(尺寸排阻柱层析工序))
使用孔径0.5/0.2μm的亲水性滤器(Merck公司)过滤纯化工序6中得到的浓缩液。将填充有尺寸排阻层析用树脂即FractogelTM BioSEC树脂(Merck公司)的QS柱(柱体积：25.4～31.1L，床高：40.0±4.0cm，Merck公司)用0.5M NaOH水溶液进行洗涤后，用含有75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行平衡化。然后，将上述滤液加载到柱上，接下来供给含有75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)。此时，在来自尺寸排阻柱的洗脱液的流路上配置用于连续地测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm下显示吸收峰的组分作为包含22KhGH-mHSA的组分，将其作为22KhGH-mHSA纯品。纯化工序7在室温下进行实施，另外，通过整个纯化工序7后供给至柱的溶液的线性流速设为30cm/小时以下。另外，加载到多模式弱阳离子交换载体上的含有22KhGH-mHSA的滤液的液量设为载体体积的8%以下。
(纯化工序8：浓缩3工序)
使用含有75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)将中空丝膜(ReadyToProcessHollow Fiber Cartridge，截留分子量30kDa，GE Healthcare公司)进行平衡化。使用该中空丝膜浓缩纯化工序7中得到的22KhGH-mHSA纯品，将22KhGH-mHSA的浓度调节至85mg/mL。在所得的浓缩液中添加其液量的1/29容量的含有90mg/mL泊洛沙姆(Poloxamer) 188和75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行混合，使用孔径0.5/0.2μm的亲水性滤器(Merck公司)进行过滤。该浓缩工序在室温下进行实施。
(纯化工序9：病毒去除工序)
制作了含有3mg/mL泊洛沙姆188和75mg/mL蔗糖的10mM磷酸缓冲液(pH7.2)。使用该缓冲液将病毒去除膜(Planova 20N，膜面积：0.12m2，材质：再生纤维素，旭化成医疗公司)进行平衡化。在压力98kPa以下，使纯化工序8中得到的滤液通过该病毒去除膜进行过滤。该病毒去除工序在室温下进行实施。
(纯化工序10：原药化工序)
在室温下，用孔径0.2μm的亲水性滤器(Merck公司)过滤纯化工序9中得到的滤液，作为22KhGH-mHSA原药。
[实施例7] 含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的稳定性的探讨1
使用实施例6中得到的22KhGH-mHSA原药，调制了具有表1所示组成的6种水性药物组合物(配方1-1～1-6)，这些药物组合物均含有15mg/mL的22KhGH-mHSA和20mM的磷酸缓冲剂，且pH不同。
[表1]
表1 水性药物组合物(配方1-1～1-6)的组成
将上述6种水性药物组合物的各1.5mL分别填充在玻璃制小瓶中，在暗处、于5℃下静置保存1周、或于40℃下静置保存1周。静置后，通过实施例13中所示的SE-HPLC分析测定了各溶液中所含的22KhGH-mHSA的单体、其聚合物、及其分解物即低分子物的比率。其结果见表2。这里，预先将在暗处、于5℃下静置1周、和于40℃下静置1周后的溶液中所含的聚合物和低分子物的比率均为约2%以下规定为稳定的水性药物组合物的条件。表2的结果显示：在该测定条件下，为了得到22KhGH-mHSA的稳定的水性药物组合物，优选将pH设为6.0以上，特别优选将pH设为6.5～7.5。
[表2]
[实施例8] 含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的稳定性的探讨2
使用实施例6中得到的22KhGH-mHSA原药，调制了具有表3所示组成的3种水性药物组合物(配方2-1～2-3)，这些药物组合物均含有15mg/mL的22KhGH-mHSA和20mM的磷酸缓冲剂、且蔗糖和氯化钠的浓度不同。所有溶液的pH均调节至7.0、渗透压比均调节至约1.0。使用蛋白物性分析装置(Optim1000、AVACTA公司)，在比色皿(cuvette) (UNi、UNCHAINEDLABS公司)中装入9μL测定样品，将比色皿(cuvette)从20.0℃以每次1℃加热到96.0℃，针对各温度测定了波长473nm处的静态光散射强度。
[表3]
表3 水性药物组合物(配方2-1～2-3)的组成
静态光散射强度的测定结果的曲线图见图1。图1中，纵轴表示静态光散射强度，该静态光散射强度与溶液中所含的蛋白发生聚集而产生的微粒的浓度之间处于正相关关系。在配方2-1～2-3中开始发生聚集的温度几乎相同，但存在以下倾向：氯化钠的浓度越高，通过提升温度而产生的微粒的量就越多。因此，为了抑制溶液中所含的22KhGH-mHSA的凝集，作为水性药物组合物中添加的赋形剂，可以说蔗糖比氯化钠更优选。
[实施例9] 含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的稳定性的探讨3
使用实施例6中得到的22KhGH-mHSA原药，调制了具有表4所示组成的6种水性药物组合物(配方3-1～3-6)，这些药物组合物均含有35mg/mL的22KhGH-mHSA、20mM的磷酸缓冲剂和70mg/mL的蔗糖，且非离子性表面活性剂(泊洛沙姆188)的浓度不同。所有溶液的pH均调节至7.2、渗透压比均调节至约1.0。
