CN114230676A

CN114230676A - 重组hm-3融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114230676A
Application number: CN202111581908.2A
Authority: CN
Inventors: 李文蕾; 王轶博; 黄瑞晶; 李剑; 曹小丹; 王根辈; 陈妍; 郝瑞家; 张玲; 王莎莎
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114230676B

Abstract

本发明提供了重组HM‑3融合蛋白及其应用，所述重组HM‑3融合蛋白包括第247号氨基酸和/或第249号氨基酸发生突变的HM‑3融合蛋白；所述HM‑3融合蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明还提供了所述重组HM‑3融合蛋白的制备方法，包括：将核酸分子连入表达载体，并导入受体细胞中；培养重组细胞，收集蛋白并进行纯化，得到所述重组HM‑3融合蛋白。本发明通过对HM‑3融合蛋白的部分氨基酸进行突变，有效解决了蛋白断裂的问题，提高了生产及加工的效率，同时不影响重组融合蛋白的结合能力并提高了生物学性能，应用前景广阔。

Description

重组HM-3融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及重组HM-3融合蛋白及其应用。

背景技术

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，如果不进行及时有效的控制，后果十分严重，甚至危害生命。常见的自身免疫性疾病有：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎以及许多种皮肤病以及自身免疫性肝病等等。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持续反复发作，导致关节内软骨受到破坏，关节功能障碍，甚至残废；血管炎病变累积全身各个器官，故本病又称为类风湿病。

以类风湿关节炎为代表的炎性自身免疫性疾病的发病率和致残率高，是影响人类健康和生存质量的重大疾病。TNFα抑制剂是目前类风湿性关节炎治疗的主流生物制剂。然而，TNF抑制剂需与甲氨蝶呤联合使用才能更好地发挥疗效，而部分类风湿性关节炎患者对甲氨蝶呤不耐受，导致此类患者不能使用联合治疗方案。此外，临床统计表明，采用TNFα抑制剂联合治疗方案后仍有约30％～40％的患者对该治疗方案无应答，未能达到主要治疗指标(症状缓解20％)。因此，除类风湿关节炎生物治疗药物的热门靶点TNFα抑制剂外，目前各大主流制药公司还在积极进行JAK抑制剂、白细胞介素抑制剂、炎细胞浸润抑制剂亲环素以及整合素阻断剂的研究，这些药物可与TNFα抑制剂互为补充，为不同类型的类风湿性关节炎患者提供多种用药选择。

新生血管是从一般血管新伸出的螺旋状毛细血管。人体在怀孕等一定条件下，可以出现新的血管，除此之外如果出现新生血管，会引发特定的疾病，这些疾病总称为“新生血管疾病”，如癌症、湿性黄斑变性等等。湿性黄斑变性又被称为新生血管性的黄斑变性，主要临床特征为形成了脉络膜新生血管。

骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎以及肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。

HM-3是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD序列)的18个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGGGRGD(SEQ ID No.1)，其对整合素αvβ3具有高度亲和性，通过阻断整合素αvβ3信号通路、抑制VEGF和TNFα的表达，从而抑制内皮细胞迁移和新生血管的生成，进而抑制RA滑膜增生。小鼠体内急性、亚急性、慢性炎症试验表明：HM-3可同时抑制血管新生和炎症反应、调节胶原型关节炎DBA/1小鼠的滑膜组织VEGF和TNFα含量，有效缓解RA症状，其治疗效果优于甲氨蝶呤。

虽然HM-3分子具有药效明确、安全性好的优势，但该小肽的体内半衰期仅为27.66±7.37min，如应用于临床，则需每日给药1～2次，极大地限制了临床应用。

对分子结构进行修饰或改造是解决半衰期较短、需连续给药问题的常用方法，其中以化学修饰应用最为广泛。中国专利CN102417540A中公开了一种聚乙二醇修饰的HM-3：mPEG-SC-HM-3，其半衰期远远高于HM-3。然而，PEG修饰技术本身存在多种问题：PEG修饰通过覆盖蛋白来降低免疫原性和延长半衰期，因此PEG修饰并不适用于所有蛋白，对于修饰位点不暴露的部分蛋白则无法正常修饰；部分蛋白的活性位点被覆盖导致其活性下降；部分蛋白修饰后构象发生变化导致活性降低或者容易聚集。PEG修饰产物必须通过降解PEG分子逐步暴露药物蛋白，但低分子量的PEG有肾脏毒性，高分子量的PEG体内降解机理不清楚，给PEG修饰药物带来了明显的用药风险。另外，由于PEG修饰涉及复杂的蛋白处理过程，且PEG分子长度存在差异，造成PEG修饰产物的分子量不均一，增加生产成本的同时，降低了成品的均一性，给产业化生产带来困难。

