JP2000507456A - 拮抗的特性を有する血管内皮細胞増殖因子の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＶＥＧＦ応答を誘発することなく細胞表面ＶＥＧＦレセプターに結合して占拠し、それにより天然ＶＥＧＦタンパク質の生物学的活性と拮抗することが可能な変異体ＶＥＧＦポリペプチドを含む血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト分子の製造に関する。特に、本発明の変異体ＶＥＧＦポリペプチドは、天然ＶＥＧＦ配列における少なくとも１つのシステイン残基の修飾を含み、それによって変異体ポリペプチドのジスルフィド結合の形成による二量体化の能力を阻害する。本発明はさらに、そのような変異体ＶＥＧＦアンタゴニストを製造する方法、天然ＶＥＧＦタンパク質とは異なった治療的および薬学的特性を有する薬学的に活性な物質を製造するための、そのような変異体を使用する方法、組成物およびアッセイに向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】 拮抗的特性を有する血管内皮細胞増殖因子の変異体 発明の分野 本発明は、血管内皮細胞増殖因子（以下、時にＶＥＧＦと称する）の特定の変 異体であって、ＶＥＧＦレセプターの細胞表面にＶＥＧＦ応答を誘導することな く結合しそして占拠し、それにより天然のＶＥＧＦタンパク質の生物学的活性を 拮抗する変異体に向けられる。本発明はさらに、そのような変異体ＶＥＧＦアン タゴニストの製造法および天然のＶＥＧＦタンパク質と異なった治療的および薬 学的特性を有する薬学的に活性な物質を製造するための、そのような変異体を使 用する方法、組成物およびアッセイにも向けられる。 発明の背景 哺乳類血管系の二つの主要細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞 は哺乳動物の全血管の内面の裏打ちを形成し、血液と組織の間に非血栓形成性界 面を構成している。したがって内皮細胞の増殖は新しい毛細管と血管の発達にと って重要な成分であり、そしてまたそのような発達は哺乳類組織の成長および/ または再生にとって必須の過程である。 内皮細胞増殖と血管新生の促進に極めて重要な役割を果たすことが示されてい る─タンパク質は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。ＶＥＧＦはもと もとはウシ下垂体濾胞細胞または濾胞星（folliculostellate;FS）細胞の培養培 地から同定精製されたヘパリン結合性内皮細胞特異的増殖因子である。Ferrara およびHenzel，Biochem．Biophys．Res．Comm．161:851-858(1989)。天然のＶＥ ＧＦは見かけ上の分子量が約46kDaの二量体で、各サブユニットはそれぞれ約23k Daの見かけ上の分子量をもっている。個々の天然のＶＥＧＦモノマー間の正常な 二量体化は、もう１つのモノマー単位のアミノ酸番号６０のシステイン残基に結 合した１つのモノマー単位のアミノ酸番号５１に位置するシステイン残基間のそ してその逆のジスルフィド結合の形成によって起こる。ヒトＶＥＧＦは様々な 組織で、それぞれが単一のRNA転写物の選択的スプライシングの結果として生じ る複数のホモ二量体型（モノマーあたり121、165、189および206アミノ酸）とし て発現する。例えば、ＶＥＧＦ₁₂₁はヘパリンを結合しない可溶性分裂促進因子 であるが、これより長いＶＥＧＦは長いものほどより強い親和力でヘパリンを結 合する。 生化学的分析から、天然ＶＥＧＦ二量体が血管内皮細胞に強い分裂促進特異性 を示すことがわかっている。例えばヒトＶＥＧＦ cDNAによってトランスフェク トされた細胞の培養培地は毛細管内皮細胞の増殖を促進したが、対照細胞の培養 培地はこれを促進しなかった。Leungら，Science 246:1306(1989)。このように 天然ＶＥＧＦ二量体は血管内皮細胞増殖と、既存の内皮からの新しい血管の形成 を伴う過程である血管新生を促進することが知られている。したがって天然ＶＥ ＧＦ二量体は、血管内皮細胞に対する増殖促進活性が重要な数多くの状態、例え ば潰瘍、血管損傷および心筋梗塞などの治療に役立ちうる。 ＶＥＧＦ二量体の内皮細胞増殖活性は、血管内皮細胞の表面だけに存在する2 つの高親和性チロシンキナーゼレセプターflt-1（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ） とKDR（キナーゼドメイン領域）によって媒介されることが知られている。DeVri esら，Science 225:989-991(1992)およびTermanら，Oncogene 6:1677-1683(1991 )。外傷などにより細胞が酸素欠乏状態になると、それらの細胞内でＶＥＧＦ生 産が増大し、それらがそれぞれのレセプターに結合することにより、最終的な生 物学的効果のシグナルとなる。次に、このシグナルは血管透過性を増大させ、細 胞が分裂、拡張して新しい血管経路を形成する。このように、天然のＶＥＧＦは 、血管内皮細胞へ結合することによって機能し血管増殖を誘導する。 しかしＶＥＧＦ誘導血管内皮細胞増殖は一定の状況では望ましいのだが、血管 内皮細胞増殖と血管新生は、種々の疾患と障害の重要な要素でもある。そのよう な疾患および障害には、腫瘍の増殖と転移、慢性関節リウマチ、乾癬、アテロー ム硬化、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑 変性、血管腫、移植された角膜その他の組織の免疫拒絶反応、および慢性炎症が 含まれる。これらいずれかの障害に冒された個体において、天然ＶＥＧＦ二量体 タンパク質の内皮細胞増殖活性を阻害する、もしくは少なくともこれを実質的に 低下させる手段を有することが望まれるのは明らかである。 天然のＶＥＧＦ活性を阻害するための利用可能な手段を有することが、多くの 理由により重要である。例えば、具体的に腫瘍細胞増殖の場合について述べると 、血管新生は過形成から新形成への移行と、増殖する充実性腫瘍への栄養の提供 にとって、極めて重要であると思われる。Folkmanら，Nature 339:58(1989)。ま た血管新生は腫瘍が宿主の血管床と接触することを可能にし、その宿主の血管床 は腫瘍細胞の転移経路になりうる。腫瘍転移における血管新生の役割は、例えば ヒト浸潤性乳がんの組織切片中の微小血管の数および密度と、実際に遠隔転移が 存在することとの相関を示す研究によって立証されている。Weidnerら，New Eng l．J．Med．324:1(1991)。したがって新形成性腫瘍の効果的治療法として考えう る一つの方法は、天然二量体ＶＥＧＦタンパク質の内皮増殖および血管新生活性 を阻害または実質的に低下させることである。 したがって、ＶＥＧＦ誘発血管内皮細胞増殖および血管新生が多くの疾患およ び障害において作用しているという役割の見地から、天然ＶＥＧＦタンパク質の １またはそれ以上の生物学的作用、例えばその分裂誘発性または血管新生作用を 減少または実質的に阻害するための手段を有することは望ましい。このように、 本発明は、天然のＶＥＧＦの１またはそれ以上の生物学的な活性を阻害すること が可能な新規のＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを同定しようとする研究に基づいて いる。具体的には、本発明は、典型的なＶＥＧＦ応答を誘導することなく、細胞 表面ＶＥＧＦレセプターに結合して占拠し、それにより天然ＶＥＧＦの作用を効 果的に減少または実質的に阻害することが可能なＶＥＧＦ変異体の同定に基づく 。そのようなＶＥＧＦ変異体を製造することができたなら、腫瘍を飢餓状態にし て退行させるために、そのような変異体を腫瘍の処置において使用することがで きるであろう。 システイン−システインジスルフィド共有結合の形成による適切に二量体化す る能力を失っているＶＥＧＦ変異体を製造することは、この研究の更なる目的で あった。そのような変異体には、システイン−システインジスルフィド結合の形 成による二量体化する能力を失っている変異体ＶＥＧＦモノマー、および少なく とも１つのシステイン−システインジスルフィド結合の形成により二量体化し得 るが、少なくとも１つのジスルフィド結合が天然ＶＥＧＦ二量体において存在し ているものとは異なる変異体ＶＥＧＦモノマーが含まれる。そのような変異体は 、細胞表面ＶＥＧＦレセプターにＶＥＧＦ応答を誘導することなく結合しそして 占拠し、それによりレセプターへの結合について天然のＶＥＧＦと拮抗し、拮抗 的に天然のＶＥＧＦ二量体の生物学的活性を阻害する能力を有する。 更なる目的として、本発明のＶＥＧＦ変異を分析系において使用し、意図した 治療的使用のための小分子アゴニストおよびアンタゴニストを発見することもで きるであろう。 上記の研究の成果が本発明の主題である。我々はここに、天然ＶＥＧＦアミノ 酸配列のアミノ酸第５１位および／または第６０位のシステイン残基の突然変異 または修飾が機能して、適切に二量体化する能力を失っているＶＥＧＦ変異体を 生じることをここに示す。具体的には、別のアミノ酸の第５１位および／または 第６０位のシステインの置換またはその部位のシステインの修飾は、ジスルフィ ド結合の形成にあずかるアミノ酸の能力を阻止する。しかし、これらの変異体は 、細胞表面ＶＥＧＦレセプターにＶＥＧＦ応答を誘導することなしに結合しそし て占拠し、それにより天然ＶＥＧＦ二量体の生物学的活性を効果的に阻害する能 力を保持している。 発明の概要 本発明は、血管内皮細胞のＶＥＧＦレセプターに結合することが可能であり、 それによってそれらの結合部位を占拠し、分裂誘発性、血管新生または他の天然 ＶＥＧＦタンパク質の生物学的活性を阻害することが可能な、天然ＶＥＧＦの変 異体を提供する。したがって、本発明の新規アンタゴニスト分子は、望ましくな い過剰な血管新生によって特徴付けられる、例えば腫瘍、および特に充実性悪性 腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化、糖尿病性のおよびその他の網 膜症、水晶体後部線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状 腺増殖症（グレーヴス病を含む）、角膜およびその他の組織移植、および慢性炎 症が含まれる疾患または障害の処置に有用である。本発明のアンタゴニストはさ らに、脳腫瘍に関連する水腫、悪性のメイグス症候群に関連する腹水、肺炎症、 ネフローゼ症候群、心膜液（心膜炎に関連するもの）および胸水などの望ましく ない血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害の処置についても有用で ある。 好ましい態様では、本発明のアンタゴニスト分子の変異体ＶＥＧＦポリペプチ ドは、天然のＶＥＧＦアミノ酸配列に存在する、そのシステイン残基の修飾によ ってもうひとつのＶＥＧＦポリペプチドと適切に二量体化することができないポ リペプチドを生じる、少なくとも１つのシステイン残基のアミノ酸修飾を含む。 特に好ましい態様では、修飾される天然ＶＥＧＦアミノ酸配列のシステイン残 基は、天然ＶＥＧＦアミノ酸配列のアミノ酸第５１位および／または第６０位で ある。 本発明の新規ＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、適切に二量体化することができ ないように天然のＶＥＧＦアミノ酸配列内のシステイン残基における少なくとも １つのアミノ酸突然変異を作出することにより、組換え的に生じさせることがで きる。典型的な突然変異には、例えば、置換、挿入、および／または欠失が含ま れる。目的のシステイン残基を、ジスルフィド結合にあずかることができないよ うに化学的に修飾することもできる。 その他の態様では、本発明は、本発明の新規ＶＥＧＦアンタゴニスト分子をコ ードする単離された核酸配列およびその核酸配列を含む複製可能な発現ベクター に向けられる。 その他の更なる態様では、本発明は、本発明の複製可能な発現ベクターでトラ ンスフェクトされ、それらベクターを発現することが可能な宿主細胞に向けられ る。 更なる別の態様では、本発明は、腫瘍の増殖の抑制など、抗血管新生が望まれ る適応症を処置するための、薬学的に許容し得る担体と混合した治療上有効量の 本発明のアンタゴニスト分子を含む組成物に向けられる。本発明の別の態様は、 治療上有効量の上記組成物を投与することを含む処置の方法に向けられる。 天然ＶＥＧＦポリペプチドの発見と変異体ＶＥＧＦポリペプチドを製造するた めの突然変異誘発というこの基本の前提に基づいて、本発明は、そこから派生す るすべての関連した態様に関し、それらには、組換えＤＮＡ材料およびそのよう な変異体の製造方法、そのような変異体を薬学的に仕上げた形態に混ぜ合わせる ための材料と情報、およびそのような変異体を使用し、天然ＶＥＧＦポリペプチ ドに関してアゴニストまたはアンタゴニスト特性を有する候補をスクリーニング するためのアッセイが含まれる。 図面の簡単な説明 第１Ａおよび１Ｂ図はともに、１６５アミノ酸を有する天然ＶＥＧＦタンパク 質のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。タンパク質の推定アミノ酸をＤＮＡ配列 の下に示し、タンパク質配列のＮ末端の最初の残基から番号を付す。負のアミノ 酸番号は、推定のリーダーシグナル配列またはプレタンパク質を意味し、一方、 正の番号は推定の成熟タンパク質を意味する。 第２図は、モノマー単位の、それぞれアミノ酸第５１位と第６０位および第６ ０位と第５１位のシステイン残基の間でジスルフィド結合を有する天然ＶＥＧＦ 二量体分子、アミノ酸第５１位のシステイン残基がアスパラギン酸残基で置換さ れた結果スタガー（staggered）二量体の形成を生じる変異ポリペプチドＣ５１ Ｄ、アミノ酸第６０位のシステイン残基がアスパラギン酸で置換された結果スタ ガー（staggered）二量体を生じる変異ポリペプチドＣ６０Ｄ、およびアミノ酸 第５１位と第６０位の両方がアスパラギン酸残基で置換され、それによりジスル フィド結合の形成と二量体化を阻止している変異ポリペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０ Ｄを示す概略図である。 第３図は、天然ＶＥＧＦ二量体（“●”）、Ｃ６０Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペプ チドから形成されたスタガー二量体（“□”）、Ｃ５１Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペ プチドから形成されたスタガー二量体（“〇”）、およびモノマーＶＥＧＦ変異 ポリペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“△”）の、ＫＤＲレセプターに対する結合 プロファイルを示すグラフである。データは、非標識競争剤のピコモーラー（ｐ Ｍ）濃度に対して、遊離に対する結合したポリペプチドの割合として示した。 第４図は、天然のＶＥＧＦ二量体（“●”）およびモノマーＶＥＧＦ変異ポリ ペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“▲”）の、ＫＤＲレセプターに対する結合プロ ファイルを示すグラフである。