[表4]
表4 水性药物组合物(配方3-1～3-6)的组成
将上述6种水性药物组合物的各1mL分别填充在玻璃制小瓶中，在室温环境下以240往返/分钟振荡24小时。通过实施例13所示的SE-HPLC分析测定振荡前和振荡后的各溶液中所含的聚合物在22KhGH-mHSA整体中所占的比率，求出从振荡后的聚合物含量(%)中减去振荡前的聚合物含量(%)后的值，以该值作为聚合物增加量(%)。其结果见表5。在该条件下，通过使泊洛沙姆188的浓度为1.0mg/mL以上，可抑制聚合物的生成，通过使其浓度为1.5mg/mL以上，可基本上抑制聚合物的生成。需要说明的是，在不含泊洛沙姆188的配方3-1中，因生成了大量聚合物，故无法得到测定值。
[表5]
表5 水性药物组合物(配方3-1～3-6)中的表面活性剂的浓度与振荡所产生的影响的关系
然后，将22KhGH-mHSA的浓度设为130mg/mL，调制了具有表6所示组成的5种水性药物组合物(配方4-1～4-5)，这些药物组合物均含有20mM的磷酸缓冲剂和70mg/mL的蔗糖、且非离子性表面活性剂(泊洛沙姆188)的浓度不同。所有溶液的pH均调节至7.2、渗透压比均调节至约1.0。
[表6]
表6 水性药物组合物(配方4-1～4-5)的组成
将上述5种水性药物组合物的各0.8mL分别填充在玻璃制小瓶中，在室温环境下以240往返/分钟振荡24小时。振荡后，通过实施例13所示的SE-HPLC分析测定了各溶液中所含的聚合物和低分子物在22KhGH-mHSA整体中所占的比率。其结果见表7。在配方4-1～4-5中，聚合物含量(%)和低分子物含量(%)的值与振荡前的值相比几乎均无变化(未显示振荡前的数据)，在所有配方中聚合物含量(%)和低分子物含量(%)的值均同等。
[表7]
表7 水性药物组合物(配方4-1～4-5)中的表面活性剂的浓度与振荡所产生的影响的关系
[实施例10] 含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的稳定性的探讨4
使用实施例6中得到的22KhGH-mHSA原药，调制了具有表8所示组成的3种水性药物组合物(配方5-1～5-3)，这些药物组合物均含有35mg/mL的22KhGH-mHSA、20mM的磷酸缓冲剂、70mg/mL的蔗糖、1.0mg/mL的非离子性表面活性剂(泊洛沙姆188)和作为防腐剂的3.3mg/mL的苯酚，且pH不同。
[表8]
表8 水性药物组合物(配方5-1～5-3)的组成
将上述3种水性药物组合物的各1mL分别填充在玻璃制小瓶中，在暗处、于5℃或25℃下静置保存2个月。对于在5℃下静置的水性药物组合物在2周后、1个月后和2个月后、而对于在25℃下静置的水性药物组合物在1个月后和2个月后进行了实施例13中记载的SE-HPLC分析和实施例15中记载的微粒数分析。其结果见表9。
从通过SE-HPLC测定而得到的聚合物含量来看，在调节至pH7.2的配方5-3中，在5℃下静置1个月的情况下、在25℃下静置2个月的情况下几乎均无变化。另一方面，在调节至pH6.2的配方5-1中，在5℃下静置1个月的情况下、在25℃下静置2个月的情况下均观察到聚合物的含量随时间而增加。另外，在调节至pH6.7的配方5-2中，在5℃下静置1个月的情况下聚合物的含量没有变化，但在25℃下静置2个月的情况下观察到聚合物随时间而增加。从通过SE-HPLC测定而得到的低分子物含量来看，在5℃下静置1个月的情况下，配方5-1～5-3几乎均无变化。另一方面，在25℃下静置2个月的情况下，在所有配方中均观察到低分子物含量的增加，但其程度轻微。从微粒数分析来看，与配方5-1和5-2相比，在调节至pH7.2的配方5-3中，10μm以上和25μm以上的微粒数大幅减少。
[表9]
[实施例11] 水性药物组合物的制剂设计
根据上述实施例7～10所示的结果，作为含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的制剂配方的合适配方的一例，可设计具有表10所示组成的配方(配方6)，其含有50mg/mL的22KhGH-mHSA、10mM的磷酸缓冲剂、75mg/mL的蔗糖、3mg/mL的泊洛沙姆188和6mg/mL的苯酚，pH调节至7.2、渗透压比调节至约1.0。可将该水性药物组合物以0.5～10mL的液量填充/封入在玻璃制或塑料制的小瓶、安瓿或注射器中。预先填充至注射器中的水性药物组合物也能以预灌封式制剂的形式供给。保存温度优选为2～10℃、例如为4℃，设想在可记录温度的冷藏库中保存。
[表10]
表10 水性药物组合物(配方6)的组成
| 成分 | 配方6 |
| 22KhGH-mHSA | 50mg/mL |
| 磷酸缓冲剂 | 10mM |
| 蔗糖 | 75mg/mL |
| 泊洛沙姆188 | 3mg/mL |
| 苯酚 | 6mg/mL |
| 盐酸或氢氧化钠 | 适量 |
| pH | 7.2 |
[实施例12] 含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物的稳定性的探讨5
调制具有表10所示组成的配方6的水性药物组合物，取1.7mL填充至硼硅酸玻璃制针筒中，在暗处、于5℃下静置保存12个月。于3个月后、6个月后和12个月后进行了实施例14中记载的性状试验、实施例16中记载的不溶性异物检查和pH测定、实施例13中记载的SE-HPLC分析、实施例15中记载的微粒数分析、以及实施例17中记载的22KhGH-mHSA定量。其结果见表11。所有检查值均无大的变化，可知配方6作为含有22KhGH-mHSA的水性药物组合物可稳定至少12个月。需要说明的是，表11中，定量法(相对于理论值(%))表示以调制配方6时的22KhGH-mHSA的量为100%时的实际定量值(%)。