为解决HM-3蛋白体内半衰期短、多肽合成成本高、不适合工业化生产等问题，中国专利CN109879969A提供了一种HM-3-Fc融合蛋白，将其在小鼠体内的半衰期由27min提升至30h以上。然而实际生产过程中发现，HM-3-Fc在使用HEK293F细胞进行瞬时转染、或是使用CHO细胞进行稳定转染时，约40％的HM-3-Fc单体在HM-3多肽的第六个氨基酸Asp后发生断裂。断裂的发生会带来两方面的负面影响，一方面，HM-3是HM-3-Fc融合蛋白的效应分子，发生断裂会使药用活性丧失；另一方面，HM-3-Fc单体断裂前后分子量差异仅1.07kDa，且理化性质非常接近，部分HM-3-Fc单体的断裂会形成3种极难分离的二聚体组合(2个完整单体、1个完整单体1个断裂单体以及2个断裂单体)，严重影响产品的纯度和药效。

因此，如何克服HM-3融合蛋白在表达过程中出现断裂从而影响产品的纯度和药效，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供重组HM-3融合蛋白及其应用，与HM-3融合蛋白相比，重组HM-3融合蛋白可以降低HM-3融合蛋白的断裂，同时不影响其生物及药学活性，改善了生产效率，提高了产品纯度。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了重组HM-3融合蛋白，所述重组HM-3融合蛋白包括第247号氨基酸和/或第249号氨基酸发生突变的HM-3融合蛋白；

所述HM-3融合蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.2：

AESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSIVRRADRAAVPGGGGRGD。

本发明中，野生型HM-3融合蛋白单体(TSL-4)由3部分组成，N端是用于延长半衰期的改构IgG4-Fc，中间使用GGGGS×3Linker作为连接子，C端是作为药效分子的HM-3十八肽。研究发现，HM-3融合蛋白在使用HEK293F细胞进行瞬时转染、或是使用CHO细胞进行稳定转染时，出现断裂的位置具有极高的一致性，纯化样品经过CE-SDS和质谱分子量检测，确认约40％亚基发生断裂，结合蛋白C端测序可以确认断裂位置为HM-3第六个氨基酸Asp后，表明是受到细胞内部某种特定蛋白酶切割导致的。

通过改变蛋白酶识别位点的氨基酸，可以使蛋白酶无法识别、结合、切割，从而阻止断裂的发生。因此，对TSL-4融合蛋白中HM-3部分进行定点突变，既能降低断裂比例，又能维持药效。验证实验表明，对HM-3融合蛋白的第247号氨基酸和/或第249号氨基酸进行突变，未断裂蛋白比例由野生型的约55％提升至86％以上，效果十分显著。

优选地，所述HM-3融合蛋白的第248号氨基酸和/或第250号氨基酸还发生了突变。

本发明中，所述重组HM-3融合蛋白可以与任意其它功能蛋白形成融合蛋白，包括但不限于Fc片段、抗体以及HSA等功能蛋白。

第二方面，本发明提供核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组HM-3融合蛋白。

第三方面，本发明提供表达载体，所述表达载体表达第一方面所述的重组HM-3融合蛋白。

优选地，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的重组HM-3融合蛋白。

优选地，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述重组细胞含有第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种第一方面所述的重组HM-3融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括：

将核酸分子连入表达载体，并导入受体细胞中；

培养重组细胞，收集蛋白并进行纯化，得到所述重组HM-3融合蛋白。

本发明中，经对重组细胞进行表达培养，从细胞培养液中分离蛋白，经过纯化即可得到本发明中的重组HM-3融合蛋白。

优选地，所述表达载体包括哺乳动物表达载体，优选为pcDNA3.4。

优选地，所述受体细胞包括哺乳动物表达细胞，优选为酵母、CHO、SP2/0、BHK或HEK293F中的任意一种，进一步优选为HEK293F或CHO。

优选地，所述纯化的方法包括亲和层析纯化。

优选地，所述亲和层析纯化包括使用Protein A或Protein G亲和层析柱进行纯化。

第六方面，本发明提供一种减少HM-3融合蛋白断裂的方法，所述减少HM-3融合蛋白断裂的方法包括对HM-3融合蛋白的第247号氨基酸和/或第249号氨基酸进行突变。