データは、非標識競争剤のナノモーラー（ｎＭ） 濃度に対して、遊離に対する結合したポリペプチドの割合として示した。 第５図は、天然ＶＥＧＦ二量体（“●”）、Ｃ６０Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペプ チドから形成されたスタガー二量体（“■”）、Ｃ５１Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペ プチドから形成されたスタガー二量体（“○”）、およびモノマーＶＥＧＦ変異 ポリペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“▲”）の、ＦＬＴ−１レセプターに対する 結合プロファイルを示すグラフである。データは、非標識ＶＥＧＦ競争剤のナノ モーラー（ｎＭ）濃度に対して、遊離に対する結合したポリペプチドの割合とし て示した。 第６図は、天然ＶＥＧＦ二量体（“●”）、およびモノマーＶＥＧＦ変異ポリ ペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“■”）の、ＦＬＴ−１レセプターに対する結合 プロファイルを示すグラフである。データは、ナノモーラー（ｎＭ）濃度の非標 識ＶＥＧＦ競争剤に対して、遊離に対する結合ポリペプチドの割合として示した 。 第７図は、天然ＶＥＧＦ二量体（“●”）、Ｃ６０Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペプ チドから形成されたスタガー二量体（“○”）Ｃ５１Ｄ変異体ＶＥＧＦポリペプ チドから形成されたスタガー二量体（“△”）、およびモノマーＶＥＧＦ変異ポ リペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“□”）の、内皮細胞における有糸分裂誘発を 刺激する能力を示すグラフである。データは、使用したポリペプチドのピコモー ラー（ｐＭ）濃度に対する内皮細胞の総数で示す。 第８図は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４６１（“■”）およびモノマー ＶＥＧＦ変異ポリペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ（“●”）の、内皮細胞のＶＥＧ Ｆ誘発性増殖を阻害する能力を示すグラフである。データは、使用したＶＥＧＦ に対する抗体またはモノマーインヒビターの割合に対して、内皮細胞の総数とし て示す。 発明の詳細な説明 本明細書で使用する、「血管内皮細胞増殖因子」または「ＶＥＧＦ」とは、米 国特許5,332,671に定義される天然の哺乳類増殖因子をいい、第１図のヒトアミ ノ酸配列、およびそのような増殖因子の、天然に存在するアレル形態および処理 を施された形態を含む。ＶＥＧＦタンパク質は、モノマー形態またはマルチマー （例えば二量体）形態のいずれかで存在し得る。「適切な二量体化」は、天然Ｖ ＥＧＦモノマー間で普通に起こる二量体化である。 ＶＥＧＦタンパク質に関して、「天然」なる語は、開始メチオニンを有するま たは有しない、いずれかのヒトまたはヒトでない動物種の天然に存在するＶＥＧ Ｆタンパク質を意味し、天然の供給源から精製された、合成された、組換えＤＮ Ａ技術によって、またはこれらおよび／または他の方法との組み合わせのいずれ かによって製造されたものである。天然のＶＥＧＦタンパク質は二量体分子とし て天然に存在し、そこにおいてそのモノマー単位がシステイン−システインジス ルフィド結合の形成により共有結合している。天然ＶＥＧＦには、具体的には、 第１図に示したアミノ酸配列を有する天然ヒトＶＥＧＦタンパク質が含まれ、in vivoで血管内非細胞の増殖を誘導する能力を持っている。 ＶＥＧＦタンパク質に関して「変異体」なる語は、天然ＶＥＧＦタンパク質と 比較して少なくとも１つのアミノ酸突然変異または修飾（即ち、変更）を有する ＶＥＧＦタンパク質を意味し、天然のＶＥＧＦタンパク質の生物学的活性の１つ またはそれ以上を欠いていてもよいかまたは欠いていてはならない。「アミノ酸 修飾」によって生じた変異体ＶＥＧＦタンパク質は、例えば、天然のＶＥＧＦア ミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失、挿入および／また は化学的に修飾することによって製造することができる。このようなＶＥＧＦ変 異体を作出する方法を以下に記載する。 「モノマー変異体」、「モノマーアンタゴニスト」、またはその文法的に等価 な用語は、該アミノ酸変更がモノマー単位間の二量体形成を阻止するように作用 する、天然ＶＥＧＦモノマーと比較して少なくとも１つのアミノ酸変更を有する 変異体ＶＥＧＦタンパク質を意味する。このように、本発明の「モノマー変異体 」または「モノマーアンタゴニスト」は、システイン−システインジスルフィド 結合の形成による二量体化が不可能なＶＥＧＦ変異体である。しかし、天然ＶＥ ＧＦタンパク質のモノマー変異体は、有糸分裂誘発性および／または血管新生的 ＶＥＧＦ応答を誘導することなく、細胞表面ＶＥＧＦレセプターに結合しそして 占拠する能力を有するであろう。それらレセプターでのモノマー変異体の結合親 和性は天然ＶＥＧＦタンパク質の親和性と異なっているかもしれないけれども。 「スタガー二量体」、「スタガーアンタゴニスト」またはその文法的に等価な 用語は、天然ＶＥＧＦタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸変更を有 し、少なくとも１つのシステイン−システインジスルフィド結合の形成による二 量体化する能力は保持しているが、形成したジスルフィド結合のうちの少なくと も１つが天然ＶＥＧＦ二量体タンパク質に存在するものと異なっている、変異体 ＶＥＧＦタンパク質を意味する。 ポリペプチドの「機能的誘導体」は、別のポリペプチドと共通して質的な生物 学的活性を有するまたはそれを欠く化合物である。即ち、例えば本発明のＶＥＧ Ｆアンタゴニスト化合物の機能的誘導体は、もとのポリペプチドアンタゴニスト と共通する質的な生物的活性を有する化合物であり、例えば細胞表面ＶＥＧＦレ セプターにＶＥＧＦ応答を誘導することなく結合することが可能であり、それに よってそれらレセプターを占拠し天然ＶＥＧＦ活性を阻害するようなものである 。「機能的誘導体」には、本発明の変異体ＶＥＧＦタンパク質のアミノ酸配列変 異体、いずれかの動物種（ヒトを含む）に由来するポリペプチドの断片、ヒトお よびヒトでないポリペプチドおよびその断片の誘導体、および天然のポリペプチ ドのペプチドアナログが含まれるがこれに限られないが、但し、それぞれの変異 体ＶＥＧＦタンパク質と共通して生物学的活性を有するまたはそれを欠いている ものである。「断片」は、成熟ポリペプチドの配列内の領域を含む。「誘導体」 なる語は、アミノ酸配列変異体、およびポリペプチドの化学的修飾物を定義する ために使用される。 本明細書においてポリペプチドおよび／またはその機能的誘導体に関する「同 一性」または「相同性」は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とはみなさ ずに、最大相同性パーセントを達成するため配列の位置を調整し、必要ならば間 隙を導入した後の対応するポリペプチドの残基と同一な候補配列中のアミノ酸残 基のパーセンテージと定義する。Ｎ−またはＣ−末端の伸長と挿入はいずれも同 一性や相同性を低下させないものと解釈される。位置を調整するための方法とコ ンピュータープログラムは当該分野でよく知られている。 機能的誘導体の定義の文脈において用語「生物学的活性」は、定量的に別のポ リペプチドと共通した少なくとも１つの機能を持つことと定義する。本発明のポ リペプチドアンタゴニストの機能的誘導体は、ＶＥＧＦ反応を誘導することなく ＶＥＧＦレセプターとの結合し、その部位に天然のＶＥＧＦが結合するのを抑制 することにより天然ＶＥＧＦタンパク質の生物学的活性を阻害する定量的能力に より統合される。 用語「アンタゴニスト」は、天然ＶＥＧＦタンパク質の生物活性を阻害する分 子を表すのに用いる。好ましくは、本明細書において、ＶＥＧＦアンタゴニスト 化合物はＶＥＧＦの血管内皮細胞増殖誘発能を阻害する。好ましいアンタゴニス トは血管内皮細胞増殖を本質的に完全に阻害する。 通常、用語「アミノ酸」および「アミノ酸（複数）」はすべての天然のＬ−α −アミノ酸を表す。しかしながら、いくつかの態様では、構造的限定を促すため に、Ｄ−アミノ酸または非天然の置換アミノ酸のいずれかが本発明のポリペプチ ドまたはペプチド中に存在してよい。例えば、ジスルフィド結合の形成と安定性 を促すため、天然ＶＥＧＦタンパク質のペプチドの機能的誘導体またはペプチド アンタゴニストの１または両末端にＤ−アミノ酸システインを与えることができ る。アミノ酸は１文字または３文字表基で示す。 Asp D アスパラギン酸 Ile I イソロイシン Thr T スレオニン Leu L ロイシン Ser S セリン Tyr Y チロシン Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン Pro P プロリン His H ヒスチジン Gly G グリシン Lys K リジン Ala A アラニン Arg R アルギニン Cys C システイン Trp W トリプトファン Val V バリン Gln Q グルタミン Met M メチオニン Asn N アスパラギン これらアミノ酸はその側鎖の化学的組成と特性に従って分類することができよ う。アミノ酸は、荷電および非荷電の、大きく２つのグループに分類される。こ れら各グループはアミノ酸をより正確に分類するためサブグループに分類される 。 Ｉ．荷電アミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン II．非荷電アミノ酸 親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン 脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン 芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 用語「アミノ酸配列変異体」または「アミノ酸改変体」は、別のアミノ酸配列 、通常天然アミノ酸配列と比べてそのアミノ酸配列に少なくとも１つの違いがあ る分子を表す。 「置換(的)」変異体は、対応する配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除 去され、その代わりに同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されているものをいう。 置換はただ一つ（分子中のただ１個のアミノ酸が置換されている）でもよく、複 数（同じ分子中の２またはそれ以上のアミノ酸が置換されている）でもよい。 「挿入(的)」変異体は、対応する配列中の特定の位置のアミノ酸の直近に１ま たはそれ以上のアミノ酸が挿入されているものをいう。アミノ酸の直近とはその アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかと結合しているこ とを意味する。 「欠失(的)」変異体は、対応するアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ 酸が除去されているものをいう。通常、欠失変異体では分子の特定領域中の１ま たは２個のアミノ酸が欠失しているだろう。 用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドを同定し、動物またはヒトの 核酸またはポリペプチド供給源中に存在する夾雑核酸またはポリペプチドから分 離することを表す。 ハイブリダイゼーションは、（１）洗浄に低イオン強度と高温、例えば、５０ ℃の、０．０１５塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウムを用いるか、または（２）ハイブリダイゼーション 時に、４２℃の、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウ ムを含む５０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含有するホルムアミ ド、例えば５０％（vol/vol）ホルムアミドのような変性剤を用いることを意味 する「ストリンジェント条件」下で行なうのが好ましい。別の例では、４２℃の 、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエ ン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロリ ン酸ナトリウム、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５ ０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を用い、４２ ℃の０．２ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄する。さらに別の例では、５ ５℃の、１０％デキストラン硫酸、２ｘ ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナ トリウム）および５０％ホルムアミドの緩衝液を用いてハイブリダイゼーション を行ない、次いで５５℃の、ＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高ストリン ジェンシー洗浄を行なう。 「形質転換」とは、DNAを、ある生物にそのDNAが染色体外要素としてまたは染 色体成分として複製できるように導入することをいう。形質転換は、使用する宿 主細胞に応じて、その細胞に適した一般的技術を用いて行われる。Cohen，S.N.P roc ．Natl．Acad．Sci．(USA) 69，2110(1972)やMandelら，J ．Mol．Biol. 53， 154(1970)に記述されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、 原核生物または堅固な細胞壁境界を持つ他の細胞に広く使用されている。そのよ うな細胞壁を持たない哺乳類細胞には、Graham，Fおよびvan der Eb，A.，Virol ogy ，52，456-457(1978)のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳類細胞宿主 系形質転換の一般的側面については、Axelが米国特許第4,399,216号（1983年8月 16日発行）に記述している。酵母への形質転換は、通常、Van Solingen，P.ら，J ．Bact. ，130，946(1977)とHsiao，C.L.ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA)76 ，3829(1979)の方法に従って行われる。ただし、DNAを細胞に導入する他の方法 、例えば核注入やプロトプラスト融合などによる方法なども使用できる。 「部位特異的突然変異誘発法」は、当技術分野で広く知られる技術であり、突 然変異させようとする一本鎖ファージDNAに対して相補的（限定されたミスマッ チ部分を除く）な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。