[表11]
表11 水性药物组合物(配方6)的针筒制剂的稳定性试验结果
[实施例13] SE-HPLC分析(采用了SE-HPLC的22KhGH-mHSA的聚合物、单体和低分子物含量的测定)
将磷酸二氢钠二水合物和氯化钠溶于水，调制了含有0.1M磷酸、0.2M氯化钠的磷酸盐缓冲液。另外，调制与作为试验对象的各水性药物组合物为相同组成、且不含22KhGH-mHSA和苯酚的溶液，将其作为样品稀释液。
使用样品稀释液来调节作为试验对象的水性药物组合物使蛋白浓度为2.0mg/mL，作为样品溶液。
使用HPLC装置(LC-20A、岛津制作所公司)和柱(TSKgel G3000SWXL，Tosho公司)，在下述表12所示的条件下进行测定。然而，关于流量，未必限于表12所示的条件，适当调节使主峰的保留时间为12分钟附近。代表性的色谱图见图2。在通过样品溶液的测定而得到的色谱图上，以在保留时间12分钟附近检测到的主峰为单体、以在主峰之前检测到的峰为聚合物、以在主峰之后检测到的峰为低分子物，由各峰的面积算出了主峰含量(%)、聚合物含量(%)、低分子物含量(%)。需要说明的是，由于在23.5分钟附近检测到的峰来自苯酚，所以从分析中去除。另外，对于与在通过样品稀释液的测定而得到的色谱图上检测到的峰相同的峰，也从样品溶液的分析中去除。
[表12]
表12 SE-HPLC的条件
[实施例14] 性状试验
使用下述溶液作为比色液。
(1) 色度参比溶液B组(褐色、Sigma-Aldrich公司)；
(2) 色度参比溶液BY组(黄褐色、Sigma-Aldrich公司)；
(3) 色度参比溶液Y组(黄色、Sigma-Aldrich公司)。
对于装入有作为试验对象的水性药物组合物的容器(小瓶等)，采用黑色和白色的背景，从容器侧面进行观察，确认了色调和清澈性。在判断色调时，可使用比色液。
[实施例15] 微粒数的测定
测定条件：使用Flow Sight颗粒图像分析装置(FlowCam VS-1、FLUID IMAGINGTECHNOLOGIES公司)，在下述表13所示的条件下进行测定。使用FlowCell (FC80FV-5、FLUIDIMAGING TECHNOLOGIES公司)，测定了作为试验对象的水性药物组合物中所含的微粒数(个/mL)。关于微粒数，分别测定了具有10μm以上和25μm以上的直径的微粒的个数。
[表13]
表13 微粒数的测定条件
| 样品体积 | 100µL |
| 距最近微粒的距离 | 0µm |
| 流速 | 0.05mL/分钟 |
| AutoImage速率 | 每秒22帧 |
[实施例16] 不溶性异物检查、pH测定和渗透压比测定的方法
关于不溶性异物检查、pH测定和渗透压比测定，利用日本药典所规定的常规方法进行实施。需要说明的是，不溶性异物检查是通过目视确认是否存在容易检测的不溶性异物的检查方法。
[实施例17] 22KhGH-mHSA的定量(Bradford法)
用水稀释浓度已知的22KhGH-mHSA溶液，调制分别含有1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL的22KhGH-mHSA的溶液，分别作为标准溶液1～5。用水稀释作为试验对象的水性药物组合物使蛋白浓度处于0.4～0.8mg/mL的范围，作为样品溶液。
利用考马斯试液进行的反应：取PierceTM考马斯(Bradford)蛋白测定试剂盒(ThermoFisher SCIENTIFIC公司)中所含的Pierce考马斯测定试剂的每5mL到15mL离心管中，采集测定所需的管数。然后，在采集了Pierce考马斯测定试剂的15mL离心管中分别添加各100μL的水(空白用)、标准溶液1～5和样品溶液，颠倒混和后在室温下静置10分钟使其反应。反应后，迅速使用分光光度计(UV-2600、岛津制作所公司)，在测定用比色皿(CELL) (比色皿(cuvette)，光路长10mm、光路宽10mm、Sarstedt公司)中装入2mL以上的测定样品，在波长595nm下进行吸光度测定。以标准溶液1～5的吸光度为Y轴、以理论蛋白浓度为X轴，制作回归曲线(标准曲线)，由样品溶液的吸光度算出蛋白浓度。
产业实用性
根据本发明，可使含有血清白蛋白与生长激素连接而成的蛋白作为有效成分的药物以水性药物组合物的形式在市场上流通。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：野生型人血清白蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 2：人血清白蛋白Redhill的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 3：人血清白蛋白突变体(A320T)的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 4：接头的氨基酸序列的例1；
SEQ ID NO: 5：接头的氨基酸序列的例2；
SEQ ID NO: 6：接头的氨基酸序列的例3；
SEQ ID NO: 7：来自野生型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点的部分核苷酸序列；
SEQ ID NO: 8：来自突变型小鼠脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点的部分核苷酸序列；合成