优选地，所述减少HM-3融合蛋白断裂的方法还包括对HM-3融合蛋白的第248号氨基酸和/或第250号氨基酸进行突变。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面述的重组HM-3融合蛋白。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或调味剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物的剂型包括注射剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂或气雾剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、静脉注射、静脉滴注、皮下注射或肌肉注射中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供第一方面所述的重组HM-3融合蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组细胞或第七方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备疾病预防和/或治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括新生血管疾病、眼部疾病或自身免疫性疾病中的任意一种。

优选地，所述新生血管疾病包括湿性老年黄斑变性或肿瘤转移。

本发明中，所述重组HM-3融合蛋白可以作为眼科用药，在眼部特别是对房水及玻璃体具有药代动力学特性。

优选地，所述自身免疫性疾病包括骨关节炎。

本发明中，所述重组HM-3融合蛋白可以对软骨细胞产生保护作用，并通过软骨细胞的病理学改变，发挥预防和治疗骨关节炎的作用，同时具有药代动力学特性。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对HM-3融合蛋白的第247号氨基酸和/或第249号氨基酸进行突变，制备得到的重组HM-3融合蛋白显著降低了蛋白断裂的比例，未断裂蛋白比例由野生型的约55％提升至86％以上，解决了蛋白断裂的问题，同时提高了细胞表达的产量和纯度，效果十分显著；

(2)本发明中重组HM-3融合蛋白中的氨基酸突变并未影响其结合活性，且具备更佳的抑制血管形成的能力，生物活性更优；所述重组HM-3融合蛋白的生产效率高，容易制备，降低了产品开发的难度及成本，应用价值更高。

附图说明

图1A为CE-SDS的检测结果图片；

图1B为CE-SDS的检测结果图片的主峰部位的放大图；

图2A为TSL-4与αvβ3的亲和力的检测结果图片；

图2B为TSL-26与αvβ3的亲和力的检测结果图片。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料与方法：

聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI，Polysciences,Inc)溶液：使用赛多利斯天平(型号：34590626)按照1g/L的用量称量至无内瓶中，加入无菌水加热至80℃，粉末溶解至澄清后，冷却至室温后利用调整pH至7.0；在生物安全柜内通过0.22μm滤膜过滤后于-20℃冰箱内保存，工作液可保存在2～8℃。

CD 293M无血清培养基(干粉，上海培源生物科技有限公司)：将配制总量95％的室温注射水加入混合容器，边搅拌边将干粉培养基加入到水中，搅拌均匀；逐步添加5M的氢氧化钠调整pH至6.8，搅拌15～30min溶解；每升培养基中加入1.9g碳酸氢钠，搅拌至溶解，缓慢添加氢氧化钠或者盐酸调整pH至6.9±0.1，加水至终体积，搅拌混匀后测定pH；用0.22μm滤膜过滤至无菌容器中，2～8℃保存。

实施例1

本实施例对HM-3融合蛋白及突变型融合蛋白的瞬转表达载体进行设计与合成。

合成HM-3融合蛋白(TSL-4融合蛋白)的编码序列(SEQ ID No.3所示)，连入pcDNA3.4(Invitrogen公司)，构建瞬转载体B1451-TSL-10。

SEQ ID No.3：

gctgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcatcgtccgccgcgcggaccgcgcggcggtcccgggcggcggcggccgcggcgac。

TSL-4融合蛋白使用瞬转载体B1451-TSL-10在HEK293F细胞中瞬时表达，纯化样品经过CE-SDS和质谱分子量检测，确认约40％亚基发生断裂，结合蛋白C端测序可以确认断裂位置为HM-3第六个氨基酸Asp后，断裂位置在HM-3十八肽中的位置为IVRRAD/RAAVPGGGGRGD。

在TSL-4融合蛋白的基础上，将HM-3融合蛋白的第247、248、249和250号氨基酸分别突变为Gly，全基因合成DNA序列与瞬转载体pcDNA3.4连接，形成4种瞬转载体B1451-TSL-26/27/28/49，经过质粒大提、0.22μm无菌滤膜过滤除菌后获得可用于瞬时转染的质粒样品。