簡単に 述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、一本鎖ファージDNAに 相補的な鎖の合成を行い、得られた二本鎖DNAをファージ維持宿主細菌に形質転 換する。形質転換した細菌の培養を上層寒天に撒き、ファージを保持する単一の 細胞からプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの50%が突然変異 型を一本鎖として持つファージを含有し、50%が元の配列を持つだろう。目的の のプラークを、キナーゼ処理した合成プライマーと、正確な対合のハイブリッド 形成が可能であり、かつ、元の鎖とのミスマッチによってハイブリッド形成が妨 害されうるような温度でハイブリッド形成させることにより選択する。次に、そ のプローブとハイブリッド形成するプラークを選択し、培養して、そのDNAを回 収する。 「機能的に連結した（operably liked）」とは、構成要素の通常の機能が行わ れうるような並置をいう。したがって、制御配列に機能的に連結したコード配列 とは、そのコード配列がそれら配列の制御下に発現できるような、また連結され たDNA配列が連続的であるような（分泌リーダーの場合は連続的かつ解読相が一 致するような）配置をいう。例えば、プレ配列または分泌リーダーの遺伝子は、 それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるので あれば、そのポリペプチドのDNAに機能的に連結している。プロモーターまたは エンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響を与えるのであれば、その コード配列に機能的に連結している。また、リボソーム結合部位は、それが翻訳 を促進するような位置にあるのであれば、コード配列に機能的に連結している。 連結は都合の良い制限部位での連結（ライゲーション）によって達成される。そ のような部位が存在しない場合は、慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプ ターまたはリンカーを使用する。 「制御配列」とは、特定の宿主生物中で機能的に連結したコード配列の発現に 必要なDNA配列をいう。原核生物に適した制御配列には、例えばプロモーター、 任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、あるいは他のまだよくわかって いない配列が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよ びエンハンサーを利用することがわかっている。 「発現系」とは、所望のコード配列と制御配列を含むDNA配列であって、その コード配列と制御配列が、それらの配列で形質転換された宿主がコードされてい るそのタンパク質を生産することができるような機能的関係にあるものをいう。 形質転換を達成するために、発現系をベクターに含めることができるが、関連す るDNAが続いて宿主染色体に組込まれてもよい。 本明細書において「細胞」「細胞系」および「細胞培養」という用語は相互交 換可能に使用され、これらはいずれも子孫を包含する。したがって「形質転換体 」または「形質転換細胞」という用語は、最初の対象細胞とそこから派生する培 養を、その継代数にかかわらず包含する。また、すべての子孫は、意図的な突然 変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でない場合も あると解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能を持つ 突然変異体子孫が含まれる。明確な指定を意図する場合は、その文脈から明らか になるだろう。 「プラスミド」は、小文字pとその前後に添えた大文字および／または数字に よって指定される。本明細書に記載の出発プラスミドは市販されているか、公け に無制限に入手できるか、もしくはそれらの入手可能なプラスミドから公表され た方法に従って構築することができる。また、他の等価なプラスミドも当技術分 野で知られており、それらは通常の当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とは、そのDNAの特定の位置でのみ作用する酵素によるDNAの触 媒的切断をいう。そのような酵素は制限酵素と呼ばれており、それぞれの制限酵 素が特異性を示す部位は制限部位と呼ばれる。本明細書で使用される種々の制限 酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件は、その酵 素の供給者によって確立されたものを使用する。制限酵素は通常、その制限酵素 を最初に得た起源の微生物を表わす大文字とそれに続く他の文字、さらにその酵 素を指定する数字からなる略号によって指定される。一般的には、約1mgのファ ージミドまたはDNA断片を約1〜2単位の酵素と共に約20μLの緩衝液中で使用する 。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質量は、その製造者によって指定される。 通常は、37℃で約1時間の保温を使用するが、これは供給者の指示に従って変更 することができる。保温後、フェノールとクロロホルムを用いる抽出によってタ ン パク質を除去し、消化された核酸をエタノール沈澱によって水相から回収する。 まれに、制限酵素による消化の後、その末端5'リン酸基を細菌アルカリ性ホスフ ァターゼで加水分解することにより、DNA断片の2つの制限切断末端が「環化」ま たは閉環を形成してその制限部位への別のDNA断片の挿入を妨害するのを防止す ることもある。特に明記しない限り、プラスミドの消化後に5'末端脱リン酸化を 行なわない。脱リン酸化の方法と試薬は従来通りである（T．Maniatisら，1982 ，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（ニューヨーク：コールドプスリン グハーバー研究所，1982）133-134ページ）。 与えられたDNA断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、その消 化物のポリアクリルアミドまたはアガロースゲルにおける電気泳動による分離、 既知の分子量を持つマーカーDNA断片と移動度を比較することによる目的断片の 同定、所望の断片を含有するゲル切片の切り出し、およびDNAとゲルの分離を意 味する。この手法は広く知られている。例えば、R．Lawnら，Nucleic Acids Res ．9 ，6103-6114(1981)やD．Goeddelら，Nucleic Acids Res. 8，4057(1980)を参 照のこと。 「連結（ライゲーション）」とは、２つの二本鎖核酸断片間にリン酸ジエステ ル結合を形成する過程をいう（T．Maniatisら，1982，前掲，146頁）。特に断わ らない限り、連結は、ほぼ等量の連結しようとするDNA断片0.5mgあたり10単位の T4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて、既知の緩衝液と条件で行なうことが できる。 形質転換体からのDNAの「調製」とは、微生物培養からプラスミドDNAを単離す ることを意味する。特に断わらない限り、Maniatisら，1982，前掲，90頁のアル カリ/SDS法を使用することができる。 「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（例えばEP特許公開番号266,032（198 8年5月4日公開）に記載されているような固相法を用いるリン酸トリエステル法 、ホスファイト法またはホスホルアミダイト法、もしくはFroehlerら，Nucl ．Ac ids Res. 14，5399-5407[1986]に記載されているようなデオキシヌクレオシドH- ホスホネート中間体による方法など）によって化学的に合成される短い一本鎖ま たは二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。これらは合成に続いてポリアクリ ルアミドゲルで精製される。 「KDR」という略号は、天然のＶＥＧＦ分子でもその変異体でもよい、ＶＥＧ Ｆ分子のキナーゼドメイン領域を表わす。キナーゼドメイン領域レセプターに結 合することがわかっているのは、この領域である。 「FLT-1」という略号は、対応するFLT-1レセプターに結合することがわかって いるFMS様チロシンキナーゼ結合ドメインを表わす。これらのレセプターは内皮 細胞の表面に存在する。 B. 一般的方法論 1. グリコシル化 本発明のＶＥＧＦ変異体は、N結合を介してグリコシル化される可能性を持ち 、しかも天然ＶＥＧＦ分子では通常はグリコシル化されていないアミノ酸配列を 少なくとも1つは持ちうる。 変異体中にN結合型グリコシル化郁位を導入するには、アスパラギン-X-セリン またはアスパラギン-X-スレオニンという式（ここにアスパラギンは受容部位で あり、Xは20種類の遺伝的にコードされるアミノ酸のいずれか（ただしグリコシ ル化を妨害するプロリンを除く）を表わす）で示されるトリペプチド配列が必要 である。D.K．StruckおよびW.J．Lennarz，The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (W.J．Lennarz編，Plenum Press，1980)の35頁、R.D．Marsh all，Biochem ．Soc．Symp.，40，17(1974)およびWinzler，R.J.，Hormonal Prot eins and Peptides (Li，C.I.編，Academic Press，ニューヨーク，1973)の1〜15 頁を参照のこと。本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、適当な部位にあるア ミノ酸を適当なアミノ酸で置換してグリコシル化を果たすことにより、修飾され る。 O結合型グリコシル化を使用する場合、動物細胞中では、N-アセチルガラクト サミン、ガラクトースまたはキシロースと、数種類のヒドロキシアミノ酸のいず れか（最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、その分子の適当な領域 に5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジン残基がある場合もある）の間 でO-グリコシド結合が起こる。 哺乳動物によって生産されたタンパク質のグリコシル化様式は、The Plasma P roteins:Structure ，Function and Genetic Control ，F.W．Putnam編，第2版， 第4巻（Academic Press，ニューヨーク，1984）の271〜315頁に詳述されており 、その開示はすべて参考文献として本明細書の一部を構成する。この章では、ア スパラギン結合型オリゴ糖が、複合構造、高マンノース構造およびハイブリッド 構造と呼ばれる少なくとも3つのグループへの細別を含めて議論されており、ま たO-グリコシド結合したオリゴ糖についても議論されている。 タンパク質に対するグリコシドの化学的および/または酵素的カップリングは 、例えばAplinおよびWristonがCRC Crit ．Rev．Biochem. （1981）の259〜306頁 （その内容は参考文献として本明細書の一部を構成する）に記述しているような 種々の活性基を用いて行なうことができる。化学的カップリング技術の利点は、 それらが比較的簡単で、天然のO-結合型およびN-結合型グリコシル化に必要な複 雑な酵素機構を必要としないということである。使用するカップリング法によっ て、（a）アルギニンまたはヒスチジン、（b）グルタミン酸やアスパラギン酸な どの遊離カルボキシル基、（c）システインなどの遊離スルフヒドリル基、（d） セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、 （e）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基、あ るいは（f）グルタミンのアミド基に糖を結合させることができる。これらの方 法はPCT WO 87/05330（1987年9月11日公開）により詳しく記述されており、その 開示は参考文献として本明細書の一部を構成する。 酵母によって生産されたタンパク質のグリコシル化様式は、TannerおよびLehl e，Biochim ．Biophys．Acta，906(1)，81-99(1987)とKukuruzinskaら，Annu ．Re v．Biochem. ，56，915-944(1987)に詳述されており、それらの開示は参考文献と して本明細書の一部を構成する。 2. アミノ酸配列変異体 a. 付加的な突然変異 本明細書に記載のＶＥＧＦ変異体を簡略化して呼ぶ場合、番号は第１Ａおよび １Ｂ図に示した推定成熟ＶＥＧＦタンパク質のアミノ酸配列に沿ってアミノ酸残 基/位置を表わすことを注記しておく。 本発明は、ＶＥＧＦモノマー単位が適切に二量体化する能力に影響するアミノ 酸配列の修飾を有する、ＶＥＧＦの変異体に向けらる。これら変異体は、血管内 皮増殖および血管新生を実質的に活性化することなく細胞表面ＶＥＧＦ受容体に 結合しそして占拠し、それにより天然ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する能力を 有している。具体的には、アミノ酸修飾は、変異体ＶＥＧＦモノマーが適切に二 量体化する能力にそのそれぞれが影響しているアミノ酸第５１位および／または 第６０位で行うことができる。さらに、これらもともとの変異体に基づいた更な る変異体は、本発明の精神からそれることなく一般に当分野でよく知られた手段 によって作ることができる。 本発明のＶＥＧＦ変異体に関しては、例えば、様々なアミノ酸残基に対して化 学的修飾を行うことができる。 b. DNA突然変異 ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体およびその変異体は、DNAの突然変異によって 調製することもできる。そのような変異体には、例えば、図1に示すアミノ酸配 列内の残基の欠失、挿入または置換がある。最終構築物が所望の活性を持つ限り 、欠失、挿入および置換を任意に組み合せて施すことにより、最終構築物を得る こともできる。明らかに、変異体をコードするDNAに施される突然変異は、その 配列を読み枠外に置いてはならず、また二次mRNA構造を形成しうる相補領域を生 み出さないことが好ましい（EP 75,444A参照）。 遺伝子レベルでは、これらの変異体は通常、ＶＥＧＦをコードするDNA中のヌ クレオチドの部位特異的突然変異によって変異体をコードするDNAを作成し、次 にそのDNAを組換え細胞培養中で発現させることによって調製される。 アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異そのものを 決定しておく必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異の効果を最 適化するために、標的コドンまたは標的領域で無作為突然変異誘発を行い、発現 したＶＥＧＦ変異体を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングす ることができる。