SEQ ID NO: 9：22K人生长激素的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 10：20K人生长激素的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 11：22KhGH-mHSA的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 12：20KhGH-mHSA的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 13：引物YA082、合成序列；
SEQ ID NO: 14：引物YA083、合成序列；
SEQ ID NO: 15：22KhGH-HSA的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 16：包含22KhGH-HSA基因的核苷酸序列、合成序列。
Claims (6)
1.水性药物组合物，其是含有人血清白蛋白与人生长激素的融合蛋白作为有效成分而构成的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为10～100mg/mL，蔗糖的浓度为50～100mg/mL，聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为1.5～4.5mg/mL，苯酚的浓度为3～9mg/mL，磷酸缓冲剂的浓度为1～30mM，pH为7.0～7.6，且该融合蛋白的氨基酸序列是具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的序列。
2.权利要求1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为15～70mg/mL。
3.权利要求1所述的水性药物组合物，其中，该磷酸缓冲剂的浓度为2～20mM。
4.权利要求1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为10～100mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该苯酚的浓度为6mg/mL，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
5.权利要求1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为15～70mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该苯酚的浓度为6mg/mL，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
6.权利要求1所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为50mg/mL，该蔗糖的浓度为75mg/mL，该聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的浓度为3mg/mL，该苯酚的浓度为6mg/mL，该磷酸缓冲剂的浓度为10mM，该pH为7.0～7.4。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019-197978 | 2019-10-30 | ||
| JP2019197978 | 2019-10-30 | ||
| PCT/JP2020/040560 WO2021085518A1 (ja) | 2019-10-30 | 2020-10-29 | 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114728043A CN114728043A (zh) | 2022-07-08 |
| CN114728043B true CN114728043B (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=75713571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080076140.0A Active CN114728043B (zh) | 2019-10-30 | 2020-10-29 | 含有血清白蛋白与生长激素的融合蛋白的水性药物组合物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220378882A1 (zh) |
| EP (1) | EP4059512A4 (zh) |
| JP (1) | JP2021070700A (zh) |
| KR (1) | KR20220095204A (zh) |
| CN (1) | CN114728043B (zh) |
| TW (1) | TW202131944A (zh) |
| WO (1) | WO2021085518A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20240132566A1 (en) * | 2019-10-16 | 2024-04-25 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for producing fusion protein of serum albumin and growth hormone |