突变对应的氨基酸及核苷酸位点如表1和表2所示。

表1

载体编号	蛋白编号	HM-3部分氨基酸序列	备注
				B1451-TSL-10	TSL-4	IVRRAD/RAAVPGGGGRGD	野生型(SEQ ID No.1)
B1451-TSL-26	TSL-26	IV<u>G</u>RAD/RAAVPGGGGRGD	(SEQ ID No.4)
				B1451-TSL-27	TSL-27	IVR<u>G</u>AD/RAAVPGGGGRGD	(SEQ ID No.5)
B1451-TSL-28	TSL-28	IVRR<u>G</u>D/RAAVPGGGGRGD	(SEQ ID No.6)
				B1451-TSL-49	TSL-49	IVRRA<u>G</u>/RAAVPGGGGRGD	(SEQ ID No.7)

表2

实施例2

本实施例进行融合蛋白的表达及纯化，步骤如下：

1.HEK293F细胞(Invitrogen)的培养：

(1)从液氮罐中取出细胞，30～40℃水浴锅(Huber，cc-118A)内快速融化后转移至生物安全柜(Thermo，1300Series A2)内，细胞转入含培养基的离心管中，1000rpm离心5min(Thermo，ST-40)，弃上清后将细胞重悬，转入125mL摇瓶，加入终体积为30mL的培养基(含4mM谷氨酰胺)培养3天；培养条件为：36.5℃，110～130rpm，8.0％CO₂浓度；

(2)从125mL摇瓶中取样0.2mL进行台盼蓝染色(Count star，IC-1000)计数，按照(3～6)×10⁵cells/mL的密度进行传代，根据实验需求进行原瓶传代或者放大传代，可逐级放大至500mL/1L/2L摇瓶，细胞活率在传代过程中需恢复至95％以上，能够正常倍增，满足需求。

2.HEK293F细胞的瞬时转染：

(1)处于对数生长期的细胞进行传代，传代后密度为(3～6)×10⁵cells/mL；

(2)调整细胞密度为1.0×10⁶cells/mL；

(3)取转染终体积1/20的Opti-MEM I Medium(GIBICO)与PEI试剂缓慢混匀待用；

(4)取转染终体积1/20的Opti-MEM I Medium与质粒(1μg/μL)缓慢混匀；

(5)将(3)缓慢加入到(4)中，混合均匀，室温孵育15min；

(6)将孵育后的(5)缓慢滴加至细胞悬液中，转入摇床继续培养；

(7)转染后18～24h内添加胰蛋白胨(OXOID)母液，至终浓度为5g/L；

(8)取1～2mL细胞样品进行中控检测，包括细胞密度、代谢检测、上清液蛋白检测等，并根据葡萄糖检测浓度补充葡萄糖至终浓度为6g/L；

(9)结束培养，检测发酵液中的蛋白浓度，进行纯化。

3.蛋白样品的纯化

(1)发酵液经6500rpm离心20min，去除细胞碎片，收获上清液；

(2)使用亲和层析色谱柱(TOSOH HC-650F)进行纯化，保留时间3.5min；

色谱柱经前处理，Buffer A(20mM PB和0.15mM NaCl，pH 7.4)平衡5CV后，加载离心后的上清液；

上样完毕后继续用Buffer A平衡5CV；

Buffer B(20mM柠檬酸-柠檬酸钠和1M NaCl，pH 5.5)淋洗5CV；

Buffer C(20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 5.5)淋洗5CV；

Buffer D(20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH 3.0～3.5)洗脱5CV，当UV280数值超过50mAU开始收集目标蛋白，当UV280数值低于50mAU停止收集目标蛋白。

经过上述操作，成功获得纯化后的上述融合蛋白，可进行后续的检测分析。

实施例3

本实施例对纯化得到的融合蛋白的质量进行检测。

SEC-HPLC检测浓度及纯度

方法如下：

样品前处理：发酵液样品使用0.22μm滤器过滤；纯化样品稀释至浓度为1mg/mL，浓度小于1mg/mL的样品无需前处理。

流动相：0.03M二水合磷酸氢二钠、0.02M二水合磷酸二氢钠和0.4M氯化钠，pH7.0，0.22μm滤膜抽滤，超声脱气5min。

HPLC条件：检测波长280nm，柱温25℃，样品池温度4℃，进样体积10μL，流速0.5mL/min进行等度洗脱，时间30min。

纯化后的融合蛋白的浓度和纯度的检测结果如表3所示，可以看出TSL-27纯度不佳，TSL-4/26/28/49纯度超过99％，质量较好。

表3不同蛋白的浓度及纯度结果

CE-SDS检测纯度

使用脱盐离心管对样品进行脱盐，至盐浓度小于50mM，用蒸馏水或者二纯水将脱盐后的样品稀释至4mg/mL。

制备还原切糖样品：取15μL样品，加入41μL SDS样品液、1μL的10kDa内标和3μLβ-巯基乙醇，70℃水浴加热10min，加入5μL糖苷酶，37℃水浴加热1h，取50μL上样。