既知の配列を持つDNA中の予定の部位に置換突然変異を作成す る部位特異的突然変異誘発法などの技術は、よく知られている。 本発明のＶＥＧＦ変異体の調製は、前もって調製した変異体または非変異体型 タンパク質をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発によって行なうことが好 ましい。部位特異的突然変異誘発法によれば、所望の突然変異のDNA配列と、横 切られる欠失接合部の両側に安定な二本鎖を形成しうるサイズと配列とを持つプ ライマー配列を与えるに足る数の隣接ヌクレオチドとをコードする、特定のオリ ゴヌクレオチド配列を使用することにより、ＶＥＧＦ変異体を生産することがで きる。通常、20〜25ヌクレオチド長で、変化させる配列の接合部の両側に約5〜1 0残基を持つプライマーが好ましい。Adelmanら，DNA 2，183(1983)（その開示は 参考文献として本明細書の一部を構成する）などの刊行物によって示されるよう に、一般に、部位特異的突然変異誘発技術は当技術分野でよく知られている。 一般的に、部位特異的突然変異誘発技術が、一本鎖型と二本鎖型の両方で存在 するファージベクターを使用することは理解されるだろう。部位特異的突然変異 誘発法に有用な典型的ベクターには、例えばMessingら，Third Cleveland Sympo sium on Macromolecules and RecombinantDNA ，A．Walton編，Elsevier，アムス テルダム（1981）（その開示は参考文献として本明細書の一部を構成する）に開 示されているようなM13ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージ は市販されており、それらの使用法は一般に当業者にはよく知られている。別法 として、一本鎖ファージ複製起点を含有するプラスミドベクター（Veiraら，Met h ．Enzymol. ，153，3[1987]）を使用して、一本鎖DNAを得ることもできる。 一般に、ここでの部位特異的突然変異誘発は、まず関連するタンパク質をコー ドするDNA配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって行われる 。所望の変異配列を保持するオリゴヌクレオチドプライマーは、通常、合成的に 、例えばCreaら，Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA)，75，5765(1978)の方法によっ て調製される。次に、そのプライマーを一本鎖タンパク質配列含有ベクターとア ニールさせ、大腸菌ポリメラーゼIクレノウ断片のようなDNA重合酵素にさらして 、突然変異保持鎖の合成を完了する。したがって、一方の鎖が元の非突然変異配 列をコードし、もう1つの鎖が所望の突然変異を保持するヘテロ二本鎖が形成さ れる。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを用いて、JM101細胞のような適当な細 胞を形質転換し、突然変異した配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択 する。 そのようなクローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り出し、 タンパク質生産に適したベクター（一般的には、適当な宿主の形質転換に使用し うるタイプの発現ベクター）に入れる。 c. 突然変異のタイプ アミノ酸配列欠失は、通常、約1〜30残基、より好ましくは1〜10残基の範囲で あり、一般的には連続的である。 アミノ酸配列挿入には、1残基から本質的に任意の長さのポリペプチドまでの アミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに1または複数のア ミノ酸残基の配列内挿入がある。配列内挿入（すなわち成熟ＶＥＧＦ配列内の挿 入）は一般的には約1〜10残基、より好ましくは1〜5残基の範囲にわたりうる。 末端挿入の例には、変異ＶＥＧＦの組換え宿主からの分泌を促進するために行な う、宿主細胞と同種もしくは異種のシグナル配列の、変異ＶＥＧＦ分子のN末端 への融合がある。 変異体の第３のグループは、ＶＥＧＦ分子中のアミノ酸残基が少なくとも1つ （好ましくは1つだけ）除去され、そこに異なる残基が挿入されているものであ る。ＶＥＧＦ分子またはその変異体の特徴を細かく調節したい場合は、このよう な置換を次の表1に従って行なうことが好ましい。 表1 元の残基 典型的置換 Ala（A） gly;ser Arg（R） lys Asn（N） gln;his Asp（D） glu Cys（c） ser Gln（Q） asn Glu（E） asp Gly（G） ala;pro His（H） asn;gln Ile（I） leu;val Leu（L） ile;val Lys（K） arg;gln;glu Met（M） leu;tyr;ile Phe（F） met;leu;tyr Ser（S） thr Thr（T） ser Trp（W） tyr Tyr（Y） trp;phe Val（V） ile;leu 機能的または免疫学的性質の本質的な変化は、表Iのよりも保存性の低い置換 を選択することによって、すなわち（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造（ 例えばシートまたはらせんコンフォメーション）、（b）標的部位における分子 の電荷または疎水性、または（c）側鎖の嵩高さ、を維持する効果がより有意に 異なる残基を選択することによって行われる。生物学的特性に最も大きな変化を もたらすと一般的に予想される置換は、（a）グリシンおよび/またはプロリンを 別のアミノ酸で置換するか、これらの残基を欠失または挿入したもの、（b）親 水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）で（を）疎水性残基（例えばロイシ ル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルを（で）置換した もの、（c）システイン残基で（を）他の任意の残基を（で）置換したもの、（d ）電気陽性側鎖を持つ残基（例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル）で（ を）負電荷を持つ残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）を（で）置換し たもの、（e）電気陰性側鎖を持つ残基で（を）正電荷を持つ残基を（で）置換 したもの、または（f）嵩高い側鎖を持つ残基（例えばフェニルアラニン）で（ を）そのような側鎖を持たない残基（例えばグリシン）を（で）置換したもので あろう。 ほとんどの欠失と挿入、そして特に置換は、ＶＥＧＦ分子またはその変異体の 特性に著しい変化をもたらさないと予想される。しかし、置換、欠失または挿入 の正確な効果を前もって予測することが困難な場合、その効果を一般的なスクリ ーニング検定法で評価することは、当業者には理解されるだろう。例えば、変異 体は通例、天然のＶＥＧＦコード核酸の部位特異的突然変異誘発、その変異体核 酸の組換え細胞培養における発現、および任意に、例えばウサギポリクローナル 抗ＶＥＧＦカラムへの免疫アフィニティー吸着（残存する免疫エピトープの少な くとも1つにそれを結合させることにより変異体を吸収するため）などによるそ の細胞培養からの精製によって作成される。 ＶＥＧＦは二量体に会合する傾向があるので、一方のサブユニットまたは両方 のサブユニットが変異体であるヘテロ二量体およびホモ二量体を提供することも 本発明の範囲に包含される。両方のサブユニットが変異体である場合、アミノ酸 配列中の変化は各サブユニット鎖について同じであってもよいし、異なってもよ い。ヘテロ二量体は、両方のサブユニットをコードするDNAで宿主細胞を同時形 質転換し、必要であれば所望のヘテロ二量体を精製するか、もしくは各サブユニ ットを別個に合成し、それらサブユニットを（例えば、尿素、グアニジン塩酸塩 などのカオトロピック試薬による処理で）解離し、解離したサブユニットを混合 した後、カオトロピック試薬を透析除去してサブユニットを再会合させることに より、容易に製造できる。 いわゆるグリコスキャン（glyco-scan）突然変異体も、本明細書でいう突然変 異体の範囲に含まれる。この態様では、ＮＸ（Ｓ／Ｔ）という配列によって同定 されるいわゆるグリコシル化部位の知識を利用する（ここにNはアミノ酸アスパ ラギンを表わし、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸を表わし、3番目の位置はア ミノ酸セリンまたはスレオニンのいずれが占めてもよい）。したがって、適宜そ のようなグリコシル化部位を導入して、その位置にグリコシル化部分を持つ種を 作成することができる。また、突然変異によって現存するグリコシル化部位を除 去して、その部位でグリコシル化されない種を作ることもできる。本発明の基本 的前提に従って天然ＶＥＧＦアミノ酸配列のアミノ酸第５１位および／または第 ６０位で導入される、本発明に包含される他の突然変異と同様に、この場合も、 最終産物がもとのＶＥＧＦ変異体の特性と総合的に異ならない限り、同分子の全 範囲でこれらアミノ酸部分外にある他の位置に、グリコシル化部位を導入できる ことは理解されるだろう。 次に、細胞溶解物または精製ＶＥＧＦ変異体の活性を、所望の特徴に適したス クリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、細胞表面ＶＥＧＦへの結合 を、以下の実施例に記載するようなよく知られたＶＥＧＦ結合アッセイを使用す ることにより常套的にアッセイすることができる。ＶＥＧＦ分子の免疫学的特徴 、例えば与えられた抗体に対する親和性など、の変化は、競合型イムノアッセイ で測定される。候補変異体による血管内皮細胞増殖の促進または抑制の変化は、 適当な検定法で測定される（以下実施例参照）。酸化還元安定性や熱安定性、疎 水性、タンパク質分解に対する感受性、担体との会合傾向、多量体への会合傾向 などといったタンパク質特性の変化は、通常の当業者によく知られる方法で検定 される。 3. 組換え発現 望ましい変異ＶＥＧＦ分子は、組換え法を含む任意の技術で調製することがで きる。また本明細書において、単離されたDNAとは、3'-および/または5'-隣接領 域を伴うもしくは伴わない化学合成されたDNA、cDNA、染色体DNAまたは染色体外 DNAを意味するものと解される。本明細書に記載の望ましいＶＥＧＦは、組換え 細胞培養での合成によって作成されることが好ましい。 そのような合成には、まず、ＶＥＧＦ分子をコードする核酸の確保が必要であ る。ＶＥＧＦ分子をコードするDNAは、ウシ下垂体濾胞細胞から、(a)それらの細 胞からcDNAライブラリーを調製し、(b)ＶＥＧＦまたはその断片（100塩基対長ま で、またはそれ以上）をコードする標識DNAを用いてハイブリッド形成分析を行 って、相同な配列を含有するライブラリー中のクローンを検出し、(c)そのクロ ーンを制限酵素分析と核酸配列決定で分析して完全長クローンを同定することに より、得ることができる。ウシ以外の哺乳類に由来するＶＥＧＦ分子をコードす るＤＮＡも、内皮または白血病細胞ライブラリーをスクリーニングすることによ って同様の形式で得ることができる。低ストリンジェンシー条件下でＶＥＧＦコ ードDNAにハイブリッド形成することができるDNAは、ＶＥＧＦをコードするDNA の同定に役立つ。高および低ストリンジェンシー条件については下に定義する。 完全長クローンがcDNAライブラリー中に存在しない場合は、本明細書に初めて開 示される核酸配列情報を用いて種々のクローンから適当な断片を回収し、それら のクローンに共通する制限部位で連結してＶＥＧＦ分子をコードする完全長クロ ーンを組み立てることができる。別法として、ゲノムライブラリーから所望のDN Aを得る。 このDNAをライブラリーから同定し、単離したら、それをさらなるクローニン グまたは発現のために複製可能なベクターに連結する。 組換え発現系の一例として、ＶＥＧＦをコードするDNAを含む発現ベクターを 用いる形質転換により、ＶＥＧＦコード遺伝子を哺乳類細胞中で発現させる。培 養培地中または宿主細胞の周辺腔中にＶＥＧＦ（すなわち分泌分子）が得られる ようなプロセシングを行ないうる宿主細胞を形質転換することが好ましい。 a. 有用な宿主細胞とベクター 本明細書に開示するベクターと方法は、広範囲にわたる原核生物および真核性 物を宿主細胞とする使用に適している。 通常、DNA配列の最初のクローニングと本発明で有用なベクターの構築には、 当然ながら、原核生物が好ましい。例えば、大腸菌K12 MM294株（ATCC番号31,44 6）は特に有用である。使用しうるその他の微生物株には、大腸菌Bや大腸菌X177 6（ATCC番号31,537）のような大腸菌株がある。これらの例はもちろん限定では なく例示である。 原核生物は発現にも使用できる。上述の株に加えて、大腸菌W3110（F-、ラム ダ-、原栄様株、ATCC番号27,325）、K5772（ATCC番号53,635）およびSR101、枯 草菌などのバチルス属、ネズミチフス菌や霊菌（セラチア=マルセサンス）など といったその他の腸内細菌、および種々のシュードモナス種も使用できる。 一般にこれらの宿主には、その宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと 制御配列を含有するプラスミドベクターが使用される。これらのベクターは通常 、複製部位と、形質転換された細胞の表現型による選択を可能にする標識配列と を保持する。例えば、大腸菌は通例、大腸菌種に由来するベクターpBR322を用い て形質転換される（例えばBolivaraら，Gene 2，95[1977]を参照）。pBR322はア ンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するので、簡単な形 質転換細胞同定手段を与える。pBR322プラスミドや他の微生物プラスミドまたは ファージは、その微生物がそれ自身のタンパク質の発現に使用しうるプロモータ ーをも含有するか、もしくはそれを含有するように修飾されなければならない。 組換えDNA構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、b-ラクタマーゼ （ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Changら，Nature，375， 615[1978]；Itakuraら，Science，198，1056[1977];Goeddelら，Nature，281，5 44[1979]）と、トリプトファン（trp）プロモーター系(Goeddelら，Nucleic Aci ds Res. ，8，4057[1980];EPO出願公開番号0036,776）がある。最も一般的に使用 されるプロモーターはこれらであるが、他の微生物プロモーターも発見され、使 用されている。