| CN115845079B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-07-18 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1515591A (zh) * | 1995-12-30 | 2004-07-28 | \ | 生长激素和血清白蛋白重组融合蛋白 |
| WO2012008779A2 (en) * | 2010-07-14 | 2012-01-19 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | A liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate |
| CN109851674A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-06-07 | 天津林达生物科技有限公司 | 一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001266557A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| CN102612376A (zh) | 2009-08-06 | 2012-07-25 | 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 | 具有延长的体内功效的生长激素 |
| SI2525834T1 (sl) | 2010-01-22 | 2019-10-30 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Rastni hormoni s podaljšano in vivo učinkovitostjo |
| US20130244231A1 (en) | 2010-11-08 | 2013-09-19 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Novel expression vector |
| US9657310B2 (en) | 2012-04-27 | 2017-05-23 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Expression vector |
| US20160015789A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-21 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | FORMULATIONS OF AN ALBUMIN hGH FUSION PROTEIN |
| ES2861059T3 (es) * | 2015-09-08 | 2021-10-05 | Japan Chem Res | Nuevo mutante de la seroalbúmina humana |
| KR20170079409A (ko) * | 2015-12-30 | 2017-07-10 | 한미약품 주식회사 | 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제 |
| US10604779B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-03-31 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of mutant-type human erythropoietin |
| WO2017159540A1 (ja) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Ｊｃｒファーマ株式会社 | 血清アルブミン－２０ｋ成長ホルモン融合タンパク質 |
| CN111278453A (zh) * | 2017-09-07 | 2020-06-12 | Jcr制药股份有限公司 | 水性药物组合物 |
| US20240132566A1 (en) * | 2019-10-16 | 2024-04-25 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for producing fusion protein of serum albumin and growth hormone |
-
2020
- 2020-10-29 US US17/772,908 patent/US20220378882A1/en active Pending
- 2020-10-29 JP JP2020180998A patent/JP2021070700A/ja active Pending
- 2020-10-29 CN CN202080076140.0A patent/CN114728043B/zh active Active
- 2020-10-29 EP EP20881312.1A patent/EP4059512A4/en active Pending
- 2020-10-29 KR KR1020227017996A patent/KR20220095204A/ko unknown