CE-SDS的检测结果如图1A所示，主峰部位的放大图如图1B所示。还原切糖样品的主峰面积、校正峰面积的百分比即为纯度。不同融合蛋白纯化后的蛋白纯度如表4所示，其中TSL-27/49的纯度最低，TSL-4仅55.4％的蛋白未发生断裂，TSL-26纯度最高为96.7％。

表4蛋白的CE-SDS纯度

样品名称	还原切糖CE-SDS纯度(％)
		对照(TSL-4)	55.4
TSL-26	96.7
		TSL-27	14.7
TSL-28	86.3
		TSL-49	23.3

实施例4

本实施例对融合蛋白与αvβ3抗原的亲和力进行检测，步骤如下：

将αvβ3(购自R&D)干粉用1×HBS-N缓冲液溶解至0.2mg/mL，用离心式脱盐柱(Thermo fisher，Pierce-89882)将溶解后的αvβ3换液至缓冲液(0.01M HEPES，0.15MNaCl，0.05％表面活性剂P20，1mM MnCl₂和1mM MgCl₂，pH 7.4)中，换液后的αvβ3的浓度用NanoDrop 2000测量。

CM5芯片(GE Healthcare)使用活化剂(400mM EDC与100mM NHS等比例混合)活化420s，流速为10μL/min。

用10mM NaAc(pH 4.5)稀释抗人Fc IgG(Jackson)至30μg/mL，并以10μL/min的速度同时注射到芯片的通道channel 1-8上，进样时间为420s，使抗人Fc IgG通过氨基与芯片偶联，最后用1M乙醇胺-HCl封闭芯片420s，流速为10μL/min。

用缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，0.05％表面活性剂P20，1mM MnCl₂和1mMMgCl₂，pH 7.4)分别稀释hIgG4同型对照(WuXi Biologics)、TSL-4和TSL-26。hIgG4同型对照和待测蛋白以10μL/min的流速分别注射到通道Fc1和Fc2上，结合时间为25s。

分析物αvβ3用相同的缓冲液稀释至5(25、50、100、200和400nM)或7(6.25、12.5、25、50、100、200和400nM)个浓度，使不同浓度的分析物和缓冲液依次流经芯片通道Fc1和Fc2上，进样速度为30μL/min。样品结合时间为60s，解离时间为60s。每次结合解离后，芯片表面用10mM甘氨酸(pH 1.5)进行再生，再生时间为60s，进样流速为30μL/min。

结合解离曲线是扣除参比通道(Fc1)和缓冲液通道后的结果。实验数据用1:1结合模式拟合得到结合速率常数ka、解离速率常数kd和亲和力常数KD。计算摩尔浓度时所用的αvβ3的分子量为191.3kDa。检测结果如图2A、图2B和表5所示。

表5亲和力检测结果数据统计

由上述结果可知，TSL-4、TSL-26与αvβ3之间的亲和力相当，分别为3.38E-07M和2.75E-07M。由此可知，在改变个别氨基酸解决了分子断裂问题的基础上，并未影响融合蛋白与靶点αvβ3的结合。

实施例5

本实施例评价TSL-4和TSL-26对斑马鱼的抗血管形成作用，步骤如下：

转基因血管绿色荧光Fli-1品系斑马鱼(环特生物)饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO₃)，以自然成对方式进行交配。

随机选取受精后2天(2dpf)的转基因血管绿色荧光Fli-1品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别按10.0、20.0和66.0ng/尾(折合0.18、0.35和1.2nmol/尾)的剂量静脉注射TSL-4，19.9和65.7ng/尾(折合0.35和1.2nmol/尾)的剂量静脉注射TSL-26，阳性对照按500ng/尾剂量的剂量注射贝伐单抗(Roche)，注射体积均为20.0nL/尾，同时设置正常对照组和溶剂对照组，每孔容量为3mL。

28℃处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析肠下血管面积，以该指标的统计学分析结果评价样品的抗血管形成作用。统计学处理结果用mean±SE表示，抗血管形成作用计算公式如下：

用SPSS软件进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，统计结果如表6所示。

表6抗血管形成作用评价实验结果(n＝10)

由表6可知，溶剂对照组斑马鱼肠下血管面积为116999像素，与正常对照组(112221像素)比较p>0.05，表明溶剂不影响血管形成。注射贝伐单抗500ng/尾的阳性对照组斑马鱼肠下血管面积为82597像素，与正常对照组比较p<0.001，其抗血管形成作用为26％，表明贝伐单抗具有明显的抗血管形成作用。

分别注射了TSL-4 10.0、20.0和66.0ng/尾的实验组斑马鱼的肠下血管面积分别为94407、75054和60328像素，与正常对照组比较，10.0ng/尾剂量组p>0.05，20.0和66.0ng/尾剂量组p<0.01&p<0.001，其抗血管形成作用分别为16％、33％和46％，表明TSL-4在本实验条件下具有明显的抗血管形成作用。

分别注射了TSL-26 19.9和65.7ng/尾的实验组斑马鱼的肠下血管面积分别为67772和61869像素，与正常对照组比较均p<0.001，其抗血管形成作用分别为40％和45％，表明TSL-26在本实验条件下具有明显的抗血管形成作用。

上述结果表明，TSL-26、TSL-4及阳性对照品贝伐单抗均具有明显的抗血管形成作用，其中以TSL-26的抗血管形成作用最佳。

综上所述，本发明通过对HM-3融合蛋白中的部分氨基酸进行突变，有效解决了分子中部分氨基酸的断裂问题，同时与靶点结合的功能未受到影响，且具备更佳的抗血管形成能力，生物活性更优的同时降低了产品开发的难度及成本，应用价值更高。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 天士力生物医药股份有限公司

<120> 重组HM-3融合蛋白及其应用

<130> 2021

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asp

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly

245 250 255

Gly Gly Gly Arg Gly Asp

260

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccctgcccag cacctgaggc cgccggggga 60

ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 120

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 180

tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 240

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 300

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 360

aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 420

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 480

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 540

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 600

caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 660

cagaagagcc tctccctgtc tctgggtggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 720

ggcggcggca gcatcgtccg ccgcgcggac cgcgcggcgg tcccgggcgg cggcggccgc 780

ggcgac 786

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ile Val Gly Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asp

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ile Val Arg Gly Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asp

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Val Arg Arg Gly Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asp

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ile Val Arg Arg Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asp

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcgtccgcc gcgcggaccg cgcggcggtc ccgggcggcg gcggccgcgg cgac 54

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atcgtcggcc gcgcggaccg cgcggcggtc ccgggcggcg gcggccgcgg cgac 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcgtccgcg gcgcggaccg cgcggcggtc ccgggcggcg gcggccgcgg cgac 54

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcgtccgcc gcggcgaccg cgcggcggtc ccgggcggcg gcggccgcgg cgac 54

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atcgtccgcc gcgcgggccg cgcggcggtc ccgggcggcg gcggccgcgg cgac 54

Claims

1.重组HM-3融合蛋白，其特征在于，所述重组HM-3融合蛋白包括第247号氨基酸和/或第249号氨基酸发生突变的HM-3融合蛋白；

所述HM-3融合蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组HM-3融合蛋白，其特征在于，所述HM-3融合蛋白的第248号氨基酸和/或第250号氨基酸还发生了突变。

3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白。

4.表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白；

优选地，所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求3所述的核酸分子。

5.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白；

优选地，所述重组细胞含有权利要求3所述的核酸分子；

优选地，所述重组细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.一种权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将核酸分子连入表达载体，并导入受体细胞中；

7.根据权利要求6所述的重组HM-3融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达载体包括哺乳动物表达载体，优选为pcDNA3.4；

优选地，所述受体细胞包括哺乳动物表达细胞，优选为酵母、CHO、SP2/0、BHK或HEK293F中的任意一种，进一步优选为HEK293F或CHO；

优选地，所述纯化的方法包括亲和层析纯化；

8.一种减少HM-3融合蛋白断裂的方法，其特征在于，所述减少HM-3融合蛋白断裂的方法包括对HM-3融合蛋白的第247号氨基酸和/或第249号氨基酸进行突变；

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或调味剂中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述药物组合物的剂型包括注射剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂或气雾剂中的任意一种或至少两种的组合；

10.权利要求1或2所述的重组HM-3融合蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的重组细胞或权利要求9所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备疾病预防和/或治疗药物中的应用；

优选地，所述疾病包括新生血管疾病、眼部疾病或自身免疫性疾病中的任意一种；

优选地，所述新生血管疾病包括湿性老年黄斑变性或肿瘤转移；

优选地，所述自身免疫性疾病包括骨关节炎。