また、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されている ので、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に連結することができる（ 例えばSiebenlistら，Cell，20，269[1980]を参照のこと）。 原核宿主細胞に加えて、酵母培養などの真核微生物も使用できる。一般的なパ ン酵母サッカロミセス・セレビシェは、なかでも最も広く使用されている真核微 生物である（ただし、その他にもいくつかの株が広く使用されている）。サッカ ロミセスでの発現には、例えばプラスミドYRp7などがよく使用される（Stinchco mbら，Nature 282，39[1979];Kingsmanら，Cene 7，141[1979];Tschemperら，Ge ne 10，157[1980]）。このプラスミドは既にtrp1遺伝子を含有しており、それが トリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC番号44,0 76やPEP4-1（Jones，Genetics 85，12[1977]）に選択マーカーを与える。酵母宿 主細胞ゲノムの特徴としてtrp1損傷が存在することは、トリプトファン不在下で の生育によって形質転換を検出するのに有効な環境となる。 酵母ベクター中の好適な促進配列には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitz emanら，J．Biol．Chem．255，2073[1980]）その他の解糖系酵素（Hessら，JAdv ．Enzyme Reg．7，149[1968];Hollandら，Biochemistry17，4900[1978]）、例え ばエノラーゼ、グリヤルアルデヒド-3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー ゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イ ソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど のプロモーターがある。また、好適な発現プラスミドを構築するには、これらの 遺伝子に付随する終結配列を、その発現ベクター中の発現させようとする配列の 3'側に連結することにより、mRNAのポリアデニル化と終結に備える。生 育条件によって転写を制御できるという利点をも持つその他のプロモーターは、 アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸性ホスファターゼ、窒素 代謝に関係する分解酵素、上述のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ 、およびマルトースとガラクトースの資化に寄与する酵素群のプロモーター領域 である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終結配列を含有するプラ スミドベクターはいずれも好適である。 微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養も宿主として使用できる。 原則的には、脊椎動物培養であるか無脊椎動物培養であるかにかかわらず、それ らの細胞はいずれも使用できる。しかし、最大の関心は脊椎動物細胞にあり、培 養された脊椎動物細胞（組織培養）の増殖は近年、日常的な手法になっている［ Tissue Culture，Academic Press社，KruseおよびPatterson編(1973)］。それら 有用な宿主細胞系の例はVERO細胞、ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ CHO）細胞系、W138、BHK、COS-7、293および即CK細胞系である。これらの細胞用 の発現ベクターは通常、（必要であれば）複製起点と、発現させる遺伝子の前に 位置するプロモーターを、必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポ リアデニル化部位および転写終結配列と共に含む。 哺乳類細胞で使用する場合、発現ベクター上の制御機能はウイルス物質から得 られることが多い。例えば広く使用されているプロモーターは、ポリオーマ、ア デノウイルス2、そして最も多くの場合シミアンウイルス40（SV40）に由来する 。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、それらが共にSV40ウイルス複 製起点をも含む断片としてウイルスから容易に得られるので、とりわけ有用であ る［Fiersら，Nature，273，113(1978)]。より小さいSV40断片やより大きいSV40 断片も、HindIII部位からウイルス複製起点に位置するBglI部位に向かって伸び る約250bpの配列が含まれている限り使用できる。さらに、所望の遺伝子配列に 通常付随するプロモーターまたは制御配列がその宿主細胞系に適合するのであれ ば、それらを使用することもでき、またそうすることがしばしば望ましい。 複製起点は、SV40その他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV） 供給源から得られるような外来の起点を含むようにベクターを構築することによ って、あるいは宿主細胞染色体複製機構によって提供されうる。 満足できる量のタンパク質が細胞培養によって生産されるが、二次コード配列 を用いる改良は、生産レベルをさらに向上させるのに役立つ。二次コード配列の 一つはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を含む。これはメトトレキセート（MT X）などの外部から制御されるパラメーターによる影響を受けるので、メトトレ キセート濃度の制御によって発現を制御することが可能になる。 ＶＥＧＦおよびDHFRタンパク質の両方をコードするDNA配列を含む本発明のベ クターによるトランスフェクションに好ましい宿主細胞を選択する際には、使用 するDHFRタンパク質のタイプに応じて宿主を選択することが妥当である。野生型 DHFRタンパク質を使用する場合は、DHFR欠損性の宿主細胞を選択して、ヒポキサ ンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地中で成功したトランスフェクシ ョンのマーカーとしてそのDHFRコード配列を使用できるようにすることが好まし い。この場合に適当な宿主細胞は、UrlaubおよびChasin，Proc．Natl．Acad．Sc i．(USA)，77，4216(1980)に記述されているように調製、増殖されるDHFR活性欠 乏性チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系である。 これに対し、MTXに対する結合親和性が低いDHFRタンパク質を制御配列として 使用する場合は、DHFR欠損細胞を使用する必要はない。この突然変異型DHFRはメ トトレキセートに対して耐性を示すので、宿主細胞自体がメトトレキセート感受 性であれば、MTX含有培地を選択手段として使用することができる。MTXを吸収で きるほとんどの真核細胞はメトトレキセート感受性であると思われる。そのよう な有用な細胞系の一つはCHO細胞系CHO-Kl（ATCC番号CCL61）である。 b. 使用できる代表的方法論 所望のコード配列と制御配列を含有する好適なベクターの構築には、一般的な 連結技術が使用される。単離されたプラスミドまたはDNA断片を切断し、加工処 理し、望ましい形態に再連結することにより、必要なプラスミドを調製する。 平滑末端が必要な場合は、10単位のポリメラーゼI（クレノウ）を用いて15℃ で15分間処理し、フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈澱すればよい 。 切断した断片のサイズ分離は、Goeddelら，Nuleic Acids Res．8，4057(1980 ）に記載の6%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なうことができる。 構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通例、連結混 合物を用いて大腸菌K12 294株（ATCC31,446）その他の適当な大腸菌株を形質転 換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によ って選択する。それらの形質転換体からプラスミドを調製し、制限マッピングお よび/またはMessingら，Mucleic Acids Res．９，309(1981)の方法もしくはMaxa mら，Mthods of Enzymology 765，499(1980)の方法によるDNA配列決定によって 分析する。 そのDNAを哺乳類細胞宿主に導入し、適当なトランスフェクタントを培地中で 選択した後、約20,000-500,O00nM濃度のメトトレキセート（DHFR活性の競合阻害 剤）の存在下に宿主細胞培養を生育することにより、DHFRタンパク質コード配列 の増幅を達成する。当然、有効濃度範囲はDHFR遺伝子の性質と宿主の特徴に強く 依存する。普遍的な上限と下限を明確にできないことは明らかである。DHFRを阻 害する他の葉酸類縁体やその他の化合物も適当な濃度で使用できるだろう。しか し、MTX自体は便利で、容易に入手でき、効果的である。 使用しうるその他の技術については実施例の前の節に記述する。 4. 有用性と製剤 本発明のＶＥＧＦアンタゴニストには、血管内皮に関係する数多くの治療的用 途がある。このような用途には、例えば、内皮細胞増殖および血管新生の調節に 使用することができる形成された物品への組み込みが含まれる。さらに、これら 物品によって腫瘍の侵入と転移を調節することができる。本発明のポリペプチド がそれに対して使用し得る、その他の障害については上に記載している。 上述の適応症に対して、治療すべき特定の疾患または障害、個々の患者の状態 、ＶＥＧＦアンタゴニストの送達部位、投与法、およびその他実施者の知る因子 を考慮して、良好な医療行為に合致する方法で変異ＶＥＧＦアンタゴニスト分子 を製剤化し、投与する。したがって、本明細書においてＶＥＧＦの「治療上有効 な量」とは、処置される状態の緩和または治癒、もしくはその悪化の予防または 軽減に有効な量であり、具体的には、血管内皮の増殖をin vivoで実質的に阻害 するに足る量である。 天然ＶＥＧＦに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応するＶＥＧＦアミノ酸 配列変種および誘導体は、ＶＥＧＦの免疫検定において標品として、また標識し た場合は競争試薬として有用である。 ＶＥＧＦは、望ましい純度を持つＶＥＧＦアンタゴニストを生理学的に許容で きる担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、貯蔵または投与のため に調剤される。このような物質は使用する用量および濃度で受容者に対して非毒 性である。ＶＥＧＦが水溶性である場合は、リン酸塩や他の有機酸塩などの緩衝 液（好ましくはpH約7〜8）中に製剤化することができる。ＶＥＧＦ変種が水に部 分的にしか溶解しない場合は、それをTween、PluronicsまたはPEG（例えばTween 80）などの非イオン界面活性剤と0.04〜0.05%（w/v）の量で調合してその溶解 性を増大させることにより、マイクロエマルジョンとして調製することができる 。 任意に、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）；低分子量（約10残基未満の）ポ リペプチド（例えばポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼ ラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性 ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのア ミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキスト リンを含む単糖類、二糖類その他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；マンニト ールやソルビトールなどの糖アルコールなどといった他の成分を加えてもよい。 治療的投与に使用されるＶＥＧＦアンタゴニストは滅菌状態でなければならな い。滅菌状態は滅菌濾過膜（例えば0.2ミクロン膜）による濾過で容易に達成さ れる。ＶＥＧＦは通常、凍結乾燥型で保存されるか、熱的変性と酸化的変性に対 して高度に安定な場合は水溶液として保存されるだろう。ＶＥＧＦアンタゴニス ト調製物のpHは通例、約6〜8であろう。ただし、より高いもしくはより低いpH値 が適当である場合もありうる。上述の賦形剤、担体または安定化剤のいくつかを 使用することにより、ＶＥＧＦアンタゴニストの塩が生成することは理解される だろう。 ＶＥＧＦアンタゴニストを非経口的に使用する場合は、一般的には、ＶＥＧＦ アンタゴニストを含有する治療組成物を滅菌注入口を持つ容器（例えば静脈内用 溶液バッグや皮下注射針で突き刺せる栓が付いたバイアル）に入れる。 一般に、その障害が許す場合は、ＶＥＧＦを部位特異的送達用に製剤化し、投 与すべきである。これは部位特異的充実性腫瘍の場合に便利である。 徐放性製剤も調製することができ、これにはマイクロカプセル粒子と移植可能 物の形成が含まれる。徐放性ＶＥＧＦ組成物を調製するには、ＶＥＧＦを生物分 解性の基盤またはマイクロカプセルに封入することが好ましい。この目的に適し た素材はポリラクチドであるが、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP133,988 A） のような他のポリー(a-ヒドロキシカルボン酸)ポリマーも使用できる。他の生物 分解性ポリマーには、ポリ(ラクトン)、ポリ(アセタール)、ポリ(オルトエステ ル)またはポリ(オルトカーボネート)がある。ここでまず考慮しなければならな いことは、その担体そのものまたはその分解産物が標的組識内で非毒性であるこ とと、その状態をさらに悪化させないことである。これは、標的とする障害の動 物モデル（そのようなモデルが利用できない場合は正常な動物）における日常的 なスクリーニングによって決定することができる。このような動物モデルは、数 多くの科学刊行物に詳述されている。 徐放性組成物の例については、米国特許第3,773,919号、EP 58,481A、米国特 許第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ特許第1176565号、U．Sidmanら，Biopol ymers 22，547[1983]、およびR．Langerら，Chem ．Tech. 12，98[1982]を参照の こと。 局所的に投与する場合は、ＶＥＧＦアンタゴニストを担体および/またはアジ ュバントなどの他の成分と混合することが好ましい。そのような他の成分の性質 については、それらが医薬的に許容でき、意図する投与に有効でなければならな いこと、およびその組成物中の活性成分の活性を分解できないこと以外の制限は ない。好適な賦形剤の例には、精製コラーゲンを含むまたは含むない軟膏、クリ ーム、ゲルまたは懸濁剤がある。これらの組成物は、好ましくは液状または半液 状で、経皮用のパッチ、プラスターおよび包帯に染み込ませることもできる。 ゲル製剤を得るには、液体組成物中に調合したＶＥＧＦを有効量の水溶性多糖 または合成ポリマー（ポリエチレングリコールなど）と混合して、局所投与に適 した粘度のゲルを形成させればよい。使用できる多糖には、例えば、アルキルセ ルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセ ルロース（メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチル セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセ ルロースなど）を含むエーテル化セルロース誘導体などのセルロース誘導体；澱 粉と分別澱粉（fractionated starch）；寒天；アルギン酸とアルギナート；ア ラビアゴム；プルラン；アガロース；カラギーナン；デキストラン；デキストリ ン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリ コーゲン；グルカン；合成生体高分子；キサンタンゴム、グアーゴム、ローカス トビーンゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、カラヤゴムなどのゴム；およ びそれらの誘導体と混合物がある。ここで好ましいゲル化剤は、生物系に対して 不活性、非毒性であり、調製が簡単で、流動性が高すぎたり粘度が高すぎたりせ ず、その中に保持されたＶＥＧＦアンタゴニストを不安定化しないものである。 上記多糖はエーテル化セルロース誘導体であることが好ましく、十分に明確な 精製されたUSPに挙げられているもの（例えばメチルセルロースや、ヒドロキシ プロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル セルロースなどのヒドロキシアルキルセルロース誘導体）がより好ましい。ここ で最も好ましいものはメチルセルロースである。 ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、一般に、適当な粘度を持つように 混合された低分子量および高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例 えば、分子量400〜600のポリエチレングリコールと分子量1500のものとの混合物 は、ペーストが得られるように適当な比率で混合すると、この目的に有効である 。 多糖類とポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用語は、コロ イド溶液と分散液を包含するものとする。一般に、セルロース誘導体の溶解性は エーテル基の置換の程度によって決定され、ここで有用な安定化誘導体は、その 誘導体を水溶性にするに足る量のエーテル基をセルロース鎖の1無水グルコース 単位あたりに持つべきである。一般的には1無水グルコース単位あたり0.35エー テル基以上のエーテル置換度であればよい。またセルロース誘導体は、Li、Na、 KまたはCs塩などのアルカリ金属塩の形態であってもよい。 ゲル中にメチルセルロースを使用する場合は、それがゲルの約2〜5%（より好 ましくは約3%）を占めることが好ましく、ＶＥＧＦアンタゴニストはゲル1mlあ たり約300〜1000mgの量で存在することが好ましい。 使用すべき用量は上述の因子に依存する。一般的な案として、ＶＥＧＦアンタ ゴニストを製剤化し、約0.1ng/cc以上、かつ、効きめはあるが不当に毒性でない 最大用量までのＶＥＧＦアンタゴニストレベルを組織内に樹立できる投与量で、 標的部位または組識に送達する。この組織内濃度は、可能であれば連続的注入、 徐放性剤、局所適用または実験的に決定した頻度での注射によって維持されるベ きである。 5. 医薬組成物 本発明の化合物は、医薬的に有用な組成物を製造するための既知の方法に従っ て、本発明のＶＥＧＦアンタゴニストを医薬的に許容できる担体賦形剤と混合す ることにより、製剤化することができる。好ましい担体賦形剤とそれらの製剤は 、ヒト血清アルブミンなどの他のヒトタンパク質を含めて、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences ，16版，1980，Mack Publishing Co.，Osloら編（その 開示は参考文献とし本明細書の一部を構成する）などに記述されている。本明細 書に記載のＶＥＧＦアンタゴニストは非経口的に、あるいは有効な形態で血流に それを確実に送達する他の方法によって投与することができる。 本発明の実施に使用される本発明のＶＥＧＦアンタゴニストの臨床的投与にと りわけ適した組成物には、例えば滅菌水溶液、または凍結乾燥タンパク質などの 滅菌された水和可能な粉末がある。一般に製剤は、さらに適当量の医薬的に許容 できる塩を、一般的にはその製剤を等張性にするに足る量で含むことが望ましい 。アルギニン塩基やリン酸などのpH調節剤も通例、適当なpH（一般的には5.5〜7 .5）を維持するに足る量で含まれる。さらに、貯蔵寿命や水性製剤の安定性を改 善するために、グリコールなどの薬剤をさらに含むことも望ましいだろう。この 方法で、変異体t-PA製剤は非経口投与、特に静脈内投与に適した薬剤となる。 本発明の医薬組成物の用量と望ましい薬物濃度は、意図するその用途によって 変化するだろう。例えば、一般に「ボーラス」投与を行うことができ、その後の 投与で、好ましくは約3μg/ml程度のほぼ一定の血中レベルを維持することが好 ましい。 しかし、一般に注入法が利用できず、また根底にある疾患が一般に重篤である ため、緊急医療施設に関係する用途では、静脈内ボーラスのように多少大きい初 期投与量を与えることが一般に望ましいだろう。 本発明の化合物に関して言及した種々の治療適応症には、治療すべき特定の障 害、個々の患者の状態、送達部位、投与法その他、各分野の実施者が知る因子を 考慮して、よい医療に合致する方法でＶＥＧＦ分子を製剤化し、投与する。 したがって、本明細書において本発明ＶＥＧＦ分子の「治療有効量」とは、処 置される状態の緩和または治癒、もしくはその悪化の予防または軽減に有効な量 であり、具体的には、血管内皮の増殖をin vivoで実質的に減少または阻害する に足る量である。一般的には、処置される治療適応症の標的であるところの組識 中で、約0.1ng/cm³以上、かつ、効きはあるが不当に毒性でない最大用量までの 本発明ＶＥＧＦアンタゴニストレベルを樹立できる投与量を使用する。本発明化 合物の治療適応症のいくつかには、組織内投与を選択できると考えられる。 以下の実施例は、単に、現在わかっている本発明の最良の実施形態を例示する ために過ぎず、本発明がこれら実施例の詳細に限定されると見なすべきではない 。 実施例1 材料−Muta-geneファージミド・インビトロ突然変異誘発キット、ネズミIgGに 特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギIgG、染色済低範囲MW標品およびT rans-Blot Transfer Medium（純粋なニトロセルロース膜）はBioRad Laboratori es（カリフォルニア州リッチモンド）から購入した。QiagenプラスミドTip100キ ットとSequenaseバージョン2.0は、それぞれQiagen（カリフォルニア州チャッツ ワース）およびUnited States Biochemical（オハイオ州クリーブランド）から 入手した。SDSゲル（4-20%勾配ポリアクリルアミド）と切断済ブロッティング紙 は、Integrated Separations Systems（マサチューセッツ州ネーティック）から 入手した。SDS試料緩衝液（×濃縮）と種々の制限酵素はNew England Biolabs（ マサチューセッツ州ベバリー）から入手した。O-フェニレンジアミン、クエン酸 リン酸緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウムおよびH₂O₂基質錠剤はSigma（ミズーリ 州セントルイス）から購入した。BufferEZEフォーミュラ1（転写緩衝液）とX-OM at AR X線フィルムはEastman Kodak Co．（ニューヨーク州ロチェスター）から 入手した。MaxosorbおよびImmunlon-1マイクロタイタープレートはそれぞれNunc （デンマーク・カンストルップ）とDynatech（バージニア州シャンティ イ）から購入した。細胞培養プレート（12ウェル）と培養培地（ウシ血清入り） は、それぞれCostar（マサチューセッツ州ケンブリッジ）とGibco（ニューヨー ク州グランドアイランド）から入手した。ポリエチレン-20−ソルビタンモノラ ウレート（Tween-20）は、Fisher Biotech（ニュージャージー州フェアローン） から入手した。G25セファデックスカラム（PD−10）と₁₂₅I標識プロテインAはそ れぞれPharmacia（ニュージャージー州ピスカタウェイ）とAmersham（イリノイ 州アーリントンハイツ）から入手した。ウシ血清アルブミン（BSA）とウサギIgG 抗ヒトIgG（Fc特異的）は、それぞれCappel（ノースカロライナ州ダーラム）とC albiochem（カリフォルニア州ラジョラ）から購入した。プラスミドベクター（p RK5）、コンピテント大腸菌細胞（DH5aとCJ236）、合成オリゴヌクレオチド、細 胞培養培地、精製されたCHO由来のＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₆₅に対するモノクロ ーナル抗体（Mate A4.6.1、2E3、4D7、SC3およびSF8）とポリクローナル抗体は 、Genentech，Inc:（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で調製された 。FLT-1、flkIおよびKDRレセプター-IgGキメラの構築、発現および精製は、Park ら，J ．Biol．Chem. 269，25646-25654(1994)に記述されている通りとした。 部位特異的突然変異誘発とＶＥＧＦ変種の発現―部位特異的突然変異誘発は、Proc ．Natl．Acad．Sci. 82，488−492(1985)とKunkelら，Methods Enzymol. 15 4 ，367-382(1987)の方法に従い、Muta-Geneファージミド・インビトロ突然変異 誘発キットを用いて行なった。ＶＥＧＦ₁₆₅イソ型のcDNAを含有するプラスミド ベクターpRK5を突然変異誘発と一過性発現に使用した。pRK5ベクターは改良型pU C118ベクターであり、CMVエンハンサーおよびプロモーターを含有する[Nakamaye ら，NucleicAcidsRes. 14，9679-9698(1986)およびVieiraら，Methods Enzymol. 155，3-11(1987)]。突然変異したDNAはQiagen Plasmid Midi Kit Tip100を用い て精製し、突然変異の配列をSequenase Version 2.0キットを用いて確認した。 突然変異DNAを、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual part I ，C5.28-5.31（Cold Spring Harbor Laboratory Press，ニューヨーク州コール ドスプリングハーバー（1989））に記述されているような制限酵素消化によって 分析した。 ヒト胚腎臓「293細胞」の一過性トランスフェクションは、過去に記述された ような改良リン酸カルシウム沈澱法を用いて6ウェルプレート中で行なった[Jord anら，Bio/Technology（原稿準備中）(1994)；Chenら，Mol ．Cell Biol. 7，274 5-2752(1987);Gormanら，DNA and Protein Engineering Techniques 2，3-10(19 90);Grahamら，Virology 52，456-467(1973)］。簡単に述べると、約1.2×10⁶細 胞を、15μgの沈降DNAの存在下に37℃で終夜培養した。細胞培養上清を無血清培 地で置換し、細胞単層を37℃で72時間培養した。ならし培地（3ml）を収集し、 遠心分離し、等分して、使用するまで−70℃で保存した。 ＶＥＧＦ₁₆₅変種のELISAによる定量−過去に記述された放射免疫測定法［Aiel loら，N ．Engl．J．Med. 331，1480−1487(1994)］を、以下の手法によるＶＥＧ Ｆ突然変異体の定量に適合させた。96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェ ルを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）中、3μg/ml濃度の抗ＶＥＧＦ₁₆₅ポ リクローナル抗体溶液100μlを用いて、4℃で終夜コーティングした。上清を捨 て、ウェルを0.03%Tween 80を含むPBSで4回洗浄した。そのプレートを検定緩衝 液（PBS中、0.5%BSA，0.03%Tween 80，0.01%チメロサール）中、周囲温度で1時 間（300μl/ウェル）遮断した後、ウェルを洗浄した。希釈した試料（100μl） とＶＥＧＦ₁₆₅標品（0.1〜10ng/ml）を各ウェルに加え、穏やかに攪拌しながら 周囲温度で1時間保温した。上清を捨て、ウェルを洗浄した。抗ＶＥＧＦネズミ モノクローナル抗体5F8溶液（1μg/mlで100μl）を加え、そのマイクロタイター プレートを穏やかに攪拌しながら周囲温度で1時間保温した。上清を捨てた後、 プレートを洗浄し、直ちに、ネズミIgGに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ 結合ヤギIgGの1:25000希釈液（100μl）を各ウェルに加えた。そのプレートを穏 やかに攪拌しながら周囲温度で1時間保温した後、上清を捨て、ウェルを洗浄し 、50mMクエン酸リン酸緩衝液pH5（100μl）中のオルトフェニレンジアミン（0-0 4%）、H₂0₂（0.012%）を加えて呈色させ、周囲温度暗所で10分間保温した。50μ lの4.5N H₂SO₄を各ウェルに加えることにより反応を停止し、492nmの吸光度をマ イクロプレートリーダー（SLT Labs）で測定した。ＶＥＧＦ₁₆₅変種の濃度は、 非線型回帰分析を用いた標準曲線の内挿法によって定量した。比較のために、二 重モノクローナル形式を用いる第2のELISAを開発した。この検定法は、マイクロ タイタープレートのコーティングに中和モノクローナル抗体（Mab A4.6. 1）を使用する点以外は、上述のELISAに似ている［Kimら，Growth Factor 7，53 -64(1992)］。 ＶＥＧＦ突然変異体の免疫ブロッティング−ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ突然変異 体（約10ng）を含むならし細胞培地（16μl）を×SDS試料緩衝液（4μl）に加え 、90℃で3分間加熱してからSDSポリアクリルアミド（4-20%アクリルアミド）ゲ ルに載せた。染色済MW標品（10μl）をそのSDSゲルの外側のレーンに載せた。ゲ ルを4℃、25mAで90分間泳動した。0.1%SDSを含むBufferEZEが入ったBio-Radタン クブロッター中、25℃、250mAで90分間、ゲルをニトロセルロース紙に転写した 。ニトロセルロースは使用する前に、0.1%SDSを含む転写緩衝液で10分間湿らせ た。転写した免疫ブロットを、PBS中、4℃で、1.0%BSAと0.1%Tween 20（遮断緩 衝液）で終夜遮断した。5種類のネズミ抗ＶＥＧＦ Mab（A.4.6.1、5C3、5F8、4D 7および2E3）を含有する溶液を、各2μg/mlのMabを用いて遮断緩衝液中に調製し 、一次抗体として使用した。その一次抗体溶液を上記免疫ブロットと共に穏やか に攪拌しながら25℃で4時間保温した後、25℃の遮断緩衝液中10分間の洗浄を3回 行なった。¹²⁵I標識プロテインAを遮断緩衝液で10⁴cpm/ml（最終濃度）に希釈し 、上記免疫ブロットと共に穏やかに攪拌しながら25℃で60分間保温した。免疫ブ ロットを25℃の遮断緩衝液中で10分間、3回洗浄した後、ろ紙上で乾燥し、2枚の 増幅スクリーンと共にKodak X-Omatフィルム上に−70℃で３日間おいた。 ¹²⁵I 標識ＶＥＧＦ₁₆₅の調製 −CHO由来のＶＥＧＦ₁₆₅の放射線標識は、クロラミ ンT触媒ヨウ素化法の改良法を用いて行なった［Hunterら，Nature 194，495-496 (1962)］。典型的な反応では、10μlの1M Tris-HCl，0.01%Tween 20（pH7.5）を 、ふた付反応容器中の5μlのヨウ素125（0.5ミリキュリー、0.24nmol）に加えた 。この反応液に、10μlのCHO由来ＶＥＧＦ₁₆₅（10μg、0.26nmol）を加えた。0. 1Mリン酸ナトリウムpH7.4中の1mg/mlクロラミンT10μlを加えることにより、ヨ ウ素化を開始した。60秒後、0.1Mリン酸ナトリウムpH7.5中のメタ重亜硫酸ナト リウム（20μl、1mg/ml）の添加によって、ヨウ素化を停止した。各添加後に反 応溶液をボルテックスにかけた。この反応混合物を、PBS中の0.5%BSA、0.01%Twe en 20で予備平衡させたPD-10カラム（G25セファデックス）にかけた。フラクシ ョンを集め、ガンマシンチレーションカウンター（LKBモデル1277）で 放射活性をカウントした。通例、ヨウ素化ＶＥＧＦの比放射活性は26±2.5μCi/ μgで、これはＶＥＧＦ₁₆₅二量体２分子につき¹²⁵I1つに相当する。 ＶＥＧＦ₁₆₅レセプター結合検定−この検定は96ウェル・イムノプレート（Immu lon-1）で行なった。各ウェルを、50mM炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6中の10μg/m1 ウサギIgG抗ヒトIgG（Fc特異的）で、4℃で終夜コーティングした。上清を捨て た後、ウェルを洗浄緩衝液（PBS中0.01%Tween 80）で3回洗浄した。そのプレー トを検定緩衝液（PBS中0.5%BSA、0.03%Tween 80、0.01%チメロサール）中で1時 間遮断した（300μl/ウェル）。上清を捨て、ウェルを洗浄した。様々な濃度の ＶＥＧＦ₁₆₅突然変異体を含むならし細胞培地（100μl）、ＶＥＧＦレセプターI gGキメラタンパク質、FLT-1 IgG、flk-1 IgGまたはKDR-IgG（最終濃度3〜15ng/m 1、50μl）とマイクロチューブ（micronic tube）中で混合した¹²⁵I放射標識Ｖ ＥＧＦ₁₆₅（50μl中に約5×10³cpm）を用いて混合物を調製した。 この溶液の一部（100μ）をコーティング済のマイクロタイタープレートに加え 、穏やかに攪拌しながら周囲温度で4時間保温した。上清を捨て、プレートを洗 浄し、各マイクロタイターウェルをガンマシンチグラフィー（LKBモデル1277） でカウントした。FLT−1、Flk−1またはKDRレセプターに対する非標識ＶＥＧＦ_{1 65} （またはＶＥＧＦ₁₆₅突然変異体）と¹²⁵I放射標識ＶＥＧＦ₁₆₅の競争的結合を プロットし、4変数フィッティングプログラム（Kaleidagraph，Adelbeck Softwa re）を用いて分析した。各ＶＥＧＦ突然変異体について、50%阻害を達成するの に必要な濃度（IC₅₀）から見かけ上の解離定数を見積もった。 内皮血管細胞増殖に関する検定−過去に記述されているようにウシ副腎皮質内 皮（ACE）細胞を標的細胞として使用することにより、ＶＥＧＦ変種の有糸分裂 誘発活性を測定した［Ferraraら，Biochem ．Biophys．Res．Comm. 161，851-859 (1989)］。簡単に述べると、12ウェルプレートに細胞をまばらに（7000細胞/ウ ェル）接種し、10％ウシ血清、2mMグルタミンおよび抗生物質を補足したダルベ ッコ改良イーグル培地中で終夜培養した。翌日、その培地を交換し、培養培地で 100ng/ml〜10pg/mlの濃度に希釈したＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ突然変異体を、接 種した細胞上に正副1対づつ重層した。37℃で5日間培養した後、細胞をトリプシ ンで解離し、Coulterカウンターを用いて定量した。ＶＥＧＦ cDNAの単離 ウシ下垂体濾胞細胞［Ferraraら，Meth ．Enzymol.（前掲）とFerraraら，Am ． J．Physiol． （前掲）に記述されているようにして得た］から全RNAを抽出し［U llrichら，Science 196，1313−1317(1977)］、そのポリアデニル化mRNA画分を オリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーによって単離した。Avivら，Proc ．N atl．Acad．Sci．USA 69，1408-1412（1971）。dT₁₂−₁₈またはランダムヘキサ マーdN₆でプライミングすることにより、cDNAを調製した［Wickensら，J ．Biol ．Chem. 253，2483-2495(1978)］。AmershamのcDNAキットを用いて二本鎖cDNAを 合成し、非対象EcoRIリンカー［Norrisら，Gene 7，355-362(1979)］を用いてEk oRIメチラーゼ処理の必要を避けた点以外は既述のようにして［Huynhら，DNA Cl oning Techniques ，A Practical Approach ，Glover編（IRL，オックスフォード ，1985)］、得られたcDNAをEcoRIで切断したlgt10にサブクリーニングした。 その組換えファージを大腸菌C600Hfl［Huynhら，前掲］に接種し、ニトロセル ロースフィルター上に複製をとった。Bentonら，Science 196，180−182(1977) 。これらのレプリカを、³²Pで標識した［Taylorら，Biochim ．Biophys．Acta, 4 42 ，324-330(1976)］配列： の合成オリゴヌクレオチドプローブと、20%ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸 ナトリウムpH6.8、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液および 50mg/mlサケ精子DNA中、42℃でハイブリッド形成させ、2×SSC、0.1%SDS中42℃ で洗浄した。 I.vegf.6と名づけた1つの陽性クローンを同定した。³²Pで標識したこのクロー ンをプローブとして、オリゴdTでプライミングしたヒト胎盤cDNAライブラリーを スクリーニングし、陽性クローンを観察した。ヒト下垂体cDNAライブラリーを同 じ標識クローンでスクリーニングしたところ、陽性クローンは検出されなかった 。 pRK5ベクターにサブクローニングした後、クローンI.vegf.6の完全なヌクレ オチド配列をジデオキシオリゴヌクレオチド連鎖終結法［Sangerら，Proc ．Natl ．Acad．Sci．USA 74，5463-5467(1977)］で決定した。配列を、シグナル 配列含むそのアミノ酸配列と共に得た。 哺乳類細胞におけるＶＥＧＦコード遺伝子の発現 最終発現ベクターpRK5.vegf.6を、I.vegf.6とpRK5から構築した。pRK5とpRK5. vegf.6の構築について以下に詳述する。 A. pRK5の構築 A.1 ． pF8CISの構築 出発プラスミドpF8CISの最初の三要素構築を以下に説明する。 1)最終ベクターのアンピシリン耐性マーカーと複製起点は、プラスミドpML（L usky,M.およびBotchen，M.，Nature，293，79[1981]）の変種である出発プラス ミドpUC13pMLから得た。pUC13pMLは、pUC13（Vieira，J.およびMessing，J.，Ge ne ，19，259(1981)）のポリリンカーをpMLのEcoRIおよびHindIII部位に移植する ことによって構築した。もう1つの出発プラスミドpUC8-CMVは、CMVエンハンサー 、プロモーターおよびスプライス供与配列の供給源である。pUC8-CMVは、CMVエ ンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与配列の約800ヌクレオチドをpUC 8の平滑末端化したPstIおよびSphI部位に挿入することによって構築した。Vieir a，J.およびMessing，J.，前掲。合成BamHI-HindIIIリンカー（New England Bio labsから市販されている）をBamI付着末端に連結してHindIII部位を作成した。 この連結の後、HindIII-HincII消化を行なった。この消化により、CMVエンハン サー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含有する約800bpの断片が得ら れた。ゲル単離の後、この800bp断片をpUC13pMLの2900bp断片に連結した。pF8CI Sの構築に必要な断片は、上記中間体プラスミドをSalIとHindIIIで消化すること によって得た。この3123bp断片は、pUC13pML由来の複製起点、アンピシリン耐性 マーカーと、エンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含むCMV の制御配列とを含有する。 2） Ig可変領域イントロンおよびスプライス受容配列を合成オリゴマーを用 いて構築した。次に示すIgGイントロンおよびスプライス受容部位の配列（Bothw ellら，Nature，290，65-67[1981]）を持つ99マーと30マーを化学合成した： DNAポリメラーゼI（クレノー断片）で合成断片を補充し、二本鎖断片を作成し た。Wartell，R.M.およびW.S．Reznikoff，Gene，9，307(1980)。次に、PstIとH in dIIIの二重消化を行なった。この合成リンカーをpUC13（VeiraおよびMessing ，前掲）のPstIおよびHindIII部位にクローニングした。上記合成オリゴヌクレ オチドを含有するクローン、標識pUCIg.10を、PstIで消化した。この断片に、Ps t I-ClaIリンカーを使用してClaI部位を加えた。HindIIIによる消化の後、Ig可変 領域スプライス受容部位とIgイントロンの一部を含む118bp断片をゲル単離した 。 3) この構築法の第3部分では、肝炎表面抗原3'末端をSV40の初期領域のポリ アデニル化部位と転写終結部位で置換した。SV40配列を含有するベクターpUC.SV 40を、VieiraおよびMessing（前掲）に記載のpUC8のBamHI部位に挿入した。次に 、pUC.SV40をEcoRIIとHpaIで消化した。SV40ポリアデニル化配列を含む143bp断 片を、この消化物からゲル単離した。pSVE.8c1D（欧州特許公開番号160,457）の 消化後、さらに二つの断片をゲル単離した。EcoRIとClal消化によって生成した4 .8kb断片は、SV40-DHFR転写単位、pMLの複製起点およびアンピシリン耐性マーカ ーを含有する。ClaIとHpaIによる消化で生成する7.5kb断片は、因子VIIIのcDNA を含有する。3要素連結により、pSVE.8c24Dを得た。この中間体プラスミドをCla IとSalIで消化して、因子VIIIのcDNAとSV40ポリA部位およびそれに続くSV40 DHF R転写単位を含有する9611bp断片を得た。 pF8CISを得るための最終的な3要素連結には、a）複製起点、アンピシリン耐性 マーカー、CMVエンハンサー、プロモーターおよびスプライス供与部位を含む312 3bpのSalI-HindIII断片、b）Igイントロンおよびスプライス受容部位を含む118b pのHindIII-ClaI断片、およびc）因子VIIIのcDNA、SV40ポリアデニル化部位およ びSV40 DHFR転写単位を含む9611bpのClaI-SalI断片を用いた。A.2. pCIS2.8c28D の構築 pCIS2.8c28Dは、因子VIIIの73kdサブユニットに結合した因子VIIIの90kdサブ ユニットからなる。この90kdはアミノ酸1〜740、73kdサブユニットはアミノ酸16 90〜2332を含む。この構築物は、次に挙げる断片の3要素連結によって調製した ：a）pF8CISの12617bp ClaI-SstII断片（dam-株から単離し、BAP処理したもの） 、b）pF8CISの216bp SstII-PstI断片、およびc）キナーゼ処理した短いPstI-Cla I合成オリゴヌクレオチド。 2つの異なる断片AとBを同じpUC118 BamHI-PstI BAPベクターにクローニングし た。A断片はpUC408BHの408bp BamHI-HindIII断片であり、B断片はHindIII-PstI オリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、連結中の重合を防止す るためのキナーゼ処理を行なわずに使用した。 ベクター中にA断片とB断片を連結した後、予想される接合部の配列を、そのヌ クレオチドを含む領域のDNA配列決定によって確認した。 得られたプラスミドpCIS2.8c28Dは、4要素連結によって構築した。融合プラス ミドをBamIとPstIで切断し、443bp断片を単離した。4要素連結の残りの3断片は 、1）pSVEFVIII（欧州特許公開番号160,457）の1944bp ClaI-BamHI、2）pSVEFVI IIの2202bp BamI-XbaI断片をさらにPstIで部分的消化し、1786bpPstI-XbaI断片 を単離したもの、および3）pCIS2.8c24Dの5828bp XbaI-ClaI BAP断片である。pC IS2.8c28Dの正確な融合接合領域中に生じる変異の翻訳されたDNA配列を決定した 。これは相関する。 A.3. pRK5 の構築 pRK5を構築する際の出発プラスミドはpCIS2.8c28Dとした。第1節から第6節ま での塩基番号はpCIS2.8c28Dを指し、CMVプロモーターの前にあるEcoRI部位の最 初のTを塩基1とする。サイトメガロウイルスの初期プロモーターとイントロンお よびSV40起点とポリAシグナルを別々のプラスミドにのせた。 1. サイトメガロウイルスプロモーターを、pCIS2.8c28Dから得たEcoRI断片（ 9999-1201）として、上記pUC118のEcoRI部位にクローニングした。12個のコロニ ーを拾い、pUC118から調製した一本鎖DNAが1201のEcoRI部位から9999のEcoRI 部位までの配列決定を可能にするような配向をスクリーニングした。このクロー ンをpCMVE/Pと名づけた。 2. 部位特異的突然変異誘発法によってSP6（Green，MRら，Cell 32，681-694 [1983]）プロモーターを挿入するために、pCMVE/Pから一本鎖DNAを調製した。SP 6プロモーターの-69から+5までの配列を含有する合成110マー（Nucleic Acids R es. ，12，7041[1984]参照）を、CMVE/P配列に対応するオリゴマーの両側の18bp 断片と共に使用した。突然変異誘発を一般的な技術で行い、標識110マーを用い て、高および低ストリンジェンシーでスクリーニングした。6つの候補クローン を選択し、配列決定した。陽性クローンを同定し、pCMVE/PSP6と名づけた。 3. 例えばSP6 RNAポリメラーゼを加え、適当なサイズのRNAを調べることによ ってSP6プロモーターを調べたところ、活性であることがわかった。 4. pCMVE/P（第1段階）とpCMVE/PSP6（第2段階）中のpUC118のClal部位（912 ）からSmaI部位までの位置を包含するように、Cla-NotI-Smaアダプターを合成し た。このアダプターをpUC118のClaI-SmaI部位に連結し、正しいクローンをスク リーニングした。このリンカーを両方配列決定し、クローンをpCMVE/PSP6-Lおよ びpCMVE/P-Lと名づけた。 5. pCMVE/PSP6-LをSmaI（リンカー/pUC118接合部にある）とHindIII（pUC118 中）で切断した。下記pSVORAADRI 11のHpaI(5573)-HindIII(6136)断片をpCMVE/P SP6-LのSmaI-HindIIIに挿入した。この連結物をスクリーニングし、クローンを 単離して、pCMVE/PSP6-L-SVORAADRIと名づけた。 a）SV40起点とポリAシグナルをpCIS2.8c28DからXmnI（5475）-HindIII（6136 ）断片として単離し、pUC119（VieiraおよびMessing，前掲に記載）のHindIII部 位からSmaI部位までにクローニングした。このクローンをpSVORAAと名づけた。 b）EcoRIによる部分消化とクレノーによる充填により、5716のEcoRI部位を除 去した。充填後の自己連結によって得たコロニーをスクリーニングし、正しいク ローンを単離して、pSVORAADRI 11と名づけた。EcoRI部位の欠失を配列決定で調 べたところ、正しいことがわかった。 c）pSVORAADRI 11のHpaI（5573）-HindIII（6136）断片を単離し、pCMVE/PSP6 -L（上記4参照）に挿入した。 6. pCMVE/PSP6-L-SVOrAADRI（第5段階）を9999のEcoRIで切断し、平滑末端化 し、自己連結させた。EcoRI部位を持たないクローンを同定し、pRKと名づけた。 7. pRKをSmaIとBamIで切断した。これをクレノーで充填し、再連結した。コ ロニーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、pRKDBam/Sma3と名づけた 。 8. pRKDBam/Sma3のHindIII部位を、コンバーターを用いてHpaI部位に変換し た。（コンバーターとは、ある制限部位を他の制限部位に変えるために使用され るDNAの断片をいう。この場合は、一端がHindIII付着末端に相補的で、他端がHp a Iの認識部位を持つ。）陽性クローンを同定し、pRKDBam/Sma,HIII-HapI 1と名 づけた。 9. pRKBam/Sma,HIII-HpaI 1をPstIとNotIで切断し、そこにEcoRI-HindIIIお よびHindIII-EcoRIリンカーを連結した。各リンカーについてクローンを発見し た。しかし、沢山のHpaIコンバーターが入り過ぎていることもわかった（2以上 のコンバーターPvuI 1部位を生む）。したがって、これらのクローンをHpaIで切 断し、自己連結させる必要があった。 10. RI-HIIIクローン3とHIII-RIクローン5をHpaIで切断し、希釈し、自己連 結させた。陽性体を同定した。そのRI-HIIIクローンをpRK5と名づけた。 B. pRK5.vegf.6の構築 クローンI.vegf.6をEcoRIで処理し、そのEcoRI挿入物を単離し、EcoRIによるp RK5の消化とその大断片の単離によって得たpRK5のベクター断片に連結した。こ れら断片の2要素連結により、発現ベクターpRK5.vegf.6を得て、ＶＥＧＦコード 配列がプロモーターに対して正しい向きにあるものをスクリーニングした。 基本pRK5ベクターの構築に関するさらなる詳細は、1994年7月26日に発行され た米国特許5,332,671から得ることができ、この特許は、参考のため本明細書の 一部を特別に構成する。 実施例2 次の実施例では、本発明が包含する種々のＶＥＧＦ突然変異体を調製するため に一般に使用される方法論を詳述する。基本的な発現ベクターは次のように調製 した。 ＶＥＧＦ₁₆₅のcDNAを含有するベクターSDVF₁₆₅を得た。ＶＥＧＦ₁₆₅のcDNAを 、Hind IIIとEco RIによる制限消化によってSDVF₁₆₅から単離した。この単離さ れた挿入物を、pRK5プラスミド中にEco RI部位とHind III部位が存在することを 利用して、pRK5プラスミドに連結した。得られたプラスミドをコンピテントCJ23 6大腸菌細胞に形質転換して、部位特異的突然変異用の鋳型を作成した。次に、 これに対応する突然変異部位を含むオリゴヌクレオチドを調製し（下記参照）、 Bio-Rad Muta-Gene突然変異誘発キットを用いて、試験管内部位特異的突然変異 誘発操作を既知の手法に従って行なった。配列決定によって突然変異部位が最終 発現ベクターに組込まれたこと確認した後、一過性発現のために、得られたベク ターを293ヒト腎臓細胞にトランスフェクションした。 最終突然変異産物を作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを調製した。 こうして前記表１の左列に示したオリゴヌクレオチドによる挿入体を製造し、 「突然変異」と題する左列の下に示した表示に従ってＶＥＧＦ分子の対応する突 然変異体を製造した。化合物の命名は慣例的命名法に従ったものである。そこで 最初の化合物についてはその突然変異体は「Ｃ５１Ｄ」と記する。これはＶＥＧ Ｆ分子で第５１位のアミノ酸のシステイン（Ｃ）残基が第５１位にアスパラギン 酸（Ｄ）を挿入するように突然変異したことを意味する。 第２図は本発明の天然ＶＥＧＦ二量体およびある変異体ＶＥＧＦポリペプチド を示すダイアグラムである。第２図に示すように、天然ＶＥＧＦ分子は一方のモ ノマー上の第５１位アミノ酸のシステインともう一方のモノマー上の第６０位ア ミノ酸のシステイン（その逆もある）の間にジスルフィド結合が形成されること により二量体化する。第５１位または第６０位アミノ酸のシステイン残基のアス パラギン酸への置換（それぞれＣ５１ＤまたはＣ６０Ｄ）は、正確な二量体化と スタガー二量体分子の形成を妨げる。第５１位および第６０位アミノ酸の両シス テイン残基の置換（Ｃ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄ）は二量体の形成を完全に妨げる。 ＶＥＧＦ変異体のＶＥＧＦレセプターへの結合−第２図に示す天然ＶＥＧＦ二 量体およびＶＥＧＦ変異体ポリペプチドの、ＫＤＲおよびＦＬＴ−１レセプター との結合能を試験した。レセプター結合アッセイは前記のごとく行なった。ＫＤ Ｒレセプターとの結合について得られた結果を第３および第４図に示す。 第３図に示すように、試験した３つのＶＥＧＦ変異体ポリペプチドは、天然の ＶＥＧＦ二量体タンパク質と同じ強さの結合親和性は示さなかったものの、すべ てがＫＤＲレセプターとの結合能を保持していた。第３図に示す結果は、モノマ ー変異体ポリペプチドＣ５１Ｄ、Ｃ６０ＤはＫＤＲレセプターとの結合能を保持 するが、試験した天然の二量体または２つのスタガー二量体に比べて結合親和性 が低下していた。第４図は、Ｃ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄモノマー変異体のＫＤＲレセプ ターとの結合親和性が天然の二量体ＶＥＧＦタンパク質より約５００倍低いこと を示している。すなわち、この結果は、結合親和性は低いものの、試験した各Ｖ ＥＧＦ変異体ポリペプチドがＫＤＲレセプターとの結合能を保持することを示し ている。 第５図および第６図は、第２図のポリペプチドのＦＬＴ−１レセプターとの結 合を測定して得られた結果を示す。第５図に示す結果は、天然のＶＥＧＦ二量体 に比べて結合親和性は低いものの、試験した変異体すべてがＦＬＴ−１レセプタ ーとの結合能を保持することを示している。第６図は、Ｃ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄモノ マー変異体のＦＬＴ−１レセプターに対する結合親和性が天然のＶＥＧＦ二量体 より約１４０倍低いことを示す。すなわち、この結果は、試験したＶＥＧＦ変異 体ポリペプチドそれぞれが、結合親和性は低いものの、ＦＬＴ−１レセプターに 対する結合能を有することを示している。 ＶＥＧＦおよびその変異体による有糸分裂誘発刺激−上記の通り、第２図に示 したＶＥＧＦ変異体はＫＤＲおよびＦＬＴ−１両レセプターとの結合能があるこ とが示されたので、これら変異体の内皮細胞に対する有糸分裂誘発能について試 験した。細胞分裂促進アッセイは上記のごとく行なった。このアッセイの結果を 第７図に示す。 第７図に示すように、天然ＶＥＧＦ二量体分子は内皮細胞における有糸分裂誘 発を効率的に刺激することができるが、試験したＶＥＧＦ変異体（スタガー二量 体Ｃ５１ＤならびにＣ６０Ｄ、およびモノマー変異体Ｃ５１Ｄ，Ｃ６０Ｄ）は、 内皮細胞の有糸分裂誘発刺激に対する阻害効果を示す。この結果は、内皮細胞に おける効率的な有糸分裂誘発刺激には、天然ＶＥＧＦＤポリペプチドの第５１位 アミノ酸と第６０位アミノ酸のシステイン残基間の適切な二量体化が必須である ことを示す。したがって、これらのデータはＶＥＧＦモノマー単位の適切に二量 体化する能力を崩壊させるアミノ酸修飾は該分子の有糸分促進能を阻害するよう に作用することを示す。これら変異体分子が「天然のＶＥＧＦ様」有糸分裂誘発 反応を誘導することなくＶＥＧＦレセプターと結合し、占拠することができると 仮定すれば、そのような変異体分子はＶＥＧＦ活性の有効なアンタゴニスト（拮 抗物質）として役立つかもしれない。 Ｃ５１Ｄ、Ｃ６０ＤモノマーのＶＥＧＦ誘発内皮細胞増殖阻害能−該モノマー の、内皮細胞のＶＥＧＦ誘発増殖阻害能を測定するために計画されたアッセイに はＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄモノマーポリペプチドを用いた。簡単には、内皮細胞を３ ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦと、異なる量のＡ４６１抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ま たはＣ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄモノマーポリペプチドいずれかの存在下で培養した。各 インヒビターの上皮細胞増殖阻害効果を示す結果を第８図に示す。 第８図に示す結果は、Ａ４６１抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体とＣ５１Ｄ、Ｃ ６０ＤモノマーポリペプチドがいずれもＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖に対する実質 的な阻害効果を示すことを示している。この阻害効果はＶＥＧＦに対するインヒ ビターの比が増加するにつれて増加する。したがって、Ｃ５１Ｄ、Ｃ６０Ｄモノ マーポリペプチドはＶＥＧＦの内皮細胞増殖活性化を阻害するように機能する。結び 上記の説明は本発明の実施に使用できる具体的方法を詳述したものである。こ れらの具体的方法を詳述しおえたので、当業者には、本発明の成果を利用して同 じ知見を得るのに確実な代替法を案出する方法が十分にわかるだろう。しかし上 述の詳細は、その全範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の 範囲の適法な解釈によってのみ決定されるべきである。ここに引用した文書はす べて特に参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年１１月５日（１９９９．１１．５） 【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フェラーラ，ナポレオン アメリカ合衆国94109カリフォルニア州 サン・フランシスコ、パシフィック・アベ ニュー・ナンバー704、2090番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．変異体血管内皮増殖因子ポリペプチドを含むＶＥＧＦアンタゴニスト分子 であって、少なくとも１つのシステイン残基のアミノ酸修飾を含み、該アミノ酸 修飾が別の血管内皮増殖因子ポリペプチドモノマーと適切に二量体化する能力を 阻害し、該アンタゴニスト分子が血管内皮増殖因子応答を有意に誘導することな く血管内皮増殖因子レセプターと結合することができるアンタゴニスト分子、お よび該アンタゴニスト分子の機能的誘導体。 ２．該アミノ酸修飾が、該少なくとも１つのシステイン残基の、ジスルフィド 結合にあずかることのできない異なったアミノ酸による置換である、請求項１記 載のアンタゴニスト分子。 ３．該置換が、天然ＶＥＧＦアミノ酸配列の第５１位および／または第６０位 アミノ酸のシステイン残基の置換である、請求項２記載のアンタゴニスト分子。 ４．システインがアスパラギン酸で置換されている、請求項３記載のアンタゴ ニスト分子。 ５．置換Ｃ５１Ｄを含む請求項４記載のアンタゴニスト分子。 ６．置換Ｃ６０Ｄを含む請求項４記載のアンタゴニスト分子。 ７．該アミノ酸修飾が、該システイン残基をジスルフィド結合にあずかること ができないようにする該少なくとも１つのシステイン残基の化学修飾である、請 求項１記載のアンタゴニスト分子。 ８．該化学修飾が、天然ＶＥＧＦアミノ酸配列の第５１位および／または第６ ０位アミノ酸の化学修飾である、請求項７記載のアンタゴニスト分子。 ９．それ以外には本質的な生物学的性質に影響を及ぼさないアミノ酸修飾をさ らに含む、請求項１記載のアンタゴニスト分子。 １０．請求項１記載のＶＥＧＦアンタゴニスト分子をコードする配列を含む、 単離された核酸配列。 １１．形質転換体宿主細胞中で請求項１０記載の核酸を発現することが可能な 複製可能な発現ベクター。 １２．請求項１１記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 １３．チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１２記載の宿主細胞。 １４．薬学的に許容し得る担体と混合した請求項１記載のＶＥＧＦアンタゴニ スト分子を含む物質の組成物。 １５．請求項１４記載の組成物を投与することを含む治療方法。