- 2020-10-29 WO PCT/JP2020/040560 patent/WO2021085518A1/ja unknown
- 2020-10-30 TW TW109137787A patent/TW202131944A/zh unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1515591A (zh) * | 1995-12-30 | 2004-07-28 | \ | 生长激素和血清白蛋白重组融合蛋白 |
| WO2012008779A2 (en) * | 2010-07-14 | 2012-01-19 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | A liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate |
| CN109851674A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-06-07 | 天津林达生物科技有限公司 | 一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达;王楠;赵洪亮;刘志敏;刘党生;薛冲;熊向华;;生物技术通讯;20070730(第04期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202131944A (zh) | 2021-09-01 |
| EP4059512A1 (en) | 2022-09-21 |
| WO2021085518A1 (ja) | 2021-05-06 |
| JP2021070700A (ja) | 2021-05-06 |
| CN114728043A (zh) | 2022-07-08 |
| EP4059512A4 (en) | 2023-12-06 |
| US20220378882A1 (en) | 2022-12-01 |
| KR20220095204A (ko) | 2022-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10772963B2 (en) | Etanercept formulations stabilized with xylitol | |
| CN108367072B (zh) | 含抗-pd-l1抗体avelumab的水性药物制剂 | |
| CN104224705B (zh) | 稳定化的液体和冻干的adamts13制剂 | |
| CN107438623B (zh) | 长效的ctp修饰的生长激素多肽的制备方法 | |
| JP5118796B2 (ja) | 二価の金属イオンを利用したＡｐｏ−２リガンドの製造方法 | |
| EP2501367B1 (en) | Formulation for HGH and RHIGF-1 combination | |
| JP7123216B2 (ja) | 新規なヒト血清アルブミン変異体 | |
| CN114728043B (zh) | 含有血清白蛋白与生长激素的融合蛋白的水性药物组合物 | |
| WO2009053106A1 (en) | Parathyroid hormone formulations and uses thereof | |
| EP1978994B1 (en) | Bmp-7 variant compositions, methods and uses | |
| WO2014078627A1 (en) | Liquid formulations for tnfr:fc fusion proteins | |
| US20190336601A1 (en) | Etanercept Formulations Stabilized with Sodium Chloride | |
| CN111329996B (zh) | 重组人生长激素的组合物和其制备方法 | |
| US20240132566A1 (en) | Method for producing fusion protein of serum albumin and growth hormone | |
| EP3431508A1 (en) | Serum albumin-20 k growth hormone fusion protein | |
| TW202217006A (zh) | 血清白蛋白與生長激素之融合蛋白質之製造方法 | |
| CN109563145B (zh) | 长效凝血因子及其制备方法 | |
| KR20160146736A (ko) | Ｈｇｆ의 동결건조 제제 | |
| Gierach et al. | Protein drug production and formulation | |
| TW202306992A (zh) | 第i型黏多醣症之治療用醫藥組成物 | |
| CN114230676A (zh) | 重组hm-3融合蛋白及其应用 | |
| EP4294371A1 (en) | Aqueous composition of an engineered protein construct comprising an fc domain | |
| JP2012532167A (ja) | インターフェロンβの精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |